Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование системы метаболизма ксенобиотиков в печени при остром панкреатите

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование системы метаболизма ксенобиотиков в печени при остром панкреатите"

«,1 О ом

На права^ р^кс^Ш/ 2003

ПРОКОПЬЕВА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ В ПЕЧЕНИ ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ

03. 00. 04. - биохимия 14. 00. 27. - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2000

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН г. Новосибирск

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Л. Ф. Гуляева доктор медицинских наук, профессор А. И. Мосунов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. Р. Колпаков доктор медицинских наук В. П. Плешаков

Ведущее учреждение:

Новосибирский Государственный Университет

Защита диссертации состоится '_марта 2000 г. в_часов

на заседании диссертационного совета (Д. 001. 37. 01.) при Научно-исследовательском Институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета

кандидат биологических наук Е. Н. Макарова

¿ОГ/-^ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема острого панкреатита является одной из сложных в современной гастроэнтерологии. Среди хирургических заболеваний органов брюшной полости панкреатит занимает третье место после острого аппендицита и острого холецистита, что составляет свыше 9% от числа больных с острыми хирургическими заболеваниями органов брюшной полости [Савельев В. С. и др., 1983; Богер М. М., 1984; Вискунов В. Г., 1995]. Актуальность его изучения обусловлена не только частотой встречаемости, но и ростом числа заболеваний, тяжестью течения, сложностью терапии и высокой летальностью. Общая летальность при панкреатите, несмотря на применение современных методик консервативного и оперативного лечения, остается очень высокой и составляет 15% при легких, и 40-70% при деструктивных формах. [Филипенко П. С., 1983; Вискунов В. Г., 1995]. Современные представления о патогенезе этого заболевания позволяют рассматривать острый панкреатит как токсическую энзимопатию. Пусковым механизмом развития этого заболевания служит высвобождение из ацинарных клеток поджелудочной железы активированных панкреатических ферментов, обычно присутствующих в виде неактивных проферментов [Бэнкс П. А., Лащевкер В. М., 1978; Савельев В. С. и др., 1988]. Наиболее частой причиной гибели больных острым панкреатитом в первые дни заболевания является эндогенная интоксикация, обусловленная массивной ферменгемией и сопровождающаяся усилением процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) с развитием циркуляторного гиповолемического шока, отека головного мозга, острой печеночной и почечной недостаточностью [Бэнкс П. А., 1982]. С одной стороны, патогенез эндогенной интоксикации окончательно не изучен. С другой - до сих пор в литературе нет попыток подробного изучения происходящих изменений в детоксикационной системе организма, хотя общепризнано, что при этой патологии снижается детоксикационная функция организма [Бэнкс П. А., 1982; Савельев В. С. и др., 1983; богер М. М., 1984; Владимиров В. Г., Сергиенко В. И., 1986]. Большинство детоксицирующих реакций у человека и животных осуществляется микросомальной монооксигеназной системой печени (МОС), участвующей в первой фазе метаболизма ксенобиотиков. Монооксигеназы локализованы в зндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов. Эти ферменты выполняют важнейшие функции, связанные с биотрансформацией как эндогенных соединений (стероидов, простагландинов, гормонов и др.), так и экзогенных соединений (лекарств, канцерогенов, анестетиков и др.). Ферменты микросомальной монооксигеназной системы печени снижают липидорастворимость чужеродных соединений и облегчают их элиминацию. Ключевую роль в связывании молекул различных соединений и активации кислорода в реакциях монооксигеназного типа играет терминальный компонент этой системы цитохром Р450, на долю которого приходится до 20% всего белка микросомальной фракции печени [Е51аЬгоок И. 1971]. Среди монооксигеназ наиболее значимыми являются иэофорг/ы 1А, 2В и 2С подсемейства. Цитохром Р450 1А подсемейства метаболизирует многие канцерогенные и токсичные соединения, а также участвует в катаболизме гормонов, в частности, эстрогенов [Гуляева Л. Ф. и др., 1994]. В метаболизме

ряда лекарственных препаратов (циклофосфамид, лидокаин, барбитураты) участвуют CYP 2В и CYP2C [Hietanen Е. et al., 1986, Гуляева Л. Ф. и др., 1994]. При введении в организм разнообразных по своей химической структуре и биологической активности чужеродных соединений может происходить обратимое повышение активности монооксигеназ. В основе этого явления лежит генетическая индукция монооксигеназ [Bresnick Е., 1978; Ляхович В. В., Цырлов И. Б., 1981; Nebert D. W., Gonzalez F. J., 1987]. Среди ксенобиотиков -индукторов особое место занимают вещества так называемого «фенобарбиталозого» типа (наркотические, снотворные,

противовоспалительные и другие лекарственные средства), а также индукторы «метилхолантренового» типа, к которым относятся канцерогенные полициклические ароматические углеводороды. Имеются соединения, относящиеся как к метилхолантреновому, так и к фенобарбигаловому типу, индуцирующие многие изоформы цитохрома Р450. К таким соединениям относится Арохлор 1254. С помощью индукторов можно повышать активность ряда ферментов МОС, что будет ускорять метаболизм ксенобиотиков, происходящий с участием этих ферментов. Дальнейшая биотрансформация ксенобиотиков может идти с вовлечением ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков. Основным ферментом этой фазы является глютатион S-трансфераза, которая вовлечена в детоксикацию электрофильных алкилирующих агентов, и продуктов ПОЛ (Wang W., Ballatori N„ 1998]. Основная ее функция заключается в катализе конъюгации гидрофобных соединений с трипептидом глютатионом. Глютатион S-трансферазы (ГБТ) представляют собой семейство изоферментов, способных катализировать перенос глютатиона на большое число электрофильных соединений, как экзогенной, так и эндогенной природы. Активность этого фермента при остром панкреатите не изучалась.

При лечении больного с острым панкреатитом применяется большое количество разнообразных лекарственных препаратов, которые, в конечном счете, метаболизируются в печени. Ввиду снижения детоксикационной функции печени, метаболизм применяемых лекарственных препаратов будет меняться. В настоящее время состояние ферментов первой и второй фазы метаболизма чужеродных соединений в печени при остром панкреатите остается неизученным; нет данных об исходном уровне активности TST и ферментов МОС и их динамическом изменении при этой патологии. В связи с этим, представляется актуальным изучение этого аспекта, так как с одной стороны, позволяет охарактеризовать состояние ферментоз первой и второй фазы метаболизма ксенобиотиков печени, дополняя таким образом, картину патогенеза панкреатита, с другой стороны, - изменяет подходы к лекарственной терапии при этом заболевании. Функциональное состояние печени, способность ее к индукции при остром панкреатите также остается неисследованным. Коррекция детоксикационной функции печени может играть важную роль в течении и исходе этого заболевания.

Цель настоящей работы: исследовать ферменты системы метаболизма ксенобиотиков в печени при остром панкреатите.

Для достижения цели требовалось решение следующих задач: 1. Исследовать активность ферментов систем метаболизма ксенобиотиков 1 фазы (цитохрома Р450):1А1, 1А2, 2В1, 2С6 и 2 фазы (глютатион S-

трансферазы) в печени крыс в ранние (2 и 4 сутки) и отдаленные (10 сутки) сроки острого экспериментального панкреатита;

2. Изучить индуцирующее действие фенобарбитала и Арохлора 1254 на ферменты 1 -ой и 2-ой фазы метаболизма ксенобиотиков в печени при остром панкреатите;

3. Оценить активность ферментов 1-ой и 2-ой фазы метаболизма ксенобиотиков в печени в отдаленные сроки течения заболевания после отмены индуктора;

4. Исследовать активность аминотрансфераз: АЛТ и ACT в плазме крови и активность ферментов метаболизма ксенобиотиков 1 фазы (цитохрома Р450): 1А1,1А2.2В1, 2С6впечени больных с острым панкреатитом.

5. Изучить изменения содержания продуктов перекисного окисления липидов и а-токоферола в ткани поджелудочной железы и плазме в первый день заболевания и содержание продуктов перекисного окисления липидов в микросомальной и цитозольной фракции печени в ранний и поздний периоды острого панкреатита;

6. Оценить динамику морфологических изменений в печени и поджелудочной железе на фоне острого экспериментального панкреатита при введении индуктора в ранние и поздние сроки заболевания.

Научная новизна работы. Впервые исследована активность ряда изоформ цитохрома Р450 печени при остром панкреатите. Показано, что при этой патологии активность таких ферментов как CYP1A1, CYP1A2, CYP2B1, CYP2C6 значительно снижена в ранние сроки заболевания, в более поздние сроки намечается тенденция возвращения их активности к контрольному уровню.

Установлено, что при введении индукторов МОС на фоне патологии поджелудочной железы эффект индукции был выше, чем в контрольных случаях. Впервые исследована активность фермента второй фазы метаболизма ксенобиотиков - глютатион S- трансферазы (ГЭТ) печени животных, больных панкреатитом, и показано повышение ее содержания в ранние (2-4 день) сроки заболевания. Введение индукторов (Арохлора 1254 или фенобарбитала) больным панкреатитом животным снижает содержание TST.

Впервые прослежены морфологические изменения в печени и поджелудочной железе одновременно с биохимическими исследованиями некоторых ферментов детоксикационной системы печени при остром панкреатите. Выявлено, что введение фенобарбитала при остром панкреатите снижает интенсивность деструктивных изменений в поджелудочной железе.

Проведено изучение динамики изменений перекисного окисления липидов в ткани поджелудочной железы в первые сутки заболевания. Выявлено, что в первые часы заболевания острым панкреатитом в поврежденном органе наблюдается как интенсификация ПОЛ, так и активация компонентов антаоксидантной системы.

Практическая ценность работы. Усиление перекисного окисления липидов в поджелудочной железе в ранние сроки, свидетельствующее о повышении концентрации активных форм кислорода, возможно, играет пусковую роль в раннем вовлечении печени в патологический процесс. Это указывает на необходимость применения экстракорпоральных методов

детсжсикации в первые сутки заболевания как для предупреждения повреждения печени, так и для снижения содержания эндогенной интоксикации. Результаты, полученные на экспериментальных животных, говорят в пользу того, что некоторые индукторы монсоксигеназной системы, в частности фенобарбитал, можно предложить в комплексном лечении панкреатита у пациента. Определение активности ферментов МОС и ГБТ в клинической практике позволит оценить изменения в системе метаболизма ксенобиотиков при остром панкреатите, что указывает на возможность коррекции лекарственной терапии.

Положения выносимые на защиту:

1. В ранние сроки заболевания острым панкреатитом наблюдается более чем 60% снижение активности ферментов первой фазы метаболизма ксенобиотиков: 1А1, 1А2, 2В1, 2С6.

2. Острый панкреатит сопровождается более, чем 2-х кратным повышением активности фермента второй фазы метаболизма ксенобиотков - глютатион Б-трансферазы в печени крыс.

3. В ткани поджелудочной железы в первые часы острого панкреатита наблюдается активизация как процессов перекисного окисления липидов, так и факторов антиоксидантной защиты. В печени процессы перекисного окисления липидов не активируются.

4. Введение индукторов микросомальной монооксигеназной системы (Арохлора 1254 и фенобарбитала) крысам с острым панкреатитом не только сохраняет индуцибельносгь цитохрома Р450, но и повышает ее.

5. Активность глютатион Б-трансферазы печени при введении индукторов (Арохлора 1254 и фенобарбитала) на фоне острого панкреатита снижается более чем на 80%.

6. Введение Арохлора 1254 в ранние сроки острого панкреатита снижает степень морфологических изменений в печени, а фенобарбитала -интенсивность воспаления в поджелудочной железе.

Апробация работы. Результаты работы доложены на международном симпозиуме «Проблемы лимфологии и эндоэкологии» [Новосибирск, 1998]; на конференции « Новые технологии в хирургии», [Новосибирск, 1999]; на межпабораторном семинаре Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 14 таблиц и 21 фотографии. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения и заключения, выводов и списка литературы, содержащего 134 отечественных и 160 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использованы крысы самцы породы Вистар весом 160 - 210 г, полученные из вивария ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск. Животные содержались в виварии и находились на стандартной лабораторной диете и перед забоем сутки не получали еды. После введения индукторов - ксенобиотиков, перед забоем, крысы голодали в

течение ночи. Индукторы микросомальных монооксигеназ вводили следующим образом: фенобарбитал по 80 мг на кг веса в физиологическом растворе в течение двух или четырех дней внутрибрюшинно; Арохлор 1254 - 300 мг/кг в растительном масле однократно внутрибрюшинно. Контролем служили животные, получавшие 0,9% раствор хлористого натрия или растительное масло, соответственно.

Моделирование острого экспериментального панкреатита Животным в асептических условиях под фторатановым наркозом производили верхнесрединную лапоротомию разрезом длиной 2 - 3 см. В рану выводили желудок, селезенку, 12-ти перстную кишку вместе с поджелудочной железой. Травматизацию поджелудочной железы вызывали путем многократного (7-10 раз) сдавливания ее паренхимы анатомическим пинцетом, сохраняя при этом брюшинный покров [Мичурин В. Ф,, 1972]. Рану передней брюшной стенки зашивали наглухо отдельными швами. Схемы введения индукторов

Введение индукторов проводилось по разным схемам.

а) Арохлор 1254

1. через двое суток после введения индуктора моделировали острый панкреатит; исследования проводили на второй день заболевания.

2. одновременно вводили индуктор и моделировали острый панкреатит; исследования проводили на второй день заболевания.

3. индуктор вводили на вторые сутки заболевания панкреатитом; исследования проводили на четвертые сутки заболевания.

4. индуктор вводили на вторые сутки заболевания, но исследования проводили на 10-й день заболевания.

б) фенобарбитал

1. индуктор вводили на вторые сутки заболевания панкреатитом; исследования проводили на четвертые сутки заболевания.

2. индуктор вводили на вторые сутки заболевания, но исследования проводили на 10-й день заболевания.

Микросомальную фракцию выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования.

Определение белка в микросомах и препаратах цитохрома Р450 проводилось методом Лоури с соавт. [Lowry О. H. et al., 1951] с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина.

Измерение количества гемопротеидов в микросомальной фракции печени проводили в соответствии с методом, описанным Омура и Сато [Omura Т. and Sato R., 1964], с использованием коэффициента экстинции 91 мМ см" 1 для цитохрома Р450 и 185 мМ"1 см"' для цитохрома Ь5. Количество цитохромов рассчитывалось в нмолях гемопротеида на 1 мг белка.

Активность ПОЛ в ткани поджелудочной железы, плазме крови и печени оценивали по содержанию продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой и выражали в нмоль МДА/г ткани [Steinbrecher U.P., 1990].

a-Токоферол измеряли флуорометрически по методу Тейлора с соавт. [Teylor S.L. et al., 1976] на спектрофлуориметре MPF-4 (Hitachi). В качестве стандарта использовали d-kx-токоферол ("Sigma").

Для светооптического изучения морфологических изменений в печени и поджелудочной железе материал готовили следующим образом. После

декапитации животных кусочки большой средней доли печени толщиной 0,30,4 см и поджелудочную железу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение суток, затем образцы обезвоживали в серии спиртов, включая ксилол возрастающей концентрации, и заключали в парафин [Волкова О. В., Елецкий Ю. К., 1982]. Срезы толщиной 4-5 мкм помещали на стекла и после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином, затем заключали в канадский бальзам [Ромейс Б., 1953; Липли Р., 1969].

Скорость деалкилирования ряда алкоксирезоруфинов определяли спектрофлуориметрически по методу Бурке и Маера [Burke М. D. and Mauer R. Т, 1978].

Активность общей TST определяли спектрофотометрически по методу Хабинга [Habing W. Н. et al„ 1974].

Экспериментальный материал обработан статистически по программе STATGRAPHICS с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты считались достоверным при Р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика изменений ферментов МОС при остром экспериментальном панкреатите у крыс

Для изучения динамики активности ферментов МОС при остром панкреатите была использована модель острого экспериментального травматического панкреатита у крыс [Мичурин В.Ф., 1972]. Выбор лабораторных животных был не случаен: морфологические и биохимические изменения у крыс при остром панкреатите сходны с таковыми у человека [Мичурин В. Ф., 1971; Савельев В. С. и др., 1983]. Исследования проводили в различные стадии течения заболевания: в острый период (2 и 4-ые сутки) и в период репаративных процессов (10-ые сутки). Для подтверждения заболевания были проведены морфологические исследования. Во всех опытных случаях наблюдали посттравматический серозный панкреатит. В печени наблюдали явления гепатодистрофии.

Одновременно с морфологическим изучением исследована динамика изменений активности некоторых изоформ цитохрома Р450 печени животных с острым панкреатитом. Показано, что реакции О-деалкилирования ряда алкоксирезоруфинов специфично осуществляются различными изоформами цитохрома Р450 печени крыс и человека [Burke D. М. et al., 1994]. Так, CYP 1А1 специфично катализирует реакцию О-деэтилирования 7-этоксирезоруфина (ЭРОД активность), CYP 1А2 - 7-метоксирезоруфина (МРОД активность), CYP 2С6 - бензилоксирезоруфина (БРОД активность), CYP 2В1 пентоксирезоруфина (ПРОД активность). Исходя из этого можно заключить, что используемые нами субстраты достаточно отражают специфическую активность исследуемых изоформ цитохрома Р450.

Результаты полученных данных представлены в таблице 1. Видно что, на вторые сутки заболевания у животных наблюдается выраженное снижение (от 63 до 84%) активности исследуемых ферментов МОС печени. 1А1-7-ЭРОД и 1А2-7-МРОД на 66 % (Р<0,05) и 63% (Р<0,01), соответственно. Для 2С6-БРОД зарегистрировано почти 70% снижение активности (Р<0,05), а для 2В1-ПРОД 84% (Р<0,05).

Таблица 1.

Характеристика МО С печени и содержание продуктов ПОЛ при остром экспериментальном панкреатите.

Группы животных Время течения болезни, сутки Содержание цитохрома Р450 пкмоль/мг белка Содержание МДА в печени в ммоль/мин/мг О-деалкилазная активность (пкмоль резоруфина в мин/мг белка)

в цитозоле в микросо- мальной фракции ЭРОД МРОД БРОД ПРОД

Панкреатит 2 837±106 30,3±4,8 28,9±2,7 18,9±4,2* 24,0±10,6" 8,4±4,9** 1,3±0,5**

Контроль - 872±26 36,5±1,5 28,6±11,5 55,2±25,8 64,0±3,4 28,2±13,5 8,3±0,02

Панкреатит 4 1380±23 15,3+1,8 10,9±5,4 12,4±0,8** 48,16±2,1** 2,8±0,1** 0,6±0,03"

Контроль 2150+140 13,3±3,1 19,4±5,5 29,4+0,9 69,93±6,3 6,36+0,9 0,7±0,14

Панкреатит 10 740±12,1 27,3+7,5 6,9±0,7 3,17+0,6* 18,33±0,4* 5,96+2,5* 2,4±1,6

Контроль 940±3,4 26,6±4,3 7,9±2,7 6,80+0,2 21,0+1,2 13,6+0,4 3,0±0,9

Примечания.* Р<0,05; ** Р<0,01; п=6

Таблица 2.

Активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы и содержание продуктов ПОЛ при введении индукторов Арохлора 1254 (Ар) и фенобарбитала (ФБ) на фоне острого панкреатита.

Группы животных Время течения болезни в сутках Время экспозиции введенного вещества, ч Содержание цитохрома Р450 пкмоль/мг белка О-деалкилазная активность (пкмоль резоруфина в мин/мг белка) Содержание МДА в печени ммоль/мин/мг

ЭРОД МРОД БРОД ПРОД в цитозоле печени в микросомальной фракции

Панкреатит 2 48, масло 660±80 34,3±3,7" 41,9±б,1** 19,4±0,3 <1,0 46,3+12* 21,2±5,1

Контроль 48, масло 680±13 49,1±1,9 77,3±6,3 18,5±5,1 <1,0 28,1 ±0,6 28,4±9,4

Панкреатит 4 48, масло 560+20 10,9±1,0* 13,9±0,3** 3,3±0,3** <1,0 16,6±5,9 15,0+0,1

Контроль 48, масло 610±20 13,5±0,3 20,2+0,5 14,0±1,0 <1,0 38,6+18,3 14,7+0,47

Панкреатит 10 192, масло 930+9,0 12,06+1,0" 28,3+1,7** 13,0±1,0** 2,2+0,2** 28,1±5,7* 13,5+3,0**

Контроль 192, масло 850±13 8,3±0,4 17,9±1,7 8,1 ±0,9 1,4±0,1 17,6±1,0 6,3±0,6

Панкреатит 2 48, Ар 2320±27 1455±207** 195,5±53,8 165,3±62,5 60,7±4,2 56,1 ±7,9 32,5±5,2

Контроль - 48, Ар 2700±37 1084±77 213,4+46,6 143,4±16,6 75,0±3,5 57,6±8,1 27,6+6,2

Панкреатит 4 48, Ар 2030±36 1365±11 ** 197,8±44 128,7±6,2* 94,3±3,9** 47,2±25 17,7±10

Контроль - 48, Ар 1740+14 870±25 135,5±107 275,7±85,9 34,3±0,4 34,7±3,8 21,2±9,9

Панкреатит 10 192, Ар 3180±60 302+155** 385,8±21,8 132,1 ±40,0 18,6±7,0 38,4±17,3 6,8±1,8

Контроль - 192, Ар 2630±70 696,7±27,8 433,3±32,5 215,0±67,5 16,0±4,5 25,1 ±12,4 5,3±1,5

Панкреатит 4 48, ФБ 2425±41 48,4±3,5** 88,9±7,4** 262,5±8,4* 354±25** 16,0±3,2 10,0±2,17

Контроль - 48, ФБ 1950±40 33,9±2,8 34,9+10,2 171,9±72,2 212,2+32 20,4+6,7 13,3±5,1

Панкреатит 10 192, ФБ 965±30 24,44±3,0* 24,2±3,8" 31,0±12,9 8,3±4,17** 13,1±1,8 9,8±3,2

Контроль - 192, ФБ 910±37 37,9±8,4 33,39±3,2 40,66123,1 16,9±1,8** 12,9±3,3 17,8+7,5

*Р<0,05, **Р<0,01; п=8

Рис. 1. Активность ферментов микросомальной монооксигеназной системы (СУР 1А1, СУР 1А2, СУР 2С6) при введении Арохлора 1.254 на фоне острого экспериментального панкреатита. Показано соотношение скорости реакции О-деалкилирования в печени крыс Арохпор-индуцированных больных панкреатитом к индуцированным маслом больным панкреатитом животным. Контроль - соотношение скорости этой реакции у ложнооперированных Арохлор-индуцированных к индуцированным маслом ложнооперированным животным.

На четвертые сутки заболевания у животных также наблюдается снижение метаболической активности цитохрома Р450, хотя оно менее выражено (от 31 до 67%) (таблица 1): 1А1-7-ЭРОД на 58% (Р<0,01), 1А2-7-МРОД на 31% (Р<0,01), 2С6-БРОД на 53% (Р<0,01), 2В1-ПРОД на 67% (Р<0,01). На десятые сутки заболевания панкреатитом снижение специфической активности изоформ цитохрома Р450 в одних случаях несущественно: 1А2-7-МР0Д на 13% (Р<0,05), 2В1-ПРОД на 19% (статистической достоверности не получено); в других случаях сохраняется до 55% (Р<0,05) для 1А1-7-ЭРОД и до 56% (Р<0,05) для 2С6-БРОД. Следует заметить, что общее количество цитохромов Р450 и Ь5, определяемых спектрально, существенно не изменялось. Полученные результаты свидетельствуют о снижении активности ряда ферментов МОС печени при остром экспериментальном панкреатите, причем степень угнетения активности зависит от выраженности повреждения поджелудочной железы. В ранние сроки (2 и 4-ые сутки) заболевания снижение активности ферментов на 63 -84% свидетельствует об угнетении всех исследуемых изоформ цитохрома Р450. В восстановительный период (десятые сутки) заболевания это уменьшение для CYP 1А1, CYP 1А2, CYP 2В1 и CYP 2С6 сохраняется и составляет 55-56% - для CYP 1А1, CYP 2С6. Активность CYP 1А2 и CYP 2В1 восстанавливалась и приближалась к исходному уровню. Следует отметить, что морфологические изменения печени (на четвертые сутки заболевания наблюдается умеренная зернистая дистрофия, на десятые сутки - выраженная зернистая дистрофия гепатоцитов), коррелируют с изменениями активности ферментов МОС печени. Хотя угнетение конститутивной (неиндуцированной) активности ряда ферментов МОС наблюдается уже на второй день заболевания, морфологические изменения отмечены только к четвертым суткам заболевания (на вторые сутки видимых изменений в печени не выявлено). Т.е. можно заключить, что биохимические изменения в печени предшествуют морфологическим. Таким образом, представленные результаты исследования демонстрируют снижение конститутивной активности исследуемых ферментов МОС при остром панкреатите, что может являться одной из причин снижения детоксикационной функции печени.

Изменение ферментов МОС печени крыс при введении Арохлора 1254 на фоне острого панкреатита

В предыдущей главе было показано, что острый панкреатит приводит к снижению активности некоторых форм цитохрома Р450, что может изменять ее детоксикационную функцию. Для оценки функциональных возможностей печени при этой патологии была исследована способность этих изоформ к индукции при введении Арохлора 1254. В этой серии экспериментов Арохлор 1254 вводили или одновременно с моделированием острого панкреатита, либо на вторые сутки заболевания. Поскольку растворителем для индуктора являлось масло, были проведены эксперименты по влиянию растворителя на изменение активности изучаемых ферментов. У всех экспериментальных животных проводилось морфологическое исследование печени и поджелудочной железы для подтверждения истинности патологии

поджелудочной железы и оценки степени морфологических изменений в этих органах.

Проведенные морфологические исследования показывают, что во всех случаях моделирования патологии поджелудочной железы гистологически достоверно выявлялись признаки течения острого панкреатита. У индуцированных животных с острым двух- и четырехсуточным панкреатитом наблюдались признаки от умеренного до выраженного, местами геморрагического панкреатита. Введение индуктора Арохлора 1254 существенно не изменяло морфологической картины острого панкреатита. В случаях введения масла признаки оментита, панкреатита были более выражены, часто с явлениями перипанкреатита. У всех индуцированных животных с патологией поджелудочной железы в печени наблюдалась либо слабая, либо выраженная гепатодисгрофия. Наряду с морфологическими изменениями в печени при патологии поджелудочной железы наблюдаются изменения активности ряда ферментов детоксикационной системы печени. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2.

Из экспериментов с разной схемой введения масла видно, что как в случае 48-часового, так и в случае 96-часового панкреатита, эффект снижения конститутивных активностей сохранялся. Так, активность ЭРОД при 48-часовом панкреатите была снижена на 30% (Р<0,01), в случае 96-часового панкреатита - на 20% (Р<0.05), МРОД на 32-46% (Р<0,01), БРОД достоверно снижена на 77% (Р<0,01) лишь при 96-часовом панкреатите. Введение крысам Арохлора 1254 сопровождалось почти 3-х кратным увеличением содержания цитохрома Р450, определенного спектрально, тогда как содержание цитохрома Ьб существенно не изменялось. Наряду с увеличением общего количества Р450 происходит и увеличение специфических активностей всех исследованных изоформ, которое зависели от схемы введения индуктора.

В экспериментах с введением индуктора одновременно с ложной операцией отмечается увеличение активностей ЭРОД в 22 раза, МРОД в 2,7 раз и БРОД в 7,7 раз. При введении индуктора через 48 часов после ложней операции происходит увеличение активностей ЭРОД в 64 раз, МРОД в 6,7 раз и БРОД в 19,7 раз.

При введении индуктора одновременно с операцией моделирования острого панкреатита активность ЭРОД увеличивалась в 42 раза, МРОД - в 4,6 раза и БРОД - в 8,5 раз по сравнению с неиндуцированными животными. При введении индуктора на фоне 48-часового панкреатита отмечено увеличение активностей ЭРОД в 125 раз, МРОД - в 14,2 и БРОД - в 39 раз в сравнении с неиндуцированными крысами (рис. 1). Следовательно, при остром панкреатите усиливается индуцибельность изоформ Р450 независимо от сроков введения индуктора, хотя степень увеличения активности ферментов зависит от способа введения Арохлора 1254.

Как видно из таблицы 2, различались и абсолютные значения исследуемых активностей. В печени больных панкреатитом и индуцированных крыс абсолютные значения активности ЭРОД были выше на 26-27% (Р<0,01) по сравнению с контролем во всех случаях, активность МРОД не имела достоверных различий. Активность БРОД в случае введения индуктора на фоне 48-часового панкреатита была ниже на 46% (Р<0,05) по сравнению с

контролем, при 95-часовом панкреатите она была выше на 14% (статистической достоверности не получено).

Таким образом, введение индуктора животным в начале заболевания острым панкреатитом повышает активность исследуемых ферментов. У крыс с острым двух- и четырехдневным панкреатитом, обработанных Арохпором 1254, индуцибельность исследуемых изоформ цитохрома Р450 не только сохранялась, но и была заметно выше по сравнению с ложнооперированными индуцированными животными.

Для изучения отдаленного влияния Арохлора 1254 исследована активность изоформ цитохрома Р450 печени крыс на десятые сутки заболевания индуцированных животных. Индуктор вводили животным на вторые сутки заболевания, при этом экспозиция его составила восемь суток. Представленные морфологические данные свидетельствуют, о том, что у больных панкреатитом животных, получавших масло, практически во всех случаях наблюдается выраженный деструктивный панкреатит с формирующимся заместительным склерозом паренхимы. В печени таких больных наблюдается выраженная гепатодистрофия. У животных с острым панкреатитом, получивших на вторые сутки заболевания Арохлор 1254, в поджелудочной железе - явления пролиферативного панкреатита с переходом органа в склероз; в печени - умеренная гепатодистрофия.

Таким образом, на 10-ые сутки заболевания после моделирования острого панкреатита чаще сохраняются признаки воспаления поджелудочной железы; т.е. признаки слабого панкреатита. У индуцированных Арохлором 1254 животных репаративные процессы в поджелудочной железе более выражены по сравнению с неиндуцированными животными. Индуктор усиливает репаративные процессы в поджелудочной железе.

У таких животных проведено исследование активности изоформ цитохрома Р450. Как видно из таблицы 1, на десятые сутки заболевания отмечается снижение специфической активности изоформ цитохрома Р450: ЭРОД - на 55% (Р<0,05), МРОД - на 13% (Р<0,05), БРОД - на 56% (Р<0,05), ПРОД - на 19% (статистической достоверности не получено) по сравнению с ложнооперированными животными. Следует отметить, что на 10-ый день острого экспериментального панкреатита сохраняется достаточно отчетливое снижение конститутивной активности CYP1A1 и CYP2C, которое зарегистрировано и на ранних сроках заболевания. Конститутивная активность CYP1A2 и CYP2B1 снижена незначительно по сравнению с ранними сроками панкреатита. Для того, чтобы оценить функциональную способность печени в этот период, были исследованы результаты влияния индуктора при введении его в начале заболевания. Поскольку растворителем для индуктора являлось масло, нами поставлены эксперименты по влиянию растворителя на изменение активности изучаемых ферментов (таблица 2). При этом, у животных с острым панкреатитом отмечается некоторое увеличение активности изоформ Р450 по сравнению с ложнооперированными крысами: ЭРОД - на 45% (Р<0,01), МРОД - на 58% (Р<0,01), БРОД - на 61% (Р<0,01), ПРОД - на 53% (Р<0,01), причем общее количество цитохрома Ь5 и Р450 существенно не отличалось от исходного уровня. Т.е. в отдаленные сроки острого панкреатита отмечается некоторый индуцирующий эффект масла.

Абсолютные значения исследуемых активностей как у больных, так и у здоровых крыс достоверно не различались, за исключением ЭРОД, где отмечено ее снижение на 67% (Р<0,01) у индуцированных больных панкреатитом крыс по сравнению с контролем (таблица 2). Как у индуцированных так и у больных панкреатитом животных, через четверо суток после введения индуктора (что соответствует 10-ти суткам заболевания или ложной операции) эффект индукции сохраняется. У ложнооперированных животных индекс индуцибельности (увеличение активности по сравнению с контролем) равен для ЭРОД - 83, МРОД - 24, БРОД - и ПРОД - 26 и 11, соответственно. У больных панкреатитом крыс этот индекс для ЭРОД составил 25, для МРОД -13, для БРОД - 10, а для ПРОД - 8,4 (рис. 1) Из этих данных следует, что «выход» из индукции происходит быстрее у больных панкреатитом животных. Общее количество цитохрома Р450 к этому времени еще остается высоким, а количество Ь5 сохраняется на исходном уровне.

Таким образом, полученные результаты показывают, что снижение конститутивной активности изоформ цитохрома Р450 (1А1, 1А2, 2В1, 2С6) в печени крыс при изучаемой патологии поджелудочной железы сохраняется на 10-ые сутки заболевания. Выявленные различия в индуцированных активностях ферментов МОС при остром панкреатите также свидетельствуют о том, что эта патология влияет не только на конститутивную активность, но и на индуцибельность изоформ цитохрома Р450. Вопрос о механизме изменения их конститутивной активности и индуцибельности при остром панкреатите остается невыясненным. Пока лишь можно предполагать, что одной из причин указанных выше различий могут быть изменения в метаболизме эндогенных соединений (витаминов, гормонов, простагландинов и др.), которые, в свою очередь, могут модулировать систему метаболизма ксенобиотиков в печени через изменение активности монооксигеназ. Другим возможным объяснением могут быть полученные в последнее время доказательства усиления перекисного окисления липидов при остром панкреатите [Савельев В. С. и др., 1983; Любицкий О.Б.и др., 1998]. Тогда снижение активности СУР может происходить за счет изменения его фосфолипидного окружения, вызванного свободно-радикальными механизмами.

Влияние фенобарбитала на ферменты МОС печени крыс при остром панкреатите

Выше был рассмотрен эффект влияния Арохлора 1254 на активность МОС печени при остром панкреатите у крыс. Поскольку Арохпор 1254 в большей степени повышает активность ферментов СУР 1А подсемейства, активность и динамика изменения цитохрома Р450 2В и 2С подсемейства была не совсем отчетливой. Принимая во внимание тот факт, что последние метаболизируют ряд лекарственных препаратов (барбитураты, снотворные), используемых при этой патологии, а также то, что фенобарбитал является лекарственным препаратом, были проведены эксперименты по влиянию этого лекарства на активность ферментов МОС. Проводимые биохимические исследования сочетали с морфологическими не только для подтверждения истинности патологии, но и для оценки динамики патологического процесса при введении индуктора больным животным. Морфологические данные

указывают на менее выраженные изменения в поджелудочной железе и печени у индуцированных фенобарбиталом здоровых животных по сравнению с индуцированными Арохлором 1254 и неиндуцированными, страдающими панкреатитом крысами. Введение фенобарбитала на вторые сутки заболевания влияет на динамику течения панкреатита, снижая степень деструктивных изменений в поджелудочной железе, как это следует из морфологической картины. Одной из основных характеристик цитохрома Р450 является способность его изоформ к индукции под воздействием различных ксенобиотиков, в частности, барбитуратов и другими лекарственными препаратами. Поэтому представлялось важным сравнить индуцибельность изоформ CYP на модели острого панкреатита и «ложной» операции при введении животным индуктора цитохромов Р450. У больных острым панкреатитом крыс (как и у ложнооперированных) введение фенобарбитала сопровождалось почти двухкратным увеличением содержания общего цитохрома Р450, определенного спектрально, тогда как содержание Ь5 существенно не изменялось. Наряду с увеличением общего количества Р450 отмечено и увеличение специфических активностей исследуемых изоформ (таблица 2). У индуцированных ложнооперированных животных на четвертые сутки отмечено, что индекс индуцибельности для БРОД составлял 28,8, для ПРОД - 33,4, а для ЭРОД - 1,2. Отмечено снижение МРОД в 2,4 раза в сравнении с неиндуцированными животными. Следует заметить, что фенобарбитал не оказывает существенного влияния CYP1A1 и CYP1А2, о чем свидетельствуют относительно низкие активности ЭРОД и МРОД. Его индуцирующий эффект, как описано ранее [Waxman D.J., Azaroff L., 1992], проявляется для цитохромов Р450 семейства 2, а именно CYP2B1 и CYP2C6. При индукции животных с острым двухсуточным панкреатитом отмечается увеличение БРОД в 89,2 раз, ПРОД - в 166 раз, ЭРОД - в 3,9 раз, МРОД - в 1,86 раз в сравнении с неиндуцированными больными животными. Сравнивая эффект фенобарбитала на здоровых и больных животных, можно видеть, что у последних индуцирующий эффект существенно выше, как и абсолютные значения исследуемых активностей (рис. 2). Так, в печени индуцированных страдающих панкреатитом крыс абсолютные значения активности БРОД были выше на 47% (Р<0,05) , ПРОД - на 67% (Р<0,01), ЭРОД - на 42% (Р<0,01), МРОД - на 154% (Р<0,01), по сравнению с ложнооперированными индуцированными животными.

Таким образом, применение фенобарбитала в начале заболевания острым панкреатитом не только индуцирует ферменты детоксикационной системы печени, но и уменьшает степень воспалительных изменений в поджелудочной железе и печени.

Для изучения отдаленного действия фенобарбитала на МОС печени при остром панкреатите проведено изучение активности изоформ цитохрома Р450 у животных с патологией поджелудочной железы, получавших фенобарбитал в течение четырех суток, начиная с третьего дня острого панкреатита. Сравнивая представленные морфологические данные, следует заметить, что у индуцированных больных панкреатитом животных в поджелудочной железе наблюдается лишь интерстициальный отек, панкреатита нет, в то время как у неиндуцированных животных сохранялись признаки слабого серозного

интерстициального панкреатита, т.е. фенобарбитал уменьшает степень воспалительных изменений в поджелудочной железе. У этих экспериментальных животных была исследована активности ферментов МОС печени 10-ые сутки заболевания, т.е. спустя четверо суток после последнего введения индуктора. К этому времени, после введения фенобарбитала, у ложнооперированных животных происходит значительное снижение активности по сравнению с индуцированными на четвертый день животными БРОД и ПРОД (в 4,2 и 12,5 раз, соответственно), но не до контрольного уровня. Эффект индуктора на ЭРОД и МРОД активности в данной экспериментальной группе сохранялся.

У индуцированных больных панкреатитом крыс отдаленное влияние фенобарбитала несколько отличалось от описанного выше. Скорость биотрансформации бензилоксирезоруфина и пентоксирезоруфина снижается к 10-ым суткам заболевания быстрее, чем у ложнооперированных животных (в 8,4 раз и 42,6 раз, соответственно), однако в отличие от контрольных крыс, происходит снижение скоростей окисления этоксирезоруфина и метоксирезоруфина (в 2 и 3,6 раз, соответственно). Следует отметить, что на десятые сутки после моделирования острого панкреатита абсолютные значения исследуемых активностей остаются выше у индуцированных больных крыс, чем у контрольных.

Таким образом, фенобарбитал, являясь лекарственным препаратом, с одной стороны, стимулирует активность монооксигеназ, с другой -обеспечивает достаточно быстрый возврат их индуцированной активности к исходному уровню. Все это может говорить о том, что это лекарство, увеличивая активность цитохрома Р450 при остром панкреатите, может влиять на фармакокинетику лекарственных препаратов, используемых в терапии этого заболевания. В любом случае, при остром панкреатите необходима коррекция ферментов МОС, которая может предполагать применение фенобарбитала в терапии этого заболевания. В пользу этого могут служить данные гистологического анализа, демонстрирующие положительный эффект фенобарбитала на динамику воспаления поджелудочной железы.

Исследование активности ферментов печени человека при остром панкреатите билиогенного генеза

Проведено исследование активности некоторых изоформ цитохрома Р450 в печени и аминотрансфераз в плазме у 15 больных с патологией поджелудочной железы. Группу составили 12 женщин и 3 мужчин, у которых причиной панкреатита была желчнокаменная болезнь.

У пациентов с хроническим панкреатитом билиогенного генеза в стадии ремиссии (7 человек) показатели активности CYP 1А1 составили 8,3±3,8Э, 1А2 - 8,3+3,5, 2С6 - 7,4±7,3, 2В1 - 3,3+3,2 пкмоль/мин/мг. Все обследованные больные не страдали какими-либо заболеваниям печени: исключены гепатиты, в т. ч. вирусные, и не отмечалось явлений холестаза. При исследовании ACT и АЛТ их уровень активности не отличался от контрольного.

В остром периоде заболевания (8 человек) у некурящих пациентов активность исследуемых изоформ цитохрома Р450 была супрессирована на

60-80% по сравнению с хронической формой в стадии ремиссии. Показатели активности CYP1A1 составили в среднем 0,81+0,9 (Р<0,01) , CYP 1А2 -1,67±1,0 (Р<0,01), CYP 2С6 - 0,58±0,5, CYP 2В1 - 0,1+0,01 (Р<0,05) пкмоль/мин/мг. Активность ACT И АПТ не отличалась от контрольного.

В печени курящих больных с острым панкреатитом активности изоформ цитохрома Р450 значительно увеличены: CYP1A1 в 10 раз (Р<0,05), CYP1A2 в 5 раз (Р<0,05), CYP 2С6 в 4 раза (Р<0,05), CYP 2В1 в 3 раза (Р<0,05) по сравнению с больными с хронической формой заболевания. Возможно, что причиной этого может быть индуцирующий эффект ПАУ (полициклических ароматических углеводородов) и других соединений, содержащихся в сигаретном дыме. Активность ACT и АЛТ у этих больных существенно не отличалась от контрольного. Следует заметить, что активность исследуемых аминотрансфераз повышается лишь в более поздние сроки заболевания.

Проводя анализ вышеизложенных данных можно отметить, что на активность изоформ цитохрома Р450 печени оказывает влияние не только индуцирующие факторы (курение), но и острый воспалительный процесс в поджелудочной железе, приводящий к значительному снижению их активности. Измененние активности аминотрансфераз (ACT и АЛТ) является менее чувствительным показателем изменений функции печени. Таким образом, в ранние сроки заболевания острым панкреатитом наблюдается снижение активности ферментов МОС, тогда как в болез поздний период болезни повышается активность ACT и АЛТ.

Динамика активности глготатион S - трансферазы при остром панкреатите и при применении индукторов в различные сроки заболевания

Для изучения динамики изменений ферментов второй фазы детоксикации при остром панкреатите исследовалась активность ключевого фермента - глютатион S - трансферазы (ГЭТ) в цитозоле фракции печени. Результаты исследований представлены на рис. 2 А.

На вторые сутки заболевания отмечается увеличение количества ГЭТ в 2,2 раза (Р< 0,01), на четвертые сутки - в 2 раза (Р< 0,05) по сравнению с контрольным уровнем. К десятому дню болезни регистрируется некоторое снижение активности этого фермента в сравнении с четвертыми сутками заболевания, однако ее уровень был в 1,5 раз выше в сравнении с исходным контрольным уровнем (Р< 0,01). Таким образом, представленные результаты указывают на активацию ферментов второй фазы, в частности ГЭТ, при остром экспериментальном панкреатите у крыс.

Для оценки влияния индукторов на активность ГЭТ печени при остром панкреатите проведены эксперименты с разной схемой введения индукторов (Арохлор 1254 и фенобарбитал) на фоне моделирования патологии поджелудочной железы. На рис. 2 (Б, С) представлены данные активности ГЭТ при различных схемах введения индукторов на фоне острого панкреатита.

При одновременном введении Арохлора 1254 и моделировании острого панкреатита на вторые сутки заболевания активность ГЭТ была в 1,8 раз ниже (Р< 0,01), чем у ложнооперированых индуцированных крыс, этот же эффект

отмечен и при введении вместо индуктора масла. Активность ГБТ у больных панкреатитом крыс была в 1,4 раз ниже по сравнению с ложнооперированными животными, которым вводилось масло.

> На четвертые сутки в серии экспериментов при введении индуктора (Арохлор 1254) во второй день заболевания активность ГБТ была снижена в 1,8 раз по сравнению с индуцированными ложнооперированными животными. При введении масла больным животным активность ГБТ была в 2 раза меньше по сравнению с ложнооперированными, получавшими масло животными (Р< 0,01).

На десятый день заболевания животных, которым на вторые сутки болезни был введен Арохлор 1254, регистрировалось снижение активности ГЭТ в 1,3 раза по сравнению с ложнооперированными индуцированными животными (Р< 0,05). У больных крыс при введении масла в те же сроки активность ГБТ была в 1,4 раза ниже по сравнению с ложнооперированными, получавшими масло животными (Р< 0,05). При сравнении активности Г8Т у индуцированных больных панкреатитом крыс с больными животными, получавшими масло (индуктор или масло вводили на второй день заболевания) выявлено снижение активности ГЭТ у индуцированных больных крыс в 1,5 раз (Р< 0,05), на четвертый день заболевания существенных различий нет, на десятый день заболевания активность ГБТ у больных индуцированных животных была выше в 1,2 раза (Р< 0,05) в сравнении с больными крысами, получавшими масло.

У ложнооперированных животных введение Арохлора 1254 повышает активность ГЭТ: на вторые сутки в 1,3 раза (Р< 0,05), на четвертые сутки в -1,5 раз (Р< 0,05), а на десятые сутки достоверных различий с контролем нет. Аналогичные эксперименты проведены с другим индуктором -фенобарбиталом. В этих экспериментах результаты были схожи с вышеизложенными. На четвертый день течения острого панкреатита у животных, которым со второго дня заболевания вводился фенобарбитал, активность ГЭТ была ниже в 2,1 раза ниже по сравнению с ложнооперированными индуцированными животными (Р< 0,05).

При введении фенобарбитала со второго дня течения болезни к десятому дню активность ГБТ не отличалась от контрольного уровня.

При введении фенобарбитала ложнооперированным животным спустя двое суток после операции наблюдается повышение активности ГБТ: на четвертые сутки в 1,4 раза (Р< 0,05), на десятые сутки в 1,2 раза (достоверности не получено). Применение фенобарбитала, в качестве индуктора, в подобных экспериментах демонстрирует такие же результаты, как и при введении Арохлора 1254.

Введение индуктора (Арохлора 1254) больным панкреатитом животным способствует снижению активности ГЭТ: на вторые сутки в 2,9 раз (Р< 0,01), на четвертые сутки в 2,5раза (Р< 0,01), на десятые сутки в 1,2 раза (Р< 0,01). Введение фенобарбитала со вторых суток заболевания больным панкреатитом животным способствует снижению активности ГБТ: на четвертые сутки в 3,1 раз (Р< 0,05), на десятые сутки активность ГЭТ не отличалась от контрольных цифр.

А)

Джнвмяа« ийиемепяй вжгмвдгоо'пс глотстмлх пр*с осп^к' тигрввпсге.

2 суток -. 4 еугол. • сутол

Б)

- Дянвняя« пгиюиений ак'жввостк гямчатион г-т^аясфвра»« при в»«хеккн Арохиор» 125 4 на фоне лсгрог© ланлреатитд.

2. еу?о*.

.4 су-гол

В)

. Диид«*** . *йг*м«*ея»&- лжгжтасчге ггамглънон

оря в&елеии* {долоба^бмтажА «а фоне острога п«искрелтагл,

-—......*■.-..,....-........—.....................

!

-509 400 300 10В 100

Панкреатит

Кох'гринь

гЬ

', ' 2 сутоп . : 4 сугезя 10 суток ••

Рис. 2. Изменение активности гяютатион Б-трансфераз о! В ПВЧОНИ при остром панкреатите и на фоне введения индукторов. (* - Р<0,05, ** - Р<0,01)

Таким образом, при остром панкреатите у экспериментальных животных наблюдается повышение уровня FST в ранние (2-4 день) сроки заболевания, что возможно обусловлено активацией перекисного окисления липидов при этом заболевании. В пользу этого предположения могут говорить данные, указывающие на участие TST в детоксикации различных альдегидов, образующихся при окислении мембранных липидов [Ria V. M. Е., Bladeren V. P. J., 1990]. Проведенные исследования с применением индукторов на фоне патологии поджелудочной железы демонстрируют, что введение Арохлора 1254 или фенобарбитала повышает активность TST у контрольных (ложнооперированных) животных, что обусловлено, как показано другими авторами, увеличением количества мРНК [Ding G. J. F. et al., 1986]. Введение индуктора больным животным в ранний период болезни приводит к значительному снижению уровня TST; к десятому дню заболеванию уровень TST все еще остается ниже исходного. Механизм такого эффекта действия индуктора при остром панкреатите у экспериментальных животных не ясен, и требует дальнейшего изучения. Возможно, введение индуктора на фоне панкреатита активирует синтез физиологических ингибиторов TST. Представленные исследования указывают на активацию некоторых ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков при остром панкреатите. Введение индукторов при этом заболевании снижает уровень TST.

Следовательно, патология поджелудочной железы - острый панкреатит влияет на активность ферментов как первой фазы, так и второй фазы.

Содержание продуктов ПОЛ и а-токоферола в ткани поджелудочной железы и плазме при остром панкреатите

Результаты исследования содержания продуктов ПОЛ (малонового диальдегида) и важнейшего жирорастворимого антиоксиданта (а-токоферола) в ткани поджелудочной железы и плазме при остром экспериментальном панкреатите крыс в первые сутки заболевания представлены в таблице 3. Выявлены происходящие в течение первых суток течения острого панкреатита заболевания фазовые изменения содержания продуктов ПОЛ и токоферола в ткани поджелудочной железы. Активация ПОЛ через 2 часа совпадает с фазой начала деструкции ацинарных клеток поджелудочной железы, о чем свидетельствуют данные морфологических исследований [Савельев В. С. и др., 1983]. Накопление продуктов ПОЛ приводит к активации фосфолипазы А [Anderson М.С., Schiller W.R., 1973], которую считают одним из основных патохимических факторов, обуславливающих аутодигестивные процессы в поджелудочной железе за счет повреждения клеточных мембран [Libeder A.V. et al., 1989]. В плазме крови отмечается постепенное динамическое увеличение количества продуктов ПОЛ. Причиной наблюдающейся стабилизации ПОЛ в ткани поджелудочной железы, возможно, становится стрессорная активация систем антиоксидантной защиты. О ней может свидетельствовать увеличение содержания а-токоферола в поджелудочной железе уже через 30 минут после начала заболевания, которое, таким образом, опережает накопление продуктов ПОЛ.

Следующий подъем МДА в 1,5 раза отмечается через 10 часов. К этому времени в поджелудочной железе возникают множественные кровоизлияния, и

в междольковой соединительной ткани выявляются очаги круглоклеточной инфильтрации, куда мигрируют преимущественно нейтрофилы. Известно, что активированные клетки - эффекторы воспаления (они в очаге, несомненно, в активном состоянии) продуцируют активные формы кислорода и могут приводить к чрезмерной интенсификации ПОЛ, о чем и свидетельствует четырехкратное увеличение содержания МДА к 20-му часу заболевания.

Таким образом, динамика изменений МДА в ткани поджелудочной железы в первые часы развития острого панкреатита вполне объяснима с традиционных позиций.

Таблица 3.

Содержание малонового диальдегида и а-токоферола в поджелудочной железе и плазме крыс с острым панкреатитом

Время Количество МДА в МДА, а-токоферол а-

течения животных плазме нмоль/г в плазме токоферол,

панкреатита ткани мкг/ЮОг

в часах. ткани

Контроль 12 2,9 ±0,36 11,7 + 0,7 0,58 ± 0,3 2,34+0,28

0,5 9 3,6 ± 0,4 14,6+1,4 0,59 ±0,17 3,74 ± 0,26*

1 8 - 11,0 ±0,71 - 1,77 ±0,31

2 9 3,7 ± 0,73 17,6 ±2,4* 0,3 + 0,1 1,83 ±0,22

3 10 3,1 ±0,34 10,4 ±0,81 0,8 ±0,1 1,80 ±0,27

4 10 3,8 + 1,1 12,0 + 0,36 0,83 + 0,14 1,76 ± 0,17

6 12 4,4 ±0,15 12,0 ±0,42 0,44 ±0,06 1,39 ±0,09*

10 8 - 17,3 ±2,2 - 2,62 ± 0,22

15 8 - 20,0 ±1,1* - 6,24 ±0,01*

20 8 - 51,0 ±7,7* - 4,0 ±0,72*

Примечание: *Р<0,05 по сравнению со значениями данного показателя в

контрольной группе.

Характер изменения содержания а-токоферола в ткани поврежденного органа оказался более неожиданным. Факты увеличения содержания витамина Е в тканях при различных патологических процессах в организме известны [Steinbrecher U.P., 1990]. Причину повышения его содержания в 1,6 раз уже через 30 минут после операции можно объяснить компенсаторной

мобилизацией и перераспределением а-токоферола в организме. Известно, что при стрессе мобилизация эндогенных запасов а-токоферола происходит с участием катехоламинов [Колосова Н. Г. и др., 1985; Голиков П. П. и др., 1987]. По данным Айдарова М.А. с соавт. уровень катехоламиноз при панкреатите значительно повышается уже в первые часы заболевания [Айдаров М. А. и др., 1978]. Однако повышенный расход антиоксиданта в очаге воспаления приводит к его дефициту. И можно видеть его снижение со 2-го по 6-й час заболевания не только относительно повышенного через 30 минут, но и по сравнению с контролем. В плазме крови также наблюдается пик снижения его уровня ко второму часу заболевания, а в дальнейшем (с 3-й по 4-й час) его уровень увеличивается, возможно, за счет эндогенных резервов, истощение которых наблюдается к 6-му часу заболевания, о чем свидетельствует снижение уровня этого антиоксиданта. В ткани поджелудочной железы с 10-го часа заболевания сохраняется повышенное содержания а-токоферола. К 15-му часу его содержание в 2,5 раза выше, чем у контрольных животных, что может свидетельствовать о перераспределении эндогенного а-токоферола в пользу очага воспаления.

Таким образом, к концу первых суток уровень а-токоферола в ткани поджелудочной железы у больных в 1,8 раза выше, чем у контрольных животных, а в плазме наоборот ниже на 30% исходного уровня. Изложенное выше позволяет считать, что свободно-радикальные процессы являются одним из значимых составляющих в патогенезе панкреатита. Интенсификация реакций ПОЛ является не только неспецифическим индикатором острого панкреатита в первые часы, но и компонентом пускового механизма перестройки метаболизма в органе. Одновременно с интенсификацией ПОЛ происходит последовательная активация факторов антиоксидантной защиты. Снижение уровня а-токоферола в первые часы заболевания может указывать на необходимость профилактической терапии при остром панкреатите. Прикладное значение выявленных фактов заключается в том, что терапия острого панкреатита может быть успешной только тогда, когда в ее составляющих будут способы, корригирующие свободно-радикальные процессы и тем самым нормализующие явления перекисного окисления липидов.

Содержание продуктов ПОЛ в цитозоле и микросомах печени у больных панкреатитом крыс и на фоне введения индукторов

Результаты исследования уровня МДА в микросомах и цитозоле печени у крыс с острым панкреатитом представлены в таблице 1. Видно, что уровень МДА на 2, 4,10 сутки заболевания острым панкреатитом крыс не отличался от уровня здоровых животных. Следовательно, при патологии поджелудочной железы процессы перекисного окисления липидов в печени животных больных острым панкреатитом не изменяются.

Исследование влияния индукторов на перекисное окисление липидов выявило повышение продуктов ПОЛ в цитозоле печени у индуцированных животных (таблица 2). Через двое суток после введения Арохлора 1254 у индуцированных здоровых крыс наблюдается увеличение содержания

продуктов ПОЛ в цитозоле в 1,8 раз (Р< 0,01) по сравнению с неиндуцированными здоровыми животными. На четвертые сутки после введения Арохлора 1254 уровень МДА в цитозольной фракции печени не отличался от уровня у неиндуцированных контрольных животных. Спустя 8 суток с момента введения индуктора Арохлора 1254 наблюдается повышение уровня МДА в 1,4 раза (различия не достоверны) по сравнению с контрольным уровнем МДА в цитозоле печени. При исследовании уровня МДА в микросомальной фракции печени у индуцированных здоровых существенных различий по сравнению с неиндуцированным животными животных не выявлено.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о влиянии индуктора (Арохлора 1254) на уровень ПОЛ в цитозольной фракции печени. Введение этого индуктора не оказывает влияния на уровень ПОЛ в микросомах печени крыс.

Проведено изучение влияния этих индукторов на свободно-радикальные процессы в различные сроки заболевания животных острым панкреатитом (таблица 2). У животных с одновременным введением Арохлора 1254 и моделированием острого панкреатита в микросомальной фракции печени наблюдается повышение уровня МДА в 1,2 раза (различия не достоверны), тогда как у ложнооперированных животных используемый индуктор не оказывает влияния. В цитозоле больных и индуцированных таким же образом животных также наблюдается повышение уровня МДА в 1,2 раза (достоверности не получено), но индуцирующий эффект был меньше на 60% по сравнению с ложнооперированными индуцированными животными. На четвертые сутки течения панкреатита при введении Арохлора 1254 на вторые сутки заболевания наблюдается повышение содержания продуктов ПОЛ в цитозоле в 2,6 раза (Р< 0,05), в то время как у контрольных (ложнооперированных) животных этот индуктор не оказывал влияния на процессы ПОЛ. У больных панкреатитом и индуцированных таким же образом животных в микросомальной фракции существенных различий с контрольным уровнем не отмечено. Введение Арохлора 1254 на вторые сутки заболевания острым панкреатитом вызывает к 10-ым суткам болезни повышение уровня МДА в цитозоле в 1,4 раза (различия не достоверны), что не отличалось от уровня МДА у ложнооперированных индуцированных животных. В микросомах печени у индуцированных больных панкреатитом животных к этому времени различий со здоровыми индуцированными животными не наблюдалось.

Введение фенобарбитала на вторые сутки заболевания животных острым панкреатитом к четвертым суткам выявило снижение уровня МДА в цитозоле ложнооперированными животными, но этот уровень близок к уровню МДА в цитозоле гепатоцитов у больных в течение 4-х суток панкреатитом крыс. В микросомах у этих животных наблюдалось снижение уровня МДА в 1,3 раза (достоверности не получено) по сравнению с индуцированными ложнооперированными животными; эти показатели также сходны с показателями уровня МДА в микросомах животных с четырехсуточным панкреатитом. К 10-м суткам заболевания крыс острым панкреатитом (при введении фенобарбитала в течение 4-х суток со вторых суток заболевания) в цитозоле печеночных клеток наблюдается снижение уровня МДА в 2 раза (Р<0,05) по сравнению с неиндуцированными больными панкреатитом

животными, но он не отличался от уровня у индуцированных ложнооперированных животных. В микросомах к этому времени наблюдается повышение МДА в 1, 4 раза (различия не достоверны) по сравнению с неиндуцированными больными панкреатитом животными, но был ниже в 1,8 раз по сравнению с уровнем МДА у индуцированных здоровых животных.

Представленные данные указывают, что активации процессов ПОЛ в печени при остром панкреатите не наблюдается. После введения индуктора выявлена активация ПОЛ в печени как у здоровых, так и у больных панкреатитом животных, что согласуется с данными Бакибаева А. А. с соавт., которые указывают что введение здоровым крысам индукторов МОС, в частности фенобарбитала, повышает интенсивность ПОЛ [Бакибаев А. А. и др., 1995]. После введения фенобарбитала наблюдается резкое увеличение содержания продуктов ПОЛ в фазе индукции цитохрома Р450 [Каган В. Е. и др., 1984]. Введение полихлорированных бифенилов наряду с повышением активности монооксигеназ, также сопровождается стимуляцией реакций ПОЛ, что согласуется с данными Лашневой Н. В. с соавт. [Лашнева Н. В. и др., 1985].

Таким образом, проведенные исследования позволяют считать, что патология поджелудочной железы не влияет на интенсификацию свободно-радикальных процессов в печени.

ВЫВОДЫ

1. Острый панкреатит как в клинике, так и в эксперименте сопровождается изменением активности ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени.

2. В ранние сроки острого панкреатита наблюдается снижение активности цитохромов Р450: 1А1, 1А2, 2В1, 2С6 в печени более, чем на 60%, при этом общее содержание цитохрома Р450 не изменяется.

3. Острый панкреатит сопровождается 2-х кратным повышением активности глютатион Б-трансферазы печени крыс.

4. Индуцибельность цитохрома Р450 после введения Арохлора 1254 или фенобарбитала у крыс в различные сроки заболевания острым панкреатитом повышена.

5. Индуцированная активность глютатион 8-трансферазы при введении Арохлора 1254 или фенобарбитала на фоне острого панкреатита снижалась более, чем на 80%.

6. В ткани поджелудочной железы в первые часы острого панкреатита наблюдается активизация как процессов перекисного окисления липидов, так и факторов антиоксидантной защиты. Содержание продуктов ПОЛ в печени не изменялось.

7. При остром панкреатите Арохлор 1254 снижает степень морфологических изменений в печени, а фенобарбитал - интенсивность воспаления в поджелудочной железе.

Практические рекомендации

1. При остром панкреатите необходимо исследовать актив! ¡ость ферментов 1 и 2 фазы метаболизма ксенобиотиков для выявления сгепени нарушений детоксикационной функции печени.

2. Положительное влияние индукторов на динамику течения панкреатита требует дальнейшего изучения для использования в клинической практике.

3. Активация процессов перекисного окисления липидов в поджелудочной железе в первые часы заболевания указывает на необходимость применения экстракорпоральных методов детоксикации в кратчайшие сроки с момента поступления больного с острым панкреатитом в стационар.

4. Для снижения интенсивности деструктивных изменений поджелудочной железы и коррекции функциональной способности печени при остром панкреатите в комплекс медикаментозного лечения возможно включение известного лекарственного препарата - фенобарбитала.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Прокопьева Н. В., Гуляева Л. Ф., Полякова Н. Е. Характеристика микросомальной гидроксилирующей системы печени при остром панкреатите. // Материалы международного симпозиума «Проблемы лимфологии и эндоэкологии». - Новосибирск. -1998. - С. 230-231.

2. Прокопьева Н. В., Айзман Я. И. Оценка дегоксикационной системы у хирургических больных. // Тез. докладов «Современные методы диагностики в ЦКБ СО РАН». - Новосибирск. - 1998. - С. 48-49.

3. Прокопьева Н. В., Гуляева Л. Ф., Полякова Н. Е. Изменения микросомальной монооксигеназной системы печени при индукции фенобарбиталом на фоне острого панкреатита. // Вопр. мед. химии. - 1999. -Т. 45,-№4. -С. 321-325.

4. Прокопьева Н. В., Гуляева Л. Ф. Изучение ферментов детоксикационной системы печени у больных с панкреатодуоденальной патологией. // Тез. докладов «Новые технологии в хирургии». - Новосибирск. - 1999. - С. 216218.

5. Прокопьева Н. В., Гуляева Л. Ф. Изучение ферментов первой и второй фазы метаболизма ксенобиотиков и перекисного окисления липидов в печени при остром панкреатите. // Бюллетень Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. -1999. - №3/4. - С. 50-56.