Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состав белков и резистентность мембран клеток при остром панкреатите (клинико-экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав белков и резистентность мембран клеток при остром панкреатите (клинико-экспериментальное исследование)"

ШШСТЕРСТВО ЗЕРАВиОХРАШБМ РОЬСР РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДОНЕЦ НАРОДОВ ШВДШСКИВ ИНСТИТУТ

На празак рукописи

КАЛШЖОВА шт. АЛЕКСАНДРОВНА

СОСТАВ БЕЛКОВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЫШЕРЛН КЛЕТОК ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ (1Ш1НИКО-ЭКСПЕРЙШШЛШОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

. 03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических паук

Ростов-йанДопу 1691 г.

Работа выполнена в Ростовской ордена Друкбы народов медицинском институте.

НАУЧНЫЕ РУКОЮдаГЕЛИ: заслуженный деятель неуки РСФСР и

КАССР, доктор ывдецшсяих наук профессор В.И.РУШ0Б

доктор ыедицкнекшс науи, профессор А.Б.ШНШНВ

ОЩШЫШВ ОШОНЖШ: доктор биологических Еаук,

старший научный сотрудник З.И.МШШШОВИЧ ■

• доктор бшгшгычешшх паук, профессор Т.Н.П0Г0РЕШЗА

Ведущая организация - Ростовский ордзна Трудового Красного Знамея государственный университет.

Зсакта состоится 21 января 1222 г. в 12 часов на заседании специализированного совета Д 064.53.01 при Ростовском ордена Другбы народов иедицинском институте. (344718, г.Ростов-на-Дону, Назгачевадскийпер. ,29). „

С диссертацией ькдано озне&ощсгься в библиотеке мздкщшского института.

Автореферат разослан 20 декабря 1921 г.

УчеяыА секретарь спецнализирозашюго Совета, доцент

И.ЯДорганов

Р

в

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Проблема острого панкреатита является одной из самых актуальных в пеоглог-пой абдоминальной хирургии. В последний десятилетия отмечается рост заболеваемости острым панкреатитом, особенно среди лад работоспособного возраста, увеличение частоты деструктивных форм, летальность при которых достигает 30~45% и более (Шалимов и соавт., 1990; Филин и соавт.,1991).

Острый панкреатит, характеризующийся наличие,; воспалительных изменения в поджелудочной железо в виде отека, геморрагического и нирового некроза, часто сочетается с другими заболеваниями органов келудочно-кнтачного тракта, коает развиться вторично после хирургических вмешательств, травма, медикаментозных воздействия, алкогольных отравлений н перехолить в хроническую форму (Лупальцов, 1388; Постникова и соавт., 1283; Дмитриев я соавт.,1969; »отАг^ » 1984; 316 001. с* а1. ,1986; Ьогепг а г еХ. ,1987).

Решение проблемы острого панкреатита требует углубленного исследования его патогенеза с помощьо широкого спектра медкко-Сиоло-гических наук и в том числе биохимик. Следует особо подчеркну«, необходимость изучения биомембрак, определявдая роль которых в функционировании клетки и субклеточных структур становится все более очевидной. • -

Данные литература указывают на нарушение основных звеньев метаболизма при острой патологии поджелудочной железы (Лкшкя и соавт., 1089; Качалов,1990; Ийзапег в* аХ. ,1969; Зрогиакп в« аХ., 1989). "

Имеются едиплчкые сведения о модификация лкпидного состава мембран сритроцнтов при остром наккреатите (Рубин, Иехов,19в4; Русаков и соавт.,1989). Однако, практически отсутствует материалы, касающиеся состояния белков клеточных мембран при данном заболевании. В связи с этим изучение мембранных белков, а также покаэате- • лей, характеризующих степень резистентности мембран клеток, «оде? способствовать формированию болев глубоких представлений о патоге-йезо острого панкреатита а открыть новие пути коррекции патологического процесса на молекулярном уровне.

Цель в задачи я с. следования. Цель» рабстц явилось изучение резистентности ыеибравяих структур по данным анализа состава белков мембран эритроцитов к активности ыемб-раносвяэанных ферментов при разннх формах острого панкреатита в

эксперименте а клинике, выявление информативных показателе8 оценки тяжести процесса, разработке с особа коррекция состояния клеточных мембран.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи.

1. В эксперименте ва модели острого панкреатита, позволяющей воспроизводить отечную, геморрагичесжую, гнойную и. некротическую формы, заболевания, изучить белковый состав мембран эритроцитов.

2. Определить аминокислотный состав белков мембран эритроцитов ори ррзшас формах экспериментального острого панкреатита ООП).

3. Изучить проницаемость эритроцктарннх ыекброи (ПЗМ), содержание, внеэритродатариого гемоглобина (ВЭГ) и активность гузаозо-б-фосфаадегидрогенагн (Г-6-ФДГ) в сыворотке крови крыс с о?едаой

и геморрагической формами острого панкреатита.

4. Определить активность кислых протеиназ, кислой а щелочной фосфатаз в тканях печени'в почек крыс с отечной и геморрагической формами острого панкреатита. °

5. Оценить состояние мембраз эритроцитов у животных о разными формами острого панкреатита после введения препарата антиокси-даятных ферментов - супероксиддисиутазы (СОД) и каталазы.

6. В клинике у больных ост|гни панкреатитом (ОД) и острт хо-лецистопанкреатитом (ОХИ) исследовать ШИ, содержание ВЭГ и средних молекул (СМ), активность Г-6-ЗДГ, кислой и щелочной фос-фатаз в сыворотке крови.

Научная новизна.

1. Разработана оригинальная модель острого панкреатита, позволяющая воспроизводить отечную, геморрагическую, гнойную и некротическую форш острого панкреатита.'

2. Показано изменение белкового и аминокислотного состава мембран эритроцитов при развитии разных форм экспериментального панкреатита. '

3. Установлены особенности изменения ГОМ, содержания ВЭГ н активности Г-6-ФДГ в сыворотке крови экспериментальных животных в больных острым панкреатитом и острым холецистопайкреатитоы.

4. Обнаружен мембранопротекторный эффект ферментов антиокси-дантной защиты - СОД и каталазы при отечной и геморрагической формах экспериментального острого панкреатита.

Научные положения диссертации, в н и о с и м н е на защит у.

1. При экспериментальном остром панкреатите наблюдается значительная годней ад ил белкового состава мембран эритроцитов в зависимости от форш заболевания.

2. Повышение уровня ВЭГ а активности Г-6-ФДГ в сшзороткс крови при э::спериленталыгом остром панкреатита коррелирует со степенью поражения подоселудочной железа и свидетельствует об усилении проппцаеыостн аритроцигарных мембран.

3. При введении СОД ц каталазы жизотшш с отечной и геморрагической формами острого панкреатита наблюдается сппкенае степепн таюлнза, содержания ВЭГ и активности Г-6-^ДГ, что свидетельствует о меибранопротекторнси действии этого препарата.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные даште об изыенепин белкового состава мембран эритроцитов и некоторая параметров, характеризующих структурно-■фушщнонельиое состояние мембрап клеток, представляют существенней интерес для понимания биохимических основ патогенеза острого панкреатита. На основании полученных данных о роли ферментов антн-оксвдантной защити в стабилизации эритроцитарннх мембран ыоано рекомендовать применение комглекса СОД и каталазц в качестве цемб-раиоаротекторного средства при лечении болышх острым пашсраатп-чогг. . '

Разний характер изьгекешй активности Г-6-4ЩГ и кислой фосфа-тазы, содержания ВЭГ и средних шлекул в сыворотке крови болышх острым панкреатитом и острым холецистопанкреатитоы шл:ет слунить ' тестом для дифференциальной диагностики данных заболеваний.

Результаты исследования используются в клинической практике хирургического отделения 1а 3 РОДЕШИ.

Разработанный "Способ моделирования острого панкреатита" (а.с.]г 1227158) использован в научно-исследовательской работе ч Ставропольской краевой больницы $ I, НПО "Роотэпидкошлекс" ИЗ РСФСР, а также в научной работе студентов иа кафедре хирургических болознс-а а 2 родами. .

Апробация рабо т и." Основные положения работы доложены на конференция*:

1. "Экстремальные состояния организма, скорая и неотложная медицинская помощь", Ростов-па-Дону, 1986.

2. Третья конференция по вопросам физиологии обмена в^щзота

в организме человека я лпзотшгх. - Вильнюс, 1987.

3. Пленум комиссии АЬ5Ы СССР л Всесоюзная конференция по не-отлоулоЛ хирургии. - Ростоз--на-До1у,Х991.

Публикация результатов исследован и я. По теме диссертанта опубликовано 9 работ.

Структура работы. Диссертация изложена иа 185 о границах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов г: методов исследования, ]езультатов и обсуэдения экспериментальных и клинических исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка использованной литературы кз 334 источников, в том числе 100 иностранных, иллюстрирована 23 таблицами и 2 4 расуисаш.

ЫЛГШ1Ш И МЕТОДУ ЛССДЩОЗАНИЯ

Объектом экспериментальных исследований служили беспородные белые крысы обоего пола массой 180-^20 г. Испод;>зозано около 400 крыс. Эксперимент проводили в соответствии с Приказом УЗ РС&СР ц 755 от К.06.77 о порядке работы с экспериментальнаки гивоткнми. По разработанное нами "Способу моделирования панкреатита" (а.с. й 13й?1о2) в асептических условиях под эфирным наркозом воспроизводили отечлук, гекорратическув, гнойную и некротическую формы острого панкреатита. Для создания отечной формы в'ткань поджелудочной лелезц вводили 1% раствор тритона л-100 и дозе 0,2 цп, геморрагической формы - раствора тритона Х-1С0 в дозе 0,3 ыл, гнойной формы - •%% раствор тритона Х-ЮО в дозе 0,4 ш, некротической формы - 5% раствор тритона 2-100 ® дозе 0,3 мл. Контролем слухплп крысы, которым под эфирным наркозом выполняли верхнею срединную ланарото;.сш. Опытных к контрольных аивотпих' забивали через трое суток. Исследовали кровь, печень» почки, подаелудочнуэ аелезу. ' • . • .

При изучении влияния антшкеидантных ферментов иа состояние мембран эритроцитов хивохннм вводили внутрибрвшинно препарат (представлен с.н.с. НПО "Ростэпидкоьахлекс" Л.В.Свечниковой) -комплекс СОД и каталаэы из расчета 1,5 ыг на I кг щчеи через I, 24,48 часов после моделирования острого панкреатита.

Клинические. наблюдения проведет! при обследовании 23 больных острым панкреатитом, 20 больных острым долецистопанкреетиток» на- -ходзвшихся на лечении в хирургическом отделении # 3 Ростовского ордена Друабы народов медицинского института. Пробы крови брали из локтевой вены больных при поступления в клинику и ира выписке.

Контрольная группа состояла из 20 практически здоровых добровольцев*.

Выделение мембран эритроцитов проводили не методу ы.саг-Яег at al. (1972). Белкозке препараты мембран подвергали диск-злектро-форезу в разделяющей системе 10% полиакриламвдюго геля, содержаще- ' го 1% додецилсульфата натрия ('НаЪвг , osbarn ,1969). Послз окрашивание беысов Кукассн к -250 гели декситометрировали прл длине волны 570 гол с помоиью специальной приставки к спектрофотометру "Спекол". Денситограгаи делит на 10 зон, процентное содержание белков в каждой зоне определяли гравиметрически^ способом. При определении молекулярной массы белков использовали белки-маркеры Фирмы "Sigma « .(США), •

Высокооцененные препараты белков гкдролизовали в 6 н НИ в запаящ'шг ампулах в течение 22 часов при П0°С. Аминокислотный анализ г.щюлизатов проводила на автоматическом анализаторе аминокислот kla " Hitachi1' Коэффициент, полярности аминокислот рассчитывали по fi.A.cauaidi , s.i/nndericooi (IS72), величину относительной гидрофобности'бежой - СО A.Aboierin. (1971).

В сыворотке крови снектрофотометрическН определяли активность Г-6-ФДГ по образованию НАДФЕ^ в инкубационной пробе при 340 т (Захарьин,1Э67), концентрации ВЗГ - циацметгемоглобиновым методом СКаракалюв, Вичев,1968), содержание средних молекул - скрининговцм методом (Габриэлян, Липатова,.1984). Проницаемость эритроцитарпых .мембран (ПЭМ) определяли методом мочевинноготейолиза (Колпаков, ?одченко,1982). Активность кислой л" щелочной фосфатаэ в сыворотке крови, 10% гошгеяатах печени н почек на физиологическом расгяо-рз с I ьй ЗДТА определяли с использованием в качество субстрата '/ -глицерофосфата (Колб, Камышников-, 1982). Активность кислнх про-• токааз а тканях печена п ночек определяли по методу Л.В.Могильниц-кой ц'соавт. (1387). Об интенсивности протеолиза судили по увеличению содержаний фолшшояоаительнш: проектов, которые определяли методом Лоурц (Покровский,I9S9). Активность «¿-амилазы определяли методом w.carraway (1959).

Статистическую обработку результатов проводили методом непрямое разностей в использованием константной формулы (Монценичуте-Эрингене,1967).

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИОСЭДРВАИИЯ И ИХ ОБСУВДШВ Z. Эхспаршенгальные всолодовання

- б -

Белки мембран эритроцитов при развитии разных форм острого панкреатита В таблице I представлена количественная характеристика белковых фракций мембран эритроцитов крас о лаларотомией (контроль), а также с отечной, геморрагической, гнойной и некротической формами экспериментального острого панкреатита (ЭОП). Мембранные белка контрольных яивотпых, выявленные в ваде 13 полос, соответствувдих отдельным полипептвдннм цепям или набору полшеатвдов, иуепцих близкие молекулярные массы (моя.м), распределены в 10 зон по мере уменьшения мол.и.

При отечной форме ЗОИ в белковом составе вритроцитарных мембран сояашдся три новые белковые фракции в зонах 2,6 и 7 с лгал.ы. около 35500,41700 и 33100 Д. Отмечается тенденция г. увеличении содержания высокомолекулярных белков, увеличение количества белка а зоне в (на 40,8%, р в 0,02) -и сшшшие в области S (на 37.2&, р « 0,02).

При развитии геморрагической формы ЭОП число дополнительных полнеептидов, выявляемых при электрофорезе, увеличизьется до 5-7. (по сравнению с контролем): помимо трех пиков в зонах 4,6 и 7 обнаружены новые белковые фракции в области I с диапазоном мол.м. I5I400-I47000 Д. Содержанке белка в этой области увеличено на 24,7$(р -=с 0,002) по сравнению о контролем и иа 17,3$ (рс0,02) до сравнена с отечной формой, изменения в остальных зонах статистически не достоверны.

Увеличение количественной представленности полшхептвдов в, отдельных электрофорегических эоаах при отечной и геморрагической формах ЭОП когет быть связано с действием протеолитических ферментов, активность которых возрастает при развитии острого панкреатита' («ишиДШ). '

При гнойной форме ЭОП во сравнению с контролем s зонах 1,2 и 3 содержание бел..а снизилось достоверно на 5Х,8#, 50,0£; в

зонах 5,7 и Ю увеличилось fia 59,7^, 155,4? и 68,652. Развитие некротической формы сопровождалось достоверным снижением содержания белка в зонах I и 2 на 3o,ï% и40,9£, увеличением в зонах 5,7 и 10 соответственно на 57,12, 155,4? в 66,2?. При сравнении некро тической фермы с гнойной не выявлено достоверных различий в соде Р жании белков с одинаковой кол.кассой. Общим для этих форм является енккенке' содержания высокоиолекулярВых белков, увеличение содержания низкомэдекулярнше белков, >исчезновение фракций 6,8,9.,

Табдицз I

Количественная характеристика белковых фракций мэибран эритроцитов крыс при развитии острого панкреатита в % от суша белков, вопгдэих з гель (X + т ; п,= 6-3)

й

фракции

т 2

3

4

5

е

7

8 9

10

Мол. масса, . кД .

125-152 91-105 83-85 62-70 50-58 41-47 32-36 25-29 17-22 10-13

Контроль

15,8+0,6 II ,0*0,9 8,6+0,3 11,1+1,2 7,755,4

9,2+0,7 4,9^0,3 4,3+0,3 20,1+1,0

Отечная

12,0^5,3 9,4+1,4 ' 10,¿¡0,3 • 8,7^3,2 5,2+0,2 9,4+0,6_ 6,2^0,6* ■ 2,7+0,4к 18,4+0,6

$огат панкреатита

.Аеморрагдчес-: кая

Гнойная

19,74) ,4х 8,9^3,7 8,8+0,3 10,2^0,4 7,64) ,4 6,7Д),3 11,7^0,8 • 6,0^,5 4,0+0,5 16,^0,8х

7,6+2,Iх 5,3+0,9х 4,370,5х 7,85) ,5 . 12,3+1,6х

23,510,8х

37,9+1,1

/

Ь'екротлческ3?

ю, 1+1,0х

6,5+1,2х 6,0+1,4 8,5^2,0 12,1+1,0х

гз.ь+^.о*

33,4+4,4х * •» *

Примечание: а - фракции" белков, в ролв.

I

которых обнаружены достоверные изменения по отновекиэ к конт-

увеличение уровня мембраносвязаяього гемоглобина (фракция 10).

Исчезновение на элеятрофорег аммах ряда полос и одновременное расширение промежуточной полосн с кол.м. 32-36 хсД при войной и некротической формах панкреатита гложет свидетельствовать об образовании агрегатов белков. Механизм подобной а-регации шает быть г бусловлэк вза!аюдействием активных форм кислорода (Л®£) как ради-глльной, так и керндикальной природы с.определишься! аминокислотами в белках (Игуменов и соавт.,1388). •

Значительная генерация АйК в процессе развития острого панкреатита р настоящее время может считаться установленной ( ЗапСеу вЪ а£. ,1334; пиПе^в вС вХ. ,138?; уап Оо1^еп е* аг. ДШЭ).

Резкое увеличение содержания мембраносвязакного гемоглобина при гиоГлой и некротической формах ЗОП шкет быть обусловлено способностью гемоглобина связываться с белкат мембран эритроцитов (Внуков и соавт. ,1587; -ЗЬа1а1 еЪ а1. ,2977).

Изменения олектрофоретического спектра мембранных белков эритроцитов при острой панкреатите могут быть связаны с модификацией . лиапдного бислоя. Нрг развитии отечной, геморрагической, гнойной в некротической форм ЭОЕ изменения в содержания основных фракций липидов мембран эритроцитов характеризуется увеличением холестерина и снижением фосфоляпадов, коррелирующими с тяжестью патологического процесса в подаелудочной железе (Сургутанова и соавт.,1987; Русаков и соавт.,1989).

Таким образом, развитие ЗОН сопровохдается модификацией бел-нового состава. Характер выявленных изменений зависит от индуцируемой формы панкреатита и развивается по двум типам: первый' выявлен для отечной и геморрагической форм, второй - Для гнойной в некротической.

Изменения белкового состава эритроцитаряых мембран в начальный период процесса, по-видимому, представллот собой приспособа-тельную реакцию красных клеток крови* Дальнейшее разрушение йрит-роцитарных оболочек может означать вкгаэчение клеток в формирование явления геиореологического синдрома, способствующего переходу ответной реакции организма при экстремальных воздействиях в позднюю фазу (Захарова и соавт.,1931)» . ' •

Аминокислотный состав белков мембран эритроцитов крыс с отечной,гекоррагической,гнойной я некротической формами острого панкреатита

Исследование показало, что как в контроле, так и во всех иссл<

дуешх формах ЗОН преобладающими аминокислотами мембранных белков являются лейцин и аспзрагиновая кислота, минимальное содерзанк;« отмечено для метиоиина, тирозина и аргшина. При отечной форме содержание валила, ызолейцш£а и лизина било выше, а глуташщовой кислоты, алашша и гиствдина ;лске, чем при ланаротомпи. Однако, разница мевду группами не являлась статистически значимой. Отпечено увеличен И1 ? содернанш аполярных аминокислот на 17,3$, гидрофобных - на 14,6%, относительной гидрофобности на 30,9$; сличение величин отношений Г11дрофальнце/Г1щрофоб1ше о 1,72 дс 1,45.

Развитие геморрагической формы панкреатита сопровозд&лось тенденций к увеличению содержания ватша и лизина и снпиению со-деркания глицшш и алшпша по сравнению с лапаротошей. При этой форме обнаружено' возрастание содержания основных, кислых, обцнх зарякешшх и гидрофильных аминокислот, коэффициента полярности к снижение относительной гндрофобности как при сравнении о лсдарсто-мией, так и с отечной формой. При гнойной форме увеличилось содержание основных аминокислот, в частности, лизина на 51,5$ (р <с0,01), снизился уровень аполярных амшокислот и относительной гидрофобности белков по сравнению о лаларотомией (на 35,6$), а также с. отечной и геморрагической формами. Некротическая форма характеризовалась снижением уровня основных и увеличением кислых аминокислот по сравнении со всеми исследуемыми группагд* гивотных, возрастанием относительной гидрофобности белков на 36,7? по отношению к гнойной форме.

Соотношение основные/кислые аминокислоты при отечной и гнойной формах возрастало соответственно на 11,2 и 12,1?, при геморрагической форме ае изменялась, при некротической - снизилось на 18,7?. Соотношения общие заряжепные/аполярные и.гидрофильные/гидрофобные аминокислоты при отечной форме снизились соответственно на 16,1 и 15,7?, при геморрагической и некротической формах не изменились, при гнойной форме возросли соответственно на 11,0 и 5,6? по сравнению с ложнооперированными животными.

Таким образом, изменение аминокислотного состава белков мембран эритроцитов в наибольшей степени вырааевы при отечной и гнойной формах, в наименьшей - при геморрагической и некротической.

Динамика соотношений незду отдельными группами аьзшокислот при развитии ЭОП, возможно, связана о изменениями во взаимодействии между основными компонентами мембран - белками и липидами. Развивающаяся при остром панкреатите диопрогеивемия,. вызывая пато-

логическую агрегацию эритроцитов, шлет способствовать дезорганизации липопротеидных структур оболочек эритроцитов.нарушение взаимодействий типа белок-белок, белок-лкшц.

Изменения аминокислотного состава белков ксыбран эритроцитов при SOU могут быть обусловлены интенсификацией процессов ПОЛ, в ходе которых в мембране происходит разрушение чувствительных к окислению функциональна групп аминокислот ( Gardner , а

также сдвигом динамического равновесия кеаду белками мембраны, плазмы крови и цитозоля эритроцитов (Громов и соавт.,1208). Нарушения в аминокислотном и белковом спектре ыеыбрая ютут возникать в результате изменения прогеолитической ачткшюсти.

Активность ферментов лизосоы в тканях нечеаи и почек крыс при развитии отечной и геморрагической t}op;-острого панкреатита

При отечной форме 30П активность кислой фоефатазн в лачени и почках незначительно снижалась, повшненяе ахтшдс-ети кнсых проте! каз в печени и снжениз в почках ке получили статистического под-тверадения. Очевидно, при этой форме острого панкреатита сохранялось нормальное функцконированиэ лазосошиьного аппарата sa счет коьяенсаторацх реакций, связанныхs в частности, с активацией энергетических процессов в митохондриях печени (Крючок ,1Э?9).

Развитие гевдррагической Форш КОП сопровождалось увеличением в тканях печени и почек активности кислой фосфатазы соответственно на 56,5$ (р в 0,03) и 66,7£ (р<;0,02), активности кислых протеи-яаз - соответственно на 57,1% (pi 0,05) и 89(р«= 0,05). При сравнения геморрагической форш с отечной обнаружено существенное увеличение активности кислой фосфатазы в гошгеиогах печени на 142,558 (р«с0,001) а почек на 03,3? (р «г 0,001), активность лизо-соиальких эцдопептвдаз в печени пе изменилось» а в сочках возросла аа 154,2% (р «» 0,02).

Полученные результат, а также данные литературы о значительном подаеие активности лиэосоиальянх фзрмептов в сыворотке крови (Шотт и соавт.,1981} Kimai, Kita ,1989) и гомогенатах подаеду-лочной Ее лезу { Adler ,1985) могут свидетельствовать о нарушения проницаемости лиэосоиалышх мембран при остром панкреатите.

Важным фактором дестабилизации лизосомалышх мембран при дьн-яой патологии является действие протеолитпческих ферментов, осво-боздаидасся из подаелудочной аелвзы в брюшную полость и плазму крови. Показано, что при экспериментальной геморрагическом пьнкреа гите акизность трипсина, лигазн г фосфолшазы А^ в крови, лиг.!$е

li nepiiTOj сальном экссудате возрастает э 2-10 раз (Филин ,1991). В условиях повышенной проницаемости сосудистой стенки активированные ферггэнти доставляются в раатачные органы, в том числе печень и почка, способствуя лнзсссмальшш повреидшиям их паренхимы.

Существенный вклад в повхкждение лкзосом и освобождение лизо-сомальннх ферментов вносят процессы интенсификации ПОЛ и нарастания активности фосфолипазы обнарунегашз в тканях печени и почек крнс с отечно-геморрагическим панкреатитом (Симаворяч, Багдасарян, 1289). Хотя способность лизосом накапливать продукты ГОЛ гожно рас-сглатр!шать как вторичную антноксадантну» эздиту, однако, при этом ora сан® поврездастся, высвобождая ферыанты в цитоплазму а вызывая гибель субклеточных структур ( Brunk , Сайапаз ,1988),

• Таким образом, можно полагать, что действие лнзосомальннх ферментов, оказавшихся за пределами лизосом вследствие лабилизацш их мембран» язляется одним из пусков'сс механизмов развития пече-тто-тчичной недостаточности при тяжелых формах острого панкреатита.

Проницаемость эрптроцдтарша мембран .содеркание ВЭГ и активность Г-8-ФДГ в сыворотке крови при экснерю.?знтально»>; остром панкреатите и после введения ферментов анткоксидант-ной защити

Одной из характеристик, непосредственно связанной с состоянием эритроцитарннх. мембран является степень ¡а проницаемости для мочевины. Как видно из табл.2, развитие отечной фор,ai ЗОЯ привело к увеличении 1Ш по сравнению с контролем, при геморрагической форме увеличение ИЗ!.! выражено е:ю более резко. ,

Согласно данным З.ИДСадавкшой и со авт. (1987), если величины ПЭИ а растворах 45:55 , 50:50 и 55:45 нревноают соответственно 10.1, 305 и 70^, то следует эту динамику рас сматривать как наибольшее гнрааение с!ЯДрома цитолиза. Такие показатели гемолиза (11,0$, 46,32, 76,3$) характерны для геморрагической формы ЭОЛ. Таким образом, определяете napavoTpu гемолиза могут быть использовали для тестирования структурных изменений эритроцитарных мембран при отечной а геморрагической формах острого панкреатита.

Возникает вопрос о причинах патологического гемолиза эритроцитов, наблодаемого при развитии острого панкреатита. Важная роль а гемолизе эритроцитов отводится AJK, генерируемым в эритроцитах (Мерзляк, Соболев,1975).

Одной из причин патологического гемолиза шкет быть ускоренное автоокислениэ гемоглобина о образованием метгемоглобина я су-

Таблица 2 _

Проницаемость вржгродатарных мембран при ЗОН к после действия ферментов АОЗ (X + т ;

и = 6-7)

Группа глвотных

Лапаротокая Отечная форма ЭОЛ

Р1

Отечная форма поелё введения СОД в кат&аазн

Геморрагическая форда ЭОЛ

Геморрагическая форма ЗОН после введения СОД и каталазы

Степень гемолиза при различных соотношениях изотонических растворов мочевины и хлористого натрия. %

45:55 : 50:50 : 50:45 ; 60;40 : 65:35

7,50+0,52 32,9+2,16 73,3+3,23 64,9+3,27

22,¿¡1,30 48,4+3,45 81,5^,18 91,вТо,СЗ

<0,001 «= 0,003 >оТ05 >0~05

2,75+0,24 5,59+0,72 <0~001

2,04+0,24 4,72+0,81 18,28+2,5 52,77^3,14 60,35^2,45

>0,05 <0,001 11,0+1,66 = 0,002

5,22+0,60 й 0^002 <0,02

<0,002 <0,001 46,3+2,73 <0^001

18,6^2,63 '<0,001 <0,001

<0,001 <0,001. 76,3+2,57

<о7оо1

53,0+3,04

<оТоох <0,001

<0,001 ?0,05

<0,001 <0,001

90,5*3,57 97,0^0,35

= 0,005 = 0,003

84,1+2,37 <0,02 =»0,05

93,8^1,72 = 0,03 <0,05.

Примечание: Здесь и в табл.3: Р^ - достоверность различия с контролем.

?2 - -достоверность различия с форшй панкреатита.

I

дорода, встуг аот в .1 зухст7иийную реакция. Г^оера-Вайса с генер ¿спей гздрокс1Льн'н'радикалов, которые могут ппщиировать ПОЛ мембран, вызывать ссвреадечиа структурных белков, кемб;аносзязатш: ферментов, копию, канала., оет'гла'шз ;егюглоШих с : о<угеду*®шм гемолизом эрит/хцитов (Масчанв соавг.,19£9).

Геэультаты определения содержания ВЭГ з снворот.1 е крови при £0П свидетельствуют о тенденции к узейдаченгг покозап яя при отечной форме панкреатита и о значительном возрастании его на 79,5? (р-=0,01) при геморрагической (•-•абд.З). Сравнение двух форм между собой показало прирост на 60,5? (р<=;Р,03) уровня ВЭГ при геморрагической форме. Таким образом, при ра: витии ЭОП наблюдается деста-^ЗмЕзадая эритроцитярннх мембран и появление в сыворотке кровп гемоглобина в повышенных концентрациях. С другой стороны, гемияовое железо как соединение с переменной валентностью является основным катализатором образования МС, вызывающих гемолиз эритроцитов ( СаггэН в* аа. ,1975).

Мы предполагаги, что возможно возникновение "порочного" круга, который приводит в итоге к дестабилизации эритроцитарных мембран, что отражено на схеме (рис.1)

----■............- Увеличение ВЭГ-«-I

Рис Л. "Порочный" круг, дестабилизирующий эритроцитарные

мембраны при остром панкреатите. Повышение уровня ВЭГ, катализирующее процессы деструкция клеточных структур (ГуськовДукаш,1989), мокет явиться одной из причин протшговекия внутриклеточного содергадаго, в том числе и ферментов, через гистогематический барьер и гиперферментемий, обнаруживаемых при остром панк$ еатите. В связи с этим весьт информативным оказалось исследование активности Г-6-ФДГ, ферманта, локализованного на внутренней ~~ поверхности лтидкого бислзя эритроцитар-ной мембраны. Развитие отечной и геморрагической форм ЭОП сопровождалось возрастанием активности Г-6-$ДГ в сыворотке крови соответственно в 2,3 и 5,3 раза (табл.З). Значительное увеличение активности фермента при геморрагической форме свидетельствует о более глубоком нарушении проницаемости эротроцитарянх мембран и о дестабилизации клеточных мембран тканей поджелудочной железы, почек, печени, легких. .

Ш

Гемолиз эритроцитов

Таблица 3

Активность Г-6-ФДГ и уровень БсГ в сыворотке крови при ЭОП и после введения ферментов ЛОЗ

Группа ¡¡¡квотных : ВЭГ, : ыг£, : г-б-фдг, :нмоль нлдгнз/мл/ :мик •

Дапаротомия * 27,8+1,76 3,8240,94

Отечная форма ООП 31,16+3,62 8,70+1,71

>0705 = 0~02

Отечная форма после введения 19,58+2,33

СОД и каталазн 3,09+0,81

Р1 = 0702 >0^05

Р2 = 0,02 -=0,01

Гелюррагическая форма ЭОП ■ • 50,0^,55 20,09+3,79

<0,01 <о7оо1

Геморрагическая фор?,а после 24,49-4,83 8,53^1,35

введения 00Д и кагалазы

ь Р-0,05 -=0,02

<0,02 <0,02

Омой, из причин изменения активности Г-6-ФДГ в сыворотке крови монет быть активация перекисных процессов в эритроцитах обнаруженная при развитии ЭОП ( Н1гауоаа АМ-о еЪ ей. Д983).

Таким образом, активация переклешя процессов в результате возрастания продукции А'Ж при остром панкреатите приводит к повреждению эригроцитарных мембран, что сопровождается выходом Г-б-йД1 в сдаоротку « вероятны?-! ешкециеи активности фермента в эритроцитах. Ранее А.Г-.Шоттои и соавт. (1381) било обнаружено сшшшие активности Г-6-ФДГ в эритроцитах периферической и портальной крови крыс с ЬОП.

Недостаточная активность Г-6-ФДГ в эритроцитах и дефицит НАДЖ, обнарутаегося п пентозном цикле, приводят . к нарупению нормальных окислительно-восстановительных процессов- в эритроцитах, енлгенна их устойчивости* к различным воздействиям и в итоге к гемолизу (Иулутко и соаат.,1388). Г-б-ФДГ участвует в функционировании ачтиокеддантной системы, играидей вааную роль в молекулярных механизмах неспецифической резистентности организма к экстремальным воздействию.! (Соколовский, 1^84).

Развитие острого пяяяриатита приводит к подавлению естественных антиоксадалтных механизмов, с чем свидетельствует сникени-э ак-

т пакости СОД, каталази, глутатионхсроксцфзы» глутаткоиредуктазы, витамина i! СГо.ьдберг, Побе?еасша,1987; Дедепко,1938; н. Alelo ot el s1983),

В связ:« с этим ш предприняли попытку восполнить недостаточность ферме) иативгей ант! оксцдантной систеш с помощью экзогенных СОД и каталазн и изучить влияние их на состояние эритроцитарннх кембрэ! при остром панкреатита у крыс. Наст установлено, что внут-рибршяшое трехкратное введение препарата СОД, катал.за в дозе : 1,5 от/кг массы тела сникает степеш гемолиза, уронен.. БЭГ и активность Г-б-ФЛГ в сыворотке крова крыс с ЗОН (табл.3). Так, ферменты антйоксщгантной защиты (ЛОЗ), вводимые гшвотнш с отечной формой <011 еявкалп достоверно ПЗМ, при тем величины степени гемоли-8а^снизилась до уровня контроля (растворы 55:45 ц 65:35) и mese его* (растворы 50:50, 5Í..;45 , 60;40). Ферменты АОЗ, вводимые животным с геморрагической формой ЭОП'такие снижали достоверно ПЭ1Д, однако величина степени геиолдЬа эритроцитов оставались во всех растворах вшй контроля. Такш образ'ом, шлю говорить о восстановлении проницаемости мембран для кочевши под влиянием препарата СОД, кат&чаза при отечной форме ЭОЛ и об улучшении состояния мембран йра геморрагической фор?ле . ' . •

Зоцягный .эффект СОД л гсаталазы заключается в подавлений этими ферментами реакции Габера-Байса. СОД переводит О^в %02 и 0?_, ка-талаэа разлагает Н^Я на Н20 л 02 без образовать радскальных про-дуктбв (Владшлирса, 1-389). . • .

Следует особо подчеркнуть роль экзогенной катрлаэы, входящей в состав данного препарата. Поскольку 'перекись водорода ннгпбаруег активность Cuniiiweii ,197В), то добавление каталазы, утилизирующей перекись, могло вызывать увеличение активности СОД. Подобный эффект обнаружен В.П.Вербол:озячем л соавт.. (1989), которые, исследуя значение СОД а каталазы в регуляции ЛОЛ в мембранах эритроцитов человека, сообщают о том, что добавка каталазы к суспензии -• мембран эритроцитов приводила к увеличения активности 00Д на 18%.

Фериенты АОЗ, вводимые животным с отечной а геморрагической формами ЗОН, снизили уровень ВЗГ на 37,2£ и на 4% по сравнению с соотвчтствугдкми формами без введена: препарата а на 29,7^ и 32,1? по сравнению с лапаротошеей. Экзогенные 00Д и каталаза, устраняя деструктивное действие свободных радикалов на мембраны эритроцитов я снижая степень гемолиза, разрывают таким образом "порочный" . круг и способствуют снижению содержания -ВЗГ в сыворотке крови.

Сшд.гш:е уровня БЭГ в сыворотке крови под влиянием фершитов ЛОЗ, по-вкдкшиу, уменьшает прооксидантиую атаку внешней стороны ыемб-рзны эритроцитов и тем сашм способствует ет&бш.нзатдщ их иембр.ш» Введение ферментер АОЗ снизило активность Г-6-§;!Г при отечной форме ЭОП на 64,5$, при геморрагической на 57,3$. Однако, если в первом случае снижение было настолько значительным, что величина активности фермента оказалась ниже. контроля, то во втором случае она оставалась вние контроля на 323,3$ (р <0,02).

Рассматривая влияние ферментов АОЗ на все изученные показатели состояния оритроцц'гарццх меибрак, ыогцо сделать выеод, что при ' отечной форгле панкреатита после лечения происходит более выраженная стабилизация мембран, чем при геморрагической фор?ле. Воздакно» это обязано с тем, что в эксперимента били кскользованы одшаг.оние дозц препарата, недостаточные для нормализации более шракегшых функциональных нарушений мембран при геморрагической форий панкреатита. Нави дашше согласуются о результата^! исследования н.зап-£еу в1; а£1934), которые показали, что назначение СОД, и каталагы в качестве лечебных средств при ЭОП вызывало значительное уменьшение отека поджелудочной нелези в хтшерамилазешш.

Результаты -биохимического исследования, мембран эритроцитов* согласуются с дашиши патоморфологического изучения ткани поджелудочной еелезы крыс с ЗОН. /

;Ме«бранодротектор£ШЙ эффект, нормализация гиетоструктуры поджелудочной железы после введения-препарата СОД, каталазз йнботйю.! с ЗОН позволяют считать перспективным применение антиокоидантних ферментов при Лечении больше острим панкреатитом.

КЛИНШХИВ ШХЭДОВАШЯ . ;

Для оценки состояния йелбрашшх структур у болышх острш' ■ панкреатитом (ОП) и острим холецаетопанкреатитом (ОХЯ) определяли слэдукцие показатели: ПЗУ, содержание ВЗГ и средних далекул (&Г), активность Г-б-ЗДГ,. кислой и щелочной фосфатаз в сыворотке крови.

У болышх ОП при поступлении в клинику отмечалось ¡тональное увеличение 1Ш в рабочих растворах с соотношениями ыочввиш к хлорида натрия 50:50 (па 80,3$, р<0,02) в 55:45 (на 48,8£, р = 0,02), у болышх ОХЕ - соответственно аз 135,2$ (р.«г0,001) а

I/ Эхе исследования выполнены о.к.с. Д.И.Зуро',

•íG.Jp CpcO.COI). Перед выпиской степень пропускания этого электрод; та черзз -м ■ лбрану снглатас:, как у 6о ьнш: ОП, т.не и у большее ОХИ, не достигая нор?« алый: величин. При срозяекии показателей 1Ш между обеюл; rjyxtnai.ni больных достоверные различия не обнаружены па в одном J3 рабочих растворов. Результата оп «деления степени мо-невинного гемолиза, долу«нине яг ляг,согласуются с данными В.А.Заха-рпл si «огтт. (ISS0) о ашенст стейсосгл эритроцитов к нершененому гаюлззу у больше; ОП, а такке с материалами исследов ния кинетики гсшлиза у болышх ОП {£л<гйн,1991),

Содеряапю ESP j больных ОП s ОШ выш ,чем у здоровых людей соответственно па 102д'47,7£, в концо лечения показатели при- ■ близились ;t норме. ÍIpjj сравнении двух обследованиях групп кекду со-<ой выявлено■ловышояко уровня ВЭГ на 31,3% (рсО ,02) у болышх ОП.

i. Появлеязо з крови болвнше.ОП ц ОШ болкзого количества свободного гемоглобина, обладав,его высокой проокездадгшой активностью, катет знавать дальнейдуо дзстг|билиза1пза'ор:и:роцнтар1ШХ, клеточных н субклеточных мембран. Контакты гешлнзнровашнк эритроцкгоз с протсазсмл приводят, к образовании вецестл, способствущзх развитию эндогенной мгсоксж-'щкк при воспалении подкелудочной ислезц.

Результаты определения количества СМ в сыворотке крови больных СЛ. и ОШ- свидетельствуют""*'о нревниешк норм; соответственно на 102,(р-сО,001) л 51,4% (р<0,001). Обнаружено увеличение уровня С-,i на 25,75£ (р - 0,03) в крови больгак 011 по

сравнении с болызнл! 0)31. Перед выпиской уровень C.J у больных ОП лровяпал контроль на 35,(р -- 0,003), у большое ОШ - снизился до иорш. Таким образом," можно заключить, что у больных ОП синдром эндогенной йгтокешеацаг, аяракея в больной степени,чем у боль- . них ОХП. ' \

•У /больных ОЯ .п ОШ обнаружено увеличение» гжхиЕяосгн Г-6-ФДГ соответственно на 241 f¡% (pcO,OÓ.I). г 150£(р^0,001)„ Перед выпиской наблюдалось снижснле активности фермента у обеих групп больных, нормализация - только пра ОШ,- Лр;г сразкешш двух групп кезду. собой'обнаружено; увеличение активности Г-6-0ДГ на 2о,7£ (р<0,05) у <5олынсс ОП. ■

При исследовании Ектнвпостн кислой Схзсфатазн выявлено увеличение активности ее im'ISOjS (р«г0Д>1) у больных ОП я на 93, (р <0,001) - у больных ОШ. К шаенту выписки отмечено снижение активности феррита у большое ОХЙ, а у больных ОН зеличята актив-кости превышали норму яа 50?» (р*Ю,05). Обяаруаено увеличение активности кзелой фосфатазы Ha,29js (р в 0,02). у больн-д ОП со ергв-

пенив с больными ОХП,

Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови больных. ОП и ОХП увеличена на 108? (рс0,001) и 32? (рсО ,01); после курса лечения в стационаре эти показатели снизились до корми. Увышчение • активности щелочной фосфатазы, периферического белка цшгоилазмати-ческ:ос мембран, свидетельствует о дестабилизации клеточных мембран тканей, преаде всего печени.(Буянов и соавт.,1583).

Изменения всех изученных кали показателей у обеих групп больных по сравнению с контролем свидетельствуют о снижении резистентности мембран клеток при ОД и ОХП. С другой стороны, установлен ряд отличий изучаемых показателей: достоверное увеличение при ОП ' по сравнению с ОХИ уровня ВЭГ и СМ, активности Г-6-ФДГ- и кислой фосфатазы, что говорит о более глубокой поражении мембранного аппарата у больных ОП. *

Найденные Наш сдвига уровня ВЗГ в ®, активности Г-б-щДГ ц кислой фосфатазы мох^ут служить в качество информативных тестов для дифференциальной диагностики острого- панкреатита н сочетагшого поражения желчевыводящей системы и подаелудочной аелезц. Определение вшенаэвас!!« показателей резистентности мембран клеток шкет быть осуществлено с небольшими затратами времени в любом хирургическом стационаре, оскеденном биохимической лабораторией,

выводи' '

1. При экспериментальном остром панкреатите наблюдается значительная модификация белкового состава эрктроцктарних мембран, развивающаяся по двум типам в зависимости от формы заболевания. При отечной и геморрагической формах увеличивается количественная. представленность лолшепткдов в отдельных олектрофоретическнх» зонах и содержание высокомолекулярных белков. Развитие гнойной н некротической форм приводит к исчазцовеншо ряда белкой и зиачихель ному увеличении содержания белков с мол.м 32-36 кД н 10-13 гД»

2. Изменения аминокислотного состава белков мембран эритроцитов крыс в наибольшей степени виршда в при отечной к гиоШой формах, в наименьшей - при геморрагической и некротической.

3. Развитие экспериментального острого панкреатита вызывает повреждение ыембрашшх структур печени и почек, о чем свидетельствует изменение активности внутриклеточных гидролаз - кислой и щелочной фосфатаз и• кислых протейназ в исследуемах тканях. Параллель ное повышение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови, гомо-генатах печени и почек соответственно в 2,2, 1,6 и 1,7 раза является объективным показателем нарушения пронвда.ж>стд лизосомаль-

[щс мембран прт: геморрагической форме.

4. Развзгпе отечной и геморрагической форм экспериментвлыях) (строго панкреатита сопровождается повдаетеа проницаемости зритро-гатарных меибр1Д и увеличением в сыворотке кроэи уровня ВЭГ,актив-юстн Г-6-Ф,1Г, коррзлиру! сцита со степень» поре 1еная поджелудочной селезы.

5. У больных острым панкреатитом и острым холецн топеккрьати-гом нарушено состояние эритроцитарннх, лизосомальиых ■ : клеточных лембрал ,о чем свидетельствует увеличение степени гемолиза .концентрация ВЭГ я средних молекул, активности Г-6-ФдГ, кислой и щелочной фосфата;) в сывс ротке крови.

6. У больных острым панкреатитом ю сравнении с (Зольными острым. холецистопанкрэатнтом уровень ВЭГ выше на 37,3$, средних молекул1 - на 25,75$, активкостг Г-6-ФДГ - на 36,7$ и кислой фосфатазы-яа 29%, что указывает на более глубокое.поражение мембранного аппарата.

7. Применение аятиоксидантних ферментов СОД и каталази при отечной и геморрагической формах экспериментального острого панкреатита приводит х снижена» проницаемости эритроцитарннх мембран, уровня ВЭГ в активности Г-6-$ДГ в сыворотке крови. Мембранопротек-торннй эффект более выражен при отечной форме, что подтверждается результатами исследования гистоструктурн поджелудочной железы.

СПИСОК РАЖ, ОШБШКОВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нембранш.е билки эритроцитов при экспериментальном панкреатите. - // Экстремальные состояния организка, скорая и неотложная медицинская.пошць. - Ростов-на-Допу, 1985. - С.73-74.

2. Влияние зиксорина на активность некоторых ферментов у больных острым панкреатитом (Т.Н.Ткачева)» - . Там же. - С.63-64.

3. Изменение активности кислых гвдролаэ при развитии воспали-тельно-деструктивнах процессов в брюпиой полости (В.И.Русаков, Н.А.Луквш). - // Третий Всесоюзн.симп.с мезд.участием "Структура

и функции лизосом". Тез.докл. - М. ,1986. - С.172-173.

4. Способ моделирования панкреатита (Э.С.Гульяиц, Н.А.Лукаи, Т.Н.Ткачзва, Т.А.Сургутакова). - // А.с.Л 1327152. - Открыли, изобретения. - 1987. - № 28. - С.2II.

5. Вторичные иммунодефицитные состояния больных панкреатитом и холецистопанкреатитом и их коррекция тмуношдулято'рами (Т.Н. Ткачева, Т.А.Лятвиненко). - // Актуальные вопросы иммунологии и иммунопатологии в медицине и курортологии. Тез.докл.конф. -Пятигорск, 1987. - С.164-165.

6, Изменения активности ферментов сыворотки крови у больных панкреатитом при лечении зяксорином {Т.Н.Ткачева, Н.АДукаи,. Я.П.Полякова). - // Актуальные вопросы обмена В1 ществ. Материал! третьей кокф. по вопросам физиологии обмева веществ в организме человека и животных. - Вильнюс, 1987. - С.215-216.

7. Мембранные бел.си эритроцитов при экспериментальном остро! панкреатите (В.И.Бубнова). - // Материалы ЗУ Всесоюзн.сьезда гаст роэнтерологов. - И.-Л. - 1990. - С.348-349.

0. Значение некоторых иммуяно-бжшшическкх показателей в да агностике острого холецистита и ходецкстоканкреатита (Т.Н.Ткачеве Т.И.Спинчевская). - // Острие хирургические заболевания брюшой полоста. Тез.докл. Пленума комиссии АШ СССР и Ьсесопзн.конф. по неотлогшой хирургии. - Ростов-на-Дону, 1991. - С.23?-2Ш.

9. Методические рекомендации по воспроизведет!» модели остро го панкреатита. - Ростов-на-Дону,1991. - 7 с.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ -СОКРАЩЕНИЙ .

АШ - активные формы кислорода

вэг - ыеэритроцитарный гемоглобин

Г-6-ФДГ - глйкозо-6-фосфатдегидрогеназа

пш - проницаемость эритроцитарншс мембран

ПОЛ - перекксное«окисление лкпидов

см - средние молекулы

сод - супероксиддЕсмутаза

оп - острый панкреатит

охп - острый холацистопанкреатит

эоп ексяерзжзктшшгнй остряй панкреатит

Подписано к печати {1. г.

tФормат бумаги 60 х 04. I/I6; Бумага офсетная. Печать офоетпвл. Пвч. лист - /

Заказ ~дс>5 тираж --fOO Tim. годаш '