Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпоксидгидролаза печени и слизистой тонкой кишки крыс при воздействии различных алиментарных и токсических факторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эпоксидгидролаза печени и слизистой тонкой кишки крыс при воздействии различных алиментарных и токсических факторов"

Академия медицинских наук СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

— \/

На правах рукописи УДК 577.15 : [616.341+616.36] : 612.392 : 615.9

КУЗЬМИНА Елена Эдуардовна

эпоксидгидролаза печени и слизистой тонкой кишки крыс при воздействии различных алиментарных и токсических факторов

(03.00.04 — Биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в лаборатории энзимологии питания Института питания АМН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ — доктор медицинских наук профессор В. А. ТУТЕЛЬЯН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор медицинских наук профессор Л. Ф. ПАНЧЕНКО. Доктор биологических наук Н. Н. СОКОЛОВ.

Ведущее учреждение — 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится « Ьд » 1991 г.

в _! I часов на заседании специализированного

совета, шифр Д 001.02.01, при Институте питания АМН ■СССР (109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института шихан,ия АМН СССР.

Автореферат разослан « ^ » СЫ^^аЛаЛ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

В. М. ЖМИНЧЕНКО

I. ВВЕДЕНИЕ

""*-■.•;.;■, ii -¡Г

' .....I Я-.-f Актуальность теш. Изучение ферментных механизмов защита

клетки от токсического действия ксенобиотиков представляется весьма актуальной и ванной для биохимии проблемой. Многочисленными работами последних лет, выполненными как у нас в стране, так и за рубе;-;:ом, расшифрованы основные пути детоксикации чужеродных соединений; достигнуты значительные успехи в исследовали структуры, свойств, молекулярной организации ферментных систем, ответственных за биотрансформацию ксенобиотиков /Парк Д.В., 1973; Арчаков В.И., 1975; Покровский А.А., 1977; Панченко Л.Ф.и др.19В1;1яхович В.В., ЦырловИ.Б., 1981; Archakov, BacJimonova, 1990; Pellconcn, v&gaJtangas, 1990/. Однако, остается много неясного в механизмах регуляции ферментативной 'активности,роли отдельных ферментов в процессах биотрансформацпи е детоксикацки ряда ксенобиотиков, загрязняющих окружающую сре,ду и представляющих реальную опасность дая здоровья человека.

В последние гсды все большее внимание специалистов в области ох-, ранн окруяапц&й среды и токсикологии привлекают .химические соединения, имеющие в своей структуре эпоксидную группу. Это внимание к эпоксидам обусловлено их высокой биологической активностью: являясь Еысокореак-тивными электрофильными соединениями, эноксиды способны вступать в нуклеофилыше взаимодействия с -такими макромолекулами клетки, как ДНК и РЕК, что и обуславливает их токсическоэ, .мутагешое и канцерогенное действие /Коблякоз В.А., Коляда А.Ю., 1986; Hjrnandez, Ber.d, 1982; IARC. Monographs , 1385; Plummer ¡ft a!., 1987; Halankar et al., 1989/. Соединения этого класса широко, распространены в природе и могут поступать в организм человека в виде лекарственных веществ и загрязнителей пищевых продуктов, как биологического, так-и антропогенного происхождения /1утельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; Xi.RO Monog- . raphs,I985; Regnaud et al.,. 1988/. Эпоксидные соединения могут образовываться эндогенно в процессе метаболического превращения различных субстратов монооксигеназной системой клеток печени, легких, почек, желудочно-кишечного тракта и.др. органов /Наlankаг -t al., 1989; Archakov, Eachir-ciiova , 1990/. Учитывая высокую биологическую активность эпоксидов, внимание.специалистов в области ксенобиохимии сконцентрировано на ферментах, участвующих в процессах их обезвреживания, в частности на эпоксидгэдролазах /ЭГ/.................-.............

1.2. Цель /работы.. Целью настоящей работы.является изучение влияния различных алиментарных , и .токсических факторов на активность мин-? росомной ЭГ и некоторых 'ферментов метаболизма ксенобиотиков печени и . слизистой оболочки тонкой кишки крыо. Для ее реализации сформулирова-

ны следующие задачи:

- Дать сравнительную характеристику микросошгой ЗГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс;

- Изучить влияние алиментарных факторов /уровня пищевого белка рациона, .качественных различий жирового компонента рациона и различного обеспечения.рациона селеном/на активность и свойства ЭГ печени и слизистой оболочки тонкой кишш крыс; ...

- Изучить влияние некоторых конташнантов пищевых продуктов биологической природы /эпоксидсодержащих микотоксинов: Т-2 токсина, де-зоксиниваленола /ДОН/ и афлатоксина Bj/ на активность и свойства ЭГ печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс.

... 1.3. Научная новизна и теоретическое значение -работы. Впервые дана сравнительная характеристика свойств ЭГ макросом печени и.слизистой тонкой кишки крыс. При этом установлено, что оба.фермента тлеют одинаковый оптимум рН, близкие значения кажущейся но отличаются по Удельная активность ЭГ слизистой кишечника составляет 4,8-IO/j от активности з печени. Микросомная ЭГ печени и слизистой кишечника различаются по степени индуцибельности in vivo но в разной степени подвержены модулирующему действию активаторов in vitro.

При. выделении ЭГ.из микросом печени бил разработан метод, с помощью которого удалось получить высокоочищенный /в 63 раза/ препарат ЭГ печени и частичноочищенный /е 11,6 раза/ препарат фермента из. макросом слизистой.оболочки тонкой кшики крыс. Установлено, что характер питания оказывает выраженное регулирующее действие на активность микросоыной ЭГ и. других ферментов метаболизма ксенобиотиков пёчени. . крыс, и, в значительно меньшей степени, на активность фермента слизистой оболочки тонкой юшки.

1.4. Научно-практическая значимость работы. В опытах на животных доказана высокая чувствительность микросомной БГ к воздействии раз- . личных токсических факторов. В частности показано, что длительное поступление низких доз эпоксидсодернащих микотоксинов - Т-2 токсина .и . ДОН, а такие афлатоксина Bj, метаболизируыцегося в печени с образованием эпоксада, вызывает значительное.увеличение активности ЭГ как в печени, так. и в слизистой оболочке тонкой кишки-крыс.. Предложено использовать определение активности ЭГ цри токсиколого-гигиекаческой оценке.пищевых добавок и контаминангов пищевых.продуктов. ........

1.5. Внедрение результатов в практику.На основании проведенных . токсиколого-биохимпческих исследований,.вклгчаищих.изучение-.активности ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков, дано заключение. о безвредности пищевой добавки - интенсивного подсластителя аснарта-

ма /регистрационные удостоверения Минздрава СССР - П-8-242 .'í 01630 от 30 мая. 1989' г. и .П-8-242 й 0I90I от 6 июля 1990 г./.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на У Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модифшсация макромолекул" /Ялта, ноябрь 1989/; на 7-м Международном симпозиуме "Микроэлементы у человека и животных" /Дубровник, май 1990/; научной конференции с международным участием "Питание: здоровье и болезнь" /Москва, ноябрь 1990/.

Публикация результатов исследования. По томе диссертации онубли-ковано. 15' научных работ, перечень которых приводится в конце автореферата. -

Структура и объем диссертация. Диссертационная работа изложена на . страницах машинописного текста, включающих 3 схеш, 5'3 таблицы, '41.рисунок . и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы / источника, в том числе отечественных/.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар. Всего в работе было использовано более 700 животных.

В качестве исследуемого материала использовали микросомную фракцию печени и слизистой оболочки тонкой иппки крыс, получешую методом дифференциального центрифугирования / stohs et al., IS76; bate, 1987/. В микросомах печени определяли активность ЭГ /НФ 3.3.2.3/ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя в.качестве субстрата стиреноксид Дравченко Л.В., Соболев B.C., 1989/; содержание цитохрома Р-450 /НФ 1.14.14.1/ по методу Омура и Сато / Omura, Sato, 1984/; активность 7-этоксикумариццеэтилазы по,методу Лэйка /balee, 1987/ и.активность карбоксилэстеразы /Н§ 3.1.1.1/ по методу Мевдоса с соавт. / Mendoza et al., 1971/. В микросомах слизистой . оболочки кишки определяли активность ЭГ и карбоксилэстеразы. Содержание белка в мгпфосомных фракциях определяли по методу Лоури и соавт.

/Lowry et al., 1951/. . ..

Величины каяущихся ^ и У?лах определяли в координатах Лайнушэе-ра-Бэрка и Зди-Хофсти в пределах изменения концентрации субстрата от 0,03 до 0,6 мМ.

В опытах in vivo изучали действие бензила /вводили-в/бр; 5 дн.; 210 мг/кг/; трансэпоксистильбена /в/бр; 3 дн.; 400 мг/кг/; 2-ацето-амидофлуорена /в/бр; однократно; 35 мг/кг/;-бутилокситолуола/в/бр; 4 дн.; I г/кг/ и зиксорина /в/я; однократно; 120 мг/кг/. В опытах

in vitro бензил, трансэпоксистильбеи и бутилокситолуол добавляли в инкубационную среду в конечной концентрации I,G Ш /в 4 мил ДГЛСО/ за 5 шн до внесения субстрата /2 мМ/. Эпоксицкклогексен /1,6 i.í¡\ в ИСО/ и 1,2-э покси-3,3,З-трдхлорпропан /0,4 мМ з ацетонитркле/ одновременно с субстратом; 2-бром-4-нитроацотофеноя /0,3 t/М.в ацетоштриле/ за 10 МШ ДО внесения субстрата /О-och et al., I97I; Da Bolo et al., 1978; Dems.Soimoll, 1981/. Тал ингибирования и величины К^ ЭГ эпоксицшстогоксеном определяли в двойных обратных координатах при кон-центрацип субстрата 0,02-0,25 мМ и концентрациях ингибитора 0,15 к 0,25 ыЫ.

Выделение и очистку ЗГ из микросом печени и слизистой оболочки топкой кишки крыс осуществляли по следующей схеме:

г,ттросо?ляля зракщ . .

Солюбшшзация /1% гаствор холата натвия, , .0,1% раствор Тритона Х-100/

12 иг белка/мл,. 3 чася

ддтЕРГЕнт-со^одщ^зироБлиыЧ жубранкьй МАТЕРИАЛ

I. Высаливание сульфатом аммония /0 - 25%/ центрифугирование 23 ООО х g, 30 г,мн

ФРШШЯ /сультат аммония/ - s 2д

II. Высаливание сульфатом аммония /25 - 3&%/ центрифугирование 23 ООО х g , 30 мик

ФРАКЦИЯ /суль Дат аммония/ - sgg

III. Высаливание сульфатом аммония /36 - 6С%[ центрифугирование 23 ООО х g , 30 мин

ФРАКЦИЯ /после высаливания сульйатом ашония/ - s gQ Диализ

ХРОМАТОГРАФИЯ ДЕЛЕ - Sephncol ; 65 фракций

/Enuigen Е - 913; 0 ~ 0,5%; 7 ойщ>-500 т/

Чистоту и молекулярную массу белковых фракций проверяли гель-электрофорезом по методу Лзммли ДзсшиИ., 1970/'; гели окрашивали по методу Ныохоффа /J'euhoff et al. , 1985/; в качестве стандарта использовали набор белков /"Signa США/. .

При изучении влияния алиментарных факторов на активность ЭГ, животные содержались на изокалорийных полусинтетических рационах, разработавши Институтом питания АМН СССР.

При изучении влияния уровня пищевого белка животные в течение 2 мес. получали рационы с содергяавиом батка 5%, 18$ и 33% белка казеина. Изокалорийность обеспечивалась za счет изменения количества углеводов /маисового крахмала/. При изучении влияния качественно раз-

личных жиров рациона крысы были разделены на 5 групп и в течение 4 нед. получали полноценные рационы, жировой килтонент которых был представлен кукурузным маслом, лтрдом и.ихтиеновым маслом, полученным из мышечной ткани сельди "Иваси" /1,П и 1У гр.,соотштстве-нно/. В рационы крыс Ш и У.гр..жировой компонент которых был представлен лярдом и рыбьим жиром, добавляли «¿.-токоферол в концентрации, эквивалентной его содержании в кукурузном тело. При.изучешт влияния обогащения рациона селеном, крысы в.течение 6 нед. получали р^цнош с различным содержанием селена - 0,5; 1,0; 2,2 и 5,0 мг селена на I кг рациона. В качестве источника селена добавляли дрожжевую муку с вы- .. соким содержанием селена, селенометионин /"дгко ", Финляндия/ и селенит натрия. При.изучении хронического действия микотоксинов животные в течение 6 мес. получали Т-2 токсин /0,063 мг/кг массы.тела - 0,021 ИЗ 50/, ДОН /1,6 мг/кг - 0,024 Ы>50/, афлатоксин Вт /0,003 мг/кг -0,001.Ы> до/. Токсины- вводили в/ж в 0,1-0,5% растворе этанола 5 раз в нед. При изучении возможных механизмов. воэрасташш активности. ЭГ при действии трихотеценовых микотокелнов, подострый Т-2 токсикоз у тавотных вызывали введением Т-2 токенпа в/л в течение. 9 дней в дозе 0,64 мг/кг массы тела. При изучении влияния актиномицина и на сте-. пень возрастания активности ЭГ, вызванное Т-2 токсином, животным вводили фенобарбитал /в/бр; 75 от/кг; 5 дней/.и актиномицин с /0,1 ыг/кг; в/бр; за 30 шн до введения фенобарбитала/. Во второй серии.эксперимента животным вводили Т-2 токсин /в/я;. I мг/кг - 3 дня и 0,7 от/кг - 4 днд/ и актиномицин а за 30 мин до введения Т-2 токсина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВШЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделение, очистка и характеристика эпоксидшдролазы из микросом печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс.

1.1. Сравнительная характеристика мнкросомной гпоксид- . тадролазн печени и слизистой оболочки тонкой кишки.

В разных сериях экспериментов активность ЭГ в микросомах печени варьировала от 6,25 до 9,67, в слизистой оболочке тонкой кишки - 0,38 до 0,81 нмоль/мин на I мг белка. Для ЭГ микросом слизистой оболочки тонкой кишки значение кажущейся К^ было довольно близко к ^ фермента микросом печени, а величина V ;их значительно ниже /рис. I/. Ферментная реакция носила линейный характер в точение 30 шн инкубации при использовании как микросом печени, так и макросом слизистой тонкой кишки. Линейность ее сохранялась при. увеличении содержания белка в пробе от 0,025 до 0,4 мг в случае макросом печени и от 0,05 до 0,8 мг в случае микросом слизистой тонкой кишки. Оптимум рЕ для микросом-

Рис. 1 . Зависимость скоростя реакция, катализируемой епоксадгндролаэсй никросои печеяя ( А )

я слизистой оболочки тонкой кяшкя ( Б ) «рис, от концентрации субстрата.

I - В координатах Лайнуявера-Бэрка;

II - В координатах Эди-Лс4сти..

V _ шоль/иин/мг белка; [Í] - концентрация субстрата, иЫ;

У. - шоль/иин/иг белка/мМ субстрата.

IS) .

ной ЭГ слизистой тонкой ишки составляет 8,7, что соответствует оптимуму РН; установленному для ЭГ печени крыс и'других видов шгеотных /James et al., 1976; bu et Fil., 1977/. При изучении влияния различных концентраций неионпых детергентов - луброла, твина-80 к BRIJ-35 на активность ЭГ миздюсом печени и тонкой кишки, не было выявлена существенных различий.

Б опытах in vivo изучали влияние некоторых модуляторов на актив-кость ЭГ микросом печени и слизистой оболочки тонкой кишки. Как видно из рис. 2 бензил вызывал значительное возрасташю активности ЭГ в "печени /до 608$/; При введении трансстильбеноксида и бутилокситолуола, активность ЭГ возрастала в печени б 6,6 и 6,3 раза соответственно. У крыс,, получавших однократно 2-ацетоа\такофщуорен, активность фермента возрастала почти в 4 раза. Введение зиксорина сопровождалось возрастанием активности фермента в печени на 205$.

Изменения активности микросомной ЭГ в слизистой оболочке тонкой кишки цри введении модуляторов были выражены в меньшей степени. Так, введение зиксорина и бутилокситолуола не влияло на активность ЭГ, а трансстильбеноксид и 2-ацетоамидофлуорен вызывали возрастание активности в 1,6 раза. Значительное, до 2205, увеличение активности фермента в слизистой оболочке тонкой юшки наблвдали только при введении бензила /рис. 2/.

В опытах in vitro бензол такяе вызывал значительную активацию ЭГ как в кикросомах печени,так и в микросомах слизистой оболочки кишки /в 5,5 и в 3,4 раза соответственно/, з то время как трансстшгьбен-

оксид и бутилокситолуол вызывали незначительное возрастание активности фермента /соответственно на.20% и 50%/ только в микросомах слизистой оболочки тонкой кишки /рис. 3/. Изучение влияния ингибиторов на активность ЭГ микросом показало, что 1,2-эпокси-3,3,3-трихлорпро-

Гю. 2 „ buu. 1» «„ u

inccui-upseaii ыжрсеси nno ( i ) i camcrel й»я|| tciioI mi ( G )

1 - Koarpoo;

2 - Eeurjti _____

3 - Т^знестии«яока£» Б . ¿teep^" Ахтнлоеп (cpieiit [cranu н I r nui.

" ' tí"<"5"Я гявши

fia. 3 • Езалиа 1л «t» uiete^x модуигтого! ш unuocti •DoxctuuvpajcuH HUpoccm ввчвяя ( 1 ) а сплстсА обивш rouat tmi ( Б ) spue.

4 - 2-lurouiuci<3jop«({ 8 • EytuoireiTasyax;

1 • Еытрслэ;

2 - Eiuu¡

3 • TpuecTUfc&toicaa;

4 • EjTBJo*civagoj.

ütiuocn {ipiein ^cunu u l кг биа».

пан и 2-бром-4-нитроацетофеноп подавляли в равной степени активность ЭГ в печени и в слизистой тонкой кишки. Эпоксициклогексен оказывал более сильное ингибируюцее действие на активность фермента в микросомах печени. При этом установлено, что эпоксициклогексен ингибирует активность ЗГ слизистой тонкой кишки,' так se как и активность фермента печени по неконкурентному типу. Константы ингибирования /K¡/ ЭГ мик-росом печени и слизистой кишки были близки и составляли соответственно 0,10 и 0,14 Ш /рис. 4/........... -

.Таким образом, на основании сравнительного изучения свойств ЭГ. мшсросом почени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс было установлено, что оба фермента имеют одинаковый-оптимум рН, близкие .значения' Код,. но отличаются по УЬ!ах. Отмечается положительная корреляция меяду, изменениями активности ЭГ в микросомах.печени и слизистой тонкой кишки при воздействии различных модуляторов как in vivo так И-in vitro что позволяет предположить.существование общих механизмов регуляции активности обоих ферментов.

в

1.2. Выделение, очистка и характеристика эпоксид-гидролазы из микросомальной фракции печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс.

Ьзл11 1а тНм «мотора мгжОятэро» и итшосп »пмсигироши мжкровсн вежи ( к ) ■ «иыехоЯ оОоаочы *м*ой пи ( Б ) жрно.

2 - Хоиров; 3 - 1,2-2ио«ся-3,3,3-«рияорарео

2 - Эаокыдокгисм; 4 • 2-Браы-4-отроаа»Тсфеяоа.

Атвосп {врмга ришш у I иг ¿«т.

• • ^Зозмчаеу хоого*ервооп вш<а! **хх7 гртшша

Выделение и очистку ЭГ из микросом-ной фракции печени, и слизистой кишки, осуществляли по указанной выше схеме. Как видно из данных, представленных в табл. I, степень максимальной очистки ЭГ, локализованной во фракциях после хроматографии на ДЕАЕ - Ь'ер1мсе1 составила 63,3 раза для микросом печени и 11,6 раза - слизистой тонкой кишки.

Абсолютный абсорбционный спектр очищенного фермента печени имеет основной пик около 280 нм. Плечо в районе 290 нм указывает на высокое содержание трип- ^ тофана. Отсутствие пика абсорбции в области 320-560 нм свидетельствует об . отсутствии гема.или фланнна. . .

Таким образом, е результате проведенных экспериментов удалось выделить высокоочищеныый препарат /более, чем з 63,3 раза/ фермента из микро-сом печени с удельной активностью 481,4 нмоль/шн/мг белка н часгкчно-очищенный./в 11,6 раза/ препарат фермента из микросом слизистой тонкой кишки с удельной активностью 4,4 нмоль/мин/мг белка.

2. Изучение влияния различных алиментарных факторов на активность зпоксидгадролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени ж слизистой оболочки тонкой кишки крыс

2.1. Изучение елияния_ уровня пищевого бачка на активность и некоторые свойства эпоксид-гидролазы"печени и слизистой оболочки тонкой •кишки крыс.

Как при снижении, так и при увеличении квоты белка в рационе наблюдается возрастание активности ЭГ /табл. 2/. Так, у крыс, получавших малобеякозый рацион, активность ЭГ возрастала более чем в 2 раза, а высокобелковый - на 86$. В микросомах слизистой оболочки тонкой кишки и дефицит, и избыток белка в рационе крыс вызывали незначительное

Таблица I.

Степень очистки эпоксидгидролазк из макросом печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс.

| Содержание ; Активность эпокскдг-.щролазы 1 Очистка,

ОРАКЦШ ( белка, мг | нмоль/мин |нмоль/мин/мг бел] Выход, % кол-бо раз

;печень { кишка 1 1 печень кишка ¡лечена кишка | печень | кишка пзкэкь I килка

Микроссмы 3560 1508 1Э700 572 5,6 0,30 100 100 1,0 1.0

Фракции

сульфата

аммония 2300 2100 14500 483 6,3 0,23 66,5 98,0 и 0,6

ДЕАЕ-ЗврЬ.асе1

Фракции 26,2 - 12610 254 481 4,4 64,0 46,0 63,3 11,6

Таблица 2.

Влияние уровня белка в рационе на активность эпоксидгидролазы, карбоксилэстеразы и содержание цитохрома Р-450 з мшфосомах печени и слизистой тонкой кишки крив.

Ферменты

Содержание белка в рационе, -1-

16

33

Печень

Зпоксвдг'царолаза, нмсль/мин/г ткани

Карбоксилэстераза, нмоль/мин/г ткани

Цитохром Р-450, нмоль/г ткани

Слизистая тонком кишки

Зпоксидгвдролаза, нмоль/минД- ткани

?.01,2±29,5б

8,57±0,62б'в

Ю,7±1,7В

1,83±0,31

89,6±И,1а'в

10,8Э±0,47а'в

14,4-0,5в

2,44±0,К

166,6*12,16 15,35±0,45а>6 18,5-1,За,<3

2,16-0,25

Представлены средние данные (М - ш ) для 6 животных;

а,б,в__ значения, обозначенные различными букпями, статистически достоверны 1'Р<0,05) одинаковыми - статистически недостоверны.

5

снижение активности ЭГ. При этом, содержание цктохрома Р-450 и активность. карбоксилэстеразы в микросомах печени находились в прямой зависимости от уровня белка в рационе животных: при дефиците белка содержание цитохрома Р-450 и активность карбоксилэстеразы были на 26$ и 21% соответственно ниг.о, а при избытке - на и 41$ соотзетствен-но выше, чем в контроле.

, На удалось выявить существенных различий в величинах кажущейся

К, ЭГ из миктюссм печени крыс, получав-

м ^ ««i------

ших рационы,.с различным содержанием бел- _ _

ка. .С целью характеристики микросомноЗ ЭГ f''' Г| | \

печеш крыс, получавших рациош с 5% и 18% белка, изучено in vivo и in vitro влияние некоторых модуляторов активности фермента /рис. 5/'. Как видно из представленных данных, введение бензила сопровождалось индукцией ЭГ в равно:! степени выраженной у крыс, получавших рационы с 5% и 18% бачка, in vitro бзнзшг вызывал многократную активацию ЭГ как в микросомах, выделенных из печени крыс, содержавшихся на малобелковсм рационе,, тале и в микросомах печени животных, получавших полноценный по белку рацион /18%/.

Изученные ингибиторы также- в равной степени .........

подавляли активность ЭГ в микросомах печени крыс обеих экспериментальных групп. Полученные результаты свидетельствуют, что микросомальная ЭГ печени крыс, получавших малобелковый рацион, не сличается существенно по своим свойствам от фермента печени животных, получавших рацион с. 18$ белка к з равной степени сохраняет способность к индукции и активации.

Изменение /уменьшение/ шкровязкости мембран ондоолазматического ретикулума /Ляпков Б.Г., 1984; Ног-Ъоппе et al. , 1934; Khnr., И.ягп, 1988/ возможно является едноа из причин возрастания активности ЭГ при изменении уровня белка в рационе. Полученные в настоящей работе результаты, указывающие на отсутствие существенных изменений свойств /в том числе К^ ЭГ при шгзкем уровне белка в рационе, позволяет предположить, что возрастание ферментной активности в отих условиях может быть также следствием индупцш фермента.

Тж. 5. ii> Чп ( Л ) ■ i. ittn ( К }

ио^гягзге* и и<т4мос-к »кокеттгтгчт.-к мчтое* -*¡< pJjlit ст. ■ рщпм.

I - Кщтт^»

'í - cozcxam ifД t puxoie;

I - Sent:; 2 - —.'tci'ni.( 3 » í-."; *---ií ."7*".'. " "f. r . - ".

UraingcTi и I tr U.01.

> ^íunmí socreiB^üCTb CT-ji H.*^ rpjm-я

Pío. 6, tann« u un (l)iu ( E ) «ug-орщ

iwajJMTopoi u <)1Шхть ыгмсютхрааэм mipocai

■ всчеи крыс, I'^iJшал ачкггмяо {виаоди upu с jnazvu.

1 - XjxjpjlM* маг то; ! - I>pi¡ 3 - FvCi* жар.

2.2. Изучение влияния качественно ра&личных жиров

рациона на активность и некоторые свойства зиок-сидгидролазы печени и слизистои оболочки тонкой шшш крыс. ""

Содержание животных на рационах с рыбьим жиром приводило к возрастанию активности ЭГ в макросомах печени в 1,6. раза по сравнению с животными,,лолучавшиыи кукурузное масло и в 1,9 раза - лярд. При атом содержание цитохрома Р-450 и активность карбоксилэстеразы в микросомах печени животных всех груш практически не изменялось. Добавление «(-токоферола в рационы с лярдом и рыбьим жиром практически не влияло на активность ЭГ и содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс. Использование в рационах животных различных жиров не оказывало существенного влияния на активность изученных ферментов в слизистой тонкой кишки. Величины кажущихся Ку для ЭГ в этих экспериментальных группах имели близкие значения. Для изучения инду-цибальности, как одной из основных-свойств зтой группы ферментов, в опытах, in vivo изучено влияние бензила на активность ЭГ. Как видно из рис. 6 бензил оказывал избирательное индуцируыцее действие на мик-росомную ЭГ в печени. В микросомах печени крыс, получавших кукурузное масло, активность ЭГ возрастала при введении бензила на 270$, на рационах с лярдом - на 340/, а с рыбьим жиром - на 430$. Не выявлено изменений активности микросоглной.ЭГ и карбоксилэстеразы в слизистой тонкой кишки крыс, получавших бензил на фоне рационов с кукурузным маслом и лярдом. В то же время использование в рационах рыбьего жира приводило к увеличению активности ЭГ в слизистой тонкой юшки при введении бензила на 70/2.

Из данных представленных на рис. 6 видно, что in vi-tro бензил активировал ЭГ макросом печени на 400% независимо от характера жира в рационе. В отличие от бензила, метирапсы в равной степени /на 240$/ вызывал увеличение активности ЭГ в микросомах, веделеглшх из печени крыс, получавши кукурузное шел о и рыбий жир. В микросомах печени

К- KO£Tpoll¡ I- £*юи;

U ■ Ш •

. Itenpucl; - Цшотсеяохси. Джтяшсп (Ф»т ртсита и I кг бел*. • - (у0^4^ маоа ыехз хрушииа

Таблица 3.

Влияние качественно различных жиров рациона на удельную активность эпоксвдгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени крыс

Ферменты I Г р у п п ы КИВОТНЫХ

■ кукурузное ! масло | лярд } лярд + вит. Е | рыбий рыои/ жир + БИТ. Е

Зпоксицгвдролаэа, кмоль/мин/пг белка 9,09±0,65а 7,70-0,45а 8,'16-0,75а 14,47±0,60в 13,78±0,57в

Карбоксллзстераза, к'кмоль/м1Н/мг* белка 0,16±0,007а 0,16±0,01а 0,Ю±0,01а'в 0,20±0,007а'в 0,22-0,01в

Цитохрсм Р-450, ныоль/мг белка 0,95±0,С4а 0,91±0,0оа 1,0С±0,02а'в 0,95±0,05а'в 1,17±0,07в ^ 1,14±0,ИВ

7-отокс::ку!;ариндоэтп-лаза.кмоль/мин/мг белка 0,86-0,05 ' Е 0,65±0,03а 0,34±0,04а'в 0,8б±0,09а,в ■

Нрздстаьлеш средние данные Ш + л ) для 6 животных;

а,в - значения, ооознгчешше различными буквами, статистически достоверны (Р< 0,051; одинаковыми - статистически нз достоверны

животных, получавших лярд, метиранон активировал ЭГ на 389$.

Степень ингибирозания ЭГ циклогексеноксидом была резной /около 65/2/ в микросомах"печени крыс, получавших лярд и кукурузное тело и составила 50^ в микросомах отвотных, получавших рыбий хсир.........

Таким образом, источник гшра в рационе не только значительно влияет на удельную активность мккрссомной ЭГ, но и молот изменять способность ее к индукции как в печени, так и в слизистой оболочке тонкой кишки. Возрастание актизности шкроссмной ЭГ печени/ вызванное изменением лирнокислотного состава мембранных липидов, по-видимому, связано с изменением таких функций мембран, как мпкровязкость и пронкцае-мость. Мояно предположить, что максимальный уровень активности ЭГ при использовании рыбьего аира связан не только с уменьшением микровязкости, но и с изменением проницаемости.клеточной мембраны / Croeat et al. , 1989; Borgeson et al. , 1989; Víatr^iabe et al. , 1989/. В пользу этого предполояешш свидетельствует факт обнаружения прямой зависимости степени индукции ЭГ бензилом в опыте in vivo от количества ПН ККб)3 в липидах макросом и отсутствия различий в стелет активации ЭГ при действии бензила in vitro . По-видимому, увеличение проницаемости клеточной мембраны приводит к изменению внутриклеточной концентрации индуктора и облегчает доступ субстрата к активноцу центру фермента. Обсуждая зозмоленые причины увеличения активности ЭГ при увеличении доли ПНДК в липидах микросом, следует отметить, что определенную роль в этом могут играть эпоксидо, .содержащиеся в маслах,/iiouniв et al. , 1988; KGraíl, Mauael , 1990/.

2.3. Изучение влияния обогащения рациона, селеном на активность эпоксидгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени крыс

Обогащение рациона селеном до2,5мг/кг не вызывало существенных изменений активности ЭГ и других изученных фердентов в микросомах печени крыс; только активность 7-этоксикумарицдеэтилазы возрастала на 51? от контрольного уровня. Лишь при увеличении концентрации селена в рационе до 5мг/кг наблюдалось резкое /до 239^/ возрастание активности ЭГ в шкросомах печени. Скорость деэтилирования 7-этоксшсумари-на при этом оставалась повышенной /на 42%/ /рис. 7/.

При сравнешш различных химических форм селена - селенометиошша и селзпита натрия в концентрации 5 мг/кг, наблюдалась та же тенденция изменения ферментной активности. В большей степени эти изменения в активности ферментов бьиш впраяены при использовании в рационах лшвот-них натрпя селенита. Степень изменений в активности ферментов коррелировала с гистологическими изменениями, обнаруженным в печени крыс,

получавших натрия селенит с рационом.

Механизмы.обнаруженных изменений активности изученных ферментов, в частности ЭГ, не ясны. Можно предположить, что эти изменения связаны с действием высоких доз селена на биологические мембраны - как антиоксидантный фактор, по мнению одних исследователей, или как прооксидант, по мнению.других / Combs, 1985/. Однако, заслуживает внимание предположение /Leiter, Wendel, 1983/ об участии селена в ферментном катализе или' его регуляции.

3. Изучение влияния эпоксидсодержащих микотоксинов на активность эпоксидгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотпкоз печени к слизистой оболочки тонкой кишки крыс. -

3.1. Изучение влияния хронического воздействия микотоксинов на активность эпоксидгидролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс.

Как видно из табл. 4, длительное поступление низких доз Т-2 токсина, ДОН и афлатоксина Вт сопровождалось достоверным возрастанием активности ыикросомной ЭГ на 39%, 31% и 46%, соответственно. Активность карбоксшгэстеразы и 7-этокспкуг.1арицдеэт:1лазы при Хроническом воздействии микотоксинов существенно не отличались от контрольного уровня. Некоторое достоверное увеличение содер-:санпя цитохрома Р-450 /на 24%/ наблюдали при введзшш Т-2 токсина, который подвергается гпд-роксилированию в цитохром P-450-содеажэщей монсокеигеназног системе печеки.

До настоящего времени остается невыясненным, может ли мпкроссм-ная ЭГ участвовать в обезвреживают Т-2 токсина и ДОН - эпоксадсодзр-жащих трихотеценовых микотоксинов. Однако обнаружено, что эпоксидсо-держацие соеданешш способны специфически активировать ЭГ печени / lieijer , De .Pierro , 1387; Sinrheinor et al. , 1987; M«-g<1i1ou,

joo ,

о - ra

gioo 1

К 123 123 1ГЗ 123 123 123

Pic, 7. Виллив odoiBtwRM рациона селеиол ва алтвигсет» апоксядгялролавн I aexoTopia Ссрисат^в иетабэялзма кеенойяотио» пвчеад хрип. К - яоитроя*! _ _ ,

А - 0,5; Б - 1,0} В - 2,5 я Г - 5,0 кг Ов/жг решова; Д - Ссленшетвонва я В - Сыеяят натри (5,0 kr 3ey?i I - Элоксилпяра-азв! 2 - Цятохр** ?-<S0j 3 - ?-Это>си^у^аррадь>твлааа. ■ - о<5озвачвет достоверность отлга! меаду ¡yy\:rnxf.

Таблица 4.

Влияние хронического воздействия ыикэтоксиков на удельную активность зпоко.вдгщролазы и некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков печени и слизистоГ; тонкой кишки кшс.

---,-1-

Контроль | Т-2 токсин ! ДОН

Ферменты

Афлатоксин Вт

Печень

Эпоксицгчшролаза, нмоль/мин/мг белка

1Сар бо к с ллэ ст ераза, мк?-голь/ыин/мг белка

Цитохром Р-450, нмоль/мг белка

7-этокеику1,ар/иццеэтила-38,нмоль/мин/мг белка

Слизистая оболочка тонкой киаки

Эпо::сид гидра лаза, нмоль/мин/мг белка

Карбоксилэстераза, мкмоль/мин/мг^ белка

6,05-0,71 0,220*0,022 0,86*0,05 0,77*0,07

0,64*0,10 0,45*0.02

8,43*0,90* 0,205*0,014 1,07*0,06х 0,81*0,07

1,40*0,25* . 0,60*0,06*

7,96*0,24* 0,218*0,013 0,84*0,05 0,82*0,08

0,97*0,10* 0,66*0.08*

8,54*0,69* 0,226*0,009 0,95*0,04 0,87*0,08

1,14*0,14* 0,41*0.31

Представлены средние данные (М * в ) для 6 животных ; к - обозначает достоверность отличий между группами (Р < 0,05)

Нмтсск , 1988; Неепаиа е^ а1. , 1988/. Возможно, что аналогичный механизм лежит в основе выявленного на фоне введения трихоте-ценовых микотоксинов возрастание активности этого фермента. В целом обнаруженное у лсивотных опытных групп умеренное возрасташе активности микросомных ферментов печени и слизистой оболочки тонкой

Рис. 8. Бллялве Г-2 гокспна на аятгисст» ?гокс:.ш^1гр<иазк uuFpocoM печенл врьс.

К - Ноятролъ; X - Т-2 токсвв, HJ.

V - Hjon/uiiHA'ir Сэляа;

контеятрацял суеегрвга.

кишш молет рассматриваться как адаптивные в ответ ка дадтельное введение микотоксинов. Обнаруженные изменения активности ферментов в слизистой оболочке тонкой кишки показывают, что поступающие с пищей незначительные количества микотоксинов могут впия'гь на метаболизм, распределение в организме и конечный биологический эатрект боль шого числа чужеродных соединений, поступающих в организм алиментарным путем и подвергающихся биотрансформацпи уже в процессе всасывания.

3.2. О возможных механизмах возрастания активности эпоксидгидролазы при действии трихотеценозых микотоксинов.

Как было показано, хроническое действие трихотеценовых микотоксинов сопровождается достоверным возрастанием активности ЗГ в михросо-мах печени крыс. В связи с этим была предпринята попытка объяснить возможный механизм действия Т-2 токсина на активность этого фермента.

В .первой части эксперимента, у .-кивотных получавших Т-2 токсин а дозе 0,64 мг/кг в течение 9 дней активность микросомной SI' возрастала в печени до 181$, при этом нэ обнаружено различий в величинах кажущихся К^,. хотя У^.дпя ЭГ печени крыс, получавших Т-2 токсин была пес-ксяькс выше /рис. 8/.

Результаты, полученные в опытах in vitro показали,, что Т-2 токсин не влияет на уровень активности ЭГ в микрссомах печени: 3,53 i 0,10 нмоль/мин/мг белка, против 3,54 - 0,10 шголх/мпн/мг белка в контроле.

Не обнаружено существенного влияния Т-2 токсина на процессы ПОЛ в мембранах макросом печени крыс. В то ке время, в опытах in vitro в условиях индукции каорн -зависимого ПОЛ активность ЭГ подавлялась.

Наряду с этим, возрастание активности микросомной ЭГ, вызванное многократным введение Т-2 токсина.в значительной степени (более, "ем V 3 раза) уменьшалось при введении актиномицина D.

Полученные результаты позволяют предположить, что возрастание активности ЭГ при введении Т-2 токсина, ло-лидимоцу, является результатом индукции синтеза ферментного белка.

ВЫВОДЫ

1. Дана сравнительная характеристика свойств ЭГ микросом печени и слизистой тонкой кишки крыс. Установлено, что оба. фермента имеют одинаковый оптимум рН, близкие значения кажущейся К,{, но отличаются по У;дах. Удельная активность ЭГ слизистой кишечника составляет 4,.8#-

от активности в печени. Микросомная ЭГ печени и кишечника различаются по степени индуцибельности in vivo но в равной степени подвержены модулирующему действию активаторов in vitro.

2. Выделен высокоочшценный /в 63 раза/ препарат ЭГ из микросом печени крыс с удельной активностью 481,4 нмоль/мш/мг белка и частично очищенный /в 11,6 раза/ препарат фермента.из микросом слизистой оболочки тонкой кишки крыс с удельной активностью 4,4 нмоль/мин/мг белка. Даш электрофоретическая и споктральная характеристики полученных препаратов ЭГ.

3. Характер питания оказывает выраженное регулирующее действие на активность микросомной ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков печени крыс и в значительно меньшей степени на активность фермента слизистой оболочки тонкой кишки.

4. В отличие от цитохрома Р-450, 7-этоксикумариндеэтилазы и кар-боксилэстеразы, активность которых находится в прямой зависимости от уровня белка в рационе, активность ЭГ при низком /5%/ уровне белка более чем в два раза превышает активность фермента при нормальном уровне /18%/ белка в рационе. Микросомная ЭГ печени крыс, получавших малобелковый рацион, не отличается по своим свойствам от ЭГ печени крыс, получавших полноценный рацион. . ...

5. Увеличение доли 1ЛГЕК со 3 в рационе сопровождается возрастанием их концентрации в мембранах шкросом и значительным увеличением . удельной активности и индуцибельности микросомной ЭГ.

6. Обогащение рациона селеном в количестве до 2,5 мг/кг не оказывает существенного влияния на активность ЭГ и других изученных ферментов мшфосом печени. В концентрации близкой к токсичной - 5 мг/кг,

как органичекая, так и неорганическая формы селена вызывают резкое возрастание активности ыикроеомной ЭГ. .

7. Длительное поступление низких доз зпоксидсодержащих микотокси-нов - Т-2 токсина и ДОН, а.также.афлатоксина Bj, метабализирующегося в печени с образованием эпоксида, вызывает значительное увеличение активности ЭГ как в.печеш,, так и в слизистой-оболочке тонкой кишки крыс. Установлено, что возрастание активности фермента, по крайней мере частично, является результатом индукции его синтеза.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

На основании проведенных токсиколого-биохимических исследований, включающих изучение активности ЭГ и других ферментов метаболизма ксенобиотиков, дано заключение о беззредности пищевой добавки - интенсивного подсластителя аспартама /регистрационные удостоверения Минздрава ССОР -.П-^8-242 ffi 01630 от 30 мая 1989 г. и II-8-242 J3 0I90I от 6 шия 1990 г./.

СПИСОК РАБОТ, 01ШЖК0ВАНЕШ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сравнительная характеристика микросомэлыгой эиоксидгндролазы печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс. //Вопросы медицинской химии, .1988, J5 6, 122-128./Соавт. Л.В.Кравченко, В.С.Соболев/.

2. Новые данные о метаболизме и физиологическом мехачизме действия аспартада.//Вопросы питания, IS89, ii I, 20-24./Соавт. В.А.Тутель-ян, М.М.Гаппаров, О.А.Вировец, Л.В.Кравченко, А.В.Васильез, А.И.Соколов, Л.С.Коновалова, Л.С.Василевская, Г.К.Шлнгик, И.Б.Тарасова, Т.А.Воробейчик/.

3. Цитохром Р-450 и ферменты функционально связанные с ним в печени крыс при Т-2 шкотоксикозе на фоне разного обеспечения селеном. //Тез. докл. У Всесогазн. конференции."Цитохром Р-450 и модификация макромолекул". - Ялта.-1989, 367-368,/Соавт. В.А.Тутельян, Л.В.Кравченко/.

4. Активность ферментов метаболизма чужеродных веществ в печени и слизистой.тонкого кишечника в условиях дефицита и избытка пищевого белка. В.кн.: Теоретические и.клинические аспекты науки о питании. Т. 9. М.,. 1989, 27-39./Соавт. Л.И.Авреньева, Л.В.Кравченко/.

5-. The effect of aspnrtsmn on the activity of r?t liver rer.obio-tic metabolizing enzymes. // Drue Metnboliqm and deposition, 1990, v. 18, 223-225 Aiith V.A.Tutelyan, L.V.Kravchenko/.

6. Защитное действие селена при остром Т-2.микотоксшсозе.//Вопросы медицинской.химии, 1990, is 5, 36-38./Соавт. Л.В.Кравченко, Л.И.Авреньева, В.А.Тутельян/.

7. Обмен кальцпя, витамина в и ферменты.метаболизма ксенобиотиков при хроническом воздействии микотоксинов.//Вопросы питшшя, 1990, й 5, 25-30,/Соавт. И.Н.Сергеев, Н.М.Пилия, Л.И.Авреньева, Л.В.Кравченко, В.Б.Спиричев, В.А.Тутельян/.

8. Роль питания в регуляции активности ферментных систем, обеспечивающих защиту организма от чужеродных веществ.//Тез. дскл. Науч- .. ной.конференгцш с международным.участием."Питание:, здоровье и болезнь". - Москва.-1990, 103,/Соавт. Л.В.Кравченко, Л.И.Авренъева/. ..........

.. ,9. Пищевой белок как модулятор активности ферментов, метаболизи-рующих ксенобиотики. Эшксидгидролаза.//Вопрссы питания, 1990, й 6, 61-64./Соавт. В.А.Тутельян, Л.В.Кравченко/'.-

10. Mycotoxins and nutritions effect of dietaiy selenium on the toxicity of T-2 toxin. // 2-nd Asia-Pacific Сопк.Animal,Plant"eiid Uicich, Toxine, Banayes Hindu Univ..Varanasi, India, Feb.19-22, 1990, p.94. /With L.I.Avrenyeva, L.V.Kravchenio/.

IX. Purification and characterization of microsomal epoxide hydro-• lasea from liver and inteetinal mucosa of rf.t and Candida maltosa yeast // Proc. YlXIth Intern.Symp. on Microsomes end Drug Oxidations, Xaro-linaka Inst..Stockholm, Sweden, Juno 25-29, 1990, p.217. /Ш-th S.U. Avetisova, i.A.Popovc/.

12. On the mechanism of protective effect of selenium against, acute T-2 mycotoxicoeis. // Abstr. 7-th Intern.Symp. on Trace elements in men end animals. Univ.Zagreb, Dubrovnik, Croatia, Yugoslavia, May 20-25, 1990, p.76. /V.'ith L.V.Kravchenkc,L.I.Avrenyeva,V.A.Tutelyan/.

13» Effect of selenium-supplemented diets on the activities of drug-metabolizing enzymes in rat liver. // Abstr. 7-th Intern.Symp.on Trace elements in man and animals. Univ.Zagreb,Dubrovnik, Croatia, Yugoslavia, May 20-25. 1990, p.103./With L.V.KraVchenko,V.A.Tutelyan/.

14. She activity of xenobiotic-metabolizing enzymes in the liver and small intestine of rats fed low and high levels of protein.//llutr. Res., 1990, v. 10, III9-II29. /With V.A.Tutelyen.L.V.Kravchenko, L.I. Avrenyeva/.

15- Dietary eelenim protects against acute toxicity of T-2 toxin in rats. // Food Additives and Contaminants, 1990, v. 7, lio 6, 321827. /tfith V.A.Tutflynn, L.V.Kravchenlco, L.I.AVranievs, J.T.Kumpulsi-nen/.

За*. 3 r'2k Тип. МЗ РСФСР T';,-.