Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение трансформирующей активности ДНК из опухоли толстой кишки человека in vitro

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение трансформирующей активности ДНК из опухоли толстой кишки человека in vitro"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ АРМЕНИИ . НАУЧНО-ИССЛВДОВАТМЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРОКТОЛОГИИ

На правах рукописи

ДАВТЯН Ольга Яковлевна

УДК 6IS.345-006.04.547.96- 3.32+576.858.6

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ДНК ИЗ ОПУХОЛИ ТОЛСТОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА IU VIVO

03.00.03 - молекулярная биология

А В'Т о р е ф е р а г

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1992г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте проктологии МЗ Республики Армения.

Научные руководители: к.б.н. ЗАХАРЯН P.A.

д.м.н. НАЗАРОВ Л.У.'

.«

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор ХАЧАТРЯН Г.С.

д.б.н., профессор ПАНОСЯН Г.А.

■ Ведущая организация - Институт тонкой органической химии АН Республики Армения.

1Я.'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Армении.

Защита диссертации состоится " -1992 г.

в ^"^асов на заседании специализированного совета

и

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

СШОНЯН А. А,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕНГСОИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы« В последние десятилетия наблюда- • ется постоянный рост заболеваемости раком толстой кишки в большинстве экономически развитых стран. Несмотря на внедрение в практику новых методов диагностики и разработку комбинированных способов лечения, сохраняется низкий уровень выживаемости больных. Основной дричиной этого являются рецидивы и метастазы, заболевания. Очевидно, что дальнейший прогресс в области клинической онкологии, и онкопроктологии в том числе, невозможен без глубоких фундаментальных исследований' процессов опухолевого роста, на основе которых могут быть разработаны ноше подходы в ранней диагностике опухолей, а также б'олее эффективные,-менее токсичные и дающие стойкие результаты методы лечения.

Для решения этих вопросов необходимо иметь соответствующие экспериментальные модели, которые бы воспроизводили.опухолевый рост на организменном уровне. Существующие в настоящее время модели рака толстой кишки на животных основаны на применении различных экзогенных химических канцерогенов или трансплантации опухолевых клеток. Однако даже системы, которые насколько возможно имитируют условия толстой кишки человека,имеют несколько серьезных.недостатков: морфологические различия, экспериментально индуцированной опухоли и рака толстой кишки человека, м'улмицентричность возникновения опухолей, другой характер метасзазирования и так далее.

Принимая во внимание вышесказанное, а также учитывая многочисленные сообщения о трансформирующей активности человечески опухолевых ДНК в экспериментах in vitro , мы сочли целесообразным рассмотреть возможность моделирования in vivo рака толстой кишки человека путем введения человеческой ДНК . из опухоли толстой кишки экспериментальным животным.

Экспериментальная модель para толстой кишки человека,полученная с использованием опухолевой человеческой ДНК, дает возможность исследовать влияние лечебных препаратов на течение; процессов трансформации, в результате чего дать определенные рекомендация по выработке оптимальной лечебной тактики больных опухолями толстой кишки, направленной на предупреждение• рецидивировання и ыетастазирования процесса.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследова-■ния явилось изучение in vivo трансформирующей активности ДНК ■ из опухоли толстой кшки человека и на основании исследований изучение возможности создания экспериментальной модели рака толстой кишки человека. '

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

- получить высокоочищенный препарат ДНК из опухоли толс---той кишки человека;

- изучить физико-химические свойства опухолевой ДНК;

- изучить трансформирующую способность человеческой опухолевой ДНК при введении ее экспериментальным животным; провести сравнительное морфологическое изучение препаратов толстой кишки, печени, других внутренних органов животных опытной и контрольной групп;

- провести эксперимент по молекулярной гибридизации образцов ДНК для выявления возможности интеграции фрагментов чело-'' веческой опухолевой ДНК в чужеродный геном;

- изучить влияние биостимуляторов - низкомолекулярных РНК биологического происхождения - на течение неопластических изменений у экспериментальных животных.

Научная новизна исследования. Проведенные нами исследования показали, что ДНК из опухоли толстой кишки человека проявляет трансформирующую активность i-n vivo f При внутрибршин-ном введении беспородным лабораторным крысам. Трансформирующее действие человеческой опухолевой ДНК выражается в индукции неопластических изменении в лизистой оболочке толстой кишки экспериментальных животных.

Введение биостимуляторов природного происхождения - дву-спиральной РНК - животным с индуцированными неопластическими изменениями в слизистой оболочке толстой кишки оказывает положительное влияние и приводит к регрессии процессов трансформации.

Практическая значимость работы. Показана возможность моделирования iü vivo рака толстой кишки человека принципиально новым путем - введением опухолевой человеческой ДНК внутри-бршинно беспородным лабораторным крысам.

Методом молекулярной гибридизации образцов ДНК показано,

что имеет место интеграция фрагментов человеческой опухолевой ДНК в геном трансформированных клеток крысы.

Изучение влияния биологических стимуляторов - низкомолекулярных РНК - на течение неопластических процессов в эксперименте позволяет рекомендовать двуспиральную РНК биологического происхождения для применения в онкопроктологической практике с целью профилактики метастазов и повышения неспецифической резистентности организма. -

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании ученого совета НИИ проктологии на научной конференции Ереванского зооветеринарного института 11987), на научной конференции Ереванского зооветинститута к 60-.летию (1988), на 7 конференции, посвященной 25-^хетию основания ЕрШУЕз (1989), на конференции молодых ученых НИИ. проктологии' (1989). '

Публикации. Цо теме диссертации опубликовано 8 научных работ, 2 рацпредложения.

Объем и структура работы. Диссертация изложения на 107 страницах машинописного текста я состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов. Библиографический указатель включает труды 99 отечественных и 137 иностранных авторов. Текст диссертации иллюстрирован 3 таблицами и 14 рисунками.

Положения, выносимые на защиту:

- ДНК из опухоли толстой лишки .человека обладает биологической активностью щ » выражающейся в трансформирующем воздействии на слизистую оболочку толстой кишки экспериментальных животных;

- индукция неопластических изменений происходит в результате. интеграции фрагментов человеческой опухолевой ДНК в геном клеток слизистой оболочки толстой кишки экспериментальных животных;

- введение'двуспиральной РНК природного происхождения животным с индуцированными неопластическими изменениями в слизистой оболочке толстой кишки оказывает положительное влияние,способствуя регрессии процессов неопластической трансформации.

СОДЕРИНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методики исследования. ДНК получали из опухоли толстой кишки, резецированной по поводу аденокарциномы, по ме-. тоду Marmur J. (196I). Депротеинизадия ДНК, предназначенная для введения животным, осуществлялась только с помощью хлороформа, для предотвращения токсического действия фенола на организм 'экспериментальных животных. Депротеинизированную ДНК осаздали свежеперегнанным этанолом.

Количественную оценку ДНК проводили спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 ЛШО. Степень очистки препаратов определяли по соотношению поглощения при длинах волн 260 и 280 нм. Если отношение было менее 2,0, проводили дополнительную депро-теинизацию препарата.

Качественное- изучение опухолевой человеческой ДНК включало в себя хроматографию на колонках с различными наполнителями, а также электрофорез. Хроматографкческое изучение при помощи гель-фильтрации на колонках с сефарозой 2В, 4В и колонках с немоди-фидированной микрокристаллической целлюлозой проводилось по общепринятым методикам. Электрофорез образцов ДНК проводился в горизонтальных камерах в 1% геле агарозы трис-ацетатном буфере рН 7,8 при напряжении 2 В/см. По окончании гель окрашивали в растворе бромистого этидяя и просматривали в ультрафиолетовом свете v2G0 ни).

Молекулярная гибридизация образцов ДНК проводилась' по методу СаузернаrU975). Зондом служила ДНК А1и-повторов, клонированных в плазмиде рВР322 E.coli . Выделение- и очистка ДНК А^и-плазмиды осуществлялась по методу Bimboim Н, До1У J .(.1979). Течение Л1и-/ДК [oCp^'j проводилось с помощью метода ник-трансляции, основанного на свойстве ДНК-полимерази I Е.со 11 присоединять нуклеотидные остатки к З'-гидроксшгьному концу, который образуется при разрыве одной из цепей двухцепочечной молекулы ДНК. включение метки определяли, оценивая радиоактивность проб, отмытых и неотмытых раствором -Ь% трихлоруксусной кислоты. Удельная радиоактивность полученной [«6'°"'J ЛХи-ДНК составляла -2,5 х I0S имп/мин/мкг.

Образцы ДНК, предназначенные дли анализа, подвергали гидро-

лизу с помощью рестрикционной эндонуклеазы S al I. Продукты ресрикционного расщепления образцов ДНК разделяли с помощью электрофореза и фрагменты ДНК для последующего анализа переносили с геля на нитроцеллюлозную бумагу. После гибридизации фильтр отмывали, просушивали и закладывали радиоавтогреф с пленкой Ш-1 в кассету с усаливающим экраном и выдерживали от 3 до 20 дней. Проявляли в стандартных условиях.

Для различных целей эксперимента проводилась обработка опухолевой ДНК ферментами ДНК-азой и РНК-азой по общепринятой методике. РНК-аза для удаления примесей подвергалась предварительному прогреванию на кипящей водяной бане.

Образцы внутренних органов экспериментальных животных подвергали морфологическому изучению. Для этой цели кусочки ткани фиксировали в 10^ нейтральном формалине, проводила через спирты возрастающей концентрации, заливали в парафин, приготовляли срезы толщиной 5-7 икм и окрашивали гематоксилин-эозином.

При постановке экспериментов было использовано 200 беспородных лабораторных крыс массой IB0-200 г, из них 55 животных составили контрольную группу. Препараты ДНК -из опухоли толстой кишки человека, из селезенки крупного рогатого скота, из лейкоцитов крови доноров - в зависимости от целей эксперимента вводили животным внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно.

Двуспиральная РНК и нуклеинат натрия вводились животным ьнутрибршинно в виде кальциевых преципитатов, полученных по методу Graham Р. (1973).

При проведении экспериментов использовались реактивы производства фирм " Sigma "DIPC0 "MILLIPORE " ((Ж), "Wattman н, "Ameraham " (Англия), "Pharraacia Pine Cheaicala " (Швеция), " Chesapol " ЧССР, п/о "Фермент", (Вильнюс, Институт микробиологии иы.А.Кирхенштейна, в/о "Изотоп" (Ташкент), НПО "Биолар" (Олайн).

Результаты я их обсуждение. Биологическая активность человеческой опухолевой ДНК изучалась в экспериментах по введению ее беспородным лабораторным крысам. На первом этапе-исследований ставилась цель изучить каким будет влияние человеческой опухолевой ДНК на организм экспериментальных животных. Для этого было использовано 40 крыс: 30 составили опытную группу,полу-

чившую ДНК из опухоли толстой кишки человека в дозе 100 мкг/ к£шса внутрибркшинно, однократно и 10 крыс контрольной группы получили по той же схеме контрольную ДНК из селезенки крупного рогатого скота.

Начиная с I недели после введения препаратов ДНК животных забивали под эфирным наркозом, внутренние органы отбирали для гистологического изучения. Проведенное микроскопическое изуче-"нйе органов брюшной полости показало, что в сроки 4-5 недель после введения опухолевой ДНК в паренхиматозных органах тлеются дистрофические изменения; при исследовании стенки толстой кишки выявлено резко выраженное воспаление, охватывающее все стзйкн кишки, В отдельных участках слизистой оболочки, выступающих над внутренней поверхностью кишки, выявлена картина аденоматоза с резко выраженной пролиферацией эпителия, железистыми структурами с признаками легкой и умеренной атипии эпителиоцитов.

Для объективизации происходящих процессов был применен количественный метод стереометрического анализа, который сводился к определению суммарной поверхности эпителия и стромы я вычислением индекса корреляции. При определении количественных покаха-телей,.,характеризующих структурные изменения в слизистой оболочке в сроки 4-5 недель, установлено, что суммарная поверхность эпителия составляла 24,3±1,2; поверхность соединительнотканной стромы - 28,0+0,9, индекс корреляции 0,9.

Параллельное гистологическое изучение.слизистой оболочки толстой кишки животных контрольной группы показало, что слизистая оболочка сохранила нормальное строение. В остальных органах - печени, селезенке, тонкой кишке - изменений также не обнаружено.

Исследование в сроки 8-10 недель после введения опухолевой ДНК человека показало, что макроскопически выявляемые полиповвд-ше образования слизистой оболочки толстой .кишки гистологически •характеризуются как аденомы тубулярного строения, в двух полипах отмечались.признаки дисплазии легкой и умеренной степени. В очагах.уплотнения слизистой оболочки'микроскопически выявлены . плоские аденомы с признаками легкой дисплазии. Объективные показатели неопластического процесса бьии следующие: при легкой дисплазии поверхность эпителия - 41,2+1,5; стромы - 32,4+2,5,ин-

деке корреляции между ними 0,7; при умеренной дисплазии эти показатели равнялись соответственно 52,4^2,5 и 29,0+3,1, индекс корреляции - 1,8.

Поскольку была выявлена прогрессия пролиферации и появились признаки атипии, было продолжено динамическое изучение изменений слизистой оболочки толстой кишки. Макроскопические изменения в сроки 12 недель после введения опухолевой ДНК были идентичны картине, обнаруженной в сроки 8-10 недель. Гистологическое изучение показало, что в полипах произошло углубление процесса атипии, в двух случаях выявлена тубулярная аденома с признаками выраженной атипии. Стереометрический анализ в случаях тубулярных аденом с тяжелой дисплазией показал, что поверхность эпителия равна 61,0+ 3,6, а показатель поверхности стромы снижен и составлял 21,0+1,2, коэффициент корреляции между эпителием и стромой равнялся 2,9.

На этих же сроках (К недель) в одном случае в слизистой оболочке толстой кишки выявлено образование 0,8 х 0,8 см, рядом с которым располагались два полиповвдных образования размерами 0,2 х 0,3 см. При гистологическом исследовании новообразования установлена тубулярная аденома с признаками тяжелой дисплазии и очаговым раком. Количественный анализ показал резкое увеличение поверхности гладкого эпителия - 78,0, и закономерное уменьшение поверхности стромы - 14,9, индекс корреляции между ними возрос до 5,5.

Параллельное гистологическое изучение внутренних органов животных контрольной группы патологических изменений не выявило.

В этой серии экспериментов было показано, .что ДНК из опухоли толстой кишки человека обладает биологической активностью, выражающейся в трансформирующем действии на слизистую оболочку толстой кишки экспериментальных животных. Микроскопически выявляемые неопластические изменения возникают примерно на 4-5 неделе после введения опухолевой ДНК. В дальнейшем отмечается углубление неопластических процессов и к 8-10 неделе развиваются ту-булярные аденомы с выраженной дисплазией.

В следующей серии экспериментов представлялось интересным определить, зависит ли проявление биологической активности опухолевой человеческой ДНК от путей введения ее. животным. С этой 'целью трем группам крыс (по 10 животных) препарат опухолевой

ДНК вводился разными путями: подкожно, внутримышечно, внутри-брюшинно. Использованная для выделения опухоль толстой кишки гистологически характеризовалась как аденокарцинома умеренной дифференциации. В группах крыс, которым опухолевая человеческая ДНК была введена подкожно и внутримышечно, при гистологическом изучении слизистой оболочки толстой кишки патологических изменений не выявлено, как и в местах введения препарата -■кожа и мышцы правого бедра (в зависимости от пути введения).В то же время у животных, получивших опуЗвэлевута ДНК внутрибрюшин-но, через 10 недель после введения в слизистой оболочке толстой кишки развилась плоская тубулярная аденома с признаками умеренной или выраженной атипии. Результаты второй серии экспериментов свидетельствовали о том, что трансформирующая активность опухолевой ДНК проявлялась только при внутрибркшинном введении препарата.

Для доказательства того, что индукция неопластических изменений обусловлена введением игленно опухолевой ДНК, а не возможными примесями РНК, группе животных (10 крыс) была внутри-брюшинно введена опухолевая ДНК, обработанная ДНК-азой. Животных наблюдали в течение 20 недель, забивая в различные сроки и проводя гистологическое изучение внутренних органов, однако патологических изменений выявлено не было.

Полученные результаты позволяют говорить о выраженной биологической активности ДНК, выделенной из опухоли толстой кишки человека. Активность опухолевой ДНК показана при внутрибршин-ном введении беспородным лабораторным крысам с последующим морфологическим изучением внутренних органов животных в различные сроки после введения препарата. Гистологическое исследование тканей внутренних органов установило, что в слизистой оболочке толстой кишки через 6-8 недель после введения опухолевой человеческой ДНК возникают изменения, характерные для неопластического роста.

В связи с приведенными данными следует, сказать, что биологическая активность нуклеиновых кислот убедительно показана при изучении инфекционных свойств вирусных РНК и ДНК, плазмидных „"Н::, которые придают бактериям новые свойства, фаговых ДНК,кого::;'; /л;: лизируют бактерию, или создают симбионты с измененны-.¡.¡к свойствами. Рядом исследоьагелей показана трансформирующая

активность ДНК, ввделенных из различных опухолей или опухолевых клеточных линий, в культурах клеток ЩН ЗТЗ (Cooper J. , 198(3,1982; Diamond а. Д983; и др.). Активность нуклеиновых кислот, возможность переноса и экспрессии их в другом организме сегодня широко используются в такой области.биологии как генная инженерия. Bendich А. (1965) экспериментально показал, что ДНК пневмококка, вируса полиомы может циркулировать в крови без существенной деградации в течение 2 часов в виде полимерных и инфекционно-активных молекул. В экспериментах Ledoux ь. (1965) 20-30% введенной внутривенно беременной крысе меченной высокополимерной ДНК определялось в эмбрионе, что также свидетельствует о транспорте ДНК по крови без существенной деградации полимера и захвате ее клетками определенных органов.

Совокупность литературных данных по генетическому переносу позволяет интерпретировать результаты, полученные нами в эксперимент по изучению трансформирующего действия человеческой опухолевой ДНК in Tivo . Биологическая активность ДНК из опухоли толстой кишки человека проявлялась индукцией неопластических изменений в слизистой оболочке толстой кишки экспериментальных животных. Степень тяжести развивающихся изменений,, возможно, зависит от степени дифференцировки человеческой опухоли, использованной для выделения ДНК. В наших "экспериментах во всех случаях опухоль гистологически характеризовалась как аденокар-цинома умеренной дифференциации. Не исключено, что опухоль другой гистологической характеристики имела бы иную степень действия в организме крыс.

Характерным является и тот факт, что введение животным контрольной группы ДНК из лейкоцитов донорской крови и из селезенки крупного рогатого скота не вызывало морфологических изменений в слизистой оболочке толстой кишки крыс, кроме пролифера-тивных процессов. В этой связи следует упомянуть исследования Cooper J. et al. (1980), Gambke Ch. et al. (1984) И других авторов, в которых показано, что ДНК из нормальных клеток вызывает трансформацию иШ'ЗТЗ'с lOQ-кратно меньшей частотой, чем опухолевая.

Не до конца ясным остается факт тропизма опухолевой ДНК, то есть индукция неопластических изменений в гомологичном орга-

-ГОне укрыс. Однако на примере ретровйрусов показано, что их онкогены обладают тканевой специфичностью, индуцируя опухоли в определенных тканях и клетках культуры ( Bish°P J- ,1983,1985). Клеточные онкогены, вдентифвдироюнтю трансфекцией, также проявляют определенную тканевую специфичность:- с - ras -На в карциноме мочевого пузыря, с- ras -Ki в карциноме легкого и толстой кишки. • siamon D. e-t al (1984) не могли констатировать экспрессии онкогена sis ни в одной из 54 исследованных опухолей человека, в то se время в отдельных случаях зарегистрирована активность этого онкогена в метастазах в лимфоузлы, хотя в первичных опухолях у этих больных онкоген был неактивен. Повышенная экспрессия онкогенов мус и ras обнаружена в самых разных опухолях, что говорит об отсутствии тканеспецифичности в активации этих двух онкогенов. Некоторые другие онкогены специфически связаны с. конкретным типом опухолей, например, онкоген лшлфомы к, и человека В-1ум, стадиеспецифический онкоген Т-1ум, а также онкогены mam и neu . • Cooper J. et al (1982) показали,что в процессе трансформации В-лимфоцитов, то есть на последовательных стадиях дифференцировки лимфоидных клеток, активируется несколько онкогенов, имеющих уникальную природу. Кроме того, клетки могут содержать и экспрессировать онкоген , но противостоять его трансформирующей силе, если не имеют мишени для воздействия онкобелка ( Bishop J. ,1983; Киселев Л.Л.,1986).

Принимая во внимание эти данные, можно предположить, что в нашем случае введенная вну.трибршинно крысам опухолевая человеческая ДНК могла попасть в клетки различных органов брюшной полости, однако проявить свою трансформирующую активность только в аналогичных гистологических структурах, а именно в клетках слизистой оболочки толстой кишки. В таком случае, в клетках кишки крысы,..претерпевших трансформацию, могли произойти интеграция и экспрессия фрагментов ДНК из опухоли человека, несущих онкогены, активные в ДНК клеток аденокарциномы толстой кишки, или других последовательностей ДНК человека, способных активировать собственный онкоген крысы.

Для выяснения этого момента был использован метод гибриди-зационного анализа по Саузерну (1975) ДНК из трансформированных клеток слизистой оболочки толстой кишки крыс. В качестве зонда гибридизации был использован А1и-фрагмент ДНК, который ввиду

исокой повторяемости является удобным маркером для вдентифи-зции фрагментов генома человека в трансформированных клетках, ззулътаты гибридизации фрагментов ДНК крысы и человека с ме- . знным в системе ник-трансляцш А1к- повтором свидетель-

гвуют о том, что ДНК, выделенная из слизистой -оболочки толстой ееки крысы с индуцированными неопластическиш изменениями, в ?личие от контрольной, содержат в своем составе нуклеотидные юледовательности, гибридизующиеся с ¿^-последовательностями ловека, Полученный результат позволяет предположить интегра-по фрагментов ДНК человека в геном трансфорлироваиных клеток

)ЫСЫ.

Способность генов активно работать после переноса между етками животных, принадлежащих к разнил классам, показана ihrussi в. (1965) в исследованиях по гибридизации сомати-, ских клеток. Чужеродные гены, перенесенные между разными ви-Ш1 животных, продолжают нормально регулироваться: например,в зтках мыши, несущих ген /-глобина кролика, синтезировалась К, не отличимая от т.РНК J> -глобина кролика, что указывает функционирование чужеродного гена в клетках мши (Mantel и. al. ,1979). Введенные, микроннгекцяей в-оплодотворенные деклетки мши фрагменты ДНК, .содержащие ген J3 -глобина кро-ta, определялись в эритроцитах особей, развившихся из этих таг ( *'>;-г.ог et al. ,1981), (Constantini Р. et al.,

Я). Результаты этих экспериментов показывают возможность (бальной интеграции крупного фрагмента эукариотической ДНК в юм мши,' причем интегрированный ген через половые клетки . вдается потомству.

Принимая во внимание данные литературы по генетическому . еносу, можно сказать, что результаты наших экспериментов по чению трансформирующей активности ДНК из опухоли толстой ки человека in vivo указывают на возможность создания моде-рака толстой кишки человека путем введения беспородным ла-зторным красам внутрибршшно человеческой опухолевой ДНК.

Сделанное заключение позволило нам провести эксперимент изучению влияния биогенных стимуляторов - низкомолекулярных природного происхождения (дсРНК и нуклеинат'а нетрия) - на ;ние неопластических изменений в толстой кишке эксперимент

талышх животных, индуцированных введением ДНК из опухоли толстой кишки человека.

С этой целью дсРНК и нуклеинат натрия начинали вводить животным через 6 недель после инъекции опухолевой ДНК, то есть, примерно со времени развития морфологических изменений в слизистой оболочке толстой кишки. Препараты вводили по следующей схеме: I группа животных (10 крыс) получила дсРНК в дозе 50 мкг/ крыса внутрибрюшинно, однократно; П группа (10 крыс) - в той же дозировке двукратно; Ш группа (10 крыс) - трехкратно,интервал между инъекциями биостимулятора составил I неделю. Нуклеинат натрия вводился по той же схеме, доза препарата составила 50 х>лг/крыса. Для повышения устойчивости препаратов к действию нуклеаз их вводили в виде кальциевых преципитатов Са-дсРНК и Са-НН.

Гистологическое изучение показало, что в слизистой оболочке толстой кишки крыс, получивших Са-дсРНК однократно,особых морфологических сдвигов по сравнению с "нелеченными" животными не отмечено, тогда как у крыс, получивших инъекции Са-дсРНК двукратно произошли'определенные регрессивные изменения процессов неопластического роста. Если у контрольных "нелеченных" животных в эти сроки наблкдались признаки клеточной и тканевой атипии, то у крыс с двукратно введенной Са-дсРНК отмечались уже очаги микроаденомы на фоне гиперплазии желез, снижение интенсивности пролиферации, атипические изменения носили очаговый характер. Тенденция к нормализации железистых структур как на тканевом, так и на клеточном уровне наблюдалась после трехкратного введения Са-дсРНК. Гистологическое изучение слизистой оболочки толстой кишки "нелеченных" животных в эти сроки выявило тубулярную аденому с признаками тяжелой дисплазии.

Аналогичные гистологические" исследования в группах животных, получавших кальциевый преципитат нуклеината натрия показало, что введение этого препарата не имело такого, эффекта на течение неопластических изменений, как дсРНК.

Анализируя результаты этого эксперимента, следует сказать, что развитие опухоли из трансформированной клетки полностью зависит от эффективности защитных сил организма, и в первую очередь, иммунной системы. В отличие от хирургического,дучево-

о, химиотерапевтического методов лечения опухолей, имеющих вой недостатки, иммунные реакции в оптимальных условиях теоре-ичсски могут привести к гибели, все опухолевые клетки. В этой вязи все большее внимание в последнее время уделяется иммуно-тимуляторам природного происхождения - низкомолекулярным РЖ. ¡звестно, что низкомолекулярные РНК имеют разнообразные биоло-пческие свойства, основными из которых являются иммуномодули-|ующие, интерфероникдуцирующие, детоксицирующие. Механизм действия двуспиральной РНК осуществляется на клеточном или субкле-■очном уровне. Дс-РНК усиливает метаболизм нормальных -клеток в ¡рёделах их физиологических возможностей, восстанавливает нару-;ениый метаболизм, замещает недостающие нуклеотиды при их дефи-гате. Изучение системы интерферонов показало, что дсРНК играет з ней ключевую' роль. Она является активным индуктором интерферона и вместе с тем необходима для проявления его действия. Ферменты, участвующие в реализации действия интерферонов,прояв-иют активность только в присутствии дсРНК. А система интерфе-эонов - одна из основных в неспецифической резистентности орга-гизма. Изучение свойств интерферонов показало, что, помимо широко известного антивирусного действия, они обладают широким зпектром других проявлений: антипролиферативной и противоопухо-ювой активностью, учас?вуют в защитных реакциях организма в делом, регулируя как активность клеточных факторов неспецифической резистентности, так и'становление иммунных процессов. Состояние защитно-регуляторных механизмов, поддерживаемых интерфероном, имеет большое значение в процессе метастазирования,поскольку способно модифицировать процесс вплоть до его полного подавления. . - •

И наших экспериментах было показано,.что введение биостимуляторов дсРНК и пуклеииата натрия 'животным с индуцированными пеопластическими изменениями в слизистой оболочке толстой кишки имело неодинаковое действие. Более выраженным антипроли-фератишым эффектом обладала дсРНК. С нашей точки зрения,регрессия неопластических изменений связана с такими свойствами дср]]д как индукция эндогенного интерферона, повышение неспецифической резистентности клеток и иммуномодуляция. Наши данные согласуются о результатами других авторов, указывающих на по-

давление дсРНК опухолевого роста в экспериментах на животных (Буйкис И.М. и др., 1989; Савенкова И.Н. и др.¡ 1989), иммуно-модулирующую активность при применении у онкологических больных (Брувере P.E. и др., 1989; Фелдаане Г.Я. и др., 1989). Нам удалось воспроизвести .эффект подавления неопластического роста с помощью дсРНК на экспериментальной модели рака толстой кишки человека, что, как нам кажется, имеет определенное практическое значение. ' , '

Вместе с тем, введение нуклеината натрия не имело положительного эффекта по сравнению с дсРНК. В работе Агабаляна A.C. с соавт. (1983) показано, что активным началом нуклеината натрия является содержащаяся в его составе дсРНК, обладавшая выраженной противоопухолевой активностью в отношении трансплантируемой гепатомы ¿¿а по сравнению е. цуклеинатом натрия. Количество дсРНК в нуклеинате натрия составляло в среднем '0,001$. Отсутствие эффекта от введения нуклеината натрия, по-видимому, объясняется тем, что вводимая доза - 50 мг - имела низкое содержание дсРНК, являющейся действующим началом препарата.

Физико-химическое изучение опухолевой человеческой ДНК включало гель-фильтрацию на колонках с сефарозой 2В, 4В,ионообменную хромат огр'афию на колонке, с немодифицированной микрокристаллической целлюлозой, электрофорез в J.% агарозном геле. Профили элюции как при гель-фильтрации, так и при ионообменной хроматографии имели один пик ДНК. Дополнительных форм ДНК (од-носпиральных, суперсйирализованных) выявить не удалось. Элек-трофоретическое изучение образцов опухолевых человеческих ДНК присутствия особых форм также не выявило, во всех случаях на элекурофореграммах идентифицирован один банд высокомолекулярной-ДНК.

Таким образом, исследования по изучению биологической активности ДНК из опухоли толстой кишки человека in vivo показали, что при внутрибрюшинном введении беспородным лабораторным крысам опухолевая ДНК проявляет трансформирующую активность, вызывая развитие неопластических изменений в слизистой оболочке толстой кишки экспериментальных животных. Механизм, по которому происходит индукция неопластических изменений, но вполне ясен, однако результаты гибридизационного анализа по Сау.зерну

|бразцов ДНК из трансформированных клеток слизистой оболочки ■олстой кишки крыс и А1и - последовательностей - уникальных ¡эркеров человеческой ДНК - позволяют предположить интеграцию >рагментов человеческой опухолевой ДНК в геном клеток крысы и депрессию либо человеческого онкогена, либо собственного онкогена крысы, приводящую 'к неопластическому перерождению клеток ■олстой кишки крысы. Введение кальциевого преципитата двуспи-»альной РНК животным с индуцированными неопластическими изме-¡ениями в слизистой оболочке толстой кишки оказывает положительный эффект, способствуя регрессии патологических изменений.

ВЫВОДЫ

1. ДНК из аденокарциномы толстой кишки человека обладает выраженной трансформирующей активностью vivo » вызывая развитие неояластических изменений в толст-ой кишке экспериментальна животных.

2. Трансформирующая активность проявляется при однократном знутрибрюшинном введении препарата опухолевой человеческой ДНК ÍB дозе 100 мкг/крыса).

'3. Возникновение нэопластических изменений происходит в эезультате интеграции и, возможно, экспрессии фрагментов человеческой ДНК в геноме Лрысы.

4. Введение кальциевого преципитата двуспиральной РНК оказывает положительный лечебный эффект, вызывая регрессию индуци-зовашшх неопластических изменений в толстой кишке экспериментальных животных.

Опубликованные работы по теме диссертации .

1. Биологическая активность ДНК из опухоли толстой кишки человека //ДАН АрмССР, 198?, 4, 179-182 (в соавт. Агабалян A.C., Сагдасарян A.A., Захарян P.A., Рухкян P.A.).

2. Подавление Са-дс-РНК опухолевого роста //Тез.докл.научн. ко.íp.Ереванского зоовегинститута к 60-лети». ■( 23 декабря I98B). - Ереван, 1988. - 57-58 (в соавт. Рухкян Д.А., Ланугаш J.B., Агабзлян A.C.).

3. Влияние кальциевых форм РНК на развитие опухолевого процесса //ДЛН ДрмССР, 1989, т.88, П I, 31-34 (в соавт. Ara-балян A.C., Багдасарян A.C., Манукян Э.В., Мартиросян B.C., РункянЛ.А., Захарян P.A.

4. Морфологические изменения слизистой оболочки толстой кишки крыс, индуцированные опухолевой ДНК /Дурн.экспер. и клин.мед., 1989, 4, 372-376 /в соавт. Багдасарян A.A., Манукян Э.В., Рухкян Д.А., Захарян P.A., Агабалян A.C.

5. Возможность переноса генетической информации челове- . ческой опухолевой ДНК //Тез.конф., поев.25-летию основания ЕрГИУВ, 17-18 октября 1989 . - Ереван, 1989.'

6. Неопластические изменения слизистой оболочки толстой кишки крыс, индуцированные ДНК из.опухоли человека //Тез.докл. конф.молодых ученых НИИ проктологии, 21-22 декабря 1989 . -Ереван, 1989, 94.

7. Трансформирующая способность ДНК-из опухоли толстой кишки человека //Научно-практич.конф. "Актуальные., вопросы проктологии". Алма-Ата - Талды-Курган, 1989, 93-94.

8. The influence of ds-RHA calcium precipitate on the' neoplastic changes of rat colon tumor vihich have been induces with DNA from human tumor./ Coloproctology, Congress report,

2nd-4th May, 1990, Berlin, GDE, 44/(v.lth Bagdasarian A.A., Agahalian A.S., Zacharian R.A,)

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1, Новая модель'опухоли толстой кишки человека у экспериментальных животных. Удостоверение J? 35 выдано НИИ проктологии ¡Ло АрмССР 10. 01.1990 г. /В соавт. Багдасарян "А: А., Манукян ' Э.В., Захарян P.A., Агабалян A.C.

2. Использование кальциевого преципитата дс-РНК в составе биосовместимой полимерной пленки "Диплен" для ускоренного заживления ран. Удостоверение I 36 выдано НИИ проктологии Ш АрмССР 10.01.1990г. /В ссавт. Базян А.Р., Акопян 3.Б..Геворкян Г.А., Багдасарян A.A., Захарян P.A., Агабалян A.C.