Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия гена CD38 при раке толстой кишки

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена CD38 при раке толстой кишки"

На правах рукописи

Перенков Алексей Дмитриевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА CD38 ПРИ РАКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

П 3 ДПР 2014

005546555

Казань-2014

005546555

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент по специальности молекулярная биология, в.н.с. НИИ Молекулярной биологии и региональной экологии «Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского» - Новиков Дмитрий Викторович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент кафедры биохимии им. Г.Я. Городисской, ГБОУВО «Нижегородской государственной медицинской академии» Минздрава РФ

- Обухова Лариса Михайловна; доктор ветеринарных наук, профессор биохимии, зав. лаб. биохимии и молекулярно-генетического анализа ФГБУ «Федерального центра токсикологической и радиационной безопасности» - Фаизов Тагир Хадиевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», г. Москва

Защита состоится «24» апреля 2014г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, ауд.211. Телефон: 7(843)23-37-842

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» www.ksu.ru Автореферат разослан « )'). » 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Согласно данным ВОЗ онкологические заболевания занимают второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. В России рак толстой кишки занимает второе место в структуре женской онкологической заболеваемости и третье место в мужской после рака предстательной железы и легкого (Чиссов В.И. и др., 2010). В связи с этим изучение биохимических особенностей течения рака толстой кишки является актуальной проблемой.

Дифференцировочная молекула С038 кодируется геном, состоящим из восьми экзонов и расположенном на четвертой хромосоме в локусе 4р15. Ряд однонуклеотидных полиморфизмов гена влияют на уровень его экспрессии и ассоциированы с онкологическими заболеваниями крови и легких (Ри X. е1 а1., 2012; Еуаёа Т.К. е1 а1., 2013). Еще одним регулятором экспрессии гена С038 является метилирование сайтов связывания с транскрипционными факторами (Реггего Е. й а1., 2000). Для гена описано две формы мРНК СБ38 -полноразмерная и альтернативная. У альтернативной формы делетирован третий экзон, что приводит к сбою рамки считывания (>Ыа К. й а1., 1997). Белковый продукт гена обладает энзиматической активностью в отношении цАДФ-рибозы. С038 играет важнейшую роль в активации, пролиферации, адгезии и хемотаксисе клеток иммунной системы. Описана физическая ассоциация СБ38 с Т и В-клеточным рецептором, СБ 16 и молекулами НЬА II класса. Известна мембранная и растворимая формы молекулы С038 (Ма1ауаз[ Б., 2008; Ногег^еш АХ. е1 а1., 2013). Экспрессия белка С038 на мембране клеток используется в качестве прогностического и диагностического маркера при лейкемиях, миеломе и хроническом лимфолейкозе (Реагсе Ь. е1 а1., 2010; АЬгатепко 1.У. е! а1., 2012), а растворимая форма СЭ38 может быть использована при оценке эффективности лечения рака молочной железы (Новиков В. В. и др., 2005). При раке толстой кишки исследования гена СЭ38 проводились в основном с использованием клеточных линий (Уаг^ 8. е1 а1., 2004). В литературе недостаточно представлены данные об экспрессии СЭ38 в периферической крови и первичных опухолевых очагах больных раком толстой кишки. Остаются не изученными ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в гене С038, метилирование его промотора, уровень мРНК и растворимой формы белка у больных раком толстой кишки.

Целью работы явилось изучение особенностей экспрессии гена С038 в периферической крови и первичных опухолевых очагах больных раком толстой кишки.

Задачи исследования

1) Установить частоту обнаружения полноразмерной и альтернативной форм мРНК СБ38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки.

2) Оценить уровни мРНК и растворимой формы белка СБ38 у больных раком толстой кишки и сопоставить с их клиническими особенностями течения заболевания.

3) Оценить наличие метилирования Срй динуклеотидов в промоторном регионе гена С038 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки.

4) Определить частоту однонуклеотидной замены 1470С/Т (гб 1130169) в гене С038 и сопоставить ее с уровнем мРНК и растворимой формы белка СБ38 у больных раком толстой кишки.

Научная новизна работы

Впервые установлена частота обнаружения мРНК полноразмерной и альтернативной форм СБ38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки, причем частота обнаружения полноразмерной формы мРНК была выше частоты обнаружения альтернативной формы.

Показано, что в крови здоровых доноров, в крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки уровень альтернативной формы мРНК СБ38 значительно ниже уровня полноразмерной формы.

Установлено, что соотношение уровня полноразмерной формы мРНК С038 к альтернативной в крови доноров, крови и очагах опухоли больных раком толстой кишки различается.

Продемонстрировано, что сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций растворимых молекул СЭ38 выше у больных раком толстой кишки, чем у доноров.

Установлено, что уровень мРНК полноразмерной и альтернативной форм СБ38 в крови больных раком толстой кишки значительно выше, чем в опухолевых очагах тех же больных.

Впервые установлено, что Срв динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 гена СЭ38 метилированы в периферической крови и опухолевых очагах, полученных от больных раком толстой кишки.

Впервые изучена частота полиморфного варианта 1470С/Т (гб1 130169) гена С038 у здоровых доноров и больных раком толстой кишки, проживающих на территории Нижегородской области. Продемонстрирована ассоциация аллели С с заболеванием. Показано, что у людей с генотипом СС повышен уровень мРНК СБ38 по сравнению с генотипом ТТ по локусу 1470С038.

Практическая значимость работы

На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени разработан метод определения уровня полноразмерной и альтернативной форм мРНК С038, который применим в качестве дополнительного мониторингового показателя при раке толстой кишки. Показано значительное увеличение уровня мРНК СБ38 в периферической крови больных при метастазировании опухоли в лимфатические узлы.

На основе ПЦР разработан метод детекции однонуклеотидного полиморфизма 1470С/Т (гб1 130169) гена СЭ38 человека, который может быть использован для определения групп с повышенным риском развития рака толстой кишки. Аллель 1470С ассоциирована с заболеванием.

Полученные данные могут быть использованы в преподавании курсов по биохимии в вузах биологического и медицинского профиля.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В опухолевых очагах, полученных от больных раком толстой кишки, детектируется мРНК С038.

2. Уровень мРНК полноразмерной формы выше альтернативной у доноров и больных раком толстой кишки.

3. В крови больных раком толстой кишки уровень мРНК СБ38 полноразмерной формы выше, а уровень мРНК альтернативной формы ниже, чем в крови здоровых доноров.

4. В периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки СрО динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 гена СБ38 метилированы.

5. Аллель 1470С (гз1130169) гена СБ38 встречается чаще у больных раком толстой кишки, чем у здоровых доноров и ассоциирован с повышенным уровнем мРНК СБ38.

Апробация работы

Результаты работы представлены на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2012), II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), XXIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнолигии» (Москва, 2011), X Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), III Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технолигии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора» (С. Петербург, 2011), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 2011), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань,2012), XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Н. Новгород, 2012), Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Минск, 2013), VI Объединенном иммунологическом форуме (Н. Новгород, 2013).

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского 12 сентября 2013 года и на заседания кафедры биохимии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» 5 февраля 2014 года.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 143 листа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 35 рисунками и 24 таблицами. Библиографический указатель включает 197 источников литературы (22 отечественных и 175 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследование включено 86 образцов периферической крови здоровых доноров, 90 образцов периферической крови и 54 образца опухолевых очагов больных раком толстой кишки (РТК), проходивших лечение в хирургическом отделении ГУЗ Нижегородская областная клиническая больница им. H.A. Семашко (г. Нижний Новгород). Также исследовали клетки перевиваемых линий COLO 205, НСТ116, HCT 15, SW-620, Т84, СаСо2, имеющих происхождение от опухолевых клеток больных РТК и предоставленных Российским онкологическим научным центром им. H.H. Блохина РАМН.

Выделение суммарной ДНК и РНК из клеток периферической крови, опухолевых очагов и клеток опухолевой культуры осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции. Детекцию мРНК проводили с помощью обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Уровень мРНК CD38 исследовали мультиплексным вариантом ПЦР в реальном времени с использованием зондов «TaqMan». Оценку уровня мРНК CD38 проводили относительно референтного гена убиквитина С (UBC) с использованием программы REST2009 (Pfaffl M.W. et al., 2002). Коэффициент, отражающий соотношение уровня полноразмерной формы мРНК CD38 (fullCD38) к альтернативной (altCD38) в одном образце рассчитывали по формуле K=ftillCD38/altCD38. Анализ метилирования CpG динуклеотидов промоторной области гена CD38 осуществляли с использованием эндонуклеаз рестрикции Acil и Hpall («Fermentas», Латвия). Результаты гидролиза хромосомной ДНК оценивали методом ПЦР. Обнаружение ОНП (однонуклеотидного полиморфизма) 1470С/Т (rsl 130169) в гене CD38 осуществляли с помощью аллель-специфической ПЦР. Праймеры подбирали с помощью пакета программ Lasergene (США) (таблица 1). Температуру отжига праймеров оптимизировали опытным путем, принимая за исходную температуру, рассчитанную с использованием программы Oligo Calculator vlO (Россия).

Определение первичной структуры кДНК проводили в автоматическом режиме с помощью прибора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям производителя. Сывороточный уровень sCD38 (растворимой формы CD38) определяли двухсайтовым иммуноферментным методом, иммунофенотипирование проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител ИКО-20 РОНЦ РАМН (Новиков В.В. и др., 2008).

Таблица 1

Характеристика праймеров и зондов, использованных в работе

Название Первичная структура (5'- 3') Методы Размер продукта (п.н.)

F CTATGGCCAACTGCGAGTTC I ПЦР 857

R2 AAGAAACTTGTCAGGTCTGT

FZ ATGAGACATGTAGACTGCCA II ПЦР 403

R719 ATCCATTGAGCATCACATGG

FZ ATGAGACATGTAGACTGCCA ПЦР в реальном времени 147

Z Rox-AAACATCCTTGCAACATTACT GAAGAAGAC-BHQ2

RZ CCAAAGAAGAATCTTGTTGC

RDZ GATAGTTTATTTCTTGTTGC

FRes AGATGCAGGGTGTCGCTGAC Рестрикционный анализ 104

RRes AACCACTTAAGTGTCCTCTG

FSnpC TTCCTACAGATAGTCAAACC ОНП 1470С/Т 134

FSnpT TTCCTACAGATAGTCAAACT

RSnp TAATACCAACCTCACAGCAC

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v.8.0. Использовали критерии Шапиро-Уилка, Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса, ранговой корреляции Спирмена и критерий «%». Количественные данные представлены в виде медианы, 25 и 75-процентилей (Ме[25%;75%]>. Для качественных признаков рассчитывали 95% доверительный интервал. Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов, соответствие выборок равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием метода у>\ Для определения риска заболевания вычислялось отношение шансов (OR-Odds Ratio) с 95% доверительным интервалом (95% C.I.-Confedence Interval). Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Для гена CD38 описано два транскрипта, которые образуются в ходе альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Первый транскрипт является полноразмерной формой и кодирует полнофункциональный белок. Второй транскрипт имеет делецию третьего экзона и предположительно кодирует усеченный белок (Nata К. et al., 1997).

Методом ОТ-ПЦР были исследованы образцы периферической крови здоровых доноров (п=10) и больных раком толстой кишки (п=10). Во всех

образцах детектировались полноразмерная (М1С038) и альтернативная (аиСБ38) формы мРНК СБ38.

Была определена частота обнаружения ШПСОЗ8 и акС038 форм мРНК в 54 опухолевых очагах больных РТК. Установлено, что частота выявления Ш11С038 формы составила 78 (64; 88)%, а акС038 формы - 52 (38; 65)%. АиСБ38 форма мРНК регистрировалась статистически значимо реже (в 1,5 раза), чем Ы1СБ38 (р<0,05). При этом она обнаруживалась только в присутствии Ад11СВ38 формы.

Различия в гистологическом типе, локализации опухоли и присутствие метастазов не сопровождались изменениями в частоте встречаемости мРНК С038. Однако у больных с первой стадией заболевания мРНК Ш1С038 формы была во всех тестируемых образцах (100%) (таблица 2). На последующих стадиях частота обнаружения мРНК Ад11С038 формы в исследуемых образцах статистически значимо снижалась и составила от 60 до 84% (р<0,05).

Таблица 2

Частота обнаружения мРНК СЭ38 на разных стадиях РТК (%)

Форма Общая Стадии опухолевого процесса

мРНК частота I II III IV И+Ш+1У

М1СВ38 78(64;88) 100(70; 100) 84(64;96) 81(49;97) 60(15;94) 75(60;87)*

аИС038 52(38;65)** 44(15;77)** 58(37;78) 54(24;81) 40(5;85) 56(41;72)

* - статистически значимые различия в сравнении с первой стадией (р<0,05)

** - статистически значимые различия в сравнении с 1и11С038 мРНК (р<0,05)

Известно, что в железистых клетках толстой кишки отсутствует экспрессия гена СБ38 (http://www.proteinatlas.org). Наши данные свидетельствуют, что в большинстве опухолевых очагах больных РТК может происходить включение гена С038. Однако для РТК показана возможность инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами, несущими на поверхности молекулы СБ38 (ЕИтагк Р. е1 а1., 2006). То есть, часть положительных результатов может быть обусловлена присутствием в опухолевых очагах активированных лимфоцитов.

Методом мультиплексной ПЦР в реальном времени оценивали уровень мРНК СБ38 у здоровых доноров (п=86) и больных РТК (п=82). Уровень Ад11СВ38 формы мРНК в крови больных РТК в 1,3 раза выше, а уровень аШ1Ю38

формы в 1,4 раза ниже, чем в крови здоровых доноров (р<0,05). При оценке уровня мРНК СЭ38 использовали образцы опухоли (п=42), в которых была выявлена мРНК СБ38. Показано, что уровень М1С038 формы мРНК в 7 раз (р<0,05), а акС038 в 9 раз (р<0,05) ниже в опухолевых очагах, чем в крови больных РТК (таблица 3).

Сравнивали коэффициенты (К), отражающие соотношение уровня мРНК Ш1С038 формы к акС038. Во всех случаях у больных наблюдался широкий разброс данных, что вероятно связано с индивидуальными особенностями течения неопластического процесса. Однако в периферической крови больных медиана значения К была статистически значимо выше в 1,8 раза (р<0,05), чем в крови доноров, а в опухолевых очагах медиана К была выше в 1,3 раза (р<0,05), чем в крови больных РТК.

Таблица 3

Относительные уровни мРНК CD38 у здоровых доноров и больных РТК

Соотношение уровней мРНК Кровь здоровых доноров Кровь больных РТК Опухолевые очаги

fullCD38 0,127 (0,088;0,166) * 0,164 (0,112;0,242) 0,0231 (0,0011;0,0470)*

altCD38 0,0251 (0,020;0,033) * 0,0182 (0,011;0,023) 0,0020 (0,0010;0,0039) *

ÍU11CD38/ altCD38 5,0 (3,5;7,4) * 9,0 (6,3; 14,6) 11,4 (9,5;14,9) *

* - статистически значимые различия с кровью больных (р<0,05)

Из полученных результатов видно, что в периферической крови больных РТК наблюдается значительное изменение коэффициента соотношения мРНК CD38, вызванное повышением уровня fullCD38 формы и снижением altCD38. Известно, что altCD38 форма мРНК кодирует полипептид, у которого отсутствует каталитический и рецепторный регионы (Nata К. et al., 1997). Вероятно, такой полипептид является антагонистом полноразмерной формы белка, и снижение его уровня может отражать активацию клеточного звена иммунитета в ответ на появление опухоли. У больных РТК имеет место повышенный уровень экспрессии молекул CD25 и CD71, являющихся на лимфоцитах периферической крови маркерами активации (Ferrone S. et al.,

2000; Шибаев М. И., 2004; Betts G. et al., 2012). Также в крови онкологических больных показано увеличение экспрессии гена CD38, которое, видимо, частично связано с факторами, выделяемыми опухолью (Bendre M.S. et al., 2005; Albenizl. etal., 2011).

В большинстве опухолевых очагов обнаруживалась мРНК CD38, при этом ее уровень был значительно (в 7 - 9 раз) ниже уровня мРНК в крови тех же больных. При исследовании клеток линий, имеющих происхождение опухолевых РТК, максимальный уровень мРНК fullCD38 формы был обнаружен в клетках линии СаСо2, а клетки линий HCT 116, SW-620 и HCT 15 имели примерно одинаковый уровень мРНК, который был ниже в 2,5 раза, чем в клетках линии СаСо2 (таблица 4). AltCD38 форма мРНК присутствовала лишь в клетках линий COL0205, НСТ116, СаСо2 (табл.3). При этом уровень fulICE>38 формы мРНК в клетках линий был в 2,8 - 7,7 раза, a altCD38 в 5 - 6,5 раза ниже, чем в опухолевых очагах (р<0,05).

Таблица 4

Относительные уровни мРНК CD38 в клеточных линиях

Соотношение уровней мРНК Название клеточной линии

COL0205 НСТ116 СаСо2 SW-620 Т84 HCT 15

fullCD38 0,0063 0,0033 0,0083 0,0032 0,0042 0,0030

altCD38 0,00040 0,00040 0,00031 - - -

fullCD38/ altCD38 15,7 8,3 26,7 - - -

Сравнивали коэффициенты К в клетках разных линий и очагах опухоли между собой. Коэффициенты в клетках линий характеризовались значительным разбросом данных, так разница между минимальным и максимальным значением составила 3,2 раза. При этом коэффициент К в очагах опухоли, несмотря на выраженную тенденцию, статистически значимо не отличался от коэффициента для клеток линий.

Известно, что опухоль толстой кишки инфильтрируют активированные Т-лимфоциты (ТЧобЬо К. й а1., 2010). В соответствии с нашими данными, для клеток крови здоровых добровольцев и больных РТК характерен полный спектр мРНК С038. В то же время лишь в 52% опухолевых очагов и в клетках трех из шести линий наблюдалась аИС038 форма мРНК. Полученные данные

позволяют говорить о мРНК С038, которая принадлежит клеткам опухолевого очага больного. Однако уровень мРНК СЭ38 в клетках изучаемых линий был значительно ниже, чем в очагах опухоли. Это может указывать на неоднородность очагов опухоли. Так, известно присутствие инфильтрирующих опухоль Т-лимфоцитов, которые несут на своей мембране молекулу С038 (ЕИшагк Р. ег а!., 2006).

Белковый продукт гена СОЭ8 исследовали в растворимой форме (бС038) в сыворотке крови доноров (п=67) и больных раком толстой кишки (п=70) (таблица 5).

Таблица 5

Сывороточный уровень эС038 у доноров и больных РТК

Фракции бСВ38 Здоровые доноры Больные РТК

Суммарная (и/ш1) 143 (124;171) 175 (170;185)*

Олигомерная (и/т) 78 (67;96) 94 (92;9б)*

* — статистически значимые различия со здоровыми донорами (р<0,05)

Установлено, что сывороточный уровень как суммарной, так и олигомерной фракций бСВ38 в 1,2 раза (р<0,05) выше в крови больных раком толстой кишки, чем в крови здоровых доноров. Как следует из таблицы 2, в крови больных РТК также повышен уровень полноразмерной формы мРНК в сравнении с донорами. Видимо повышение уровня мРНК приводит к увеличению сывороточного содержания бС038, которое отражает реакцию иммунной системы организма на заболевание.

Результаты сравнения уровней мРНК СБ38 в образцах периферической крови больных РТК на разных стадиях заболевания представлены на рисунке 1. Установлено, что в сравнении со здоровыми донорами, у больных РТК на первой стадии наблюдалось повышение уровня ЙЙ1С038 мРНК в 1,4 раза (р<0,05). На второй стадии регистрировалась лишь тенденция к его повышению. Третья стадия характеризовалась наиболее выраженным повышением уровня М1СБ38 мРНК. Он был повышен у больных РТК в сравнении с нормой в 1,9 раза (р<0,05). На четвертой стадии уровень ЛШС038 не отличался от нормы, сохраняя лишь небольшую, статистически не значимую тенденцию к повышению. В отличие от ИШСОЗв формы уровень аНС038 мРНК на первой и второй стадиях был ниже нормы в 1,4 раза (р<0,05) и в 1,8 раза

(р<0,05), соответственно. На третьей стадии ее уровень повышался в 1,5 раза в сравнении с нормой и в 1,7 и 3,0 раза в сравнении с первой и второй стадиями, соответственно (р<0,05). На четвертой стадии уровень акС038 формы мРНК не отличался от нормы, как и уровень мРНК й|11С038.

Доноры I

II III IV

Стадии

• МесНап □ 25%-75% I Мт-Мах

Доноры

I

IV

• МесПап □ 25%-75% X Мт-Мах

II III

Стадии

Рисунок 1 - Уровень полноразмерной (А) и альтернативной (Б) форм мРНК С038 в крови больных РТК на разных стадиях заболевания

* — статистически значимые различия со здоровыми донорами (р<0,05) А _ статистически значимые различия с III стадией заболевания (р<0,05)

На первой и второй стадиях коэффициент К был статистически значимо повышен в сравнении с нормой (К=10,0 и 10,7 против 5,0, соответственно). На третьей стадии, несмотря на повышение уровня fullCD38 и altCD38 форм, он не отличался от нормы (К=6,7), а на четвертой стадии опять статистически значимо повышался (К=7,5), хотя уровень мРНК CD38 обеих форм находился в пределах нормы. Из полученных результатов видно, что на первой и второй стадиях РТК наблюдается значительное изменение коэффициента соотношения мРНК CD38, вызванное снижением уровня altCD38 форм. На третьей стадии коэффициент К не отличался от нормы, однако, происходило значительное повышение уровня обеих форм мРНК. Четвертая стадия характеризовалась повышением коэффициента К при нормализации уровней обеих форм мРНК. Видимо коэффициент отношения уровня fullCD38 формы мРНК к altCD38 может являться показателем активности клеток иммунной системы организма (Шибаев М.И., 2004; Betts G. et al., 2012).

Наряду с исследованием мРНК CD38 изучали изменения в концентрации сывороточного уровня суммарной и олигомерной фракций sCD38 у больных РТК (п=44) на разных стадиях заболевания (таблица 6). Уровень суммарной фракции sCD38 в сыворотке крови больных РТК значительно повышен на первой стадии опухолевого процесса (в 2,2 раза) и снижается на последующих (в 1,2 раза), в сравнении с донорами (р<0,05). Олигомерная фракция sCD38 практически не изменяется на разных стадиях заболевания и повышена в 1,2 раза в сравнении с донорами (р<0,05).

Таблица 6

Сывороточный уровень sCD38 у больных РТК на разных стадиях

Фракции sCD38 Здоровые доноры Больные раком толстой кишки

I стадия II стадия III стадия IV стадия

Суммарная (U/ml) 143 (124;171) 354 (246;403)* 174 (170;190)*а 181 (172;185)*а 174 (174;174)А

Олигомерная (U/ml) 78 (67;96) 97 (92;97) 92 (91;97)* 93 (91;94) 93 (91;93)

* - статистически значимые различия с донорами (р<0,05) А - статистически значимые различия с первой стадией заболевания (р<0,05)

Повышение уровня суммарной фракции sCD38 на первой стадии свидетельствует о важной роли растворимой формы CD38 на начальных этапах развития опухоли. Предполагается, что растворимая форма CD38 учавствует в уходе опухоли от иммунного ответа. Подобный механизм описан для рака молочной железы, при котором увеличение концентрации sCD38 ведет к блокаде лиганда мембранной формы CD38 и ограничивает поступление эффекторных клеток в тканевое пространство (Новиков В.В. и др., 2005).

Нами показано повышение уровня M1CD38 формы мРНК в крови больных в 1,4 раза и снижение altCD38 в 1,5 раза в сравнении с донорами на первой стадии заболевания. Это повышение приводит к изменению коэффициента соотношения уровней fullCD38 и altCD38 форм мРНК. Он был в 2 раза больше в периферической крови больных на первой стадии в сравнении с донорами. Поэтому увеличение уровня суммарной фракции sCD38 на первой стадии может быть обусловлено его продукцией клетками крови. На последующих стадиях заболевания изменения уровня обеих форм мРНК CD38 не сопровождались колебаниями сывороточного содержания sCD38. Вероятно в формировании повышенного сывороточного уровня sCD38 могут принимать участие клетки, формирующие воспалительный очаг вокруг опухоли, который характерен для рака толстой кишки (Terzic J. et al., 2010). Также интересно отметить, что на первой стадии заболевания в очагах опухоли частота обнаружения мРНК CD38 полноразмерной формы составила 100% и снижалась на последующих стадиях. Поэтому, несмотря на низкий уровень мРНК CD38 в очагах опухоли в сравнении с кровью тех же больных, они так же могут участвовать в формировании пула растворимых молекул CD38 в сыворотки крови.

Различия в гистологическом типе и локализации опухоли не сопровождались изменениями в уровне мРНК и растворимого белка CD38. Однако уровень обеих форм мРНК CD38 в крови больных с региональными метастазами был выше в 1,5 - 2,2 раза, чем у больных без метастазов и с отдаленными метастазами (таблица 7). При этом коэффициент К и сывороточный уровень sCD38 в крови больных без метастазов и с метастазами статистически значимо не различались.

Известно, что метастазирование при РТК характеризуются иммуносупрессией, в которой участвуют активированные Т-регуляторы (Betts G. et al., 2012). Одним из условий полноценной иммуносупрессии Т-регуляторами является высокий уровень экспрессии белка CD38 на мембране (Bahri R. et al., 2012). Показано, что у больных на третьей и четвертой стадиях

происходит увеличение количества Т-регуляторных клеток в периферической крови почти в два раза (Курганова Е.В. и др., 2010). Поэтому повышение уровня мРНК у больных с региональными метастазами, обнаруженными на третьей стадии заболевания, может быть результатом увеличения доли Т-регуляторных клеток. Однако доля Т-регуляторных клеток от общего числа лимфоцитов составляет лишь несколько процентов. Видимо, наличие метастатических клеток в региональных лимфатических узлах приводит к увеличению уровня мРНК С038 в клетках иммунной системы.

Таблица 7

Относительные уровни мРНК СБ38 в периферической крови больных РТК с наличием и отсутствием метастазов

Соотношен ие уровней мРНК Доноры Метастазы

отсутствуют присутствуют

региональные отдаленные

fulCD38 0,127 (0,088;0,166) 0,162 (0,120;0,226)*A 0,245 (0,135;0,285)* 0,153 (0,090;0,196)

altCD38 0,0251 (0,020;0,033) 0,017 (0,004;0,014)*A 0,037 (0,015;0,039)* 0,021 (0,012;0,023)A

fulCD38/ altCD38 5,0 (3,5; 7,4) 9,5 (6,5;18,7)* 6,6 (4,8;13,1) 7,3 (5,2;10,9)*

* - статистически значимые различия с донорами (р<0,05) ▲ - статистически значимые различия с больными, имеющими региональные метастазы (р<0,05)

Повышение уровня altCD38 формы мРНК у больных с метастазами может показывать изменения в регуляции активированных лимфоцитов. Матричная РНК altCD38 кодирует полипептид, антагонистичный полноценному белку CD38. Его присутствие может снижать вероятность диапедеза клеток иммунной системы и передачи внутриклеточных сигналов, что в конечном итоге приводит к снижению их функциональной активности. У больных с отдаленными метастазами уровень мРНК CD38 статистически значимо не отличался от уровня у доноров, что вероятно связано с малым количеством тестируемых образцов.

Изучение уровня мРНК CD38 в опухолевых очагах больных на разных стадиях развития новообразования, при разных гистологических типах, локализации опухоли, разном характере метастазирования показало отсутствие статистических различий, несмотря на обнаруженные тенденции. Постоянство уровня мРНК CD38 в очагах опухоли указывает на важную роль молекулы при РТК, которая может вносить вклад в формирование сывороточного уровня sCD38 и участвовать в передаче активационных сигналов. Известно, что молекула CD38 участвует в миграции лимфоцитов через эндотелий сосудов (Malavasi F. et al., 2008). Наши исследования линий клеток, выделенных из региональных (SW-620) и отдаленных (Т84) метастазов, показали наличие в них мРНК fullCD38 (таблица 3). Полученные данные находятся в соответствии с литературными. Показано участие многих молекул адгезии (CD31, CD54, CD56, CD146, CD166 и CD171) в метастазировании опухолевых клеток (Rosette С. et al., 2005; Wong C.W. et al., 2012). Вероятно, молекула CD38 также принимает участие в метастазировании опухолевых клеток.

Для анализа метилирования CpG динуклеотидов в позициях +754, +761, +765 и +791 промоторного региона гена CD38 была сформирована выборка, состоящая из 10 образцов крови и 15 образцов опухолевых очагов больных РТК, клеток линий COLO 205, НСТ116, НСТ15, SW-620, Т84, СаСо2 и 10 образцов периферической крови здоровых доноров. Среди образцов опухолевых очагов были отобраны образцы, содержащие обе формы мРНК CD38 (п=5), содержащие только полноразмерную форму мРНК (п=5) и образцы не содержащие мРНК (п=5). Во всех исследуемых образцах обнаружено CpG метилирование в области связывания рецептора ретиноевой кислоты (позиции + 754, + 761, + 765) и транскрипционного фактора Spl (позиция + 791). Известно, что Spl и рецептор ретеноевой кислоты принимают участие в регуляции экспрессии гена (Malavasi F. et al., 2008). Полученные нами результаты показывают отсутствие связи между наличием мРНК CD38 и метилированием областей связывания приведенных выше транскрипционных факторов. Примененный в работе метод позволяет выявлять метилирование последовательностей CpG в единичных молекулах ДНК. То есть, метилирование промоторного участка гена CD38 в геноме лишь некоторых клеток в общей массе может давать положительную реакцию. Это позволяет говорить о неоднородности всех исследуемых образцов. Для CD38 показана экспрессия лишь на некоторых этапах созревания иммунных клеток крови. Опухолевые очаги характеризуются неоднородностью своего строения и могут содержать клетки с неактивным геном. Наличие метилирования и мРНК CD38 в

однородных клеточных линиях показывают, что метальные группы в изучаемых областях промотора не блокирует транскрипцию гена (Мшшпапеш Р. е! а1., 1995; ШеЬоЫ М. ег а1., 2011). В результате наших исследований установлено, что клетки линий характеризовались наименьшим уровнем мРНК С038 в сравнении с очагами опухоли и кровью больных (таблица 4).

Для оценки частоты ОНП 1470С/Т (ге1130169) у здоровых доноров и больных РТК был разработан метод детекции аллельных вариантов ОНП 1470С/Т (гэ1130169) СЭ38 на основе ПЦР. Обнаружено повышение частоты встречаемости аллели С в выборке больных в сравнении с донорами (р<0,05). Данные о частоте встречаемости полиморфных вариантов гена СБЗБ у больных и здоровых анализировались на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга (таблица 8). Обе выборки отклонений от равновесия Харди-Вайнберга не имели. Полученные данные указывают на ассоциацию аллели С с риском развития РТК.

Таблица 8

Частота встречаемости полиморфных вариантов гена СБ38 (1470С/Т) у здоровых доноров и больных РТК

Аллели, генотипы Доноры (п = 86) Больные (п = 90) 011 95% С.1.

Аллель С 0,427 0,570 5С2 = 7,14; ±1=1-, р=0,008 1,78 1,16-2,71

Аллель Т 0,573 0,430 0,56 0,37 - 0,86

Генотип СС 0,163 0,281 х2 = 8,58; ¿£=2; р=0,01 2,01 0,96-4,19

Генотип СТ 0,535 0,584 1,22 0,67 - 2,22

Генотип ТТ 0,302 0,135 0,36 0,17-0,77

Проведено сопоставление уровня мРНК у здоровых лиц (п=86) и больных раком толстой кишки (п=81) с их генотипами ОНП 1470С/Т (гв 1130169) в гене С038. Уровень М1С038 формы мРНК в образцах крови здоровых доноров с гомозиготой СС был выше в 1,3 раза (р<0,05) в сравнении с донорами, имеющими гетерозиготу СТ. При этом в образцах крови с гомозиготой ТТ уровень й111С038 формы мРНК был в 1,3 раза (р<0,05), а аИСЭ38 в 1,4 раза (р<0,05) ниже, чем в крови доноров с гетерозиготой СТ (рис.2). Полученные нами результаты совпадают с опубликованными В. Хартманом, который исследовал лимфобластоидные клетки В-клеточных линий и показали, что

клетки с генотипом СС характеризовались повышенным уровнем мРНК CD38 (Hartman W. et al., 2010).

Füll CD38 Füll CD38 Füll CD38 I Min-Max

Alt CD38 Alt CD38 Alt CD38

Рисунок 2 - Уровни мРНК СБ38 в крови здоровых доноров с разными генотипами ОНП 1470С/Т (гэ1130169)

* - статистически значимые различия с донорами, имеющими гетерозиготу СТ (р<0,05)

Проанализирована связь полиморфных вариантов гена СБ38 (1470С/Т) с относительным содержанием С038-положительных клеток (п=17) и сывороточным уровнем вСВ38 (п=14) в крови здоровых доноров (таблица 9). Сывороточный уровень суммарной фракции бС038 статистически значимо не менялся у доноров с разными генотипами, а уровень олигомерной фракции у доноров с гетерозиготой СС в сравнении с донорами, имеющими гомозиготу ТТ, был повышен в 1,7 раза (р<0,05). Обнаружена корреляция между сывороточным уровнем суммарной (11=0,65, р<0,05) и олигомерной (11=0,64, р<0,05) фракций молекул бС038 и генотипами ОНП 1470С/Т .

Таблица 9

Сывороточный уровень бС038 и относительное содержание С038-положительных клеток у здоровых доноров с разными генотипами ОНП

1470С/Т (гз1130169)

Белок СБ38 Генотип СС Генотип СТ Генотип ТТ

Фракции SCD38 (U/ml) Суммарная 151 (144;161) 143 (142;151) 134 (127;145)

Олигомерная 99 (77; 124) 77 (65;85) 58 (48;70)*

CD3 8-положительные клетки (%) 16,3 (15,9;17,4) 14,2 (13,5;16,6) 12,6 (12,1;14,1) *

* - статистически значимые различия с донорами с гомозитогой СС (р<0,05)

Относительное содержание С038-положительпых клеток в крови здоровых доноров, имеющих гомозиготу СС, было в 1,2 раза выше, чем в крови доноров с гомозиготой ТТ (р<0,05). В остальных случаях статистически значимых различий не выявлено. Установлена корреляция между генотипами ОНП 1470С/Т (гэ1130169) доноров и количеством С038-положительных лимфоцитов (11=0,73, р<0,05). Видно, что у доноров с генотипом СС также повышен сывороточный уровень растворимого С038 и количество С038-положительных клеток в периферической крови.

В крови больных РТК с гомозиготой ТТ уровень мРНК Ш11С038 был ниже в 1,5 раза, чем у больных, имеющих гетерозиготу СТ (р<0,05) и гомозиготу СС (р<0,05). В то же время уровень мРНК у больных с генотипами СТ и СС не различался (рисунок 3). Уровень мРНК аКСОЗв у больных с гомозиготой ТТ имел тенденцию к снижению в сравнении с больными, имеющими генотип СТ (в 1,5 раза) и СС (в 1,3 раза). Сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций бСВ38 не менялся у больных РТК в зависимости от генотипа ОНП 1470С/Т.

Анализ экспрессии гена СВ38 у здоровых доноров и больных РТК с разными генотипами ОНП 1470С/Т (гэ! 130169) показал, что у здоровых доноров уровень мРНК обеих форм, количество СБ38-положительных лимфоцитов и уровень бС038 повышается в ряду генотипов: СС>СТ>ТТ. В то же время уровень мРНК в крови больных с генотипами СС и СТ не отличался и был повышен в сравнении с больными, имеющими генотип ТТ.

АК СП38 АН СЭ38 Ак С038

Рисунок 3 - Уровни мРНК СБ38 в периферической крови больных РТК с разными генотипами ОНП 1470С/Т (ге1130169)

* — статистически значимые различия с больными, имеющими гомозиготу ТТ (р<0,05)

Растворимая форма СБ38 не менялась в сыворотке крови больных с разными генотипами ОНП 1470С/Т (гэ1130169). Отсутствие различий между " больными с разными генотипами вероятно связано с особенностями течения неопластического процесса и реакцией организма на опухоль.

выводы

1. В периферической крови больных раком толстой кишки присутствует как полноразмерная, так и альтернативная формы мРНК CD38, в опухолевых очагах больных раком толстой кишки полноразмерная форма мРНК CD38 присутствует в 78 (64; 88)% случаев, а альтернативная лишь в 52 (38; 65)% случаев и выявляется только в присутствии полноразмерной формы.

2. Уровень обеих форм мРНК CD38 в периферической крови больных выше, чем в опухолевых очагах. Как в крови, так и в очагах опухоли уровень полноразмерной формы мРНК выше уровня альтернативной. У больных уровень полноразмерной формы мРНК в периферической крови выше, а альтернативной ниже, чем в крови доноров.

3. В периферической крови больных РТК на третьей стадии значительно увеличен уровень обеих форм мРНК CD38 в сравнении с другими стадиями. Наличие региональных метастазов также характеризуется повышенным уровнем мРНК CD38 в периферической крови.

4. Сывороточный уровень как суммарной, так и олигомерной фракций растворимых молекул CD38 у больных РТК повышен в сравнении со здоровыми донорами. На первой стадии уровень суммарной фракции растворимых молекул CD38 в два раза выше, чем на других стадиях заболевания.

5. CpG динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 промотора гена CD38 метилированы как в периферической крови, так и в опухолевых очагах больных РТК.

6. Частота встречаемости аллели 1470С (rsl 130169) в гене CD38 у больных РТК достоверно выше, чем у здоровых доноров (%2 = 7,14; d.f.=l; р=0,008). В периферической крови больных с генотипами СС и СТ зарегистрирован повышенный уровень полноразмерной формы мРНК CD38 в сравнении с больными с генотипом ТТ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Perenkov A.D. Heterogeneous expression of CD38 gene in tumor tissue in patients with colorectal cancer / A.D. Perenkov, D.V. Novikov, N.A. Sakharnov, A.V. Aliasova, O.V. Utkin, A.Iu. Baryshnikov, V.V. Novikov // Mol. Biol. (Mosk). -

2012. -V. 46, № 5. - C. 786-791. (Список ВАК, РИНЦ-0,318, авт.-0,3) п.л.

2. Новикова C.B. Особенности экспрессии генов дифференцировочных молекул в клеточных линиях, полученных от больных раком толстого кишечника / C.B. Новикова, А.Д. Перенков, H.A. Сахарнов, Д.В. Новиков, К.И. Ексина, E.H. Филатова, А.Ю. Барышников, A.B. Алясова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. — 2012. —№ 2-3. — С. 241— 245. (Список ВАК, РИНЦ-0,095, авт.-0,25 п.л.)

3. Перенков А.Д. Уровень полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD38 в периферической крови на разных стадиях рака толстой кишки /

A.Д. Перенков, Д.В. Новиков, A.B. Алясова // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7, № 2-3. - С. 295. (Список ВАК, РИНЦ-0,282, авт.-0,05 п.л.)

4. Перенков А.Д. Исследование встречаемости мРНК молекулы CD38 в опухолевых очагах больных аденокарциномой тела матки / А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, Е.Ю. Конторщикова, К.А. Коровушкина, О.В. Уткин, В.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 1. — С. 48^9. (Список ВАК, РИНЦ-0,351, авт.-0,1 п.л.)

5. Перенков А.Д. Встречаемость мРНК гена CD38 в опухолевых очагах больных колоректальным раком на разных стадиях заболевания / А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, A.B. Алясова, А.Ю. Барышников, В.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 4. - С. 108. (Список ВАК, РИНЦ-0,351, авт.-0,05 п.л.)

6. Филатова E.H. Полноразмерная и альтернативная формы мРНК гена CD38 в клетках перевиваемых линий, полученных от больных раком толстого кишечника / E.H. Филатова, А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, А.Ю. Барышников,

B.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. -

C. 55. (Список ВАК, РИНЦ-0,351, авт.-0,05 п.л.)

7. Перенков А.Д. Распределение аллельных вариантов ОНП. rsl 130169 гена CD38 у здоровых доноров и больных раком толстой кишки / А.Д. Перенков В.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. —2013. - Т. 12, № 2. - С. 64. (Список ВАК, РИНЦ-0,351, авт.-0,05 п.л.)

8. Перенков А.Д. Уровни альтернативных форм мРНК гена CD38 у здоровых доноров и больных раком толстой кишки / А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, О.В. Уткин, A.B. Алясова, А.Ю. Барышников, В.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 64. (Список ВАК, РИНЦ-0,351, авт.-0,05 п.л.)

II. Тезисы докладов региональных и международных конференций:

9. Перенков А.Д. Получение генетической конструкции для экспрессии CD38 человека в клетках Е. Coli / А.Д. Перенков // Сборник тезисов 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века», Пущино. - 2010. - С. 169-170.

10. Перенков А.Д. Анализ экспрессии гена CD38 / А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, О.В. Уткин // Сборник тезисов III научно-практическая школа-конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций роспотребнадзора: «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск. — 2011. — С. 209—211.

11. Перенков А.Д. Частота встречаемости мРНК CD38 антигена в опухолевых очагах больных миомой матки / А.Д. Перенков, Д.В. Новиков, Е.Ю. Конторщикова, К.А. Коровушкина, В.В. Новиков // Сборник тезисов XXIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. — 2011. - С. 100.

12. Перенков А.Д. Исследование метелирования гена CD38 при раке толстого кишечника методом метилчувствительного рестрикционного анализа / А.Д. Перенков, C.B. Шумилова, О.В. Уткин, Д.В. Новиков // Сборник тезисов всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора», Санкт-Петербург.-2011.-С. 155-156.

Список сокращений кДНК — комплементарная ДНК мРНК — матричная РНК

ОТ-ПЦР - сопряженная с обратной транскрипцией полимеразная цепная реакция

РТК - рак толстой кишки U/ml - количество условных единиц в мл sCD38 - растворима форма молекулы CD38 ОНП — однонуклеотидный полиморфизм fullCD38 - полноразмерная форма мРНК altCD38 - альтернативная форма мРНК

К - коэффициент соотношения уровня полноразмерной формы мРНК к альтернативной в одном образце

Благодарности

Автор выражает благодарность за помощь в выполнении работы проф. Новикову В.В., проф. Алясовой A.B., к.б.н. Бабаеву A.A., к.б.н. Шаховой К.А., Сахарнову H.A., к.б.н. Шумиловой C.B., Калугину A.B.

Подписано в печать 27.02.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 109. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИНГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Перенков, Алексей Дмитриевич, Нижний Новгород

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

04201457707

На правах рукописи

Перенков Алексей Дмитриевич

Экспрессия гена СБ38 при раке толстой кишки

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Новиков Д.В.

Нижний Новгород-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................10

1.1 Молекула СЭ38.........................................................................................10

1.2 Энзиматичеекая функция молекулы СЭ38.....................................16

1.3 Рецепторная и сигнальная функции молекулы С038.......................23

1.4 Ген СБ38...............................................................................28

1.5 мРНК гена СБ38..................................................................32

1.6 Молекула С038 при опухолях.................................................34

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................38

2.1 Материалы............................................................................38

2.2 Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот......................38

2.3 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.............39

2.4 Реакция обратной транскрипции................................................39

2.5 Полимеразная цепная реакция в реальном времени.............................40

2.6 Полимеразная цепная реакция..................................................42

2.6.1 Детекция мРНК полноразмерной и альтернативной форм.............42

2.6.2 Обнаружеие метилирования Срв динуклеотидов........................43

2.6.3 Аллель-специфическая ПЦР...................................................44

2.7 Электрофорез ДНК в агарозном геле..........................................45

2.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.....................45

2.9 Иммуноферментный метод определения растворимых дифферецировочных молекул в сыворотке крови..............................46

2.10 Реакция непрямой иммунофлуоресценции.................................47

2.11 Статистический анализ результатов..........................................49

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................50

3.1 Определение частоты обнаружения мРНК СБ38 у больных раком

толстой кишки..........................................................................50

3.1.1 Разработка метода детекции полноразмерной и альтернативной форм мРНК СЭ38......................................................................50

3.1.2 Частота выявления полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD38 в опухолевых очагах больных раком толстой кишки..................52

3.2 Разработка метода оценки уровня мРНК CD38 с использованием ПЦР в реальном времени...................................................................57

3.3 Экспрессия гена CD38 у здоровых лиц и больных раком толстой кишки.....................................................................................61

3.4 Экспрессия гена CD38 в клетках периферической крови и опухолевых очагах в зависимости от клинико-морфологических показателей больных раком толстой кишки.................................................................71

3.5 Исследование метилирования промоторного региона гена CD38 у больных раком толстой кишки......................................................98

3.6 Разработка метода детекции однонуклеотидной замены 1470С/Т в гене CD38 с использованием аллель-специфической ПЦР........................102

3.7 Исследование частоты встречаемости полиморфных вариантов гена CD38 (1470С/Т) у здоровых доноров и больных раком толстой кишки..104

3.8 Экспрессия гена CD38 у здоровых доноров и больных раком толстой

кишки с разными генотипами ОНИ 1470С/Т..................................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................118

ВЫВОДЫ..............................................................................121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

U/ml - количество условных единиц в мл

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты

е.а. — единицы активности

кДНК- комплементарная ДНК

мРНК- матричная РНК

н.о. - нуклеотидные основания

ОТ-ПЦР- обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

sCD38 - растворима форма молекулы CD38

XJIJ1 - хронический лимфолейкоз

CD - claster of differentiation

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

full CD38 - полноразмерная форма мРНК

alt CD38 - альтернативная форма мРНК

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Согласно данным ВОЗ онкологические заболевания занимают второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. В России рак толстой кишки занимает второе место в структуре женской онкологической заболеваемости и третье место среди мужской после рака предстательной железы и легкого [Чиссов В.И. и др. 2010]. В связи с этим изучение биохимических особенностей течения рака толстой кишки является актуальной проблемой.

Дифференцировочная молекула CD38 кодируется геном, состоящим из восьми экзонов и расположенном на четвертой хромосоме в л оку се 4р15. Ряд однонуклеотидных полиморфизмов гена влияют на уровень его экспрессии и ассоциированы с онкологическими заболеваниями крови и легких [Pu X. et al., 2012; Eyada Т.К. et al., 2013]. Еще одним регулятором экспрессии гена CD38 является метилирование сайтов связывания с транскрипционными факторами [Ferrero Е. et al., 2000]. Для гена описано две формы мРНК CD38 -полноразмерная и альтернативная. У альтернативной формы делетирован третий экзон, что приводит к сбою рамки считывания [Nata К. et al., 1997]. Белковый продукт гена обладает энзиматической активностью в отношении цАДФ-рибозы. CD38 играет важнейшую роль в активации, пролиферации, адгезии и хемотаксисе клеток иммунной системы. Описана физическая ассоциация CD38 с Т и В-клеточным рецептором, CD16 и молекулами HLA II класса. Известна мембранная и растворимая формы молекулы CD38 [Malavasi F., 2008; Horenstein A.L. et al., 2013]. Экспрессия белка CD38 на мембране клеток используется в качестве прогностического и диагностического маркера при лейкемиях, миеломе и хроническом лимфолейкозе [Pearce L. et al., 2010; Abramenko I.V. et al., 2012], a растворимая форма CD38 может быть использована при оценке эффективности лечения рака молочной железы [Новиков В. В. и др., 2005]. При раке толстой кишки исследования гена CD38 проводились в основном с

использованием клеточных линий [Yang S. et al., 2004]. В литературе недостаточно представлены данные об экспрессии CD38 в периферической крови и первичных опухолевых очагах больных раком толстой кишки. Остаются не изученными ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в гене CD38, метилирование его промотора, уровень мРНК и растворимой формы белка у больных раком толстой кишки.

Целью работы явилось изучение особенностей экспрессии гена CD38 в периферической крови и первичных опухолевых очагах больных раком толстой кишки.

Задачи исследования

1) Установить частоту обнаружения полноразмерной и альтернативной форм мРНК CD38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки.

2) Оценить уровни мРНК и растворимой формы белка CD38 у больных раком толстой кишки и сопоставить с их клиническими особенностями течения заболевания.

3) Оценить наличие метилирования CpG динуклеотидов в промоторном регионе гена CD38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки.

4) Определить частоту однонуклеотидной замены 1470С/Т (rsl 130169) в гене CD38 и сопоставить ее с уровнем мРНК и растворимой формы белка CD38 у больных раком толстой кишки.

Научная новизна работы

Впервые установлена частота обнаружения мРНК полноразмерной и альтернативной форм CD38 в периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки, причем частота обнаружения

полноразмерной формы мРНК была выше частоты обнаружения альтернативной формы.

Показано, что в крови здоровых доноров, в крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки уровень альтернативной формы мРНК СБ38 значительно ниже уровня полноразмерной формы.

Установлено, что соотношение уровня полноразмерной формы мРНК СБ38 к альтернативной в крови доноров, крови и очагах опухоли больных раком толстой кишки различается.

Продемонстрировано, что сывороточный уровень суммарной и олигомерной фракций растворимых молекул СБ38 выше у больных раком толстой кишки, чем у доноров.

Установлено, что уровень мРНК полноразмерной и альтернативной форм СЭ38 в крови больных раком толстой кишки значительно выше, чем в опухолевых очагах тех же больных.

Впервые установлено, что СрО динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 гена СЭ38 метилированы в периферической крови и опухолевых очагах, полученных от больных раком толстой кишки.

Впервые изучена частота полиморфного варианта 1470С/Т гена СБ38 у здоровых доноров и больных раком толстой кишки, проживающих на территории Нижегородской области. Продемонстрирована ассоциация аллели С с заболеванием. Показано, что у людей с генотипом СС повышен уровень мРНК СБ38 по сравнению с генотипом ТТ по локусу 1470С038.

Практическая значимость работы

На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени разработан метод определения уровня полноразмерной и альтернативной форм мРНК СБ38, который применим в качестве дополнительного мониторингового показателя при раке толстой кишки. Показано значительное увеличение уровня мРНК С038 в периферической крови больных при метастазировании опухоли в лимфатические узлы.

На основе ПЦР разработан метод детекции однонуклеотидного полиморфизма 1470С/Т (гэ1130169) гена СБ38 человека, который может быть использован для определения групп с повышенным риском развития рака толстой кишки. Аллель 1470С ассоциирована с заболеванием.

Полученные данные могут быть использованы в преподавании курсов по биохимии в вузах биологического и медицинского профиля.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В опухолевых очагах, полученных от больных раком толстой кишки, детектируется мРНК СЭ38.

2. Уровень мРНК полноразмерной формы выше альтернативной у доноров и больных раком толстой кишки.

3. В крови больных раком толстой кишки уровень мРНК С038 полноразмерной формы выше, а уровень мРНК альтернативной формы ниже, чем в крови здоровых доноров.

4. В периферической крови и опухолевых очагах больных раком толстой кишки Срв динуклеотиды в позициях +754, +761, +765 и +791 гена С038 метилированы.

5. Аллель 1470С (гз1130169) гена СЭ38 встречается чаще у больных раком толстой кишки, чем у здоровых доноров и ассоциирован с повышенным уровнем мРНК СБ38.

Апробация работы

Результаты работы представлены на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2012), II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), XXIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнолигии» (Москва, 2011), X Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва,

2011), III Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технолигии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора» (С. Петербург, 2011), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 2011), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань,2012), XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Н. Новгород, 2012), Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Минск, 2013), Объединенном иммунологическом форуме (Н. Новгород, 2013), VI Объединенном иммунологическом форуме (Н. Новгород, 2013).

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского 12 сентября 2013 года и на заседания кафедры биохимии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» 5 февраля 2014 года.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 143 листа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 35 рисунками и 24 таблицами. Библиографический указатель включает 197 источников литературы (22 отечественных и 175 иностранных).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Благодарности

Автор выражает благодарность за помощь в выполнении работы проф. Новикову В.В., проф. Алясовой A.B., к.б.н. Бабаеву A.A., к.б.н. Шаховой К.А., Сахарнову H.A., к.б.н. Шумиловой С.В., Калугину A.B.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Молекула CD38

Белковая молекула, обозначенная в соответствии с международной классификацией как CD38, является трансмембранным гликопротеином второго типа, который обладает энзим этической активностью [Кнапп В. и др., 1990; Howard М. et al., 1993; Matesanz-Isabel, 2011]. Кроме энзиматической активности белок обладает функцией рецептора адгезии и участвует в активации Т и В лимфоцитов и натуральных киллеров (NK) [Trinchieri G., 1989; Kitanaka A. et al., 1999; Slaughter N., 2003] (рис. 1).

Человеческий CD38 имеет молекулярную массу в 45 кДа, имеет в своем составе 300 аминокислот и состоит из короткого N—концевого цитоплазматического домена (20 аминокислот), трансмембранного участка (23 аминокислоты) и длинного С—концевого домена (257 аминокислот), а также содержит четыре участка гликозилирования (N100, N164, N209 и N219) и два сайта, связывающих гиалуроновую кислоту [Alessio М. et al., 1990; Malavasi F. et al., 1994; Nishina H. et al., 1994]. Около 25% от молекулярной массы белка составляют углеводные группы. Установлено, что углеводные группы не влияют на ферментативную активность, связывание с лигандом, трасдукцию внутриклеточных сигналов и положение белка на мембране клеток. Однако, имеют важное значение в стабильности молекулы CD38 на мембране клеток. Так, выяснилось, что без углеводных групп белок не стабилен в мономерной форме и всегда олигомеризуется [Gao Y., Mehta К., 2007].

Молекула CD38 имеет "L''-образную форму и состоит из а спиральных и Р складчатых участков, причем на С конце преобладают (3 складчатые структуры, а на N конце - а спиральные структуры (рис. 2). NH2-K0HueB0ft домен формируется из пучка а спиралей и двух коротких (3-структур, а СООН-концевой домен состоит из 4 параллельных Р-структур, окруженных двумя длинными и двумя короткими а спиралями. Между двух доменов находится шарнирный регион, состоящий из трех пептидных цепей,

Энзнматическая активность

Сигнальная функция

_ Предполагаемый сайт

Сайт связывания ,,

связывания CDi 1

Рисунок 1 - Схема строения и функций мембранной формы CD38 антигена [Malavasi F., Torino А., 2006]

— аминокислотная последовательность

— углеводные группы

lilsSiil ~ сайты связывания с гиалуроновой кислотой

соединенных дисульфидными связями: Цистеин 119 - Цистеин 201 (уникальна для белка CD38), Цистеин 64 - Цистеин 82, Цистеин 99 - Цистеин 180, Цистеин 160 - Цистеин 173, Цистеин 254 - Цистеин 275 и Цистеин 287 -Цистеин 296 [Liu Q. et al., 2005]. Шарнирный регион формирует полость, где находятся каталитически важные аминокислоты: глутаминовая кислота в 226 позиции входит в каталитический центр, остатки триптофана в 125 и 189 позициях отвечают за связывание с субстратом, а глутаминовая кислота в 146

позиции и триптофан в 221 позиции регулируют циклазную/гидролазную активность молекулы CD38. При замене глутаминовой кислоты в 146 позиции на аланин, а триптофана 221 на фенилаланин происходит изменение ферментативной активности CD38 в сторону циклазной [Zhang Н.М. et al., 2011].

а спираль

N - терминальный домен

Р-структура

С - терминальный домен

Рисунок 2 - Доменная структура мембранной формы CD38 [Malavasi F. et al., 2008]

Показана возможность олигомеризации молекулы CD38 на мембране клеток. Причем олигомерная форма молекулы имеет более выраженную циклазную активность, чем мономерная форма, которая в большей степени несет функцию белка адгезии [Chidambaram N. et al., 1998; Новиков В. В., Кравченко Г. А., Бабаев А. А., 2009; Chini Е. N. et al., 2009]. Показана возможность образования димерной и тетрамерной форм молекулы CD38 на поверхности клеток. Тетрамеризация происходит путем взаимодействия двух димерных форм молекулы, которые в отличие от тетрамерной формы более

стабильны. Установлено, что тетрамерная форма достаточно легко переходит в димерную под действием детергентов [Bruzzone S. et al., 1998; Hara-Yokoyama M. et al., 2012].

Молекула CD38 экспрессируется клетками слизистой желудка, поджелудочной железы, печени, легких, слизистой носа, клетками почек, тимуса, миндалин, лимфатических узлов кишечника, пейеровых бляшек, клетками роговицы, астроцитами, селезенки, мышечными клетками, а так же эритроцитами и тромбоцитами, часто в качестве цитоплазматических и ядерных молекул [Malavasi F. et al., 1994; Funaro A. et al., 1995; Geerts A., 2001; Sizzano F. et al., 2007]. Более выражена ее экспрессия на лимфоцитах, моноцитах, дендритных клетках и натуральных киллерах (NK) [Deaglio S., Malava