Матричная РНК белков системы "интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2" в опухолевых очагах

Шумилова, Светлана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Матричная РНК белков системы "интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2" в опухолевых очагах
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Матричная РНК белков системы "интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2" в опухолевых очагах"

На правах рукописи

-¿ШАгМ^

ШУМИЛОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

МАТРИЧНАЯ РНК БЕЛКОВ СИСТЕМЫ «ИНТЕРЛЕЙКИН-2 - РЕЦЕПТОР ИНТЕРЛЕЙКИНА-2» В ОПУХОЛЕВЫХ ОЧАГАХ 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Нижний Новгород 2012

005055998

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского».

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Г.А. Кравченко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К.Н. Конторщикова доктор медицинских наук С.Н. Лавровский

Ведущая организация:

Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН,. г. Москва

Защита состоится « 20»$шт 2DI2 года в ,,~> часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан «Jö » HQ3£>P$l 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Понимание фундаментальных биохимических процессов, лежащих в основе канцерогенеза, является необходимым звеном в борьбе с онкологическими заболеваниями. Возникающие в ходе канцерогенеза мутации приводят к глубоким изменениям транскриптома (совокупности РНК) опухолевых клеток. Изменения характерны чаще всего для транскриптов генов, кодирующих белки, участвующие в передаче внутриклеточных и межклеточных сигналов, биохимических механизмах прохождения по клеточному циклу. Так, в опухолевых клетках обнаруживаются матричные РНК, кодирующие белки системы «интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2» («IL-2 - IL-2R»), которая является одним из ключевых звеньев в активации и пролиферации иммунокомпетентных клеток (Новиков В.В., 2010).

Система «IL-2 - IL-2R» наряду с IL-2 включает три белковые субъединицы его рецептора, кодируемые разными генами (IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG) и синтезируемые на разных мРНК. Рещающую роль в запуске системы играет альфа-субъединица рецептора интерлейкина-2 (IL-2Ra). Известно, что высокая экспрессия LL-2Ra в неопластических клетках приводит к повышению их пролиферативной, трансформирующей активности, устойчивости к лекарственным препаратам и коррелирует с плохим прогнозом для пациента (Kuhn D., Dou Q., 2005). Показано существование ряда альтернативных форм матричной РНК альфа-субъединицы IL-2R (CD25, CD25Exo4Del, CD25Exo4-5Del и др.) (Cosrmn D., 1984; Choi С., 1997). Они кодируют белки, которые могут выполнять различные функции, влияя на связывание IL-2 с рецептором и, как следствие, на развитие опухоли и на механизмы противоопухолевого иммунитета.

Изменения в транскриптоме опухолевых клеток могут происходить как за счет включения или выключения гена в целом, так и на уровне альтернативного сплайсинга пре-матричной РНК. Изучение связанных с многообразием мРНК системы «IL-2 - IL-2R» изменений транскриптома клеток опухолевых очагов при развитии новообразований позволит расширить представления о биохимических основах опухолевого роста.

Цель работы

Изучение особенностей транскриптома клеток опухолевых очагов, связанных с многообразием мРНК системы «IL-2 - IL-2R», в сопоставлении с картиной опухолевого роста.

Задачи

1. Разработать метод одновременной детекции трех альтернативных форм мРНК альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 и методы идентификации мРНК интерлейкина-2, а также бета- и гамма-субъединиц рецептора интерлейкина-2.

2. Провести анализ частоты выявления трех альтернативных форм мРНК IL-2Ra в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника (РТК), раком легкого (PJI) и раком тела матки (РТМ).

3. Оценить частоту определения мРНК интерлейкина-2, а также бета- и гамма-субъединиц рецептора интерлейкина-2 в опухолевых очагах больных раком тела матки.

4. Сопоставить картину экспрессии генов системы «IL-2 - IL-2R» в клетках опухолевых очагов со встречаемостью мРНК раково-тестикулярных белков, мРНК белков ICAM-1, CD38 и Fas, с картиной опухолевого роста и показателями иммунитета.

5. Исследовать наличие мРНК белков системы «IL-2 - IL-2R» в клетках перевиваемых линий.

Научная новизна работы

Впервые разработан метод одновременной детекции трех альтернативных форм мРНК альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 человека с использованием ОТ-ПЦР.

Впервые показано присутствие сплайсированного варианта мРНК IL-2Ra CD25Exo4-5Del в периферической крови здоровых добровольцев и установлена первичная структура данной мРНК.

Впервые продемонстрировано присутствие альтернативных форм мРНК IL-2Ra CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del в опухолевых очагах больных РТК, PJI, РТМ и периферической крови онкологических больных. Чаще всего в опухолевых очагах обнаруживается полноразмерная форма мРНК IL-2Ra, а затем в порядке убывания мРНК CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del. Такая закономерность продемонстрирована для онкологических больных,

находящихся на разных стадиях заболевания, с метастазами и без метастазов, с разной локализацией и гистологической формой опухоли.

Показано, что альтернативные варианты мРНК CD25, CD25Exo4Del, CD25Exo4-5Del встречаются в опухолевых очагах при РТК чаще, чем при РТМ.

Впервые исследованы особенности транскриптома клеток опухолевых очагов в сравнении со встречаемостью альтернативных форм мРНК IL-2Ra. При РТК показано, что транскриптом клеток опухолевых очагов, характеризующийся присутствием мРНК mFas, Fas del 5, Fas del 3,4, sFas, Fas del 4,6, Fas del 3,4,6, CD38, GAGE1-8, PAGE1, SSX1,2,4, NY-ESO-1, MAGEA1-6, статистически значимо чаще содержал мРНК полноразмерной формы CD25, нежели мРНК CD25Exo4-5Del. Кроме того, мРНК полноразмерной формы CD25 достоверно чаще, в сравнении с мРНК CD25Exo4-5Del, обнаруживается при отсутствии в опухолевых очагах мРНК Fas del 4, Fas del 4,6, Fas del 5, Fas del 3,4,6, CD38Exo3Del, sICAM-1, GAGE1-8, CT7, XAGE1, SSX1,2,4, NY-ESO-1. Форма мРНК CD25Exo4-5Del, в сравнении с мРНК CD25Exo4Del, выявляется реже в Fas del 5 и Fas del 3,4-позитивных и CD38Exo3Del-HeraTHBHbix опухолевых очагах.

Впервые установлено, что в опухолевых очагах больных РТК мРНК CD25Exo4Del встречается чаще совместно с мРНК SSX1,2,4, а мРНК CD25Exo4-5Del детектируется чаще совместно с мРНК ICAM-1.

При PJ1 впервые показано, что мРНК CD25Exo4-5Del в опухолевых очагах чаще детектируется совместно с мРНК XAGE1 и SSX1,2,4, а метастазирование в 2 раза реже сопровождается присутствием в опухолевых очагах мРНК CD25Exo4-5Del.

Впервые обнаружено, что особенности экспрессии гена IL-2RA, связанные с продукцией альтернативных форм мРНК в опухолевых очагах больных РТК, не отражаются на сывороточном содержании растворимых дифференцировочных молекул CD25, являющихся продуктом посттрансляционной модификации белка.

В опухолевых очагах больных раком тела матки впервые зафиксирована экспрессия генов IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG. Присутствие мРНК бета-субъединицы IL-2R показано в 100% случаев, мРНК IL-2, альфа-субъединицы IL-2R и гамма-субъединицы IL-2R обнаруживаются с частотой от 57 до 87%.

Впервые показано, что относительное содержание CD4+, CD8+, CD25+ и CD95+ мононуклеарных клеток крови больных РТМ и сывороточное

содержание растворимых молекул CD25 не меняется при наличии или отсутствии альтернативных форм мРНК IL-2Ra в опухолевых очагах.

Присутствие в опухолевых очагах больных РТМ мРНК IL-2 как правило сопровождается наличием мРНК трех субъединиц его рецептора, кодирующих полноценную систему «интерлейкин-2 - его рецептор».

Впервые продемонстрировано, что наличие мРНК всех четырех генов системы «IL-2 - IL-2R» в опухолевых очагах больных РТМ сопровождается сниженным сывороточным содержанием растворимых молекул ICAM-1. В отсутствие экспрессии хотя бы одного из данных генов повышается сывороточная концентрация растворимых молекул CD25, что свидетельствует о развитии иммунного ответа на опухоль.

Впервые охарактеризован профиль экспрессии генов системы «IL-2 -IL-2R» в клетках перевиваемых линий HuT78, А549, NCI-H23, COLO 205, НСТ116, НСТ15, SW620.

Практическая значимость работы

Разработанный в рамках настоящей работы метод одновременного определения трех альтернативных форм мРНК IL-2Ra в опухолевых очагах онкологических больных может быть использован при создании новых подходов к оценке прогноза течения заболевания и эффективности проводимой терапии. В частности, показано, что наличие мРНК CD25Exo4-5DeI в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника можно рассматривать как показатель благоприятного течения заболевания.

Полученные данные могут быть применены в преподавании курсов по биохимии для студентов вузов биологического и медицинского профиля.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие рака толстого кишечника, рака легкого, рака тела матки сопровождается появлением в опухолевых очагах трех альтернативных форм мРНК IL-2Ra в различных комбинациях.

2. В опухолевых очагах чаще всего выявляется полноразмерная форма мРНК CD25, затем в порядке убывания мРНК CD25Exo4DeI и мРНК CD25Exo4-5DeI.

3. Сплайсированные варианты мРНК IL-2Ra клеток опухолевых очагов с различной частотой встречаются совместно с другими транскриптами, в частности с мРНК раково-тестикулярных белков и белков, реализующих иммунный ответ.

4. Вариации в экспрессии четырех генов системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я» в опухолевых очагах больных РТМ сопровождаются изменениями в сывороточном содержании растворимых дифференцировочных молекул.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на: I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2008» (Казань, 2008), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2010» (Н. Новгород, 2010), IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Н. Новгород, 2010), XV Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2010), II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Н. Новгород, 2011), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора» (С. Петербург, 2011), XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Н. Новгород, 2012).

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского 12 сентября 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации

литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 15 рисунками и 26 таблицами. Библиографический указатель включает 182 источника литературы (7 отечественных и 175 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследование включено 49 образцов опухолевых очагов и 49 образцов периферической крови больных РТК, проходивших лечение в хирургическом отделении ГУЗ Нижегородская областная клиническая больница им. H.A. Семашко; 34 образца опухолевых очагов больных РЛ, находившихся на лечении в ГУЗ Нижегородский областной онкологический диспансер; 40 образцов опухолевых очагов и 17 образцов периферической крови больных РТМ, проходивших лечение в 1-ом гинекологическом отделении ГУЗ Нижегородская областная клиническая больница им. H.A. Семашко, а также в гинекологическом отделении ФГУ Приволжский окружной медицинский центр ФМБА. В работе использовали 73 образца периферической крови здоровых добровольцев, полученные в клинических лабораториях городских больниц №34 и №5 (г. Нижний Новгород). Исследовали лизаты клеток перевиваемых линий НиТ78, Н9, Kit225 Кб, Ramos, А549, NCI-H23, COLO 205, НСТ116, НСТ15, SW-620, Т84, СаСо2, предоставленные Российским онкологическим научным центром им. H.H. Блохина РАМН.

Выделение суммарной РНК из клеток периферической крови, опухолевого очага или лизата клеток культуры осуществляли методом фенол-хлоформной экстракции. Детекцию матричных РНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией. Определение первичной структуры кДНК осуществляли в автоматическом режиме с помощью прибора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител серии ИКО (РОНЦ РАМН). Сывороточный уровень растворимых форм дифференцировочных молекул CD25 и CD54 определяли двухсайтовым иммуноферментным методом (Новиков В.В. и др., 2008).

Для компьютерного анализа данных в работе использовали пакет программ Lasergene (http://www.dnastar.com) согласно рекомендациям

производителя. Анализ первичных структур ДНК и матричной РНК осуществляли с использованием программы MapDraw данного пакета. Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили в программе MegAlign. Олигонуклеотидные праймеры конструировали, используя программы PrimerSelect пакета Lasergene и Oligo Calculator v 10 (Россия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 8.0. Анализ различий относительных частот обнаружения мРНК в группах проводили с использованием статистического критерия сравнения пропорций. Для представления исследованных количественных показателей были использованы медиана, 25 и 75 процентили. Межгрупповой анализ количественных показателей проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. При анализе качественных и количественных признаков различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Известно, что ген альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 способен давать несколько транскриптов, образующихся путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Анализ литературных данных позволил сделать заключение, что 4-й экзон гена IL-2RA играет ключевую роль в связывании интерлейкина-2 и представляет наиболыций интерес при изучении частоты встречаемости альтернативных вариантов матричной РНК IL-2Ra. Основываясь на первичной структуре мРНК IL-2Ra, мы осуществили дизайн олигонуклеотидных праймеров и провели подбор условий постановки ОТ-ПЦР, что позволило одновременно определять три формы мРНК IL-2Ra в одной пробирке. Разработанный метод апробировали на образцах клеток периферической крови здоровых добровольцев. С помощью данного метода детектировали кДНК, соответствующую фрагментам трех альтернативных форм матричной РНК IL-2Ra: полноразмерной формы (CD25), формы с делетированным 4-м экзоном (CD25Exo4Del) и формы с делецией экзонов 4 и 5 (CD25Exo4-5Del) (Рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов кДНК Комплементарная ДНК, синтезированная на матрице: А -полноразмерной формы мРНК 1Ь-2Яа; Б - альтернативной формы мРНК 1Ь-2Яа с делецией размером 28 и.о.; В - альтернативной СВ25Ехо4Бе1 формы мРНК 1Ь-2Ка; Г - альтернативной СВ25Ехо4-5Бе1 формы мРНК 1Ь-2Яа

1 - маркер размерности ДНК. выраженный в парах нуклеотидных оснований; 2 - кДНК 1Ь-2Яа

Нуклеотидные последовательности полученных фрагментов кДНК были определены в ходе секвенирования и сопоставлены с помощью программы М^АП§п с последовательностями вариантов мРНК 1Ь-211(х, аннотированными и размещенными в базах данных ЕпБетЫ и АЗРюБВ. Установлено соответствие фрагментов заявленным вариантам мРНК.

С использованием разработанного метода определена частота выявления трех сплайсированных вариантов мРНК 1Ь-2Яа в образцах опухолевых очагов больных РТК, РЛ, РТМ. Набор альтернативных форм мРНК 1Ь-2Иа в опухолевых очагах варьировал как у больных внутри данных групп, так и между группами (рис. 2).

Экспрессия гена 1Ь-2ЯА была зафиксирована в 100% тестированных опухолевых очагов больных РТК, в 94% случаев - у больных РЛ, в 83% - у больных РТМ. В данных образцах опухолевых очагов обнаружено присутствие от одного до трех вариантов сплайсинга мРНК 1Ь-2Яа в различных комбинациях. При всех трех онкологических заболеваниях полноразмерная форма мРНК СБ25 встречалась статистически значимо чаще, чем СБ25Ехо4-5Ве1 (р=0,002 для РТК, р=0,042 для РЛ, р<0,001 для РТМ). Наблюдалась тенденция к снижению частоты обнаружения матричных РНК в ряду «СБ25 - С025Ехо4Бе1 - С025Ехо4-50е1». Каждая из трех

100

С025 С025Ехо40е1 С025Ехо4-5Ре!

Рис. 2. Частота обнаружения мРНК 1Ь-2Яа в опухолевых очагах больных Статистически значимые различия по сравнению с частотой детекции:

1 - мРНК СБ25 при РТК (р<0,05)

2 - мРНК СБ25Ехо4-50е1 при РЛ (р=0,042)

3 - мРНК СЭ25Ехо4Ве1 при РТМ (р<0,05)

4 - мРНК СБ25Ехо4-50е1 при РТК (р=0,032)

5 - мРНК СБ25Ехо4-50е1 при РТМ (р<0,05)

6 - мРНК СБ25 при РТМ (р<0,05)

альтернативных форм мРНК 1Ь-2Ка выявлялась чаще при раке толстого кишечника, чем при раке тела матки (р=0,008 для СБ25, р<0,001 для СБ25Ехо4Ве1 и СБ25Ехо4-5Бе1). В опухолевых очагах больных РЛ полноразмерная форма мРНК СБ25 детектировалась реже, чем при РТК (р=0,012), но частота ее обнаружения не отличалась от таковой при РТМ. Обратная картина наблюдалась при сравнении частоты детекции мРНК, кодирующих формы 1Ь-2Кя, не способные связывать лиганд. Частота обнаружения мРНК СБ25Ехо4Пе1 и СБ25Ехо4-5Ве1 была выше в опухолевых очагах больных РЛ, чем при РТМ (р=0,004 и р=0,014, соответственно), но не отличалась от частоты их детекции при РТК.

Различия в локализации первичного опухолевого узла и гистологическом типе опухоли не сопровождались изменениями в частоте встречаемости альтернативных форм мРНК СБ25 и СВ25Ехо4Бе1. Однако наблюдались различия в частоте обнаружения мРНК СБ25Ехо4-5Ве1. При РТК она чаще встречалась в опухолевых очагах, локализованных в прямой кишке, чем в ректо-сигмовидном отделе (р=0,012) и сигмовидной кишке (р=0,037). Кроме того, в опухолевых очагах мужчин, но не женщин, выявлена статистически значимо меньшая частота обнаружения мРНК СБ25Ехо4-50е1 по сравнению с частотой детекции мРНК СБ25 (р=0,004).

Все три сплайсированные варианта мРНК 1Ь-2Яа встречались в опухолевых очагах на разных стадиях онкологических заболеваний. Если при РТК развитие заболевания от стадии к стади не сопровождалось изменениями в частоте определения мРНК 1Ь-2Яа, то при РЛ обнаружена выраженная тенденция к снижению частоты детекции альтернативных форм мРНК С025Ехо4Бе1 и СВ25Ехо4-5Бе1 от 1 к 3 стадии заболевания (табл. 1).

Таблица 1

Частота обнаружения альтернативных форм мРНК 1Ь-2Ыа в клетках опухолевых очагов на разных стадиях РТК и РЛ

Заболевание Стадия мРНК СЭ25 мРНК СВ25Ехо4Бе1 мРНК СБ25Ехо4-5Бе1

1 10/10 (100%) 9/10 (90%) 7/10 (70%)

РТК 2 24/25 (96%) 23/25 (92%) 20/25 (80%)

3 9/9 (100%) 8/9 (89%) 8/9 (89%)

4 5/5 (100%) 5/5 (100%) 2/5 (40%)

1 6/7 (86%) 7/7 (100%) 5/7(71%)

РЛ 2 5/7 (71%) 6/7 (86%) 3/7 (43%)

3 5/6 (83%) 5/6 (83%) 2/6 (33%)

Заметим, что мРНК С025Ехо4Бе1 и СВ25Ехо4-5Бе1 кодируют функционально не активные варианты альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2. Если предположить, что частота выявления таких белков является характеристикой баланса функционально активных и неактивных форм рецептора 1Ь-2 в опухолевых клетках больных РЛ, то снижение частоты их присутствия в опухолевых очагах может быть отражением

смещения этого баланса в сторону образования функциональных рецепторов и, следовательно, усиления пролиферативной активности раковых клеток по ходу прогрессирования заболевания. Образование метастазов при РЛ также характеризовалось выраженной тенденцией к снижению частоты выявления мРНК СВ25Ехо4-5Бе1, а также С025Ехо4Ве1 (рис. 3).

Несть метастазы И нет глетаста^ов

Рис. 3. Частота выявления альтернативных форм мРНК 1Ь-2Ки в клетках опухолевых очагов больных РЛ с метастазами и без метастазов

СР25 С025Ехо4Ре1 СР25Ехо4-50е1

Известно, что в клетках нормальных тканей толстого кишечника, легкого и тела матки отсутствует экспрессия гена 1Ь-2ЯА. Появление мРНК 1Ь-2Яа в опухолевых очагах может быть следствием активации гена 1Ь-2ЯА в злокачественно трансформированных клетках или присутствия в очагах активированных лимфоцитов. При раке толстого кишечника нами проведена оценка частоты встречаемости трех альтернативных форм мРНК 1Ь-2Ка в периферической крови больных. У всех тестированных больных, как и у здоровых лиц, обнаруживались три альтернативные формы мРНК 1Ь-2Яа. Неполный спектр форм мРНК в опухолевых очагах большинства больных указывает на то, что их источником являются или опухолевые клетки или инфильтрирующие опухоль лимфоциты с неполным набором мРНК 1Ь-2Ки, например СВ4+СБ25Ыё11 Т -регуляторы. Однако информация о спектре альтернативных форм мРНК 1Ь-2Яа в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах в литературе отсутствует.

Установлено, что при РТК мРНК CD25Exo4Del встречается чаще совместно с мРНК раково-тестикулярного белка SSX1,2,4 (р=0,013). Кроме этого, транскриптом клеток опухолевых очагов, характеризующийся присутствием ряда альтернативных вариантов мРНК белка Fas, опосредующего апоптоз (mFas, Fas del 5, Fas del 3,4, sFas, Fas del 4,6, Fas del 3,4,6), мРНК активационного белка CD38, а также мРНК восьми раково-тестикулярных белков семейства GAGE (GAGE1-8), мРНК PAGE1, мРНК трех белков семейства S SX (SSX1,2,4), мРНК NY-ESO-1 и мРНК шести раково-тестикулярных генов семейства MAGEA (MAGEA1-6), статистически значимо чаще содержал мРНК полноразмерной формы CD25, нежели мРНК CD25Exo4-5Del (р<0,05). Матричная РНК полноразмерной формы CD25 достоверно чаще в сравнении с мРНК CD25Exo4-5DeI обнаруживалась при отсутствии в опухолевых очагах мРНК Fas del 4, Fas del 4,6, Fas del 5, Fas del 3,4,6, CD38Exo3Del, sICAM-1, GAGE1-8, CT7, XAGE1, SSX1,2,4, NY-ESO-1 (p<0,05). Форма мРНК CD25Exo4-5Del в сравнении с мРНК CD25Exo4DeI выявлялась реже в Fas del 5 и Fas del 3,4-позитивных и CD38Exo3Del-негативных опухолевых очагах (р<0,05).

При PJI мРНК CD25Exo4-5Del обнаруживалась чаще совместно с мРНК раково-тестикулярных белков XAGE1 и мРНК SSX1,2,4 (р=0,008 и р=0,049, соответственно). При РТМ выявлена обратная тенденция к снижению частоты выявления матричной РНК с делетированными экзонами в образцах, содержащих мРНК XAGE1 и SSX1,2,4 (табл. 2). Таким образом, при всех трех онкологических заболеваниях вариации в частоте детекции делетированных форм мРНК IL-2Ra сопровождаются изменениями в частоте выявления мРНК раково-тестикулярных белков XAGE1 и SSX1,2,4, характерных для опухолевых клеток.

Таблица 2

Частота обнаружения альтернативных форм мРНК IL-2R.cz в опухолевых очагах, содержащих и не содержащих мРНК раково-тестикулярных белков

Забо лева ние мРНК

IL-2Ra SSX1,2,4+ SSX1,2,4 " XAGE1+ XAGEl"

РТК CD25 29/29(100%) 18/19(95%) 16/16(100%) 31/32(97%)

CD25Exo4Del 29/29(100%) * 15/19(79%) 16/16(100%) 28/32 (88%)

CD25Exo4-5Del 24/29 (83%) 13/19(68%) 13/16(81%) 24/32 (75%)

РЛ CD25 21/24(88%) 6/8 (75%) 15/16(94%) 15/16(94%)

CD25Exo4Del 19/24 (79%) 6/8 (75%) 13/16(81%) 12/16(75%)

CD25Exo4-5Del 13/24 (54%) T 1/8 (13%) 11/16(69%) #* 3/16(19%)

РТМ CD25 10/11 (91%) 13/20(65%) 5/7 (71%) 16/22(72%)

CD25Exo4Del 4/11 (36%) 12/20(60%) 4/7 (57%) 11/22 (50%)

CD25Exo4-5Del 2/11 (18%) 9/20 (45%) 2/7 (29%) 9/22 (41%)

Статистически значимые различия по сравнению с частотой детекции:

* - мРНК CD25Exo4Del при SSX1,2,4" (р=0,013) ▼ - мРНК CD25Exo4-5Del при SSX1,2,4~ (р=0,049) ** - мРНК CD25Exo4-5Del при XAGE1" (р=0,008)

Обнаружено, что в образцах опухолевых очагов больных РТК, содержащих мРНК CD25Exo4-5Del, мРНК белка ICAM-1 детектируется в 2,1 раза чаще, чем в СБ25Ехо4-5Ве1-негативных образцах (р<0,001). Показано, что при раке толстого кишечника повышенный уровень экспрессии ICAM-1 клетками опухолей ассоциирован с высоко дифференцированными новообразованиями, а также с высокой восприимчивостью к лизису цитотоксическими Т-лимфоцитами (Wang Q. et al., 2009; Hamai A. et al., 2008). То есть, наличие мРНК CD25Exo4-5Del в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника можно рассматривать как показатель благоприятного течения заболевания.

Наряду с определением частоты выявления экспрессии генов, принимающих участие в реализации иммунного ответа, было проведено

сравнение особенностей экспрессии гена IL-2RA в опухолевых очагах с показателями состояния иммунитета больных. При раке толстого кишечника было осуществлено сопоставление частоты обнаружения альтернативных вариантов мРНК IL-2Ra с сывороточной концентрацией продуктов пострансляционной модификации продуктов гена IL-2RA - растворимыми дифференцировочными молекулами CD25. Однако никаких статистически значимых изменений выявлено не было. При раке тела матки проведено более детальное исследование связи вариаций в экспрессии гена IL-2RA в опухолевых очагах с иммунным ответом. Наряду с сывороточным содержанием суммарной и олигомерной фракций растворимых дифференцировочных молекул CD25 оценивали популяционный состав периферической крови больных, в том числе содержание CD25, CD8, CD4, СБ95-положительных клеток. Однако и в этом случае никаких статистически значимых изменений выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии прямой связи между характером экспрессии гена IL-2RA в опухолевых очагах и тестированными показателями иммунитета.

Альфа-субъединица рецептора интерлейкина-2 является одним из белков, входящих в состав высокоаффиного рецептора IL-2, полноценно работающего в активно пролиферирующих клетках. Более полная картина о функциональных возможностях IL-2Ra может быть получена при совместном изучении экспрессии гена IL-2RA и трех других генов, входящих в систему «IL-2 - IL-2R». В рамках настоящего исследования были разработаны методы детекции матричной РНК IL-2, IL-2RJ3, IL-2Ry и с помощью данных методов был проведен анализ встречаемости данных мРНК в опухолевых очагах больных раком тела матки (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма фрагментов ДНК

А - кДНК IL-2; Б - кДНК IL-RP; В - кДНК IL-Ry; Г - маркер размерности ДНК, выраженный в парах нуклеотидных оснований

Установлено, что частота обнаружения матричной РНК компонентов системы «1Ь-2 - в опухолевых очагах больных РТМ варьирует (рис.

5). Во всех тестированных образцах была обнаружена мРНК бета-

субъединицы 1Ь-2Я. Присутствие мРНК альфа- и гамма-субъединиц зафиксировано в меньшем количестве образцов, а мРНК ГЬ-2 - лишь в 57% (13/23) образцов. При этом присутствие мРНК 1Ь-2 во всех случаях кроме одного сопровождалось наличием мРНК трех субъединиц его рецептора. В остальных 10 образцах, характеризующихся отсутствием мРНК 1Ь-2, наблюдались различные сочетания мРНК компонентов системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я».

11-2 11-2Яа |1_-2[ф И-2Г?у

Рис. 5. Частота обнаружения мРНК 1Ь-2,1Ь-2Ка, 1Ь-2Яр. 1Ь-2Яу в

опухолевых очагах больных РТМ Статистически значимые различия по сравнению с частотой детекции: * - мРНК 1Ь-2 (р<0,05) ** - мРНК 1Ь-2Я(3 (р=0,008)

Отсутствие мРНК одной или нескольких субъединиц рецептора 1Ь-2 в 12 тестированных опухолевых очагах свидетельствует о том, что использованные нами методы детектируют в этих случаях мРНК системы «1Ь-2 - 1Ь-21Ъ>, продуцируемые не лимфоцитами, а опухолевыми клетками.

Выявленные особенности экспрессии генов системы «1Ь-2 - 1Ь-21Ъ> в опухолевых очагах больных РТМ были сопоставлены с сывороточным содержанием суммарной и олигомерной фракций растворимых дифференцировочных молекул СБ25 (вСБ25) и 1САМ-1 (зСБ54) (табл. 3). У больных, в опухолевых очагах которых было зафиксировано отсутствие хотя бы одной из мРНК 1Ь-2, 1Ь-2Яа, 1Ь-2Бф или сывороточный уровень

суммарной фракции растворимых дифференцировочных молекул СЭ25 был

повышен в сравнении с больными с полной экспрессией в опухолевых очагах всех генов системы «1Ь-2 - 1Ь-21Ъ> (р=0,009). Подъем сывороточного содержания растворимых дифференцировочных молекул СБ25 у больных, в опухолевых очагах которых гены системы «1Ь-2 - 1Ь-21Ъ> экспрессируются не в полном составе, служит отражением иммунного ответа, направленного на элиминацию опухолевых клеток.

Таблица 3

Сывороточный уровень растворимых дифференцировочных молекул CD25 и CD54 у больных РТМ, U/ml

Дифференцировочная молекула Норма Особенности транскриптома клеток опухолевых очагов

Присутствуют мРНК IL-2, IL-2Ra, IL-2Rß и IL-2Ry Нет хотя бы одной из мРНК IL-2, IL-2R«, IL-2Rß, IL-2Ry

5СБ25, суммарная фракция 400(361;446) 339(311;379) 665 (372; 882) *

бСВ25, олигомерная фракция 358 (267; 434) 416(219; 534) 463 (183; 616)

бСВ54, суммарная фракция 78 (54; 165) 26 (18; 39)** 80 (68; 155)*

бСБ54 олигомерная фракция 138 (92; 178) 136 (55; 158) 146(116; 193)

* - статистически значимые различия по сравнению с группой, где

присутствуют мРНК 1Ь-2,1Ь-2Яа, 1Ь-2Яр и 1Ь-2Яу (р<0,05)

** - статистически значимые различия по сравнению с нормой (р<0,001)

Больные РТМ, опухолевые очаги которых характеризовались присутствием мРНК всех белков системы «1Ь-2 - 1Ь-211», имели пониженный сывороточный уровень растворимых молекул 1САМ-1 (р<0,001). При отсутствии мРНК хотя бы одного из компонентов системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я» сывороточное содержание растворимых дифференцировочных молекул 1САМ-1 (СБ54) оставалось в пределах нормы. То есть, координированная экспрессия всех генов системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я» способна угнетать иммунный ответ, что выражается в снижении сывороточного содержания б1САМ-1.

Вероятно, это связано с присутствием на злокачественно трансформированных клетках полноценного рецептора 1Ь-2, синтезом эндогенного 1Ь-2 и ростом опухоли, приводящим к иммуносупрессии.

Для оценки конститутивной экспрессии генов системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я» непосредственно в опухолевых клетках был проведен анализ встречаемости мРНК 1Ь-2, 1Ь-2Яа, 1Ь-21ф, 1Ь-2Яу в клеточных линиях, полученных от больных лимфомами, а также раком толстого кишечника и легкого (табл. 4).

Таблица 4

Матричная РНК 1Ь-2,1Ь-2Яа, 1Ь-2Гф, 1Ь-2Яу в перевиваемых клеточных линиях, полученных от больных онкологическими заболеваниями

Название Источник мРНК мРНК мРНК мРНК

клеточной IL-2 IL-2Ra IL-2RP IL-2Ry

линии

НиТ78 Т-клеточная лимфома - + + + + +

Н9 + + + + + +

Kit225 Кб - + + - + +

Ramos лимфома Беркитта - + + + - +

А549 рак легкого - - + -

NCI-H23 - - + -

COLO 205 рак толстого кишечника - - + +

НСТ116 + - + -

НСТ15 - - + +

SW-620 - - - +

Т84 - - - +

СаСо2 - - - +

+ : показано присутствие мРНК

- : мРНК не обнаружена

Наличие мРНК 1Ь-2 зарегистрировано в клетках линий Н9 (Т-клеточная лимфома) и НСТ116 (рак толстого кишечника). Полученные результаты подтверждают способность к продукции одного из ведущих цитокинов иммунной системы - интерлейкина-2 - опухолевыми клетками, имеющими происхождение как от Т-клеток, так и от эпителия толстого кишечника. В клетках остальных 10-ти тестированных линий не обнаружена мРНК 1Ь-2.

Отсутствие экспрессии гена IL-2 в данных типах клеток является свидетельством независимости их пролиферации от эндогенного IL-2.

Присутствие альтернативных форм мРНК IL-2Ra было выявлено в клетках всех тестированных линий, происходящих от Т-клеточных лимфом (НиТ78, Н9, Kit225 Кб) и лимфомы Беркитта (Ramos). При этом в клетках линии Kit225 Кб, источником которой явились Т-лимфоциты больного Т-клеточной лимфомой, были обнаружены лишь два сплайсированных варианта мРНК IL-2Ra - полноразмерный и с делетированным 4-м экзоном. В образцах клеток остальных трех линий лимфом показано одновременное присутствие всех трех изучаемых альтернативных форм мРНК.

В клетках всех исследованных линий, полученных от больных раком легкого и раком толстого кишечника, не зафиксировано конститутивной экспрессии гена альфа-субъединицы IL-2R. Можно предположить, что синтез мРНК IL-2Ra в данных изолированных культурах опухолевых клеток не происходит из-за отсутствия активатора, подобного активаторам синтеза IL-2Ra в клетках гемопоэтической системы (TGF-ß, CD28, интерлейкин-1 и др.) (Rothenberg Е„ Diamond R., 1994; Kim Н. et al., 2005). Возможно также, что индукция экспрессии гена IL-2RA в тестированных типах клеток происходит только после воздействия экзогенного IL-2.

мРНК бета-субъединицы рецептора интерлейкина-2 обнаружена в клетках всех линий больных Т-клеточными лимфомами и раком легкого. Среди клеточных линий, полученных от больных раком толстого кишечника, присутствие мРНК IL-2Rß было зафиксировано в клетках COLO 205, НСТ116 и НСТ15. В остальных случаях (линии SW-620, Т84, СаСо2) экспрессии гена IL-2RB не обнаружено. Также отсутствие мРНК IL-2Rß показано в клетках линии Ramos (лимфома Беркитта).

Экспрессия гена гамма-субъединицы рецептора интерлейкина-2 зафиксирована в клетках всех тестированных линий, полученных от больных лимфомами. В образцах клеток двух линий, полученных от больных раком легкого, мРНК IL-2Ry не обнаружена. Экспрессия гена IL-2RG зафиксирована во всех исследованных клеточных линиях больных раком толстого кишечника, кроме линии НСТ116.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что экспрессия генов бета- и гамма-субъединиц IL-2R в клетках линий, полученных от больных раком толстого кишечника и раком легкого, варьировала (табл. 4). При этом одновременное присутствие мРНК IL-2Rß и IL-2Ry в клетках двух линий указывает на возможность формирования на поверхности клеток рецептора

средней аффинности. Вероятным объяснением наличия мРНК лишь одной субъединицы из трех в клетках шести линий является их принадлежность к рецепторам других цитокинов. Так, рецепторы интерлейкина-2 и интерлейкина-15 содержат бета-субъединицы одинакового строения, а гамма-субъединица входит в состав рецепторов IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21 (Waldmann Т., O'Shea J., 1998; Asao Н. et al., 2001).

Таким образом, в линиях неопластических клеток, полученных из опухолевых очагов больных раком толстого кишечника и раком легкого, показано молчание гена IL-2RA. В предыдущих разделах работы была обнаружена экспрессия гена IL-2RA в образцах опухолевых очагов больных РТК и PJI. Наличие мРНК IL-2Ra в клетках опухолевых очагов больных данными заболеваниями может иметь следующие причины. Во-первых, источником мРНК IL-2Ra могут являться лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, в частности Т-регуляторы. Их характерной чертой является высокий уровень экспрессии гена альфа-субъединицы IL-2R. Во-вторых, экспрессия гена IL-2RA может происходить в опухолевых клетках, находящихся в условиях in vivo, но теряться при переводе в культуру. Для поддержания гена во включенном состоянии нередко необходимы особые условия микроокружения раковых клеток, отсутствующие в клеточной культуре, но присутствующие в организме. Хорошо известен феномен изменения профиля экспрессии генов при переводе клеток в культуру (Bellot G. et al., 2012). При этом происходит включение одних и выключение других генов. В-третьих, присутствие мРНК IL-2Ra может являться индивидуальной особенностью каждой конкретной опухоли. В пользу этого говорит выявленное нами отсутствие мРНК IL-2Ra в ряде опухолевых очагов больных раком легкого и раком тела матки. Наконец, источником исследуемой мРНК могут быть опухоль-инфильтрирующие лимфоциты и раковые клетки одновременно.

выводы

1. С использованием разработанного метода одновременной детекции трех альтернативных форм мРНК альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 показано, что мРНК CD25, CD25Exo4Del, CD25Exo4-5Del в различных сочетаниях присутствуют в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника, раком легкого, раком тела матки, в периферической крови здоровых волонтеров и онкологических больных.

2. Обнаружено, что сплайсированные варианты мРНК CD25, CD25Exo4Del, CD25Exo4-5Del детектируются в опухолевых очагах чаще при раке толстого кишечника, чем при раке тела матки, при этом в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника, раком легкого, раком тела матки мРНК CD25Exo4-5Del встречается реже, чем мРНК CD25.

3. Установлено, что в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника форма мРНК CD25Exo4Del детектируется чаще совместно с мРНК раково-тестикулярного белка SSX1,2,4, а форма CD25Exo4-5Del чаще совместно с мРНК белка ICAM-1. При раке легкого мРНК CD25Exo4-5Del обнаруживается в опухолевых очагах чаще совместно с мРНК раково-тестикулярных белков SSX1,2,4 и XAGE1.

4. Выявлено, что в опухолевых очагах больных раком тела матки, а также в клетках линий, полученных от больных лимфомами, раком толстого кишечника и раком легкого, присутствуют мРНК всех четырех генов системы «интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2» в различных комбинациях.

5. Показано, что одновременная экспрессия генов IL-2, IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG в опухолевых очагах больных раком тела матки сопровождалась сниженным сывороточным содержанием растворимых дифференцировочных молекул ICAM-1. В отсутствии экспрессии хотя бы одного из данных генов повышалась сывороточная концентрация растворимых дифференцировочных молекул CD25.

Благодарности

Автор выражает благодарность за помощь в выполнении работы проф. Алясовой A.B., к.м.н. Конторщиковой Е.Ю., к.б.н. Новикову Д.В., к.б.н. Шаховой К.А., Пресняковой Н.Б., Сахарнову H.A., Перенкову А.Д., Калугину A.B.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Разработка и апробация метода детекции мРНК альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 в клетках опухолевых очагов человека / Новикова C.B., Алясова A.B., Новиков Д.В. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2010. - Т. 2, № 2. -С. 563-565.

2. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Анализ экспрессии гена а-цепи рецептора ИЛ-2 в клетках опухолевых очагов больных КРР / Новикова C.B., Сахарнов H.A., Новиков Д.В., Алясова A.B. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 2. - С. 56.

3. Сахарнов H.A. Анализ встречаемости транскриптов гена АРТ-1 в опухолевых клетках больных РТК / Сахарнов H.A., Новиков Д.В., Алясова A.B., Новикова C.B. (Шумилова C.B.), Уткин О.В., Новиков В.В. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 2. — С. 58.

4. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Анализ экспрессии гена альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 в клетках опухолевых очагов больных раком легкого / Новикова C.B., Новиков Д.В., Белова Т.В., Плеханова Е.С., Пегов Р.Г., Алясова A.B. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 18.

5. Новиков Д.В. Анализ экспрессии гена CD38 в опухолевых очагах онкогинекологических больных / Новиков Д.В., Перенков А.Д., Конторщикова Е.Ю., Новикова C.B. (Шумилова C.B.), Коровушкина К.А., Барышников А.Ю., Новиков В.В. // Российский биотерапевтический журнал. -2010.-Т. 9, № 3. - С. 17.

6. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Анализ встречаемости альтернативных форм мРНК гена IL-2A в клетках опухолевых очагов больных колоректальным раком / Новикова C.B., Алясова A.B., Новиков Д.В. // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, № 1. - С. 42.

7. Шумилова C.B. Анализ экспрессии генов системы IL-2 - IL-2R в клеточных линиях аденокарциномы легких А549 и NCI-H23 / Шумилова C.B., Новиков Д.В., Барышников А.Ю., Новиков В.В. // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 64.

II. Тезисы докладов региональных н международных конференций:

1. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Метод одновременной детекции двух форм мРНК альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 в клетках опухолевых очагов / Новикова C.B. // Сборник тезисов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Н. Новгород. - 2010. - С. 107.

2. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Продукты транскрипции гена альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 в клетках опухолевых очагов больных колоректальным раком / Новикова C.B. // XV Нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, 19-23 апреля 2010 г. Труды молодых ученых по естественнонаучным дисциплинам. - 2010. - С.19.

3. Новикова C.B. (Шумилова C.B.) Метод детекции двух форм матричной РНК гена IL-2RA / Новикова C.B. // Мат-лы научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора, посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», Н. Новгород. - 2011. - С. 5658.

Список сокращений

кДНК - комплементарная ДНК

мРНК - матричная РНК

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция/полимеразная цепная реакция

РЛ - рак легкого

РТК - рак толстого кишечника

РТМ - рак тела матки

IL-2 - интерлейкин-2

IL-2R - рецептор интерлейкина-2

IL-2RA - ген альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2

IL-2Ra - альфа-субъединица рецептора интерлейкина-2

IL-2RB - ген бета-субъединицы рецептора интерлейкина-2

IL-2RP - бета-субъединица рецептора интерлейкина-2

IL-2RG - ген гамма-субъединицы рецептора интерлейкина-2

IL-2Ry - гамма-субъединица рецептора интерлейкина-2

U/ml - количество условных единиц в мл

Подписано в печать 05.10.2012. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1. Заказ №703. Тираж 100.

Отпечатано в ЦЦП РИУ Нижегородского госуниверснтета им. Н.И. Лобачевского 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шумилова, Светлана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Система «интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2».

1.2 Альфа-цепь рецептора интерлейкина-2.

1.3 Роль альтернативного сплайсинга пре-мРНК. в развитии опухоли.

1.4 Альтернативный сплайсинг пре-мРНК IL-2Ra.

1.5 Роль системы «IL-2 - IL-2R» в канцерогенезе.

1.6 Характеристика раково-тестикулярных генов.

1.6.1 Суперсемейство генов MAGE.

1.6.2 Семейство генов LAGE/NY-ESO.

1.6.3 Суперсемейство генов GAGE/PAGE/XAGE.

1.6.4 Семейство генов SSX.

1.6.5 Семейство генов CSAGE.

1.7 Характеристика дифференцировочных молекул. клеток иммунной системы.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.2 Выделение суммарной РНК.

2.3 Реакция обратной транскрипции.

2.4 Полимеразная цепная реакция.

2.5 Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.6 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.7 Реакция непрямой иммунофлуоресценции.

2.8 Иммуноферментный метод определения растворимых дифферецировочных молекул в сыворотке крови.

2.9 Метод ОТ-ПЦР для детекции мРНК дифференцировочных и раково-тестикулярных белков.

2.10 Компьютерный анализ данных.

2.11 Статистический анализ результатов.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Разработка метода одновременной детекции трех альтернативных форм мРНК 1Ь-2Яа на основе ОТ-ПЦР.

3.2 Альтернативные формы мРНК альфа-цепи рецептора интерлейкина-2 человека в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника.

3.3 Альтернативные формы мРНК 1Ь-2Яа в опухолевых очагах больных. раком легкого.

3.4 Матричная РНК компонентов системы «интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2» в опухолевых очагах больных раком тела матки.

3.4.1 Оптимизация метода ОТ-ПЦР для детекции. матричной РНК 1Ь-2,1Ь-2Яр, 1Ь-11у.

3.4.2 Экспрессия генов 1Ь-2,1Ь-2ЯА, 1Ь-2ЯВ, 1Ь-2БЮ. в опухолевых очагах больных РТМ.

3.5 Экспрессия генов системы «интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2» в клеточных линиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Матричная РНК белков системы "интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2" в опухолевых очагах"

Актуальность проблемы

Система «IL-2 - IL-2R» наряду с IL-2 включает три белковые субъединицы его рецептора, кодируемые разными генами (IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG) и синтезируемые на разных мРНК. Решающую роль в запуске системы играет альфа-субъединица рецептора интерлейкина-2 (IL-2Ra). Известно, что высокая экспрессия IL-2Ra в неопластических клетках приводит к повышению их пролиферативной, трансформирующей активности, устойчивости к лекарственным препаратам и коррелирует с плохим прогнозом для пациента [81]. Показано существование ряда альтернативных форм матричной РНК альфа-субъединицы IL-2R (CD25, CD25Exo4Del, CD25Exo4-5Del и др.) [36; 34]. Они кодируют белки, которые могут выполнять различные функции, влияя на связывание IL-2 с рецептором и, как следствие, на развитие опухоли и на механизмы противоопухолевого иммунитета.

W.'-V .V\ 11 / % k> Z^;.,^' при развитии новообразований позволит расширить представления о биохимических основах опухолевого роста.

Целью работы явилось изучение особенностей транскриптома клеток опухолевых очагов, связанных с многообразием мРНК системы «IL-2 - IL-2R», в сопоставлении с картиной опухолевого роста.

Задачи исследования

5. Исследовать наличие мРНК белков системы «IL-2 - IL-2R» в клетках перевиваемых линий.

Научная новизна работы

Впервые продемонстрировано присутствие альтернативных форм мРНК IL-2Ra CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del в опухолевых очагах больных РТК, PJT, РТМ и периферической крови онкологических больных. Чаще всего в опухолевых очагах обнаруживается полноразмерная форма мРНК IL-2Ra, а затем в порядке убывания мРНК CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del. Такая закономерность продемонстрирована для онкологических больных, находящихся на разных стадиях заболевания, с метастазами и без метастазов, с разной локализацией и гистологической формой опухоли.

Впервые исследованы особенности транскриптома клеток опухолевых очагов в сравнении со встречаемостью альтернативных форм мРНК IL-2Ra. При РТК показано, что транскриптом клеток опухолевых очагов, характеризующийся присутствием мРНК mFas, Fas del 5, Fas del 3,4, sFas, Fas del 4,6, Fas del 3,4,6, CD38, GAGE 1-8, PAGE1, SSX1,2,4, NY-ESO-1, MAGEA1-6, статистически значимо чаще содержал мРНК полноразмерной формы CD25, нежели мРНК CD25Exo4-5Del. Кроме того, мРНК полноразмерной формы CD25 достоверно чаще, в сравнении с мРНК CD25Exo4-5Del, обнаруживается при отсутствии в опухолевых очагах мРНК Fas del 4, Fas del 4,6, Fas del 5, Fas del 3,4,6, CD38Exo3Del, sICAM-1, GAGE1-8, CT7, XAGE1, SSX1,2,4, NY-ESO-1. Форма мРНК CD25Exo4-5Del, в сравнении с мРНК CD25Exo4Del, выявляется реже в Fas del 5 и Fas del 3,4-позитивных и CD38Exo3Del-негативных опухолевых очагах.

При PJI впервые показано, что мРНК CD25Exo4-5Del в опухолевых очагах чаще детектируется совместно с мРНК XAGE1 и SSX1,2,4, а метастазирование в 2 раза реже сопровождается присутствием в опухолевых очагах мРНК CD25Exo4-5Del.

В опухолевых очагах больных раком тела матки впервые зафиксирована экспрессия генов IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG. Присутствие мРНК бета-субъединицы IL-2R показано в 100% случаев, мРНК IL-2, альфа- субъединицы IL-2R и гамма-субъединицы IL-2R обнаруживаются с частотой от 57 до 87%.

Впервые показано, что относительное содержание CD4+, CD8+, CD25+ и CD95+ мононуклеарных клеток крови больных РТМ и сывороточное содержание растворимых молекул CD25 не меняется при наличии или отсутствии альтернативных форм мРНК IL-2Ra в опухолевых очагах.

Впервые охарактеризован профиль экспрессии генов системы «IL-2 -IL-2R» в клетках перевиваемых линий HuT78, А549, NCI-H23, COLO 205, НСТ116, НСТ15, SW620. Л ^ •. %>1 t ni м, с 1 i

I ы

I »«

1 í i >1« i í i V > i i' i I* , i t i V . i 'A

Практическая значимость работы

Разработанный в рамках настоящей работы метод одновременного определения трех альтернативных форм мРНК 1Ь-2Яа в опухолевых очагах онкологических больных может быть использован при создании новых подходов к оценке прогноза течения заболевания и эффективности проводимой терапии. В частности, показано, что наличие мРНК СБ25Ехо4-5Эе1 в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника можно рассматривать как показатель благоприятного течения заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие рака толстого кишечника, рака легкого, рака тела матки сопровождается появлением в опухолевых очагах трех альтернативных форм мРНК 1Ь-2Яа в различных комбинациях.

2. В опухолевых очагах чаще всего выявляется полноразмерная форма мРНК СЭ25, затем в порядке убывания мРНК СБ25Ехо40е1 и мРНК С025Ехо4-5Бе1.

3. Сплайсированные варианты мРНК 1Ь-2Яа клеток опухолевых очагов с различной частотой встречаются совместно с другими транскриптами, в частности с мРНК раково-тестикулярных белков и белков, реализующих иммунный ответ.

Апробаиия работы

Результаты работы представлены на: I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2008» (Казань, 2008), III Всероссийском с международным участием конгрессе м

I I и

V ь 1 ' < студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2010» (Н. Новгород, 2010), IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Н. Новгород, 2010), XV Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2010), II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010), научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (Н. Новгород, 2011), X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора» (С. Петербург, 2011), XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Н. Новгород, 2012).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 138 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 15 рисунками и 26 таблицами. Библиографический указатель включает 182 источника литературы (7 отечественных и 175 иностранных).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шумилова, Светлана Викторовна

ВЫВОДЫ

1. С использованием разработанного метода одновременной детекции трех альтернативных форм мРНК альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 показано, что мРНК СЭ25, С025Ехо40е1, С025Ехо4-50е1 в различных сочетаниях присутствуют в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника, раком легкого, раком тела матки, в периферической крови здоровых волонтеров и онкологических больных.

2. Обнаружено, что сплайсированные варианты мРНК СЭ25, СВ25Ехо4Бе1, С025Ехо4-5Бе1 детектируются в опухолевых очагах чаще при раке толстого кишечника, чем при раке тела матки, при этом в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника, раком легкого, раком тела матки мРНК СБ25Ехо4-50е1 встречается реже, чем мРНК СЭ25.

3. Установлено, что в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника форма мРНК СБ25Ехо40е1 детектируется чаще совместно с мРНК раково-тестикулярного белка 58X1,2,4, а форма СБ25Ехо4-5Ве1 чаще совместно с мРНК белка 1САМ-1. При раке легкого мРНК С025Ехо4-50е1 обнаруживается в опухолевых очагах чаще совместно с мРНК раково-тестикулярных белков 88X1,2,4 и ХАОЕ1.

5. Показано, что одновременная экспрессия генов 1Ь-2, 1Ь-211А, 211В, 1Ь-21Ш в опухолевых очагах больных раком тела матки сопровождалась сниженным сывороточным содержанием растворимых дифференцировочных молекул 1САМ-1. В отсутствии экспрессии хотя бы одного из данных генов повышалась сывороточная концентрация растворимых дифференцировочных молекул С025.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Переход нормальной клетки в злокачественно трансформированную сопровождается глубокими биохимическими изменениями. Вследствие появления серии мутаций меняется спектр продуктов, синтезируемых раковой клеткой, происходят изменения в свойствах плазматических мембран, в результате чего клетка перестает реагировать на контакты с соседними клетками и начинает активно пролиферировать. Происходят глубокие преобразования цитоскелета. По сравнению с нормальной клеткой сильно меняется спектр генов, которые работают в раковой клетке, меняется ее транскриптом. Исчезают одни и появляются другие транскрипты [3].

Изменение профиля экспрессии генов приводит к включению ранее не характерных для данного типа клеток генов, что регистрируется по наличию соответствующей матричной РНК. К таким генам относятся гены, экспрессия которых характерна в норме для клеток иммунной системы, в частности ген альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 [4].

Ранее было показано, что ген IL-2RA способен давать несколько транскриптов, образующиеся путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Один из вопросов, который решался в рамках настоящего исследования, заключался в анализе частоты обнаружения указанных транскриптов в опухолевых очагах больных такими широко распространенными социально значимыми заболеваниями как рак толстого кишечника, рак легкого и рак тела матки.

На первом этапе работы был проведен анализ литературных данных с целью выявления областей белка альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-2 человека, ответственных за его связывание с лигандом. Было установлено, что регион IL-2Ra, зашифрованный в 4-м экзоне, играет ключевую роль в данном процессе, а анализ матричной РНК, кодирующей изоформы с делецией 4-го экзона, представляет наибольший интерес при изучении влияния альтернативного сплайсинга пре-мРНК IL-2RA на биологическую роль белковой молекулы.

В связи с этим была проведена разработка ОТ-ПЦР метода детекции альтернативных форм мРНК IL-2Ra с делецией 4-го экзона. В частности, был осуществлен анализ первичной структуры мРНК IL-2Ra, дизайн олигонуклеотидных праймеров и подбор условий постановки реакции. Метод апробирован на образцах клеток периферической крови здоровых добровольцев и позволяет детектировать три альтернативные формы матричной РНК IL-2Ra: полноразмерную форму (CD25), форму с делетированным 4-м экзоном (CD25Exo4Del) и форму с делецией экзонов 4 и 5 (CD25Exo4-5Del).

С использованием разработанного метода был проведен анализ частоты обнаружения трех сплайсированных вариантов мРНК IL-2Ra в образцах опухолевых очагов больных раком толстого кишечника, раком легкого, раком тела матки. Набор альтернативных форм мРНК IL-2Ra в опухолевых очагах варьировал как у больных внутри данных групп, так и между группами. Экспрессия гена IL-2RA была зафиксирована в 100% тестированных опухолевых очагов больных РТК, в 94% - больных РЛ, в 83%> - больных РТМ. В данных образцах опухолевых очагов обнаружено присутствие от одного до трех вариантов сплайсинга мРНК IL-2Ra в различных комбинациях. При всех трех онкологических заболеваниях форма мРНК CD25 встречалась чаще, чем CD25Exo4-5Del, а также наблюдалась тенденция к снижению частоты обнаружения матричной РНК в ряду «CD25 - CD25Exo4Del - CD25Exo4-5Del». Три альтернативные формы мРНК IL-2Ra выявлялись чаще при раке толстого кишечника, чем при раке тела матки. В опухолевых очагах больных РЛ полноразмерная форма мРНК CD25 детектировалась реже, чем при РТК, но частота ее обнаружения не отличалась от таковой при РТМ. Обратная картина наблюдалась при сравнении частоты детекции мРНК, кодирующей формы IL-2Ra, не способные связывать лиганд. Частота обнаружения мРНК CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del была выше в опухолевых очагах больных РЛ, чем при РТМ, но не отличалась от частоты их детекции при РТК.

Локализация первичного опухолевого узла и гистологический тип опухоли не были связаны с частотой выявления альтернативных форм мРНК

СБ25 и СВ25Ехо4Бе1. Однако, в зависимости от особенностей течения заболевания, наблюдались различия в частоте обнаружения мРНК С025Ехо4-50е1. При РТК она чаще встречалась в опухолевых очагах, локализованных в прямой кишке, чем в ректо-сигмовидном отделе и сигмовидной кишке. Кроме того, в опухолевых очагах мужчин, но не женщин, выявлена статистически значимо меньшая частота обнаружения мРНК С025Ехо4-50е1 по сравнению с частотой детекции мРНК СБ25.

Известно, что в клетках нормальных тканей толстого кишечника, легкого и тела матки отсутствует экспрессия гена 1Ь-2ЯА. Обнаружение матричной РНК 1Ь-2Яа в опухолевых тканях данных органов может иметь два объяснения.

Во-первых, источником мРНК 1Ь-2Яа могут являться раковые клетки, что говорит об активации гена 1Ь-211А в эпителиальных клетках органов при опухолевых процессах. Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что альтернативный сплайсинг пре-мРНК, как механизм регуляции работы гена, приводит к образованию в данных типах клеток различных комбинаций мРНК 1Ь-2Яа, кодирующих как функциональную субъединицу рецептора, так и протеины, не способные выполнять функции рецептора. Альтернативные полипептиды, кодируемые мРНК СБ25Ехо4Бе1 и С025Ехо4-5Ве1, могут принимать участие в формировании неактивного рецептора на поверхности клетки.

Известно, что высокая экспрессия гена 1Ь-211А в неопластических клетках приводит к повышению их пролиферативной, трансформирующей активности, устойчивости к лекарственным препаратам и коррелирует с плохим прогнозом для пациента [81]. Продукция раковой клеткой нефункциональных 1Ь-2Яа, кодируемых альтернативными мРНК, может вызывать конкуренцию с полноценным белком за связывание лиганда и оказывать противоположный эффект.

Другим источником матричной РНК 1Ь-2Яа в образцах опухолевых очагов могут быть лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, в том числе СБ4+СВ25Ы®Ь Тгевв.

1 ¡Л"',"1 < * . V >, " '"Л'лУЧ'А! ' г > и' ч 1!К V'" Ч'Л в

В ходе настоящего исследования показано, что все три альтернативные формы мРНК 1Ь-2Яа в периферической крови онкологических больных, а также здоровых лиц определяются в 100% случаев и таким образом находятся в некотором балансе друг с другом. Для клеток опухолевых очагов больных РТК, РЛ и РТМ показано смещение этого равновесия в сторону уменьшения образования мРНК СБ25Ехо4Ве1 и СЭ25Ехо4-5Бе1. Если источник мРНК 1Ь-211а в опухолевых очагах - лимфоциты, то такой дисбаланс матричной РНК, синтезируемой в ТГЬб, может быть причиной усиления активационных сигналов в данных клетках. Повышение уровня активации и пролиферации Т1Ьв в свою очередь может быть ассоциировано как с механизмами противоопухолевого иммунитета, так и с механизмами ухода опухоли из-под надзора иммунной системы.

С другой стороны, подобный сдвиг равновесия между мРНК 1Ь-2Яа в клетках опухолевых очагов может свидетельствовать о том, что основной вклад в пул молекул, обнаруживаемых с помощью разработанного нами метода, вносят мРНК, синтезируемые в опухолевых клетках, а не в клетках крови.

Три сплайсированных варианта мРНК 1Ь-2Яа встречались в опухолевых очагах больных 1-4 стадий РТК и 1-3 стадий РЛ. При РЛ показана тенденция к снижению частоты детекции обеих альтернативных форм мРНК С025Ехо4Бе1 и С025Ехо4-5Бе1 в опухолевых очагах больных от 1 к 3-й стадии заболевания при относительно неизменном уровне обнаружения полноразмерной формы мРНК. Если предположить, что частота выявления таких молекул является характеристикой баланса функционально активных и неактивных форм рецептора 1Ь-2 в опухолевых клетках больных РЛ, то данная картина может быть следствием смещения этого баланса в сторону образования функциональных рецепторов и, следовательно, усиления пролиферативной активности раковых клеток по ходу прогрессирования заболевания.

Исследуемые формы матричной РНК 1Ь-2Яа были обнаружены в опухолевых очагах больных РТК и РЛ как с метастазами, так и без метастазов. При этом показана тенденция к увеличению частоты выявления совместно

1 ил п V «и,| I,и< '

1 14 К . И ^ 1 ' I к <> г I I I * к к 1 и ГI V « I I 1 Л »л!1 * и< * »1 ь У

I <

I « мРНК CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del в опухолевых очагах больных PJT без метастазов по сравнению с пациентами с метастазами. Если сделать допущение, что обнаружение сплайсированных вариантов мРНК IL-2Ra, кодирующих нефункциональные формы белка, связано с пониженным риском возникновения метастазов при PJI, то это может быть обусловлено следующей причиной. Продукция опухолевыми клетками нефункциональных форм IL-2Ra может препятствовать связыванию IL-2 со своим рецептором на поверхности раковой клетки, что ведет к снижению ее пролиферативной активности в случае воздействия эндогенного цитокина.

В образцах опухолевых очагов было проведено сопоставление частоты обнаружения мРНК IL-2Ra с особенностями транскриптома раковых клеток. В частности, осуществлено сравнение частоты детекции мРНК IL-2Ra с частотой обнаружения мРНК 22 раково-тестикулярных белков, а также 11 альтернативных вариантов мРНК трех дифференцировочных белков. Установлено, что при РТК мРНК CD25Exo4Del встречается чаще совместно с мРНК раково-тестикулярного белка SSX1,2,4. При PJ1 мРНК CD25Exo4-5Del обнаруживается чаще совместно с мРНК раково-тестикулярных белков XAGE1 и SSX1,2,4. При РТМ выявлена обратная тенденция к увеличению частоты обнаружения мРНК белков XAGE1 и SSX1,2,4 в тех образцах, где отсутствует хотя бы одна из форм мРНК IL-2Ra с делетированными экзонами. Таким образом, обнаружено, что при всех трех онкологических заболеваниях вариации в частоте детекции делетированных форм мРНК IL-2Ra сопровождаются изменениями в частоте выявления мРНК раково-тестикулярных белков XAGE1 и SSX1,2,4. Известно, что XAGElb является одним из доминирующих антигенов, стимулирующих функции цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль [75]. Вероятно, совместное обнаружение в опухолевых очагах матричной РНК IL-2Ra с делетированными экзонами и XAGE1 является отражением механизмов активации инфильтрирующих опухоль Т-лимфоцитов. \ s 0

Установлено, что в образцах опухолевых очагов больных РТК, содержащих мРНК С025Ехо4-5Бе1, мРНК белка 1САМ-1 детектируется в 2,1 раза чаще, чем в СБ25Ехо4-5Ве1-негативных образцах. Показано, что при раке толстого кишечника повышенный уровень экспрессии гена 1САМ-1 клетками опухолей ассоциирован с высокодифференцированными новообразованиями, а также с высокой восприимчивостью к лизису цитотоксическими Т-лимфоцитами [173; 60]. То есть, наличие мРНК С025Ехо4-5Бе1 в опухолевых очагах больных раком толстого кишечника можно рассматривать как показатель благоприятного течения заболевания.

Наряду с определением частоты выявления экспрессии генов, принимающих участие в реализации иммунного ответа, было проведено сравнение особенностей экспрессии гена 1Ь-2ЯА в опухолевых очагах с показателями состояния иммунитета больных. При раке толстого кишечника было осуществлено сопоставление частоты обнаружения альтернативных вариантов мРНК 1Ь-2Яа с сывороточной концентрацией продуктов пострансляционной модификации 1Ь-2Яа - растворимыми дифференцировочными молекулами СВ25. Однако никаких статистически значимых изменений выявлено не было. При раке тела матки проведено более детальное исследование связи вариаций в экспрессии гена 1Ь-2КА в опухолевых очагах с иммунным ответом. Наряду с сывороточным содержанием суммарной и олигомерной фракций растворимых молекул СБ25 оценивали популяционный состав периферической крови больных, в том числе содержание СБ25-положительных клеток. Однако и в этом случае никаких статистически значимых изменений выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии прямой связи между характером экспрессии гена 1Ь-2ЯА в опухолевых очагах и тестированными показателями иммунитета.

Альфа-субъединица рецептора интерлейкина-2 является одним из белков, входящих в состав высокоаффиного рецептора 1Ь-2, полноценно работающего в активно пролиферирующих клетках. Более полная картина о функциональных возможностях 1Ь-2Яа может быть получена при совместном изучении » Гч ^.и"', ! > .V <1 1 • Ч V И и' « К1и Я,-1 * • 'V1 » Л' ,« { экспрессии гена 1Ь-2ЯА и трех других генов, входящих в систему «1Ь-2 - 1Ь-2Я». В рамках настоящего исследования были оптимизированы методы детекции матричной РНК 1Ь-2, 1Ь-2Яр, 1Ь-2Яу, и с помощью данных методов был проведен анализ встречаемости данной мРНК в опухолевых очагах больных раком тела матки.

Установлено, что частота обнаружения матричной РНК белков системы «1Ь-2 - 1Ь-211» в опухолевых очагах больных РТМ варьирует. Во всех тестированных образцах была обнаружена мРНК бета-цепи 1Ь-2К. Присутствие мРНК альфа- и гамма-цепей зафиксировано в меньшем количестве образцов, а мРНК 1Ь-2 - лишь в 57% случаев. При этом экспрессия гена 1Ь-2 почти всегда сопровождалась экспрессией генов трех цепей его рецептора. В остальных же образцах наблюдались различные сочетания мРНК компонентов изучаемой системы.

Источником мРНК 1Ь-2, 1Ь-2Яр, 1Ь-2Яу в опухолевых очагах больных РТМ могут быть как раковые клетки, так и клетки иммунной системы, инфильтрирующие опухоль. При этом обнаруженное в ряде случаев отсутствие мРНК одной или нескольких цепей рецептора 1Ь-2 в тестированных опухолевых очагах свидетельствует в пользу того, что использованные нами методы детектируют мРНК, синтезированную не Т-лимфоцитами, а раковыми клетками.

Выявленные особенности экспрессии генов системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я» в опухолевых очагах больных РТМ были сопоставлены с сывороточным содержанием суммарной и олигомерной фракций растворимых дифференцировочных молекул С025 и 1САМ-1 (СБ54). У больных, в опухолевых очагах которых было зафиксировано отсутствие хотя бы одной из мРНК 1Ь-2, 1Ь-2Яа, 1Ь-2Бф и 1Ь-2Иу, сывороточный уровень суммарной фракции растворимых молекул СБ25 был повышен в сравнении с больными с полной экспрессией в опухолевых очагах всех генов системы «11,-2 - 1Ь-2Я». Подъем сывороточного содержания растворимых молекул СБ25 у больных, в опухолевых очагах которых гены системы «1Ь-2 - 1Ь-2Я» экспрессируются не в полном составе, служит отражением напряженного иммунного ответа, направленного на элиминацию опухолевых клеток.

Больные РТМ, опухолевые очаги которых характеризовались присутствием мРНК всех белков системы «IL-2 - IL-2R», имели пониженный сывороточный уровень растворимых дифференцировочных молекул ICAM-1. Координированная экспрессия всех генов системы «IL-2 - IL-2R», обеспечивающая пролиферацию опухолевых клеток, потенциально способна угнетать иммунный ответ. Одним из результатов угнетения иммунного ответа является снижение адгезионных межклеточных процессов, в которых принимают участие молекулы адгезии ICAM-1 (CD54). Падение интенсивности межклеточных взаимодействий обычно имеет следствием пониженную скорость шеддинга молекул CD54 с клеточных мембран и снижение сывороточной концентрации растворимых молекул CD54 [2].

С целью установления особенностей конститутивной экспрессии генов системы «IL-2 - IL-2R» непосредственно в опухолевых клетках был проведен анализ встречаемости мРНК IL-2, IL-2Ra, IL-2Rß, IL-2Ry в клеточных линиях, полученных от больных лимфомами, раком толстого кишечника и раком легкого.

Наличие мРНК IL-2 зарегистрировано в клетках линий Т-клеточной лимфомы и рака толстого кишечника. Полученные результаты подтверждают способность к продукции одного из ведущих цитокинов иммунной системы -интерлейкина-2 - опухолевыми клетками, имеющими происхождение как от Т-клеток, так и от эпителия толстого кишечника. В клетках остальных 10-ти тестированных линий не обнаружена мРНК IL-2. Отсутствие экспрессии гена IL-2 в данных типах клеток является свидетельством независимости их пролиферации от эндогенного IL-2.

Присутствие альтернативных форм мРНК IL-2Ra было выявлено в клетках всех четырех тестированных линий, происходящих от Т-клеточных лимфом и лимфомы Беркитта. При этом в клетках одной линии, источником которой явились Т-лимфоциты больного Т-клеточной лимфомой, были обнаружены лишь два сплайсированных варианта мРНК 1Ь-2Яа -полноразмерный и с делетированным 4-м экзоном. В образцах клеток остальных трех линий лимфом показано одновременное присутствие всех трех изучаемых альтернативных форм мРНК.

В клетках всех исследованных линий, полученных от больных раком легкого и раком толстого кишечника, не зафиксировано конститутивной экспрессии гена альфа-субъединицы 1Ь-211. Можно предположить, что синтез мРНК 1Ь-2Яа в данных изолированных культурах опухолевых клеток не происходит из-за отсутствия активатора, подобного активаторам синтеза 1Ь-211а в клетках гемопоэтической системы (ТОБ-Р, СЭ28, интерлейкин-1 и др.) [135; 76]. Возможно также, что индукция экспрессии гена 1Ь-2ЯА в тестированных типах клеток происходит только после воздействия экзогенного 1Ь-2. мРНК бета-субъединицы рецептора интерлейкина-2 обнаружена в клетках всех линий лимфом, кроме лимфомы Беркитта. мРНК 1Ь-2Яу присутствовала в образцах всех тестированных клеточных линий лимфом.

Экспрессия генов бета- и гамма-цепей 1Ь-2Я в клетках линий, полученных от больных РТК и РЛ, варьировала. При этом одновременное присутствие мРНК 1Ь-2ЯР и 1Ь-2Яу в клетках двух линий указывает на возможность формирования на поверхности клеток рецептора средней аффинности. Вероятным объяснением наличия мРНК лишь одной цепи из трех в клетках шести линий является их принадлежность к рецепторам других цитокинов. Так, рецепторы интерлейкина-2 и интерлейкина-15 содержат бета-цепи одинакового строения, а гамма-субъединица входит в состав рецепторов 1Ь-2,1Ь-4,1Ь-7,1Ь-9,1Ь-15 и 1Ь-21 [169; 9].

Таким образом, показано отсутствие мРНК 1Ь-2Яа в линиях неопластических клеток, полученных из опухолевых очагов больных раком толстого кишечника и раком легкого. В предыдущих разделах работы была обнаружена экспрессия гена 1Ь-2ЯА в образцах опухолевых очагов больных РТК и РЛ. Наличие мРНК 1Ъ-2Ка в клетках опухолевых очагов больных данными заболеваниями может иметь следующие причины. Во-первых, источником мРНК IL-2Ra могут являться TILs, в частности инфильтрирующие опухоль Т-регуляторы. Их характерной чертой является высокий уровень экспрессии гена альфа-цепи IL-2R. Во-вторых, экспрессия гена IL-2RA может происходить в опухолевых клетках, находящихся в условиях in vivo, но теряться при переводе в культуру. Для поддержания гена во включенном состоянии нередко необходимы особые условия микроокружения раковых клеток, отсутствующие в клеточной культуре, но присутствующие в организме. Хорошо известен феномен изменения профиля экспрессии генов при переводе клеток в культуру [17]. При этом происходит включение одних и выключение других генов. В-третьих, присутствие мРНК IL-2Ra может являться индивидуальной особенностью каждой конкретной опухоли. В пользу этого говорит выявленное нами отсутствие мРНК IL-2Ra в ряде опухолевых очагов больных раком легкого и раком тела матки. Наконец, источником исследуемой мРНК могут быть опухоль-инфильтрирующие лимфоциты и раковые клетки одновременно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шумилова, Светлана Викторовна, Нижний Новгород

1. Князев Д.И., Новиков Д.В., Сахарнова Т.А. и др. Экспрессия гена ICAM-1 в опухолевых клетках больных раком толстого кишечника // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. - Т. 2, № 2. -С. 528-531.

2. Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. М.: Медицинское информационное агентство. 2008. - 249 с.

3. Новиков В.В. Молекулярная биология опухолевого роста // Онкология. Руководство для врачей в 2-х томах. Под ред. Б.Е. Шахова и др. Н.Новгород: НГМА. 2010. - Т. 1.С. 69-84.

4. Новиков В.В. Особенности транскриптома опухолевых клеток // Рос. биотерап. журнал. Тез. IX Всерос. научно-практ. конференции с межд. участием «Отечественные противоопухолевые препараты». 2010. - № 2. -С. 55.

5. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Рос. биотерап. журн. 2002. - Т. 1, № 3. - С. 27-33.

6. Симбирцев А. С. Интерлейкин-2 и рецепторный комплекс интерлейкина-2 в регуляции иммунитета // Иммунология. 1998. - № 6. - С. 3-8.

7. Ярилин А.А., Добротина Н.А. Введение в современную иммунологию. -Н.Новгород: ННГУ, 1997. 238 с.

8. Antony Р.А., Paulos С.М., Ahmadzadeh М. et al. Interleukin-2-dependent mechanism of tolerance and immunity in vivo // J. Immunol. 2006. - V. 176, № 9. - P. 5255-66.

9. Asao H., Okuyama C., Kumaki S. et al. Cutting edge: the common gamma-chain is an indispensable subunit of the IL-21 receptor complex // J. Immunol. 2001. -V. 167, № l.-p. 1-5.

10. Aydin F., Yilmaz M., Ozdemir F. et al. Correlation of serum IL-2, IL-6, and IL-10 levels with IPI in patients with aggressive non-Hodgkin's lymphoma // Am. J. Clin. Oncol. 2002. - V. 25, № 6. - P. 570-72.

11. Bach J. F. Regulatory T cells under scrutiny // Nat. Rev. Immunol. 2003. - V. 3, № 3. - P. 189.

12. Baecher-Allan C., Brown J. A., Freeman G. J., Hafler D. A. CD4+CD25hlgh regulatory cells in human peripheral blood // J. Immunol. 2001. - V. 167, № 3. -P. 1245-1253.

13. Baik Y.H., An J.Y., Noh J.H. et al. Can serum interleukin-2 receptoralpha predict lymph node metastasis in early gastric cancer? // J. Korean Surg. Soc. — 2012. — V. 82, №3.-P. 143-148.

14. Barnhart B.C., Lee J.C., Alappat E.C., Peter M.E. The death effector domain protein family // Oncogene. 2003. - V. 22, № 53. - P. 8634-8644.

15. Bazan J.F. Unraveling the structure of IL-2 // Science. 1992. - V. 257, № 5068. -P. 410-413.

16. Bien E., Balcerska A., Kuchta G. Serum level of soluble interleukin-2 receptor alpha correlates with the clinical course and activity of Wilms' tumour and soft tissue sarcomas in children // Biomarkers. 2007. - V. 12, № 2. - P. 203-213.

17. Bien E., Balcerska A. Serum soluble interleukin 2 receptor alpha in human cancer of adults and children: a review // Biomarkers. 2008. -V. 13, № 1. - P. 1-26.

18. Bien E., Balcerska A. Serum soluble interleukin-2 receptor, beta2-microglobulin, lactate dehydrogenase and erythrocyte sedimentation rate in children with Hodgkin's lymphoma // Scand. J. Immunol. 2009. - V. 70, № 5. - P. 490-500.

19. Birney E., Andrews T.D., Bevan P. et al. An overview of Ensembl // Genome Res. 2004. - V. 14, № 5. - P. 925-928.

20. Brentani H., Caballero O.L., Camargo A.A. et al. The generation and utilization of a cancer-oriented representation of the human transcriptome by using expressed sequence tags // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, № 23. - P. 1341813423.

21. Brinkmann U., Vasmatzis G., Lee B. et al. Novel genes in the PAGE and GAGE family of tumor antigens found by homology walking in the dbEST database // Cancer Res. 1999. - V. 59, № 7. - P. 1445-1448.

22. Burton J., Goldman C.K., Rao P. et al. Association of intercellular adhesion molecule 1 with the multichain high-affinity interleukin 2 receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87, № 18. - P. 7329-7333.

23. Cabrera R., Ararat M., Eksioglu E.A. et al. Influence of serum and solubleCD25 (sCD25) on regulatory and effector T-cell function in hepatocellular carcinoma // Scand. J. Immunol. 2010. - V. 72, № 4. P. 293-301.

24. Cantrell D.A., Smith K.A. The interleukin-2 T-cell system: a new cell growth model // Science. 1984. -V. 224, № 4655. - P. 1312-1316.

25. Carlile G.W., Smith D.H., Wiedmann M. A non-apoptotic role for Fas/FasL in erythropoiesis // FEBS Letters. 2009. - V. 583, № 4. - P. 848-854.

26. Castrignano T., D'Antonio M., Anselmo A. et al. ASPicDB: a databaseresource for alternative splicing analysis // Bioinformatics. 2008. - V. 24, № 10. - P. 1300-1304.

27. Champagne B., Tremblay P., Cantin A., Pierre Y.S. Proteolytic cleavage of ICAM-1 by human neutrophil elastase 1 // J. Immunology. 1998. - V. 161, № 11.-P. 6398-6405.

28. Chaput N., Louafi S., Bardier A. et al. Identification of CD8+CD25+Foxp3+ suppressive T cells in colorectal cancer tissue // Gut. 2009. -V. 58, № 4. - P. 520-529.

29. Chiou S.H., Sheu B.C., Chang W.C. et al. Current concepts of tumor-infiltrating lymphocytes in human malignancies // Reprod. Immunol. 2005. - V. 67. - P. 35-50.

30. Cho B., Lim Y., Lee D.Y. et al. Identification and characterization of a novel cancer/testis antigen gene CAGE // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. -V. 292, №3. p. 715-726.

31. Choi C. Homo sapiens interleukin-2 receptor mRNA, alternatively spliced, partial cds // Submitted Neurology, Yonsei University, Shinchon-dong, South Korea 1997. - URL: http://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/AF008556.l.

32. Chomez P., Backer O., Bertrand M. et al. An Overview of the MAGE Gene Family with the Identification of All Human Members of the Family 1 // Cancer Reseach. -2001. V. 61. - P. 5544-5551.

33. Cosman D. Cloning, sequence and expression of human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. - V. 312, № 5996. - P. 768-771.

34. Deaglio S., Mehta K., Malavasi F. Human CD38: a (r)evolutionary story of enzymes and receptors // Leukemia Res. 2001. - V. 25, № 1. - P. 1-12.

35. Dummer R., Posseckert G., Sugamura K. et al. Circulating interleukin-2 receptors are a group of multimeric proteins with immunoreactivity for interleukin-2 receptor alpha, beta, and gamma chains // J. Interferon Cytokine Res. 1996. - V. 16.-P. 315-320.

36. Eckmann L., Jung H.C., Schurer-Maly C. et al. Differential cytokine expression by human intestinal epithelial cell lines: regulated expression of interleukin 8 // Gastroenterology. 1993. - V. 105, № 6. - P. 1689-1697.

37. El Houda Agueznay N., Badoual C., Hans S. et al: Soluble inteleukin-2 receptor and metalloproteinase-9 expression in head and neck cancer: prognostic value and analysis of their relationship // Clin. Exp. Immunol. -2007. V. 150, № 1. - P. 114-123.

38. Ferrari S., Cannizzaro L.A., Battini R. et al. The gene encoding human vimentin is located on the short arm of chromosome 10 // Am. J. Hum. Genet. 1987. - V. 41.-P. 616-626.

39. Fisher J.R., Schindel M., Bulzebruck H. et al. Decrease of interleukin-2 secretion is a new independent prognostic factor associated with poor survival in patients with small-cell lung cancer // Ann. Oncol. 1997. - V. 8. - P. 457-461.

40. FitzGerald D.J., Wayne A.S., Kreitman R.J., Pastan I. Treatment of hematologic malignancies with immunotoxins and antibody-drug conjugates // Cancer Res. -2011. V. 71, № 20. - P. 6300-6309.

41. Fontenot J.D., Gavin M. A., Rudensky A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells // Nat. Immunol. 2003. - V. 4, № 4.-P. 330-336.

42. Frankish A., Mudge J.M., Thomas M., Harrow J. The importance of identifyingalternative splicing in vertebrategenomeannotation // Database (Oxford). 2012. - URL: http://database.oxfordjournals.org/content/2012/ bas014.

43. Frey D.M., Droeser R.A., Viehl C.T. et al. High frequency of tumor-infiltrating FOXP3(+) regulatory T cells predicts improved survival in mismatch repair-proficient colorectal cancer patients // Int. J. Cancer. 2010. - V. 126, № 11. - P. 2635-2643.

44. Fujita T., Takaoka C., Matsui H., Taniguchi T.: Structure of the human interleukin-2 gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. - P. 7437-7441.

45. Garcia-Tunnon I., Ricote M., Ruiz A. et al. Interleukin-2 and its receptor complex (alpha, beta and gamma chains) in in situ and infiltrative human breast cancer: an immunohistochemical comparative study // Breast Cancer Res. 2004. - V. 6, № l.-P. 1-7.

46. Gesbert F., Delespine-Carmagnat M., Bertoglio J. Recent advances in the understanding of interleukin-2 signal transduction // J. Clin. Immunol. 1998. -V. 18, №5.-P. 307-320.

47. Gjerstorff M., Kock K., Nielsen O. MAGE-A1, GAGE and NY-ESO-1 cancer/testis antigen expression during human gonadal development // Human Reproduction. 2007. - V. 1. - P. 1-8.

48. Glaser R., Andridge R., Yang E.V. et al. Tumor site immunemarkers associated with risk for subsequent basal cell carcinomas // PLoS One 2011. - V. 6, № 9. -URL: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F 10.1371 %2Fjournal.pone. 0025160.

49. Graveley B.R. Alternative splicing: increasing diversity in the proteomic world // Trends Genet. 2001. - V. 17, № 2. - P. 100-107.

50. Grungreiff K., Reinhold D., Ansorge S. Serum concentrations of sIL-2R, IL-6, TGF-betal, neopterin, and zinc in chronic hepatitis C patients treated with interferon-alpha // Cytokine. 1999. - V. 11, № 12. - P. 1076-1080.

51. Gupta S., Zink D., Korn B. et al. Strengths and weaknesses of EST-based prediction of tissue-specific alternative splicing // BMC Genomics. 2004. - V. 5. -P. 72.

52. Hamai A., Meslin F., Benhalam H. et al. ICAM-1 has a critical role in the regulation of metastatic melanoma tumor susceptibility to CTL lysis by interfering with PI3K/AKT pathway // Cancer Res. 2008. - V. 68, № 23. - P. 9854-9864.

53. Huang A,, Quinn H., Glover C. et al. The presence of interleukin-2 receptor alpha in the serum of colorectal cancer patients is unlikely to result only from T cell up-regulation // Cancer Immunol. Immunother. 2002. - V. 51, № 1. - P. 5357.

54. Hunt M.J., Halliday G.M., Weedon D. et al. Regression in basal cell carcinoma: an immunohistochemical analysis // Brit. J. Dermatol. 1994. - V. 130, № 1. - P. 1-8.

55. Ikeguchi M., Hirooka Y. Interleukin-2 gene expression is a new biological prognostic marker in hepatocellular carcinomas // Onkologie. 2005. - V. 28. - P. 255-259.i t

56. Ishida N., Kanamori H., Noma T. et al. Molecular cloning and structure of the human interleukin 2 receptor gene // Nucleic Acids Research. 1985. - V.13, № 21.-P. 7579-7589.

57. Jmal A., Ghanem A., Boussen H. et al. Seric soluble interleukin-2 receptor alpha in nasopharyngeal carcinoma in Tunisia. Prospective study about 45 cases // Tunis Med. 2007. - V. 85, № 8. - P. 651-654.

58. Jo S.A., Hwang S.H., Chang C.L. et al. Clinical relevance of elevated levels of serum soluble interleukin-2 receptor alpha (sIL-2Ra) in patients with non-Hodgkin's lymphoma // Korean J. Lab. Med. 2010. - V. 30, № 6. - P. 600-605.

59. Johnston J.A., Kawamura M, Kirken R.A. et al. Phosphorylation and activation of the Jak-3 Janus kinase in response to interleukin-2 // Nature. 1994. - V. 370, № 6485.-P. 151-153.

60. Jonuleit H., Schmitt E. The regulatory T cell family: distinct subsets and their interrelations // J. Immunol. 2003. - V. 171, № 12. - P. 6323-6327.

61. Kasprzak A., Olejniczak K., Przybyszewska W., Zabel M. Cellular expression of interleukin 2 (IL-2) and its receptor (IL-2R, CD25) in lung tumours // Folia Morphol. 2007. - V. 66. - P. 159-166.

62. Kawai Y., Kaidoh M., Ohhashi T. MDA-MB-231 produces ATP-mediated ICAM-1 -dependent facilitation of the attachment of carcinoma cells to human lymphatic endothelial cells // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2008. - V. 295, № 5. -P. 1123-1132.

63. Kelleher D., Pandol S.J., Kagnoff M.F. Phorbol myristate acetate induces IL-2 secretion by HUT 78 cells by a mechanism independent of protein kinase C translocation // Immunology. 1988. - V. 65, № 3. - P. 351-355.

64. Kikuchi E., Yamazaki K., Nakayama E., Sato S. Prolonged survival of patients with lung adenocarcinoma expressing XAGE-lb and HLA class I antigenl // Cancer Immunity. 2008. - V. 8. - P. 13-16.

65. Kim H.P., Kim B.G., Letterio J., Leonard W.J. Smad-dependentcooperative regulation of interleukin 2 receptor alpha chain gene expression by T cell receptor and transforming growth factor-beta // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280, № 40. -P. 34042-34047.

66. Kondo M., Takeshita T., Ishii N. et al. Sharing of the interleukin 2 (IL-2) receptor y chain between receptors for IL-2 and IL-4 // Science. 1993. - V. 262, № 5141.-P. 1874-1877.

67. Kono N., Kanda Y., Yamamoto R. et al. Prognostic signifi cance of serum soluble interleukin-2 receptor level in non-Hodgkin's lymphoma: a single center study in Japan // Leukemia and Lymphoma. 2000. - V. 37. - P. 151-156.

68. Kotlajich M.V., Hertel K.J. Death by Splicing: Tumor Suppressor RBM5 Freezes Splice-Site Pairing // Molecular Cell. 2008. - V. 32. - P. 162-164.

69. Kreitman R.J., Arons E., Stetler-Stevenson M. Et al. Recombinant immunotoxins and other therapies for relapsed/refractory hairy cell leukemia // Leuk. Lymphoma. 2011. - V. 52. - P. 82-86.

70. Kuhn D.J., Dou Q.P. The role of interleukin-2 receptor alpha in cancer // Front. Biosci. -2005. V. 10-P. 1462-1474.

71. Lange B.J., Yang R.K., Gan J. et al. Soluble interleukin-2 receptora activation in a Children's Oncology Group randomized trial of interleukin-2 therapy for pediatric acute myeloid leukemia // Pediatr. Blood Cancer. 2011. - V. 57, № 3. -P. 398-405.

72. Leonard W.J., Depper J.M., Uchiyama T. et al. A monoclonal antibody that appears to recognize the receptor for human T-cell growth factor; partial characterization of the receptor // Nature. 1982. - V. 300, № 5889. - P. 267-269.

73. Leonard W.J. Molecular cloning and expression of cDNAs for the human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. - V. 311, № 5987. - P. 626-631.

74. Leonard W.J., Donlon T.A., Lebo R.V., Greene W.C. Localization of the gene encoding the human interleukin-2 receptor on chromosome 10 // Science. 1985.- V. 228, № 4707. P. 1547-1549.

75. Lin C., Mak S., Meitner P. A. et al. Cancer/testis antigen CSAGE is concurrently expressed with MAGE in chondrosarcoma // Gene. 2002. - V. 285. - P. 269278.

76. Lin W.C., Yasumura S., Whiteside T. L. Transfer of interleukin 2 receptor genes into squamous cell carcinoma. Modification of tumor cell growth // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1993. - V. 119. - P. 1229-1235.

77. Lin W.C., Yasumura S., Suminami Y. et al. Constitutive production of IL-2 by human carcinoma cells, expression of IL-2 receptor, and tumor cell growth // J. Immunol. 1995.-V. 155.-P. 4805-4816.

78. Liparoto S.F., Ciardelli T.L. Biosensor analysis of the interleukin-2 receptor complex // J. Mol. Recognit. 1999. - V. 12, № 5. - P. 316-321.

79. Loose D., Signore A., Bonanno E. et al. Prognostic value of CD25 expression on lymphocytes and tumor cells in squamous-cell carcinoma of the head and neck // Cancer Biother. Radiopharm. 2008. - V. 23, № 1. - P. 25-33.

80. Lowe C.E., Cooper J.D., Brusko T. et al. Large-scale genetic fine mapping and genotype-phenotype associations implicate polymorphism in the IL2RA region in type 1 diabetes // Nature Genet. 2007. - V. 39. - P. 1074-1082.

81. Lund F., Solvason N.J., Grimaldi C.R., Michael E. Parkhouse and Maureen Howard Murine CD38: an immunoregulatory Ectoenzyme // Immunology Today.- 1995. V. 16, № 10. - P. 469-473.

82. Luo B., Carman C.V., Springer T.A. Structural basis of integrin regulation and signaling // Ann. Rev. Immunol. 2007. - V 25. - P. 619-647.

83. Matutes E. Novel and emerging drugs for rarer chronic lymphoid leukaemias // Curr. Cancer Drug. Targets. 2012. - V. 12, № 5. - P. 484-504.

84. McDoniels-Silvers A.L., Stoner G.D., Lubet R.A., You M. Differential expression of critical cellular genes in human lung adenocarcinomas andsquamous cell carcinomas in comparison to normal lung tissues // Neoplasia. -2002.-V. 4.-P. 141-150.

85. Mellgren K., Hedegaard C.J., Schmiegelow K., Müller K. Plasma cytokine profiles at diagnosis in pediatric patients with non-Hodgkin lymphoma // J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2012. - V. 34, № 4. - P. 271-275.

86. Mercken L., Moras V., Hemon L. et al. An exon 5-deleted mRNA encodes a functional interleukin 2 receptor alpha-subunit // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - V. 180, №3.-P. 1390-1395.

87. Minami Y., Kono T., Miyazaki T., Taniguchi T. The IL-2 receptor complex: its structure, function and target genes // Annu Rev. Immunol. 1993. - V. 11.-P. 245-267.

88. Mitsui F., Aikata H., Hashimoto Y. et al. A first case of hepatic angiosarcoma treated with recombinant interleukin-2 // Hiroshima J. Med. Sei. 2011. - V. 60, №4.-P. 91-96.

89. Miyawaki T., Uehara T., Nibu R. et al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood // J. Immunol. 1992. - Vol. 149. - P. 3753-3758.

90. Miyazaki T., Manuyama M., Yamada G. et al. The integrity of the conserved 'WS motif common to IL-2 and other cytokines receptors is essentials for ligand binding and signal transduction // EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 3191-3197.

91. Moon J.J., Rubio E.D., Martino A. et al. A permissive role for phosphatidylinositol 3-kinase in the Stat5-mediated expression of cyclin D2 by the interleukin-2 receptor // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279, № 7. - P. 5520-5527.

92. Nagata S., Golstein P. The Fas death factor // Science. 1995. - V. 267. - P. 1449-1456.

93. Nelson B.H. IL-2 regulatory T cells, and tolerance // J. Immunol. -2004. V. 172.-P. 3983-3988.

94. Niitsu N., Iijima K., Chizuka A. A high serum-soluble interleukin-2 recept or level is associated with a poor outcome of aggressive non-Hodgkin's lymphoma // Eur. J. Haematol. 2001. - V. 66. - P. 24-30.

95. Nikaido T., Shimizu A., Ishida N. et al. Molecular cloning of cDNA encoding human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. - V. 311, № 5987. - P. 631-635.

96. Noguchi M., Adelstein S., Cao X., Leonard W.J. Characterization of the human interleukin-2 receptor gamma chain gene // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, № 18.-P. 13601-13608.

97. Novikov D. V., Belova T. V., Plekhanova E. S. et al. Early Detection of Cancer/Testis mRNAs in Tumor Cells Circulating in the Peripheral Blood of Colorectal Cancer Patients // Molecular Biology. 2012. - V. 46, № 5. - P. 687692.

98. Ohta M., Tanaka F., Sadanaga N. et al. Expression of the TRAG-3 gene in human esophageal cancer: The frequent synchronous expression of MAGE-3 gene // Oncology Reports. 2006. - V. 15. - P. 1529-1532.

99. Old L.J. Cancer/testis (CT) antigens a new link between gametogenesis and cancer // Cancer Immun. - 2001. - V. 1. - P. 1-9.

100. Otte M., Zafrakas M., Riethdorf L. et al. Pantel MAGE-A Gene Expression Pattern in Primary Breast Cancer // Cancer Research. 2001. - V. 61. - P. 66826687.

101. Ozdemir F., Aydin F., Yilmaz M. et al. The effects of IL-2, IL-6 and IL-10 levels on prognosis in patients with aggressive non-Hodgkin's lymphoma (NHL) // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2004. - V. 23. - P. 485-488.

102. Papoff G., Hausler P., Eramo A. et al. Identification and characterization of a ligand-independent oligomerization domain in the extracellular region of the CD95 death receptor // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 3241-3250.

103. Park J., Kwon T.K., Kim I. et al. A new strategy for the diagnosis of MAGE-expressing cancers // J. Immunol. 2002. - V. 266. - P. 79-86.

104. Peuchmaur M., Emilie D., Crevon C. et al. IL-2 mRNA expression in Tacpositive malignant lymphomas // Am. J. Pathol. 1990. - V. 136. - P. 383390.

105. Piancatelli D., Romano P., Sebastiani P. et al. Local expression of cytokines in human colorectal carcinoma: evidence of specific interleukin-6 gene expression // J. Immunother. 1999. - V. 22, № 1. - P. 25-32.

106. Plaen E., Smit C., Boucouey M. et al. Genes expressed in cancer and germ line cells // Immunogenetics. 2005. - V. 13. - P. 195-198.

107. Qiu F.B., Wu L.Q., Lu Y. et al. Predominant expression of Thl-type cytokines in primary hepatic cancer and adjacent liver tissues // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int.-2007.-V. 6.-P. 63-66.

108. Reichert T.E., Kashii Y., Stanson J. et al. The role of endogenous interleukin-2 in proliferation of human carcinoma cell lines // Br. J. Cancer. 1999. - V. 81, № 5.-P. 822-831.

109. Reinecker H.C., Podolsky D.K. Human intestinal epithelial cells express functional cytokine receptors sharing the common gamma c chain of the interleukin 2 receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92, № 18. - P. 8353-8357.

110. Rickert M., Boulanger M.J., Goriatcheva N., Garcia K.C. Compensatory energetic mechanisms mediating the assembly of signaling complexes between interleukin-2 and its alpha, beta, and gamma(c) receptors // J. Mol. Biol. 2004. -V. 339, №5. P. 1115-1128.

111. Rickert M., Wang X.Q., Boulanger M.J. et al. The structure of interleukin-2 complexed with its alpha receptor // Science. 2005. - V. 308, № 5727-P. 1477-1480.

112. Rimoldi D., Salvi S., Hartmann F. et al. Expression of IL-2 receptors in human melanoma cells // Anticancer Res. 1993. - V. 13. - P. 555-564.

113. Robb R.J., Munck A., Smith K.A. T cell growth factor receptors. Quantitation, specificity, and biological relevance // J. Exp. Med. 1981. - V. 154, № 5. - P. 1455-1474.

114. Robb R.J., Kutny R.M. Structure-function relationships for the IL 2-receptor system. IV. Analysis of the sequence and ligand-binding properties of soluble Tac protein // J. Immunol. 1987. - V. 139, № 3. - P. 855-862.

115. Rosenberg S.A. Raising the bar: the curative potential of human cancer immunotherapy // Sci. Transl. Med. 2012. - V. 4, № 127. - P. 127.

116. Rossetti G., Collinge M., R.Bender J. et al. Integrin-dependent regulation of gene expression in leukocytes // Immunological Reviews. 2002. - V. 186. - P. 189-207.

117. Rothenberg E.V., Diamond R.A. Costimulation by interleukin-1 of multiple activation responses in a developmentally restricted subset of immature thymocytes // Eur. J. Immunol. 1994. - V. 24, № 1. - P. 24-33.

118. Royuela M., De Miguel M. P., Bethencourt F. R. et al. IL-2, its receptors, and bcl-2 and bax genes in normal, hyperplastic and carcinomatous human prostates: immunohistochemical comparative analysis // Growth Factors. 2000. - V. 18. -P. 135-146.

119. Rubin L.A., Kurman C.C., Fritz M.E. et al. Soluble interleukin 2 receptors are released from activated human lymphoid cells in vitro // J. Immunol. 1985. - V. 135, №5.-P. 3172-3177.

120. Rubin L.A., Nelson D.L. The soluble interleukin-2 receptor: biology, function, and clinical application // Ann. Intern. Med. 1990. - V. 113, № 8. - P. 619-627.

121. Russell S.M., Keegan A.D., Harada N. et al Interleukin-2 receptor gammachain: a functional component of the interleukin-4 receptor // Science. -1993.-V. 262.-P. 1880-1883.

122. Sakata H., Murakami S., Hirayama R. Serum soluble interleukin-2 receptor (IL-2R) and immunohistochemical staining of IL-2R/Tac antigen in colorectal cancer // Int. J. Clin. Oncol. 2002. - V. 7, № 5. p. 312-317.

123. Salama P., Phillips M., Grieu F. et al. Tumor-infiltrating FOXP3+ T regulatory cells show strong prognostic significance in colorectal cancer // J. Clin. Oncol. 2009. - V. 27, № 2. - P. 196-192.

124. Sarquis M.S., Agrawal S., Shen L. et al. Distinct expression profiles for PTEN transcript and its splice variants in Cowden syndrome and Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome // Am. J. Hum. Genet. 2006. - V. 79, № 1. - P. 23-30.

125. Secor E.R., Singh J.A., Guernsey L.A. et al. Bromelain treatment reduces CD25 expression on activated CD4(+) T cells in vitro // Int. Immunopharmacol. -2009. V.9, № 3. - P. 340-346.

126. Sharfe N., Dadi H.K., Shahar M., Roifman C.M. Human immune disorder arising from mutation of the alpha chain of the interleukin-2 receptor // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. - V. 94, № 7. - P. 3168-3171.

127. Sharon M., Klausner R.D., Cullen B.R. et al. Novel interleukin-2 receptor subunit detected by cross-linking under high-affinity conditions // Science. 1986. - V. 234, № 4778. - P. 859-863.

128. Shibuya H., Yoneyama M., Nakamura Y. et al. The human interleukin-2 receptor beta-chain gene: Genomic organization, promotor analysis and chromosomal assignment // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 3697-3703.

129. Simpson A.J.G., Caballero O.L., Jungbluth A. et al. Cancer/Testis antigens, gametogenesis and cancer // Nature Reviews. 2005. - V. 5. - P. 615-625.

130. Smith K. A. The quantal theory of immunity // Cell Res. 2006. - V. 16, № 1. -P. 11-19.

131. Spachacz R., Kasprzak A., Stefanska K. et al Tissue expression of cytokines (IL-la, IL-2, IL-6, IL-12, TNF-a) in B-cell lymphomas in children // Folia Morphol. 2003. - V. 62. - P. 483-85.

132. Stamm S., Ben-Ari S., Rafalska I. et al. Function of alternative splicing // Gene. 2005. - V. 344. - P. 1-20.

133. Stasi R., Zinzani L., Galieni P. et al. Prognostic value of serum IL-10 and soluble IL-2 receptor levels in aggressive non-Hodgkin's lymphoma // Br. J. Haematol. 1994. - V. 88, № 4. - P. 770-777.

134. Stauber D.J., Debler E.W., Horton P.A. et al. Crystal structure of the IL-2 signaling complex: paradigm for a heterotrimeric cytokine receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103, № 8. - P. 2788-2793.

135. Stein U., Walther W., Shoemaker R.H. Reversal of multidrug resistance by transduction of cytokine genes into human colon carcinoma cells // J. Natl. Cancer Inst. 1996. - V. 88, № 19. - P. 1383-1392.

136. Stevens A.C., Matthews J., Andres P. et al. Interleukin-15 signals T84 colonic epithelial cells in the absence of the interleukin-2 receptor beta-chain // Am. J. Physiol. 1997. - V. 272. - P. 1201-1208.

137. Tanaka T., Saiki O., Doi S. et al. Expression of novel interleukin 2 binding molecules and their functional roles in human B cell differentiation // J. Clin. Invest. 1988. -V. 82, № 1. - P. 316-321.

138. Taniguchi T., Matsui H., Fujita T. et al. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 // Nature. 1983. - V. 302. - P. 305-310.

139. Taniguchi T., Minami Y. The IL-2iIL-2 receptor system: a current overview // Cell.- 1993.-V. 73.-P. 5.

140. Tian H., Cao B., Wang S. Clinical significance of detection of IL-2R for non-small cell lung cancer // Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 1998. - V. 1, № 2. - P. 90-91.

141. Tilli T.M., Franco V.F., Robbs B.K. et al. Osteopontin-c splicing isoform contributes to ovarian cancer progression // Mol. Cancer Res. 2011. - V. 9, № 3. -P. 280-293.

142. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M. et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science. 1989. - V. 245, № 4915. - P. 301-305.

143. Tsudo M., Kitamura F., Miyasaka M. Characterization of the interleukin-2 receptor beta chain using three distinct monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 1982-1986.

144. Vamosi G., Bodnar A., Vereb G. et al. IL-2 and IL-15 receptor alpha-subunits are coexpressed in a supramolecular receptor cluster in lipid rafts of T cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2004. V. 101.-P. 11082-11087.

145. Van der Bruggen P., Traversari C., Chomez P. et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma // Science. -1991.-V. 254.-P. 1643-1647.

146. Waldmann T.A. The interleukin-2 receptor // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. -P. 2681-2685.

147. Waldmann T.A., O'Shea J. The use of antibodies against the IL-2 receptor in transplantation // Curr. Opin. Immunol. 1998. - V. 10, № 5. - P. 507-512.

148. Waldmann T.A. Daclizumab (anti-Tac, Zenapax) in the treatment of leukemia/lymphoma // Oncogene. 2007. - V. 26, № 25. - P. 3699-3703.

149. Wan L., Cai H., Yang H. et al. Biotechnological Products and Process Engineering // Applied Microbiol, and Biotech. 2008. - V. 81, № 1. - P. 33-41.

150. Wang G.S., Cooper T.A. Splicing in disease: Disruption of the splicing code and the decoding machinery // Nat. Rev. Genet. 2007. - V. 8, № 10. - P. 749761.

151. Wang Q., Li B., Liu B. et al. Polymorphisms of the ICAM-1 exon 6 (E469K) are associated with differentiation of colorectal cancer // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2009.-V. 28. -P. 139-145.

152. Wang X., Rickert M., Garcia K.C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors // Science. 2005. - V. 310, №5751.-P. 1159-1163.

153. Xu Q., Lee C. Discovery of novel splice forms and functional analysis of cancer-specific alternative splicing in human expressed sequences // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31, № 19. - P. 5635-5643.

154. Yano T., Fukuyama Y., Yokoyama H. et al. Interleukin-2 receptors in pulmonary adenocarcinoma tissue // Lung Cancer. 1996. - V. 16, № 1. - P. 1319.

155. Yoshimatsu K., Kuhara K., Itagaki H. et al. Changes of immunological parameters reflect quality of life-related toxicity during chemotherapy in patients with advanced colorectal cancer // Anticancer Res. 2008. - V. 28, № IB. - P. 373-378.

156. Zendman A., Van Kraats A., Weidle U. et al. The XAGE family of cancer/testis-associated genes: alignment and expression profile in normal tissues, melanoma lesions and Ewing's sarcoma // Int. J. Cancer. 2002. - V. 99. - P. 361369.

157. Zendman A., Ruiter D., Van Muijen G. Cancer/testis-associated genes: identification, expression profile, and putative function // Journal of cellular physiology. 2003. - V. 194. - P. 272-288.

158. Zmuidzinas A., Mamon H.J., Roberts T.M., Smith K.A. Interleukin-2-triggered Raf-1 expression, phosphorylation, and associated kinase activity138V

Информация о работе

Шумилова, Светлана Викторовна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Матричная РНК белков системы "интерлейкин-2 - рецептор интерлейкина-2" в опухолевых очагах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы