Белки-мишени для адресной доставки контейнерных систем в мозг млекопитающих. Фундаментальные и прикладные аспекты

Баклаушев, Владимир Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белки-мишени для адресной доставки контейнерных систем в мозг млекопитающих. Фундаментальные и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белки-мишени для адресной доставки контейнерных систем в мозг млекопитающих. Фундаментальные и прикладные аспекты"

На правах рукописи

БАКЛАУШЕВ ВЛАДИМИР ПАВЛОВИЧ

БЕЛКИ-МИШЕНИ ДЛЯ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ КОНТЕЙНЕРНЫХ СИСТЕМ В МОЗГ МЛЕКОПИТАЮЩИХ. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

03.01.04-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 Я НОЯ 2013

МОСКВА-2013 г.

005541038

Работа выполнена в Отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского» Минздрава РФ и в НОЦ «Медицинские нанобиотехнологии» Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова.

Научный консультант:

Академик-секретарь отделения медико-биологических наук РАМН, д.м.н., профессор Чехонин Владимир Павлович Официальные оппоненты:

Терентьев Александр Александрович, чл.-корр РАМН, д.м.н., профессор, зав. кафедрой биохимии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва.

Беклемишев Анатолий Борисович, д.б.н., профессор, зав. лабораторией генной инженерии. ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, Новосибирск

Вавилин Валентин Андреевич, д.м.н., профессор, зав. лабораторией метаболизма лекарств и фармакокинетики НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН. Ведущая организация:

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Защита состоится «24» декабря 2013 на заседании Диссертационного совета Д. .001.034.01. по медицинским наукам при ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках НИИ биохимии СО РАМН и Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова

Автореферат разослан «22» ноября 2013

Учёный секретарь

диссертационного совета Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Создание лекарственных препаратов направленного типа действия уже более 100 лет является актуальной задачей медицины. Особое значение создание адресных препаратов имеет в нейропсихофармакологии и терапии опухолей. В первом случае актуальность этой проблемы обусловлена избирательной проницаемостью гематоэнцефапического барьера (ГЭБ), из-за которой критически ограничиваются возможности фармакотерапии нервных и психических заболеваний. Во втором — актуальность продиктована необходимостью применения цитостатических препаратов, имеющих тяжелейшие системные токсические эффекты при существующих «неадресных» способах лечения. В случае первичных нейроэпи-телиальных опухолей, локализующихся внутри ГЭБ, актуальность в определенном смысле суммируется: наличие ГЭБ и высокая активность эффлюксных систем в неопласгическом эндотелии снижает биодоступность цитостатика по отношению к опухолевому очагу, а неспецифическое накопление препарата в органах и тканях обуславливает цитотоксичность. [V.P. Torchilin 2010].

Нанобиотехнологические подходы — заключение активного вещества в нанокон-тейнеры, экранирование инертным полимером, связывание лекарства с наночастицами с последующим контролируемым высвобождением и пр. — позволяют существенно пролонгировать фармакокинетику активного вещества, увеличить его биодоступность и уменьшить системное токсическое действие [A.V.Kabanov, 2003 — 2010]. Однако, сами по себе эти технологии не позволяют достичь самого главного — активного и избирательного накопления самого наноконтейнера в патологическом очаге в головном мозге. Такое накопление возможно только при наличии на поверхности наноконтейнера вектора — молекулы, обеспечивающей селективное и прочное взаимодействие с клеткой-мишенью. Наиболее перспективные кандидаты на роль вектора в настоящий момент это высокоаффинные мо-ноклональные или рекомбинантные антитела к поверхностным маркёрам клеток в патологическом очаге, в частности, в очаге низкодифференцированной глиальной опухоли [V.P. Chekhonin 2001 — 2007].

Наиболее актуальной зоной для адресной доставки лекарств при высокоинвазивных глиальных опухолях, своеобразным фронтом, на котором происходит сражение, является периферия опухоли и перитуморальная зона со стороны нормальной нервной ткани. Именно в этой области происходит активная инвазия глиомных клеток. Как реактивные астроци-ты, образующие перитуморальный глиальный вал, так и наиболее интенсивно мигрирующие клетки глиомы позитивны по коннексину 43 (Сх43) [Bates DC, 2007]. Это интегральный мембранный белок, образующий гексамеры — ко1шексоны в результате димеризации которых формируются межклеточные щелевые контакты (gap-junctions). Сх43 в виде геми-каналов и/или сформировавшихся щелевых контактов участвует в регуляции как межклеточной адгезии, так и в процессах поддержания ионного и водного гомеостаза, обмена внутриклеточными мессенджерами, модулирующими пролиферацию, дифференцировку,

миграцию, апоптоз и др. [Prochnow N, 2008]. Показано, что определенную роль в активной миграции Сх43-позитивных глиомных клеток в перитуморальную зону могут играть гете-рологические щелевые контакты между ними и GFAP-позитивными астроцитами [Oliveira R et al, 2005]. Помимо того, что Сх43-положительные клетки Сб-глиомы обладают более высокой способностью к миграции, чем Сх43 негативные, они более устойчивы к оксида-тивному стрессу и различным другим повреждающим факторам [Lin J. H., 2002, Giardina SF, 2007]. Таким образом, Cx43 представляется перспективной мишенью как для ингибиро-вания опухолевой инвазии, так и для адресной доставки лекарств в перитуморальную зону.

Среди белков, специфичных для церебрального эндотелия особого внимания заслуживает цереброспецифический анионный транспортер (BSAT1, ОАТР14) [Lee et al. 2005, Syguiama et al., 2007]. BSAT1 является представителем широко распространенного семейства транспортеров органических анионов ОАТР, локализуется на люминальной мембране эндотелиоцитов, осуществляя АТФ-зависимый транспорт тироксина в головной мозг. Высокая специфичность BSAT1 по отношению к микрососудам нервной ткани делает его очень интересной мишенью для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в церебральные капилляры.

Патологические (в особенности — опухолевые) микрососуды характеризуются повышенной экспрессией сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и его рецептора VEGFR1, а также весьма активным VEGF-зависимым ангиогенезом [Plate КН, 2012]. Эффективность применения антител к VEGF подтверждена клиническим опытом (в 2003 FDA был одобрен к клиническому применению препарат «Авастин», являющийся гуманизированным антителом к VEGF). Крайне актуальным представляется вопрос применения водорастворимого рецептора VEGFR1 в качестве "ловушки" VEGF [Holash J., 2002, 2008] и антител к нему для адресной доставки в VEGF-позитивные неопластические эндотелиоциты [Ferrara N., 2004].

Выбор наноконтейнеров для создания адресного препарата на сегодняшний день довольно широк и зависит от природы транспортируемого вещества и особенностей органа-мишени. Для доставки цитостатических препаратов применяются как хорошо изученные иммунолипосомы [Torchilin VP, 2010], так и относительно новые полиэлектролитные нано-гели [Kabanov A.V., 2012]. И липосомы, и наногели имеют широкие возможности по модификации их поверхностей как инертными полимерами (ПЭГ и др.), пролонгирующими фармакокинетику и делающими их незаметными для клеток РЭС (так называемые stealth-липосомы), так и различными векторными молекулами, включая моноклональные антитела.

Резюмируя современное состояние вопроса, можно заключить, что актуальным и очень востребованным в нейрофармакологии является создание адресных наноконтейнер-ных препаратов на основе моноклональных антител к белкам-мишеням, способным обеспечить активную доставку в очаг патологии в головном мозге.

Цель работы

Изучить мембранные белки, ассоциированные с клетками нервной ткани и глиаль-

ных опухолей, и разработать наноконтейнерные системы адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в мозг на основе моноклональных антител к ним. Задачи

1. Провести поиск нативных белков-мишеней в мембранных фракциях и солюбилизиро-ванных препаратах трансмембранных белков эндотелиоцитов головного мозга крысы.

2. Получить рекомбинантные внеклеточные фрагменты Сх43, BSAT1, VEGFR1, VEGF и охарактеризовать их физико-химические и биологические свойства.

3. Провести иммуноцитохимический анализ исследуемых белков-мишеней, оцепить их клеточную и субклеточную локализацию, уровень экспрессии в клетках глиом и нормальных клетках нервной ткани.

4. Исследовать векторные свойства моноклональных антител к рекомбинантпым внеклеточным фрагментам Сх43, BSAT и антител к AMVB1 и VEGF в экспериментах in vitro и in vivo.

5. Изучить противоопухолевые эффекты водорастворимого внеклеточного фрагмента VEGFRl(sFltl) in vitro и in vivo, сравнить эффективность антиангиогенной терапии с помощью водорастворимого VEGFR1 (sFltl) и моноклональных антител к VEGF.

6. Изучить ингибирующее влияние моноклональных антител к внеклеточному фрагменту Сх43 в отношении функций щелевых контактов астроцитов, и оценить перспективы применения анти-Сх43 антител в терапии низкодифференцированных глиом.

7. Разработать векторную наноконтейнерную систему для доставки диагностических агентов и визуализации перитуморалыюй зоны экспериментальной высоко инвазивной глиомы на основе stealth-липосом и антител к внеклеточным фрагментам исследуемых белков.

8. Разработать систему направленного транспорта противоопухолевых препаратов в очаг и перитуморальную зону экспериментальной глиомы Сб на основе иммунолипосомаль-ных контейнерных систем.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые:

• С помощью соответствующих моноклональных антител идентифицирован и охарактеризован по параметрам тканевой специфичности и субклеточной локализации антиген аблюминалыюй поверхности эндотелиоцитов AMVB1.

• Получены моноклональные антитела к внеклеточным фрагментам Сх43 и BSAT1 и с их помощью охарактеризованы иммунохимические свойства, тканевая и клеточная специфичность этих белков.

• Показан эффект инактивации функций щелевых контактов с помощью моноклональных антител к Сх43.

• Проведена визуализация Сх43 - и GFAP -позитивных клеток перитуморального астро-глиального вала после внутривенного введения антител к Сх43 и GFAP.

• Разработана Dil- и Gd-DTPA-содержащая иммунолипосомальная система для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в перитуморальную зону глиобластомы.

• Показана противоопухолевая эффективность моноклональных антител к рекомбинант-кому внеклеточному фрагменту Е2 Сх43 в отношении экспериментальной низкодиффе-решшрованной глиомы.

• Продемонстрирована возможность адресной терапии низкодифференцированных глиом 101/8 и С6 крысы с помощью наногелей, векторизованных антителами к Сх43, BSAT1 и VEGF.

Положения, выносимые на защиту

• Нормальный гематоэнцефалический барьер непроницаем для введенных в кровоток моноклональных антител к поверхностным маркерам эндотелия и астрошпов. Опухолевая неоваскуляризация приводит к дедифференцировке барьерного эндотелия и критическому повышению проницаемости для антител.

• Цереброспецифический анионный транспортёр BSAT1 и белок щелевых контактов Сх43 являются перспективными мишенями для адресной доставки наноконтейнерных препаратов с помощью специфических антител.

• Моноклональные антитела к Сх43 ингибируют функции щелевых контактов в экспериментах на культурах глиомных клеток и астроцитов.

• Антиангиогенная терапия низкодифференцированной глиомы с помощью MAb VEGF и sFltl показала обнадеживающие результаты в экспериментах in vitro, однако не подтвердилась в экспериментах in vivo.

• Моноклональные антитела к Сх43 ингибируют развитие низкодифференцированной глиальной опухоли и могут быть положены в основу создания нового биотерапевтического средства лечения мультиформной глиобластомы.

• Иммунолипосомальные системы на основе ПЭГилированных липосом с ковалентно пришитыми к концам ПЭГ моноклональными антителами к Сх43 и VEGF могут применяться для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в зону инвазии низкодифференцированной внутрикраниальной глиомы.

• Полиэлектролитные наногели, синтезированные из блок-сополимеров PEG-b-PMA и векторизованные моноклональными антителами к Сх43 и VEGF представляют перспективный вариант разработки адресной терапии глиобластомы и могут быть рекомендованы для доклинической апробации.

Апробация, внедрение, публикации

Результаты диссертационной работы используются в Отделе медицинских нанобио-технологий Российского государственного медицинского университета и НИИ нейрохирургии им. H.H. Бурденко РАМН. Различные аспекты диссертационной работы явились основанием для планирования новых научных тем, продолжающих данное научное направление.

Основные положения были представлены на: VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease Germany, Berlin, 2003, I — III Международных форумах по нано-технологиям (Роснанофорум). Москва, 2009 — 2011; Всероссийской научно-практической конференции "Наноонкология", Москва, 2009; Конференции с международным участием «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» Москва, 2009; 22nd ECNP Congress (European College of Neuropsychopharmacology) 2009, Istanbul, Turkey; 23nd ECNP Congress (European College of Neuropsychopharmacology) 2010; Международной конференции «Молекулярная биология - медицине» Киев, Украина, 2011; V — VII московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва 2009,2012,2013; XXVIII (91) сессии общего собрания РАМН (2013).

Личный вклад автора заключается в подготовке и проведении экспериментальных исследований и анализе полученных результатов. Результаты, представленные в диссертации, получены либо лично автором, либо под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы в российских и зарубежных научных журналах, результаты диссертации включены в монографию «Мо-ноююнальные антитела к нейроспецифическим белкам» Москва, Медицина, 2007.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 320 страницах; состоит из введения, 8 глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В основных главах работы приведены: обзор литературы, материалы и методы исследования, главы 3 — 7 посвящены результатам собственных исследований; глава 8 — обсуждению полученных результатов.

Диссертация иллюстрирована 104 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Методы получения и очистки нативных мембранных белков и рекомбинантных внеклеточных фрагментов белков

В основу модификаций приготовления препаратов мембранных белков ЭЦМ была положена методика Lidinsky. (1983). Протокол очистки мембранных белков включал гомогенизацию, фильтрацию через нейлоновые сита 360-160 мкм, центрифугирование в ступенчатом градиенте декстрана, осмотический лизис клеток, соллюбилизацию в детергентах.

Дизайн рекомбинантных внеклеточных фрагментов BSAT1, Сх43 и VEGFR1 (sFIt) а также рекомбинантного VEGF проводили с помощью программ DNAStar и Vector NTI (Invi-trogen). Мембранную топологию анализировали с помощью программ НММТОР, ТМНММ, TMPred (www.expasy.org) (Таблица 1).

Таблица 1. Характеристика полученных рекомбинантных белков

Название Физ.-хим. свойства Экспр. вектор Праймеры Эндонукл. рестр. Белок слияния

BSAT1 451-557а. о. Наиболее крупный внеклеточный фрагмент BSAT, 108 а.о., 11,6 кДа, р! 8 PQE30 5'-AGCTGGATCCTGTGAAA-ATTCCAGTGTGGCC-3'; V-AGTCAAGCTTAGAAATACAGA-AACATTTGGGA-5' BamHI, HindlII

Коннек-син 43 J73. 208а-0 Вторая внеклеточная петля Е2, 36 а.о„ M.w. 4.28 кДа, pl = 7,87; pCBDQ, pHPML' 5-GATCAGATCTCAGTGGTA-CATCTATGGGT-3'; З'-GATC-AAGCTTAGATGGTTTTCT-CCGTGGGAC-5' BgUI, HindlII CBD- домен; HPML-домен

VEGFR1 1 51-421 а.о. 2-4 Ig-подобные внеклеточные домены (sFlt-b-í)-M.w. 50 КДа. рЕТ32а 5'-GCATCCATGGTCAGCTAC-TGGGACAC-3', З'-GCATAGAT-CTTAGAGTGGCAGTGAGGT-TTT-5' Ncol, BglII

VEGF.6, Полноразмерный секрети-руемый белок. M.w. 23 КДа. pQE60 5'-GCATGAATTCATGAACITTC-TGCTGTCTTGGG-3', 3'-GCATCTCGAGCCGCCTCGGCTT -GTCACATC-5' EcoRI, Xhol тио-редок-син (trx)

Полученными плазмидными ДНК трансформировали клетки E.coli SG13009 (Qiagen). Продукцию рекомбинантных белков осуществляли в стандартных условиях (среда LB, 37°С, индукция 100 мкМ изопропил b-тиогалактозидом, продукция в течение 4 часов). Очистку полученных рекомбинантных внеклеточных фрагментов белков проводили в денатурирующих условиях на Ni-NTA-агарозе (Invitrogen) по протоколу, рекомендованному фирмой Qiagen. Для определения молекулярной массы и оценки чистоты полученных препаратов белков применяли диск-электрофорез в полиакриламидном геле в модификации Laemmli (1970). Идентификацию полученных антител проводили с помощью иммуноблот-тинга на PVDF мембране (Millipore) с хем«люминесцентной визуализацией (ECL advance, GE Healthcare).

1 Плазмидные векторы, разработанные на базе вектора рРЕЗО Р.И. Дмитриевым (От^пеу М, 2007), содержащие нуклеотидную последовательность СВО и НРМЬ доменов Са-АТФазы человека РМСА4Ь

Методы получения и анализа моноклональных антител Монокпональные антитела получали по технологии Köhler G. и Milstein С.

(1975) с некоторыми модификациями. Очистку моноклональных антител из асцита проводили с помощью аффинной хроматографии на агарозе с иммобилизованным белком G (Invitrogen) по протоколу фирмы-изготовителя. Изотипирование полученных моноклональных антител проводили с помощью набора IS02 (Sigma-Aldrich) в соответствии с рекомендациями производителя. Определение коэффициента аффинности проводили по методу, предложенному J.D. Beatty и соавт (1987). Биотинилирование моноклональных антител проводили с помощью набора ProtOn (Vector Lab, USA) по протоколам производителя. Для проведения экспериментов по биораспределению моноклональные антитела метили 1251 с помощью Иодогена по протоколу Salacinzki, P.R.P. (1981). При проведении экспериментов с флюоресцентной визуализацией очищенные моноклональные антитела метили флюоресцентными красителями серии Alexa Fluor (Invitrogen, USA) по протоколу производителя.

Иммуноцитохимический анализ проводили на фиксированных и живых клетках низ-кодифференцированных глиом крысы (С6, 101/8) и человека (U87, U251), а также фиксированных 4% параформальдегидом астроцитах и фибробластах крысы. Иммуногистохимиче-ский анализ проводили на срезах головного мозга и органов крысы. При иммуноперокси-дазной визуализации в качестве вторых антител применяли меченные пероксидазой иммуноглобулины козы А-9917 или А-3682 (Sigma Aldrich), либо биотинилированные иммуноглобулины лошади ВА-2000 (Vector Labs) и комплекс авидин-биотин-пероксидаза (АВС-Vectastain Elite, Vector Labs). При многоцветной иммунофлюоресцентной визуализации в качестве вторых антител применяли коктейли анти-мышиных IgG козы, меченных Alexa Fluor 488 (Invitrogen) и анти-кроличьих IgG козы, меченных Alexa Fluor 633 (Invitrogen).

Результаты иммунофлюоресцентного анализа регистрировали с помощью флюоресцентного микроскопа Leica DMI6000 и сканирующего лазерного конфокального микроскопа Nikon Al.

Методы работы с культурами клеток

Цитотоксичность наноконтейнерных препаратов (липосомы и наногели) оценивали на культурах клеток с помощью MTS реагента (Invitrogen) по протоколу фирмы-производителя. Для флюоресцентной визуализации клеток после стереотаксической имплантации в мозг крысы их метили Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit (Invitrogen) или Dil (Invitrogen) по протоколам фирм производителей.

Исследования функций щелевых контактов проводили по методу Goldberg и соавт (1995) с двойным флюоресцентным мечением. Для этого в монослойную культуру добавля-

ли ЮмкМ Calcein AM и 5мкМ Dil в бессывороточной среде DMEM F12. Затем клетки отмывали, суспендировали и добавляли к диссоциированным немеченым клеткам в соотношении 1:100. Качественно передачу Calcein AM регистрировали с помощью флюоресцентного микроскопа Leica DMI6000 и лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 STED

Исследование биологической активности антител и рекомбинантных функционально активных белков in vitro проводили с помощью теста восстановления монослоя на клетках глиомы Сб. Для этого в культуре со 100% конфлюэнтностью линейно повреждали монослой, после чего в ростовую среду добавляли исследуемые антитела или рекомбинантные белки и восстановление монослоя регистрировали в автоматическом режиме с помощью инвертированного микроскопа DMI 6000, оборудованного боксом для прижизненной микроскопии клеточных культур.

Методы синтеза и анализа наноконтейнерных систем Векторные stealth-липосомы готовили по методике Kamps и соавт (2000), модифицированной в соответствии с задачами конкретного эксперимента. Наногели из диблок-сополимеров полиэтиленгликоль-Ь-полиметакриловая кислота (PEG-b-PMA) синтезировали по методике Н.В. Нуколовой (2010).

Моделирование глиобластомы и In vivo визуализация

Для воспроизведения ортотопической модели мультиформной глиобластомы человека на крысах выполняли стереотаксическую имплантацию в стриатум клеток аллогенных клеток глиомы С6 и 101/8.

MP-исследование производилось на MP-томографах Biospec и ClinScan фирмы Bruker с напряжённостью поля 7Т. Волюмометрия (количественная оценка объёма) глиобластомы в динамике производилась с помощью программного пакета ImageJ (Wayne Rasband, NIMH, USA) по Т2 взвешенным изображениям.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и характеристика моноклональных антител к AMVB1

Иммунизация мышей препаратами нативных мембранных белков с последующей процедурой слияния их плазмоцитов с клетками миеломы SP2/0 и скрининга антитело-продуцирующих гибридом позволили получить нескольких клонов гибридных клеток, продуцирующих антитела к белкам ЭЦМ, в числе которых был клон, обозначенный нами 2В6, распознающий специфический антиген аблюминальной мембраны эндотелиоцитов, названный нами AMVB1.

Иммуногистохимический анализ очищенного препарата МАЬ2В6 показал, что они высокоаффинно связывались с антигеном эндотелиоцитов церебральных микрососудов, преимущественно содержащемся в микрососудах мозжечка (Рис. 1). Константа аффинности МАЬ2В6 составила 1,5x10"9 М"1.

Рис. 1. Иммунопероксидазный анализ эндотелиального антигена АМУВ1 с помощью моноклональ-ных антител 2В6 на срезах мозга крысы. А. Кора мозжечка. Б. Кора больших полушарий. Увеличение *50.

Иммуногистохимическое исследование тканевой специфичности МАЬ2В6 на срезах печени, лёгких, селезёнки, почки, сердца показало, что экспрессия антигена, специфичного для МАЬ2В6 помимо мозга, наблюдается в микрососудах, локализующихся в слизистой и мышечной оболочках крупных бронхов и белой пульпе селезёнки.

Для визуализации структур ГЭБ (эндотелиоциты, астроциты) с помощью МАЬ2В6 и моноклональных антител к ОБАР нами был разработан метод комбинированного имму-нопероксидазного окрашивания, заключающийся в последовательной обработке срезов двумя видами первичных и вторичными антителами. При этом иммунохимическую реакцию, обусловленную МАЬ №1, визуализировали субстратной смесью с диаминобензидином (коричневое окрашивание), а реакцию МАЬ №2 —смесью с диаминобензидином и хлоридом кобальта (синее окрашивание). Последовательное выполнение этих протоколов с блокированием пероксидазной активности после первого этапа окрашивания позволило получить высокоспецифическое двойное окрашивание (Рис. 2).

В дальнейшем мы повторили двойную визуализацию АМУВ1, ЕВА и вРАР, применив два вида МАЬ: 2В6 и 8МГ71 (81егпЬе^ег 1пс), поликлональные антитела к СИ АР, флюоресцентные вторичные антитела и сканирующую лазерную конфокальную микроскопию (Рис. 3, Рис. 4).

Рис. 2. Двойное иммуно-пероксидазное окрашивание церебральных микрососудов и астро-цитов. Увеличение

1x400

1 лр •

^ *

>*> т"

V ' ■ ^^

Рис. 3. Двойная иммунофлюо-ресцситиая визуализация

АМУВ1 и ОРДР с помощью МАЬ2В6 и антител к СТАР.

Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия. Отрезок 20 мкм.

Для исследования субклеточной локализации выполняли сканирующую лазерную конфокальную микроскопию АМУВ1 и ЕВА и определяли их положение относительно докрашенного ЭАР1 ядра. Этот простой анализ показал, что ЕВА локализован на люминаль-ной (внутренней по отношению к ядру) мембране, в то время как АМУВ1 в эндотелиоцитах локализован на внешней, по отношению к ядру, то есть на аблюминальной мембране (Рис. 4).

А. Общий вид ЕВА-позитивных церебральных микрососудов (Увеличение х400). Б. В. Увеличенное (х640) изображение церебральных капилляров. Визуализируется люминальная мембрана эндо-телиоцитов. Г. Двойная иммунофлюорес-ценция ЕВА (красная флюоресценция) и вРАР (зеленая флюоресценция). Д,Е. Субклеточная локализация эндотели-ального антигена АМУВ1 по данным сканирующей лазерной конфокальной микроскопии

^ V г— ,—N НЕ

>ро в| в Т. Я / А-

л ^ р Б.

Рис. 4. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия ЕВА и вГАР на срезах мозга крысы.

Экспрессия AMVB1 в небарьерных эндотелиоцитах микрососудов селезенки и локализация этого антигена на аблюминальной мембране позволила нам сделать вывод, что, несмотря на его присутствие в церебральном эндотелии, он не ассоциирован напрямую с функциями ГЭБ. Аблюминальная локализация данного белка делает возможным его применение только при доставке через патологический ГЭБ, когда нарушен эндотелиальный барьер и белки из кровотока могут достигать аблюминальной мембраны.

Цереброспецифический анионный транспортер BSAT1

В результате анализа первичной структуры, физико-химических свойств и мембранной топологии BSAT1 крысы для клонирования и экспрессии был выбран наиболее крупный внеклеточный фрагмент (451 — 557 а.о.; 108 а.о., 11,6 кДа, pl 8). Иммунизация мышей Balb/c рекомбинантными препаратами BSAT1 и последующее применение гибри-домной технологии позволили получить моноклональные антитела, селективно распознающие белок-мишень в иммунофермептном анализе и в иммуноблоттинге.

Тканевую и органную специфичность полученных моноклонапьных антител к BSATI451.557 исследовали в иммунофлюоресцентном анализе на вибротомных срезах нормального мозга, печени, почек, селезенки, сердца и яичников крысы. Иммуноцитохимиче-ский анализ проводили на фиксированных препаратах монослойных культур астроцитов, НЕК293, HUVEC и глиомы Сб. Было обнаружено, что полученные антитела не распознают гомологов ОАТР в печени, почках, селезенке, легком и сердце. На срезах яичников экспрессия BSAT1 была обнаружена в примордиальных фолликулах. На срезах мозга методом двойного иммунофлюоресцентного окрашивания с помощью моноклональных антител к BSAT1 было обнаружено, что иммунофлюоресценция BSAT1 в нормальной нервной ткани локализуется как в эндотелиальных клетках, так и в GFAP-положительных астроцитах. При иммуногистохимическом исследовании срезов мозга, содержащих глиальные опухоли С6 и 101/8 мы также обнаружили экспрессию BSAT1 как в клетках перитуморальной области, так и в очаге глиомы. В культуре клеток НЕК293, синтезирующих белки плотных контактов Z01 и окклюдин, экспрессия BSAT1 выявлялась преимущественно в мембранных структурах (Рис. 5), при этом наблюдалась частичная колокализация BSAT1 и окклюдина (Рис. 5Д). В этих же клетках сигнал BSAT1 точно колокализовался с мембранным треккером Dil.

Рис. 5. Двойной иммунофлюорес-центный анализ BSAT1 и белков плотных контактов в культуре клеток НЕК293. А., Д. - Результирующее изображение. Б,Е. — ядра, докрашенные DAPI. В.Ж. -иммунофлюоресценция BSAT1. Г.

- иммунофлюоресценция ZOl. 3. Иммунофлюоресценция окклю-дина. А-Г — увеличение х200. Д —3

— увеличенный фрагмент, отрезок 4 мкм.

Таким образом, в результате исследования были получены моноклональные антитела к BSAT1, распознающие как белок-антиген в иммуноблоттинге, так и нативный белок, локализующийся в клетках, образующих ГЭБ. Органная специфичность полученных антител ограничивается мозгом и яичниками, что соответствует имеющимся в литературе данным по экспрессии BSAT1/OATP-D в органах и тканях. Колокализация сигнала от антител к BSAT1 с Dil и сигналами белков плотных контактов свидетельствует о мембранной локализации антигена, выявляемого полученными антителами.

Белок щелевых контактов коинексин 43

В результате клонирования вставки, содержащей последовательность Е2 внеклеточного фрагмента Сх43 в векторы pCBDQ и pHPML и последующей трансформации E.coli были созданы два штамма, продуцирующих химеры Е2 Сх43 с N-концевыми полипептидами CBD и HPML соответственно. Очищенные препараты внеклеточного фрагмента Сх43 применялись для иммунизации мышей в процессе получения моноклональных антител. Путём многоэтапного скрининга и последовательных процедур реклонирования позитивных гибридом было получено 3 клона, обозначенных: 3F4, 7F4 и С9Н12. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия с помощью полученных моноклональных антител к Сх43 и по-ликлональных антител к астроглиальному маркеру GFAP на срезах мозга крысы с экспериментальной глиомой С6 позволила визуализировать Сх43 на GFAP-положительных реактивных астроцитах в области перитуморапьного вала (Рис. 6).

Рис. 6. Иммунофлюорес-центная визуализация

Сх43-положительных аст-роцитов с помощью мо-ноклональных антител к внеклеточному фрагменту Е2 Сх43.

Зеленая флюоресценция — МаЬСх43+ антимышиные IgG с Alexa Fluor 488 (Invitrogen); красная флюоресценция — поликлональные антитела к GFAP + антикроличьи IgG с Alexa Fluor 594 (Invitrogen). А. Общий вид астроцитарно-го вала вокруг глиомы. Метка = 50 мкм.

Б. Фрагмент астроцитарного вала. Метка = 20 мкм.

Для оценки клеточной и видовой специфичности очищенные моноклональные антитела к Сх43 тестировали в иммунофлюоресцентном анализе на препаратах различных клеточных культур. Было обнаружено, что полученные антитела не обладают видовой специфичностью и выявляют нативный Сх43 как в культурах клеток крысы (нормальные аст-роциты, клетки глиомы С6), так и в культурах клеток человека (клетки глиобластомы Ш51 и эмбрионального почечного эпителия НЕК 293) (Рис. 7).

Результаты иммуногистохимического анализа тканевой и органной специфичности с помощью полученных антител показали, что в печени, селезёнке, легких, почке МАЬЕ2Сх43 почти не визуализировали Сх43 позитивные клетки. Единичные положительные клетки обнаруживались по периферии почечных клубочков. Согласно данным литературы и базам данных белков (уу\у\у.ип1рго1.огц). помимо астроцигов головного мозга, высокая экспрессия гена Сх43 наблюдается в кардиомиоцигах, поэтому мы ожидали обнаружить интенсивный иммунофлюоресцентный сигнал при окрашивании срезов сердца. Однако, на вибротомных срезах сердца, окрашенных по классическому иммуногистохимическому протоколу, отчётливой визуализации коннексонов не наблюдалось, вероятно, вследствие сте-рического экранирования Е2-фрагмента в димеризованных коннексонах.

А., Б. Культура астроцитов из мозга новорожденных крысят. Красная флюоресценция — поликлональные антитела к GFAP; зеленая флюоресценция

— МАЬ Сх43. Ядра клеток — DAPI (Invitrogen). В. Глиома С6 крысы. Красное — ß-Катенин (Zymed), зеленое — МАЬ Сх43 Г. Эмбриональный почечный эпителий (НЕК 293). Красное — пан-Кадгерины (Zymed), зеленое — МАЬ Сх43. Д. Глиобластома U251 человека. Синяя флюоресценция

— МАЬ Сх43+антимышиные IgG с Alexa Fluor 350 (Invitrogen). Оранжево-красная флюоресценция — актиновые филаменты, окрашенные Phalloidin TRITC (Fluka). Ядра клеток — TOTO 633 (Invitrogen). А. — Д. Культуры, фиксированные параформальдегидом. Е. Визуализация Сх43 на живой культуре глиомы С6 (зеленая флюоресценция). Ядра клеток докрашены TOTO 633. Увеличение х 1 ООО.

Рис. 7. Иммунофлюоресцентный анализ на культурах клеток с помощью антител к внеклеточному фрагменту Е2 Сх43.

Водорастворимая форма VEGFR1 (sFltl) и VEGF1(¡4

Основной идеей клонирования растворимой изоформы VEGFR1 было создание

функционально активной «ловушки» VEGF для разработки антиангиогенной терапии низ-кодифференцированных глиом. Как известно, существует три тирозинкиназных рецептора, связывающихся с VEGF, причем самое прочное взаимодействие наблюдается между VEGF и VEGFR-1 (Flt-1) [Ferrara N., 2004; Wu F., 2010]. Для создания рекомбинантной ловушки VEGF мы клонировали в прокариотический вектор pQE60 нуклеотидную последовательность 2-4 Ig-подобных доменов (sFlt-2-4), функцией которых считается связывание с лиган-дом [Barleon В., 1997]. Рекомбинангный VEGF164 крысы получали, решая две параллельные задачи. Первой задачей было получение белка-мишени для создания моноклональных антител и последующей адресной доставки в VEGF-позитивные опухолевые микрососуды, а также разработки новых антиангиогенных средств. Вторая задача: получение лиганда для оценки функциональной активности рекомбинантного sFltl2-4- В результате иммуноблот-тинга с коммерческими антителами к VEGF и VEGFR1 оба очищенных препарата sFlth^ и VEGF/trx (белок слияния VEGF 164 с тиоредоксином) показали иммунохимическую идентичность нативным белкам.

При получении моноклональных антител к VEGF была применена та же система скрининга гибридом, что и при получении антител к BSAT1 и Сх43. Полученные монокло-нальные антитела к VEGF хорошо визуализировали нативный димер и несколько слабее — 16

мономер VEGF и гораздо слабее — рекомбинантный белком слияния VEGF^/trx. Эти результаты позволяют предполагать, что полученные нами антитела к VEGF преимущественно взаимодействуют с нативным димером VEGF наиболее распространенной функциональной активной изоформы этого белка.

Б. Глиобластома U251 человека. В. НЕК293. Г. Позитивный контроль: моноклональные антитела к VEGF (al316, Abeam) на клетках HUVEC. Вторичные антитела Goat antimouse Alexa Fluor 488 (Invitrogen). A-B — ядра клеток докрашены TOTO 633 (Invitrogen). Отрезок — 20 мкм.

Рис. 8. Иммунофлюорссцентный анализ VEGF с помощью полученпых моноклональных антител. А. Глиома С6 крысы.

Иммунофлюоресцентный анализ показал, что полученные антитела визуализируют цитоплазматический пул VEGF, при этом характерное окрашивание наблюдалось во всех клетках культуры С6 глиомы крысы, U251 глиобластомы человека, HUVEC и НЕК293 (Рис. 8). Окрашивание сетчатых компартментов в перинуклеарной области, наблюдаемое во всех клеточных препаратах, соответствует локализации эндоплазматического ретикулума, в котором происходит биосинтез VEGF.

НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕРЕЗ ПОВРЕЖДЕННЫЙ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР

В поисках адекватного вектора для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в очаг интракраниальной глиомы все полученные нами моноклональные антитела тестировали на модели мультиформной глиобластомы у крыс, вопроизведен-ной как описано ранее [Chekhonin et al, 2007]. Иммуногистохимический анализ AMVB1, BSAT1, Сх43 и VEGF показал экспрессию белков-мишеней как в самих глиомных клетках (Сх43, VEGF), так и в неопластических микрососудах (AMVB1, BSAT1).

Эксперименты по биораспределению моноклональных антител были разделены на несколько этапов. На первом этапе оценивались антитела AMVB1 и полученные ранее в нашей лаборатории антитела к GFAP. В процессе этих исследований, мы проанализировали

биораспределение специфических и неспецифических антител в динамике, отдельно оценивая временные интервалы через 6, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после внутривенного введения. Было обнаружено, что, вследствие дефекта эндотелиального барьера в глиоме, результаты накопления специфических и неспецифических антител в первые сутки различаются незначительно. Поэтому, при планировании экспериментов следующих этапов с антителами к В8АТ1 и Сх43, были выбраны две временные точки, соответствующие наибольшему накоплению специфических антител: 48 и 72 часа.

Кинетика 1251-меченых антител в крови наиболее точно описывалась логарифмической функцией (Я2 = 0,97 — 0,99) и была схожей для всех трёх видов исследованных антител. Оценка радиоактивности в образцах, печени, селезенки, почки, сердца и лёгкого в течение 96 часов показала отсутствие существенных различий в накоплении специфических антител и неспецифических иммуноглобулинов. Во всех органах отмечалась тенденция к элиминации указанных антител на поздних сроках после введения. В отличие от других антител, антитела к АМУВ1 в большом количестве накапливались в селезенке (до 1,7% введенной дозы на 1 г сырого вещества).

При анализе радиоактивности препаратов мозга было обнаружено, что в интактном (контралатеральном) полушарии вплоть до 72 часов после введения накопление меченных 1251 специфических и неспецифических антител не превышает 0,01% введенной дозы. Такое значение радиоактивности можно трактовать, как неспецифический фон, обусловленный остаточной радиоактивностью следов крови, неизбежно остающихся после перфузии.

В пораженном (ипсилатеральном) полушарии было зарегистрировано повышенное проникновение из кровотока как неспецифических, так и всех трех видов специфических антител. Содержание неспецифических 1£Ст в ипсилатеральном полушарии через 6 часов после введения было в 23,8 раза больше, чем в интактном контралатеральном (0,05±0,01%1.с1/§ и 0,002±0,0005%Ы./§ соответственно; М±а, р < 0,05), что, вероятно, являлось следствием дефекта гематоопухолевого барьера. Максимальное содержание ^Стт в пораженном полушарии наблюдалось спустя 48 часов после введения и достигало 0,09±0,02%/г. Однако, в дальнейшем происходила элиминация неспецифических антител из мозга, и к концу наблюдения (96 часов) их содержание в ипсилатеральном полушарии составляло 0,03±0,01%/г (М±ст).

Радиоактивность полушария с глиомой у крыс после введения антител к вРАР на ранних сроках эксперимента (6-48 часов) была в 1,2 — 2 раза выше, чем в контроле и в среднем в 18,9 раза выше, чем в контралатеральном полушарии. Спустя 48 часов после введения антител к ОБАР, в отличие от контрольных иммуноглобулинов, мы наблюдали достоверный рост показателя радиоактивности ипсилатеральной гемисферы мозга. Через 96 18

часов после введения накопление антител к GFAP в пораженном глиомой полушарии достигало 0,17 ± 0,02%i.d/g (М±ст), что в 5,7 раза выше аналогичного показателя в контроле (IgGm). Отношение радиоактивности пораженного полушария к интактному на поздних сроках после введения антител к GFAP составляло 26,8 (72 ч.) и 24,3 (96 ч.) что также достоверно выше этого же коэффициента для IgGm (7,1 и 6,7 для 72 и 96 часов соответственно).

Радиоактивность ипсилатеральной гемисферы мозга крыс, получивших инъекцию антител к AMVB1, до 48 часов наблюдения достоверно не отличалась от контроля. Однако через 72 и 96 часов отмечался рост показателя накопления моноклональных антител 2тВ6, который составил 0,07 ± 0,01%i.d/g и 0,12 ± 0,02 %i.d/g соответственно (М±а). Последний показатель был в 4 раза выше, чем аналогичный в контроле и в 24,0 раза выше, чем радиоактивность контралатерального полушария на этом же сроке.

При введении меченных l25I MAb BSAT1 радиоактивность ткани глиалыюй опухоли через 48 часов после инъекции достигала 0,261 ± 0,064 % введенной дозы/г. В параллельном контрольном эксперименте с IgGm этот показатель составил 0,095 ± 0,014 % введенной дозы/г. Кроме того, аналогичное накопление MAb BSAT1 по сравнению с IgGm наблюдалось в яичниках (0,259 ± 0,025 и 0,106 ± 0,007 % введенной дозы/г соответственно). Таким образом, было показано трехкратное по сравнению с контрольными IgGm и более чем 25-кратное, по сравнению с интактным полушарием мозга накопление меченных |251 антител к BSAT1 в глиоме.

У крыс, получивших специфические антитела к Е2 Сх43, в пораженном глиомой полушарии через 48 часов мы наблюдали накопление радиоактивности в размере 0.27 ± 0.01% введенной дозы на грамм сырого вещества (Рис. 9). Это более чем в 50 раз выше, чем значение радиоактивности в нормальной ткани мозга и почти в пять раз выше, чем аналогичное накопление в опухоли контрольных неспецифических IgG мыши. Удельная радиоактивность пораженного глиомой полушария при введении 1251-МАЬЕ2Сх43 превышала аналогичный показатель, наблюдаемый нами ранее при внутривенном введении крысам с глиомой меченных 1251 моноклональных антител к AMVB1 и GFAP.

Проведенные эксперименты с радиоактивно меченными антителами к AMVB1, GFAP, Сх43 и BSAT1 позволили сделать вывод о специфическом связывании указанных моноклональных антител с антигенами-мишенями в зонах патологического повышения проницаемости ГЭБ, что обуславливает накопление вводимых антител в ткани внутримоз-говой глиомы Сб.

экстракраниальной глиомой через 48 часов после

0.300

внутривенного введения.

По оси ординат: % радиоактивности от введенной дозы

0.250

0.200

0.150

0.050

0.100

на 1 г сырого вещества, р < 0,05.

о.ооо

■ MabCx43 IgGm

Рис. 9. Распределение меченных |251 моноклональных антител к вне-

клеточному фрагменту Сх43 в организме крыс с экспериментальной

Адресная доставка в перитуморальную зону глиомы С6 флюоресцентно меченных моноклональных антител

Наряду с экспериментами по биораспределению радиоактивно меченных моноклональных антител, позволяющих количественно оценить накопление, для исследований клеток-мишеней, захватывающих антитела, введенные в кровоток, мы применили мечение флюоресцентными метками Alexa Fluor 660 и Alexa Fluor 488 (Invitrogen) MAb E2Cx43-Alexa Fluor® 660

Применение MAb Cx43, конъюгированных с Alexa Fluor 660, позволило визуализировать клетки, в которых происходит накопление этих антител. Через 48 часов после внутривенного введения антител с флюорофором специфическая флюоресценция в клетках глиомы и перитуморальной зоны была обнаружена у всех экспериментальных животных. Поскольку одной из мишеней для моноклональных антител к Сх43 являются Сх43-положительные реактивные астроциты, после приготовления срезов мозга экспериментальных крыс мы проводили их дополнительную иммунофлюоресцентную визуализацию с помощью поликлональных антител к специфическому астроглиальному маркеру — GFAP (Рис. 10), Это исследование подтвердило, что введенные внутривенно антитела к Сх43 накапливаются преимущественно в перитуморальной зоне, там, где глиомные клетки контактируют с клетками астроглиального вала, окружающего опухоль (Рис. 10В).

Результаты исследования колокализации антител к Сх43 и GFAP подтвердили, что эти антитела, частично, захватываются реактивными астроцитами глиального перитумо-рального вала (Рис. 11, желтые стрелки), однако большая часть клеток, визуализированных после внутривенного введения MAb Е2 Сх43, GFAP-негативны (Рис. 11, голубые стрелки).

С учетом локализации этих клеток в перитуморальном астроглиальном вале и их веретено-видной формы можно предполагать, что эти клетки могут происходить из двух источников: а) быть Сх43-позитивными астробластами, дедифференцироваиными из астроцитов организма хозяина по действием сигналов из патологического очага; б) быть Сх43-позитивными клетками глиомы, мигрировавшими в перитуморальную зону.

и поликлональных антител к GFAP ex vivo. А. Иммунофлюо-ресценция на срезах с помощью антител к GFAP. Б. Прижизненно визуализированные с помощью антител к Сх43-А1еха Fluor 660 клетки. В. Объединённое изображение. Г. Отрицательный контроль (внутривенное введение меченных Alexa Fluor 660 неспецифических антител). Отрезок — 50 мкм.

Рис. 10. Двойнаи визуализация клеток перитуморалыюго аст-роглиального вала с помощью MAb Е2 Сх43, введенных in vivo,

MAb BSAT1-Alexa Fluor® 660

С целью достоверно локализовать накопление меченых антител к BSAT1 в глиом-ных клетках, а не в неопластических микрососудах или в реактивных астроцитах, окружающих опухоль, мы предприняли эксперимент с предварительным мечением глиомных клеток непосредственно перед имплантацией в мозг с помощью мембранного трейсера Dil. Несмотря на «разбавление», обусловленное клеточным делением, опухолевых клеток, такая метка позволяла надёжно идентифицировать опухолевые клетки в течение двух недель после имплантации. В результате этого эксперимента было достоверно показано, что меченные Alexa Fluor 660 MAb BSAT1 накапливаются в Dil-позитивных клетках глиомы (Рис. 12). Наиболее интенсивный флюоресцентный сигнал от MAb BSAT1 ограничивался пределами глиомы. Однако, в перитуморальной зоне также наблюдался захват антител к BSAT1 опухолевыми клетками (Рис. 12Б - Д). Флюоресценции клеток в канале Alexa Fluor 660 на срезах мозга крыс с глиомой, получивших неспецифические иммуноглобулины, не наблюдалось.

Рис. II. Анализ колокализации введенных внутривенно MAb Е2 Сх43 с Alexa Fluor 660 (пурпурная флюоресценция) и GFAP реактивных астроцитов (зеленая флюоресценция). Желтыми стрелками показаны GFAP и Сх43- позитивные клетки, Синими стрелками показаны GFAP-негативные Сх43-позитивные клетки. Увеличение х 630

MAb VEGF-Alexa Fluor® 488

При иммуногистохимическом анализе срезов мозга с глиомой С6 наиболее яркий флюоресцентный сигнал VEGF совпадал с границей глиомы. Это подтверждает известный факт о повышении экспрессии VEGF и приоритете VEGF-зависимого ангиогенеза в низко-дифференцированных глиомах и ещё раз свидетельствует о схожести процессов опухолевой прогрессии глиомы С6 и мультиформной глиобластомы.

Рис. 12. Иммунофлюоресцентный анализ BSAT1 с помощью первично меченых моноклональных антител, введенных внутривенно крысам с DÏI+ глиомой. А.

Общий вид глиомы. Желтая флюоресценция: Dil; красная флюоресценция - MAb BSAT1, меченные Alexa Fluor 660. Увеличение *200. Б-Г - увеличенный фрагмент, показывающий Dil-позитивные клетки глиомы, связавшие, MAb BSAT1 в перитумораль-ной зоне. Б. Объединенное изображение, В. Ядра клеток, окрашенные DAPI, Г. Dil, Д. MAbBSATl-Alexa Fluor 660. Отрезок - 20 мкм. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия.

Спустя сутки после внутривенного введения MAb VEGF-Alexa 488 была обнаружена специфическая флюоресценция, как в опухолевой ткани, так и в периопухолевом пространстве, где визуализировались группы веретеновидных клеток (Рис. 13А). В интактной нерв-

ной ткани специфической флюоресценции, обусловленной МАЬ \TEGF-Alexa 488, не наблюдалось (Рис. 13Б). Внутривенное введение неспецифических иммуноглобулинов приводило к усилению фонового флюоресцентного сигнала в опухоли, однако визуализации каких-либо клеток в глиоме и периглиомной зоне отмечено не было (Рис. 13В). Полученные данные убедительно свидетельствуют о селективном накоплении моноклональных антител к УЕОР в очаге низкодифференцированной УЕОР-зависимой глиомы и в области периглиомной зоны.

Tumor

Рис. 13. Флюоресцентный анализ накопления антител к VEGF меченных Alexa Fluor® 488 после внутривенного введения. А Перитуморальная зона, МАЬ VEGF-Alexa 488; Б. Нормальная нервная ткань, МАЬ VEGF-Alexa 488; В. Перитуморальная зона в отрицательном контроле с IgGm-Alexa 488. (Микрофотографии любезно предоставлены С.А. Шейным).

Резюмируя результаты данного раздела, можно подчеркнуть следующее. Исследования молекулярного состава и проницаемости ГЭБ позволили охарактеризовать основные маркеры функциональной зрелости эндотелиоцитов церебральных микрососудов, которые могут применяться в исследованиях in vitro и in vivo для иммунофеногипирования барьерного эндотелия. Охарактеризован феномен патологической проницаемости эндотелиально-го барьера в неопластических микрососудах низкодифференцированной глиомы Сб. Показана целесообразность и эффективность применения моноклональных антител к мембранным белкам, ассоциированным с эндотелиоцигами церебральных микрососудов и астроци-тами для доставки диагностических и терапевтических средств к клеткам глиомы. Понимание основных механизмов реализации барьерных свойств и регуляции проницаемости ГЭБ для макромолекул может способствовать созданию новых высокоэффективных средств для диагностики и терапии заболеваний центральной нервной системы в целом и нейроонколо-гических заболеваний в частности.

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ КОНТЕЙНЕРНЫХ СИСТЕМ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ К КЛЕТКАМ НИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ГЛИАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ Применение наноконтейнеров, таких как мицеллы, липосомы, наногели и пр. является одним из самых популярных подходов к созданию адресных противоопухолевых препаратов [Torchilin VP, 2009]. В наших исследованиях, посвященных адресной доставке диагностических меток и лекарственных препаратов к клеткам глиомы С6, мы также применили этот подход, использовав в качестве наноконтейнеров ПЭГилированные (stealth) липосомы и наногели. Как известно, оболочка из ПЭГ позволяет пролонгировать фармакокине-тику и облегчает модификацию наноконтейнеров векторными молекулами. В качестве векторов в наших исследованиях по адресной доставке мы применили моноклональные антитела к Сх43, GFAP и VEGF. Для каждого из этих антител была показана высокая селективность по отношению к очагу внутричерепной глиомы. В качестве наноконтейнеров для доставки диагностических меток были выбраны липосомы. Выбор мотивирован тем, что, во-первых, это единственные апробированные в клинике наноконтейнеры, а во-вторых липосомы очень легко и надёжно метятся флюоресцентной меткой (липофильный Dil). Кроме того, липосомы представляются перспективной основой для создания МРТ контрастов, поскольку в их стенку можно встроить большое количество липидов, содержащих хелатную группу Gd-DTPA и, таким образом, сделать липосомы парамагнитными.

Адресная доставка иммунолипосом с флюоресцентной меткой или МРТ-контрастом в очаг экспериментальной глиомы С6 с помощью моноклональных антител к Сх43 и GFAP

Перитуморальная зона со стороны здоровой ткани окружена мощным валом из реактивных астроцитов, в большом количестве продуцирующих GFAP и Сх43. Как отмечалось выше, моноклональные антитела к этим белкам способны накапливаться в перитумо-ральной зоне, там, где гибнет наибольшее количество реактивных астроцитов и высвобождается антиген-мишень. Получив обнадёживающие результаты в экспериментах in vitro, мы спланировали эксперимент по оценке эффективности доставки ПЭГилированных иммунолипосом на основе моноклональных антител к GFAP и МАЬЕ2Сх43 в перитуморальную зону экспериментальной интракраниальной глиомы in vivo.

Полученные РЕСилированные липосомы характеризовались по диаметру и концентрациям суммарных липидов и белка (в образцах липосом с пришитыми антителами). Диаметр липосом, определенный методом фотодинамического рассеивания, находился в пределах 110 — 140 нм (среднее значение 130 ± 15 нм). Средняя концентрация липидов в полученных липосомальных препаратах составляла 20.5 ±1.1 мг/мл, концентрация антител в го-

товых эмульсиях почти не отличалась, в зависимости от вида антител, и находилась в пределах 0,4 — 0,6 мг/мл.

Флюоресцентный анализ срезов мозга крыс через 48 часов после внутривенного введения иммунолипосом с антителами к Сх43 и к GFAP крысам с экспериментальной глиомой выявил накопление обоих видов иммунолипосом в клетках в области перитумо-рального астроглиалыюго вала. При этом флюоресценция Dil в случае липосом с антителами к GFAP выявлялась в виде мелких внутриклеточных включений, а в случае липосом с антителами к Е2 Сх43 — в виде гетерогенного окрашивания цитоплазмы.

При внутривенном введении иммунолипосом с парамагнитной меткой в виде Gd-DTPA наблюдалось накопление МРТ-контраста в глиоме в случае применения антител к Е2 фрагменту Сх43. Уже через 6 часов после введения таких иммунолипосом наблюдалось заметное повышение интенсивности Т1 сигнала по периферии опухоли (Рис. 14.Е) В результате этого гипоинтенсивная в этом режиме ткань опухоли становилась изоинтенсивной. Вычитание из контрастированного Т1 взвешенного изображения фона (т.е. вычитание пиксельных значений до введения контраста) позволило четко визуализировать накопление иммунолипосом на основе MAb Е2 Сх43 в зоне перитуморалыюй глиомной инвазии (Phc.14F). Введение невекторных липосом, равно как и липосом с неспецифическим вектором не сопровождалось сколь либо заметным накоплением сигнала в пораженном полушарии (Рис. 14.В, С).

В результате проведенных исследований в экспериментах in vivo показано, что полученные наноконтейнерные системы на основе МАЬЕ2Сх43 могут применяться для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов, а также генетического материала в перитуморальную зону низкодифференцированных глиом, туда, где происходит наиболее активная инвазия опухолевых клеток.

Before 30 mm 1 h

Before 6h 24h

ТШ

щ.

Ш ¿Ж

SS о pppjqj • Л *

Before 24h Subtraction

\ V \

Рис. 14. Результаты динамического МРТ-исследования в Т1 режиме. А. Внутривенное введение Gd-DTPA. Наблюдается контрастирование центральных отделов опухоли. В. Введение невекторных липосом. С. Введение иммунолипосом с неспецифическими антителами. Накопление не регистрируется. D. Введение иммунолипосом с антителами к GFAP. Контрастирование перитуморальной зоны недостаточное. Е. Введение липосом с антителами к Е2 Сх43. Регистрируется отчетливая область повышения интенсивности Т1-сигнала по периферии опухоли. F. Результаты попиксельного вычитания "фона" до введения контраста: регистрируется

накопление иммунолипосом в перитуморальной зоне.

Адресные иммунолипосомальные системы на основе моноклональных антител к VEGF

В экспериментах с адресной доставкой ПЭГилированных флюоресцентно-меченых иммунолипосом в очаг низкодифференцированной глиомы С6 наиболее показательные результаты были получены при применении в качестве вектора моноклональных антител к VEGF (Рис. 15).

При введении невекторных липосом, флюоресценция визуализировалась преимущественно в сосудах и в перивазальных пространствах, где, вероятно, происходила пассивная экстравазация, обусловленная дефектом эндотелиального барьера (Рис. 15А). В случае иммунолипосом с неспецифическим вектором (IgGm) флюоресценция опухолевой ткани была 26

более выражена. Как и в первом случае, визуализировались сосуды и участки экстравазации (Рис. 15Б). Более интенсивную флюоресценцию в опухоли при введении липосом с IgGm можно объяснить неспецифической сорбцией IgGm. Кроме того, нельзя исключить связывание таких иммунолипосом с рецепторами к Fc-фрагменту и другими антитело-связывающими поверхностными белками. Также как в случае липосом без антител, дефект ГЭБ способствует пассивной диффузии липосом с IgGm в глиому.

Рис. 15. Флюоресцентный анализ меченых Di! иммунолипосом, векторизованных антителами к VEGF на срезах головного мозга с глиомой С6 через 48 часов после внутривенного введения. А

- ПЭГилированные липосомы. Б - ПЭГилирован-ные липосомы, конъюгированные с неспецифическими IgGm В - селективное накопление в опухоли ПЭГилированных липосом конъюгированных с моноклональными антителами к VEGF. Панорамная съёмка на микроскопе Leica DMI6000B с объективом >' 1О

Наиболее яркая флюоресценция в пределах опухоли наблюдалась в случае иммунолипосом с MAb VEGF. Данный феномен был выявлен у всех животных, получивших липосомы с MAb VEGF (Рис. 15В). Это свидетельствовало о селективном накоплении векторных иммунолипосом в опухоли.

Визуализация периглиомного астроцитарного вала на срезах мозга крыс, получивших иммунолипосомы, с помощью антител к GFAP показала, что в перитуморальной зоне, где присутствуют как интенсивно мигрирующие глиомные клетки, так и GFAP-позитивные реактивные астроциты, захват иммунолипосом с MAbVEGF осуществляется и первыми и вторыми клетками (Рис. 16).

Таким образом, модификация ПЭГилированных липосом антителами к VEGF позволяет добавить к пассивному компоненту доставки активный, обусловленный специфическим взаимодействием иммунолипосом с антигеном-мишенью, презентированным на опухолевых клетках. Известно, что вследствие патологического строения сосудистой сети, высокого внутричерепного давления и развития отека, поступление в опухоли мозга терапевтических агентов затруднено. Добавление векторной молекулы в виде моноклонального антитела способствует кратному повышению эффективности доставки наноконтейнеров в опухолевую ткань с нарушенным ГЭБ. Подобный подход, основанный на высокоселектив-

ной доставке наноконтейнерных систем векторного типа, может повысить эффективность терапии солидных опухолей, в том числе высокоагрессивных и резистентных глиом.

Рис. 16. Двойной иммунофлюоресцентный анализ иммунолипосом с MAbVEGF, меченных Dil (красная флюоресценция) и GFAP-позитивных реактивных астроцитов перитуморального астроглиального вала (зелёная флюоресценция). А. Общий вид опухоли и перитуморальной зоны. Граница опухолевой ткани показана линией. Участки накопления векторных иммунолипосом показаны белыми стрелками. Б. Совмещенное изображение В. ядра клеток докрашенные DAPI. Г. Флюоресценция Dil. Д. Флюоресценция GFAP. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия, максимальная проекция. Отрезок 10 мкм.

РАЗРАБОТКА СИСТЕМ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ

ПРЕПАРАТОВ В ОЧАГ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛИОМЫ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К VEGF, BSAT И СХ43

Одной из новейших разновидностей наноконтейнеров для цитостатических препаратов являются биодеградируемые наногели [Kabanov et al, 2009]. Их выбор для наших экспериментов был обусловлен высокой ёмкостью, биосовместимостью, возможностью управлять внутренним объёмом и возможностью модификации поверхности наногелей монокло-нальными антителами к Сх43, VEGF и BSAT1.

Эксперименты по терапии глиомы С6 векторными наноконтейнерными препаратами цисплатина были проведены на 37 крысах с подтвержденной на МРТ глиомой С6 (Таблица 2). Эффективность терапии оценивали по увеличению продолжительности жизни и динамике развития глиомы по данным МРТ у леченных животных по сравнению с контролем.

Медиана выживаемости животных, получивших инъекции растворителя наногелей (5% глюкоза) составила 24 сут (Рис. 17). В группе животных, получивших свободный цисплатин, медиана выживаемости оказалась больше на 6 суток и составила 30 суток (р = 0,5). Вместе с тем, в группе получавшей инъекции свободного цисплатина у животных

наблюдались быстрая потеря веса и выраженное снижение двигательной активности, свидетельствующие о системном токсическом действии цисплатина.

Таблица 2. Суммарные данные по адресной наноконтейнерной терапии глиомы Сб.

Препарат Кол-во животных Дозировка CDDP (мг/кг) Схема терапии (сут. после импл.) МРТ (сут. после импл.) Медиана выживаемости (сут после импл.)

NG 8 5 7-14-21 7, 14,21,28 23

NG-MAb VEGF 5 34

NG-MAb Сх43 5 34

NG-MAb BSAT1 6 24

NG-IgGm 4 21

CDDP 5 30

5% Глюкоза 9 — 24

Обозначения: NG - наногели, загруженные CDDP без специфического вектора; NG-MAb VEGF — наногели, загруженные CDDP, покрытые ПЭГилированными MAbVEGF; NG-MAb Сх43 — наногели, загруженные CDDP, покрытые ПЭГилированными МАЬЕ2Сх43; NG-IgGm — наногели, загруженные CDDP, покрытые ПЭГилированными неспецифическими иммуноглобулинами. CDDP — группа крыс, получивших свободный цисплатин.

Медиана выживаемости животных, получивших инъекции наногелей без вектора и наногелей с неспецифическим вектором составила 23 и 21 сутки соответственно.

Медиана выживаемости в группах крыс, получавших адресные паноконтейнеры составила 23, 34 и 34 суток для наногелей с антителами к BSAT1, VEGF и Сх43 соответственно. Различия были достоверны между группами NG-MAbVEGF/NG-MAbCx43 и плацебо (р < 0,05), также как между векторными наногелями с MAbVEGF, МАЬСх43 и невекторными NG и NG-IgG.

Cumulative Proportion Survtving (Kaplen-MeleO Выживши«

I 07

-NG-IgG

- - NG-MAbCx43

- NG-МАЬВ SAT1

- NG-MAb VEGF

Рис. 17. Кривые выживания Каплана-Мейера животных с глиомой С6, получавших терапию адресными наногелями.

Обозначения те же, что и в Таблице (Таблица 2).

20 25 30 35 40 45 50 55

Морфометрический анализ, проведенный на Т2-взешенных коронарных и аксиальных МРТ-изображениях головного мозга подтвердил эффективность векторной терапии с помощью наногелей с антителами к УЕОБ и Сх43 (Рис.18). Различия в объёме глиомы в

этих группах были достоверны по сравнению с плацебо и группами невекторной терапии на 21 сутки. У крыс, получавших невекторные Ыв и N0 с неспецифическими объём глиомы на этом сроке составлял 309,66±55,73мм3; 371,57±68,25мм3 соответственно. В то время как в группах с векторными наногелями эти показатели были 174,07±30,95 мм3, 210,33±49,83 мм3 и 93,11±26,84 мм3 для МАЬ Сх43, В8АТ1 и УЕОР соответственно. К 26 суткам происходила гибель большинства животных контрольных групп, поэтому статистический анализ не проводили. У выживших животных, получавших N0 без вектора объём глиомы составлял 477,89 ± 45,69 мм3. К 30-м сутками в живых оставались только крысы из групп Ш-МАЬ УЕвР, Ш-МАЬ Сх43 и СОЭР.

После 36 суток в живых осталась только одна крыса, получавшая МО-МАЬСх43, у которой наблюдалась полная регрессия опухоли к 60-м суткам после имплантации.

5% Оехгг

N0-

N3-

N3-N0-

СОЭР

ТПр - X.'™ 1 ' *

Й1

> » 1 ¡^ т

" Г"

; чт )

■ ио ' У '

— —

- "1®

Рис. 18. Динамическая МРТ головного мозга у крыс с глиомой С6, получавших адресную наноконтей-нерную терапию. Обозначения: 5% [^схгг — 5% глюкоза; N0 — невекторные наногели; N0-0x43 - наногели векторизованные с МАЬЕ2Сх43; Ыв-ВВАТ — наногели, векторизованные МАЬВ8АТ1; ЫО-^О — наногели с неспецифическими иммуноглобулинами; N0 -\Т:ОР — наногели, векторизованные МЛЬУР.ОК; СББР — терапия свободным цисплатином. Т2 взвешенные изображения (01т8сап 7Т, Вгикег).

Таким образом, была показана эффективность адресной наноконтейнерной терапии глиомы С6 с помощью цисплатина, заключенного в наногели, векторизованные монокло-нальными антителами к Сх43 и VEGF.

Адресная наноконтеннерная терапия глиомы 101/8

Экспериментальная глиома 101/8 — альтернативная глиоме С6 модель мульти-формной глиобластомы человека, применяемая для разработки и испытания различных терапевтических технологий и характеризующаяся относительно высокой чувствительностью к платина-содержащим цитостатикам [Steiniger SC, Khalansky AS, 2004]. Эксперименты были проведены на 44 самках породы Вистар, которым имплантировали в дно третьего желудочка кусочки опухоли от больной крысы (моделирование выполнялось в НИИ морфологии человека РАМН доктором A.C. Халанским).

Таблица 3. Суммарные данные по экспериментам с адресной наноконтейнерной терапией глиомы 101/8.

Препарат Кол-во животных Дозировка CDDP (мг/кг) Схема терапии (сут. после импл.) МРТ (сут. после импл.) Медиана выживаемости (сут. после импл.)

NG/CDDP 6 5 5-10-15 5, 10, 15, 20 26

MAbBSATl-NG/CDDP 7 5, 10, 15,20, 25 39

МАЬСх43-NG/CDDP 7 5, 10, 15, 20, 25 — 60 42

IgG- NG/CDDP 6 5, 10, 15, 20 20

CDDP 8 5, 10, 15, 20, 25 28

5% Глюкоза 10 — 5, 10, 15 15

Перед экспериментами по терапии образцы мозга крыс с экспериментальной глиомой 101/8 исследовали с помощью рутинных гистологических методов и иммуногнстохи-мического анализа на предмет экспрессии антигенов-мишеней. Гистологический анализ развивающихся интрастриарных глиом в период с 5 по 15 сутки показал все признаки муль-тиформной глиобластомы: полиморфизм клеток, наличие параклеточного отёка, кровоизлияний, центрального некроза, быстро возникающей внутричерепной дислокации. Иммуноги-стохимический анализ показал высокий уровень экспрессии белков мишеней в глиоме 101/8. При этом Сх43 локализовался преимущественно в перитуморалыгой области, в то время как BSAT1 — в перитуморальной области и в центральной части глиомы.

Все животные, получавшие 5% глюкозу, погибли в течение 21-суток (1С5о = 15). Медиана выживаемости животных, получивших наногели с цисплатином без антител (NG) и с неспецифическими иммуноглобулинами была соответственно на 11,5 и 8,5 суток выше, чем в группе с 5% глюкозой. Между собой и с группой, получавшей свободный цисплатин,

эти показатели достоверно не отличались. Однако, объективное состояние животных, получавших наноконтейнерный цисплатин было существенно лучше, чем в группе, леченной свободным препаратом. Это проявлялось в менее выраженной потере веса и относительно сохранной двигательной активности вплоть до развития симптомов внутричерепной дислокации на 22 — 27 сутки.

Медиана выживания крыс в опытных группах, получавших наногели, с «направляющими» антителами к Сх43 и BSAT1 была соответственно на 27 и 26,6 суток выше, чем у животных в группе с 5% глюкозой. Выживаемость в опытных группах также была достоверно выше, чем выживаемость в группах животных, получавших невекторные наногели и наногели с неспецифическими иммуноглобулинами (Рис. 19). Таким образом, анализ выживаемости показал, что терапия низкодифференцированной глиомы 101/8 адресными препаратами наноконтейнерного цисплатина достоверно более эффективна, чем терапия невекторными наногелями и свободным цисплатином.

Морфометрический анализ показал, что различия объёма глиомы в группах, получавших NG, NG-IgG и 5% глюкозу недостоверны. В опытных группах, получавших адресные наногели с цисплатином (NG-MAbCx43, NG-MAbBSATl) объём глиомы вплоть до 30 суток исследования был достоверно меньше, чем аналогичный показатель в контрольной группе (Рис. 20).

Рис. 19. Кривая выживания крыс после терапии векторными нанокоитей-нерными препаратами цисплатина. Обозначения: Dextrose — контрольная группа, получавшая 5% глюкозу; CDDP — свободный цисплатин; NG/CDDP — невекторные наногели с цисплатином; МАЬСх43-NG/CDDP, MAbBSAT-NG/CDDP — векторные наногели с антителами к Сх43 и BSAT1 соответственно; IgG-NG/CDDP — наногели с неспецифическими иммуноглобулинами.

Резюмируя данный раздел, можно заключить, что в исследовании с экспериментальной глиомой 101/8 подтверждена эффективность синтезированных нами векторных наноконтейнерных препаратов CDDP на основе полиэлектролитных наногелей с ПЭГ, кова-

лентно связанных с моноклональными антителами к Сх43 и В8АТ1. Этот подход может способствовать созданию новых высокоэффективных нанотехнологических препаратов для лечения мультиформной глиобластомы.

Рис. 20. Динамическая МРТ у крыс с глиомой 101/8 после терапии СББР невскториьши и векторными наногелими с СООР. Обозначения те же, что на Рис. 19. Т2-взвешенньге изображения без контраста (СПп8сап 7Т, Вгикег)

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К СХ43 И VEGF КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА АДРЕСНОЙ ТЕРАПИИ НИЗКО ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЛИОМ

Векторная молекула, будь то антитело, рекомбинантный пептид или аптамер, аф-финно связываясь с мембранным белком-мишеныо, может, так или иначе, влиять на функцию этого белка. Если мишень — опухоль ассоциированный маркёр и его функция связана с передачей митогенного сигнала, опухолевой инвазией и пр. — векторная молекула сама по себе может потенциально обладать противоопухолевой активностью. Наиболее ярким

примером этого дуализма (средство доставки и/или лекарство) являются антитела к VEGF. Известно, что гуманизированные антитела к VEGF — Бевацизумаб — достаточно успешно применяются для антиангиогенной терапии. В то же время, гиперэкспрессия VEGF делает возможным адресную доставку других противоопухолевых средств с помощью указанных антител.

Получив моноклональные антитела к рекомбинантному внеклеточному фрагменту Сх43, мы предположили, что обработка этими антителами глиомных клеток будет препятствовать нормальной функции гемиканалов и организации щелевых контактов. Учитывая последние результаты исследований, показывающие активирующую роль Сх43 в опухолевой инвазии (Oliveira R, 2005), мы также предположили, что в случае, если полученные нами антитела действительно нарушают функции коннексонов, они могут обладать противоопухолевой активностью. Таким образом, эксперименты по оценке противоопухолевой эффективности МАЬЕ2Сх43, MAbVEGF и sFltl сформировали отдельное направление наших изысканий, не связанное напрямую с проблемой адресной доставки, однако являющееся непосредственным воплощением концепции адресной терапии.

Исследование биологических эффектов моноклональных антител к Е2 Сх43: ингибирование функции щелевых контактов

Оценку функции щелевых контактов в культурах астроцитов и глиомных клеток проводили по методу Goldberg et al. (1995) в нашей модификации. Принцип метода заключается в том, что клетки загружают двумя флюоресцентными маркерами, один из которых — гидрофильный цитоплазматический, способный передаваться через gap-junctions (например — Calcein AM, Gibco, пик поглощения/эмиссии -494/517 нм), а второй — гидрофобный, полностью растворяющийся в мембране и не передающийся от клетки к клетке (DilCig, Sigma-Aldrich, пик поглощения/эмиссии -549/565 нм). Предварительно меченые клетки добавляются к немеченым и коинкубируются. Распространение флюоресценции Calcein AM из клеток, позитивных по двум флюорофорам (красному — Dil и зеленому — Calcein AM) в окружающие их немеченые клетки свидетельствует об организации между ними функционально-активных щелевых контактов, через которые и передается зеленый флюорофор.

Эксперимент по Goldberg в контрольных сериях (без моноклональных антител к Е2 Сх43) показал активное распространение Calcein AM по немеченым клеткам. Уже через час инкубации с мечеными Dil и Calcein AM астроцитами вокруг них хорошо визуализировались клетки, позитивные только по зеленому флюорофору (Рис. 21). Это свидетельствовало о передаче Calcein AM через вновь образованные между астроцитами щелевые контакты.

Добавление антител к внеклеточному фрагменту Е2 Сх43 в препараты меченых и немеченых астроцитов до концентрации 10 мкг/мл за 30 минут до их смешивания почти

полностью блокировала передачу Са1сет АМ немеченым клеткам (Рис. 21). Проточная ци-тофлюориметрия подтвердила, что добавление моноклональных антител к Е2Сх43 более чем в 4 раза снижает эффективность функционирования щелевых контактов. Механизм этого ингибирования, вероятно обусловлен тем, что антитела, взаимодействуя с внеклеточной петлёй Е2, препятствуют докингу гемиканалов и образованию щелевого контакта между соседними клетками.

Рис. 21. Результаты эксперимента по Goldberg. А, В, С — контрольный эксперимент без МАЬЕ2Сх43. Отмечается передача Calcein AM (А, С, зеленая флюоресценция) от первично меченых клеток (показаны синими стрелками) окружающим клеткам. D, Е, F — тот же эксперимент с лрединку-бацией с МАЬЕ2Сх43. Передача Calcein AM через gap-junction полностью блокирована. Увеличение хбЗО.

Исследование противоопухолевой активности моноклональных антител к внеклеточному сегменту Е2 Сх43 на модели глиомы С6

Данные о том, что полученные моноклональные антитела ко второму внеклеточному фрагменту Сх43 нарушают межклеточный сигналинг посредством щелевых контактов в глиомных клетках и накапливаются в перитуморальной зоне при внутривенном введении позволили нам предположить, что МАЬЕ2Сх43 могут проявлять противоопухолевую активность в отношении низкодифференцированной глиомы. Чтобы проверить это предположение, был проведен эксперимент по монотерапии глиомы С6 с помощью моноклональных антител к Е2 Сх43. 52 крысы с имплантированной глиомой случайным образом делили на две группы. В первой группе (опыт, п = 26), начиная с пятых суток после имплантации, еженедельно в течение четырёх недель проводили внутривенное введение МАЬЕ2Сх43 в количестве 5 мг/кг. Крысы второй группы (контроль, п = 26) получали препарат неспецифических иммуноглобулинов 0№т) по аналогичной схеме введения.

Морфометрический анализ растущей глиомы показал, что в группе крыс, получавших терапию МАЬЕ2Сх43, начиная с 14 суток, наблюдается замедление развития глиомы

по сравнению с контрольной группой, которое становится достоверным к 21-му дню после имплантации глиомы (Рис. 23). К 29-м суткам после имплантации средний объём глиомы в опытной группе, получавшей терапию специфическими антителами, был в два раза меньше, чем в контрольной группе (204,98 ± 37,67 мм3 и 431,00 ± 56,48 мм3 соответственно, р = 0.003). При этом относительный объём глиомы в опытной и контрольной группах составлял 12,4% ± 2,7% и 23,6% ± 3,1% соответственно. После 29-х суток почти все крысы контрольной группы погибали, поэтому количественный морфометрический анализ не проводили, однако МРТ выжившим крысам опытной группы проводили до шести месяцев после имплантации.

Анализ выживаемости животных с экспериментальной глиомой с помощью метода Каплан-Майера показал, что крысы, получавшие терапию препаратом МАЬЕ2Сх43 в дозе 5 мг на кг веса, достоверно переживали крыс контрольной группы (Рис. 22). В контрольной группе 100% животных погибли, медиана выживаемости контрольных крыс составила 28 суток. Пять из 26-ти (19,23%) крыс с глиомой С6 в опытной группе полностью выздоровели и по истечению 6 месяцев после моделирования глиомы произвели потомство (выздоровевших крыс наблюдали в течение 8 месяцев). У этих крыс верифицированная на МРТ глиома полностью регрессировала и на всем протяжении наблюдения, несмотря на беременность и роды, не наблюдалось рецидивирования опухоли. Медиана выживаемости у крыс в опытной группе составила 38 суток (р > 0,01 по сравнению с контролем).

Динамическая МРТ головного мозга у выживших животных показала, что глиома при этом подвергается обратному развитию, в результате которого образуется либо глиоме-зедермальный рубец, либо киста (Рис. 23).

В литературе описаны случаи спонтанного выздоровления крыс с экспериментальной глиомой С6 [Vince GH, 2004], однако наш собственный опыт, основанный на моделировании глиомы С6 более чем на 300 животных, показывает, что в случае подтвержденного приживления имплантированных клеток глиомы спонтанного выздоровления не происходит никогда — все животные погибают в течение четырёх-пяти недель после моделирования, вне зависимости от количества имплантированных клеток. Стандартизованная процедура стереотаксической имплантации клеток глиомы приводит к 100% приживлению их у крыс и, соответственно, к 100% их гибели (Chekhonin VP, 2007). Учитывая этот факт, а также имеющиеся в литературе данные о том, что С6 глиома — одна из самых агрессивных и резистентных к терапии линий глиомных клеток крысы, полное выздоровление 19,23% в группе из 26 животных после терапии МАЬЕ2Сх43 можно рассматривать как весьма перспективный результат.

Эксперимент по внутривенному введению радиоизотопно и флюоресцентно меченых препаратов МАЬЕ2Сх43 в системный кровоток крысам с экспериментальной глиомой С6,

позволил нам доказать, что введенные системно антитела накапливаются в перитумораль-ной зоне, где наблюдается гиперэкспрессия Сх43. При этом мы обнаружили, что визуализируются как Сх43- и GFAP-позитивные реактивные астроциты, так и пул веретеновидных GF AP-негативных Сх43-позитивных клеток. Последние в равной степени могут быть как дедифференцированными астроцигами — аетробластами, теряющими способность экспрессии специфических белков промежуточных филаментов, так и описанными в литературе мигрирующими в перитуморальную зону глиомными клетками, экспрессирующими белки щелевых контактов. Чтобы подтвердить это предположение, и показать, что введенные внутривенно антитела связываются с Сх43-позитивными клетками, происходящими из глиомы, мы провели эксперимент с предварительно меченными глиомными клетками. В качестве такой метки был выбран мембранный трейсер Dil, характеризующийся высокоинтенсивной флюоресценцией с пиком 560 нм. Предварительно было показано, что клетки глиомы С6, обработанные 10 цМ Dil, не теряют туморогенные свойства и в течение как минимум 18 суток, несмотря на неизбежное разведение трейсера в процессе пролиферации, сохраняют достаточное количество флюорофора для их достоверной идентификации.

Антитела к Сх43 были помечены сукцинимидным эфиром Alexa Fluor 488 (Invitrogen) и введены внутривенно на 14 сутки после имплантации меченых Dil клеток глиомы Сб. Флюоресцентный анализ на свежеприготовленных замороженных срезах головного мозга с глиомой через 48 часов после введения показал, что Alexa 488 и Dil достоверно колокализуются в клетках, расположенных в перитуморальной зоне и даже в нормальной ткани, за пределами астроглиального перитуморального вала (Рис. 24). Это доказывает, что введенные внутривенно антитела к Сх43 распознают именно Сх43-позитивные глиомные клетки, мигрирующие из периферии глиомы.

Кривые выживаемости {Kaplan-Meier)

• Поги0и*е à Выживите

4 - Контроль

Т » ---Терапия МЛЬЕ2С"4Э

Рис. 22. Анализ выживаемости крыс при терапии моноклональными антителами к Е2 фрагменту Сх43. Примечание: в опытной группе наблюдается достоверное (р<0,01) увеличение медианы выживаемости, по сравнению с контролем (28 и 38 суток, соответственно). 19,23% животных опытной группы полностью выздоровели

15 20 25 30 35 40 45 50

Дни после ииллянтаиии глиомы

Сутки после имплантации глиомы 7 14 21 28

Рис. 23. МРТ-дииамика роста глиомы С6 при терапии специфическими антителами к Е2 Сх43

(опыт) и неспецифическими IgG мыши (контроль) в течение 27 суток после имплантации.

Результаты эксперимента по колокализации позволяют предположить, что механизм опухоль-супрессивного действия антител может быть связан с ингибированием миграции и/или сигналинга Сх43-позитивных клеток глиомы. В частности, блокирование с помощью МАЬСх43 экстраклеточных фрагментов Сх43 может затруднять образование гетерологич-ных щелевых контактов с астроцитами, роль которых в инвазии показана в экспериментальных исследованиях [Oliveira R, 2005]. Это наше предположение находит подтверждение и в ряде других опубликованных работ [Bates DC, 2007, Lin JH, 2002]. Так Jane Lin с соавторами в своих исследованиях in vitro и in vivo наглядно продемонстрировали два пути вторжения глиомных клеток в паренхиму мозга крысы: паренхиматозный и по ходу опухолевых сосудов. Отмечено, что Сх43 позитивные клетки способны образовать гетерологич-ные контакты с астроцитами, обеспечивая себе миграцию по периневральным путям. Однако, есть и более поздние исследования, в которых показано, что Сх43 может интенсифицировать миграцию путем активации р38 MAP киназы, и этот процесс не связан с образованием щелевых контактов [Behrens J, 2010]. Таким образом, как функции Сх43 в процессе инвазии глиомы, так и механизм опухольсупрессивного действия антител к его внеклеточному фрагменту подлежат дальнейшему изучению.

Рис. 24. Иммунофлюоресцентный анализ иеритуморальной зоны с помощью введенных внутривенно меченых антител к Сх43. А. Перитуморальная зона под малым увеличением. Отрезок — 100 мкм. В квадрате показана область, просканированная под большим увеличением (Б). Отрезок 50 мкм. Стрелками показана ко-локализация Dil (первично меченные клетки глиомы) и Alexa 48В (антитела к Сх43, введенные внутривенно). В. Увеличенный в 2 раза фрагмент, показывающий Dil-познтивную клетку глиомы, захватившую антитела к Сх43.

Резюмируя результаты эксперимента про терапии глиомы С6 с помощью антител к внеклеточному фрагменту Сх43, можно сделать вывод: внутривенное введение полученных нами МАЬЕ2Сх43 в дозе 5 мг/кг крысам с глиомой С6 с семидневным интервалом приводит к достоверному замедлению роста имплантированной в мозг глиомы С6 и достоверному увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных, а в 19% случаев даже к полному выздоровлению без возникновения рецидивов в течение всей последующей жизни животных.

ВЫВОДЫ

1. Иммунизация мышей препаратом мембранной фракции эндотелиоцитов церебральных микрососудов позволила получить B-лимфоциты селезенки, способные при слиянии с клетками миеломы Sp2/0 образовывать гибридные клетки, продуцирующие монокло-нальные антитела к антигену аблюминальной мембраны эндотелиоцитов AMVB1, гиперпродукция которого наблюдается в эндотелиоцитах микрососудов мозжечка и неопластических микрососудов глиомы крысы. Внутривенное введение полученных антител крысам с экспериментальной глиомой приводит к достоверному накоплению их в ткани опухоли (0,12% ± 0,02%/i.d.).

2. Иммунизация мышей Balb/c рекомбинантным внеклеточным фрагментом 451 —

557 а.о. цереброспецифического анионного транспортера BSAT1 и последующее при-

менение гибридомной технологии позволили получить высокоаффинные монокло-нальные антитела к BSAT1 (Kafr4,4 *108 М"'), которые при внутривенном введении крысам с глиомой С6 достоверно накапливаются в опухолевой ткани (0,26% ± 0,02%/i.d).

3. Клонирование нуклеотидной последовательности внеклеточного фрагмента Е2 кон-нексина-43 крысы в плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности фрагментов РМСА4Ь АТФазы человека, позволило синтезировать в E.coli иммуногенные рекомбинантные белки-слияния Cx43CBD и Cx43HPML. Иммунизация мышей Balb/c этими препаратами и последующее применение гибридомной технологии позволили получить высокоаффинные моноклональные антитела к Е2 Сх43 (Ка(т0,8*109 М"1), которые достоверно накапливаются в перитуморальной зоне при внутривенном введении крысам с экспериментальной глиомой С6 (0,27% ± 0,01/i.d). Взаимодействие антител с Е2 Сх43 4-х кратно ингибирует пассаж цитоплазматического красителя через щелевые контакты.

4. Рекомбинантный препарат внеклеточного фрагмента VEGFR1 fs FitJ 2-3) и моноклональные антитела к VEGF в концентрации 1 мкг/мл обладают способностью ингиби-ровать миграцию глиомных клеток в тесте восстановления монослоя клеток глиомы С6 на 37% и 97% соответственно (р<0,05). Терапия рекомбинантным функционально активным sFltlj.j и препаратом моноклональных антител к VEGF не приводит к достоверному увеличению выживания животных с экспериментальной глиомой Сб.

5. Моноклональные антитела ко второму внеклеточному фрагменту Е2 Сх43, внеклеточному фрагменту BSATI и полноразмерному VEGF164 визуализируют клетки-мишени в очаге глиомы и в перитуморальной зоне при внутривенном введении и применимы для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов с помощью ПЭГилированных иммунолипосом.

6. Терапия с помощью векторной наноконтейнерной системы на основе полиэлектролитных наногелей, загруженных цисплатином и связанных с ПЭГилированными антителами к внеклеточным фрагментам Сх43, BSAT1 и полноразмерному VEGFi64 позволяет достоверно уменьшить скорость роста экспериментальных глиом 101/8 и С6 крысы и увеличить выживаемость животных более чем на 40% (р<0,05).

7. В экспериментах на крысах с глиомой С6 показано, что моноклональные антитела к Е2 Сх43 при внутривенном введении обладают достоверной противоопухолевой активностью, увеличивают выживаемость в 1,4 раза (р < 0,01) и способствуют полному регрессу опухоли с выздоровлением у 19,2% экспериментальных животных.

Основные публикации по теме диссертации

1. Абакумов М.А., Гольдт А. Е., Сокольски-Папков М., Зоркина Я.А., Баклаушев В.П., Гудилин Е.А, Кабанов A.B., Чехонин В. П. Векторизованные наночастицы оксида железа для визуализации эндотелиоцитов методом МРТ. Бюлл. эксп. биол. и мед., 2011, 151, №6, с. 672 — 676.

2. Абакумов М.А., Гриненко Н.Ф., Баклаушев В.П., Сандалова Т.О., Нуколова Н.В., Сокольски-Папков №, Вишвасрао X., Кабанов A.B., Чехонин В.П. Опухоль-специфичный контрастный агент на основе суперпарамагнитных наночастиц оксида железа для визуализации глиом методом магнито-резонансной томографии. Бюлл. эксп. биол. и мед., 2012, Том 153., №1 С.101 —105.

3. Баклаушев В. П., Юсубалиева Г. М., Турина О. И., Чехонин В. П. Комбинированный имму-нопероксидазный анализ в визуализации клеточных элементов гематоэнцефалического барьера. // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2006 — №4 — С. 198 — 201.

4. Баклаушев В.П., Турина О.И., Юсубалиева Г.М., Гриненко Н.Ф., Цитрин Е.Б., Викторов И.В., Чехонин В.П. Иммунофлюоресцентный анализ коннсксина-43 на основе моноклональных антител к его экстраклеточному домену. Клеточные технологии в биол.и мед. 2009., № 4, с 236 — 241.

5. Баклаушев В.П., Турина О.И., Юсубалиева Г.М., Дмитриев Р.И., Чехонин В.П. Получение ре-комбинантного экстраклеточного фрагмента коннексина-43 крысы. Бюлл.эксп.биол. и мед., 2009 147. №9, с. 277 — 282.

6. Баклаушев В.П., Кардашова К.Ш., Турина О.И., Леопольд A.B., Семенова A.B., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Клонирование, экспрессия цереброспецифического анионного транспортера BSAT1 и получение моноклональных антител к его внеклеточному фрагменту. Бюлл. эксп. биол. и мед., 201 l.-N 12.-С.678-683.

7. Баклаушев В.П., Кардашова К.Ш., Турина О.И., Юсубалиева Г.М., Зоркина Я.А., Чехонин В.П. Органная, клеточная и субклеточная локализация цереброспецифического анионного транспортера BSAT1. Бюлл. эксп.биол. и мед., 2013.-N 4.-С.487-494.

8. Баклаушев В.П., Чехонин В.П., Павлов К.А. Моноклональные антитела в диагностике и терапии глиом. Биомедицинская химия 2009, т.55, № 2, с.140-154.

9. Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Турина О.И., Гриненко Н.Ф., Викторов И.В., Белопасов В.В., Чехонин В.П. Адресная доставка моноклональных антител к экстраклеточному фрагменту коннексина-43 в очаг внутримозговой глиомы. Астраханский медицинский журнал 2010, №1,с.164 — 167.

10. Волгина Н.Е., Турина О.И., Гриненко Н.Ф., Баклаушев В.П., Иванова Н.В., Чехонин В.П. Экспрессия белков плотных контактов эндотелиоцитами пупочной вены человека, окультивированными с аллогенными астроцитами. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2012.-N 3.-C.129-I34.

11. Дедов И.И., Тюльпаков А.Н., Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Арчаков А.И., Мошковский С.А. Персонализированная медицина; современное состояние и перспективы. Вестник РАМН, 2012.-N 12.-С.4-12.

12. Зубков Е.А., Баклаушев В.П., Кардашова К.Ш., Турина О.Н., Морозова А.Ю., Сторожева З.И., Кекелидзе З.И., Чехонин В.П. Эффекты пренатального воздействия антител к нейроспецифи-ческому транспортеру анионов на когнитивные функции крыс. Бюлл. эксп.биол. и мед., 2013.-N 4.-С.435-438.

13. Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Корчагина A.A., Шеин С.А., Гриненко Н.Ф., Павлов К.А., Чехонин В.П. Лиганд-рецепторный анализ в оценке функциональной активности рекомбинант-ных VEGF и экстраклеточного фрагмента VEGFR1 человека. Бюлл. эксп. биол. и мед., 2011, Том 152, №12, С.648 —653

14. Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Павлов К.А., Чехонин В.П. Получение рекомбинантного экстраклеточного фрагмента рецептора фактора роста эндотелия сосудов VEGFR1 человека в E.coli. Бюлл. Эксп.биол. и мед., 2011, Том 151, № 3,322 — 327.

15. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Дмитриева Т.Б.. Иммунохимические наносистемы в диагностике и направленной терапии глиом. Научные основы и перспективы развития онкологии. Нанотехнологии и наноматериалы в медицине (Сборник материалов XIX (82) сессии Общего собрания РАМН). М.Медицина 2008,336 с. С. 267 — 299.

16. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Кузнецов Д.А. Медицинские нанобиотехнологии адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в мозг. Вестник РГМУ, 2010, Вып.З, с.6 — 10.

17. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Кузнецов Д.А. Медицинские наночастицы и наноконтейнеры в диагностике и векторной терапии заболеваний ЦНС. Вестник РГМУ, 2010, Вып.4, с. 10 —15.

18. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. и соавт. Моделирование и иммуногистохи-мический анализ глиомы Сб. // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2007 — №2 — С. 65 — 73.

19. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. и соавт. Направленный транспорт меченных 1251 антител к GFAP и AMVB1 в очаг экспериментальной глиомы Сб. // Доклады российской академии наук. 2008. — Том 418; №5; с 1 - 4.

20. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М. Перспективы направленной терапии глиом. Вестник РАМН, 2009 №4, с. 30 —42.

21. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Турина О.И., Белопасов В.В.. Направленный транспорт моноклональных антител к белкам-маркерам экспериментальной глиомы. Астраханский медицинский журнал 2008, №3, 49 — 51.

22. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Волгина Н.Е., Турина О.И. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения гематознцефалического барьера. Вестник РАМН, 2012,-N 8.-С.66-78.

23. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г AI., Павлов К.А. и соавт. Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам в радиоиммунодиагностике и терапии низкодифферен-цированных глиом. Глава в монографии: Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам. Под ред. В.П. Чехонина, О.И. Гуриной, Т.Б. Дмитриевой. М. Медицина 2007 и соавт. с.223—254.

24. Чехонин В.П., Буланов К.Л., Юсубалиева Г.М., Цибулыаша Е.Л., Турина О.И., Скоблов Ю.С., Швец В.И., Жирков Ю.А., Баклаушев В.П. Исследование биодеградации меченных 1251 моноклональных антител при системном введении крысам с экспериментальной глиомой Сб. Биомедицинская химия, 2007, том 53, вып.5, с 532-540

25. Шеин С.А., Турина О.И., Леопольд, A.B., Баклаушев В.П., Корчагина A.A., Чехонин В.П. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. Клеточные технологии в биол. и мед., 2012, № 1, с.24 - 28.

26. Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Турина О.И., Гуляев М.В., Пирогов Ю.А., Чехонин В.П. Противоопухолевые эффекты моноклональных антител к внеклеточному фрагменту коннек-

сина 43 при индуцированной низкодифференцированной глиоме. Клеточные технологии в биол. имед., 2012, № I, с.51—57.

27. Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Турина О.И., Цитрин Е.Б., Чехонин В.П. Иммунохимиче-ский анализ глиофибриллярного кислого белка в оценке астроглиальной реакции при экспериментальной глиоме Сб. Клеточные технологии в биологии и медицине 2010, N 1, с.17-23.

28. Baklaushev VP, Grinenko NF, Tsitrin ЕВ, Yusubalieva GM, Belyaev MS, Mukhin VE, Gurina OI, Bykovskaya SN, Chekhonin VP. Downregulation of gap junctions in astrocytes by anti-Connexin-43 monoclonal antibodies. British Journal of Medicine & Medical Research, 2011, 1(2): 35-44.

29. Baklaushev VP, Kavsan VM, Balynska OV, Yusubalieva GM, Abakumov MA, Chekhonin VP. New Experimental Model of Brain Tumors in Brains of Adult Immunocompetent Rats. British Journal of Medicine & Medical Research 2(2): 206-215, 2012

30. Baklaushev VP, Yusubalieva GM Tsitrin EB, Gurina OI, Grinenko NF, Victorov IV, Chekhonin VP Visualization of connexin 43-positive cells of glioma and the periglioma zone by means of intravenously injected monoclonal antibodies. DrugDeliv. 2011, I8(5):331-337.

31. Chekhonin VP, Baklaushev VP, Gurina O.I., Grinenko N.F., Yusubalieva GM, Ryabinina A.E. A binary immunoliposomal system directed to Cx43-positive glioma cells. Drug Delivery Tech., 2010, Vol 10No2, pp.42— 47.

32. Chekhonin VP, Baklaushev VP, Yusubalieva GM Belorusova AE, Gulyaev MV, Tsitrin EB, Grinenko NF, Gurina OI, Pirogov YuA. Targeted delivery of liposomal nanocontainers to the peritumoral zone of glioma by means of monoclonal antibodies against GFAP and the extracellular loop of CX43. Nanomedicine. 2012 Jan;8(l):63-70.

33. Chekhonin VP, Baklaushev VP, Yusubalieva GM, Gurina OI. Targeted Transport of (125)I-Labeled Antibody to GFAP and AMVB1 in an Experimental Rat Model of C6 Glioma // J Neuroimmune Pharmacol. 2008 Sep 4.

Патенты

1. Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Турина О.И., Чехонин В.П. Способ получения иммуноген-ного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента коннексина-43 Патент на изобретение № 2408728 от 28.07.2009.

2. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Макаров А.В., Дмитриева Т.Б. Бинарная иммунолипосомальная наносистема адресной доставки к коннексин-43 положительным опухолевым клеткам Патент на изобретение № 2422154 от 21.08.2009.

3. Чехонин В.П., Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Турина О.И., и соавт. Способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодиффсренцированных глиом» Чехонин В.П. Патент на изобретение №2437159 от 26.04.2010.

4. Чехонин ВП, Юсубалиева Г.М., Баклаушев В.П., Турина О.И., и соавт. Способ получения мо-ноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эццотелиоци-тов. Патент на изобретение №2439160 от 25.06.2010.

5. Чехонин ВП, Юсубалиева Т.М., Баклаушев В.П., Турина О.И., и соавт. Способ лечения низко-дифференцированных глиом. Патент на изобретение № 2457862 от 07.07.2011.

Автор выражает глубокую признательность академику-секретарю отделения медико-биологических наук РАМН Владимиру Павловичу Чехонину за неоценимый вклад в данную работу и пристальное внимание, уделённое её выполнению и завершению. Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории иммунохимии ГНЦССП им. В.П. Сербского: Гаухар Маратовну Юсубалие-ву, Ольгу Ивановну Турину, Надежду Филипповну Гриненко, Наталью Владимировну Нуколову, Андрея Вячеславовича Макарова, Клавдию Павловну Ионову, [Илью Васильевича Викторова|, Ирину Петровну Лазаренко, Карину Шамильевну Кардашову, сотрудников кафедры и отдела Медицинских нанобиотехнологий РГМУ им. Н.И. Пирогова: Анну Владимировну Леопольд, Сергея Александровича Шеина, Максима Артёмовича Абакумова, Илью Леонидовича Губского, Филиппа Александровича Кошкина, Ирину Ивановну Шепелёву, коллектив кафедры некрологам Астраханской медицинской академии (заведующий кафедрой д.м.н., профессор Владимир Викторович Белопасов), коллектив радиозотопного блока (руководитель, д.х.н. Юрий Самойлович Скоблов) и группы мембранных биоэнергетических систем (руководитель д.х.н. Михаил Иванович Шахпаронов) Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН, коллектив группы оптических исследований (руководитель Евгений Борисович Цитрин) Института биологии развития им. H.H. Кольцова РАН, старшего научного сотрудника Института белка РАН, к.х.н. Ивана Андреевича Кашпарова, ведущего научного сотрудника Института морфологии человека РАМН, к.б.н. Александра Сергеевича Халаиского в соавторстве с которыми выполнены разделы этой работы.

Заказ №2017/13 . Формат 60x90/16. Усл. печ. 3 л. Бумага офсетная. Тираж 150 шт. Отпечатано в типографии ООО «Аналитик» . Москва, Ленинградское шоссе, д. 18. Тел. 617-09-24

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Баклаушев, Владимир Павлович, Новосибирск

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР СОЦИАЛЬНОЙ И СУДЕБНОЙ ПСИХИАТРИИ им.

В.П. СЕРБСКОГО

РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н.И. ПИРОГОВА

05201450699

БАКЛАУШЕВ ВЛАДИМИР ПАВЛОВИЧ

03.01.04 - Биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: Академик РАН, Д.м.н., профессор В.П. Чехонин

МОСКВА-2013 г.

Список сокращений

а.о. аминокислотные остатки

ГЭБ гематоэнцефалический барьер

ГК гемиканал (коннексон) — гексамерная мембранная структура, образованная коннексинами

ИПТГ изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

ИФА иммуноферментный анализ

кДНК комплементарная ДНК

JIPA лиганд рецепторный анализ

мРНК матричная РНК

Нт нейротелин

ПК плотные контакты (tight junction, TJ)

п.о. пары оснований

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПЭГ полиэтиленгликоль

TP трансферриновый рецептор

РЭС ретикуло-эндотелиальная система

ЦНС центральная нервная система

ЩФ щелочная фосфатаза

ЩК щелевой контакт (gap-junction)

ЭЦМ эндотелиоциты церебральных микрососудов

уГТП у-глутамилтранспептидаза

AMVB1 антиген аблюминальной поверхности эндотелиоцитов

BDNF церебральный нейротрофический фактор (brain derived neurotrophic factor)

BSAT цереброспецифический анионный транспортер (brain specific anion

transporter)

Bsg базиджин (basidgin)

CBD кальмодулин-связывающий домен (calmodulin binding domain)

CHAPS 3-[(3-Холоамидопропил) диметиламино]-1-пропансульфонат

Cx коннексин

CPE энтеротоксин Clostridium perfringens

Dil 1,Г-октадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбо-цианин перхлорат

DSPE дистеароилфосфатидилэтаноламин

ЕВА эндотелиальный барьерный антиген (endothelial barrier antigen) EMMPRIN внеклеточный индуктор матриксных металлопротеиназ (extracellular

matrix metalloproteinase inducer)

EPR enhanced permeability and retention (феномен повышенной проницае-

мости эндотелиального барьера в опухолевой ткани) FC S фетальная сыворотка телёнка (fetal calf serum)

GFAP глиофибриллярный кислый белок (glial fibrillar acidic protein), ос-

новной астроглиальный маркер GFP зеленый флюоресцентный белок (green fluorescent protein)

GLUTI переносчик глюкозы-1 .

GPI гликозилфосфатидилинозитол

ICAM-1 межклеточный белок клеточной адгезии (intercellular cell adhesion

molecule)

i.d. введенная доза (injected dose)

IL-1 интерлейкин-1

JAM контактные адгезивные молекулы (junctional adhesive molecules)

LAT1 переносчик крупных аминокислот (large amino acid transporter)

MCT переносчик монокарбоксильных соединений

MMP матриксные металлопротеиназы

MRP белок множественной лекарственной резистентности (multidrug

resistance-associated protein) M.w. Молекулярный вес (Molecular weigh)t

OATP переносчик органических анионов

PAL-E патологический эндотелиальный белок (Pathologische Anatomie

Leiden-Endothelium) PEC AM-1 тромбоцит-эндотелиальный белок клеточной адгезии-1 PEG-b-PMA Polyethylene glycol)-6-poly(methacrylic acid) (блок-сополимер поли-

этиленгликоля и полиметакриловой кислоты) Pgp Р-гликопротеин

РМСА Са-АТФаза плазматической мембраны человека (Plasma Membrane

Calcium-ATPase)

SAGE серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression)

sFltl водорастворимый внеклеточный фрагмент VEGFR1

siRNA малые интерферирующие РНК (small interfering RNA)

SPDM spectral precision distance microscopy/spectral position determination

microscopy

SSH вычитающая гибридизация (suppression subtractive hybridization)

TMB 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

TNF-a фактор некроза опухолей-альфа

VCAM-1 сосудистый белок клеточной адгезии-1 (vascular endothelial cell adhe-

sion molecule)

VEGF сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial

growth factor)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений....................................................................................................................2

Актуальность.............................................................................................................................10

Цель работы...............................................................................................................................13

Задачи..........................................................................................................................................13

Научная новизна.......................................................................................................................14

Положения, выносимые на защиту.......................................................................................15

ГЛАВА 1 Поверхностные белки-мишени клеток, образующих гематоэнцефалический барьер, и адресная терапия низкодифференцированных глиом (обзор литературы). 17

Введение.......................................................................................................................................17

Методология поиска новых белков ЭЦМ.................................................................................18

Маркеры эндотелия церебральных микрососудов...................................................................21

Базиджин (НТ7, 5А11, CD 147, Мб, EMMPRIN, 0X47)....................................21

Эндотелиальный барьерный антиген (ЕВА)......................................................25

Перицит-ассоциированный 140 кДа антиген (аминопептидаза-N)..................29

Кавеолины..............................................................................................................30

Трансферриновый рецептор (CD71)...................................................................32

Ферментные и транспортные системы церебральных эндотелиоцитов................................35

у-Глутамилтранспептидаза...................................................................................36

Переносчики глюкозы из семейства GLUT........................................................38

Транспортеры аминокислот.................................................................................40

Транспортеры органических анионов семейства ОАТР...................................41

Монокарбоксильные транспортеры (МСТ)........................................................45

Транспортер активного выброса (Р-гликопротеин, MDR1).............................46

Белки межклеточных контактов структур ГЭБ........................................................................49

Белки плотных контактов.....................................................................................49

Белки щелевых контактов....................................................................................57

Изменения поверхностных белков ЭЦМ при патологии ГЭБ................................................60

Моноклональные антитела к белкам-мишеням для диагностики и терапии низкодифференцированных глиом............................................................................................61

Общие аспекты адресной терапии глиом с помощью моноклональных антител.................63

Адресная терапия с помощью антител к рецепторам факторов роста...................................64

Адресная радиоиммунотерапия с помощью антител к белкам внеклеточного матрикса....69

Перспективы адресной терапии с помощью антител к эндотелиальным антигенам опухолевых микрососудов.........................................................................................................72

Адресная доставка наноконтейнерных форм цитостатических препаратов.........................75

Активная загрузка наноконтейнеров цитостатиками..............................................................77

Контролируемое высвобождение активного вещества...........................................................80

Придание наноконтейнерам «векторных» свойств..................................................................82

Заключение..................................................................................................................................85

ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования....................................................................90

Препаративные методы выделения и очистки нативных мембранных белков церебральных эндотелиоцитов...........................................................................................................................90

Выделение фракции церебральных микрососудов............................................90

Солюбилизация мембранных белков..................................................................91

Фракционирование и очистка мембранных белков...........................................92

Дизайн рекомбинантных внеклеточных фрагментов В8АТ1, Сх43 и УЕОРШ (эРк) а также рекомбинантного УЕОБ.............................................................................................................92

Первичная структура и мембранная топология внеклеточных фрагментов исследуемых белков............................................................................................................93

Клонирование и экспрессия внеклеточных фрагментов В8АТ1и Сх43..........95

Методы анализа полученных нативных и рекомбинантных белков....................................100

Определение концентрации ДНК и белка........................................................100

Диск-электрофорез в ПААГ с ББЗ....................................................................101

Иммуноблоттинг.................................................................................................103

Иммуноферментный анализ...............................................................................103

Лиганд-рецепторный анализ..............................................................................105

Получение и характеристика моноклональных антител.......................................................106

Моноклональные антитела к AMVB1...............................................................107

Моноклональные антитела к BSAT1, Сх43, VEGFR1 и sFltl.........................109

Определение изотипа и константы аффинности полученных моноклональных антител.........................................„.....................................................................................110

Модификации моноклональных антител..........................................................111

Методы иммунопероксидазной и флюоресцентной визуализации......................................113

Иммуноцитохимический анализ........................................................................113

Тест восстановления монослоя (Wound-healing assay)..........................................................118

Протокол эксперимента по испытанию бинарной иммунолипосомальной системы in vitro..................................................................................................................118

Гистологический и иммуногистохимический анализ на срезах органов крысы................119

Транскардиальная перфузия и приготовление срезов органов......................119

Методы гистохимического окрашивания.........................................................120

Пероксидазный иммуногистохимический анализ...........................................121

Иммунофлюоресцентный анализ на срезах мозга крысы.....................................................123

Приготовление ПЭГилированных липосом...........................................................................125

Моделирование мультиформной глиобластомы у крыс.......................................................126

Статистическая обработка полученных результатов.............................................................129

ГЛАВА 3 Поиск, выделение и очистка потенциальных белков-мишеней. Получение и иммунохимический анализ моноклональных антител................................................130

Преимущества и недостатки существующих подходов для выделения нативных мембранных белков ЭЦМ.........................................................................................................130

Аблюминальный мембранный антиген сосудов головного мозга (AMVB1)......................135

Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к AMVB1 и характеристика специфичности моноклональных антител..................................................136

Получение и иммунохимический анализ рекомбинантных белков мишеней для адресной доставки......................................................................................................................................146

Цереброспецифический анионный транспортер BS ATI......................................................146

Клонирование и экспрессия внеклеточного фрагмента 451 — 557 а.о.........146

Получение и иммунохимический анализ моноклональных антител.............147

Белок щелевых контактов коннексин 43.................................................................................151

Клонирование и экспрессия внеклеточного фрагмента Е2 Сх43...................151

Получение моноклональных антител к Е2 Сх43.............................................152

Исследование клеточной, субклеточной локализации Сх43 и тканевой специфичности МАЬЕ2Сх43...............................................................................................................................155

Водорастворимая изоформа рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста VEGFR1 (sFlt) и VEGF..............................................................................................................160

Клонирование и экспрессия sFltl......................................................................160

Клонирование и экспрессия VEGF164..............................................................163

Иммунохимическая идентификация рекомбинантных VEGFiôs и sFltl2-4 и оценка функциональной активности с помощью лиганд-рецепторного анализа.......164

Получение моноклональных антител к VEGF164.............................................168

ГЛАВА 4 Направленный транспорт моноклональных антител через поврежденный гематоэнцефалический барьер.............................................................................................171

Фундаментальные и прикладные аспекты оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера для антител в норме и при патологии.......................................................................171

Исследование проницаемости эндотелиального барьера в неопластических микрососудах .....................................................................................................................................................172

Оценка проницаемости эндотелиального барьера в неопластических микрососудах.....................................................................................................................179

Направленный транспорт меченых анти- GFAP и AMVB1 антител к белкам мишеням клеток нервной ткани и церебральных эндотелиоцитов.......................................................181

Исследование распределения меченных I МАЬ2В6 в выделенных микрососудах мозга и печени крысы..............................................................................181

Оценка кинетики моноклональных антител к AMVB1 и GFAP в сыворотке крови здоровых крыс с последующим анализом активности.......................................183

125

Биораспределение моноклональных антител, меченных I, при внутривенном введении

крысам с экспериментальной глиомой С6..............................................................................186

Биораспределение моноклональных антител к GFAP и AMVB1..................187

Биораспределение моноклональных антител к BSAT1...................................191

Биораспределения моноклональных антител к Е2 Сх43.................................192

Адресная доставка в перитуморальную зону глиомы С6 флюоресцентно меченных моноклональных антител.........................................................................................................194

MAb Е2Сх43-А1еха Fluor® 660...........................................................................195

MAb BSATl-Alexa Fluor® 660 ...........................................................................198

MAb VEGF-Alexa Fluor® 488.............................................................................199

ГЛАВА 5 Разработка и испытание контейнерных систем направленной доставки диагностических препаратов к клеткам низкодифференцированной глиальной опухоли......................................................................................................................................202

Адресные иммунолипосомальные системы на основе моноклональных антител к Сх43 и GFAP...........................................................................................................................................202

Бинарная имунолипосомальная система на основе антител к Сх43..............202

Адресная доставка иммунолипосом с флюоресцентной меткой или МРТ-контрастом в очаг экспериментальной глиомы С6 с помощью моноклональных антител к Сх43 и GFAP.....................................................................................................205

Адресные иммунолипосомальные системы на основе моноклональных антител к VEGF .....................................................................................................................................................213

ГЛАВА 6 Разработка систем адресной доставки противоопухолевых препаратов в очаг экспериментальной глиомы на основе моноклональных антител к VEGF, BSAT и Сх43.........................................................................................................................................219

Дизайн адресных наноконтейнеров.........................................................................................220

Адресная наноконтейнерная терапия глиомы С6..................................................................225

Адресная наноконтейнерная терапия глиомы 101/8..............................................................229

ГЛАВА 7 Моноклональные антитела к Сх43 и VEGF как потенциальные средства адресной терапии низкодифференцированных глиом....................................................238

Исследование trx/sFltb-з, MAbVEGF и МАЬЕ2Сх43 в тесте восстановления монослоя клеток глиомы С6......................................................................................................................239

Исследование биологических эффектов моноклональных антител к Е2 Сх43:

ингибирование функции щелевых контактов in vitro и in vivo.............................................242

Антиангиогенная терапия низкодифференцированной глиомы С6 с помощью моноклональных антител к VEGF и растворимого sFlth-4...................................................251

Исследование противоопухолевой активности моноклональных антител к внеклеточному" сегменту Е2 Сх43 на модели глиомы С6................................................................................255

ГЛАВА 8 ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................265

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................277

Литература.................................................................................................................................279

Актуальность

Создание лекарственных препаратов направленного типа действия уже более 100 лет является актуальной задачей медицины. Особое значение создание адресных препаратов имеет в нейропсихофармакологии и терапии опухолей. В первом случае актуальность этой проблемы обусловлена избирательной проницаемостью гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), из-за которой критически ограничиваются возможности фармакотерапии нервных и психических заболеваний. Во втором — актуальность продиктована необходимостью применения цитостатических препаратов, имеющих тяжелейшие системные токсические эффекты при существующих «неадресных» способах лечения. В случае первичных нейроэпителиальных опухолей, локализующихся внутри ГЭБ, актуальность в определенном смысле суммируется: наличие ГЭБ и высокая активность эффлюксных систем в неопластическом эндотелии снижает биодоступность цитостатика по отношению к опухолевому очагу, а неспецифическое накопление препарата в органах и тканях обуславливает цитотоксичность. На фоне высокой химиорезистентности глиомных клеток, все эти факторы драматически сказываются на результатах противоопухолевой терапии нейроонко-логических больных [1].

Информация о работе

Баклаушев, Владимир Павлович
доктора медицинских наук
Новосибирск, 2014
ВАК 03.01.04

Диссертация

Белки-мишени для адресной доставки контейнерных систем в мозг млекопитающих. Фундаментальные и прикладные аспекты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы