Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гены-мишени фармакологического действия бромпроизводного 2-аминоадамантана-ладастена в клетках головного мозга крыс

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гены-мишени фармакологического действия бромпроизводного 2-аминоадамантана-ладастена в клетках головного мозга крыс"

На правах рукописи

ЯМИДАНОВ РЕНАТ САЛЕКОВИЧ

ГЕНЫ-МИШЕНИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БРОМПРОИЗВОДНОГО 2-АМИНОАДАМАНТАНА - ЛАДАСТЕНА В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2006

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и в ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (г. Москва)

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Вахитова Юлия Венеровна

Научный консультант: академик РАМН

Середенин Сергей Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 5 июля 2006 г. в 14 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Просп. Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан: 2 июня 2006 г.

Ученый секретарь

регионального диссертационного совета, к.б.ш^^^ ^ у^7"Ьикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение механизмов реализации фармакологических активностей лекарственных средств является приоритетной задачей фундаментальной фармакологии и основой безопасного и эффективного их клинического применения. Традиционные фармакологические подходы, ориентированные прежде всего на отбор веществ, потенциально обладающих заданными . активностями, а также на первичный скрининг спектров их фармакологических свойств, не предусматривает разработку лекарственных препаратов на основе знания механизмов реализации их активности. Поэтому для более рационального использования фармакологических средств необходимо детальное знание путей их воздействия на клетку, ткань и организм в целом. Как известно, введение лекарственных препаратов приводит к изменению функционального состояния большого количества мишеней разного уровня, являющихся компонентами различных сигнальных, метаболических, транспортных и др. путей, что определяет множественность эффектов, часть из которых может быть даже нежелательной для конкретного лекарственного средства. Развитие принципиально новых молекулярно-биологических методов и подходов вносит очень важный вклад в познание механизмов действия лекарственных препаратов. Переход на качественно иной уровень разработки и анализа свойств лекарственных веществ был предопределен достижениями последних лет в области геномных исследований, молекулярной биологии, биоинформатики, которые открыли новые перспективы и для фармакологии, прежде всего в свете возможностей более полной характеристики механизмов действия лекарственных средств (Colantuoni et al., 2000; Green et al., 2001; Ishii et al., 2000). В настоящее время на ранних этапах разработки лекарств, а также при углубленном изучении механизмов действия как новых, так и хорошо известных лекарственных средств широко применяются различные методы анализа функционального состояния потенциальных биологических мишеней - генов и кодируемых им белков (Collins, 1999; Luo et al., 2001; Marcotte et al., 2001). Различные биочипы, количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени, 2D- электрофорез белков и другие методы анализа дифференциально экспрессирующихся генов и белков (SAGE, SSH, TOGA, ES-MS-MS, MALDI-MS и др.) являются стандартными инструментами поиска, идентификации и последующей валидации генов и белков,

ассоциированных как с терапевтическими, так и с возможными побочными эффектами лекарственных средств.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является поиск и идентификация генов и белков - мишеней, дифференциально экспрессирующихся в клетках головного мозга экспериментальных животных и определяющих реализацию фармакологических эффектов нового нейротропного лекарственного средства -ладастена. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Выявить спектр дифференциально экспрессирующихся генов в клетках головного мозга крыс через 1.5 ч после однократного воздействия ладастена методом гибридизации на коммерческих макрочипах "Atlas™ Rat cDNA Expression Array" и "Atlas Rat 1.2 cDNA Expression Array" (BD Biosciences, США), содержащих 588 и 1176 генов соответственно.

2. Провести подтверждение уровня экспрессии выявленных генов-мишеней ладастена методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

3. Исследовать влияние ладастена на функциональное состояние белков в клетках головного мозга крыс через 1.5 часа после однократного воздействия препарата.

Научная новизна. Впервые проведен поиск и идентификация генов и белков-мишеней нового нейротропного лекарственного препарата ладастена в клетках головного мозга крыс. Показано, что однократное экспериментальное воздействие ладастена вызывает изменения уровня экспрессии 26 генов головного мозга крыс. Регулируемые ладастеном гены кодируют белки, относящиеся к функциональным группам онкогенов и опухолевых супрессоров (APC, Rb), компонентов цитоскелета {Tubal, actin), внутриклеточного сигналинга (PKCIP, PMCÄ), метаболизма (Gapdh, NSE), синаптических белков (Syn IA&IB, PLP, CPG2, гЕХОЮ, rabphilin-3A, RAB7), ферментов, участвующих в синтезе опиоидных и других регуляторных пептидов (CARB Н, hypocretin, receptor galanin 3), мембранных транспортеров (GAT3), молекул клеточной адгезии (N-CAM) и др. В качестве потенциальных фармакологически значимых мишеней ладастена следует рассматривать гены С ARB H, hypocretin, galanin receptor 3 и GAT3, изменение активности которых позволяет объяснить отдельные механизмы анксиолитических и стресспротекторных свойств препарата.

Впервые идентифицированы 14 белков головного мозга крыс, значительно отличающихся по уровню их экспрессии в контрольных и опытных вариантах, в том числе - ферменты гликолитического метаболизма - fructose-bisphosphate aldolase А и glyceraldehyde 3-phosphate-dehydrogenase; белки-шапероны - proteasome 26S ATPase subunit 4, hypoxia up-regulated 1, heat shock 70ГО protein 5, valosin-containing protein; транспортные, везикулярные белки и белки цитоскелета - tubulin, alpha-intemexin, clathrin light, chain A, collapsin response mediator protein 2, neuronal protein 22. В качестве мишеней фармакологического действия ладастена могут быть рассмотрены белки-ферменты гликолитического метаболизма, collapsin response mediator protein 2, neuronal protein 22. Увеличение экспрессии везикулярных, транспортных, цитоскелетных белков и некоторых других, вероятно, связано с механизмами нейропластичности, реализующимися в ответ на лекарственное воздействие.

Практическая значимость. Полученные нами данные о спектре генов и белков-мишеней вносят вклад в доклинические аспекты разработки лекарств, углубляя и дополняя представления о механизмах фармакологической активности ладастена, что открывает новые перспективы его клинического применения и с другой стороны, демонстрируют возможности комплексного использования новых методов и подходов для анализа механизмов действия лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XVI зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004 г.); на 6-ой конференции Немецкого Нейробиологического Общества (Gettingen, 2005 г.); на 8-ой Региональной конференции ECNP (Москва, 2005 г.); на V съезде Всероссийского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); на 18-ом конгрессе ECNP (Amsterdam, 2005); на 4-ой Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (10002-251/П-10/142-448/260503-196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (Hill - 2217.2003.4), РФФИ - Агидель (02-0497904).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 8 таблиц и 14 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования (глава 3) и их обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы, включающего 31б! источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-250 г. Были использованы две группы животных - контрольная и опытная - по три крысы в каждой. Ладастен вводили крысам внутрижелудочно в виде суспензии с Tween 80 (50 мг/кг), контрольным животным - дистиллированную воду с Tween 80. Через 1.5 ч животных декапитировали, извлекали целый головной мозг и растирали его в жидком азоте.

Суммарную РНК выделяли с использованием "TRIzol Reagent" ("Invitrogen", США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Примеси ДНК удаляли с помощью ДНКазы I ("Promega", США) с последующей очисткой смесью фенол-хлороформ. Гибридизацию меченых 32Р или 33Р кДНК проводили на "Atlas™ Rat cDNA Expression Array" и "Atlas Rat 1.2 cDNA Expression Array" (BD Biosciences, США), содержащих 588 и 1176 амплифицированных фрагментов кДНК известных генов крысы соответственно. Получение меченых проб, гибридизацию и анализ проводили согласно протоколу производителя. Результаты гибридизации анализировали с использованием программы "ImageQuant software 5.0" ("Molecular Dynamics", CHIA) и "Microsoft Excel" ("Microsoft corporation", США). Подтверждение результатов, полученных с помощью гибридизации, проводили методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени на "iCycler iQ™ RealTime PCR Detection System" ("BIO-RAD", США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I и программного обеспечения "iCycler iQ Real-Time Detection System software" версия 3.0.6070 ("BIO-RAD", CILIA). Праймеры к нуклеотидным последовательностям подтверждаемых генов подбирали с помощью

программы Primer 3 (wwwjgenome.wi.mit.edu/cgi.biii/primer/primer3wvvw.cgi) с последующим анализом в программах "DNAStar" ("LaserGene") и OLIGO 6.0. Изменения в уровнях экспрессии генов рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы REST Tool VI.9.9 (Corbertt Research, США), обладающей возможностью статистической обработки данных (Pfaffl et al., 2002). Поиск и идентификацию белков-мишеней ладастена проводили в. Центре Протеомных исследований Института биомедицинской химии РАМН (г. Москва) методом двумерного электрофоретического разделения белков с последующей их идентификацией методом времяпролетной масс-спектрометрии (20-PAGE - MALDI-TOF, http://www.expasv.org/ch2d/: Shevchenko et al., 1996). Белки идентифицировали с использованием алгоритма анализа пептидного фингерпринта с помощью программного обеспечения Mascot и базы данных NCBI.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Краткая характеристика изучаемого препарата.

Бромпроизводное 2-аминоадамантана ладастен (М-(2-адама!ггил) N-парабромфениламин), синтезированный и доклинически изученный в ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, разработан и внедрен в медицинскую практику в качестве психостимулятора с анксиолитической и актопротекторной активностью (Морозов и др., 1993). Как показывают многочисленные данные поведенческих, биохимических и фармакологических исследований, позитивное влияние ладастена на работоспособность обусловлено особенностями физико-химических, фармакокинстических свойств препарата, и в значительной степени -комплексным воздействием на центральные нейромедиаторные и функционально и анатомически связанные нейроэндокринные и нейроиммунные системы мозга (Морозов и др., 2001). Несмотря на то, что спектры фармакологической активности ладастена достаточно полно и подробно охарактеризованы на поведенческом и биохимическом уровнях, детали клеточных и молекулярных механизмов кратковременных и долговременных эффектов препарата практически не изучены. С целью изучения молекулярных механизмов реализации фармакологических эффектов ладастена, нами проведен поиск генов и белков, дифференциально экспрессирующихся в клетках головного мозга крыс в ответ на однократное введение препарата современными методами анализа экспрессионного статуса генов и белков.

2. Анализ дифференциальной экспрессии генов в клетках головного мозга крыс при однократном воздействии ладастена методом гибридизации на макрочипах "Atlas™ Rat cDNA Expression Array".

На рис.1 представлены радиоавтографы кДНК макрочипов контрольного и

опытного вариантов (гибридизация на "Atlas™ Rat cDNA Expression Array", 588 генов), на которых отмечены наиболее значимые дифференциально экспрессирующиеся гены. Количественный анализ результатов 3-х гибридизаций позволил нам выявить 15 из 588 генов, воспроизводимо меняющих уровень экспрессии в клетках мозга крыс в ответ на однократное воздействие ладастена (табл.1). Выявлено усиление транскрипционной активности генов А PC, Rb, Tubal, ß-actin и ингибирование - hsp70, Calm, PLP, NSE, Gapdh, Syn IA&IB, IIA&IIB, PMCA, GA T3, CARBH, PKCIP.

3. Анализ дифференциальной экспрессии генов в клетках головного мозга крыс при однократном воздействии ладастена методом гибридизации на макрочипах "Atlas Rat 1.2 cDNA Expression Array".

Для дальнейшего поиска генов-мишеней, вовлеченных в реализацию

фармакологических эффектов ладастена, был проведен расширенный анализ экспрессии 1176 фрагментов кДНК известных генов крысы. Как следует из табл.2, через 1.5 ч после однократного воздействия ладастена происходит ингибирование транскрипционной активности генов bHIH, RNA polymerase 1127 kDa subunit, Thymus cell surface antigen, cis-Golgi matrix protein GM130, galanin receptor 3, noggin, hypocretin (orexin) neuropeptide precursor, skeletal muscle tyrosine kinase receptor и emerin (в пределах 2% - 77% от уровня контроля); и усиление - CPG2, 140-Ю NCAM, гЕХ070, rabphilin-ЗА, cell cycle progression-related protein D123, RAB7, gro (от 1.5 до 4.2 раз).

4. Подтверждение дифференциальной экспрессии генов, идентифицированных гибридизацией на кДНК макрочипах, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Результаты гибридизационного анализа подтверждали с помощью

количественной оценки транскрипционной активности всех указанных генов методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (табл.3 и табл.4). Данный метод позволяет провести полуколичественную оценку изменений экспрессионного статуса генов. Значения пороговых циклов и эффективности ПЦР, полученные в ходе построения стандартной кривой ПЦР на "iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection System" ("BIORAD", США), использовались в программе REST Tool VI.9.9 (Corbertt Research,

контроль экспрессирующиеся гены

Рис.1. Радиоавтографы гибридизации на Atlas™ Rat cDNA Expression Array. А- контроль; Б -ладастен (50 мг/кг).

Линиями отмечены гены, дифференциально экспрессирующиеся в клетках головного мозга крыс в ответ на однократное введение ладастена. Нижние прямоугольники обозначают положение контрольных сигналов: ДНК фага X (отрицательный контроль); гены "домашнего хозяйства".

Таблица 1. Влияние однократного воздействия ладастена на экспрессию генов в клетках головного мозга крыс (Atlas™ Rat cDNA Expression Airay)

Название гена Номер GENBANK Уровень экспрессии генов (опыт/контроль] Функциональная группа/локализация

hypoxanthine-guanlne phosphorlbosyl transferas (Hprt) M63983 1 Метаболизм белков/цитоплазматический белок

Adenomatosis polyposis coll protein (APC) D38629 2.0 Межклеточный трансдуктор/цитоплазматический белок, эндоплазматический ретикулум

cytoplasmic fi-actin (actln) vom? 1.75 Цитоскелет/белок цитоскелета

Tubal (tubulin alpha-1) V01227 1.62 Цитоскелет/белок цитоскелета

retinoblastoma susceptibility-associated protein (Rb) D25233 1.50 Суперссор онкогенов/ядерный белок

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) M17701 0.72 Метаболизм/цитоплазматический белок

Heat shock 70 kDa protein (Hsp70) Z27118 0.68 Белок теплового шока/цито плазматический белок

PKC inhibitor protein-l(PKCIP) D17615 0.66 межклеточный сигналлинг/цитоплазматический белок

Calmodulin (Calm) X13817 0.63 Са*2-связывающий белок/цитоплазматический и ядерная локализация

Synapsins 2АЛ2В (Syn2A&2B) M27925 0.60 Экзоцитоз/белок цитоскелета

GABA transporters (GAT3) M95738 0.57 Транспорт/белок плазматическиой мембраны

myelin proteoiipld protein (PLP) M11185 0.52 Межклеточное взаимодействие/белок плазматической мембраны

neuron-specific enoiase (NSE) AFO19973 0.47 Энергетический метаболизм/цитоплазматический белок

plasma membrane calcium-transporting A TPa (PMCA) J03754 0.44 Переносчик АТФазы/белок плазматической мембраны

Synapsins 1A&1B (Syn1A&1B) M27812 0.43 Экзоцитоз/белок цитоскелета

carboxypeptidase H (CARB H) J04625 0.42 лосггрансляционная модификация белков/ цитоплазматический белок

Таблица 2. Влияние однократного воздействия ладастена на экспрессию генов в головном мозге 1фыс (Atlas Rat 1.2 cDNA Expression Array)

Название гена Номер GENBANK Уровень экспрессии генов (опыт/контроль) Функциональная группа/локализация

hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferas (HPRT) M63983 1 Метаболизм белков/ цитоплазматический белок

seminal vesicle SVS-protein S X01114 4.25 Внеклеточный транспорт/внеклеточно-секретируемый белок

ГВХ070 AF032667 2.9» Экзоцитоз/ белок плазматической мембраны

140-kD NCAM polypeptide X06564 2.83 Клеточные взаимодействия/ белок плазматической мембраны

cell cycle progression-related protein D123 U34843 2.47 Неклассифицированна/ цитоплазматический белок

unidentified mRNA expressed in embryo and tumor but not normal differentiated ceils K02816 2.40 Активация транскрипции/ядерный белок

rabphllin-3A U12571 2.27 Экзоцитоз/ цитоплазматический белок

RAB7/member RAS oncogene family X12535 1.92 Транспорт, модулятор ГТФ-азной активности С-белка/ белок плазматической мембраны

Cro D11444 1.80 Фактор роста/ внеклеточно-секретируемый белок

CPG2 protein X95466 1.43 Клеточные взаимодействия/ внеклеточно-секретируемый белок

Thymus cell surface antigen X03150 0.77 Антиген/ белок плазматической мембраны

Creatine kinase, muscle form M14864 0.73 Энергетический метаболизм/цитоплазматический белок

cIs-Golgl matrix protein GM130 U35022 0.68 Экзоцитоз/ комплекс Гольджи

EH domain-binding protein epsin (EPN) AFO18261 0.66 Эндоцитоз/цитоплазматический белок

Emerln X98377 0.50 Неклассифицированна/ ядерные мембраны и поры

Noggin U31203 0.50 Внеклеточный транспорт/ внеклеточно-секретируемый белок

ether-a-go-go-like potassium channel 1 (ELK1); BEC2 protein AJ007628 0.47 Ионные каналы/белок плазматической мембраны

skeletal muscle fyros/ле kinase receptor (MUSK) U34985 0.41 Протеин-киназа/ белок плазматической мембраны

N-hydroxy-2-acetyiaminofluorene (ST1C1) L22339 0.31 Метаболизм ксенобиотиков/цитоплазматический белок

Basic helix-loop-helix transcription factor (bHIH) U58279 0.25 Транскрипционный фактор/ ядерный белок

Hypocretln (orexin) neuropeptide precursor AFQ19565 0.23 Нейропептид/ внеклеточно-секретируемый белок

nuclear pore complex protein 84 (NUP84); 84-kDa nucleoporin U93692 0.20 Неклассифицированна/ядерная мембрана

RNA polymerase 1127 kDa subunit AF025424 0.17 РНК-полимераза/ ядерные белки

galanin receptor 3 AF031522 0.02 Рецептор/ белок плазматической мембраны

США) для определения относительного уровня мРНК подтверждаемых генов. Из 38 генов, идентифицированных на макрочипах обоих форматов, данным методом подтвержден экспрессионный статус 26 генов. Применение экспрессионных кДНК-макрочипов и количественной ОТ-ПЦР позволило нам установить, что ладастен влияет на экспрессию генов структурно и функционально различных белков. Ниже описаны возможные последствия индуцируемых ладастеном изменений в экспрессии генов и их взаимосвязь с механизмами действия и его фармакологической активностью.

Гены ферментов метаболизма

Однократное введение ладастена ингибирует экспрессию генов NSE (82% от уровня контрольных значений) и Gapdh (63%), кодирующих ферменты аэробного гликолиза - нейрон-специфичную енолазу [ЕС 4.2.1.11] и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу [ЕС 1.2.1.12]. Ладастен, как показано ранее, снижает уровень глюкозы и инсулина в крови, что, вероятно, обусловлено незначительным активирующим влиянием на симпато-адрсналовую систему (Морозов и др., 2001). Подавление ладастеном транскрипции генов некоторых ферментов гликолитического пути может свидетельствовать об адаптивном снижении интенсивности гликолиза в ответ на уменьшение поступления глюкозы в клетки головного мозга.

Гены регуляторных нейропептидов

Карбоксипептидаза Н (CARB Н) - один из основных ферментов посттрансляционного процессинга предшественников эндогенных опиоидов (р-эндорфинов, Met- и Ьеи-энкефалинов) и регуляторных пептидов (адренокортикотропный гормон, вазопрессин, окситоцин, мсланотропин; Akil et al., 1998). Гиноталамо-гипофизарно-кортикоадреналовая система (11 КС) - важнейшая пептидергическая нейросекреторная система, активация которой под действием различных стрессовых факторов обеспечивает перестройку и адаптацию механизмов поддержания гомеостаза (Хайдарлиу, 1989). Обнаружено, что однократное введение ладастена приводит к длительному снижению содержания кортизола в сыворотке крови крыс (Халимов и др., 1997). Еще один возможный механизм регуляции активности ГГКС, частично определяющий антистрессовое действие ладастена, - его влияние на биосинтез нейропептидов. Ингибирующсе влияние ладастена на экспресс-

Таблица 3. Подтверждение результатов гибридизации мРНК Atlas™ Rat cDNA Expression Array на методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Название гена Уровень экспрессии ОТ-ПЦР (доверит, интервал) Р Характер изменения

hypoxanthine-guanlne phosphoribosyl transferas (Hprt) 1,000 (0,804-1,219) 1,000 я

Adenomatosis polyposis coli protein (APC) 2,078 (1,598-2,656) 0,003 т

cytoplasmic P-Hctln (actin) 1,814 (1,480-2,217) 0,001 Î

retinoblastoma susceptibility-associated protein (Rb) 1,754 (1,307 - 2,436) 0,001 t

Tubulin alpha-1 (Tubal) 1,635 (1,231-2,295) 0,054 т

PKC inhibitor protein-l(PKCiP) 0,855 (0,742-0,985) 0,003 4

neuron-specific enolase (NSE) 0,820 (0,617-1,070) 0,055 1

plasma membrane calcium-transporting A TPa (PMCA) 0,796 (0,629-1,009) 0,156 1

myelin proteolipid protein (PLP) 0,648 (0,513-0,821) 0,001 1

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 0,631 (0,339-0,950) 0,052 1

GABA transporter3(GAT3) 0,625 (0,546 - 0,725) 0,001 1

synapsins 1A&1B (Syn1A&1B) 0,440 (0,335 - 0,574) 0,001 1

CarboxypepOdase H (CARB H) 0,095 (0.079 - 0,109) 0,001 1

Статистически значимые различия в экспрессии генов при р<0,05. Т и 4- - повышение и понижение экспрессии, соответственно.

сию гена CARB Н (10% от контроля) может свидетельствовать об участии регуляторных пептидов в проявлении его нейротропных, иммуномодулирующих и антистрессовых активностей.

Гипокретины (орексины) - регуляторные нейропептиды, специфически экспрессирутощиеся в латеральном гипоталамусе. Установлена роль этих нейропептидов в регуляции циклов сна и бодрствования, пищевого поведения, функций автономной нервной системы, стрессовых реакций (Kukkonen et al., 2002). Стрессогенный эффект гипокретинов опосредуется активацией гипоталамо-гипофизарной и дофаминергических центральных систем (Meghan et al., 2002). Влияние ладастена на экспрессию гена предшественника гипокретина (32% от уровня контроля), выявленное в наших экспериментах, свидетельствует об участии данной нейропептидной регуляторной системы в механизмах стресспротекторных и, возможно, противотревожных свойств препарата. Как показывают результаты наших

Таблица 4. Подтверждение результатов гибридизации мРНК Atlas Rat 1.2 cDNA Expression Array на методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Название гена Уровень экспрессии ОТ-ПЦР (доверит, интервал) Р Характер изменения

hypoxanthlne-guanine phosphoribosyl transients (HPRT) 1,000 (0,801 -1,249) 1,000 =

cell cycle progression-related protein D123 4,502 (3,402 - 6,083) 0,001 т

rabphiiin-ЗА 2 547 (2,118-3,135) 0,001 т

rEXOTO 2,542 (2,229-2,875) 0,001 Î

CPG2 protein (CPG2) 1,862 (1,506 - 2,334) 0,001 т

RABT/member RAS oncogene family 1,479 (1,206-1,873) 0,028 т

140-kD NCANt polypeptide (140-NCAM) 1,455 (1,163-1,736) 0,001 Î

Gro 1,308 (0,946 - 2,037) 0,098 t

Thymus cell surface antigen 0,872 (0,741-1,028) 0,222 4

Emerin 0,681 (0,586 - 0,782) 0,002 4

Basic helix-loop-helix transcription factor (bHIH) 0,580 (0,415-0,800) 0,056 i

RNA polymerase 1127 kDa subunlt 0,442 (0,325 - 0,567) 0,001 4-

Noggin 0,345 (0,275 - 0,448) 0,001 • 4.

Hypocretin neuropeptide precursor 0,32 (0,29 - 0,36) 0,001 4-

Galanin receptor 3 0,136 (0,112-0,169) 0,001 4

Статистически значимые различия в экспрессии генов прир<0,05. Т и 4- - повышение и понижение экспрессии, соответственно.

исследований, еще одной пептидергической системой, вовлеченной в механизмы нейротропных эффектов ладастена, является система гапанина. Ладастен выраженно ингибирует экспрессию гепа рецептора галанина 3 (13% от контрольных значений). Галанин — ингибиторный нейропептид, экспрессируется совместно с ингибиторными нейромедиаторами - ГАМК, нейропептидом . Y, веществом Р и регулирует высвобождение ацетилхолина, норадреналина, серотонина и дофамина (Bartfai et al., 1993). Галанин проявляет широкий спектр биологической активности — участвует в регуляции пищевого поведения, болевой чувствительности, контроле высвобождения инсулина и др. Установлена роль галанина в патогенезе болезни Альцгеймера, а также в механизмах обучения и памяти (Counts et al., 2003).

Гены синаптических белков и цитоскелета

За последние годы накоплено много данных о влиянии психостимуляторов, антидепрессантов и других психоактивных веществ на структуру и активность компонентов синаптического проведения сигнала, на функциональную активность везикулярных, мембранных, транспортных и цитоскелетных белков (Berke et al., 1998). Продукт гена GAT - осуществляет обратный захват и перенос высвободившегося в синаптическую щель ГАМК, что является одним из механизмов поддержания оптимального уровня нейромедиатора (Masson et al., 1999). Ладастен, как показано ранее, обладает анксиолитической активностью, реализация которой сопряжена преимущественно с активацией ГАМКергической нейромедиаторной системой (Середенин и др., 1999). Полученные нами данные о влиянии ладастена на обратный захват ГАМК (ингибирование гена GAT3 на 35%) согласуются с известными ранее фактами, поскольку увеличение уровня ГАМК в области ГАМКд -бензодиазепинового рецепторного комплекса повышает его связывание с бензодиазепиновым сайтом. Таким образом, GAT3 можно рассматривать как новую молекулярную мишень для ладастена.

Протеолипидный белок (PLP) - один из основных компонентов миелина (50% белка миелина; Boggs et al., 1978). PLP способствует компактизации и стабилизации миелиновой оболочки, необходимой для нормального функционирования цитоскелета аксонов (MacMillan et al., 2000). Ввиду разнообразия функций PLP сложно однозначно интерпретировать полученные нами данные о влиянии ладастена на экспрессию гена PLP (ингибирование на 46%), однако можно предположить, что изменение его транскрипционной активности приводит к нарушению образования миелина или является неспецифической реакцией па индуцированное препаратом усилите активности нейронов. Синапсины - локализованные в пресинаптических нервных окончаниях фосфопротеины, специфически ассоциированные с внешней поверхностью мембраны синаптических везикул. Они взаимодействуют со многими белками цитоскелета и обратимо связывают синаптические везикулы с актиновыми микрофиламентами. Фосфорилирование РКА или CaMKIV и CaMKII синапсина I приводит к диссоциации тройного комплекса везикулы-синапсин 1-актин, высвобождению везикул с последующим экзоцитозом нейромедиаторов и сопровождается увеличением содержания свободного синапсина I в цитозоле

(Greengard et al., 1993). Ранее нами показано, что однократное воздействие ладастена вызывает усиление фосфорилирования СаМКП в гипоталамусе и стриатуме крыс (данные не опубликованы). Наблюдаемое подавление транскрипции гена Syn IA&IB (42 % от контроля) происходит, возможно, по механизму обратной связи в ответ на повышение уровня синапсина I. Rabphillin3a и RAB7 являются представителями семейства белков малых ГТФаз (Stenmark et al., 2001), участвующих в процессах направленного перемещения и прикрепления (targeting and docking) везикул к активным зонам плазматической мембраны пресинаптического нервного окончания (Ali et al., 2005). Помимо участия в экзоцитозе, Rab белки регулируют механизмы внутриклеточного мембранного переноса, транспортируя вновь синтезированные молекулы от комплекса Гсшьджи к другим клеточным компартментам (Chen et al., 2001). Полученные нами данные позволяют предположить, что ладастен оказывает влияние на процессы аксонального транспорта и экзоцитоза. везикул, о чем свидетельствует воздействие препарата на транскрипционную активность генов гЕХО70 (увеличение уровня мРНК в 2.5 раза), rabphilin-iA (индукция в 2.5 раза), RAB7 (увеличение в 1.5 раза). Влияние ладастена на экспрессию генов гЕХ070, rabphilin-ЗА, RAB7 позволяет раскрыть детали механизмов действия препарата на различные этапы процесса синаптической нейропередачи (экзоцитоза, мембранного транспорта) и вносят вклад в понимание молекулярных основ мембранотропных свойств препарата. В ряде работ показано, что общими мишенями для соединений, индуцирующих нейрональную активность, служат гены структурных белков цитоскелета (Freeman et al., 2002; Sokolov et al., 2003; Jayanthi et al., 2002; Freeman et al., 2001). Увеличение транскрипционной активности генов тубулина (в 1.6 раза) и актина (в 1.8 раза) под действием ладастена свидетельствует, вероятно, об адаптивных изменениях структурных элементов клетки, что является проявлением феномена синаптической пластичности.

Гены компонентов сигнальных путей

Нами ранее выявлено участие сАМР-, Са2+-фосфолипяд- и Са 2+/кальмодулин-зависимых сигнальных систем в проявлении активностей ладастена (Вахитова и др., 2004). В данной серии экспериментов нами установлено изменение под действием ладастена экспрессии генов РМСА (80% от значений контроля) и PKCIP (85%). Геи PKCIP кодирует специфический белковый ингибитор РКС, модулирующий

активность протеинкиназы С. Белок PKCIP связывает фосфоршшрованные белки-мишени, действуя как адапторный белок компонентов сигнальных путей, и препятствует их прямому взаимодействию друг с другом (Yaffe, 2002). Плазматическая Са2+-АТРаза (РМСА) - интегральный компонент системы, контролирующей уровень Са2+в нейронах. РМСА играет ключевую роль в восстановлении базального уровня Са2+ в цитоплазме после воздействия стимулов, вызывающих приток Са2+ в клетку (Carafoli, 2002). Ранее мы обнаружили резкое увеличение активности в клетках мозга Са2+-АТРазы через 0.5 ч после введения ладастена и постепенное снижение активности фермента в течение следующих 1.5 ч (Вахитова и др., 2004). Подавление транскрипции гена РМСА происходит, вероятно, в ответ на избыточную активацию Са2+-АТРазы по механизму обратной связи.

Следует отметить, что лишь часть идентифицированных нами генов может рассматриваться в качестве фармакологически значимых мишеней ладастена (GAT3, CARB Н, hypoeretin, galanin receptor3). Изменения активности транскрипции генов, кодирующих белки компонентов различных сигнальных путей {РМСА, PKCIP), структурных элементов нервных клеток (Syn IA&IB, PLP, rEX070, rabphilin-3A, RAB7, actin, Tuba), ферменты (NSE, Gapdh), могут быть связаны с проявлением пластичности нейронов и отражать процессы координированной компенсаторной перестройки структурно-метаболических потребностей клеток в ответ на лекарственное воздействие,

5. Поиск и идентификация белков-мишеней ладастена С использованием 2П-гель-электрофореза (рис.2) получены протеомные карты исследуемых образцов. При помощи MALDI-TOF-масс-спектрометрии трипсинового гидролизата из образцов контрольного и опытного вариантов проанализировано и идентифицировано 14 белков, различающихся по уровню их экспрессии в мозге крыс через 1.5 часа после введения ладастена (табл. 5)..

Установлено увеличение экспрессии ряда белков-шаперонов - proteasome 26S ATPase subunit 4 (139%), hypoxia up-regulated 1 (163% or контроля), heat shock 70kD protein 5 (122%), valosin-containing protein (122%) - которые осуществляют селективную деградацию белков, участвуют в фолдинге белков, выполняют транспортные функции (Dai et al., 2001; Calabrese et al., 2002; Stacchiotti et al., 1997;

Hypoxia up-regulated 1

& Clathrinlight^A- £ H- "

I. ' ^

10

«FlUctose-bisphosphtfte aldolase

.glyccrailcliydej-phoephate-dehydrogenase

Б Pi

Mw, kDa

U

250 '

Hypoxia up-regulated 1

Рис.2.2-0 электрофорез белков головного мозга крыс после однократного внутрижелудочного введения ладастена (50 мг/кг). Стрелками обозначены дифференциально-экспрессирующиеся белки, интенсивность которых превышает пороговое значение, необходимое для идентификации пятна при помощи масс-спектрометрии. (А-контроль, Б-опыт).

Таблица 5. Протеомный анализ белков головного мозга крыс при однократном внутрижелудочном введении ладастена (50 мг/кг).

Название белка Номер no NCBI Молекулярная масса, Da Изоэлектрическая точка, Pi Уровень экспрессии ± стантд. отклонение Р

Hypoxia up-regulated 1 gi|20302024 111220 5,11 1,63310,04 0,102

Clathrin light chain A gi|116503 26964 4,41 1,582±0,034 0,124

Tubulin alpha 6 gi|34868254 63023 5,86 1,51310,038 0,163

Proteasome 26S ATPase subunlt 4 gi|38970025 47379 5,09 1,391 ±0,030 0,079

Alpha-internexin (Alpha-lnx) gi|1703221 56082 5,2 1,29610,092 0,052

Dihydropyrimidinase-like 2 gi|40254595 62239 5,95 1,233±0,016 0,033

Heat shock 70k0 protein 5 gi| 38303969 72302 4,7 1,22610,032 0,046

Valosin-containing protein gi|38014694 89293 5,14 1,22610,028 0,061

Fructose-bisphosphate aldolase (EC 4.1.2.13) A gi[68186 39235 8,31 0,90010,411 0,096

glyceraldehyde 3- phosphate- dehydrogenase gi|56188 35813 8,26 0,79910,036 0,117

Glycoprotein lb (platelet) gi|16758814 43892 6,34 0,76410,038 0,054

Similar to OCT (chaperonin containing TCP-1) epsllon subunlt gi|34854923 69428 6,70 0,62510,029 0,078

Similar to Electron transfer flavoprotein alpha-subunit gl|27720225 34929 8,62 0,49010,050 0,114

Neuronal protein 22 gi| 18252579 22486 6,84 0,38710,043 0,069

Wynn et al., 1994). Выявленное ранее защитное действие ладастена на клетки при интенсивных физических нагрузках (Морозов и др., 1993) может быть обусловлено вовлечением стрессовых белков в механизмы цитопротективного эффекта препарата. Незначительное ингибирование экспрессии ферментов гликолиза - fructose-bisphosphate aldolase А [ЕС 4.1.2.13] (90% от контроля) и glyceraldehyde 3-phosphate-dehydrogenase [ЕС 1.2.1.12] (79%), вероятно, свидетельствует о снижении гликолиза в клетках мозга при действии ладастена. Увеличение экспрессии синаптических белков — tubulin (151%), alpha-internexin (129%, нейрональный белок промежуточных филаментов), clathrin light chain А (158%, основной компонент окаймленных

пузырьков, участвующих в эндоцитозе и осуществляющих транспорт между аппаратом Гольджи, лизосомами, эндосомами и цитоплазматической мембраной; Pearse et al., 1975), collapsin response mediator protein 2 (125%, участвует в механизмах увеличения конусов роста аксона, ассоциации микротрубочек; ассоциирован с патогенезом болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний; Gu et al., 2000; Yoshida et al., 1998; Inagaki et al., 2001), neuronal protein 22 (38%, взаимодействует с элементами цитоскелета; Depaz et al., 2005) - вероятно, сопряжено с морфологическими и пластическими адаптивными изменениями в клетках, увеличением интенсивности процессов экзо- и эндоцитоза в ответ на усиление нейрональной активности, индуцированной ладастеном.

В заключении хотелось бы отметить, что проведенные нами исследования вносят вклад в доклинические аспекты разработки лекарства, углубляя и дополняя представления о механизмах фармакологической активности- ладастена, что открывает новые перспективы его клинического применения и с другой стороны, демонстрируют возможности комплексного использования новых методов и подходов для анализа механизмов действия лекарственных средств.

21

ВЫВОДЫ

1. Впервые с помощью гибридизации на кДНК макрочипах проведен анализ спектра генов, дифференциально экспрессирующихся в клетках головного мозга крыс в ответ на однократное воздействие нейротропного лекарственного средства ладастена.

2. Показано, что ладастен в клетках головного мозга крыс модулирует транскрипцио1шую активность генов ферментов гликолитического метаболизма, белков цитоскелета, синаптических функций, опухолевых супрессоров, регуляторных нейропегггидов и внутриклеточного сигналинга.

3. В качестве фармакологически значимых генов-мишеней ладастена следует рассматривать гены ферментов гликолиза Gapdh и NSE, ферментов, участвующих в синтезе опиоидных и других регуляторных пептидов CARB Н, hypocretin, galanin receptor 3 и мембранного транспортера GAT3.

4. Методами протеомного анализа выявлено и идентифицировано 14 белков, различающихся по уровню их экспрессии в мозге крыс через 1.5 часа после введения ладастена.

5. Мишенями ладастена, ассоциированными с его фармакологическими активностями являются следующие белки: ферменты гликолитического метаболизма - fructose-bisphosphate aldolase А и glyceraldehyde 3-phosphate-dehydrogenase, белки синаптических функций - neuronal protein 22 и collapsin response mediator protein 2.

6. Использованные нами методические подходы позволяют обосновать молекулярные механизмы реализации биологических активностей нового нейротропного лекарственного средства ладастена и тем самым прогнозировать спектры фармакологических свойств и возможные побочные эффекты препарата, а также открывают новые перспективы его клинического применения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вахитова Ю.В., Ямиданов P.C., Вахитов В.А., Середенин С.Б. Анализ изменений экспрессии генов в головном мозге 1фыс после одшяфатного воздействия производного 2-аминоадамантана с использованием кДНК макрочипов // Молекуляр. Биология. - 2005.- Т. 39, - № 2. - С. 276-285.

2. Вахитова Ю.В., Ямиданов P.C., Середенин С.Б. Влияние ладастена на экспрессию генов в мозге крыс // ДАН. - 2005. - Т. 401, - № 5.- С. 692-695.

3. Ямиданов P.C., Вахитова Ю.В. Поиск генов, модулируемых производными аминоадамантана // XVI Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. Февраль, 2004. - С. 131.

4. Yamidanov R.S, Vakhitova J.V, Mikhaylova M.G, Sercdcnin S.B. Gene expression patterns associated with psychostimulating drug. Ladasten action in rat brain// 6th Meeting of the German Neuroscience Society in Göttingen, Germany, 17-20 Febrary 2005. - V.2, -P. 112

5. R.S. Yamidanov, Vakhitova J.V., Seredenin S.B. Changes in gene expression profiles in rat brain induced by ladasten // 8th ECNP Regional Meeting, Moscow, Russia, 14-16 April, -2005.-P.184.

6. Vakhitova J.V., Salimgareeva M.Kh., Yamidanov R.S., Seredenin S.B. Use of DNA/Protein Array for profiling transcription factors activated by aminoadamantane compound Ladasten in rat brain // 8a ECNP Regional Meeting, Moscow, Russia, 14-16 April,-2005.-P. 182.

7. Vakhitova J., Salimgareeva M. Kh., Yamidanov R.S., Seredenin S.B. Use of DNA/Protein Array for proffiling transcription factors activated by aminoadamatane compound bromantan in rat brain// 18th ECNP Congress, Amserdam, The Netherlands, 2226 October, 2005. - Vol. 15. - P. 653.

8. Вахитова Ю.В., Ямиданов P.C., Садовников С.В., Салимгареева М.Х., Середенин С.Б. Геномные подходы к поиску новых терапевтических мишеней психотропных средств // Медицинская генетика. - 2005. -Т. 4, - № 4. - С. 165.

9. Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Ямиданов P.C., Середенин С.Б.. К механизмам фармакологической активности ладастена Н 4-я Международная конференция "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", Москва. Март, - 2006. - С. 18.

10. Ямиданов Р.С, Вахитова Ю.В., Середенин С.Б.. Протеомный анализ действия психостимулятора ладастена // 4-я Международная конференция "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", Москва. Март, - 2006. - С. 83.

ЯМИДАНОВ РЕНАТ САЛЕКОВИЧ

ГЕНЫ-МИШЕНИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БРОМПРОИЗВОДНОГО 2-АМИНОАДАМАНТАНА - ЛАДАСТЕНА В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 02.06.2006 г. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 '/16- Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7 Тираж 100 экз. Заказ № 371.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситст РОСЗДРАВА»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ямиданов, Ренат Салекович

Список сокращений и условных обозначений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика производных адамантана и их использование в практике

1.2 Физико-химические и фармакологические свойства ладастена

1.2.1 Физико-химические свойства и особенности фармакокинетики

1.2.2 Фармакологические свойства ладастена

1.2.2.1 Нейропсихотропные свойства

1.2.2.2 Иммунотропные свойства

1.2.2.3 Актопротекторные свойства и метаболические эффекты препарата

1.3 Новые подходы к исследованию молекулярных механизмов действия фармакологических средств

1.3.1 Методы изучения генной экспрессии

1.3.1.1 ДНК-гибридизация на микрочипах

1.3.1.2 ОТ-ПЦР в режиме реального времени

1.3.2 Методы изучения экспрессии белков

1.3.2.1 Двумерный электрофорез

1.3.2.2 Масс-спектрометрия

Глава 2. Объекты и методы исследований

2.1 Препарат

2.2 Объекты исследований

2.3 Выделение суммарной РНК из головного мозга крыс

2.4 Гибридизация на макрочипах

2.5 Анализ изображений радиоавтографов

2.6 Построение кДНК с помощью обратно-транскрипционной реакции

2.7 Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени

2.8 Двумерный электрофорез белков

2.9 Анализ изображений двумерных электрофореграмм

2.10 Гидролиз белков и МАЬБТ-ТОГ масс-спектрометрия

Глава 3. Результаты исследований

3.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов в клетках головного мозга крыс при однократном воздействии ладастена на чипе, содержащем 588 фрагментов генов

3.2 Анализ дифференциальной экспрессии генов в клетках головного мозга крыс при однократном воздействии ладастена на чипе, содержащем 1176 фрагментов генов

3.3 Подтверждение дифференциальной экспрессии генов, идентифицированных в результате гибридизации на кДНК макрочипах, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени

3.4 Поиск и идентификация белков-мишеней ладастена

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1 Поиск и идентификация генов - мишеней ладастена

4.1.1 Гены ферментов различных метаболических путей

4.1.2 Гены регуляторных нейропептидов и их рецепторов

4.1.3 Гены мембранных транспортеров

4.1.4 Гены белков синаптических функций

4.1.5 Гены белков цитоскелета и межклеточных взаимодействий

4.1.6 Гены, кодирующие компоненты сигнальных путей

4.1.7 Гены опухолевых супрессоров

4.2 Поиск и идентификация белков - мишеней ладастена

4.2.1 Белки-ферменты гликолитического метаболизма

4.2.2 Стрессовые белки и белки- шапероны

4.2.3 Защитные белки

4.2.4 Синаптические белки

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гены-мишени фармакологического действия бромпроизводного 2-аминоадамантана-ладастена в клетках головного мозга крыс"

Актуальность проблемы. Изучение механизмов реализации фармакологических активностей лекарственных средств является приоритетной задачей фундаментальной фармакологии и основой безопасного и эффективного их клинического применения. Традиционные фармакологические подходы, ориентированные прежде всего на отбор веществ, потенциально обладающих заданными активностями, а также на первичный скрининг спектров их фармакологических свойств, не предусматривает разработку лекарственных препаратов на основе знания механизмов реализации их активности. Поэтому для более рационального использования фармакологических средств необходимо детальное знание путей их воздействия на клетку, ткань и организм в целом. Как известно, введение лекарственных препаратов приводит к изменению функционального состояния большого количества мишеней разного уровня, являющихся компонентами различных сигнальных, метаболических, транспортных и др. путей, что определяет множественность эффектов, часть из которых может быть даже нежелательной для конкретного лекарственного средства. Развитие принципиально новых молекулярно-биологических методов и подходов вносит очень важный вклад в познание механизмов действия лекарственных препаратов. Переход на качественно иной уровень разработки и анализа свойств лекарственных веществ был предопределен достижениями последних лет в области геномных исследований, молекулярной биологии, биоинформатики, которые открыли новые перспективы и для фармакологии, прежде всего в свете возможностей более полной характеристики механизмов действия лекарственных средств (Colantuoni et al., 2000; Green et al., 2001; Ishii et al., 2000). В настоящее время на ранних этапах разработки лекарств, а также при углубленном изучении механизмов действия как новых, так и хорошо известных лекарственных средств широко применяются различные методы анализа функционального состояния потенциальных биологических мишеней — генов и кодируемых им белков (Collins, 1999; Luo et al., 2001; Marcotte et al., 2001). Различные биочипы, количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени, 2D- электрофорез белков и другие методы анализа дифференциально экспрессирующихся генов и белков (SAGE, SSH, TOGA, ES-MS-MS, MALDI-MS и др.) являются стандартными инструментами поиска, идентификации и последующей валидации генов и белков, ассоциированных как с терапевтическими, так и с возможными побочными эффектами лекарственных средств.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является поиск и идентификация генов и белков - мишеней, дифференциально экспрессирующихся в клетках головного мозга экспериментальных животных и определяющих реализацию фармакологических эффектов нового нейротропного лекарственного средства — ладастена. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Выявить спектр дифференциально экспрессирующихся генов в.клетках головного мозга крыс через 1.5 ч после однократного воздействия ладастена методом гибридизации на коммерческих макрочипах "Atlas™ Rat cDNA Expression Array" и "Atlas Rat 1.2 cDNA Expression Array" (BD Biosciences, США), содержащих 588 и 1176 генов соответственно.

2. Провести подтверждение уровня экспрессии выявленных генов-мишеней ладастена методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

3. Исследовать влияние ладастена на функциональное состояние белков в клетках головного мозга крыс через 1.5 часа после однократного воздействия препарата.

Научная новизна. Впервые проведен поиск и идентификация генов и белков-мишеней нового нейротропного лекарственного препарата ладастена в клетках головного мозга крыс. Показано, что однократное экспериментальное воздействие ладастена вызывает изменения уровня экспрессии 26 генов головного мозга крыс. Регулируемые ладастеном гены кодируют белки, относящиеся к функциональным группам онкогенов и опухолевых супрессоров

APC, Rb), компонентов цитоскелета (Tubal, actin), внутриклеточного сигналинга (PKCIP, РМСА), метаболизма (Gapdh, NSE), синаптических белков (Syn IA&IB, PLP, CPG2, rEX070, rabphilin-SA, RAB7), ферментов, участвующих в синтезе опиоидных и других регуляторных пептидов (CARBH, hypocretin, receptor galanin 3), мембранных транспортеров (GAT3), молекул клеточной адгезии (NCAM) и др. В качестве потенциальных фармакологически значимых мишеней ладастена следует рассматривать гены CARBH, hypocretin, galanin receptor 3 и GAT3, изменение активности которых позволяет объяснить отдельные механизмы анксиолитических и стресспротекторных свойств препарата.

Впервые идентифицированы 14 белков головного мозга крыс, значительно отличающихся по уровню их экспрессии в контрольных и опытных вариантах, в том числе - ферменты гликолитического метаболизма - fructose-bisphosphate aldolase А и glyceraldehyde 3-phosphate-dehydrogenase; белки-шапероны -proteasome 26S ATPase subunit 4, hypoxia up-regulated 1, heat shock 70kD protein 5, valosin-containing protein; транспортные, везикулярные белки и белки цитоскелета - tubulin, alpha-internexin, clathrin light chain A, collapsin response mediator protein 2, neuronal protein 22. В качестве мишеней фармакологического действия ладастена могут быть рассмотрены белки-ферменты гликолитического метаболизма, collapsin response mediator protein 2, neuronal protein 22. Увеличение экспрессии везикулярных, транспортных, цитоскелетных белков и некоторых других, вероятно, связано с механизмами нейропластичности, реализующимися в ответ на лекарственное воздействие.

Практическая значимость. Полученные нами данные о спектре генов и белков-мишеней вносят вклад в доклинические аспекты разработки лекарств, углубляя и дополняя представления о механизмах фармакологической активности ладастена, что открывает новые перспективы его клинического применения и с другой стороны, демонстрируют возможности комплексного использования новых методов и подходов для анализа механизмов действия лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XVI зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004 г.); на 6-ой конференции Немецкого Нейробиологического Общества (Gettingen, 2005 г.); на 8-ой Региональной конференции ECNP (Москва, 2005 г.); на V съезде Всероссийского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); на 18-ом конгрессе ECNP (Amsterdam, 2005); на 4-ой Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (10002-251/П-10/142-448/260503-196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ - 2217.2003.4), РФФИ - Агидель (02-04-97904).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 8 таблиц и 14 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования (глава 3) и их обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы, включающего 316 источников.