Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние бромпроизводного аминоадамантана - ладастена на активность протеинкиназ и фосфорилирование белков в клетках головного мозга и печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние бромпроизводного аминоадамантана - ладастена на активность протеинкиназ и фосфорилирование белков в клетках головного мозга и печени крыс"

На правах рукописи

САЛИМГАРЕЕВАМИЛЯУШАХАМИТОВНА

ВЛИЯНИЕ БРОМПРОИЗВОДНОГО АМИНОАДАМАНТАНА-ЛАДАСТЕНАНААКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНКИНАЗ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

И ПЕЧЕНИ КРЫС

03.00.04 - биохимия 14.00.25 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА-2004

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук Вахитова Юлия Венеровна доктор медицинских наук Вальдман Елена Артуровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Башкатов Сергей Александрович доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Защита состоится 4k июня 2004 г.

в fy часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 69. тел. (3472) 35-54-79, факс (3472) 35-60-88, e-mail: dissovibg@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71.

Автореферат разослан мая 2004 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета:

Ф.Р. Гималов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Фармакологические средства, созданные на основе адамантана, используются в клинической практике с середины 60-х годов, и с тех пор интерес фармакологов к лекарственным препаратам производным аминоада-мантана, не снижается. Это связано как с уникальными свойствами самой молекулы адамантана, так и с широким спектром фармакологической активности его производных (Багрий, 1989). К числу фармакологических препаратов, производных адамантана, относятся хорошо известное противовирусное средство ремантадин; противопаркинсонические - мидантан, гимантан; иммуномодулирующее средство - кемантан; психостимулятор - адапромин; эффективный при болезни Альцгеймера - мемантин и др. (Davies et al., 1964; Schwab, 1969; Stromberg et al., 1970; Галегов и др., 1979; Шмарьян и др., 1980; Атрошенко, 1997; Арцимович, Галушина, 1999).

Среди производных адамантана имеются соединения, способные повышать адаптационные возможности организма к действию комплекса экстремальных факторов среды обитания и деятельности - так называемые актопротекторы. Наиболее активными в этом отношении оказались производные 2-аминоадамантана, в частности, ладастен, содержащий Вг" в фенильном радикале у азота 2-аминоадамантана; адаптоген экстренного типа действия - хлодантан; комбинация бемитила с ладастеном - бромитил (Жирнов, 1991; Кундашев, 1992; Красных,

Производное 2-аминоадамантана - ладастен ^-^-адамантил)-^^ бромфениламин) разработан в качестве средства фармакологической коррекции изменений функционального состояния организма в условиях действия стрессор-ных факторов различной природы. Его особенностью является сочетание психостимулирующих и анксиолитических свойств, что, как полагают, обусловлено его регулирующим влиянием на центральные дофамин-, серотонин- и ГАМК-ергические медиаторные системы (Сергеева, 1993; Девойно, 1993; Морозов и др., 1995, 1999; Лосев и др., 1995). В то же время, большое разнообразие фармакологических эффектов ладастена предполагает разные механизмы их реализации, ко-

1995).

торые, как известно, сопряжены с активацией определенных внутриклеточных систем сигнальной трансдукции и/или их взаимодействием. В связи с этим особый интерес представляет изучение функционального состояния протеинкиназ, активируемых различными молекулами-посредниками, в частности, циклическим АМФ, CaJ+ и др. С активацией этих систем сопряжены такие фундаментальные клеточные процессы, как пролиферация, дифференциация, иммунный ответ и др. В то же время для более эффективного и безопасного использования фармакологических средств необходимо детальное знание путей их воздействия на клетку, ткань и организм в целом. Следовательно, изучение внутриклеточных систем сигнальной трансдукции, участвующих в реализации фармакологических эффектов ладастена, позволит понять некоторые молекулярные механизмы его действия.

При выборе органов (мозг, печень), в клетках которых изучали динамику активности протеинкиназ, руководствовались данными о фармакокинетике и фармакодинамике препарата при однократном его применении (Сергеева, Красных, 1995). Ладастен проявляет избирательную тропность к тканям мозга, через 10 мин после перорального введения коэффициент распределения составляет что свидетельствует о высокой проницаемости препарата через ге-матоэнцефалический барьер. Также ладастен быстро и в высоких концентрациях проникает в печень, максимальная концентрация наблюдается через 40 мин (Кр=6.5±0.32).

Цель и задачи исследования: Целью настоящего исследования явилось выявление основных внутриклеточных сигнальных систем, задействованных в реализации биологических эффектов ладастена.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. выявить влияние ладастена на включение vivo в белки мембран и цитоплазмы клеток головного мозга и гепатоцитов крыс;

2. изучить влияние ладастена на активность цАМФ - зависимых протеинки-наз в сочетании с уровнем фосфорилирования белков в клетках головного мозга и гепатоцитах крыс;

3. исследовать эффект ладастена на активность Са2<-фосфолипид-зависимых протеинкиназ в клетках головного мозга и гепатоцитах крыс;

4. оценить активность фосфорилированных форм Саг*/кальмодулин-зависимых протеинкиназ II типа в клетках гипоталамуса и стриатума, а также в клетках мозга в целом под влиянием ладастена;

5. определить уровень экспрессии митоген-активируемых киназ (ERK1/ERK2) и их активность в клетках головного мозга крыс и культуре клеток Т-лимфоцитов крови человека под действием ладастена.

Научная - новизна работы. Впервые показано участие цАМФ-, Са2+ фосфолипид-, Са5+-кальмодулинзависимых протеинкиназ II, МАП-киназ (ERK1/2 и pERKl/2) в реализации биологического действия ладастена. Выявлена основная роль Са2+-активируемых систем сигнальной трансдукции в этом процессе. Впервые обнаружена дифференциальная активация кальмодулинзависимых про-теинкиназ II в клетках стриатума и гипоталамуса через разные промежутки времени. Впервые экспериментально показано, что комитогенный эффект ладастена в культуре Т-лимфоцитов сопряжен с активацией конечного эффектора МАП-киназного каскада ERK2.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в познание отдельных молекулярных механизмов действия фармакологических препаратов аминоадамантанового ряда, в частности ладастена, и могут использоваться для разработки новых фармакологических модуляторов отдельных этапов сигналинга. Результаты работы могут быть использованы в лекционном материале при чтении курсов по биохимии и фармакологии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 2-ом Съезде Российского Научного Общества Фармакологов (Москва, 2003); 7-ой Пущин -ской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); Научно-практической конференции "Проблемы создания новых лекарственных средств" (Уфа, 2003); FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (Belgium, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования; главы, посвященной результатам собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 69 отечественных и 107 зарубежных источников литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследований были использованы беспородные белые крысы-самцы массой 180-250 г. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных". Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде суспензии: ла-дастен, нифедипин - в физиологическом растворе с добавлением Tween 80 (0.04%), циннаризин - в физиологическом растворе, контрольным животным -физиологический раствор с добавлением Tween 80. Дозы: ладастен (ГУЛ НИИ Фармакологии им. В. В. Закусова РАМН) 50 мг/кг, циннаризин (ICN, США) 50 мг/кг, нифедипин (ICN, США) 10 мг/кг. Декапитацию крыс проводили после однократного введения препаратов через 15 мин, 0.5 ч, 1 ч, 1.5 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, органы извлекали и быстро помещали в жидкий азот, затем растирали до порошкообразного состояния. В исследованиях использовали также лимфоциты периферической крови здоровых доноров-добровольцев.

В работе были использованы следующие методы. Выделение белков проводили стандартными методами (Sloboda, 1975; Liang, 1977; Элиот, 1981). Проте-инкиназную активность определяли по методу Киккава с сотр. (1983). Определение активности Са -АТФазы проводили по методу, описанному В.П. Скулаче-вым (1962). Для определения фосфорилирования белков in vivo (Loeb, 1970) через 15 минут после введения ладастена внутрибрюшинно вводили ортофосфорную кислоту в количестве 80 МБк. Процедуру иммуноблоттинга

осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя (оборудование производства BIO-RAD, антитела - Biosource, Cell Signaling, США). Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ) с 0.1%-ным ДДС-Na с линейным градиентом акриламида (6-16%). Количественную оценку оптической плотности полос на радиоавтографах проводили с помощью программы TotalLab. 2.O. (США). Эксперименты проводили в трех биологических повторностях от 2-х до 9 раз. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в рамках стандартного пакета методов статистического анализа Statistica for Windows V.5.O., а также с помощью программы MS Exe} 5.0. Различия считали существенными при уровне значимости Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

К началу наших исследований в литературе практически отсутствовали сведения о влиянии бромпроизводных аминоадамантана, в частности, ладастена на системы внутриклеточного сигналинга. Поэтому мы сочли целесообразным в первую очередь изучить вопрос о том, какие белки меняют свой статус фосфори-лирования под действием ладастена - локализованные на клеточной мембране или цитоплазме? Результаты представлены в таблице.

Влияние ладастена (50 мг/кг, 2 час) на включение [ИР] в мембраносвязанные и цитоплазматические белки головного мозга и печени крыс in vivo (в % к контролю)

Белки Головной мозг Печень

Цитоплазматические 302,6 ±7,13 114,0 ±5,24

Мембраносвязанные 506,0 ±28,3 Г 123,0 ±7,16*

Как видно из этих данных, ладастен усиливает включение радиоактивной метки как в цитоплазматические, так и мембраносвязанные белки обоих органов. В то же время, этот процесс более активно протекает в клетках головного мозга крыс. Обращает на себя внимание и более высокий уровень включения радиоактивного фосфора в мембранные белки мозга, что, возможно, обусловлено активацией некоторых рецепторов или мембранных ионных каналов клетки под действием ладастена, обладающего мембранотропным эффектом.

В дальнейшем мы изучали в основном цитоплазматические белки, так как нас больше интересовало влияние ладастена на функциональное состояние отдельных внутриклеточных сигнальных систем и сопряженное с этим фосфорили-рование белков.

Влияние ладастена на активность цАМФ - зависимых протеинкиназ в клетках головного мозга и печени крыс

Определение активности протеинкиназы А (ПКА) в растворимой фракции белков гомогената (супернатант после центрифугирования при 20000 g) головного мозга крыс проводили в пределах 30 мин после извлечения органов и их гомогенизации в соответствующем буфере. Активность протеинкиназы А идентифицировали с помощью высокоспецифичного ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ по уровню подавления им базальной или стимулированной цАМФ активности.

Как видно из рис. 1, ладастен на базальный уровень активности ПКА во всех исследованных промежутках времени значительного влияния не оказывает. Небольшое ее увеличение (около 10%) выявляется после одно- и шестичасового действия препарата. Следует отметить, что под действием ладастена через 0.5,2 и 12 ч в клетках головного мозга крыс проявляется протеинкиназная активность, которая не подавляется ингибитором, специфичным для ПКА.

в % к базальной активности

130

100

120

110

80 70

60

90

| 'базальная активность

"■• "ОПЫТ

• контроль

50 —(—+

-н

0,5 1 2

6

12 время, час

Рис. 1. Влияние ладастена на активность протеинкиназы А в растворимой фракции белков головного мозга крыс (субстрат - гистон Ш^) в присутствии высокоспецифичного ингибитора протеинкиназы А.

Введение в реакционную смесь избытка цАМФ увеличивает активность ПКА в клетках головного мозга крыс как в контрольном, так и опытном вариантах. При этом максимальная ее активность наблюдается через два часа после введения ладастена и превышает базалъный уровень на 36%, а протеинкиназная активность, стимулированная экзогенным цАМФ, в контрольном варианте увеличивается примерно на 53%.

В клетках печени активность ПКА, детектируемая белковым ингибитором, выявляется в первые два часа действия ладастена и превышает базальный ее уровень почти на 10%. Начиная примерно с 3-х часового интервала, в клетках печени под действием ладастена активируются протеинкиназы, не подавляемые высокоспецифичным ингибитором ПКА. Максимальная активность цАМФ-независимых протеинкиназ выявлена после 6-ти часового действия препарата. В отличие от опытного варианта, в контроле активность протеинкиназы А в исследованном промежутке времени, (0.5-12 ч) варьирует в пределах 7-16%. Избыток цАМФ в реакционной среде значительно увеличивает активность протеинкиназ в опытном варианте, причем максимальная их активность выявляется через 6 ч после введения ладастена. В отличие от клеток головного мозга, в гепатоцитах в опытном варианте цАМФ-индуцированная активность ПКА значительно ниже.

При использовании в качестве субстрата основного белка миелина проте-инкиназная активность в клетках головного мозга крыс, подавляемая ПКА, проявляется примерно через 8 ч после введения ладастена, достигая максимума при 12 часовом его действии (рис. 2). Обращает на себя внимание высокая активность протеинкиназ в клетках головного мозга крыс через 2 ч после введения ладасте-на. Их активность не подавляется ингибитором цАМФ-зависимых протеинкиназ и стимулируется избытком цАМФ.

в % к базальной активности

2 6 12 время, час

Рис. 2. Влияние ладастена на активность протеинкиназы А в растворимой-фракции белков головного мозга крыс (субстрат - основной белок миелина) в присутствии высокоспецифичного ингибитора протеинкиназы А.

Следует отметить, что в растворимой фракции белков головного мозга крыс при введении в реакцию избытка цАМФ значительно увеличивается активность протеинкиназ после 6-ти и 12-ти часового действия ладастена, однако они не ингибируются белковым ингибитором цАМФ-зависимых протеинкиназ.

Кроме того, под действием ладастена в клетках головного мозга крыс увеличивается фосфорилирование белков с молекулярными массами 14 и 30 кДа. Анализ имеющихся данных показывает, что они в головном мозге крыс могут соответствовать одной из изоформ основного белка миелина (14 кДа) и протеоли-пидному белку миелина (30 кДа) (Хухо, 1990).

Таким образом, ладастен при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг увеличивает базальный уровень активности протеинкиназы А в клетках головно-

го мозга и печени крыс в первые часы действия примерно на 10%. При цАМФ-стимулирующем воздействии на клетку ладастен способствует повышению активности протеинкиназы А в клетках головного мозга и снижению ее в гепатоци-тах. Ладастен повышает уровень фосфорилирования изоформы основного белка миелина с молекулярной массой 14 кДа и протеолипидного белка (30 кДа) головного мозга крыс. Представленные выше результаты позволяют сделать предположение о том, что в реализации фармакологического эффекта ладастена участвуют как цАМФ-зависимые, так и цАМФ-независимые сигнальные системы.

Влияние ладастена на активность Cai+ - фосфолипидзависимых протеинкиназ в клетках головного мозга и печени крыс

Определение активности протеинкиназы С (ПКС) проводили в растворимой фракции белков головного мозга и печени крыс в системе in vitro с использованием в качестве субстрата гистона III-SS (Sigma, США), а также с введением в реакционную среду и без него.

Как видно из рис. 3, в исследованном интервале времени ладастен оказывает существенное влияние на активность ПКС в клетках головного мозга. Выявлены три пика увеличения активности ПКС - через 0.5 ч, 4 ч и 8 ч. На наш взгляд, особого внимания заслуживает более чем 2.5-кратное увеличение активности ПКС через 0.5 ч после введения ладастена. в % к контролю

0,5 1,5 4 6 8 12 время, час

Рис. 3. Динамика активности протеинкиназы С в цитозольной фракции белков головного мозга крыс при однократном внутрижелудочном введении лада-стена (50 мг/кг). Субстрат - гистон III-SS.

Для идентификации активности ПКС в первые часы действия использовали ингибитор ПКС - стауроспорин (2.5 нМ; ISN, США). При наличии Са2+ через 0.5 ч после введения ладастена стауроспорин подавляет активность ПКС на 70%, через 4 ч - до уровня контроля. В случае отсутствия в среде Са2+ через 30 мин после введения ладастена стауроспорин ингибирует активность ПКС почти до уровня контроля, а через 4ч - наблюдается максимальное ингибирование.

Динамика активности ПКС в гепатоцитах под действием ладастена имеет ряд отличий от клеток головного мозга крыс: во-первых, достаточно высокая ее активность проявляется уже через 15 мин после введения препарата; во-вторых, 4-х часовое действие последнего приводит к значительному ингибированию активности ПКС; в-третьих, в гепатоцитах уровень активации ПКС в целом ниже, чем в клетках головного мозга.

Изменение концентрации Са2+ в клетках головного мозга и печени крыс под действием ладастена может быть связано как с высвобождением ионов кальция из кальциесом эндоплазматического ретикулума, так и их поступлением из межклеточного пространства вследствие активации мембранных кальциевых каналов. С целью проверки данного предположения активность ПКС в растворимой фракции белков головного мозга и печени крыс определяли после селективной блокады Са2+-каналов кальциесом циннаризином (50 мг/кг) и мембранных - нифеди-пином (10 мг/кг) на фоне действия ладастена и без него.

Результаты исследований показали, что оба блокатора кальциевых каналов в использованных нами концентрациях ингибируют активность ПКС в клетках головного мозга и гепатоцитах, причем действие циннаризина носит более выраженный характер (рис. 4). Следовательно, ладастен на начальных этапах действия на клетку способствует развитию кратковременной «кальциевой вспышки» в цитоплазме путем мобилизации ионов кальция из внутри- и межклеточных депо. Ингибирование активности ПКС при блокаде Са2+-каналов производным дигид-ропиридина в клетках обоих органов, вероятно, свидетельствует о том, что лада-стен активирует мембранные кальциевые каналы L-типа, характеризующиеся высокой проводимостью Са2+.

в % к контролю

140 т +Са2+ -Са2+

120 100 80 60 40 20 0

+Саг+ - Са2*

■ » контроль

опыт

ннфедипин + ладастсн

цивваризив + ладастен

Рис. 4. Влияние нифедипина и циннаризина на активность протеинкиназы С в цитозольной фракции белков головного мозга крыс на фоне действия ладастена (50 мг/кг) через 30 мин после однократного его внутрижелудочного введения. Контроль - нифедипин (10 мг/кг); циннаризин (50 мг/кг). Субстрат - гистон Ш-

Оптимальная концентрация ионов кальция в цитоплазме поддерживается разными механизмами, в том числе за счет изменения активности Са2+-АТФазы. Как в клетках головного мозга, так и печени крыс наблюдается резкое увеличение активности Са2+-АТФазы через 0.5 ч после введения ладастена, что, вероятно, связано с необходимостью удаления избыточной концентрации Са2+ из цитоплазмы для исключения их цитотоксического действия. В клетках головного мозга следующий пик активности Са2+-АТФазы выявляется в интервале времени от 8 до 12 ч после введения ладастена, что фактически совпадает со вторым максимумом увеличения активности ПКС в этом органе (рис. 5).

SS.

в % к контролю

700 600 ■ 500 ■ 400 ■ 300 ■ 200 • 100 •

0 ■

0,5 1,5 2 4 6 8 12 время, час

Рис. 5. Динамика активности Са -АТФазы в растворимой фракции белков головного мозга крыс при однократном внутрижелудочном введении ладастена.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что однократное внутрижелудочное введение ладастена в дозе 50 мг/ кг способствует существенному увеличению активности протеинкиназы С в цитозольной фракции белков головного мозга и печени крыс. При этом препарат оказывает влияние на функциональное состояние кальциевых каналов L-типа, которые блокируются нифедипином. Выявлено, что в первые часы действия ладастена оптимальная концентрация Са2+ в цитозоле клеток исследованных органов может поддерживаться путем активации Са2+-АТФазы.

Влияние ладастена на активность Са2+/кальмодулинзависимых протеинкиназ в клетках стриатума и гипоталамуса головного мозга крыс

Как отмечалось выше, ладастен оказывает влияние на мембранные Са2+-каналы и на начальных этапах действия способствует существенному притоку Са внутрь клетки. Одним из последствий этого является значительное увеличение активности протеинкиназы С. В то же время Са2+ может взаимодействовать с разными белками, активируя их.

Сопоставляя изложенный выше материал с некоторыми известными механизмами действия ладастена, можно предположить причастность Са2+-активируемых белков, в частности, кальмодулина, к отдельным звеньям биологического действия исследуемого нами препарата. С этой целью нами методом им-муноблоттинга исследована активность фосфорилированной формы Са2+/кальмодулинзависимой протеинкиназы II (pCaMKII) в разных структурах мозга крыс, в частности, в клетках стриатума и гипоталамуса.

а) контроль опыт

pCaMKII б) pCaMKII v * - *^Tt* * 100,0 ±22,12 Мшшшшть. 311,4 ±66,72*

в) 100,0 ±3,81 84,6 ±1,96

pCaMKII

100,0 ±4,74 113,0 ±1,97

Рис. 6. Содержание pCaMKII (The 286) в клетках стриатума головного мозга крыс после разового внутрижелудочного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю):

а-0.5 ч; б-1ч; в-2ч.

Как видно из рис. 6, ладастен через 0 5ч после внутрижелудочного введения более чем в три раза увеличивает содержание pCaMKII в клетках стриатума. Более продолжительное действие ладастена к данному эффекту не приводит, наоборот, наблюдается незначительное ингибирование фосфорилирования СаМКП.

В отличие от клеток стриатума, в клетках гипоталамуса через 0 5 и 1 ч после введения ладастена содержание фосфорилированной Са2+/кальмодулинзависимой протеинкиназы II увеличивается примерно на 25%,

достигая почти 200% к 2-х часовому интервалу действия препарата (рис. 7). В то же время, при определении содержания pCaMKII в клетках целого мозга схожая закономерность действия ладастена нами не была выявлена (рис. 8)

а) pCaMKII — контроль опыт ЩзЩШ

б) 100,0 ±8,51 125,7 ± 7,92

pCaMKII — 100,0 ±4,33 123,7 ±9,76'

в) pCaMKII — > | v. *

100,0 ±17,42 198,0 ±21,56*

Рис. 7. Содержание pCaMKII (The 286) в клетках гипоталамуса головного мозга крыс после разового внутрижелудочного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю):

а-0.5ч; б-1ч, в-2ч.

контроль опыт

pCaMKII — РШМ

100,0 ±7,57 75,0 ±9,49*

Рис. 8. Содержание pCaMKII (The 286) в клетках головного мозга крыс через 0 5 ч после разового внутрижелудочного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю).

Таким образом, внутрижелудочное введение ладастена в дозе 50 мг/кг приводит к дифференциальной активации Са2+/кальмодулинзависимой протеинкина-зы II в разных структурах головного мозга через разные промежутки времени. Сходный характер действия ладастена на содержание рСаМКП достаточно сложно интерпретировать. В качестве одной из версий можно предположить, что увеличение содержания рСаМКИ на ранних этапах действия ладастена, возможно, связано со стимуляцией высвобождения нейромедиаторов из нейронов, локализованных в стриатуме. Не исключено, что следующий этап увеличения содержания рСаМКИ в клетках гипоталамуса связан с необходимостью усиления биосинтеза нейромедиаторов по типу обратной связи до уровня физиологической потребности.

Влияние ладастена на активность митоген-активируемых киназ

Каскад митоген-активируемых киназ (МАПК) является основным путем сигнальной трансдукции, вовлекаемой в систему внутриклеточного сигналинга при активации рецепторов ростовых факторов. Рецепторы последних соединены с эффекторными G-белками, в частности, Ras-семейства, которые активируют МАП-киназный каскад при трансдукции митогенного сигнала (Bгunet et я1., 1995; Kalab et в!, 1996). Активность Ras-каскада (Ка8->КаГ->МЕК1/2->ЕКК1/2) связана с функциональным состоянием четырех киназ. Конечная киназа ERK1/2 фос-форилирует ряд белковых субстратов, в том числе транскрипционные факторы, которые повышают экспрессию "среднеранних генов" клеточного ответа на ми-тогенный сигнал.

Включение МАП-киназного каскада лимитируется двумя факторами: наличием активированного рецептора ростовых факторов и протеинкиназы С (Ozanne et я1., 2000). Как было изложено выше, ладастен в первые часы действия резко усиливает активность протеинкиназы С, что позволяет сделать предположение о возможности активации при этом и МАП-киназного каскада. С этой целью в клетках головного мозга нами исследована экспрессия ERK1/2 киназ и содержа-

ние фосфорилированных форм (pERKl/2), субстратами которых, как известно, являются некоторые онкогены, в частности c-fos, выполняющие функцию транскрипционных факторов (Sherr, Roberts, 1999; Wilkinson, Millar, 2000).

Как видно из рис. 9, через 0.5 ч после введения ладастена выявляется тенденция снижения экспрессии ERKl/2-киназ в клетках головного мозга крыс. В тоже время следует отметить отсутствие значимых отличий между контрольным и опытным вариантами в содержании фосфорилированных форм обеих киназ.

контроль опыт

ERK1 (44 Юа) — '•S&ii^rjsU,

ERK2 (42 Ша) —

ERK1 100,0 ±7,33 71,5 ±5,57*

ERK2 100,0 ±5,75 73,0 ±4,65*

Рис. 9. Экспрессия митоген-активируемых протеинкиназ ERK1/2 в клетках головного мозга крыс через 0.5 ч после разового внутрижелудочного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю).

При более продолжительном действии ладастена (1.5 ч) в клетках мозга крыс нами не выявлены значительные изменения экспрессии ERK1/2 киназ, но обнаружено резкое снижение содержания их фосфорилированных форм (рис. 10), что может свидетельствовать о возможном отсутствии влияния МАП-киназ на функциональное состояние генов-мишеней в данном временном интервале.

контроль

опыт

рЕЮС1 (44 Ша)

рЕИС2 (42 кИа)

рЕЮС1 100,0 ±8,51

54,0 ±5,70'

рЕМС2 100,0 ±9,43

38,0 ±6,90'

Рис. 10. Содержание митоген-активируемых протеинкиназ рБКК1/2 в клетках головного мозга крыс через 1.5 ч после разового внутрижелудочного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю)

В исследованиях Ю В. Вахитовой и соавт. (2002) в 72-часовой культуре лимфоцитов периферической крови здоровых доноров также было установлено отсутствие у ладастена собственного митогенного эффекта, но был выявлен слабый комитогенный эффект при ТкР-опосредованной стимуляции Т-лимфоцитов В связи с этим несомненный интерес представляло выявление роли терминирующих МАП-киназный каскад БИК1/2 киназ и их фосфорилированных форм.

контроль митоген 0,1 цМ лад 1 цМлад

ЕЮС1 (44 кДа) _

ЕЮС2 (42 кДа)

«—-

ЕИС1

100,0 ± 8,33 91,0± 11,96 103,0 ±6,91

ЕИС2

100,0 ±6,50 85,0 ±7,32 132,0 ±7,40

Рис. 11. Экспрессия митоген-активируемых протеинкиназ БКК1/2 в Т-лимфоцитах периферической крови человека под действием разных концентраций ладастена (в % к уровню активации митогеном)

В результате исследований нами установлено, что в данной системе лада-стен, независимо от его концентрации, существенного влияния на экспрессию ERK1 киназы и содержание ее активированной формы не оказывает (рис. 11,12). В то же время ладастен при концентрации 1 цМ усиливает экспрессию ERK2 киназы и ее фосфорилированной формы. Причем уровень последней при концентрациях ладастена 0.1 -1.0 цМ практически одинакова.

Рис. 12. Содержание митоген-активируемых протеинкиназ pERKl/2 в Т-лимфоцитах периферической крови человека под действием разных концентраций ладастена (в % к уровню активации митогеном).

Таким образом, на основе представленных данных можно сделать заключение о том, что комитогенный эффект ладастена в культуре Т-лимфоцитов сопряжен с активацией МАП-киназного каскада, в частности, ERK2 киназы. Еще один важный вывод можно сделать на основе сопоставления результатов, полученных нами на терминально дифференцированных клетках головного мозга и культивируемых клетках Т-лимфоцитов: влияние ладастена на активацию Ras-ERK1/2 каскада киназ носит тканеспецифический характер, и, возможно, сопряжено с их способностью индуцировать синтез ростовых факторов в Т-лимфоцитах под действием препарата.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлено, что реализация биологических эффектов ладастена на начальных этапах действия связана преимущественно с Са2+-зависимыми системами внутриклеточного сигналинга, что проявляется в увеличении активности ПКС более чем в 2 раза с последующим включением механизмов, нормализующих уровень Са2+.

2. Показано, что увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция связано как с высвобождением их из кальциесом, так и с активацией мембранных Са2+-каналов L-типа, ингибируемых нифедипином.

3. Выявлено, что внутрижелудочное введение ладастена способствует дифференциальной активации Са2+/кальмодулинзависимой протеинкиназы II в разных структурах головного мозга крыс: в клетках стриатума через 0.5 ч, а в клетках гипоталамуса через 2 часа после введения препарата.

4. Впервые экспериментально показаны индуцированные ладастеном изменения цАМФ-зависимой протеинкиназной активности в растворимой фракции белков клеток головного мозга и печени крыс на начальных этапах действия препарата.

5. Выявлено, что однократное введение ладастена ингибирует экспрессию МАП-киназ ERK1/ERK2 в клетках головного мозга крыс и снижает содержание их фосфорилированных форм через 1.5 ч.

6. Показано, что ладастен в концентрации 0.1 (1М при опосредованной через Т-клеточный рецептор стимуляции Т-лимфоцитов увеличивает содержание фосфорилированной формы ERK2 киназы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Середенин СБ. Влияние ладастена на активность протеинкиназ и фосфорилирование белков в клетках головного мозга крыс // Материалы 2-го Съезда Российского Научного Общества Фармакологов. Москва, 2003. С. 88.

2. Салимгареева М.Х., Вахитова Ю.В. Влияние ладастеиа на активность Са2+- фосфолипидзависимых протеинкиназ в клетках головного мозга и печени крыс // Материалы 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пу-щино,2003.С. 373.

3. Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Середенин СБ. Фармакологическое действие ладастена сопряжено с активацией сАМР- и Са2+-фосфолипидзависимых сигнальных систем клетки // Материалы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Пущино, 2003. С. 144-147.

4. J. Vakhitova, M. Salimgareeva, R. Yamidanov, S. Seredenin. Effects of the Ladasten upon the activity cAMP- and Ca2+-dependent protein kinases, expression of genes involved in dopamine biosynthesis // FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction. Belgium, 2003. P. 139.

5. Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Середенин СБ. Влияние ладастена на активность протеинкиназы С в клетках головного мозга крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004. Т. 67, № 2. С.12-15.

6. Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Середенин СБ. Влияние ладастена на активность сАМР-зависимых протеинкиназ и фосфорилирование белков в клетках головного мозга крыс // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004. Т. 67, №3. С.

САЛИМГАРЕЕВА МИЛЯУША ХАМИТОВНА

ВЛИЯНИЕ БРОМПРОИЗВОДНОГО АМИНОАДАМАНТАНА -

ЛАДАСТЕНА НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНКИНАЗ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕЧЕНИ КРЫС

03.00.04 - биохимия 14.00.25 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 20.05.2004 Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 1/16. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ № 303.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет

»11652

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салимгареева, Миляуша Хамитовна

Введение.

1. Обзор литературы.

Фармакологические свойства и механизмы действия бромпроизводного ами-ноадамантана - ладастена

1.1. Общие сведения о препарате.

1.2. Фармакологические свойства ладастена.

1.2.1. Иммуностимулирующие свойства.

1.2.2. Актопротекторные свойства.

1.2.3. Психостимулирующие свойства.

1.2.4. Другие фармакологические активности ладастена.

1.3. Внутриклеточные системы сигналинга.

1.3.1. Фосфорилирование-дефосфорилирование белков.

1.3.2. цАМФ-зависимые протеинкиназы.

1.3.3. Са2+-фосфолипидзависимые протеинкиназы.

1.3.4. Са2+-кальмодулинзависимые протеинкиназы.

1.3.5. Механизмы Са2+-сигнализации в клетках.

1.3.6. Митоген-активируемые протеинкиназные каскады.

2. Объекты и методы исследования

2.1. Объект исследований.

2.2. Выделение белков цитоплазмы.

2.3. Выделение белков мембраны.

2.4. Выделение лимфоцитов крови.

2.5. Приготовление тотального клеточного лизата для иммуноблоттинга.

2.6. Фосфорилирование белков in vivo.

2.7. Определение активности протеинкиназ.

2.8. Электрофорез белков.

2.9. Определение Са2+-АТФазы.

2.10. Иммуноблоттинг.

2.11. Статистический анализ результатов исследований.

2.12. Реактивы и материалы.

3. Результаты и их обсуждение.

Влияние ладастена на активность протеинкиназ и фосфорилирование белков

3.1. Фосфорилирование белков in vivo.

3.2. Влияние ладастена на активность цАМФ-зависимых протеинкиназ в клетках головного мозга и печени крыс.

3.3. Влияние ладастена на активность Са -фосфолипидзависимых протеин-киназ в клетках головного мозга и печени крыс.

3.4. Влияние ладастена на активность Са /кальмодулинзависимых протеинкиназ II в клетках стриатума и гипоталамуса головного мозга крыс.

3.5. Влияние ладастена на активность митоген-активируемых киназ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние бромпроизводного аминоадамантана - ладастена на активность протеинкиназ и фосфорилирование белков в клетках головного мозга и печени крыс"

Актуальность темы. Фармакологические средства, созданные на основе адамантана, используются в клинической практике с середины 60-х годов, и с тех пор интерес фармакологов к лекарственным препаратам производным аминоадамантана, не снижается. Это связано как с уникальными свойствами самой молекулы адамантана, так и с широким спектром фармакологической активности его производных (Багрий, 1989). К числу фармакологических препаратов, производных адамантана, относятся хорошо известное противовирусное средство ремантадин; противопаркинсонические - ми-дантан, гимантан; иммуномодулирующее средство - кемантан; психостимулятор - адапромин; эффективный при болезни Альцгеймера - мемантин и др. (Davies et al., 1964; Schwab, 1969; Stromberg et al., 1970; Галегов и др:, 1979; Шмарьяни др., 1980; Атрошенко, 1997; Арцимович, Галушина, 1999).

Среди производных адамантана имеются соединения, способные повышать адаптационные возможности организма к действию комплекса экстремальных факторов среды обитания и деятельности - так называемые акто-протекторы. Наиболее активными в этом отношении оказались производные 2-аминоадамантана, в частности, ладастен, содержащий Вг" в фенильном радикале у азота 2-аминоадамантана; адаптоген экстренного типа действия — хлодантан; комбинация бемитила с ладастеном - бромитил (Жирнов, 1991; Кундашев, 1992; Красных, 1995).

Производное 2-аминоадамантана - ладастен (1М-(2-адамантил)-М-п-бромфениламин) разработан в качестве средства фармакологической коррекции изменений функционального состояния организма в условиях действия стрессорных факторов различной природы. Его особенностью является сочетание психостимулирующих и анксиолитических свойств, что, как полагают, обусловлено его регулирующим влиянием на центральные дофамин-, серото-нин- и ГАМК-ергические медиаторные системы (Сергеева, 1993; Девойно, 1993; Морозов и др., 1995, 1999; Лосев и др., 1995). В то же время, большое разнообразие фармакологических эффектов ладастена предполагает разные механизмы их реализации, которые, как известно, сопряжены с активацией определенных внутриклеточных систем сигнальной: трансдукции и/или их взаимодействием. В связи с этим особый интерес представляет изучение функционального состояния протеинкиназ, активируемых различными молекулами-посредниками, в частности, циклическим АМФ, Са и др. С активацией этих систем сопряжены такие фундаментальные клеточные процессы, как пролиферация, дифференциация, иммунный ответ и др. В то же время для более эффективного и безопасного использования фармакологических средств необходимо детальное знание путей их воздействия на клетку, ткань и организм в целом. Следовательно, изучение внутриклеточных систем сигнальной трансдукции, участвующих в; реализации фармакологических эффектов ладастена, позволит понять некоторые молекулярные механизмы его действия.

При выборе органов (мозг, печень), в клетках которых изучали динамику активности протеинкиназ, руководствовались данными о фармакокине-тике и фармакодинамике препарата при однократном его применении (Сергеева, Красных, 1995). Ладастен проявляет избирательную тропность к тканям мозга, через 10 мин после перорального введения коэффициент распределения составляет Кр=2.29±0.1, что свидетельствует о высокой проницаемости препарата через гематоэнцефалический барьер. Также ладастен быстро и в высоких концентрациях проникает в печень, максимальная концентрация наблюдается через 40 мин (Кр=6.5±0.32).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось выявление основных внутриклеточных сигнальных систем, задействованных в реализации биологических эффектов ладастена.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. выявить влияние ладастена на включение [ Р] in vivo в белки мембран и цитоплазмы клеток головного мозга и гепатоцитов крыс;

2. изучить влияние ладастена на активность цАМФ-зависимых протеинкиназ в сочетании с уровнем фосфорилирования белков в клетках головного мозга и гепатоцитах крыс;

3. исследовать эффект ладастена на активность Са -фосфолипид-зависимых протеинкиназ в клетках головного мозга и гепатоцитах крыс;

4. оценить активность фосфорилированных форм Са /кальмодулин-зависимых протеинкиназ II типа в клетках гипоталамуса и стриатума, а также в клетках мозга в целом под влиянием ладастена;

5. определить уровень экспрессии митоген-активируемых киназ (ERK1/ERK2) и их активность в клетках головного мозга крыс и культуре клеток Т-лимфоцитов крови человека под действием ладастена.

Научная новизна работы. Впервые показано участие цАМФ-, Са -фосфолипид-, Са -кальмодулинзависимых протеинкиназ II, МАП—киназ (ERK1/2 и pERKl/2) в реализации биологического действия ладастена. Выявлена основная роль Са2+-активируемых систем сигнальной трансдукции в этом процессе. Впервые обнаружена дифференциальная активация Са /кальмодулинзависимых протеинкиназ II в клетках стриатума и гипоталамуса через разные промежутки времени. Впервые экспериментально показано, что комитогенный эффект ладастена в культуре Т-лимфоцитов сопряжен с активацией конечного эффектора МАП-киназного каскада ERK2.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в познание отдельных молекулярных механизмов действия фармакологических препаратов аминоадамантанового ряда, в частности ладастена, и могут использоваться для разработки новых фармакологических модуляторов отдельных этапов сигналинга. Результаты работы могут быть использованы также в лекционном материале при чтении курсов по биохимии и фармакологии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 2-ом Съезде Российского Научного Общества Фармакологов (Москва, 2003); 7-ой

Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); Научно-практической конференции "Проблемы создания новых лекарственных средств" (Уфа, 2003); FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (Belgium, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования; главы, посвященной результатам собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 69 отечественных и 107 зарубежных источников литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Салимгареева, Миляуша Хамитовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлено, что реализация биологических эффектов

Л I ладастена на начальных этапах действия связана преимущественно с Са -зависимыми системами внутриклеточного сигналинга, что проявляется в увеличении активности ПКС более чем в 2 раза с последующим включением механизмов, нормализующих уровень Са2+. л I

2. Показано, что увеличение внутриклеточной концентрации Са связано как с высвобождением их из кальциесом, так и с активацией

Л I мембранных Са -каналов L-типа, ингибируемых нифедипином.

3. Выявлено, что внутрижелудочное введение ладастена способствует дифференциальной активации Са /кальмодулинзависимой протеинкиназы II в разных структурах головного мозга крыс: в клетках стриатума через 0.5 ч, а в клетках гипоталамуса через 2 ч после введения препарата.

4. Впервые экспериментально показаны индуцированные ладастеном изменения цАМФ-зависимой протеинкиназной активности в растворимой фракции белков клеток головного мозга и печени крыс на начальных этапах действия препарата.

5. Выявлено, что однократное введение ладастена ингибирует экспрессию МАП-киназ ERK1/ERK2 в клетках головного мозга крыс и снижает содержание их фосфорилированных форм через 1.5 ч.

6. Показано, что ладастен в концентрации 0.1 (хМ при опосредованной через Т-клеточный рецептор стимуляции Т-лимфоцитов увеличивает содержание фосфорилированной формы ERK2 киназы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученный нами экспериментальный материал свидетельствует о том, что фармакологическое действие ладастена на клетку сопряжено с активацией различных сигнальных систем, что вероятно, закономерно, учитывая достаточно широкий спектр его фармакологической активности. В то же время, доминирующими являются пути, зависящие от внутриклеточной концентрации ионов; кальция. Так, однократное - воздействие ладастена уже через 0.5 ч приводит к существенному увеличению активности одной из Са -зависимых киназ - протеинкиназы С. Ее активация, как известно, происходит I. только при достаточно высокой концентрации Са (Крутецкая и др., 2001). Поэтому можно предположить, что наиболее ранним и, возможно, первичным событием действия ладастена на клетку является активация механизмов, обеспечивающих увеличение внутриклеточной концентрации I.

Са . Естественно возникает вопрос о том, как ладастен способствует притоку Са в клетку? В литературе описано множество механизмов, I. обеспечивающих достаточно быстрое увеличение Са в клетке (Крутецкая и др., 2001). Одним; из них, возможно, задействованных и при введении ладастена, является активация потенциалзависимых мембранных ионных каналов, в частности, кальциевых каналов; Ингибиторный анализ показал снижение активности протеинкиназы С в клетках головного мозга при одновременном введении ладастена и нифедипина, селективного блокатора быстроактивируемых кальциевых каналов L-типа. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что ладастен действительно оказывает влияние на функциональное состояние мембранных кальциевых каналов.

Подтверждением этому, на наш взгляд, очень важному выводу, служат следующие обстоятельства: во-первых, это результаты наших экспериментов с использованием радиоактивно меченого ортофосфата in vivo. Нами показано, что при однократном введении ладастена происходит более интенсивное включение радиоактивного фосфора в мембранные белки, чем в растворимые белки цитоплазмы. Оно более чем в пять раз превышает сходные показатели в белках, выделенных из контрольных животных. Во-вторых, в качестве одного из механизмов активации мембранных кальциевых каналов можно рассматривать селективное фосфорилирование одной из их субъединиц протеинкиназой А. Как показывают наши исследования динамики активности протеинкиназы А под действием ладастена, регистрируемое изменение ее активности отмечается на; начальных этапах действия препарата, что, возможно, также имеет отношение к первичным механизмам действия исследуемого нами препарата. В-третьих, убедительным доказательством влияния ладастена на системы, обеспечивающие интенсивный приток Са в клетку является заметная

Л I Л I активация основной Са -транспортирующей молекулы — Са -АТФазы. Как показывают наши эксперименты, в зависимости от исследованных органов под действием ладастена активность Са2+-АТФазы увеличивается в 3-8 раз, по сравнению с контролем. Причем, этот эффект наблюдается в двух временных интервалах, в первые 0.5 ч и через 8-12 ч после введения препарата с небольшими осцилляциями. Надо отметить, что регистрацию активности Са2+-АТФазы мы начали только через 0.5 ч после действия препарата, что фактически совпадает с пиковыми значениями активности ПКС. Видимо, ее активация происходит значительно раньше, что будет предметом наших дальнейших исследований. Как известно, диффузия Са2+ из межклеточного пространства в клетку, кроме рецептор-ионных каналов, может обеспечиваться и рецепторами отдельных; аминокислот, в: частности, NMDA-рецепторами. В литературе достаточно много сведений о влиянии различных ксенобиотиков на функциональное состояние данного рецептора, в то же время практически отсутствуют данные о влиянии на них фармакологических препаратов со спектром действия, присущего ладастену. Поэтому этот вопрос также должен быть предметом пристального внимания.

Результаты наших исследований4 показывают, что.и увеличении л I внутриклеточной концентрации Са под действием ладастена, вероятно, значительная роль принадлежит и депонированному в кальциесомах Са . Об этом свидетельствуют данные об ингибировании активности протеинкиназы С под действием циннаризина - блокатора экзоцитоза Са из кальциесом ЭР. Не исключено, что механизм действия ладастена связан и с использованием г митохондриального резерва Са2+, но по ряду технических причин этот вопрос нами не исследовался.

Таким образом, изложенный выше материал свидетельствует о том, что одним из первичных механизмов действия ладастена на клетку является включение: множественных систем, обеспечивающих резкое увеличение л I внутриклеточной концентрации Са в ограниченном интервале времени. Можно предположить, что реализация фармакологических эффектов ладастена связана, в первую очередь, с активацией Са2+-зависимых протеинкиназ, в частности, протеинкиназы С и кальмодулин-зависимой протеинкиназы. Что касается последней, то чрезвычайно интересным, на наш взгляд, является дифференциальная во времени ее активация в клетках разных структур мозга, а именно, стриатума и гипоталамуса. Причем, резкое увеличение активности CaMKII наблюдается уже через 0.5 ч после введения препарата. Не исключено, что наблюдаемый региональный эффект сопряжен с необходимостью усиления синтеза нейромедиаторов, в частности дофамина. В качестве одного из механизмов нами предположена следующая последовательность процессов. Поскольку ладастен повышает л I внутриклеточную концентрацию Са , то при определенном пороговом их значении, он может индуцировать экзоцитоз нейромедиатора из пресинаптических терминалей в синаптическую щель. Часть нейромедиатора, связавшись со специфическими рецепторами на постсинаптической мембране, будет способствовать стимуляции передачи нервных импульсов, активируя центральную нервную систему, а часть, связавшись со специфическими транспортными белками, пополнит везикулярный пул нейромедиатора. Особенностью действия ладастена является угнетение обратного захвата нейромедиатора, > что, несомненно, приводит к его дефициту в пресинаптических везикулах. Следовательно, необходим ресинтез нейромедиатора, и, вероятно, этот процесс сопряжен с активацией СаМКП, которые: селективно фосфорилируя транскрипционные факторы, усиливают экспрессию генов ферментов, участвующих в биосинтезе катехоламинов. Справедливость данного предположения подтверждается тем, что ладастен действительно через 1-1.5 ч после введения животным усиливает экспрессию ключевого фермента биосинтеза катехоламинов — тирозингидроксилазы в клетках головного мозга (Ю. В. Вахитова, неопубликованные данные). Важно также подчеркнуть, что последовательность активации СаМКН и дофаминпозитивных нейронов в клетках стриатума и гипоталамуса в целом не противоречит имеющимся в литературе данным, и в первой главе отмечалось, что после введения ладастена; снижение концентрации нейромедиатора в первую очередь наблюдается в клетках стриатума.

Особого внимания заслуживает выяснение механизма усиления экспрессии гена тирозингидроксилазы в клетках головного мозга под действием ладастена. Следует отметить, что структура данного гена и регулирующих его активность нуклеотидных последовательностей изучена достаточно подробно. Примечательно, что в 5-прилегающей области гена тирозингидроксилазы идентифицированы последовательности, специфически связывающиеся с транскрипционными факторами, экспрессия которых усиливается при активации протеинкиназы A (CREB), протеинкиназы С (SP1), митоген-активируемых киназ (АР-1) и др. К сожалению, полученного нами на данный момент экспериментального материала недостаточно для однозначной интерпретации взаимосвязи между активацией протеинкиназ и уровнем; экспрессии гена тирозингидроксилазы при однократном воздействии ладастена. В то же время, можно предположить, что к изменению экспрессионного статуса гена тирозингидроксилазы под действием исследуемого нами препарата причастны как цАМФ-, так и Са2+-зависимые протеинкиназы. В литературе достаточно много примеров, описывающих взаимовлияние (как ингибирование, так и усиление) протеинкиназ, активируемых через G-белки. В последнем случае разные протеинкиназы могут фосфорилировать один и тот же белок, но по различающимся по локализации сериновым, треониновым или тирозиновым остаткам. Известно, что множественность фосфорилированных сайтов определяет прочность взаимодействия со специфическими нуклеотидными последовательностями в промоторной области и уровень экспрессии того или иного гена. По-видимому, взаимосвязь разных путей передачи сигнала обусловлена необходимостью включения целой совокупности клеточных реакций в ответ на внешние воздействия, в данном случае ладастена, что требует их комплексной регуляции.

Примером множественной регуляции являются и исследованные нами пути передачи сигналов, т.е. активность протеинкиназ А, С и МАП-киназ (ERK1/ERK2). Дело в том, что стимуляция активности протеинкиназы С может активировать и Ras-зависимый МАП-киназный каскад, конечными киназами которого являются ERK1/ERK2, путем ингибирования Gap-белка. Активация ERK1/ERK2 киназ в конечном счете определяет функциональное состояние онкогена c-fos, который в комплексе с продуктом гена c-jun, формирует гетеродимер АР-1, транскрипционный фактор, имеющий сайты связывания в регуляторной области многих генов, в частности, упомянутого выше гена тирозингидроксилазы, генов циклинов и др. Однако, активность гена c-fos определяется функциональным состоянием не только МАП-киназ, но и других протеинкиназ, в частности, протеинкиназ А и С. Анализ имеющихся в литературе механизмов активации гена c-fos показывают взаимодействие ПКА и ПКС-зависимых путей, чаще взаимоподавляющего действия этих путей на разных этапах передачи сигнала. Известно, что одним из компонентов ПКС-пути являются Gj-белки. Их ингибирование понижает активность фосфолипазы С. В то же время они служат антагонистами Gs-белков, активирующих аденилатциклазу (Кухарь и др., 1992). Следовательно, стимуляция ПКС-пути, включающего Gj-белки, приведет к подавлению цАМФ-зависимого пути. С другой стороны, обработка клеток ксенобиотиками, повышающими уровень цАМФ, блокирует распад фосфотидилинозитидов. Кроме того, фосфорилирование каталитического домена белка Raf-1 протеинкиназой А подавляет его активность и препятствует его фосфорилированию протеинкиназой С или тирозинкиназой Lck (Rhee et al., 1989; Hafner et al., 1994). Вероятно, цАМФ-зависимые факторы, препятствуют также и взаимодействию белков Ras и Raf (Cook, MeCormick, 1993). Несмотря на столь сложное взаимодействие, на1 уровне конечной мишени, т.е гена c-fos, их действие носит однонаправленный, активирующий характер.

Результаты наших исследований показали, что ладастен в клетках головного мозга ингибирует как экспрессию, так и; содержание активированных форм МАП-киназ — ERK1/ERK2, по крайней мере, в первые часы действия. Эти данные позволяют придти по крайней мере к двум существенным; выводам: во-первых, об отсутствии у ладастена эффекта, стимулирующего синтез ростовых факторов; во-вторых, о его митогенной активности. В то же время, в культивируемых клетках Т-лимфоцитов выявлена комитогенная его активность (Вахитова и др., 2002). Наши исследования показали, что она может быть связана с повышением активности МАП-киназы ERK2 (но не ERK1) в культивируемых клетках.

Таким образом, изложенный выше материал свидетельствует о том, что исследование отдельных систем сигнальной трансдукции в клетках разных органов и тканей дает возможность уточнить спектр и обосновать фармакологической активности лечебных препаратов.

90

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салимгареева, Миляуша Хамитовна, Уфа

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций.-М.: Наука, 1994.- 228 с.

2. Кухарь В.П., Луйк А.И., Могилевич С.Е. Химия биорегуляторных процессов.- Киев, Наукова думка, 1992.-368 с.

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки.- М.: Мир, 1994.- Т. 2.- 539 с.

4. Априкян А.Г., Нестерова М.В., Глухов А.И., Северин Е.С. Связывание холофермента и субъединиц цАМФ—зависимой протеинкиназы с ядрами // Биохимия.- 1987.-Т. 52, №8.- С. 1300-1306.

5. Арцимович Н.Г., Галушина Е.С., Фадеева Т.А. Адамантаны лекарства XXI века // International J. on Immunorehabilitation - 2000.- V. 2, №1- P. 5460.

6. Арцимович Н.Г., Галушина T.C. Синдром хронической усталости.-Краснодар.- 1999.- 258 с.

7. Атрошенко О.Н. Поиск фармакологических корректоров работоспособности в постгипоксический период в ряду производных 3-оксипиридина// Дисс. .канд. биол. наук.- М 1997.

8. Багрий- Е.И. Адамантаны: получение, свойства, применение.- М.: Наука, 1989.-264 с.

9. Бобков Ю.Г., Виноградов В.М., Катков В.Ф., Лосев С.С., Смирнов А.В. Фармакологическая коррекция утомления // М.: Медицина 1984 - 203 с.

10. Бойко С.С., Жердев В.П., Кисляк Н.А. Использование метода газожидкостной хроматографии для изучения фармакокинетики иметаболизма производных адамантана // Хим.-фарм. журн.- 1991- Т. 25, №1- С. 57-59.

11. Вахитова Ю.В., Сибиряк С.В., Курчатова Н.Н., Середенин С.Б. Влияние ладастена на пролиферативную активность и апоптоз Т-лимфоцитов периферической крови // Эксперим. и клинич. фармакология.-2002.- №6 С. 49-52.

12. Галегов Г.А., Пушкарская H.JL, Леонтьева Н.А. Ремантадин как ингибитор репродукции вируса гриппа // Вопросы вирусологии.- 1979.-№3.- С. 306-308.

13. Галушина Т.С., Фадеева Т.А., Арцимович Н.Г. Исследование роли нейротропного препарата бромантана в регуляции гуморального иммунитета // Иммунология.- 1996.- №4.- С. 28-30.

14. Галушина Т.С., Фадеева Т.А., Арцимович Н.Г. Исследование роли нейротропного препарата бромантана в регуляции гуморального иммунитета//Иммунология 1996.- №4 — С. 31—45.

15. Галушина Т.С., Фадеева Т.А., Арцимович Н.Г. Экспериментальная оценка роли нового нейротропного препарата бромантана в регуляции клеточного иммунитета // Иммунология. — 1996.- №4 — С. 28-30.

16. Ганелина Л.Ш. цАМФ-зависимое фосфорилирование белков и его регуляторная роль в клетке // Цитология 1985.- Т. 28, №8 - С. 851-864.

17. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки: Классификация и структура. Структура и механизм функционирования // Соросовский образовательный журнал 1998.- №5- С. 2-16.

18. Гусев Н.Б. Протеинкиназы: строение, классификация, свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал.- 2000 Т.б, №12.- С. 4-12.

19. Дзгоев G.E., Иванова Л.Н., Фосфорилирование белков папиллярной зоны почки эндогенными цАМФ-зависимыми протеинкиназами // Биохимия.- 1990.- Т. 55, №5.- С. 814-821.

20. Долгачева Л.П, Абжалелов Б.Б., Баумуратов А.С., Зинченко В.П., Бронников Г.Е. Аденилатциклазный путь участвует в регуляции внутриклеточного уровня Са2+ в преадипоцитах бурого жира // Цитология.- 2002 Т.44, №1- С. 56-60.

21. Ефимова Л.П. Влияние фармакологических средств корректоров качества операторской деятельности на сердечно-сосудистую и симпатоадреналовую системы //Дисс. .канд. биол. наук.- М - 1990.

22. Жирнов Е.Н. Новая комплексная методика оценки действия лекарственных средств на психофизиологическое состояние и качество деятельности операторов // Дисс.канд. мед. наук.- М., 1991.— 194 с.

23. Золотов Н.Н., Сергеева С.А., Лосев С.С. Определение антирадикальной активности лекарственных препаратов производных адамантана // Тез. докл. УГ конф. «Биоантиоксидант» - М - 1993- Т. Г.— G. 20-21.

24. Иежица И.Н., Бугаева Л.И., Спасов А.А., Морозов И.С. Влияние бромантана на неврологический статус крыс при двухмесячном введении // Экспер. и клин, фармакол 2000-Т. 63, №5 - С. 13-17.

25. Ильенко В.И., Прозорова И.Н., Киселева И.В., Ветласенин А.В. Механизм защитного действия ремантадина в организме // Ремантадин и: другие ингибиторы вирусов —Рига: Зинатне, 1982.- С. 144—153.

26. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия.-2000.- Т. 65, №1.-С. 5-33.

27. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость.- М.- 1986- 255 с.

28. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности.-М.: Мир, 1986—144 с.

29. Крапивин С.В., Сергеева С.А., Морозов И.С. Количественный фармакоэлетроэнцефалографический анализ действия бромантана // Бюл. эксперим. биол. и мед.- 1993.- №11.- С. 515-518.

30. Красных Л.М. Фармакокинетика актопротекторов — производных адамантана//Дисс. . канд. биол. наук.-М., 1995 164 с.1. Л I

31. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Механизмы Са сигнализации в клетках // Цитология.- 2001.- Т.43, №1.- С. 5-32.

32. Крутецкая: З.И., Лебедев О.Е., Курил ова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации.- СПб., 2003.- 208 с.

33. Кудрин B.C., Сергеева С.А., Красных Л.М., Мирошниченко И.И., Грехова Т.В., Гайнетдинов P.P. Влияние бромантана на дофамин- и серотонинергические системы мозга крыс // Эксперим., и клинич. фармакология.- 1995.- №4 С. 8-11.

34. Кундашев У.К. Фармакологическая коррекция работоспособности человека в условиях вертикальных перемещений из среднегорья в высокогорье // Дисс. . канд. мед. наук -М.—1992:- 156 с.

35. Морозов И.С., Клейменова Н.Н. Влияние бромантана на физическую работоспособность лабораторных животных // Эксперим. и клинич. фармакология. -1998.- №6,— С. 51-53.

36. Морозов И.С., Климова Н.В., Сергеева С.А., Иванова И.А., Барчуков

37. B.Г., Ковалев Г.И., Пятин Б.М., Авдюнина Н.И. Производные адамантана, повышающие устойчивость организма к экстремальным воздействиям // Вестник АМН.- 1999.- №3.- С. 28-32.

38. Морозов И.С., Пухова Г.С., Авдулов Н.А., Сергеева С.А., Спасов А.А, Иежица И.Н. Механизмы нейротропного действия бромантана // Эксперим. и клинич. фармакология.- 1999.- №1- С. 11—14.

39. Мышкин В.А., Сергеева С.А., Алехин Е.К. Влияние актопротекторов на перекисное окисление липидов в мозге при отравлении крыс карбофосом. // IV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» М.: 1997 — С. 278.

40. Нестерова М.И., Барбашев С.Ф., Арипжанов А.А., Абдукаримов А., Северин Е.С. Транслокация в ядро и влияние цАМФ — зависимой протеинкиназы на процесс транскрипции // Биохимия 1980 - Т. 45, №6—1. C. 979-991.

41. Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза (под ред. Шевченко Ю.Л.) М.: ГЭОТАР- МЕД, 2004.- 222 с.

42. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса Новосибирск, 1983231 с.

43. Потехина Е.С., Надеждина Е.С. Митоген-активируемые протеинкиназные каскады и участие в них Ste-подобных протеинкиназ // Успехи биологической химии.- 2002 Т. 42 - С. 235-256.

44. Саевец А.Н. Иммунофармакологический профиль некоторых стимуляторов центральной нервной системы // Дис. . канд. биол. наук — М.- 1990.

45. Северин Е.С., Кочеткова М.Н. Роль фосфорилирования в регуляции клеточной активности.- М.: Наука, 1985.- 286с.

46. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ.- М.- Волгоград, 1999 638 с.

47. Сергеева С. А., Красных Л.М. Кинетика распределения бромантана по органам и тканям крыс при однократном введении // Хим-фарм. журн-1995.-№4.-С. 27-29.

48. Сергеева С. А. Механизмы действия производных адамантана, обладающих защитными эффектами в экстремальных условиях // Дисс. .докт. биол. наук М., 1993.

49. Скулачев В.П. Соотношение окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи.- М.:Изд-во АН СССР, 1962.- 156 с.

50. Сытина Л.И. Фармакологическая коррекция эмоционального стресса в условиях высокогорной гипоксии // Дисс. . канд. мед. наук М.- 1990.190 с.

51. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений.- М.: Наука, 2002.- 294с.

52. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций // Соросовский образовательный журнал.- 2001.- Т. 7, №1,- С. 10-15.

53. Ульмасов Х.А., Нестерова М.В., Северин E.G. Автофосфорилирование цАМФ-зависимой протеинкиназы из мозга свиньи // Биохимия.— 1980 —Т. 45; №4.-С. 661-668.

54. Ульмасов Х.А., Нестерова М.В., Северин Е.С. цАМФ-зависимая протеинкиназа из мозга свиньи: субъединичная сруктура, механизм автофосфорилирования: и диссоциации на субъединицы под действием цАМФ // Биохимия 1980.- Т. 45, №5.- С. 835-844.

55. Фадеева Т.А., Галушина Т.С., Арцимович Н.Г. Роль бромантана в регуляции иммунитета // Тез. докл. VII конф. «Перспективы развития химии и практического применения каркасных соединений» — Волгоград, 1995.-С. 24-25.

56. Халимов А.Р., Насыров Х.М., Сергеева С.А. Влияние бромантана на уровень кортизола и инсулина в сыворотке крови крыс // Здравоохранение Башкортостана 1997.-№3- С. 7-10.

57. Хамидова Т.В., Бугаева Л.И., Морозов И.С., Спасов А.А. Влияние бромантана при курсовом введении на репродуктивную функцию крыс II Экспер. и клин, фармакол.- 2000.- Т. 63^ №3.- С. 36-39.

58. Хамидова Т.В., Бугаева Л.И., Морозов И.С., Спасов А.А. Влияние бромантана при курсовом введении на репродуктивную функцию крыс // Экспер. и клин, фармакол 2000 - Т. 63, №3 - С. 36-39.

59. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран.- М., 1975 — 406 с.

60. Хухо Ф. Нейрохимия: основы и принципы.- М.: Мир, 1990.- 384 с.

61. Шмарьян М:И:, Климова Н.В., Лаврова Л.Н:, Вихляев Ю.И, Морозов И.С. Оксипроизводные адамантила, обладающие антикаталептической; активностью // Авторское свидетельство № 731714. Бюлл. открытия. Изобретения.- 1980.- Т.5, №58.

62. Элиот Б., Надь 3., Набхольц М.В кн. Методы исследований в иммунологии (под ред. Лефковитса И., Перниса Б.)- М.: Мир, 1981,— С. 300-319.

63. Юдаев Н.А., Афиногенова С.А., Покровский Б.В., Протасова Т.Н. Циклические нуклеотиды // Успехи современной биологии — 1975.- Т. 80, №3.- С. 254-261.

64. Allibritton N.L., Oancea Е., Kuhn М.А. Meyer Т. Source of nuclear calcium signals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.- V. 91.- P. 12 458-12 462.

65. Atkins C.M., You M., Groome N.P., Sweatt D.J. Regulation of myelin basic protein phosphorylation by mitogen-activated protein kinase during increased action potential firing in the hippocampus // J. Neurochem.-1999.- V. 73.- P. 1090-1097.

66. Babcock D.F.,Hille B. Mitochondrial oversightof cellular Ca2+ signaling // Curr. Opin. Neurobiol 1998.-V. 8-P. 394-404.

67. Basu A. The potential of protein kinase С as a target for anticancer treatment // Pharmac. Ther.- 1993.- V. 59.- P. 257-280.

68. Beavo J.A., Mumby M.C. Cyclic AMP-dependent protein phosphorilation // Handbook of Experimental Pharmacology 1982 - V. 581- P. 363-392.

69. Berridge M.J. Capacitative calcium entry // Biochem. J.- 1995.- V.312.- P. 1-11.

70. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and calcium signaling // Nature.- 1993. -V.361.- P. 315-325.

71. Berridge M.J., Bootman M.D., Lipp P. Calcium a life and death signal // Nature.- 1998.- V. 395.- P. 645-648.

72. Bloom F.E., Veda Т., Battenberg E., Greengard P. Immynocytochemical localization in synapses of protein and endogenous substrate for protein kinase in mammalian // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1979.- V. 76.- P. 5982-5986.

73. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.- 1976.- V. 72, №1, 2.- P. 248-254.

74. Brindle P. Protein kinase A dependent activator in transcription factor CREB reveals new roles for CREM repressors // Nature.- 1993.- V. 364.- P. 821-824.

75. Brunet A., Brondello J.M., L'Allemain G., Lenormand P., McKenzie F., Pagus G., Pouyssegur J. MAP kinase module: role in the control of cell proliferation // C. R. Seances Soc. Biol. Fil.- 1995.- Vol. 189.- P. 43-57.

76. Buxton I.L.O., Brunton L.L. Compartments of cyclic AMP and protein kinase in mammalian cardiomyocites // J. Biol. Chem- 1983 V. 258 - P. 10 223-10 239.

77. Chawla S. Regulation of gene expression by Ca2+ signals in neuronal cells // European Journol of Pharmacology.- 2002.- Vol. 447- P. 131-140.

78. Chawla S. Regulation of gene expression by Ca2+ signals in neuronal cells // European J. of Pharmacology.- 2002-V. 447.- P. 131-140.

79. Cheifetz S., Moscarello M.A. Effect of bovine basic protein charge microheterogeneity on protein-induced aggregation of unilamellar vesicles contaning a mixture of acidic and neutral phospholipids // Biochemistry.-1985.-V. 24.-P. 1909-1914.

80. Chen R.H., Sarnecki C., Blenis J. Nuclear localization and regulation of erk- and rsk- encoded protein kinase // Mol. Cell. Biol 1992.- №12 - P. 915927.

81. Chiariello M., Gomez E., Gutkind J.S. Regulation of cyclin-dependent kinase (Cdk 2) Thr-160 phosphorylation and activity by mitogen-activated protein kinase in late Gi phase // Biochem. J 2000 - V. 349 - P. 869-876.

82. Choguet D., Sarihou P., Primi D. Cyclic AMP-modulated potassium channels in murine В cells and their precursors // Science.- 1987.- V. 235.- P. 1211-1214.

83. Coghlan V.M., Perrino B.A., Howard M., Langeberg L.K., Hicks J.B., Gallatin W.M., Scott J.D. Association of protein kinase A and protein phosphatase 2B with a common anchoring protein // Science.- 1995.- V. 267-P. 108-111.

84. Cohen P. The role of protein phosphorylation of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase GMP dependent protein kinase // FEBS Lett.- 1980. -V. 119.-P. 301-306.

85. Cook S.J., McCormick F. Inhibition by cAMP of Ras-dependent activation of Raf// Science.- 1993.- V. 262.- P. 1069-1072.

86. Cooper D.M.F., Mons N., Karpen J.W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and signalling // Nature 1995 — V. 374 - P. 421424.

87. Corbin J.D., Keely S.L. Characterization and regulation of heart adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase isozymes // J. Biol. Chem-1978.-V. 252.-P. 910-918.

88. Corbin J.D., Kelly S.L., Park C.R. cAMP-dependent protein kinase of skiletal: measurement and properties // J. Biol. Chem.- 1977.- V. 244.- P. 7134-7142.

89. Corbin J.D., Kelly S.L., Park C.R. The distriution and dissotiation of cyclicadenosin 3',5'-monophosphat-dependent protein kinase in adipose, cardiac and other tissues // J. Biol. Chem.- 1975.- V. 250.- P. 218-225.

90. Crivici A., Ikura M. Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.- 1995.- V. 24.- P. 85-116.

91. Crooke S.T., Bennet C.F. Mammalian phosphoinositide-specific phosholipase С isoenzymes // Cell calcium 1989 - V. 10 - P. 309-323.

92. Druummond R.M., Mix T.C.H., Tuft R.A., Walsh J.V., Fay F.S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes fromBufo marinus // J.Physiol.- 2000- V. 522.3-P. 375-390.

93. Erlichman J., Rosenfeld R., Rosen O.M. Phosphorylation of cyclic adenosine 3',5-monophosphate-dependent protein kinase from bovine cardiacmuscle // J. Biol: Chem.- 1974.- V. 249.- P. 5000-5003.f) 2+

94. Fagan K.A., Mons N., Cooper L.M.F. Dependence of the Ca -inhibitable adenylyl cyclase of C6 2B glioma cells on capacitative Ca entry // J. Biol. Chem.- 1998.- V. 273.- P. 9297-9305.

95. Ferreira M.C.D.J., Helies Toussaint C., Imbert - Teboul M., Bailly C.,2+

96. Verbavartz J. M., Bellanger A. — C., Chabardes D. Co - expression of a Ca -inhibitable adenylyl cyclase and of a Ca2+-sensing receptor in the cortical thick asending limb cell of the rat kidney // J. Biol. Chem- 1998 - V. 273.- P. 15 192-15 202.

97. Flokhart D.A., Corbin J.D. Regulatory mechanisme in the control of protein kinases // CRC Crit. Rev. Biochem.- 1982 V.12 - P. 133-186.

98. Geahlen R.L., Carmihael D.F., Hashimoto E., Krebs E.G. Phosphorilation of cAMP dependent protein kinases subunit // Adv. Enzyme Regul.- 1982.- V. 20.- P. 195-208.

99. Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Tepikin A.V., Petersen O.H. Calcium transport patways in the nucleus // Pflugers Arch 1996 - V. 432 - P. 1-6.

100. Gonzalez G.A. Characterization of motifs which are critical for activity of the cyclic AMP responsive transcription factor CREB // Mol. Cell. Biol.- 1991.-V. 11.- P. 1306-1312.

101. Greengard P. Phosphorylated proteins as physiological effectors // Science.— 1977.-V. 199.-P. 146-152.

102. Gunter Т.Е., Gunter K.K., Sheu S. S., Gavin C.E. Mitochondrial calcium transport: physiological and pathological relevance // Am. J. Physiol - 1994. -V. 267.-P. 313-339.

103. Hafner S., Adler H.S., Mishak H., Janosch P., Heidecker G., Wolfman A., Pippig S., Lohse M., Ueffing M., Kolch W. Mechanism of inhibition of Raf-1 by protein kinase A // Molecular and Cellular Biology.- 1994.- V. 14.- P. 66966703.

104. Hepler P.K, Wayne R.O. Calcium and plant development // Ann. Rev. Plant. Physiol.- 1985.- V. 36.- P. 397-439.

105. Hille В. Ion channels of excitable membranes // 3rd Edition. Sinauer Associates Inc., Sunderland, USA.-2001 P. 725 .

106. Hille B. Ionic channels of excitable membranes // 2nd Edition. Sinauer Associates Inc., Sunderland, USA.- 1992-P. 607.

107. Hofman F., Beavo J.A., Bechtel P.J., Krebs F.G. Comparison of adenosine 3',5' dependent protein kinases from rabbit skeletal and bovine heart muscle // J. Biol. Chem.- 1975.-V. 250, № 22.-P. 7795-7801.

108. Jain M.K., Yen-Min W.N., Morgan Т.К. Phase transmission in a lipid belaied membrane. II Influence of adamantane derivatives // Chem. Phys. Lipids.- 1976.- V. 1.- P. 71-78.

109. Jayasree S.N., DaFoneseca C.J., Tjernberg A., Darnell J., Brian T. Reguirment of Ca and CaMKII for Statl Ser-727 phosphorylation in response to IFN-y // PNAS- V. 99, №9.- P. 5971-5976.

110. Kalab P., Kubiak J.Z., Verlhac M.H., Colledge W.H., Maro B. Activation of p90rsk during meiotic maturation and first mitosis in mouse oocytes and eggs: MAP kinase- independent and -dependent activation // Development.- 1996.-Vol. 122.-P. 1957-1964.

111. Kawasaki H., Kretsinger R. Protein Profile. Calcium-binding Proteins.-1994.- V. 261.- P. 2638-2644.

112. Keenan S.M., Bellone C., Baldassare J.J. Cyclin-dependent kinase 2 nucleocytoplasmic translocation is regulated by extracellular regulated kinase // J. Biol. Chem.- 2001.- V. 276.- P. 22 404-22 409.

113. Kerlavage A.R., Taylor S.S. site-specific cyclic nucleotide binding and dissociated of the holoenzyme of cAMP-dependent protein kinases // J. Biol. Chem.- 1982.- V. 253.-P. 1744-1754.

114. Kikkawa U., Minakuchi R., Takoi Y., Nishizuka Y. Calcium activated phospholipid dependent protein kinase (Protein kinase C) from rat brain // Methods Enzymology.- 1983.- V. 99.- P. 288-289.

115. Komalavilas P., Lincoln T.N. Phosphorylation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by cyclic GMP-dependent protein kinase // J. Biol. Chem.- 1994.-V. 269.-P. 8701-8707.

116. Komalavilas P., Lincoln T.N. Phosphorylation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by cyclic GMP-dependent protein kinase // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271.- P. 21 933-21 938.

117. Kretsinger R. Calmodulin and myosin-light chain kinase: how helices are bent// Science.- 1992.- V. 258.- P. 50-51.

118. Krupinski J., Coussen F., Bakalayr H.A., Tang W.-I., Feistein P.G., Orth K., Slaugter C., Reed R.R., Gilman A.G. Adenylyl cyclase amino acid seguence: possible channel- or transporter-like structure // Science.- 1989.- V. 244 P. 1558-1564.

119. Laemmli U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of nead of bacteriophag T4 // Nature.- 1970.- V. 227, №5259.- P. 680-685.

120. Lander H.M., Jacovina A.T., Davis R.J., Tauras J.M. Differential activation of mitogen-activated protein kinase by nitric oxide-related species // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271.- P. 19 705-19 709.

121. Lavoie J.N., L'Allemain G., Brunet A., Muller R., Pouyssegur J. Cyclin D1 expression is regulated positively by the p42/p44 МАРК and negatively by the p38/HOGMAPK pathway // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271.-P. 20 608-20 616.

122. Levitan I.B. Modulation of ion channels by protein phosphorilation and de phosphorilation// Annu. Rev. Physiol.- 1994-V. 56.-P. 193-212.

123. Levitan I.B. Phosphorilation of ion channels // J. Membr. Biol.- 1985 V. 87.-P. 177-190.

124. Liang C.T., Sacrator B. // Biochim. et biophis. acta- 1977 V. 466, №3-p. 434-487.

125. Licata S.C., Pierce C.R. The roles of calcium/calmodulin and Ras/mitogen-activated protein kinases in the development of psichostimulant-induced behavioral sensitization//!. ofNeurochemistry-2003.- V. 85.- P. 14-22.

126. Lohmann S.M., Walter V. Regulation of Cellular and Subcellular Concentrations and Distribution of Cyclic Nucleotide-dependent protein kinases // Adv. in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research — 1984-V. 45.-P. 12-18.

127. Maeno H., Reyes R.L., Ueda Т., Rudolph S.A., Greengard P. Autophosphorylation of adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase from bovine brain // Arch. Biochem. Biophys.- 1974.- V. 164.- P. 551559.

128. Maj J. The influence of dopaminergic agents on serotonin neurons // Antipsychot. Drugs. Pharmacodyn. and Pharmacokinet. Pros. Int. Symp. -Stockholm, 1974.-Oxford.- 1976.-P. 235-241.

129. Marshall K. The МАРК cascade // Curr. Opin. Gen. Develop. 1994.- №4.-P. 82-90.

130. Matsuda S., Kawasaki H., Moriguchi Т., Gotoh Y., Nishida E. Activation on protein kinase cascades by osmotic shock // J. Biol. Chem.- 1995.- V. 270.- P. 12 781-12 786.

131. Mayr В., Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB // Nature Reviews Molecular Cell Biology.- 2001.- V. 2.- P. 599-609.

132. Mignery G.A., Sudhof T.C. The ligand binding site and transduction mechanism in the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor // EMBO J 1990 - V. 9.-P. 3893-3898.

133. Mochly Rosen D., Khaner H., Lopez J. Identification of intracellular receptor proteins for activated protein kinase С // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1991.-V. 88.-P. 3997-4000.

134. Morgenroth V.H., Hegstrand L.R., Roth R.H., Greengard P. Evidence for involvement of protein kinase in the activation by adenosine 3',5' — monophosphate of brain tyrosine 3 — monooxygenase // J. Biol. Chem — 1975 — V. 250.-P. 1946-1948.

135. Naumov A.P., Kiselyov K.I., Mamin A.G., Kaznacheyeva E.V., Kuryshev Yu.A., Mozhayeva G.N. ATP-operated calcium permeable channels activated via a guanine nucleotide-dependent mechanism in rat macrophages // J. Physiol.- 1995.-V. 486.2.-P. 339-347.

136. Naumov A.P., Kuryshev Yu.A., Kaznacheyeva E.V., Mozhayeva G.N.1. Л I

137. ATP-activated Ca -permeable channels in rat peritoneal macrophages // FEBS Lett.- 1992.- V. 313.- P. 285-287.

138. Nishizuka Y. Protein kinase С and lipid signaling for sustained cellular responses // FASEB J.- 1995.- V. 9.- P. 484-496.

139. Nishizuka Y. Studies and perspectives of protein kinase С // Science.- 1986.-V. 233.- P. 305.

140. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implication for cellular regulation // Nature.- 1988.- V.334 P. 661-665.

141. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surfase signal transduction and tumor promotion // Nature.- 1984.- V. 308.- P. 693-698.

142. Ozanne B.W., McGarry L., Spense H.J., transcriptional regulation of cell invasion: AP-1 regulation of a multigenic invasion programme // Eur. J. Cancer.- 2000.- V. 36, №13.- P. 1640-1648.

143. Putney J.W. A model for reseptor regulated calcium entry // Cell Calcium.- 1986.-V. 7.-P. 1-13.

144. Putney J.W. Capacitative calcium entry revisited // Cell Calcium— 1990-V. 11.-P. 611-624.

145. Randall A.D. The molecular basis of voltage-gated Ca2+ chanell diversity: is it time for T?//J. Membrane Biol.- 1998.-V. 161.-P. 207-213.

146. Rangel-Aldao R., Rosen O.M. Dissociation and reassociation of the phosphorylated and non phosphorylated forms of adenosine 3',5'— monophosphate-dependent protein kinase from bovine cardiac muscle // J. Biol. Chem.- 1977.-V. 251.-P. 3375-3380.

147. Rangel-Aldao R., Rosen O.M. Mechanism of self-phosphorylation of 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase from bovine cardiac muscle // J. Biol. Chem.- 1979.-V. 251.-P. 7526-7529.

148. Rhee S.G., Sun P.-G., Ruy S.-H., Lee S.Y. Studies of inositol phospholipid-specific phospholipase С // Science.- 1989.- V. 244.- P. 546-550.

149. Ricken S., Leipziger J., Greger R., Nitschke R. Simultaneous measurements of cytosolic and mitochondrial Ca transients in HT29 cells // J. Biol. Chem.— 1998.- V. 273.-P. 34 961-34 969.

150. Ron D., Chen C-H:, Caldwell J., Jamieson L., Orr E., Rosen D.-M. Cloning of an intracellular receptor for protein kinase C: a homolog of the P subunit of G proteins //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.-V. 91.-P. 839-843.

151. Rubin C.S. Characterization and comparison of membrane — associated and cytosolic cAMP-dependent protein kinases // J. Biol. Chem.- 1979 — V. 254.-P. 12 439-12 449.

152. Rubin C.S., Rangel-Aldao R., Sarcar D., Erlihman J., Flescher N. Characterization and comparison of membrane-associated and cytosolic cAMP-dependent protein kinases // J. Biol. Chem 1979 - V. 254. P. 37973805.

153. Rubin C.S., Rosen O.M. Phosphorylation-dephosphorylation of enzymes // Annu. Rev. Biochem.- 1975. V. 44.- P. 831-887.

154. Sarcar D., Erlichman J., Rubin C.S. Identification of a calmodulin (CaM) binding protein that co-purifies with the regulatory subunit (R II) of braine protein kinases // Fed. Proc 1983.- V. 42- P. 2250.

155. Schwab R.S. Amantadine-HCl (simmetrel) into relation to L-Dopa in thetreatment of Parkinson's disease // Trans. Amer. Neur. Ass.- 1969.- V. 94.- P. 85-90.

156. Sherr C.J., Roberts J.M. Cdk inhibitors: positive and negative regulators of Gi-phase progression//Genes. Develop.- 1999.-№13-P. 1501-1512.

157. Sloboda R.D., Rudolph S.A., Rosenbaum J.L., Greengard P. Cyclic AMP-dependent endogenous phosphorylation of a microtubule-associated protein // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1975.-V. 72, № 1.-P. 177-181.

158. Stromberg U., Svensson Т.Н., Waldeek B. On the mode of action ofamantadine // J. Pharm. Pharmacol.- 1970.- V. 22.- P. 959-962.

159. Supattapone S., Danoff S.K., Theibert A., Joseph S.K., Steiner J., Snyder S.H. Cyclic AMP-dependent phosphorylation of a brain inositol trisphosphate reseptor decreases its release of calcium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988-V. 85.-P. 8747-8750.

160. Sutherland E., Rail T. Fractional and characterization of a cyclic adenine ribonucleotide formed by tissue particles // J. Biol. Chem.- 1958.-V. 232.- P. 1077-1091.

161. Walsh D.A., Ashby C.D., Gonzales C., Calkins D., Fischer E.H., Krebs E.G. Purification; and characterization of a protein inhibitor of adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase // J. Biol. Chem.- 1971- V. 246.— P. 1977-1985.

162. Walter U., Kanof P., Schulman H., Greengard P. Adenosine 3',5-monophosphate receptor proteins in mammalian brain // J. Biol. Chem.- 1978.-V.253.- P. 6275-6280.

163. Wilkinson M.G., Millar J.B.A. Control of the eukariotic cell cede by MAP kinase signaling pathways // FASEB- 2000.- №14.- P. 2147-2157.