Молекулярные механизмы мнестических эффектов антифеинов

Куликова, Ольга Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы мнестических эффектов антифеинов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы мнестических эффектов антифеинов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК л НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ О * ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

2 О СЕН да

На правах рукописи

КУЛИКОВА Ольга Григорьевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МНЕСТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ АНТИФЕИНОВ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.04 — БИОХИМИЯ 14.00.25 — ФАРМАКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в отделе нейрофармакологии им. акад. С. В. Аничкова Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор — академик РАМН Б. И. Ткаченко).

Научный консультант — доктор медицинских паук профессор Н. С. САПРОНОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. С. ГАЙЦХОК.И доктор медицинских наук профессор В. Б. ДОЛГО-САБУРОВ доктор медицинских наук профессор В. А. КРАУЗ

Ведущая организация: НИИ эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится « » 1994 г.

в « /з » час. на заседании специализированного совета Д 001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

Автореферат разослан « /6 » 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета

доктор биологических наук Л. В. ПУЧКОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одной из наиболее актуальных проблем в области современной нейрофармакологии является проблема изыскания эффективных фармакологических средств для оптимизации интеллектуально-мнеотической деятельности мозга, коррекции нарушений памят, лечения больных с длительно текущими органическими и функциональными заболеваниями. Прогресс а этой области невозможен без глубокого понимания физиологических и молекулярных механизмов действия применяемых препаратов. Однако, несмотря на очевидные успехи в выяснении механизмов памяти, в настоящее время не сложилось единого мнения, какие биохимические события определяют процесс закрепления информации в долговременной памяти. По-прежнему остается открытым вопрос о путях оптимизирующего влияния нейроактивных веществ на высшие интегративные функции мозга. Использование большинства из них является эмпирическим и лишь отчасти основано на понимании нейрохимических событий, лежащих в основе образования, хранения и реализации временных связей - в основном тех, которые так или иначе связаны с изучением взаимодействия нейромедиаторов С рецепторами клетки-мишени.

Общепризнанно, что необходимым этапом в механизмах закрепления информации является активация экспрессии генома (Ашмарин, 1989; Круг ликов, 1985, Kandel, 1990; Malthies, 1989). При этом подразумевается, что эта активация является "синап тической" и осуществляется через систему вторичных посредников. Однако, конкретные механизмы функциональной регуляции транскрипционной активности в нейронах не ясны, а, следовательно, остается открытым вопрос о путях вовлечения синтеза РНК и белка при действии нейроактивных веществ в процесс консолидации следа памяти. В поспедние годы получены данные о непосредственном взаимодействии нейромедиаторов и гормонов со структурами клеточных ядер (Розен, 1985,1991; Третьяк, 1990; Evans, 1988; Vedeckis, 1992). Однако, эти отрывочные сведения не дают ясного представления о механизмах их взаимодействия с генетическим аппаратом, о' роли ядерных молекулярных мишеней нейроактивных соединений в регуляции транскрипции и, тем более, о значении данного феномена для функционирования нейронов. Вместе с тем, решение этого вопроса является весьма перспективным, так как может не только внести существенный вклад в понимание биохимических событий, обеспечивающих процесс фиксации и хранения следа памяти, но и создать реальную основу для изыскания принципиально новых эффективных ноо гропных средс гв.

Изучение молекулярных механизмов памяти является плодотворным лишь при наличии адекватных модельных систем. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы можег быть применение в качестве фармакологических

зондов мнемотропных соединений с четхо определенным спектром физиологических эффектов. Очевидно, что механизм действия используемых препаратов должен Сыть расшифрован полностью.

С этой целью в настоящей работе были использованы производные имидазолдикарбоновой кислоты (антифеины), синтезированные в отделе нейрофармакологии НИИЗМ РАМН (С.ВЛничхоо и соаат., 1958). Они отличаются по своему химическому строению лишь радикалом в первом положении имидазольного кольца, близки по целому ряду физиологических и метаболических эффектов, но обнаружили разнонаправленное действие на сохранение выработанного навыка. Наиболее изученный представитель этой группы этилнооантифеин (этимизол) отнесен к препаратам с элементами ноотропного типа действия и с успехом применяется в неврологической практике. Однако, несмотря на высокую эффективность зтилнорантифеина при ряде патологических состояний, до настоящего времени остаются неизученными те тонкие биохимические механизмы, которые определяют высокую нейротропную активность этого препарата. Максимальная избирательность действия именно на процесс сохранения информации, высокая эффективность этимизола при однократном использовании позволяли предполагать его действие на функционально значимые метаболические звенья, лежащие в основе этого процесса.

Таким образом, перспективность исследования путей функциональной регуляции РНК-синтезирующей системы клеток головного мозга и необходимость поиска адекватных подходов для такого изучения определили цель настоящей работы - исследование молекулярных механизмов реализации мнестических эффектов антифеинов. Для решения этой проблемы представлялось целесообразным поставить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ влияния антифеинов (этил-, ал лил-, пропилнорантифеин, деметилированные производные аллил- и зтилнорантифеина - М^ и М^) на процесс выработки и сохранения условных рефлексов с их действием на синтез макромолекул.

2. Исследовать влияние соединений из группы антифеина на ключевые компоненты системы рецептор - вторичный посредник.

3. Исследовать систему ядерных молекулярных мишеней антифеинов; изучить роль прямой активации транскрипционной активности клеток головного мозга в долговременном сохранении следа памяти.

Научная новизна. В работе впервые экспериментально обоснована эффективность фармакологического подхода для изучения молекулярных механизмов памяти.

Впервые проведено комплексное исследование г руппы веществ с близкой структурой и разнонаправленными мнестическими эффектами на поведенческом,

клеточном и молекулярном уровнях. При однократном введении этилнорантифеин и его деметилированные производные Mj. М2, аллил-, пропилнорантифеич оказывают нейроспецифическое разнонаправленное действие на РНК-синтезирующую систему гиппокампа и нейронов коры головного мозга крыс, что коррелирует с противоположным влиянием этих соединений на сохранение условных рефлексов. При этом введение веществ с положительным влиянием на транскрипционную активность приводит к увеличению синтеза белков синаптических мембран, уровня их фосфорилирования и активности мембранносвязанной протеинкиназы С.

Впервые на молекулярной модели функционирования аденозиновых рецепторов изучено влияние антифеинов на аданилатциклазу. Установлено, что действие этимизола и его структурных аналогов не опосредовано А1 и А2 рецепторами аденозина. Активность высокоаффинной ФДЭ сАМР синаптических мембран изменяется однонаправленно при действии антифеинов. Впервые показано, что вещества с эффективным положительным влиянием на транскрипционную активность могут не оказывать прямого действия на структурно-функциональное состояние мембран (диеновые и триеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, №,К-АТРаза, Мд.Са- и Са-АТРазы,-протеинкиназа С). Ключевую роль в действии антифеинов на сохранение следа

памяти играет изменение РНК-синтезирующей системы нейронов.

Впервые обнаружено, что С-этимизол после однократного" применения способен проникать в ядра клеток головного мозга и специфически связываться с компонентами хроматина.

Установлена способность веществ с эффективным влиянием на процесс сохранения следа памяти (антифеины, пирацетам, кофеин) изменять транскрипционную активность нейронов при их непосредственном взаимодействии с хроматином. Показано, что только этилнорантифеин и его деметилированные производные повышают Са-АТРазную активность хроматина гиппокампа и нейронов коры головного мозга.

Впервые для выяснения функциональной роли сАМР-независимого фосфорилирования негистоновых белков использован комплексный подход: анализ фосфорилированных белков хроматина клеток головного мозга в системных опытах и ¡л vitro: применение антисывороток к белкам HMG 2, HMG 14, HMG 17; выделение, очистка, идентификация сАМР-незгвисимых протеинкиназ I и II казеинового типа из хроматина нейронов и глии, а также отдельных фракций HMG белков. Впервые показано, что действие антифеинов зависит от типа фермента и природы белка-субстрата. Установлено, что регуляция транскрипции ангифеинами при изменении функционального состояния головного мозга происходит при участии фосфорилированной формы белка HMG 14. Показано, что этилнорантифеин и его аналоги не влияют на транскрипционную активность

хроматина глии и его сАМР-независимое фосфорилирование. Обнаружено разнонаправленное влияние антифеиноз на автофосфорилирование протеинкиназы N11. Впервые установлено, что при действии веществ с определенной структурой может происходить дополнительное фосфорилирование, наряду с р-регуляторной, а-каталитической субъединицы фермента, что коррелирует с их стимулирующим влиянием на фосфорилирование HMG 14 и транскрипцию. Установлено, что молекулярной мишенью действия антифеинов на хрома1Ин является комплекс сАМР-независимая протеинкиназа N11 - негистоновый белок HMG14. Непосредственное влияние антифеинов на сАМР-независимую протеинкинаэу Nil может играть пусковую роль в их эффективном разнонаправленном действии на транскрипционную активность и сохранение следа памяти.

Научно-практическое значение работы. Работа, в основном, носит теоретический характер. Выдвинуто новое направление в биохимической фармакологии • изучение молекулярных механизмов памяти с помощью " фармакологических зондов - соединений с близкой структурой и избирательным дейс гвием на отдельные этапы памя ти.

Полученные в работе данные о непосредственном воздействии эффективных мнемотропов на системы регуляции функциональной активности генома нервных клеток вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов действия фармакологических препаратов, нейромедиаторов и гормонов и открывают весьма перспективный путь в изыскании веществ для оптимизации интеллектуально-мнестической деятельности мозга, направленной коррекции устойчивых патологических состояний, в генезе которых ведущими являются расстройства функции памяти.

Полученные в работе данные и сформулированные положения значительно расширяют наши представления о принципах нейрохимической организации процессов обучения и памяти; они могут найти применение в различных областях биологии и медицины, интересы которых требуют знания, молекулярных механизмов памяти.

Анализ характера изменений фосфорилирования HMG белков протеинкиназой N11 хроматина нейро.юв и глии в зависимости от действия антифеинов на транскрипционную активность вносит существенный вклад в понимание роли сАМР-независимых протеинкиназ и отдельных групп негистоновых белков в структурно-функциональных перестройках хроматина.

Помимо теоретического значения выполненное исследование представляет практическую ценность, поскольку в работе получены принципиально новые данные о молекулярных механизмах препарата ноотропного типа дейсшия этимизола и его структурных аналогов. Полученные результаты дают возможность более целенаправленно использовать антифеины в

практической медицине, расширяют спектр эффективных стимуляторов долговременной памяти и способствуют разработке новых подходов к лечению больных с длительно текущими органическими и функциональными заболеваниями.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для изучения молекулярных механизмов памяти в качестве фармакологических зондов могут быть использованы антифеины - соединения с близкой структурой, избирательным и разнонаправленным действием на сохранение слада памяти.

2. Влияние модуляторов памяти из группы аншфеина на транскрипционную активность нейронов не определяется мембранными рецепторами и системой вторичных посредников, а осуществляется на уровне ядерных структур.

3. Антифеины оказывают прямое разнонаправленное влияние на комплекс сАМР-независимая протеинкиназа Nil - негистоновый белок HMG 14. Это играет пусковую роль в модулирующем влиянии этих веществ на транскрипционную активность хроматина нейронов; противоположный характер наблюдаемых, изменений определяется структурой этилнорантифеина и его аналогов.

4. В цепи биохимический событий, обеспечивающих сохранение информации в долговременной памяти, необходимым 'этапом является непосредственное воздействие нейроактивных веществ на функциональную активность хроматина клеток головного мозга, что создает реальную основу для целенаправленого изыскания эффективных ноотропных средств.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы временной организации клетки и их регуляция на различных уровнях" (Пущино, 1983), на IX и X Всесоюзных конференциях по биохимии нервной системы (Ереван, 1983, Горький, 1987), на Всесоюзном симпозиуме "Нейрохимические механизмы регуляции памяти" (Пущино, 1983), на 16 съезде европейских биохимических обществ (Москва, 1984), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на I Всесоюзной конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга человека" (Ленинград, 1985), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы разработки, изучения и производства лекарственных средств (Каунас, 1985), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы фармакологии, токсикологии нейротропных средств (Рига, 1986), на советско-итальянском симпозиуме по нейропсихофармакологии (Ташкент, 1986), на VI Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988), на Межреспубликанской научно-практической конференции "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных средств" (Волгоград, 1989), на 28 совещании по проблемам

высшей нервной доп ;ельности (Лениирад, 1989), на Всесоюзной конференции "Биофизика мемЗсан' (Каунас, 1Э90), на V Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра'1 (Гродно, 1990), на конференции "Медицина и биология сегодня и завтра", посвященная 100-петию ИЭМ (1990), на II международной конференции стран Балтии по фармакологии и клинической фармакологии (Таллинн, 1990), на Всесоюзной конферащии "Фармакологическая коррекция гипоксических состоянии'1 (Гродно, 1991), на Международной конференции "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (С.Петербург, 1992), на 24 и 25 конгрессах Международного психоэндокринопогического общества (Таормина, Италия, 1993; Сиэтл, США, 1994), на I Международном конгрессе "Гормоны, мозг, нейропсихофармахология" (Родос, Греция, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, 3 главы, содержащие обзор литературы, материалы и методы, экспериментальную часть, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, библиографический указатель. Диссертация изложена на 2Gic границах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 38 рисунков. В библиографическом указателе- 159 отечественных и 293 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на самцах белых крыс массой 200-220 г, содержащихся на обычном пищевом рационе в режиме инвертированного света (6-18 ч). Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно из расчета 1,5-3 мг/кг массы тела. Контрольные животные получали физиологический раствор.

Влияние структурных аналогов этилнорантифеина на процесс обучения и памяти исследовали в моделях условнорефлекторного поведения. Вещества вводили ежедневно за 30 мин до начала обучения, а при исследовании эффективности сохранения навыка однократно, непосредственно после завершения обучения; тестирование сохранения условных рефлексов производили через 30 дней. (Этот раздел работы выполнен совместно с сотрудником НИИЭМ РАМН Г.Ю. Борисовой).

Нейрональные и глиальные клетки из коры головного мозга крыс получали по методу Витвицкого (1983). Выделение клеточных яде0 проводили с использованием неионного детергента Тритон Х-100. В работе использовали препараты, содержащие не менее 90-95% нейрональных (или тлиальньгх) ядер, идентифицированных по критериям Lovtrup-Rsin, McEven (1966). Хроматин из клеточных ядер получали по методу Sing, Sung (1972).

Синаптические мембраны, митохондрии и миелин получали в градиенте плотности сахарозы по методу Рожанца и соавт. (1978).

Экстракцию слабосвязанных белков хроматина 0,35 М NaCI проводили по методу Бураковой и соавт. (1980). HMG-белки выделяли из ядер клеток печени по методу Goodwin, Johns (1978); отдельные фракции HMG белков - по методу Sanders (1977) на коленке с КМ-сефадексом G-25, дополнительно очищали методом препаративного электрофореза с последующей их элюцией.

Выделение сАМР-независимых протеинкиназ I и II типа из хроматина нейрональных или глиалоных ядер коры головного мозга крыс проводили по оригинальному методу с применением ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-25 и гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-150.

Для определения уровня гидроперекисей липиды экстрагировали из плазматических мембран по методу Кейтса (1975). Уровень диеновых и триеновых конъюгатов определяли по методу Каган и соавт. (1986), количество малонового диальдегида по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Владимиров, Арчаков, 1981).

ор

Активность аденилатциклазы (А1Д) определяли по образованию [ Р] сАМР 32

из [а- Р] ATP (Premont et al., 1978). Продукты реакции идентифицировали с. помощью тонкослойной хроматографии на плайтинках "Stíufol". Здесь и в последующих разделах экспериментально подбирали условия оптимального протекания изучаемых ферментативных реакций.

Активность ФДЭ сАМР определяли по образованию [ HJAMP (при работе с

о О

постмитохондриальным супернатан гом) или суммы [ Н]АМР и [ Н)аденозина (при

работе с мембранной фракцией, содержащей 5'-нуклеотидазу) из [ Н]сАМР с последующим анализом продуктов реакции с помощью тонкослойной хроматографии.

Активность Ыа,К-АТРазы, Ca,Mg-, Са-АТРаз синаптических мембран и Са-АТРаз ядер и хроматина определяли в присутствии 1-2 мМ оубаина или Са-ЭГТА буфера по накоплению в среде инкубации Рн, который измеряли по методу Lowry, Lopez (1966) или Eibl, Lands (1969).

За активность протеинкиназы С (ПКС) принимали разность между 32 32

включением [ Р] из [у- АТР] в гистон Н1 в присутствии и при удапении активаторов (Ca, фоефатидилсерин).

О РНК-сишеяирующей ах/ивности судили по включению [ H]UMP в кислоюнерастворимый осадок в ходе инкубации ядер при 37' в течение 10 мин. Матричную активность хроматина определяли аналогичным способом. Кроме обычных компонентов в среду инкубации добавляли дополнительно 2,5 ед. РНК-полимерэзы Кг*)// (СКТГ БАВ, Новосибирск). ДНК-зависимый синтез РНК протекал ü среде, содержащей только ионы Mg (5мМ). что усыновлено с помощью теста с нктиномициномД Активность PHKJ3 клеточных ядер опраделяпи

спектрофотометрически при 260 мкм по приросту кислоторастворимых продуктов расщепления РНК за 10 мин.

Влияние антисывороток к фракциям белков HMG на фосфорилирование белков и матричную активность хроматина изучали при инкубации хроматина с очищенными иммунными антисыворотками в течение 18 ч при 4* до внесения меченых предшественников. В качестве контроля использовали хроматин, инкубированный в тех же условиях с равным по белку количеством неиммунной сыворотки. (Идентифицированные иммунные антись-^ротки были любезно предоставлены стл.сотрудником С.-П.Университета НАФедоровой).

Для определения включения меченых аминокислот в цитсструктуры головного мозга крыс животным вводили по 5 МБк на кг массы [^Н]лейцина (МА.450 ТБк/М). Определяли удельную радиоактивность только ТХУ-нерастворимой части выделенных цитоструктур.

При исследован«) динамики распределения меченого этимизола в цитоструктурах 14С-этимизол вводили внутрибрюшинно из расчета 3 мг/кг (37 МБк/кг). Через различные промежутки времени (от 2 мин до 2 суток) выделяли субклеточные фракции, в которых определяли уровень радиоактивности и количество белка. О специфическом связывании ^С-этимизола судили после его инкубации с препаратами синаптических мембран, хроматина или протеинкиназы NH. Анализ связывания проводили по Скэтчарду.

зз

О величине фосфорилирования судили по уровню включения [ Р] в белки

после инкубации хроматина с [y-33PJA7P или [y-P]GTP в течение 1 мин при 30*.

Об активности выделенных протеинкиназ судили по уровню включения [ Р] в

белки - субстраты после их инкубации с ферментами в присутствии [ Р]АТР или [^PJGTP в течение 15 мин при 30*.

Электрофоретический анализ негистоновых белков хроматина проводили на вертикальных пластинах 18%-ного полиакриламидного геля (ПААГ) по методу LaemmO (1970) в модификации Bhorjee (1981) в присутствии ДДС-Na или в "гистоновой" системе, взяв за основу метод Panlum, Chalkty (1969). Белки синап тических мембран разделяли в 9%- или 15%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na. Денситометрировали гели при 570 нм на денситометре "LeHz Walzlaw", либо разрезали на кусочки по 2 мм и определяли радиоактивность в диоксановом сцинту.лляторе.

Определение количества белка проводили по методу Lowry et al. (1951), а ДНК по методу Burton (1956). Содержание сАМР определяли с помощью наборов фирмы "Amersham" (cyclic AMP FUA Mt). Уровень общих липидов определяли сульфованилиновым методом с использованием стандартных наборов "Lachema". Радиоактивность определяли, используя диоксановый сцинтиллятор Biay

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы MIcrostat фирмы Ecosoft Inc на IBM PC AT 286..

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Поиск фармакологических соединений для изучения молекулярных механизмов обучения и памяти.

Одним из подходов к изучению прирйды нейрохимических процессов, лежащих в основе долговременной памяти, может быть их изучение на фоне действия фармакологических средств, способных на длительный срок закреплять приобретенную информацию при однократном применении. С этой целью было начато изучение структурных аналогов эффективного стимулятора памяти эжпнорантифеина (этимизола) (рис.1).

N.. ^со-нн-сн3

€Х

м^со-кн-сн,,

I 3

N ОО-МН-СНд « СМН2 Н СОКН2

\к 2<<Х з<(Х

ГЦ^СО-МН-СНд ^^СС-МН-СНд Н^СО-НН2

сн2-сн3 сн2-сн3 сн2-сн3

N со-мн-сн3 N ^.со-ин,

<Х ' <1

г^со-нн-сн» н^со-мн,

I о . г

сн2-сн=си2 сн2-сн=сн2

<х

N ^СО-ИН-СНо

6 II

со-м-сн

СН2-СН2-СН3

Рис.1 Химическая структура препаратов из ряда антифеина

1. Норантифеин 4,5-ди(Ы—метилкарбамоил)инидазол

2. Этилнорантифеин, (этимизол) ¡-этил-4,5-да(М-металкарбамоил)имидазол

3. М, 1—этил—4—карбанюил—5—метилкарбамоилимх1дазол

4. М2 I—этил—4.5—дикарбамоалимидазол

5. Аллилнорантифеин 1—алл ил —4,5—ди(Ы—метилкарбамоил /имидазол

6. Деметилированный аллилнорантифеин 1—алл ил—4,5—дикарбамоалимидазол

7. Пропилнорантифеин 1—пропил—4,5—ди(Ы—метилкарбамоил)имидазол

■ Исследование влияния антифеинов (3 мг/кг) на процесс обучения и памяти проводили с использованием методик, различающихся по сложности вырабатываемой реакции и модальности подкрепления - условный рефлекс активного избегания (УРАИ) в челночной камере, УРАИ в Y-образном лабиринте, пищедобывательный рефлекс в Y-образном лабиринте. Полученные данные . позволяют разделить исследованные антифеины по их действию на выработку и сохранение условного рефлекса в этих моделях инструментального обучения на 4 группы:

1. Этилнорантифеин (этимизол), нз имеющий оптимизирующего эффекта на стадию формирования навыка, но положительно влияющий на процесс его сохранения. 2. Деметилированные по метилхарбамоильным группировкам производные этилнорантифеина М^ и Mg, которые не влияют на стадию обучения, но обладают значительным улучшающим эффектом на долговременную память. 3. Аллил- и пропилнорантифеин, отличающиеся от этилнорантифеина лишь радикалом в 1-ом положении имидазольного кольца; они не обладают оптимизирующим влиянием на выработку УР, но ухудшают эффективность его хранения. 4. И, наконец, деметилированный аллилнорантифеин - утративший способность влиять на обучение и память.

Таким образом, исследованные вещества обнаружили четкое и разнонаправленное действие на процесс консолидации и сохранения навыка при отсутствии положительного влияния на обучение. Так как эти препараты незначительно различаются по своей структуре, очевидно, что различия их мнестических эффектов могут быть обусловлены разнонаправленными изменениями в конкретных молекулярных звеньях клеточного метаболизма, которые вызывают эти вещества.

Большое внимание в молекулярных механизмах памяти уделяется процессам синтеза макромолекул (Ашмарин, 1987; Круг ликов, 1989; Kandel, 1986; Mailhies, 1978). Наши собственные наблюдения также свидетельствуют о значительном (на 66% по сравнению с активным контролем) увеличении РНК-синтезирующей активности нейронов коры i оловного мозга крыс через 1 ч после выработки УРАИ в челночной камере. Повышение уровня синтеза было связано именно с процессом фиксации энграммы памяти, так как в группе, служившей активным контролем (животные получали в количественном, но не в качественном отношении то же раздражение, что и опытные), неспецифическое возбуждение структур головного мозга не приводило к заметному увеличению включения меченого предшественника РНК в клеточные ядра головного мозга крыс.

Особенно убедительные доказательс гпа этого факта были получены при изучении влияния соединений с максимальной избирательностью действия именно на процесс консолидации - этилнорантифеина и его структурных аналогов по отношению к РНК-синтезируюшгй системе ядер гиппокампа и коры головного

мозга крыс (активность РНК-полимераз I и II, рибонуклеаз (РНКаз), магричная активность хроматина).

Таблица 1

Влияние антифеинов на РНК-синтезирующую систему ядер коры головного мозга

крыс.

Вещество (Змг/кг) Скорость включения [ЭЩ11МР пмоль /мг ДНК- мин Активность РНКаз ОД/мг белка мин»

нейроны глия нейроны

К. (п=12) 59,3±1,3 100% 35,9±1,1 100% 3,0±0,11 100%

Мг (п=5) 79,6±3,9* +34 36,9±4,8 +3 3,0±0,11 +10

М1 (п=5) 87,1±1,9* +46 37,7±3,7 +5 3,3±0,31 +17

Э. (п-Э) 74,9±4,2* +26 Э4,5±1,2 -4 Э,5±0,31 +13

ДА. (п=3) 53,8±2,2 -9 35,2±3,6 -2 2,9±0,37 -5

А. (п=9) 49,2±2,3* -17 33,7±2,9 -6 2,0±0,21 -3

П. (п=6) 45,0±1,8* "24 34,4±2,3 -4 2,7±0,1Э -10

Примечание: К. - контроль Э. - эгилнорантифеин ДА. - деметинированный аллилнорантифеин А. - аллилнорантифеин П. - пропилнорантифеин (п) - количество опытов »- п-3, * - р < 0,05

Этимизол, М^, через 60 мин увеличивают РНК-синтезирующую активность ядер и матричную активность хроматина нейронов, не не глии при однократном введении в дозе 1,5-3 мг/кг, эффективной для их влияния на стадию консолидации (табл.1). Аллил- и пропилнорантифеин, напротив, снижают эти показатели. Особенно яркими были эффекты антифеинов в отношении РНК-синтезирующей активности ядер гиппокампа: этимизол, М^, М2 повышают ее на 31%, 39%, 55% соответственно. Аллил- и пропилнорантифеин снижают на 19% и 27%. Не было отмечено изменений РНКазной активности ядер коры и гиппокампа при действии антифеинов (табл.1).

Об изменении структурно-функционального состояния хроматина клеток головного мозга при действии антифеинов свидетельствуют также данные по определению его Са-АТРазной активности. Выработка УРАИ в челночной камере сопровождалась повышением активности этого фермента: в ядрах нейронов коры на 29% по сравнению с активным контролем, в ядрах гиппокампа на 83%. М2 и этилнорантифеин через 60 мин после применения повышали Са-АТРазную активность нейрональных ядер коры головного мозга крыс на 32% и 25%. Еще более значитепьное увеличение активности этого фермента (+62% и +47%) обнаружилось в ядрах гиппокампа, то есть наблюдалась прямая корреляция между изменениями активности Са-АТРазы и РНК-син тезирующей системы. Аллил- и пропилнорангифеин - вещества с отрицательным действием на

lî

транскрипционную активность не оказывали влияния на Са-АТРазу. Также не было отмечено изменений активности этого фермента в глиальных ядрах.

Особо следует отметить, что аллил- и лролилнорантифеин сохраняют однонаправленное действие с этимизолом на ряд других показателей, характеризующих фармакологическую активность (дыхание, возбудимость структур головного мозга, влияние на систему гипофиз-кора надпочечников) и даже превосходят его no эффективности действия (Бородкин, 1966; Сапронов и соавт., 1987), но имеют противоположное влияние именно на процесс сохранения УР и РНК-синтезирующую систему. В то же время деметилированные производные этимизола М^ и Mj значительно уступают ему по показателям фармакологической активности, но превосходят в действии на эффективность со.\ранения навыка и транскрипционную активность ядер коры и гиппокампа.

Таким образом, соединения с близкой структурой, близкие по целому ряду физиологических эффектов,, обладают ярко выраженным противоположным действием на сохранение УР и РНК- синтезирующую систему нейронов.

Согласно предполагаемой схеме памяти, ее обязательным условием, кроме активации генетического аппарата клеток мозга, является устойчивое повышение проводимости отдельных синапсов, что связано с изменением пластических свойств мембран в результате модификации и обновления мембранных белков (Alton, 1991 ).

Установлено, что однократное введение этилыорантифеина (3 мг/кг) через 180 мин значительно повышает (на 47% по сравнению с контролем) фосфорилирование белков мембран коры головного мозга крыс. По данным электрофоретического анализа в ПААГ в присутствии ДДС-Na стимулирующий эффект сильнее всего проявляется в области белков с молекулярной массой 45, 24-30,19,8-10 кДа.

Этимизол и его деметилированные производные приводят к повышению активности мембранносвкзанной протеинкиназы С через 180 мин (но не через 15 мин) после введения. Аллил- и пролилнорантифеин не оказывают влияния на акпвзностъ фермента (табл.2). Учитывая сроки введения антифеиноа, можно предположить, что стимулирующий эффект на фосфорилирование синалтических белков связан с усилением процессов транскрипции и трансляции.

Используя [3Н]лейцин (как предшественник белка), мы попытались проследить дальнейшую цепь биохимических событий в различных субклеточных образованиях и выяснить их возможную роль в реализации мнестических эффектов антифеинов. Для этого аминокислоты вводили через 60 мин после введения антифеинов (когда были обнаружены заметные изменения РНК-синтезирующей активности), а фракционирование начинали через 6С, 120 и 180 мин после этого. В большинстве исследованных цитоструктур (ядра нейронов, митохондрии, компоненты эндоплазматического ретикулума) коры и гиппокампа

четких закономерностей между влиянием антифеинов на интенсивность включения ['^Н]лейцина и их действием на РНК-синтезирующую систему и эффективность сохранения навыка обнаружено не было. Однако, введение этилнорантифеина, М1 и М2 - веществ с выраженным положительным влиянием на эти показатели приводило через 180 мин к увеличению синтеза синаптосомальных белков (табл.2).

Таблица 2

Влияние антифеинов на фосфорилирование и обновление белков синап гич&жих мембран коры головного мозга крыс (п-5).

Исследуемое вещество (Змг/кг) Включение [3Н] лейцина Активность протеинкиназы С пмоль/мг белка- мин

180 мин 15 мин 180 мин

Контроль Mi Мг Этилнорантифеин Аллилнорантифеин Пропилнорантифеин 185± 8 100% 246±16* +33 219±10* +18 215± 9* +16 198± 9 +7 197±10 +7 294±36 100% 315±27 +7 318±31 +8 315±33 +7 309±36 +5 306+33 +4 294±36 100% 435±26* +4€ 419±i<1* +43 403±32* +37 346±22 +18 352±20 +17

Примечание: (п) - количество опытов * - р<0,05 '

Таким образом, применение в качестве фармакологических зондов антифеинов - веществ, обладающим широким спектром мнестических эффектов, максимальной избирательностью действия именно на процесс сохранения следа памяти, высокой эффективностью при однократном применении позволяет с большой долей уверенности говорить о том, что в действии антифеинов на процесс фиксации и сохранения следа памяти значительную роль играет изменение РНК-синтезирующей системы ядер гиппокампа и нейронов коры головного мозга крыс. Функциональную значимость этого факта поддерживают результаты по обновлению в этих условиях синаптических белков и увеличению уровня их фосфорилирования.

2. Изучение роли синаптических мембран в механизмах функциональной регуляции транскрипции нервных клеток антифеинами.

При [«учении действия нейроактивных соединений на интегративную деятельность мозга особое внимание уделяется процессам,' характеризующим функциональную активность мембран. Это связано, прежде всего, с тем, что эффекты большинства эндогенных и экзогенных веществ опосредуются системой рецептормый комплекс-вторичный посредник. Логично было предположить, что влияние мод/ллторов долговременкой памяти из группы антифеина на РНК-

синтезирующую систему также реализуется опосредовано по следующей схеме (на примере сАМР): связывание с рецептор ом на клеточной мембране активация мембранной АЦ и повышение уровня сАМР активация сАМР-зависимых протеинкиназ -* фосфорилирование белков хроматина -> активация генетического аппарата.

Учитывая структурное сходство антифеинов с аденозином и мешлксан тинами, было изучено их влияние на систему аденозиновых рецепторов. Кофеин и другие метилксантины блокируют аденозиновые рецепторы, и в настоящее время именно с этим свойством связывают их стимулирующее действие в ЦНС (Daly, 1986; Bumstock, 1978). Взаимодействуя с рецепторами аденозин и его антагонисты, модулируют активность аденилатциклазы (АЦ) мозга через 2 типа рецепторов: А^-ингибирующий и А2-акгивирующий фермент (Londos et al., 1981; Daval el el., 1991). В настоящей работе идентификацию рецепторов проводили по соотношению сродства рецепторов к производным аденозина, устойчивым к аденозиндезаминазе, - 6М-(2-фенилизомропил)аденозину (ФИА) и 5(N- этилкарбоксамидаденозину) (НЕКА). Учитывали также, что функционирование G-белков в составе рецептора зависит от ионного состава сроды (Grazlano, Gllman, 1987 : Oumanetal., 1989).

■ig|Ki ,м

Рис.2 Влияние нейроактивных еещосш на активность аденилатциклазы в мембранах коры (А) и гомогенате стриатума (Б1 головного мозга крыс в присутствии аденозиндезаминазы (п=5) 1.ФИА 2. НЕКА 3. ФИА в присутствии 1 тМ изобутилметилксантичо 4. эгилнорантифеин 5. базальная АЦ в - р< 0,05

В синаптических мембранах коры головного мозга крыс агоними снижали аюивность АЦ, при этом ФИА обладал более высоким (наномолирны* ■/ сродством к МаР стимулируемой АЦ по сравнению с НЕКА (с микромолярщ. м сродством)

(рис.2А). Учитывая данные о преимущественном сродстве ФИА к А^, а НЕКА к Аг-рецептору, можно полагал,, что в синалтических мембранах коры выявлены А.| -рецепторы аденозина. Действие производных аденозина через А^ рецептор проявлялось только в присутствии Однако, при удалении бТР из

инкубационной среды ФИА и НЕКА не влипли на ферментативную активность, даже если №С1 присутствовал в оптимальной концентрации (80 мМ).

Аг-рецептор нам удалось выявить в гомогенате стриатума (рис.2Б); этот факт подтверждают также данные о значительном снижении (на 42%) активности АЦ при внесении в среду 1-5 ед/мл аденозиндезаминазы, что свидетельствует об активирующем влиянии эндогенного аденозина. В гомогенате стриатума НЕКА в большей степени, чем ФИА повышал активность АЦ. Наблюдаемые эффекты, как и в случае ингибирующих рецепторов, требовали присутствия СТР. Необходимым условием проявления активности АЦ, сопряженной с А2-рецелторами, было удаление из среды инкубации ионов Са.

Таким образом, в условиях эксперимента в мембранах коры головного

мозга крыс отчетливо проявляется активность АЦ, сопряженной с

А1 -ингибирукмцим, а в стриатуме с А2-активирующим рецептором. Однако, в этой

модельной системе антифеины с противоположным влиянием не!

транскрипционную активность хроматина нейронов, не изменяли активность, как

базальной, так и ЫвЯ-стимулируемой АЦ. Так, этилнорантифеин не оказывал

Ч 4

влияния на активность исследуемого фермента в концентрациях 10-10 М (рис.2). Не было отмечено эффектов на активность АЦ и для деметилированных производных этилнорантифеинз - М^ и Ранее было показано, что аллил- и пропилнорангифеин в ряду антифеинов обладают более выраженным действием на изученные мембранные показатели (Вислобоков, Зайцев, 1982). Однако, и эти соединения не оказывали влияния на активность АЦ, сопряженной с рецепторами

А1иА2'

Этот вывод подтверждается экспериментами по определению связывания

С-этимизола с синап гическими мембранами к легок головного мозга крыс. Анализ экспериментальных данных показал, что специфическое связывание этимизола не обнаруживалось как в отсутствие, так при добавлении а инкубационную среду Мд2+, вТР, необходимых для модуляции активности АЦ аденозином и его неметаболизирующими производными.

В то же время антифеины оказывали заметное влияние на ФДЭ сАМР с высоким сродством к субстрату, контролирующую базальный уровень сАМР, и низким сродством, которой приписывается важнейшая роль в регуляции уровня сАМР в экстремальных у: ловиях (51гас1а, 1985).

При отсутствии эффекта на 5'-нуклеотидазу антифеины с противоположным действием на транскрипционную активность нейрональных ядер, обнаружили однонаправленное ингибирующее влияние на активность ФДЭ

сАМР (рис.3). Усиление ингибирующего эффекта происходит в следующем ряду: деметилированные производные, этил-, аллил-, пропилкорантифеин. Иными словами, наименьший подавляющий эффект на ФДЭ оказали М^ и М2 - вещества с наиболее выраженным влиянием на Р НК-синтезирующую систему нейронов.

■|д|к|,м -|д|К1,м

Рис.Э Влияние антифеинов на активность ФДЭ сАМР с высоким (А) и с низким (Б) сродством к субстрату в мембранной фракции коры головного мозга крыс (п«7)

1. Mj 2. М^ 3. норантифеин 4. этил- Е. аллил-6. пропилнорантифеин • - р < 0.05

Действие антифеинов отчетливо проявлялось при их концентрации в инкубационной среде 10-5-10-3 м. Поэтому маловероятно, что заметное подавление аллил- и пропилнорантифеином высокоаффинной ФДЭ в достаточно высоких концентрациях может существенно отразиться на уровне сАМР ш vivo. Действительно, было обнаружено отсутствие подъема сАМР в коре, гиппокампе и стриатуме головного мозга крыс через 15 и 60 мин после однократного введения антифеинов в дозе 3 мг/кг.

Большинстве работ о молекулярных механизмах функционирования аденозиновых рецепторов сводится к изучению системы регуляции сАМР. В то же время показана связь эффектов аденозина на этот тип рецепторов с Са-з£висимыми процессами и обменом фосфолипидов (Silineky, 1985; Petcofl, Cooper, 1987) (подобные закономерности отмечаются и в отношении других типов рецепторов). Видимо, здесь нет необходимости объяснять критерии выбора для проводимого анализа - Са-АТРаз и протеинкиназы С синаптичоских мембран; регуляторная роль зтих важнейших ферментных систем в молекулярных механизмах, обеспечивающих преобразование сигналов в ответные реакции

нейронов достаточно широко обсуждается в литературе (Глебов: Крыжановский, 1988; Alkon. Nelson, 1990; Eboll, 1991; Kennedy, 1989). Однако, нам не удалось обнаружить непосредственного влияния антифеинов (10"^-10'^М) на активность транспортной Мд.Са-АТРазы, актомиозинподобной Са-АТРазы синаптосом коры, гиппокампа и стриатума и мембранной протеинкиназы С. Не удалось также выявить изменений активности АТРаз через 15,60 и 180 мин после однократного применения антифеинов (табл.3).

Таблица 3

Сравнительный анализ метаболических и фармакологических эффектов

антифеинов.

Анализируемый эффект НА. ДА. Ml м2 э. А. п.

Фармакологическая активность увепичэние активности *

Мембранные эффекты:

АЦ-рецептор 0 0 0 0 0 0 0

ФДЭ сАМР >

Са-АТРазы in vitro in vivo 15,60,180 мин 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Протеинкиназа С in vitro in vivo 15 мин in vivo 180 мин ООО 0 0 0 0 0 + 0 0 + 0 0 + ООО ООО

Процессы ПОЯ 0 0 0 0 0 0 0

Na.K-АТРаза in vitro in vivo 15 мин 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Выработка УР 0 0 0 0 0- 0- 0-

Сохранение УР 0 0 ++ ++ + - -

РНК-синтезирующая система нейронов 0 0 ++ ++ +

(+) - выраженный положительный эффект; (++) - усиление эффекта; (-) -отрицательный эффект; (0) - отсутствие эффекта; (0-) - отсутствие эффекта или отрицательный эффект. НА. - норантифеин; ДА. - деметилированный аллилнорантифеик; М,, ^ - деметилированные производные этилнорантифеина; Э. • этил-, А. - аллил-, П. - пропилнорантифеин

Не менее важную роль роль, чем вторичные посредники, в передаче транссиналтического сигнала играют свободно-радикяиьные перестройки синаптических мембран. Процессы переписного окисления липидов (ПОЛ) приводят к циклическим изменениям жидко-кристаллической структуры мембран и модулируют активность важнейших мембранносвязанных ферментов (АЦ, №,К-АТРаза, ФДЭ сАМР, протеинкиназа С), рецепторов и каналов (Бурлакова, 1989). Проведенный анализ влияния антифеинов на состояние липидной компоненты показал, что зтимизол и его структурные аналоги не влияют на уровень диеновых, триековых коныогатов и ТБК-активных продуктов характеризующих различные стадии ПОЛ.

Таким образом, действие на транскрипционную активность нейронов аналогов этилнорантифеина не определяется их влиянием на важнейшие универсальные механизмы регуляции клеточного метаболизма: структурно-функциональное состояние мембран и систему рецептор-вторичный посредник; противоположные эффекты на долговременную память коррелируют лишь с их влиянием на генетический аппарат клеток головного мозга. Поэтому можно предположить, что модулирующее действие антифеинов осуществляется на уровне ядерных структур. Полученные результаты о влиянии этих соединений на Са-АТРазную активность, связанную с сократительными компонентами негистоновых белков хроматина коры и гиппокампа головного мозга крыс в опытах № уйго также подтверждают это предположение и свидетельствуют о том, что молекулярная мишень действия антифеинов может быть непосредственно связана с хроматином.

3. Исследование роли прямой регуляции транскрипции клегок головного мозга в мнестических эффектах антифеинов.

В последние годы появился целый ряд новых данных, свидетельствующих о существовании по меньшей мере 2-х параллельных путей регуляции экспрессии генома найромедиаторами и гормонами: 1. при участии вторичних посредников, образующихся в результате взаимодействия нейроактивных веществ с рецептором на клеточной мембране; 2. посредством прямого воздействия на активность генетического аппарата.

Поскольку характер действия антифеинов на РНК-синтезирующую систему

нейронов не определяется системой рецептор-вторичный посредник (раздел 2),

необходимо было изучи гь вопрос о проникновении этих соединений в клетки

головного мозга. Без этич результатов целесообразность обсуждения прямого

воздействия антифеинов на генетический аппарат нейронов была бы

сомнительной. Для выявления акцепторов антифеинов проведено исследование 14

распределения 1 С-этимизола в цитоструктурах коры головного мозга крыс.

Установлено, мо через 2 мин после введения метка проникает в клетки мозга, а

через пять минут самый высокий уровень радиоактивности по сравнению с

другими цитоструктурами обнаруживается в клеточных ядрах. Их высокая

акцептирующая способность к С- этимизолу удерживается на протяжении семи сук " При этом преимущественное связывание препарата с клеточными ядрами не случайно, а имеет, видимо, функциональное значение, так как РНК-синтезирующая активность нейронов коры головного мозга крыс через 30, 60 и 180 мин после однократного введения зтимизола повышается на 18%, 26% и 35% соответственно.

Изучрчие процесса связывания С-этимизола с препаратами хроматина нейронов коры головного мозга крыс показало наличие специфического связывания. Анализ полученных экспериментальных данных по Скэтчарду позволил определить параметры этого процесса: константу связывания (Кд) -27±2,Знмоля и максимальное число доступных мест связывания (Втах) * 360 фмолей на мг белка. Этот факт еще раз подтвердил возможность прямого действия антифеинов на системы регуляции функциональной активности хроматина клеток головного мозга.

Действительно, обнаружено, что этилнорантифеин и его структурные аналоги способны непосредственно влиять на транскрипционную активность изолированных ядер гиппокампа и нейронов коры головного мозга крыс. При этом они, как и в системных опытах, проявляют разнонаправленное влияние (рис.4). Особенно яркий стимулирующий эффект оказывают М^ и Mg. Аллил- и пропилнорантифеин, напротив, снижают транскрипционную активность.

•ig [К]. м

Рис. 4 Впияние антифеинов на РНК-синтезирующую активность ядер нейронов (А) (п=9) и глии (Б) (п=5) коры головного мозга крыс 1.М2 2. М| 3. этилнорантифеин 4. деметилированный аллилнорантифеин 5. аллилнорантифеин 6. пропилнорантифеин в-р<0,05

Деметилированный аллилнорантифеин не вызывает достоверных изменений. Разнонаправленные эффекты антифеинов на хроматин нейронов исчезали при экстракции слабосыязанных негистюновых белков солевыми растворами с низкой ионной силой (0,35 М ЫаС1) (рис. 5).

-1д [К]. М -1д 1К],М

Рис.5 Участие слабосвязанных негистоновых белков в эффектах антифеинов на транскрипционную активность хроматина нейронов (п-7) А. исходный хроматин Б. хроматин, обедненный слабосвязанными нсгистоновыми белками • - р<0,05

1.М, 2. М^ 3. этилнорантифеин 4.деметилированный аллилнорантифеин 5. аллилнорантифеин 6. пропилнорантифеин

Следует также подчеркнуть, что как и в системных опытах, этимизол и его аналоги не влияют на транскрипционную систему глиальных ядер и хроматина. (рис.4) Нейроспецифичность полученных эффектов подтверждают также данные об однонаправленном влиянии антифеинов на РНК-син тезирующую систему ядер клеток печени. В этом случае аллил- и пропилнорантифеин оказывали наибольшее стимулирующее действие, а М^ и М2 утратили эту способность.

Таким образом, выстраивается довольно последовательная система аргументов, свидетельствующая о прямом действии антифеинов на системы регуляции функциональной активности генетического аппарата клеток головного мозга. Этот вывод определил необходимость поиска ядерных молекулярных мишеней этих соединений.

Анализ данных литературы, а также собственных экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, позволил предположить, что с,гцестаенным моментом в действии изучаемых веществ на транскрипционную активность может быть их влияние на сАМР-независимое фосфорилирование белков хроматина.

Рис. 6 Влияние этилнорантифеина и его структурных аналогов на сАМР-независимое фосфорипирование негистоновых белков хроматина А. однократное введение Змг/кг Б. ш пЬо 10*6 м айтифеинов В. фракция слабосвязанных белков (0,35 М N801) 1.М22. М1 Э. этилнорантифеин 4. аллилнорантифеик 5. пропилнорантифеин

□ - нейроны коры ■ - гилпокамп • - р<0,05

Действительно, разнонаправленные эффекты антифеинов, которые они оказывают на РНК-синтезирующую систему клеток головного мозга крыс и сохранение выработанных УИ, отчетливо проявились и при действии этих соединений на сАМР-независимое фосфорипирование белков хроматина (сАМР в концентрациях 10'^ - 10"^ М не оказывал влияния на этот процесс). При однократном применении в дозе 3 мг/кг и непосредственном воздействии в низких дозах этилнорантифеин и его деметилированные производные повышают его уровень в ядрах гиппокмпа и нейронов коры, а аллил- и пропилнорантифеин снижают (рис. 6 А, Б). В то же время исследованные соединения не оказывают влияние на фосфорилирование белков хроматина из глиальных ядер, Таким образом, прослеживается корреляция в действии антифеинов на транскрипционную активность хроматина клеток головного мозга и сАМР-независимое фосфорилирование хромосомальных белков.

Изучение действия этилнорантифеина и его структурных аналогов на сАМР-независимое фосфорилирование различных фракций хроматина показало, что исследуемые вещества, не влияя на интенсивность фосфорилирования гистонов и прочносвязанных белков, модулируют этот процесс во фракции слабосвязанных негистоновых белков нейронов, но не глии коры головного мозга крыс. В присутствии вТР (эти условия, специфичны для определения. сАМР-независимой протеинкиназы II) этилнорантифеин, М^, М2 увеличивают

интенсивность фосфорилирования (рис. 6В). В го же время аллил- и пролилнорантифеин, снижающие транскрипционную акплность, не изменяют уровень сАМР-независимого фосфорилирования слабосвязанных белков. Следует отметить, что при удалении этой фракции сАМР-независимое фосфорилирование белков хроматина снижалось в 5 раз (с 9,4±0,18 до 1,9±0,15 нмоаей на мг белка мин). Напомним, что модулирующий эффект антифеинов на транскрипцию также исчезал при экстракции белков 0,35 М №С1.

В состав этой фракции входит значительное когхчество белков с различными свойствами. С помощью электрофореза в 18%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Ыа было изучено, какие именно белки хроматина ответственны за стимуляцию процесса фосфорилирования при действии этимизола. Электрофоретический анализ суммарных белков хроматк а и фракции слабосвязанных белков показал, что межа включается в высокоподвижные белки с молекулярной массой 10 кДа (рисУА, 1).

Эта же величина была получена и при определении молекулярной массы различных компонентов фракции слабосвязанных белков хроматина нейронов головного мозга при гель-фильтрации на колонке с сефадексом в-150: белки с наиболее высокой степенью фосфорилирования имели молекулярную массу 10 кДа. Значительное снижение степени фосфорилирования при экстракции белков 0,35 М №С1 также происходит за счет этой высокоподвижной фракции.

Рис. 7 Радиоактивность фракций слабосвязанных бепков после фосфорилирования хроматина нейронов в присутствии [ЗЗр]СТР (п=5) А. электрофорез с ДДС-№ 1. контроль 2. влияние этимизола (10-5 М) 3. денситограмма электрофореза. На верхней абсциссе величина Мг стандартных белков (в кДа): химотрипсиноген - 25; мисг побин -17,8; цитохром С -12,3

Б. "гистоновая система" а. гистон Н1 б. НМС1/2 в. НМв 14 г. нмв 17

Этимизол избирательно увеличивает степень фосфорилирования этих низкомолекулярных компонентов, если хроматин предварительно инкубировали в присутствии [33PJATP или [33P]GTP (рис.7А, 2).

Часть слабосвязанных белков, экстрагируемых 0,35 М NaCI, относится к группе высокоподвижных белков - белков HMG (High Mobility Group). Они привлекают особое внимание исследователей, поскольку целый ряд данных свидетельствуют в пользу их участия в процессе структурно-функциональных перестроек хроматина, связанных с активацией транскрипции (Dorblc, Wffllg, 1S87; Gaziil et el., 1S80; Yamasu et al., 1986; Welsbrod, Weintraub, 1979).

Их характерными особенностями являются низкая величина молекулярной массы (а, следовательно, высокая подвижность при электрофорезе с ДДС-Na), растворимость в 0,35M NaCI и в 2%-ной трихлоруксусной кислоте (для HMG 14 и HMG 17 - в 10%-ной ТХУ) (Johns, 1982; Тугей et al., 1982). Для идентификации низкомолекулярных белков, чувствительных к этимизолу, нами было использовано и это свойство белков группы HMG. С этой целью хроматин из нейронов головного

•эо

мозга инкубировали в присутствии ["PJATP, затем экстрагировали белки 0,35М NaCI с последующим фракционированием в 2%-, 10%- и 25%-ной трихлоруксусной кислоте. При этом основную часть метки обнаруживали во фракции, обогащенной белками HMG 14 и HMG 17. Этимизол увеличивал фосфорилирование только этой фракции, при этом степень фосфорилирования возрастала на 37%.

HMG-белки имеют специфический аминокислотный состав (25% основных и 30% кислых аминокислотных остатков), что дает возможность исследовать их в "гистоновой" электрофооетической системе (Караванов, Афанасьев, 1983; Johns, 1982). Электрофорез (в присутствии мочевины и уксусной кислоты) слабосвязанных белков хроматин позволил выявить пик с высоким уровнем радиоактивности. По длине пробега белки этого пика соответствуют HMG 14/17 (рис.7Б,1). Этимизол и в этом случае увеличивал степень фосфорилирования в среднем в 2 раза (7Б,2).

Таким образом, показано, что стимуляция фосфорилирования белков хроматина нейронов головного мозга крыс при действии атимизола происходит за счет низкомолекулярных белков (10 кДа), которые по целому ряду свойств проявили значительное сходство с белками HMG 14/17.

Веским аргументов в пользу этого вывода являются результаты опытов по изучению влияния антисывороток к фракциям белков HMG на транскрипционную активнрсть хроматина мозга и фосфорилирование его хромое ом&льных белков.

Антисыворотки к белкам HMG 2,14,17 снижают транскрипцию хроматина нейронов коры головного мозга крыс. Ингибирующее влияние на транскрипцию обусловлено, вероятно, несколькими причинами. При образовании иммуншх комплексов белки HMG - антитела к белкам HMG могут создаваться стерические препятствия для продвижения РНК-полимеразы. HMG 14 и HMG 17, изменяя углы

выхода нити ДНК и увеличивая радиус сверхспирализации ДНК, участвуют в формировании транскрипционно активной конформации хроматина (Harrington, 1982; Uberhacher et al., 1982). Взаимодействие HMG 14/HMG 17 c антисыворотками, очевидно, ограничивает их участие в конформационных преобразованиях.

Таблица 4

фосфорилирование белков хроматина нейронов, обработанного иммунными сыворот- "1 к белкам HMG 14 и HMG17 в присутствии GTP (п-5)

Модельная система нмоль [33р]/мг белка-мин

Хроматин Хроматин + неиммунная сыворотка Хроматин + иммунная антисыворотка кбелкам НМв17 №Ж314 Хроматин + этимизол (10-бМ) Хроматин + этимизол (10-бМ) + антисыворотка к НМв 14 5,13±0,22 100 (%) 5,52±0,37 +8 5,81 ±0,39 +4 4,14±0,35* -26 7,13±0,24* +37 5,52±0,35 +7

Кроме того, можно предположить, что антисыворотки к белкам HMG могут препятствовать образованию модифицированных форм этих белков. Действительно, при выяснении влияния антисывороток к белкам HMG 14 и HMG 17 на процесс сАМР-независимого фосфорилирования белков хроматина показано, что антисыворотка к HMG14 обнаруживает ингибирующий эффект (табл.4). В то же время антисыворотка к HMG 17 не оказывает заметного влияния на этот процесс. Вызываемое этимизолом повышение уровня фосфорилирования белков хроматина нейронов ингибировалось антисывороткой к HMG 14. Введение в систему фосфорилирования in vitio антисыворотки к HMG 14, очевидно, приводило к экранированию и (или) изменению конформации части сайтов фосфорилирования. Данное предположение основывается' на том, что сайты фосфорилирования и антигенные детерминанты в молекулах белков расположены в непосредственной близости друг от друга (Норр, Woods, 1981).

Сопоставление данных об ингибировании антисывороткой к HMG 14 активирующего влияния этимизола на фосфорилирование бепков хроматина нейронов с повышением транскрипционной активности при действии этого соединения, а также результатов электрофоретического анализа свидетельствует, что регуляция транскрипции антифеинами может осуществляться при участии фосфори лированного бежа HMG 14.

Таким образом, этилнорантифеин и его структурные аналоги влияют на оАМР-независимое фосйорилирование HMG-подобных белков хроматина. Однако, процесс этот суммарный и осуществляется протеинкиназами NI и Nil типа. Для того, чтобы выяснить, как реализуется эффект антифеинов, представлялось

необходимым выделить сАМР-независимые протеинкиназы из хроматина нейронов и глии коры головного мозга крыс. В основу выделения были положены принципы, применяемые для очистки ферментов данного 1ипа из клеточных ядер печени или тимуса (1поие е1 а>., 1984; Уи1ап1 еу а1., 1985). Были подобраны условия, обеспечивающие наиболее полную солюбилизацию фермента в нативном состоянии. Из ряда исследованных способов лучшие результаты дала экстракция 0,ЗМ (МН^ЗО^ в сочетании с дезинтеграцией хроматина ультразвуком. Последующие этапы включали разделение ферментов методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-25 и их очистку методом гель-фильтрации на колонке с сефад эксом С-150. Использование в качестве источника ферментов хроматина дало возможность не прибегать к целому ряду дополнительных процедур (в частности, хроматографии на фосфоцеллюлозе), которые применяются при выделении протеинкиназ из клеточных ядер или гомогената различных тканей. Использование приведенной схемы разделения и очистки ферментов привело к получению препаратов, очищенных в 66 и 694 раза по отношению к исходному экстракту из хроматина.

Для идентификации выделенных ферментов были изучены их сзойства по критериям, определяющим различные типы протеинкиназ (гистонкиназы, казеинкиназы, тирозинкиназы, Са2+, кальмодулиизависимые ПК) (табл.5).

Таблица 5

Основные свойства выделенных сАМР-независимых протеинкиназ I и II из хроматина нейронов коры головного мозга крыс

Свойства фермента N1 N11

Связывание с ДЭАЭ-сефадексом А-25 . +

Молекулярная масса ПК (х10_3) 45 130

Доноры фосфата АТР атр.отр

Кто для АТР .9.5 7,5

«л, для вТР 120 8,3

Активность в присутствии казеина и 100% 100%

10мММдС1г

+сАМР 96% 98%

-казеин, + фосфитин * 146% 192%

-каззин, + суммарные гистоны 3% 4%

+гепарин (1 мкг/мл) 86% 30%

-МдС12,+10мММпС12 44% 5%

-МдС1г, + 1 ММ СаС1г 43% 69%

+10-5мСаС1г 92% 79%

+10-5 (и СаОг + 2,5 мкг/мл кальмодулин. 88% 80%

* оптимальное количество МдС12 в этом случае составило 5 мМ. Знаки (+) или (-) означают наличие или отсутствие компонента в инкубационной среде

Было показано что обе выделенные протеинкиназы эффективно фосфорилируют казеин и фосфитин и практически неактивны в отношении гистонов. Известно что казеинкиназэ II способна использовать GTP почти также эффективно, как и ATP (Pinna, 1991). Выделенная протеинкиназа II хроматина оказалась активна практически в равной степени при использовании в качестве источника фосфата как АТР, так и GTP.

Казеинкиназы различаются по чувствительности к гепарину (Hathaway et al., 1989). Фермент I типа не ингибируется низкими концентрациями этого вещества, в то время как казеинкиназа II практически полностью подавляется гепарином в концентрации 1 мкг/мл. Как следует из табл.5, гепарин в указанной концентрации эффективно ингибирует лишь фермент II типа.

Необходимым условием для проявления максимальной активности выделенных ферментов является присутствие ионов Мд2+ в среде инкубации. Их замена на ионы Мп2+ привела к значительному снижению фосфорилирования казеина этими ферментами. По этому признаку исследуемые протеинкиназы нельзя отнести к типу тирозинспецифических протеинкиназ, которые являются Мп2+ -зависимыми ферментами (Thomburg et al., 19/9).

В идентификации выделенных протеинкиназ существенным моментом явилась их дифференциация о г Са?+, калмодулин-зависимой формы, для которой характерна гораздо более высокая активность в нейронах головного мозга по сравнению с другими тканями (Nairn, 1985; Sahyoun et al., 1985). Однако, не было отмечено стимуляции фосфорилирования белков ионами Са2+, а также Са^+ в сочетании с калмодул'ином.

Таким образом, выделенные ферменты по целому ряду признаков (связывание с ионообменником, молекулярная масса, используемые субстраты, доноры фосфата, ионная зависимость и г.д.) (Елизаров и соавт., 1990; Pinna, 1991) можЬо с полным основанием отнести к сАМР-независимым протеинкиназам NI и Nil казеинового типа (казеинкиназы NI и Nil).

Физиологическая роль некоторых протеинкиназ надежно установлена, тогда как функция других остается невыясненной. К последним как рал и относятся сАМР-независимые протеинкиназы: они представляют собой ферменты довольно хорошо изученные :п viiru (правда, jto не относится к протеинкиназам хроматина и казеинкиназам мозга) и обладающие непонятными функциями m vivo. В первую очередь, это касается бслкон-субс,гратов казоинкиназ (Bohmann, 1992; Jackson, 1992; Hunter, Karin 1992). Вместе с тем. при выяснении участия протеинкиназ в механизмах регуляции транскрипции при действии нейроактивных соединений этот вопрос является одним из наиболее значительных.

Характер действия этимизопу зависит от типа формента и поироды белка-субстрата. Препарат не игиял на акминоыьпротоинкии.оы NI при использовании

О 3 7 Б 5 -!Э М. М

09076643

-;д [к], м

Рис. 8 Влияние этимизола на фосфорилирование различных белков-

субстратов протеинкиназами N1 (А) и N11 (Б) (п-7)

1. казеин 2. НМС-белки 3 негистоновыэ белки, растворимые в

0,35 М N801 4. гистон Н1

По оси абсцисс - концентрация этимизола

в качестве субстрата казеина. фосфитина, гистона Н1, негистоновых белков группы НМв (они были выделены из ядер и идентифицированы) (рис.ВА).

Однако, при исследовании казеинкиназы N11 влияние этимизола носило избирательный характер. Так, препарат не действовал на уровень фосфорилирования казеина и гистона Н1. В то же время при использовании слабосвязанных негистоновых и НМЗ-белков зтимизол стимулировал фосфорилирование. При этом эффект проявлялся в диапазоне концентраций от 10"8-10"4М (рис.8Б).

Действие антифеинов может быть связано с изменением уровня фосфорилирования белков НМС 14 и НМв 17, так как НМв 1 и НМв 2, входящие с состав суммарной фракции, видимо, не фосфорилируются этими ферментами (РаМшо е! а1., 1985). Чтобы выяснить, какие из белков группы НМС являются акцепторами фосфата при действии этимизола на выделенную протеинкиназу МП был проведен электрофоретический анализ белков НМв, фосфорилированных этой формой фермента. При этом основной пик радиоактивности был обнаружен в области высокоподвижных белков с Мг 10 кДа (рис.ЭА). Полученные результаты согласуются с данными о стимуляции этимизолом процесса фосфорилирования белков хроматина нейронов за счет фракции, сходной с НМС 14/НМС 17.

Этот вывод нашел подтверждение и в последующих экспериментах, где изучалось влияние этимизола на фосфорилирование выделенных, очищенных и идентифицированных белков НМв 14 и НМС 17 протеинкиназой II хроматина нейронов. Этимизол оказывал стимулирующее действие на активность

протеинкиназы N11 при использовании в качестве субстрата белка HMG 14 и не не влиял на фосфорилирование HMG17 (рис.ЭБ).

Мг Х103 68

17,8 12,3

в 7 е Hgpq.M

Рис. 9 Роль отдельйых фракций HMG-белков в действии этимизола на сАМР-неэаоисимоа фосфорилирование хроматина нейронов А. Электрофоретическое разделение HMG-белков, фосфорилированных казеинкиназой N11

t. радиоактивность белковых компонентов 2. денситограмма

На верхней абсциссе величины Mr маркерных белков Б. Влияние этимизола на фосфорилирование HMG 14(1) и HMG17(2) протеинкиназой Nil хроматина нейронов • - р<0,05

Таким образом, этимизол не влияет на активность-лротоинкиназы NI и избирательно стимулирует фосфорилирование белка HMG 14 протеинкиназой Nil хроматина нейронов головного мозга крыс.

Полученные данные свидетельствуют об участии сАМР-независимой протеинкиназы N11 в регуляторном влиянии аитифеинов на функциональную активность хроматина нейронов. В таком случае изменения в структуре молекулы этимизола, значимые для его влияния на 1ранскрипционную активность и долговременную память, должны проявиться и в действии на этот фермент.

Для анализа были использованы деметилированные производные этилнорантифеина (М^, М2) с положительным влиянием на транскрипционную активность хроматина нейронов, аллилнорантифеин и пропилнорантифеин с отрицательным влиянием, а также деметилированный аллилнорантифиин - бет достоверного влияния на этот процесс.

Рис. 10 Влияние антифеинов на фосфорилирование HMG-белков протеинкиназами N1 (А) и N11 (Б) хроматина нейронов (п-7) 1. 2. М^ Э. этилнорантифеин 4. деметилированный

аллилнорантифеин 5. алллил- 6. пропилнорантифеин а. уровень протеинкиназы NI • - р<0,05

Ни одно из проверенных соединений не влияет на фосфорилирование

HMG-белков протеинкиназой NI (рис.1 OA). В то же время антифеины оказывают

модулирующее действие на активность протеинкиназы N11 (рис.1 ОБ). При этом

этимизол и его деметилированные производные М< и М, повышают уровень

8 6

фосфорилирования HMG-белков в концентрации 10 - Ю М. Деметилированный аллилнорантифеин не влияет на активность ПК Nil. Аллилнорантифеин и пропилнорантифеин, напротив, снижают активность фермента в том же диапазоне концентраций. Таким образом, эффекты зтимизола и его структурных аналогов на протеинкиназу Nil коррелируют с их действием на транскрипционную активность хроматина нейронов.

В этом плане следует обратить внимание еще на одно обстоятельство. Активность ПКаз N1 и N11 на всех стадиях выделения и очистки значительно выше в нейрональном хроматине по сравнению с глиальным. Тем не менее, этимизол стимулировал активность казеинкиназы N11 не только из хроматина нейронов, но и глии. Аллилнорантифеин, напротив, снижал уровень фосфорилирования HMG-белков этой формой протеинкиназы. Следовательно, отсутствие эффектов антифеинов на сАМР-независимое фосфорилирование хромосомальных белков глии не связано с особенностями протеинкиназ из двух типов клеток: выделенные ферменты реагируют одноналравпенно на присутствие антифеинов, независимо от своего происхождения. Видимо, количественное уменьшение содержания белков HMG, снижение активности сАМР-независимых протеинкиназ в глиальных

ядрах в сочетании с плотной упаковкой хроматина не позволяют реализоваться эффектам исследуемых веществ.

Поскольку характер действия антифеинов на выделенную протеинкиназу N11 зависел от исследуемого субстрата, то, вероятно, этм соединения изменяли свойства белка, повышая сродство к ферменту и увеличивая уровень их фосфорилирования. Однако, такое однозначное объяснение полученных результатов осложняется тем обстоятельством, что казеинкиназы N1 и N11, подобно другим типам протеинкиназ обладают способностью к автофосфорилированию. Поэтому для выяснения возможного механизма действия этимизола и его структурных аналогов на активность сАМР-независимых протеинкиназ N1 и N11, было изучено влияние этих веществ на процесс их автофосфорилирования.

У протеинкиназы N1 модификации подвергается ее единственная субъединица, которая по результатам проведенного нами электрофоретического анализа, имеет молекулярную массу 45 кДа. Это соответствует данным литературы, а также результатам, полученным в процессе очистки фермента методом гель-фильтрации. Этилнорантифеин и его структурные аналоги не влияют на автофосфорилирование протеинкиназы N1 в диапазоне концентраций от 10'7 - 10'® М, что свидетельствует о неспособности из ученных соединений взаимодействовать с ферментом этого типа.

В то же время автофосфорилирование протеинкиназы Nil достоверно усиливается в присутствии этилнорантифеина и его деметилированного аналога Мп- в концентрации 10"7, 10"6, 10"5 М на 58% <68%), 33% (54%) и 25% (35%) соответственно. Аллил- и пропилнорантифеин в этих же концентрациях снижают автофосфорилирование на 19% (16%), 24% (20%), 10% (5%).

В большинстве работ, посещенных изучению сАМР-независимых протеинкиназ II типа из различных тканей, авторы отмечают, что фермент состоит из 2-х субъединиц - 2а и 2ß (Pinna, 1991). Автофосфорилирдванию подвергается регулягорная р-субъединица с молекулярной массой 25 кДа. Чтобы определить, с какой субъединицей взаимодействуют антифеины, был проведен электрофоретический анализ ПК N11 после ее инкубации в соеде, содержащей

по С

[ Р]АТР и исследуемые соединения в концентрации 10" М. В отсутствие антифеинов на электрофореграмме был зарегистрирован только один максимум радиоактивности с молекулярной массой 25 кДа (рис.11,3), который в соответствии с данными литературы соответствует р-субъедимице фермента (Pinna, 1991). Анализ электрофореграммы фермента после а о инкубации с аллил-и пропилнорантифеином мзидегельствует о досюверном снижении автофосфорилирования р-субьединицы на 23% и 18% (по площади пика) по сравнению с контролем (рис 11, 4.5), Этимизол и М1 увеличивают автофосфорилирование р-субьединицы на 30-35% (рис.11,1 2)

M'XlO? 68 ¿^

Рис.11 Электрофоретический анализ протеинкиназы Nil хроматина нейронов после реакции автофосфорилирования в присутствии [33р]дтр На нижней оси абсцисс - длина геля (мм);

На верхней абсциссе - величины Mr стандартных белков (в кДа) 1.М1 2. этилнорантифеин 3. контроль 4. пропилнорантифеин 5. аллилнорантифеин

Кроме того, в их присутствии отмечено автофосфорилирование и «.-каталитической субъединицы - с молекулярной массой 43 кДа (рис.11,1,2). Этот факт вполне согласуется с данными Meggio el al. (1983) о том, что при определенных условиях (например, в присутствии поликатионов с гуанидиновыми группировками) автофосфорилированию может подвергаться а-субъединица казеинкимазы II из цитозоля печени, и это коррелирует с увеличением активности фермента.

Таким образом, этилнорантифеин и его структурные анапоги могут непосредственно взаимодействовать с протеинкиназой N1' хроматина, изменяя ее каталитическую активность в отношении пегие тоновых HMG-белков. Тем более, что ^4С-этимизол, как было установлено в настоящей работе, специфически связываете« с протеинкиназой N11 с Кд - 8 нмолей.

•На основании полученных якспериментальных данных можно представить следующую последовательность молекулярных событий, наблюдаемых при действии этимизола и его структурных аналоюв: сАМР-независимая ПК N11 ->. фосфорилирование негистоновых HMG белков --> РНК-синтсзирующал система -> синтез белка > модуляция долговременней памяти (рис.12).

УХУДШАЮТ ПАМЯТЬ

УЛЧШАЮТ ПАМЯТЬ

Рис. 12 Схема действия антифеинов

Антифеины быстро проникают в клетку и связываются с хроматином. Незначительные изменения в структуре молекулы антифеина сказываются на их противоположном влиянии на транскрипционную активность ядер гиппокмпа и нейронов коры головного мозга: положительный эффект обнаружен у зтилнорантифеина, М^, Мг; отрицательный - у аллил- и пропилнорантифеина. Выраженность стимулирующего эффекта зависит от конформационных перестроек в молекуле этимизола, связанных с процессом деметилирования метилкарбамоильных группировок. Это было отмечено как в отношении процесса дополнительного автофосфорилирования а-каталитической субъединицы только при действии зтилнорантифеина и его деметилированных производных, так и в отношении разнонаправленного влияния антифеинов на сАМР-независимое фосфорилирование негис тоновых белков НМб-группы протеинкиназой N11 хроматина нейронов. При этом изменение уровня фосфорилирования НМй 14 вносит, как было показано в настоящей работе, существенный вклад в процесс структурно-функциональных перестроек хроматина, связанных с активацией транскрипции.

Характер действия антифеинов на активность ПК N11 хроматина нейронов, но не глии, коррелирует с разнонаправленными эффектами этих соединений на последующие изменения РНК-синтезирующей системы нейрональных ядер и синтеза синалтосомальных белков. Это, в свою очередь, коррелирует с разнонаправленными эффектами антифеинов на процесс консолидации и хранения следа памяти. Чрезвычайно демонстративным в этом отношении

является то, что деметилированные производные этилнорантифеина • М^ и М2, обладая минимальными мембранными эффектами, низкой фармакологической активностью, но наиболее выраженным с эмулирующим влиянием в ряду антифеина на транскрипционную активность хроматина нейронов проявили наиболее выраженное положительное действие в отношении долговременной памяти. В то же время утяжеление радикала у ал лил- и пропилнорантифеина не только не усилило их влияния на ПК N1, РНК-синтвзирующую систему и долговременную память, но и привело к отрицательному эффекту.

Необходимо подчеркнуть: что п£>и воздействии веществ этого ряда происходят не только заметные изменения РНК-синтезирующей системы гиппокампа и нейронов коры мозга (60-180 мин), но именно в эти сроки наблюдается повышение синтеза синаптосомальных белков, процесса их фосфорилирования, а также активности протеинкиназы С. По современным представлениям о молекулярных механизмах памяти, указанные процессы могут, в конечном счете, могут приводить к изменению пороговых свойств нейронов и формированию функциональных клеточных ансамблей.

Иными словами, выявленная молекулярная мишень этимизола и его сгруктурных аналогов обнаружила определенные черты сходства с рецептором плазматической мембраны: помимо специфического связывания с лигандом она обеспечивает передачу сигнала, то есть запускает цепь биохимических событий, приводящих к эффективному разнонаправленному действию на процесс сохранения следа памяти.

Совокупность полученных в настоящей работе данных н§ позволяет объяснить эффекты антифеинов на функциональную активность хроматина с точки зрения представлений о пусковой роли мембранных рецепторов. Можно полагать, что их действие не определяется влиянием на систему рецептор-вторичный посредник, а может происходить по альтернативным путям, включая непосредственную регуляцию функциональной активности генетического аппарата. Существование различных путей функционального воздействия. на системы регуляции экспрессии генома (через систему вторичных посредников, прямое влияние), видимо, обеспечивает высочайшую лабильность генетических процессов и их высокую в ответ на внешние факторы. Таким образом, сама возможность интегративной деятельности мозга определяется не только высокой генетической активностью нервной клетки, но и многообразием систем принятия качественно новой информации, поступающей из внешнего мира.

Исследованные вещества обладают способностью облегчать не столько процесс формирования ьнграммы, сколько процесс консолидации, создавая максимальный эффект при однократном применении. Подобная уникальность позволяет предполагать действие антифеинов на наиболее важные нейрохимические события, лежащие в основе фиксации и сохранения навыка. 9

этом ипано более, чем привлекательным становится предположение, что изменение синтеза РНК при непосредственном взаимодейс1ии с хроматином нейроактквных веществ является молекулярным механизмом, в значительной степени, определяющим возможность устойчивого сохранения информации. В пользу этого т .идетельствуют не только представленные в настоящей работе данныет о молек.у пярных механизмах действия антифеинов, но и результаты об эффективном, прямом влиянии на РНК-синтезирующую систему нейронов кофеина, пирацетама, фрагментов АКТГ (ЯеюпагсИ, Кийкоуа, 199Э).

Сегодня уже стало привычным считать реальной возможность фармакологического воздействия на состояние транссиналтической регуляции биохимических спаем клетки введением агоиистов и антагонистов нейромедиаторов Однако, до сих пор не предпринимались попытки использовать возможность целенаправленного воздействия нейроактивных веществ на системы регуляции экспрессии тенома клеток головного мозга. Между тем, этот подход вполне заслуживает того, чтобы сга1ь объектом самого пристального внимания. Дальнейшие исследования, направленные на анализ механизмов прямого действия модуляторов долговременной памяти • представителей различных фармакологических групп ■ на функционалы(ую активность РНК-синтезирующей системы, являются весьма перспективными. Они имеют не только общебиологическое значение, формируя новые представления о путях передачи функционального сигнала как одной из фундаментальных проблем биохимии и физиологии, но также играют немаловажную роль в решении практических задач, создавая основу для целенаправленного изыскания эффективных фармакологических средств, позволяющих проводить коррекцию устойчивых патологических состояний.

ВЫВОДЫ

1 РНК-синтезирующая активность ядер нейронов головного мозга кгэыс увеличивается после окончания выработки условного рефлекса и зависимости от степени обученное.in. Установлена корреляция в разнонаправленном действии этилнорантифеина и его структурных аналогов на РНК-синтезирующую систему ядер гиппокампа и нейронов коры юловного мозга крыс с их влиянием на сохранение условных рефлексов иырабоi чнных в различных моделях обучения Подобной взаимосвязи между действием лих соединений на транскрипционную активность и процессы формирования навыка не обнаружено При действии антифеинов не происходит изменений РНК-синтезирующей системы глианьных клеток. Транскрипционная активность ядер клеток печени изменяется однонагтравленно: усиление эффектов происходит в следующем ряду

деметилированные производныь, этил-, алпип-, пропипнорантифемн.

2. Введение антифеинов с положительным влиянием на транскрипционную активность клеток головного мозга и сохранение условных рефлексов (эгилнорантифеина, Mj, М^) через 180 мин приводит к увеличению синтеза белков синаптических мембран. В эти сроки этимизол и его деметилированные производные повышают фосфорилирование отдельных фракций белков синаптических мембран и активность мембранносвязанной протеинкиназы С, что, может быть, связано с вторичными изменениями структурно-функционального состояния сииаптическиу мембран при действии антифеинов.

0. Установлено, ч о действие антифеинов на интегративные функции мозга не опосредовано аденоэиновыми рецепторами. В модельной системе, /де отчетливо проявляется действие згонистов и антагонистов аденозина, этимизол и его структурные аналоги не оказывают влияния на аденилатцикпазу, сопряженную с A.j - ингибирующим и Aj - активирующим рецепторами.

4. Разнонаправленное действие антифеинов на функциональную активность нейрональн» • - ядер не определяется мембранными рецепторами и системой вторичных посредников. Установлено отсутствие корреляции между влиянием этих соединений на транскрипционную активность хроматина нейронов с их действием на активноеib аденилатциклазы, ФДЭ cAMP, Са.Мд- , Са-АТРаз, Ne.K-АТРазы синаптических мембран, а также на уровень сАМР, диеновых, триеновых кснъюгатов и малоноаог о диальдегида.

5. В различные сроки введения 14С-этимизола его основными акцепторами являются поверхностные белки микросом и клетрчные ядра. Специфическое связывание меченого этимизола происходит только с хроматином, но не с синаптическими мембранами.

6. Установлена способность веществ, эффективно изменяющих долговременную память (антифеины, кофеин, пирацетам) модулировать фанскрипционную активность клеток головного мозга при их непосредственном взаимодействии с хроматином. Разнонаправленное влияние антифеинов на РНК-синтезирующую систему нейронов, но не глии сохраняется в опытах in vttro. Наибольший стимулирующий эффект в ряду антифеинов оказывают М^ М2. Эффекты антифеинов исчезают при экстракции слабосвязанных негистоновых белков. Антифеины оказывают прямое разнонаправленное действие на Са-АТРазную активность хроматина нейронов.

. 7. Антифеины оказывают избирательное разнонаправленное влияние на сАМР-независимое фосфорилирование негистоновых белков группы HMG хроматина нейронов, но не глии коры й гиппокампа головного мозга крыс. Это коррелирует с их действием на транскрипцию.

3. Из хроматина неироноа и г лии коры головного мозга крыс выделены две ' АМР-независимые протеинкиназы, которые идентифицированы как казеинкииазы

N1 и №. Установлено, что антифеины не влияют на активность протеинкиназы N1 и избирательно модулируют фосфорилирование HMG 14 протеинкиназой Nil хроматина нейронов и глии.

9. В присутствии зтимизола и его деметилированных производных, но не аллил- и пропилнорантифеина, значительно увеличивается автофосфоритфование сАМР-независимой протеинкиназы Nil. Лишь при стимулирующем действии зтимизола и его демотилиросанных производных М^ и М2 происходит фосфорилирование не только р-регуля торной, но и а-каталитической субъединицы протеинкиназы Nil.

10. Установлено, что функциональная регуляций транскрипции клеток головного мозга исследованными модуляторами долговременной памяти происходит при участии фосфорилированных форм негистоновых белков группы HMG. Деметилированные производные этилнорантифеина - вещества с минимальными мембранными эффектами обнаружили наиболее выраженное положительное влияние на сАМР-независимое фосфорилирование белка HMG 14 протеинкиназой NU. Утяжеление радикала у аллил- и пропилнорантифеина привело к отрицательному действию на этот процесс. Отмеченная структурно-функциональная связь также обнаружена при действии ангифемнов на транскрипционную активность хроматина нейронов и процесс консолидации следа памяти.

11. Весь комплекс полученных данных свидетельствует, что молекулярной мишенью действия антифеинов является сАМР-независимая протеинкиназа N11 хроматина нейронов. Можно полагать, что прямое действие антифеинов на этот фермент запускает цепь биохимических событий, прив дящих к эффективному разнонаправленному влиянию этих соединений на долговременную памшь.

12. Необходимым этапом в многокомпонентной системе нейрохимического обеспечения сохранения следа памяти _ является активация нейроактивными веществами системы регуляции транскрипции. Возможность прямого воздействия на генетический аппарат клеток головного мозга с помощью фармакологических веществ открывает новые пути в целенонаправленном изыскании эффективных иоотропных средств

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Разумовская Н.И. Функциональная активность ядер клеток головного мозга в условиях действия нейротропного препарата этимизола, повышающего эффективность памятиУДез.науч.сообш. 9 Всес.конфер.по биохимии нервной системы. - Ереван, 1983. - С.290-291.

2. Бородкин Ю.С., Белявцева Л.М., Куликова О.Г., Лосев НА., Матвеева И.М., Разумовская Н.И. Динамика распределения меченого этимизола в цитоструктурах головного мозгаУ/Бюлл.эксперим.биол.мед,-1983. - T.XCVl, N 10. - С.53-55.

3. Разумовская Н.И.. Белявцева Л.М., Куликова О.Г., Матвеева И.М. Регуляция синтеза РНК в клетках мозга при фармакологической коррекции его функционального состоянияУ/Тчз.докл.конф.европ.биохим,обществ. -1993. - С.190.

4. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Борисова Г.Ю., Разумовская Н.И. Новые данные о метаболических эффектах этимизола, стимулятора памятиУ/Нейрохимические механизмы регуляции памяти.:Тез.докл.Всес.симп. - Пущино, 1984. - С.9.

5. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Ефремова Л.С. Богданова НА., Разумовская Н.И. Динамика изменений синтеза РНК в клеточных ядрах головного мозга крыс под действием этимизолаУ/Нейрохимия.-1984. - Т.З, N 3. - С.329-332.

8. Разумовская Н.И., Лапина ИА., Белявцева Л.М., Куликова О.Г. и др Сопоставление сверхмедленной активности с изменениями функционального состояния цитоструктур неокортексаУ/Физиол.ж.СССР. -1984,- N 2. - С.125-128.

7. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Разумовская Н.И., Бородкин ЮС. Нейрохимические эффекты стимулятора памяти этимизолаУ/Принципы и механизмы деятельности мозга человека:Тездокл.1 Всес.конф.- Л., 1S85. - С,166.

8. Разумовская Н.И., Белявцева Л.М., Куликова О.Г. Использование этимизола в качестве фармакологического зонда при исследовании молекулярных основ памятиУ/Вестник АМН СССР. -1985, N 9. - С.44-50.

9. Куликова О.Г. Са-зависимая АТФаза клеточных ядер головного мозга. Эффекты этимизолаУ/Вестник АМН СССР. - 1985,- N 9. - С.61-54.

10. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Разумовская Н.И. Синтез РНК в клеточных ядрах различных отделов головного мозга крыс при действии этимизолаУ/Нейрохимия. -1985. - Т.4, N1. - С.3-9.

11. Белявцева Л.М., Куликова О Г., Разумовская Н.И. Действие стимулятора памяти этимизола на хроматин мозгаУ/Докл АН СССР. - 1985. - Т.283, N 2. - С.490-492.

12. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Александрова И.Я. Разумовская Н.И. Исследование молекулярных механизмов действия антифеинов на долговременную п амя тъУ/Актуа льные вопросы разработки, изучения и производства лекарственных средств. - Каунас, 1985. - С.242-244.

13. Белявцева Л.М., Борисова Г.Ю., Рейхэрдт Б А, Куликова О.Г. Исследование участия синтеза РНК е механизмах стимуляции этимизолом долговременной памятиУ/Актуальные вопросы фармакологии и токсикологии нейротропных средств. - Рига, 198S. - С.16-19.

14. Разумовская Н.И., Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Матвеева И.М. Исследование молекулярных основ памяти с использованием фармакологических зондовУ/Тез.докл.\/ Всес.Биохим.съезда.- М. -1986,Т.2.- С.456-457.

15. Лишневская Е.Б., Куликова О.Г., Разумовская Н.И. Действие антифеинов на систему циклического аденозинмонофосфата в структурах мозга крысУ/Нейрохимия. -1987. - Т.6, N 3. - С. 350-36G.

16. Куликова О Г., Богданова НА., Разумовская Н.И. Влияние антифеинов на фосфорилировэниебелковхроматинаУ/Нейрохимия. -1988. -Т.7, N2. -С.189-196

17. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Богданова НА., Разумовская Н.И. Регуляция синтеза РНК в клетках мозга и корреляция долговременной памяти производными кофеинаУ/Фундаментальные достижения нейрохимии - медицине:Тез.10-й Всес.конферен. - Горький, 1987. - С.21-22.

18. Бородкин Ю.С., Разумовская Н.И., Белявцева Л.М., Куликова О.Г. и др. Нейрохимические основы хранения долговременной памяти. Рассмотрение на примере антифеинаУ/Фармакология -клинике.-Л., 1988.-С.5-12.

19. Бородкин Ю.С., Белявцева Л.М., Борисова Г.Ю., Куликова О.Г., Разумовская Н.И. Сравнительное исследование роли синтеза РНК и с AMP в механизмах действия кофеина на долговременную памятьУ/Фармакология и научн.-техн.прогресс: Тез.докл.У1 Всес.съезда фармакологов. - Ташкент, 1988. - С 57.

20. BorodWn Yu.S., Razumovskaya N.I., Kulikova O.G., Belavtseva L.M. Neurochemical studies on antlfelnes: a group of nootropic drugs. //Ann.lnst.Super.SanHa. - 1988.- V.24, N3.-P.417-420.

21. Борисова Г.Ю., Белявцева Л.М., Александрова И.Я., Куликова О.Г. Сравнительное исследование нейрохимических и поведенческих эффектов деметилированного аналога этимизолаУ/Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных ■ и сердечно-сосудистых веществ.:Тез.докл.межреспубл.научно-практ.конф. - Волгоград,- 1989, С.73-74.

22. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Бородкин Ю.С. К вопросу об учас тии в процессе обучения прямой активации синтеза РНК нейроактивными веществамиУЯездокл.28 совещ.по проблемам ВНД.- Л., 1989. - С.63-64.

23. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Богданова НА. фосфорилирование ¡iMG-белков при изменении транскрипционной активности хроматина нейронов головного мозгаУ/Структура и функции клеточного ядра: Тез,10-го Всесоюзн.симпозиума. -Гродно, 1990.-С.142.

24. BorodWn Yu.S., Kulikova O.G. The molecular aspects of antifeines mnestic

erfectsj/The II Battle meeting on pharmacology and clinical pharmacology - Tallinn, 19Э0. -P.20.

25. Куликова О.Г., Белявцева Л.М. Исследование молекулярных механизмов мнестической деятельности мозга с использованием фармакологических гондовУ/Медицина и биология - сегодня и завтра: Тез.конфер., посвящ.ЮО-летию ИЭМ,-Л., 1990. - С.66-68.

26. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Богданова НА., Рейхардт БА. Исследование роли синаптичаских мембран в мнестической деятельности мозга с использованием фармакологических зондов.//Биофизика мембран: Тезщокл.Научн.конферен. - Каунас (Литва), 1990. - С.25.

27. Рейхардт БА., Куликова О.Г., Белявцева Л.М. Влияние антифеинов с различными мнестическими эффектами на фосфодиэстеразы сАМР, перекисное окисление липидов и синтез РНК в нейронах головного мозга крысУ/Бюлл.зксперим.биол.и медицины,-1991. - T.CXI, N 5. - С.483-485.

28. Богданова НА., Куликова О.Г. Выделение и исследование сАМР-независимых протеинкиназ хроматина клеток головного мозгам/Биохимия. - 1991. - Т.56, N 1. -С.41-48.

29. Богданова НА., Куликова О.Г. Действие антифеинов с различными мнестическими эффектами на сАМР-независимые протеинкиназы хроматина головного мозгаУ/Бюлл.эксперим.биол.мед. -1991. - T.CIX, N 2. - С.159-161.

30. Рейхардт БА., Куликова О.Г., Белявцева Л.М. Молекулярные механизмы антигипоксического действия этилнорантифеина и его деметилированных производи ыхУ/Фармакологическая коррекция гипоксических состояний: Тездокл.2 Всес.конферен. - Гродно, 1991. - С.186

31. Белявцева Л.М., Козлов C.B., Куликова О.Г., Суркова ЕА., Федорова НА. Влияние белков HMG и их фосфорилированных форм на процесс транскрипции в нейрональных ядрах головного мозга крыс (Данные иммунохимического анализа)У/Биохимия. -1992. - Т.57, вып.2. - С.214-218.

32. Богданова НА., Куликова О.Г. Влияние структурных аналогов этилнорантифеина на аутофосфорилирование сАМР-независимых протеинкиназ хроматина нейронов Y/Эксперим.и клинич.фармакол. -1992. - N 5. - С.19-21.

33. Рейхардт БА., Белявцева Л.М., Куликова О.Г. Участие синтеза белков цитоструктур головного мозга в действии антифеинов на долговременную памятьУ/Бюлл.эксперим.биол.и мед. - 1992. - T.CXJII, N 5. - С.506-508.

34. Рейхардт БА., Белявцева Л.М., Куликова О.Г. Деметилированные производные этилнорантифеина - эффективные мнемотропыУ/Нейрофармакология на рубеже 2-х тысячелегий:Тоз.Всес.конф.- С.П., 1992.- С.186.

35. Куликова О.Г., Белявцева Л.М., Рейхардт БА. Нейрохимический анализ ноотропов: проблемы и перспективы. //Нейрофармакология на рубеже 2-х гысячелегий:Тез.Всес.конф,- С.П., 1992.- С.117.

36. КуликоваО.Г., Белявцева Л.М., Рейхардт Б.А., Борисова Г.Ю., Александрова И.Я Бородкин Ю.С. Участие синтеза РНК в процессе выработки и сохранения условных рефлексов (исследование с использованием антифеинов)У/Ж.высш.н.деят,- 19Э2. -Т.42. -0.687-691.

37. Куликоза О.Г., Белявцева Л.М., Рейхардт БА., Бородкин Ю.С. Современные аспекты поиска новых эффективных ноотропных средств: проблемы и перспективыУ/Вестник АМН. -1992. вып.8. - С.56-60.

38. Kulikova O.G., Beliavtseva L.M., Reichardt В A., Sapronov N.S. About molecular mechanisms of cognitive function modulators./A-leuroendocrinology. Letters - 1993. - P. 318.

39. Reichardt BA, Sapronov N.S., Kulikova O.G., Beliavtseva L.M. The role of pituitary-adrenal system In mnestic effects of some nootropic drugsY/Meuroendocrinology. Letters -1993,-P. 342.

40. Reichardt BA., Kulikova O.G., Beliavtseva L.M., Sapronov N.S. Brain RNA synthesis .the new possibility for nootropic drugs search.//Neuropsychopharmaco|ogy. - 1993. - V.9, N2S.-P.177.

41. Kulikova O.G., Beliavtseva L.M., Reichardt В A., Sapronov N.S. Nuclear receptors for neuroactive drugs. Role in memory storage modulation. //Neuropsychopharmacology. -1993, - V.9j N 2S. - P.178-179.

42. Куликова О.Г., Богданова НА. Фосфорилирование белков HMG при изменении транскрипционной активности нейрональных и глиальных ядер головного мозга крысу/Биохимия. -1993. - Т.58, вып.7. - С.Ю47-1052.

43. Kulikova O.G., Reichardt BA., Sapronov N.S.. The study of brain function with new type of neurotropic drugsy/lnlernational Pharm Connections, Neva Perss, Ins. -1994. - V.1, N 1. -P.8.

44. Рейхардт БА- Куликова О.Г.. К вопросу об участии рецепторов аденозина в рефляции антифеинами функциональной активности хроматина нейроновУ/Биохимия. -1994 - Т.59, вып.9. - С. 1153-1158.

45. Kulikova O.G., Reichardt BA, Sapronov N.S .The different mechanisms of chromatin phosphorylation In neurons and glia during memory modulationy/10 ESN Meeting. -Jerusalem, Israel, 1994. - No 159.

46. Kulikova O.G., Reichardt В A., Sapronov N.S . Hormone like action of some exogenous memory siimulantsy/Proc. Intern. Soc. of Psychoendocrinoiogy: 25th Congress, Seattle, USA-1994-P.135.

Информация о работе

Куликова, Ольга Григорьевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1994
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярные механизмы мнестических эффектов антифеинов ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы мнестических эффектов антифеинов"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы мнестических эффектов антифеинов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия