Биосинтез тирозингидроксилазы и механизмы его регулирования в клетках головного мозга крыс под действием ладастена

Садовников, Сергей Валентинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез тирозингидроксилазы и механизмы его регулирования в клетках головного мозга крыс под действием ладастена
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез тирозингидроксилазы и механизмы его регулирования в клетках головного мозга крыс под действием ладастена"

На правах рукописи

САДОВНИКОВ СЕРГЕИ ВАЛЕНТИНОВИЧ

БИОСИНТЕЗ ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РЕГУЛИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАДАСТЕНА

03 00 04 - биохимия 14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ииа!Б17Э7

Уфа-2007

003161797

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научные руководители

кандидат биологических наук, Вахитова Юлия Венеровна доктор медицинских наук, Вальдман Елена Артуровна

Официальные оппоненты* доктор медицинских наук, профессор

Островская Рита Ушеровна доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна

Ведущая организация Институт биохимии им АН Баха РАН

Защита диссертации состоится " ^Ч " ноября 2007г в ДО) часов на заседании Диссертационного совета КМ 002 133 01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, по адресу 450054, Уфа, Проспект Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан " октября 2007 г

Ученый секретарь ' ®ик®Улатова ^ ^

Регионального диссертационного совета, к б н ;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В современной клинической практике широко используется ряд адамантан-содержащих лекарственных препаратов, обладающих противопаркинсонической (амантадин, мемантин) [ЗсИаууаЬ е1 а1, 1969, ЯаЬеу й а1, 1992], противовирусной (ремантадин, адапромин) [Першин и соавт, 1973, Букринская, 1988], ноотропной (адафеноксат) [РеИшу е! а1, 1988], иммуностимулирующей (кемантан) [Арцимович и соавт, 1990], миорелаксантной (диадоний) [Харкевич и соавт, 1974], противоопухолевой (ДАМП) [Но е1 а1, 1972] активностью Однако, у многих производных адамантана, помимо основных эффектов, обнаружены нейропсихотропные свойства активирующего типа, обусловленные, как полагают, специфическим дофамин- и серотонинпозитивным действием, а также тропностыо к рецепторам возбуждающих аминокислот [Морозов и др, 2001] Эти вещества обладают низкой токсичностью, не вызывают эйфории, толерантности и зависимости [Вальдман и соавт , 1976] Еще одним общим свойством этих соединений является их высокая мембранотропность, связанная с липофильностью адамантанового ядра, и в значительной степени определяющая особенности фармакокинетики и фармакодинамики адамантановых производных [Ковалев, 1977] В ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН на протяжении ряда лет проводился целенаправленный поиск новых эффективных средств психоактивирующего действия на основе производных адамантана [Морозов и соавт , 1999] В результате скрининговых исследований по анализу совокупности фармакологических свойств и выраженности психоактивирующих эффектов было отобрано соединение АДК-709 - №(пара-бромфенил)амин После обнаружения в спектре действия препарата анксиолитических свойств соединение получило название ладастен [Середенин и соавт, 2001] К настоящему времени фармакологическая активность ладастена и некоторые аспекты механизмов его действия достаточно подробно изучены и охарактеризованы Это позволило рекомендовать препарат для клинических исследований в качестве антиастенического средства при психогенных астенических расстройствах [Сюняков и соавт , 2006]

структурные аналоги фенилалкиламинов, сиднониминов, а также антигипоксанты, транквилизаторы, ноотропы, адаптогены и вещества метаболического типа действия [Бобков и соавт , 1984] В то же время, экспериментальные психофармакологические исследования позволили выявить целый ряд преимуществ ладастена перед классическими психостимуляторами Следует отметить, что в доступной нам литературе данные о лекарственных веществах — производных аминоадамантана - с подобным спектром действия не обнаружены, что определяет необходимость изучения механизмов действия ладастена Поскольку ранее использованные нейрохимические методы не позволяли придти к заключениям о том, как реализуются его эффекты, главным образом психостимулирующие, в настоящей работе в качестве концептуального избран подход оценки динамики функционального состояния потенциальной фармакологической мишени ладастена - ключевого фермента биосинтеза катехоламинов — тирозингидроксилазы Подробное изучение нейрохимического профиля ладастена, механизмов ei о дофаминпозитивного действия в процессе реализации эффектов препарата позволяет углубить представления о фармакологических мишенях ладастена и открывает перспективы создания на его основе новых, более эффективных препаратов

Цель исследования Выявление основных механизмов регуляции биосинтеза ключевого фермента синтеза катехоламинов тирозингидроксилазы (ТГ) в клетках различных структур головного мозга крыс при однократном введении ладастена Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо были поставлены следующие задачи

- исследовать влияние однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivo) на уровень L-ДОФА и дофамина в различных структурах мозга крыс,

- изучить динамику экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы, а также уровня фермента, фосфорилированного по Ser40 (pTr-Ser40) в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме, и гиппокампе головного мозга крыс в зависимости от продолжительности действия препарата (50 мг/кг, т vivo),

- изучить действие однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivo) на характер метилирования CpG-динуклеотидов промоторной области гена тирозингидроксилазы, экспрессируюшегося в гипоталамусе крыс,

-исследовать эффект ладастена (однократно, 50 мг/кг, in vivó) на динамику уровня гистондеацетилазы 1 (HDAC1), а также содержание ацетилированных форм НЗ и Н4 гистонов (ацетил-НЗ, ацетил-Н4) в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс Научная новизна. Впервые показано, что ладастен при однократном внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг увеличивает экспрессию гена тирозингидроксилазы и содержание соответствующего белка, коррелирующее с накоплением продуктов реакции — L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе, гиппокампе и вентральной области покрышки экспериментальных животных Синтез de novo данного катехоламина под действием ладастена рассматривается в качестве основного механизма, определяющего особенности психоактивирующего действия препарата Впервые показано, что изменение транскрипционной активности гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса крыс под действием ладастена может быть связано с изменением характера метилирования CpG-динуклеотидов в промоторной его области выявлено увеличение частоты деметилирования CpG-динуклеотидов в последовательностях, ассоциированных с сайтами связывания отдельных транскрипционных факторов Установлено, что ладастен снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе крыс, а также влияет на содержание ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в различных структурах мозга крыс Научно-практическая значимость Установленные геномные и внутриклеточные механизмы действия ладастена подтверждают данные о спектрах фармакологической активности препарата, что определяет целесообразность его использования в клинике при необходимости коррекции ряда состояний Полученные данные учтены при составлении инструкции по применению ладастена в качестве антиастенического средства

Внедрение результатов исследования в практику Методические подходы, использованные в данной работе, могут найти применение на этапах доклинического исследования потенциальных лекарственных препаратов с целью уточнения спектра действия и анализа механизмов их активностей Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций студентам на кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета

Основные положения, выносимые на защиту Предметом защиты данной работы являются следующие основные результаты исследований

- одним из механизмов, обеспечивающим особенности психоактивирующего действия ладастена является усиление экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы и биосинтеза дофамина в отдельных структурах мозга крыс,

- в регуляцию транскрипционной активности данного гена вовлекаются эпигенетические механизмы, что проявляется в увеличении частоты деметапирования цитозинов в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов в промоторной области гена тирозингидроксилазы,

- ладастен ингибирует активность гистондеацетилазы 1 и влияет на содержание ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4

Конкурсная поддержка работы Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (10002-251/П-10/142-448/260503-196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ - 2217 2003 4), РФФИ - Агидель (02-0497904), Программы целевых расходов Президиума РАН "Поддержка молодых ученых" (10324-812)

Апробация работы Основные результаты работы были представлены на У-м Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006), Научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону , 2006), 1П Съезде Фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007) Работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии и генетики (протокол № 14 от 2 октября 2007 г ) Публикации По теме диссертации опубликовано 5 работ

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 143 страницах, содержит 3 таблицы и 20 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3 и 4), заключения, выводов и списка литературы, включающего 202 источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180250 г и 25-ти дневных крысах-самцах линии Вистар Во всех опытах использовали две группы животных - контрольную и опытную - по 5-12 крыс в каждой Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде суспензии ладастен, с добавлением Г ween 80, контрольным живогаым - физиологический раствор с добавлением Tween 80 Дозы ладастен (опытно-технологический отдел ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН) 50 мг/кг Все манипуляции с животными проводили в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных живошых" (1977) Декапитацию крыс проводили после однократного введения препаратов через 15 мин, 0 5 ч, 1 ч, 1 5 ч, 2 ч, 2 5 ч Сразу после декапитации извлекали головной мозг, и в зависимости от целей исследования использовали в экспериментах либо целый головной мозг, либо выделяли структуры головного мозга (стриатум, гипоталамус, гиппокамп, вентральную область покрышки, прилежащее ядро) (Glowmski и Iversen, 1966) Гкани замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С

Суммарные препараты ДНК из структур головного мозга получали с использованием стандартной методики, включающей в себя инкубацию с протеиназой К и последующей фенольно-хлороформной очисткой (Sambrook et al, 2001) Бисульфитуio модификацию ДНК проводили по методу Olek et al (1996) Полимерашую цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартному протоколу с использованием Taq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas, США) Модифицированные бисульфитом натрия образцы ДНК амплифицировали с двумя парами праймеров (методом ПЦР) Подбор праймеров к исследуемому фрагменту гена тирозингидроксилазы осуществляли с помощью программы MethPnmer v 1 1 b (последовательное™ AF069036 EMBL, Х04914 GenBank) Аналитический и препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях, элюцию ДНК из агарозных гелей, подготовку компетентных клеток и их трансформацию проводили в соответствии с (Sambrook et al, 2001) Клонирование элюированных из геля продуктов ПЦР проводили с помощью набора "pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems" (Promega, США) по методике фирмы - изготовителя Выделение и

очистку плазмидной ДНК осуществляли "Wizard® Plus Mimpreps DNA Purification System"(Promega, США) Реакцию автоматического прямого секвенирования

проводили на приборе ABI Prism 310 с использованием набора "BigDye™ Terminator v3 0 Cycle Sequencing Ready Reaction" (Applied Biosystems, Великобритания) по протоколам производителя Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3 01 Очистку продукта ПЦР для секвенирования проводили согласно протоколу "Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США)

Суммарную РНК выделяли с использованием "TRIzol Reagent" (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя Примеси ДНК удаляли с помощью ДНКазы I (Promega, США) с последующей очисткой смесью фенол-хлороформ Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием oligo(dT)i2-i8-npaHMepa (Invitrogene, США) и обратной транскриптазы M-MuLV (MBI Fermentas, США) в термоциклере „Терцик" ("ДНК-Технология", Россия)

Анализ экспрессии гена тирозингидроксилазы проводили методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе "îCycler iQ™ RealTime PCR Detection System" (BioRad, CHIA) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I и программного обеспечения "lCycler iQ Real-Time Detection System software" версия 3 0 6070 (BioRad, США) Праймеры к нуклеотидным последовательностям анализируемого гена подбирали с помощью программы Primer 3 (www_genome wi mit edu/cgi bin/pnmer/primer3www cgi) с последующим анализом в программах "DNAStar" ("LaserGene") и OLIGO 6 0 Изменения в уровнях экспрессии гена ТГ рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы REST Tool VI 9 9 (Corbertt Research, США), обладающей возможностью статистической обработки данных (Pfaffl et al, 2002)

Выделение цитоплазматических и гистоновых белков проводили по методам, описанным в (Hjelmand, 1990) Концентрацию белков оценивали спектрофотометрически (спектрофотометр "SmartSpec™ Plus", BioRad, США) по методу Bradford (1976), используя бычий сывороточный альбумин V в качестве стандарта

Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ) с 0 1%-ным SDS с линейным градиентом

акриламида (6-15%) Количественную оценку оптической плотности полос на радиоавтографах осуществляли с помощью программы TotalLab 2 О (США) Эксперименты проводили в трех биологических повторностях от 2-х до 9 раз Процедуру иммуноблотганга (оборудование производства BioRad, США) и гибридизацию с

антителами к ТГ, plT-Ser40, HDAC1, АсНЗ, АсН4 (антитела фирм Biosource, Cell Signaling, США) проводили в соответствии с протоколами, рекомендованными производителями

Содержание дофамина и L-ДОФА в гипоталамусе, стриатуме и гиппокампе головного мозга крыс анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ- детекцией

Ста гистическая оценка результатов Результаты обрабатывались с помощью программ Statsoft Staüstica 6 0 (Microsoft Corp , США), REST Tool VI 9 9 (Corbertt Research, США), BiQ_Analyser (ht'p //hq-an tl\ sei bioaii nipi-ml mpj ie/), BioEdit V 5 0 9 (CIIIA) Достоверности различий групповых средних оценивались с помощью дисперсионного анализа На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Краткая характеристика изучаемого препарата Бромпроизводное 2-аминоадамантана ладастен (М-(2-адамантил) N-парабромфениламин), синтезированный и фармакологически изученный в ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН, разработан в качестве лекарственного средства, обладающего психостимулирующими, селективными анксиолитическими и иммунотропными свойствами (Морозов и соавг, 1993, Середенип и соавт , 2001, Яркова и соавт , 2001) Препарат обладает также антиоксидантной, детоксицирующей активностью, повышает резистентность opi анизма к действию различных экстремальных факторов Физико-химические особенности молекулы ладастена, в частности, липофильность, определяют фармакокинетические свойства препарата, а именно, способность интенсивно и быстро распределяться в органы и ткани экспериментальных животных и человека, а также проникать через гематоэнцефалический барьер Показано, что

уже через 10 мин после однократного per os введения (100 мг/кг, 2% ПЭГ-400) препарат обнаруживается в мозге крыс, а максимальный уровень препарата регистрируется через 60 мин (Сергеева, Красных, 1994) Как показывают проведенные ранее психофармакологические, нейрохимические,

электрофизиологические исследования, нейротропные эффекты ладастена обусловлены сложным модулирующим влиянием на центральные дофамин-, серотонин- и ГАМКергические системы мозга (Морозов и соавт, 2001), однако, механизмы формирования и реализации комплекса психотропных активностей препарата остаются во многом неясными В связи с этим в настоящей работе основное внимание было уделено изучению молекулярных механизмов, определяющих и обосновывающих психостимулирующие свойства ладастена

2 Экспрессия гена тирозингидроксилазы в разных структурах головного мозга крыс под действием ладастена и механизмы его регуляции Как уже отмечалось выше, ладастен, наряду с другими веществами, проявляющими психостимулирующую активность, обладает способностью увеличивать содержание нейромедиаторов - дофамина (ДА) и серотонина преимущественно в лимбических структурах мозга (во фронтальной коре, шппокампе, гипоталамусе), стимулировать высвобождение дофамина из пресинаптических термин алей стриатума (Кудрин и соавт, 1995, Грехова и соавт, 1995) и ингибировать обратный захват дофамина, норадреналина и серотонина изолированными синаптосомами головного мозга крыс (Морозов и соавт, 1999) Предположения о способности ладастена активировать биосинтез нейромедиатора подтвердились в экспериментах с блокадой ДОФА-декарбоксилазы специфическим ингибитором 3-оксибензгидразином Было установлено, что ладастен в условиях ингибирования ДОФА-декарбоксилазы способствует накоплению в стриатуме и фронтальной коре L-ДОФА, что может быть следствием прямого влияния препарата на биосинтез и/или активность тирозингидроксилазы в клетках мозга (Lapa et al, 2005)

2 1 Влияние ладастена на экспрессию гена и белка тирозингидроксилазы и содержание дофамина в различных структурах головного мозга крыс Как известно, в вентральной области покрышки сконцентрированы тела дофаминергических нейронов, дающих проекции в вентральный стриатум, в том числе в прилежащее ядро, гиппокамп, лобную кору, шпоталамус, миндалину и

другие структуры лимбической системы мозга. Это определяет широкие функции мезопимбияеекой системы - участие в механизмах формирования памяти, эмоций, обучения, нейроэндокринной регуляции. Кроме того, ДА нейроны ме.золимбичсской системы мозга являются нейрохимическим субстратом подкрепления и ''награды", а также вовлекаются в механизмы действия многих йсихосткмупирующих веществ и определяют их аддиктивный потенциал (Robinson et al., 1993; Di Cluava. 1995). Принимая во внимание данные псих о (фармакологических и нейрохимических исследований лада ctcl га нами был проанализирован ряд параметров, характеризующих динамику состояния системы биосинтеза катехоламинов при однократном введении препарат я, а именно - содержание L-ДОФА и дофамина, оценка -экспрессии гена и бедка тирозингидроксилазы (ТГ) в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, отриатумс, и гиш'юкамгге крыс.

Наши исследования выявили определенную специфичность влияния ладастена на динамику жспрсссии гена и белка ТГ, а также накопление L-ДОФА и ДА в зависимости от отдела мозга. Так, однократное введение ладастена вызываем быстрое (уже через 30 мин) увеличение уровня мРПК гена IT в вентральной области покрышки.

Рис. 1. Влияние ладастена на уровей, экспрессии мРНК гена тирозингидроксилазы в

нейтральной области покрышки. Уронеш.. мРПК гена ТГ показан относительно уровня мРНЕС гена «домашнего хозяйства» РОК.

Как видно иъ ^ис,!*; максимальный уровень мРНК гена ТГ отмечается через 1.5. ч после введения препарата. Обращает ли себя внимание, быстрота и длительности ответа данного гена на воздействие ладастена, что, вероятно, свидетельствует об индукции de novo транскрипции гена ТГ в данной структуре мозга. Содержание L-ДОФА и ДА изучали и прилежащем ядре, где локализованы терминала ДА-с о держащих нейронов, проецирующихся из вентральной области покрышки Данные, нредставленЕШе на рис 2 показывают, что уровень дофамина в этой структуре

увеличивается уже через 1 ч после введения ладастена и достигает максимальных значений через 2 ч. Иная динамика накопления отмечена для 1,-ДОФА: через 2 ч после введения препарата наблюдается значительное возрастание уровня Г-ДОФЛ, сохраняющееся па высоком уровне и через 2.5 ч.

Таким образом, ладастсн при однократном введении увеличивает уровень мРНК ТГ в вентральной области жжрштгки. и это коррелирует с динамикой накопления L-ДОФА и ДА в прилежащем ядре и максимумом проявлении поведенческих эффектов ладастена. Отменим, что способность ладастена оказывать позитивное влияние на ДА нейроггередачу именно в вентральной области покрышки -прилежащем ядре подтверждает наличие выраженных >icихостиму!iир)'ющнх свойств Препарата. В то же время, способность индуцировать de novo биосинтез Катсхо л аминов, детектируемый по накоплению L-ДОФА, определяет "ненстощагощ и й: тип действия ладастена, выгодно отличающий препарат от "классических" психостимуляторов.

Как показывают результаты наших исследовании, однократное введение Ладастена сопровождается изменениями уровня L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе (рис. За). Как видно из рис. 36 в клетках гипоталамуса индуцируемые ладастепом Изменения уровня мРНК гена и белка IT имеют линейный характер, достигая максимума к 2 ч после однократного воздействия препарата, и коррелируют с содержанием продукта реакции - L-ДОФА. Увеличение уровня Ser40-TT л гипоталамусе происходит через ] ч после введения препарата, а макм&мальное значение данного показателя отмечено через 2 ч. Данные, представ ленные на рис. 3, свидетельствуют о влиянии ладастена не только па de novo синтез ТГ, но и на

ПДИ ■ LftOK

Рис. 2. Влияние ж а даетеj га на содержание ДА и L-ДОФА в прилежащем ядре.

активность фермента, следствием чего является увеличение уровня L- ДОФА и дофамина в этой структуре в сопоставимых временных интервалах.

Как известно, отдельные популяции ДА-садержащих Нейронов гипоталамуса опосредуют центральную регуляцию поведенческих и эндокринных функций за счет ко-локали'йЩйи с клерками, продуциру ющими нейрорегуляторные пептиды (Maui'er el al. 1997). Таким образом, активация ладаетеном синтеза дофамина в гипоталамусе, выполняющего роль нейромедиатора, нсЦромодуляторй: и пейрогормона в этой структуре, может, по крайней мере, частично, обуславливать опосредованную ДА-нейронами регуляцию нейрозндокршшых функций и, как- следствие, реалшацшо стресспротекторных, метаболических, и м м у но моду лиру юп (их эффектов препарата.

жл

550

5 1W I II

al б)

Рис 3. Влияние ладастспа на содержание в гипоталамусе крыс: а) 1,-ДОФА и дофамина, б) па экспрессию гена и уровень белка тирозипшдроксилазы и pTT-Scr40. ВБ - вестерн-б лот, 1 -контроль, 2-онъп

В стриатуме через 0.5 ч после воздействия уровень ДА и в большей степени L-ДОФА значительно снижается (рис. 4а). Однако, к 2 - 2.5 ч содержание Т-ДОФА увеличивается почти в дна раза. Влияние ладастспа на экспрессию гена и белка Tí' в стриатуме представлено ría рис. 46. Через 0.5 ч уровень мР1 ПС гена ТГ значитагыю ингибирован (20%) и сохраняется приблизительно па том же уровне до 1,5 ч наблюдений (33% от уровня контрольных значений). Интересно, та в стриатуме ладастен во всех исследованных, промежутках времетги не оказывает влияния ira содержание белка ТГ. тогда как незначительное повышение уровня Scr40-TF происходит через 0.5 ч после введения препарата, a s период между 1-1.5 ч наблюдаем снижение уровня Зег40-ТГ.

lit

Е *

11Л

Ранее было покатую, что ладастен длительно стимулирует высвобождения ДА из дорсального стриатума крыс (1 рехова и соавт., 1995). Подобный эффект является характерным для психостимуляторов типа кокаина, амфетамина и ряда его Проюв одных, вызывающих усиление высвобождения ДА в етриатуме, скщрошждающееся истощением внутриклеточного пула псйро медиатора (ЗЬЫшЬ й а!., 1997). Способность ладаетена стимулировать, накопление 1,-ДОФА в етриатуме и других исследованных структурах мозга крыс может свидетельствовать и пользу потенциальной против опаркш к о I шчео кой активности препарата, направленной на основное патогенетическое звено паркинсонизма.

¿¡Г,|

ймРНК

ТН ГрТН

а) б)

Рис. 4. Влияние ладастспа на содержание в етриатуме крыс: а) Ь-ДОФА и дофамина, б) на экспрессию гена и уровень балка тирозипгидроксилазы и рТГ-5ег40 ЦБ — вестерньблоч, 1-котроль. 2-опъп.

Как следует из рис. 5а, в гиппокампе содержание и Ь-ДОФА и ДА через 1.5 ч после введения ладаетена увеличивается почт в 3 раза, и практически не изменяется во всех остальных исследованных временных промежутках. Как следует из рис. 56, Существенных изменений уровня мРНК ТГ в данной структуре под действием ладаетена не выявляется: во всех исследованных временных интервалах данный показатель находится па уровне контрольных значений. Что касается влияния препарата на изменение содержания белка ТГ в гиппокампе. то, небольшое повышение дашюго показателя отмечается через 0.5 ч, и более значительное - через 1.5 ч после введения ладаетена. Влияние ладаетена на уровень 8ег40-ТГ в гиппокампе отражено на рис. 46, из которого следует, что незначительное увеличение уровня йсг40-ТГ происходит через 0.5 ч после введения препарата, оставаясь на уровне значений контроля во всех остальных временных интервалах

Увеличение уровня L-ДОФА и /(А п этой структур представляется интересным, поскольку известно, что дофа минергически е нейроны шщокамта вовлекаются в процессы консолидации намят, что про демо hci pvipoLiai i о многими исследователя ми на in vivo и in vitro моделях долговременной нотенциации (Т'геу ct al., 1990, 1991).

0,5 1,6 15

к pe мл. чао

а) б)

Рис. 5. Влияние ладастена на содержание и гиппокампе крыс а) L-ДОФА и дофамина, б) па экспрессию гена и уровень белка шрозкнги дрокемjиты и pTT-Ser4Q. ВБ -вестерн-бл от, 1 -ко шро л г,. 2-опыт,

3. Влияние ладастена на характер метилирования остатков цитозина в Промотор ной области гена тирозин гидр оксида зы в клетках гипоталамуса головного мозга кpF.»iс. Несмотря на то, что к настоящему времени механизмы ткапеспецифической регуляции экспрессии гена ТГ достаточна полно и подробно исследованы, немногое известно о роли эпигенетических механизму в регуляции экспрессии данного гена. В качестве одного из возможных механизмов, обуславливающих изменение транскриптшm шой активности гена ТГ под действием исследуемого нами препарата, мы предположили возможность его влияния на характер метилирования цитозина л СрП-динуклеотидах в про моторной его области. Анализ эффектов ладастена (однократное виутрнжелудочное введение, дскапитания через 1 5 ч) па характер метилирования цитозшгов в 5 -фланкирующей области гена ТГ, э кс прсс сиру тощего с я в клетках гипоталамуса, проводили методом биеульфшпого сскиенировгшия. Этот метод позволяет определять статус метилирования всех CpCi-дииуклеогидов в исследуемом фрагменте ЩЕК.

I íoлученные наш данные свидетельствуют о том, что ладастен при однократном введении экспериментальным животным вызывает изменение характера

метилирования СpG-динуклеоти дол, локализованных в 5'-фланкирующей области гена ТГ в клетках гииоттамуса головного мозга крыс. Оно проявляется в увеличении чистоты деметилировaiшя остатков питолща в последовательностях, расположенных непосредственно в сайгах связывания транскрипционных факторов АР-2 (в позиции -218), Egr-1/Sp-I (-117), CRE-1 (-43), CRE-2 (-95) или в непосредственной близости от них - АР-2 (-228, -225), НЕРТ (-156, -143, -140), Jigr-1/Sp-l (-134), AP-1-CRE-1 enhancer element (-19, -8) (рис. 6). Как показывают результаты наших исследований, л опытном варианте частота метилирования цитозиыа в позиции -43 CRE-1-элемента снижена почти в 2 раза по сравнению с контролем, тогда как остаток цитозипа в позиции -95, расположенный в сайте CRE-2, деметилировап ъ меньшей степйш. Можно предположить, что наблюдаемое нами усиление транскрипционной активности гена ТГ в клетках гипоталамуса* по крайней мере, частично ассоциировано с процессами метилирования/де.чегшi ирования цнго-чинов CRE-1 юследоиательноста промоторпой области данного гена. Нами также установлено, что ладастен индуцирует деметаигиропаиие датозина в положении -218, локализовашюго непосредственно в последовательности АР-2. и 2-х цитвдинов в позициях -228 и -225, прилегающих к сайту связывания данного транскрипционного фактора.

Рис. 6. Диаграмма частоты метилирования 376 п.о. 5'фланкирующего региона Гена тирозингидроксилазы(-292 - +84) гипоталамуса мозга крыс. Данные представлены в виде средней частоты метилирования каждого СрО-динуклеотида ± стандарт гш ошибка. Звездочками отмечены достоверные различия. До ею верность рассчитывали с помощью точного двустороннего критерия Фишера (р<0,05).

Таким образом, полученный нами экспериментальный материал, в совокупности с известными литературными данными, позволяет предположить, что усиление активности транскрипции гена ТГ в клетках гипоталамуса головного мозга крыс при введении ладастена может быть связано с избирательным деметилированием цитозина в CpG-динуклеотидах в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов или в прилегающих к ним последовательностях

4. Влияние ладастена на уровень гистондеацетилаз в различных структурах мозга крыс Как известно, с метилированными цитозинами в составе CG-динуклеотидов взаимодействует ряд метил-связывающих белков, например, МеСР2, MBD1, которые мобилизуют белковые комплексы, способные ковалентно модифицировать гистоны (гистонацетилазы/гистондеацетилы, HAT/HDAC), и ферменты ремоделинга хроматина (например, семейства SWI/SNF), изменяющие структуру нуклеосом (Fischle et al, 2003) Согласно существующим представлениям, биохимическая модификация гистонов и локальный ремоделинг хроматина являются важными факторами, модулирующими экспрессию генов, в частности путем регуляции доступности транскрипционных факторов (Felsenfeld et al, 2003) HDAC осуществляют деацетилирование гистонов НЗ и Н4 по остаткам лизина, и эта модификация сопряжена с ингибированием транскрипции определенных генов Не так давно стали появляться сведения, указывающие на то, что некоторые психотропные средства (кокаин, вальпроевая кислота, антидепрессанты) обладают способностью модифицировать гистоны в области промоторов генов-мишеней (Kumar et al, 2005, Newton and Duman, 2006)

Нами исследовано однократное влияние ладастена на динамику уровня HDAC1, содержание ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в гипоталамусе, гиппокампе и стриатуме крыс

Как видно из рис 7, уровень HDAC1 в стриатуме начинает снижаться уже через 15 мин после введения ладастена, а к 1 ч уровень фермента составляет 65% от показателей контроля Уровень ацетилированных гистонов НЗ также снижается почти наполовину через 1 ч и менее значимо через 2 ч после введения ладастена, тогда как уровень ацетилированных гистонов Н4 незначительно уменьшается через 1 и 2 ч (рис 8) Обращает на себя внимание несовпадение уровней гистондеацетилазы 1

и ацетилированных гистонов, что вероятно, связано с тем, что снижение уровня адетшгиров энных гистонов сопряжено с активацией других форм гистондеацешлаз и/или иш ибированием активности ацетшпрансфераз. Тем не менее, по крайней мере, в стриатуие ладастен проявляет себя как ингибитор гистондеацетилазы ] типа.

В шгтпокампе наблюдается иная динамика уровня [ГОЛС1 при действии ладастен а (рис. 9) Незначительное снижение уровня фермента происходит через 0.5 ч после ведения препарата, а через 1 час мы наблюдаем незначительное увеличение уровня ацетилированных форм гистонов 113 и Н4 (рис. 10) в :и/ой структуре. Интересно также, что через [ .5 ч после введения ладастена уровень гистондеацетилазы 1 увеличивается на 60% по сравнению с контролем, а к 2-м часам происходит снижение содержания ацетилированных гистонов. Наличие корреляции между уровнями гистондеацетилазы и апетилиров энными гисшшши свидетельствуем о том, ш-о в гипнокамне ладастен индуцирует деацетш сирование гистонов в значительной степени гистондсацетилазой ].

Рис, 7. Уровень 1ЮАС1 в клетках ориатума крыс после однократного В1 [утрижел у до чного в не дения

ладастена (50 мг/кг, а % к контролю). Нормализацию

проводили по уровню белка Ь-Мш1ш в тех же образцах. ВБ -вестерн-бяот: 1-контроль,2 - опыт.

Рис. 8. Уровень атют:шрованных гистонов НЗ и 114 в клетках стриатума мозга крыс после однократного внутриже л у дочного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю).

шш

Рис. У Уровень 1ШАС1 и клетках гшшокампа крыс после однократного 1 я IV трижепу до-чного введения ладастена (50 мг/кг, в % к контролю). Нормализацию про»оддяи но уровню белка Ь-ШЬиНп н тех же образцах. ВБ -востер! 1-6 лог, 1-контроль, 2 -опыт.

I -..1

£ 1

S вя

у С\'1

° 0.2

■ ЛсИ ЛгТд

Uüu

Рис 10. Уровень ацетилированных ¿истоков Ш и Н4 в -клетках гишюкампа крыс после однократного щутриже дудочного введения ладастена (50 Ж/кг, в % к контролю).

В отличие от вышеприведён1ых структур) в гипоталамусе (рис. 11) влияние ладастена на уровень IШАСI выражен менее чёгко и только через 15 мни после введения препарата проявляется небольшое, в пределах 10%, снижение уровня 1ГОАС1. И то же время отмечается значительное увеличение уровня ацепшировагшых Н4 ги сто но б через 1 ч после введения ладастена и менее выраженной - НЗ (рис. 12). Заметим также, что начиная с 1.5 ч происходит некоторое снижение уровня ацетилированных форм тистонов НЗ Можно гак же предположить, что в гипоталамусе, также как и в стриазу ме деацетилирование гистоиов поддерживается другими классами гистоидеацегилаз.

Таким образом, полученные нами данные дают основание предполагать, что контроль на уровне структуры хроматина играет важную роль в механизмах индуцируемых ладастспом изменений 'щшскрипциошюй активности многих геков-мишенеЙ в клегках мозга.

Рис. 11. Уровень НОАСI в клетках гипоталамуса крыс после однократного внутрижслудочпого введения ладаетена (50 мг/кг, в % к контролю). Нормализацию проводили по уровню белка В» ШЬвйп в тех же образцах. «К — вестерн-6л от; 1 -контроль, 2 — опыт.

О ОЛ

? о.г

■ Ап?НЭ A.-Hd

Рис. 12. Уровень

ацетил ированных гистонов НЗ и 114 в клетках гипоталамуса крыс после однократного

внутрижслудочпого введения ладаетена (50 мг/кг, в % к контролю).

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ладастей в дозе 50 мг/кг при однократном введении внутрь вызывает дифференциальную экспрессию гена тирозин: и дроке и л азы в клетках вентральной области покрышки, стриатума, гипоталамуса и гиттпонампа головного мозга крыс. В отдельных структурах мозга показано адекватное уровню экспрессии гена тирозингидрокеилазы увеличение синтеза фермента и образование дофамина. Способность ладаетена индуцировать de novo биосинтез катехоламинов, детектируемый по накоплению L-ДОФЛ, определяет, во-первых, длительность эффектов препарата, а, во-вторых, "пей сгущающий" тип действия ладаетена, выгодно отличающий его от "классических" психостимуляторов.

2. Показана регион-специфичность биосинтеза тирозипгилроксилазы под действием ладаетена в клетках мозга крыс, обусловленная дифференциальными механизмами его регуляции.

3. Охарактеризовано влияние ладаетена на метилирование цитозина в CpG-динуклеотидах в промоторпой области гена тирозингидроксилазы. Показано, что

препарат вызывает селективное деметилирование цитозина в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов

4 Показано, что ладастен в дозе 50 мг/кг при однократном введении внутрь снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе, не вызывая существенных изменений в гипоталамусе

5 Установлено, что однократное действие ладастена вызывает изменения уровня ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс Полученные нами данные дают основание предполагать, что контроль на уровне структуры хроматина играет важную роль в механизмах индуцируемых ладастеном изменений транскрипционной активности многих генов-мишеней в клетках мозга

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Вахитова Ю В , Ямиданов Р С , Садовников С В , Салимгареева М X , Середенин С Б Геномные подходы к поиску новых терапевтических мишеней психотропных средств//"Медицинская генетика" -2005 -Т 4, №4 - С 165

2 Вахитова Ю В , Садовников С В , Ямиданов Р С , Середенин С Б Деметилирование остатков цитозина в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках головного мозга крыс под действием производного аминоадамантана - ладастена // Генетика -2006-Т 42, № 7 - С 968-975

3 Садовников С В, Вахитова Ю В, Ямиданов Р С Влияние нейротропного лекарственного средства ладастена на статус метилирования СрО-динуклеотидов в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса головного мозга крыс // Материалы научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" Ростов-на-Дону, 2006 - С 21

4 Садовникова С В , Салимгареева М X , Вахитова Ю В Влияние нейротропного лекарственного средства ладастена на содержание НО А С1 в различных структурах мозга // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Уфа, 2007 -С 113-114

5 Садовников С В , Салимгареева М X , Вахитова Ю В , Ямцданов Р С , Середенин СБ Изменение уровня гистондеацетилазы HDAC1 в различных структурах головного мозга крыс под действием ладастена // Материалы III съезда фармакологов России "Фармакология-практическому здравоохранению" Санкт-Петербург 2007 — С 1933

Формат 60х84'/16 Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Печать на ризографе Уел печ л 2,79 Уч -изд л 2,05 Тираж 100 экз Заказ № 35

Отпечатано на оборудовании издательства «Гилем» АН РБ 450077, г Уфа, ул Кирова, 15 Тел 273-05-93, 272-36-82 e-mail gilem@anrbru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Садовников, Сергей Валентинович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Модификации гистонов и регуляция работы хроматина.

1.1.1. Хроматин.

1.1.2. Ремоделинг хроматина.

1.1.3. Модификации гистонов.

1.1.4. Ацетилирование гистонов.

1.2. Метилирование ДНК - механизм эпигенетического контроля за функциями клетки.

1.2.1. Метилирование ДНК.

1.2.2. Ферменты, осуществляющие метилирование ДНК.

1.2.3. Функциональное значение метилирования ДНК.

1.3. Фармакологические свойства производного 2-аминоадамантана - ладастена и механизмы их реализации

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы исследований.

2.1.1. Препарат.

2.1.2. Экспериментальные животные.

2.1.3. Извлечение структур головного мозга крыс.

2.1.4. Бактериальные штаммы и векторы.

2.1.5. Перечень использованных реактивов и материалов.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Методы анализа содержания белков.

2.2.1.1. Выделение белков цитоплазмы.

2.2.1.2. Экстракция гистонов.

2.2.1.3. Электрофорез белков.

2.2.1.4. Электроперенос белков из акриламидных гелей на мембранные фильтры (блоттинг).

2.2.1.5. Гибридизация с антителами.

2.2.1.6. Детекция белков.

2.2.2. Методы исследования экспрессии генов.

2.2.2.1. Выделение суммарной РНК.

2.2.2.2. Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы

2.2.2.3. Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2.2.3. Методы исследования метилирования остатков цитозина в

2.2.3.1. Выделение суммарной ДНК.

2.2.3.2. Модификация нуклеотидов бисульфитом натрия.

2.2.3.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.

2.2.3.4. Элюция ДНК из агарозных гелей.

2.2.3.5. Лигирование продуктов ПЦР.

2.2.3.6. Подготовка компетентных клеток.

2.2.3.7. Трансформация компетентных клеток Е.соИ рекомбинантной ДНК.

2.2.3.8. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.3.9. Секвенирование ДНК.

2.2.3.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.2.4. Определение количественного содержания Ь-ДОФА и дофамина.

ГЛАВА 3. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ

ВРАЗНЫХ СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛАДАСТЕНА И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЕЁ РЕГУЛЯЦИИ 3.1. Влияние ладастена на экспрессию гена, белка и активность тирозингидроксилазы и содержание Ь-ДОФА и дофамина в различных структурах головного мозга крыс.

3.1.1. Вентральная область покрышки, прилежащее ядро.

3.1.2. Гипоталамус.

3.1.3. Стриатум.

3.1.4. Гиппокамп.

3.2. Влияние ладастена на характер метилирования цитозина в промоторной области гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса головного мозга крыс.

ГЛАВА 4. МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛАДАСТЕНА

4.1. Влияние ладастена на динамику уровня гистондеацетилазы 1 и ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в различных структурах мозга крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез тирозингидроксилазы и механизмы его регулирования в клетках головного мозга крыс под действием ладастена"

Актуальность проблемы. В современной клинической практике широко используется ряд адамантан-содержащих лекарственных препаратов, обладающих противопаркинсонической (амантадин, мемантин) [БсЬашаЬ й а1., 1969; ЯаЬеу а!., 1992], противовирусной (ремантадин, адапромин) [Першин и соавт., 1973; Букринская, 1988], ноотропной (адафеноксат) [Ре1коу е1 а1., 1988], иммуностимулирующей (кемантан) [Арцимович и соавт., 1990], миорелаксантной (диадоний) [Харкевич и соавт., 1974], противоопухолевой (ДАМП) [Но е1 а1., 1972] активностью. Однако, у многих производных адамантана, помимо основных эффектов, обнаружены нейропсихотропные свойства активирующего типа, обусловленные, как полагают, специфическим дофамин- и серотонинпозитивным действием, а также тропностью к рецепторам возбуждающих аминокислот [Морозов и др., 2001]. Эти вещества обладают низкой токсичностью, не вызывают эйфории, толерантности и зависимости [Вальдман и соавт., 1976]. Еще одним общим свойством этих соединений является их высокая мембранотропность, связанная с липофильностью адамантанового ядра, и в значительной степени определяющая особенности фармакокинетики и фармакодинамики адамантановых производных [Ковалев, 1977]. В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН на протяжении ряда лет проводился целенаправленный поиск новых эффективных средств психоактивирующего действия на основе производных адамантана [Морозов и соавт., 1999]. В результате скрининговых исследований по анализу совокупности фармакологических свойств и выраженности психоактивирующих эффектов было отобрано соединение АДК-709 - К-(пара-бромфенил)амин. После обнаружения в спектре действия препарата анксиолитических свойств соединение получило название ладастен [Середенин и соавт., 2001]. К настоящему времени фармакологическая активность ладастена и некоторые аспекты механизмов его действия достаточно подробно изучены и охарактеризованы. Это позволило рекомендовать препарат для клинических исследований в качестве антиастенического средства при психогенных астенических расстройствах [Сюняков и соавт., 2006].

Как уже отмечалось выше, первоначально ладастен разрабатывался в качестве средства повышения адаптации и работоспособности в экстремальных условиях, включающих интенсивные физические и эмоционально-психические нагрузки. Традиционно с этой целью использовались психостимуляторы - производные и структурные аналоги фенилалкиламинов, сиднониминов, а также антигипоксанты, транквилизаторы, ноотропы, адаптогены и вещества метаболического типа действия [Бобков и соавт., 1984]. В то же время, экспериментальные психофармакологические исследования позволили выявить целый ряд преимуществ ладастена перед классическими психостимуляторами. Следует отметить, что в доступной нам литературе данные о лекарственных веществах - производных аминоадамантана - с подобным спектром действия не обнаружены, что определяет необходимость изучения механизмов действия ладастена. Поскольку ранее использованные нейрохимические методы не позволяли придти к заключениям о том, как реализуются его эффекты, главным образом психостимулирующие, в настоящей работе в качестве концептуального избран подход оценки динамики функционального состояния потенциальной фармакологической мишени ладастена - ключевого фермента биосинтеза катехоламинов - тирозингидроксилазы. Подробное изучение нейрохимического профиля ладастена, механизмов его дофаминпозитивного действия в процессе реализации эффектов препарата позволяет углубить представления о фармакологических мишенях ладастена и открывает перспективы создания на его основе новых, более эффективных препаратов.

Цель исследования. Выявление основных механизмов регуляции биосинтеза ключевого фермента синтеза катехоламинов тирозингидроксилазы (ТГ) в клетках различных структур головного мозга крыс при однократном введении ладастена.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать влияние однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivó) на уровень L-ДОФА и дофамина в различных структурах мозга крыс;

- изучить динамику экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы, а также уровня фермента, фосфорилированного по Ser40 (pTT-Ser40) в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме, и гиппокампе головного мозга крыс в зависимости от продолжительности действия препарата (50 мг/кг, in vivo);

- исследовать эффект ладастена (однократно, 50 мг/кг, in vivo) на динамику уровня гистондеацетилазы 1 (HDAC1), а также содержание ацетилированных форм НЗ и Н4 гистонов (АсНЗ, АсН4) в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс.

Научная новизна. Впервые показано, что ладастен при однократном внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг увеличивает экспрессию гена тирозингидроксилазы и содержание соответствующего белка, коррелирующее с накоплением продуктов реакции - L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе, гиппокампе и вентральной области покрышки экспериментальных животных. Синтез de novo данного катехоламина под действием ладастена рассматривается в качестве основного механизма, определяющего особенности психоактивирующего действия препарата. Впервые показано, что изменение транскрипционной активности гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса крыс под действием ладастена может быть связано с изменением характера метилирования СрО-динуклеотидов в промоторной его области: выявлено увеличение частоты деметилирования СрО-динуклеотидов в последовательностях, ассоциированных с сайтами связывания отдельных транскрипционных факторов. Установлено, что ладастен снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе крыс, а также влияет на содержание ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в различных структурах мозга крыс.

Научно-практическая значимость. Установленные геномные и внутриклеточные механизмы действия ладастена подтверждают данные о спектрах фармакологической активности препарата, что определяет целесообразность его использования в клинике при необходимости коррекции ряда состояний. Полученные данные учтены при составлении инструкции по применению ладастена в качестве антиастенического средства.

Внедрение результатов исследования в практику. Методические подходы, использованные в данной работе, могут найти применение на этапах доклинического исследования потенциальных лекарственных препаратов с целью уточнения спектра действия и анализа механизмов их активностей. Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций студентам на кафедре общей биологии и генетики Башкирского государственного педагогического университета.

Основные положения, выносимые на защиту. Предметом защиты данной работы являются следующие основные результаты исследований: одним из механизмов, обеспечивающим особенности психоактивирующего действия ладастена является усиление экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы и биосинтеза дофамина в отдельных структурах мозга крыс;

- в регуляцию транскрипционной активности данного гена вовлекаются эпигенетические механизмы, что проявляется в увеличении частоты деметилирования цитозинов в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов в промоторной области гена тирозингидроксилазы;

- ладастен ингибирует активность гистондеацетилазы 1 и влияет на содержание ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (10002-251/П-10/142-448/260503-196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ - 2217.2003.4), РФФИ - Агидель (02-04-97904), Программы целевых расходов Президиума РАН "Поддержка молодых ученых" (10324-812).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V-м Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006); Научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону , 2006), III Съезде Фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007). Работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии и генетики (протокол № 14 от 2 октября 2007 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 3 таблицы и 20 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3 и 4), заключения, выводов и списка литературы, включающего 227 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Садовников, Сергей Валентинович

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ладастен в дозе 50 мг/кг при однократном введении внутрь вызывает дифференциальную экспрессию гена тирозингидроксилазы в клетках вентральной области покрышки, стриатума, гипоталамуса и гиппокампа головного мозга крыс. В отдельных структурах мозга показано адекватное уровню экспрессии гена тирозингидроксилазы увеличение синтеза фермента и образование дофамина. Способность ладастена индуцировать de novo биосинтез катехоламинов, детектируемый по накоплению L-ДОФА, определяет, во-первых, длительность эффектов препарата, а, во-вторых, "неистощающий" тип действия ладастена, выгодно отличающий его от "классических" психостимуляторов.

2. Показана регион-специфичность биосинтеза тирозингидроксилазы под действием ладастена в клетках мозга крыс, обусловленная дифференциальными механизмами его регуляции.

3. Охарактеризовано влияние ладастена на метилирование цитозина в CpG-динуклеотидах в промоторной области гена тирозингидроксилазы. Показано, что препарат вызывает селективное деметилирование цитозина в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов.

4. Показано, что ладастен в дозе 50 мг/кг при однократном введении внутрь снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе, не вызывая существенных изменений в гипоталамусе.

5. Установлено, что однократное действие ладастена вызывает изменения уровня ацетилированных форм гистонов НЗ и Н4 в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс. Полученные нами данные дают основание предполагать, что контроль на уровне структуры хроматина играет важную роль в механизмах индуцируемых ладастеном изменений транскрипционной активности многих генов-мишеней в клетках мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведено комплексное изучение механизмов формирования нейротропной активности нового оригинального фармакологического препарата ладастена. Выбор препарата в качестве объекта исследования обусловлен его высокой фармакологической активностью, подтвержденной во 2-ой фазе клинических испытаний, а главное, сложным фармакологическим спектром, включающим психостимулирующие, анксиолитические и иммунотропные свойства. Препараты с подобным фармакологическим спектром востребованы в клинике, поскольку сочетание психостимулирующего и анксиолитического эффектов является оптимальным для терапии психогенных астенических расстройств, которым подвержена значительная часть трудоспособного населения. В то же время отметим, что наличие у психостимулятора анксиолитического компонента является нетипичным. В доступной литературе данные о лекарственных веществах с подобным спектром действия не обнаружены, что определило необходимость изучения механизмов действия ладастена.

Ладастен, наряду с другими соединениями, проявляющими психостимулирующую активность, обладает способностью увеличивать содержание нейромедиаторов - дофамина и серотонина преимущественно в лимбических структурах мозга (фронтальной коре, вентральной области покрышки, гиппокампе, гипоталамусе) и стимулировать высвобождение дофамина из пресинаптических терминалей стриатума. В то же время, неизвестно, за счет каких механизмов происходит увеличение содержания нейромедиатора на фоне действия ладастена, хотя была показана способность препарата ингибировать обратный захват дофамина, серотонина и норадреналина синаптосомами стриатума, а также тролность препарата к Дз подтипу рецепторов дофамина в стриатуме, которым, как известно, приписываются функции пресинаптических ауторецепторов, модулирующих преимущественно высвобождение дофамина. Существует ряд косвенных данных, свидетельствующих о возможном влиянии препарата на процессы биосинтеза катехоламинов. Нами был проанализирован ряд параметров, характеризующих динамику состояния системы биосинтеза катехоламинов при однократном введении ладастена, а именно - содержание L-ДОФА и дофамина, оценка экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы (ТГ), а также уровень тирозингидроксилазы, фосфорилированной по Ser40, в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме, и гиппокампе головного мозга крыс в зависимости от продолжительности действия препарата. На наш взгляд, наиболее важными с точки зрения механизмов формирования психостимулирующей активности ладастена, являются данные о способности препарата оказывать стимулирующее влияние на экспрессию гена ТГ в клетках вентральной области покрышки, коррелирующее с увеличением уровня L-ДОФА и дофамина в прилежащем ядре, получающем проекции из VTA. Обращает на себя внимание "ранняя" (через 0.5 ч после введения препарата) индукция транскрипции ТГ в VTA. Это, вероятно, свидетельствует о необходимости компенсаторного синтеза катехоламинов, вследствие усиленного высвобождения дофамина из прилежащего ядра, о чем косвенно можно судить по снижению тканевого уровня L-ДОФА и дофамина в этой структуре. Тогда как возрастание уровня мРНК ТГ в VTA через 1.5 ч, скорее всего, свидетельствует об активации de novo синтеза тирозингидроксилазы и катехоламинов. Подтверждением этому служат данные о значительном увеличении и L-ДОФА и дофамина в прилежащем ядре через 2 ч после введения ладастена. О том, что ладастен на начальных этапах своего действия способствует высвобождению нейромедиатора, свидетельствует также длительное снижение тканевого уровня L-ДОФА и дофамина в стриатуме, не компенсируемое активацией ТГ. Однако, к 2.5 ч в этой структуре наблюдаем увеличение уровня L-ДОФА, что вероятно сопряжено с активацией биосинтеза ТГ в других структурах, например, в VTA и компактной части черной субстанции. Таким образом, способность ладастена индуцировать de novo биосинтез катехоламинов, детектируемый по накоплению L-ДОФА, определяет, во-первых, длительность эффектов препарата, а, во-вторых, "неистощающий" тип действия ладастена, выгодно отличающий его от "классических" психостимуляторов. В качестве гипотезы можно предположить следующую последовательность событий. Индуцированное ладастеном высвобождение дофамина в вентральной области покрышки, стимулирует Д[ рецепторы, локализованные на пресинаптических глутаматных терминалях. Это приводит к высвобождению глутамата, который, в свою очередь, активирует

АМРА и NMDA рецепторы, расположенные на ДА нейронах и/или 2+ дендритах и вызывает опосредованную Na и Са деполяризацию. В результате, активируются потенциал-управляемые кальциевые каналы и

Л I увеличивается ток Са в клетку, в том числе и через АМРА и NMDA

Л I рецепторы, с последующей активацией кальмодулина и Са /кальмодулин-зависимых протеинкиназ (СаМК). CaMKII далее либо прямо, либо опосредованно через МАП-зависимый сигнальный каскад, фосфорилирует многие внутриклеточные белки-мишени, в числе которых тирозингидроксилаза, белки цитоскелета, нейротрофические факторы и другие белки, изменения функционального состояния которых обуславливают реализацию эффектов препарата.

В гипоталамусе индуцируемые ладастеном изменения уровня мРНК, белка и активности ТГ во времени имеют линейный характер, достигая максимума к 2 ч после однократного воздействия препарата, и коррелируют с содержанием продукта реакции - L-ДОФА. Активация ладастеном синтеза дофамина в гипоталамусе, играющего роль нейромедиатора, нейромодулятора и нейрогормона в этой структуре, может, по крайней мере, частично, определять опосредованную дофамин-позитивными нейронами регуляцию нейроэндокринных функций и реализацию стресспротекторных, метаболических, иммуномодулирующих эффектов препарата.

В гиппокампе повышение уровня L-ДОФА и дофамина, вероятно, позволяет обосновать отдельные механизмы проявляемой ладастеном ноотропной активности, поскольку известно, что дофаминергические нейроны гиппокампа играют ключевую роль в реализации когнитивных функций и вовлекаются в процессы консолидации памяти, что продемонстрировано многими исследователями in vivo и in vitro моделях долговременной потенциации (ДВП). Нами проведено изучение возможного влияния ладастена на синаптическую пластичность в гиппокампе на модели ДВП. Показано, что ладастен оказывает влияние на эффективность индукции кратковременной потенциации (КВП) клетках поля CAI и способствует трансформации кратковременной фазы потенциации в долговременную, которая сохраняется в течение 6 часов. В экспериментах с антагонистом Д1/Д5 рецепторов SCH 23390 установлено, что эффект ладастена на долговременную потенциацию опосредуется Д1/Д5 подтипом рецепторов, но не в результате непосредственного взаимодействия ладастена с рецепторами. Наиболее вероятно, что индуцированное ладастеном увеличение синтеза дофамина в гиппокампе и/или в других областях мозга, иннервирующих гиппокамп, способствует более продолжительному высвобождению нейромедиатора во время индукции КВП, и как следствие, активации Д1/Д5 рецепторов. Учитывая продолжительность поддержания ДВП в срезах гиппокампа при действии ладастена (в течении 6 ч), а также известные факты о том, что длительное поддержание ДВП является процессом, зависимым от de novo синтеза белка, в экспериментах с блокатором трансляции анизомицином показано, что введение в среду последнего препятствует трансформации кратковременной потенциации в долговременную, что свидетельствует в пользу того, что данный процесс на фоне ладастена является зависимым от de novo синтеза белка.

Таким образом, нами установлено дифференциальное влияние ладастена на активность транскрипции гена ТГ, уровень и активность тирозингидроксилазы и содержание Ь-ДОФА и дофамина в разных структурах головного мозга крыс. На наш взгляд, одним из основных механизмов регуляции тканеспецифичной транскрипции гена ТГ является изменение активности отдельных транскрипционных факторов, индуцируемых протеинкиназами различных сигнальных каскадов. В первую очередь это относится к транскрипционному фактору СЯЕВ, который определяет как базальный, так и индуцированный разными сигналами уровень экспрессии гена ТГ. Так, сопоставление динамики уровня рСЯЕВ и мРНК ТГ выявило в гипоталамусе временное соответствие активации СЯЕВ и гена ТГ, тогда как в гиппокампе можно полагать СЯЕВ-независимую активацию этого гена при действии ладастена. В стриатуме ингибирование транскрипции гена ТГ может быть зависимым от СЯЕВ, но, скорее всего, опосредуется другими транскрипционными факторами, негативно регулирующими экспрессию этого гена.

Несмотря на то, что к настоящему времени механизмы тканеспецифической регуляции экспрессии гена ТГ достаточно полно и подробно исследованы, немногое известно о роли эпигенетических механизмов в регуляции экспрессии данного гена. В качестве одного из возможных механизмов, обуславливающих изменение транскрипционной активности гена ТГ под действием исследуемого нами препарата мы предположили возможность его влияния на характер метилирования цитозина в Срв-динуклеотидах в промоторной его области. Как следует их полученных нами данных, ладастен при однократном введении экспериментальным животным вызывает изменение характера метилирования Срв-динуклеотидов, локализованных в 5'-фланкирующей области гена ТГ в клетках гипоталамуса головного мозга крыс. Оно проявляется в увеличении частоты деметилирования остатков цитозина в последовательностях, расположенных непосредственно в сайтах связывания транскрипционных факторов АР-2 (в позиции -218), Egr-1/Sp-l (-117), CRE-1 (-43), CRE-2 (-95) или в непосредственной близости от них - АР-2 (-228, -225), НЕРТ (-156, -143, -140), Egr-1/Sp-l (-134), AP-l-CRE-1 enhancer element (-19, -8). Как показывают результаты наших исследований, в опытном варианте частота метилирования цитозина в позиции -43 CRE-1-элемента снижена почти в 2 раза по сравнению с контролем, тогда как остаток цитозина в позиции -95, расположенный в сайте CRE-2, деметилирован в меньшей степени. Можно предположить, что наблюдаемое нами усиление транскрипционной активности гена ТГ в клетках гипоталамуса, по крайней мере, частично ассоциировано с процессами метилирования/деметилирования цитозинов CRE-последовательности промоторной области данного гена.

Поскольку ранее нами была показана способность ладастена оказывать влияние на изменение транскрипции многих генов в клетках мозга крыс, представляло интерес изучение механизмов контроля транскрипции на уровне структуры хроматина. Предпосылкой наших исследований стали данные о том, что некоторые психотропные средства (кокаин, вальпроевая кислота, антидепрессанты) обладают способностью модифицировать гистоны в области промоторов генов-мишеней.

Обращает на себя внимание несовпадение уровней гистондеацетилазы 1 и ацетилированных гистонов, что вероятно, связано с тем, что снижение уровня ацетилированных гистонов сопряжено с активацией других форм гистондеацетилаз и/или ингибированием активности ацетилтрансфераз. Тем не менее, по крайней мере в стриатуме ладастен проявляет себя как ингибитор гистондеацетилазы 1.

В гиппокампе наблюдается иная динамика уровня НБАС1 при действии ладастена. Наличие корреляции между уровнями гистондеацетилазы и ацетилированными гистонами свидетельствует о том, что в гиппокампе ладастен индуцирует деацетилирование гистонов в значительной степени гистондеацетилазой 1.

В отличие от вышеприведённых структур в гипоталамусе влияние ладастена на уровень НБАС1 выражен менее чётко. В то же время отмечается значительное увеличение уровня ацетилированных Н4 гистонов после введения ладастена и менее выраженной - НЗ. Можно также предположить, что в гипоталамусе, также как и в стриатуме деацетилирование гистонов поддерживается другими классами гистондеацетилаз.

Таким образом, полученные нами данные дают основание предполагать, что контроль на уровне структуры хроматина играет важную роль в механизмах индуцируемых ладастеном изменений транскрипционной активности многих генов-мишеней в клетках мозга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Садовников, Сергей Валентинович, Уфа

1. Бобков, Ю.Г. Фармакологическая коррекция утомления / Ю.Г. Бобков, В.М. Виноградов, В.Ф. Катков и др. М.: Медицина, 1984. - 208 с.

2. Букринская, А.Г. Вирусология / А.Г. Букринская. М.: Медицина, 1986. -336 с.

3. Вальдман, A.B. Психофармакология эмоций / A.B. Вальдман, Э.Э. Звартау, М.М. Козловская. М., 1976. - 327 с.

4. Вальдман, Е.А. Влияние нового противопаркинсонического препарата гимантана на активность моноаминоксидаз / Е.А. Вальдман, Т.А. Воронина, JI.H. Аксёнова и др. // Эксперим. клинич. фармакол. 2003. -Т. 66, №5.-С. 3-5.

5. Ванюшин, Б.Ф. Материализация эпигенетики или небольшие изменения с большими последствиями / Б.Ф. Ванюшин // Химия и жизнь. 2004. -№ 2 - С. 32-37.

6. Гвоздев, В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК / В.А. Гвоздев // Соросовский образовательный журнал. 1999. -№ 10 - С. 11-17.

7. Георгиев, Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия / Г.П. Георгиев -М.: Наука, 1989.-255 с.

8. Карпов, B.JI. ДНК, хроматин, гистоновый код / B.JL Карпов // Вест. РАН- 2003. Т. 73, № 6. - С. 496-513.

9. Климова, Н.В. Пат. № 1601978. Способ получения М-(4-бромфенил)-М-(2-адамантил) амина / Н.В. Климова, Н.М. Зайцева, Г.В. Пушкарь и др.- Опубл. 1990, Бюл. изобрет. № 39.

10. Коряков, Д.Е. Модификации гистонов и регуляция работы хроматина / Д.Е. Коряков // Генетика 2006. - Vol. 42, № 9. - Р. 1170-1185.

11. Кудрин, B.C. Влияние бромантана на дофамин- и серотонинергические системы мозга крыс / B.C. Кудрин, С.А. Сергеева, JI.M. Красных и др. // Эксперим. клинич. фармакол. 1995. - Т. 58, № 4. - С. 8-11.

12. Морозов, И.С. Производные адамантана, повышающие устойчивость организма к экстремальным воздействиям / И.С. Морозов, Н.В. Климов, С.А. Сергеева и др. // Вест. РАМН. 1999. - № 3. - С. 28-32.

13. Морозов, И.С. Фармакология адамантанов / И.С. Морозов, В.И. Петров, С.А. Сергеева. Волгоград. - 2001. - 318 с.

14. Пендина, A.A. Метилирование ДНК универсальный механизм регуляции активности генов / A.A. Пендина, В.В. Гринкевич, Т.В. Кузнецова, B.C. Баранов // Экол. генетика. - 2004. - Т. 2, № 1 - С. 27-37.

15. Першин, Г.Н. Химиотерапия вирусных инфекций / Г.Н. Першин, Н.С. Богданова. -М.: Медицина, 1973. 143 с.

16. Саложин, C.B. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров / C.B. Саложин, Е.Б. Прохорчук, Г.П. Георгиев // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 5 - С. 641-650.

17. Свердлов, Е.Д. Болезни генома и новая молекулярная генетика / Е.Д. Свердлов // Мол. микробиол. вирусол. 2000. - № 1. - С. 3-29.

18. Середенин, С.Б. Пат. № 2175229 РФ. Анксиолитическое средство / С.Б. Середенин, М.А. Яркова, Б.А. Бадыштов и др. опубл. 2001, Бюл. изобрет. № 30.

19. Страйер, J1. Гены высших организмов и их экспрессия / JI. Страйер М.: Мир, 1985.-400 с.

20. Сюняков, С.А. Результаты клинического исследования ладастена / С.А. Сюняков, С.А. Гришин, Е.С. Телешова и др. // Эксперим. клинич. фармакол. 2006. - Т. 69, № 4. - С. 5-10.

21. Угрюмов, М.В. Механизмы нейроэндокринной регуляции / М.В. Угрюмов. М.: Наука, 1999. - 299 с.

22. Харкевич, Д.А. О значении адамантильных радикалов для механизма миопаралитического действия бисчетвертичных аммониевых соединений / Д.А. Харкевич, А.П. Сколдинов, Д.Н. Ибадова // Фармакол. и токсикол, — 1974. — № 2. — С. 166-171.

23. Шиф, М. Метилирование и деметилирование ДНК как мишени противораковой терапии / М. Шиф // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 5. - С. 651-669.

24. Ahringer, J. NuRD and SIN3 histone deacetylase complexes in development / Trends Genet. 2000. - Vol. 16, № 8. - P. 351-356.

25. Amara, S.G. Neurotransmitter transporters as molecular targets for addictive drugs / S.G. Amara, M.S. Sonders // Drug Alcohol Depend. 1998. - Vol. 51, № 1-2.-P. 87-96.

26. Ammon-Treiber, S. Gene expression of transcription factors in the rat brain after morphine withdrawal / S. Ammon-Treiber, H. Tischmeyer, U. Riechert, V. Höllt // Neurochem. Res. 2004. - Vol. 29, № 6. - P. 1267-1273.

27. Antequera, F. Number of CpG islands and genes in human and mouse / F. Antequera, A.P. Bird // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 11995-11999.

28. Aranyi, T. The tissue-specific methylation of the human tyrosine hydroxylase gene reveals new regulatory elements in the firs exon / T. Aranyi, B.A. Faucheux, O. Khalfalla et al. // J. Neurochem. 2005. - Vol. 94. - P. 129139.

29. Attwood, J.T. DNA methylation and the regulation of gene transcription / J.T. Attwood, R.L. Yung, B.C. Richardson // Cell Mol. Life Sci. 2002. - V. 59. -P. 241-257.

30. Baylin, S.B. Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer / S.B. Baylin, M. Esteller, M.R. Rountree, K.E. Bachman, K. Schuebel, J.G. Herman //Hum. Mol. Genet. -2001. Vol. 10. -P. 687-692.

31. Baylin, S.B. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia / S.B. Baylin, J.G. Herman, J.R. Graff, P.M. Vertino, J.-P. Issa // Adv. Cancer Res. -1998. Vol. 72. - P. 141-196.

32. Baylin, S.B. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics / S.B. Baylin, J.G. Herman // Trends Genet. 2000. - Vol. 16, № 4. -P. 168-174.

33. Becker, P.B. ATP-dependent nucleosome remodeling / P.B. Becker, W. Horz // Annu. Rev. Biochem. 2002. - Vol. 71. - P. 247-273.

34. Berke, J.D. Addiction, dopamine and the molecular mechanisms of memory / J.D. Berke, S.E. Hyman // Neuron. 2000. - Vol. 25. - P. 515-532.

35. Best, J.A. The response of the tyrosine hydroxylase gene to cyclic AMP is mediated by two cyclic AMP-response elements / J.A. Best, Y. Chen, K.M. Piech, A.W. Tank // J. Neurochem. 1995. - Vol. 65, № 5. - P. 1934-1943.

36. Bestor, T.H. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn binding regulatory domain / T.H. Bestor // J. EMBO- 1992, № 7. Vol. 11.-P. 2611-2617.

37. Boeger, H. Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter / H. Boeger, J. Griesenbeck, J.S. Strattan, R.D. Kornberg // Mol Cell.-2003.-Vol. 11, №6.-P. 1587-1598.

38. Boulikas, J. Poly(ADP-ribosylated) histones in chromatin replication / J. Boulikas // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 14638-14647.

39. Boundy, V.A. Regulation of tyrosine hydroxylase promoter activity by chronic morphine in TH9.0-LacZ transgenic mice / V.A. Boundy, S.J. Gold, C.J. Messer et al. // J. Neurosci.- 1998. Vol. 18, № 23. - P. 9989-9995.

40. Bradberry, C.W. Dynamics of extracellular dopamine in the acute and chronic actions of cocain / C.W. Bradberry // J. Neurosci. 2002. - Vol. 8, № 4. - P. 315-322.

41. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72, № 1-2. - P. 248-254.

42. Butcher, S.P. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study / S.P. Butcher, I.S. Fairbrother, J.S. Kelly, G.W. Arbuthnott // J. Neurochem. 1988. - Vol. 50, № 2. - P. 346-355.

43. Cazorla, P. A response element for the homeodomain transcription factor Ptx3 in the tyrosine hydroxylase gene promoter / P. Cazorla, M.R. Smith, K.Z. O'Malley, P.H. Burbach // J. Neurochem. 2000. - Vol. 74. - P. 1829-1837.

44. Cervoni, N. Demethylase activity is directed by histone acetylation / N. Cervoni, M. Szyf // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 40778-40787.

45. Chee, M. AP-1, CREB and CBP transcription factors differentially regulate the tyrosine hydroxylase gene / M. Chee, H. Barker, J.C. Miller, E.B. Ziff // Mol. Brain Res. 1998. - Vol. 55. - P. 101-114.

46. Chen, G. Groucho/TLE family proteins and transcriptional repression / G. Chen, A.J. Courey//Gene.-2000.-Vol. 249, № 1-2.-P. 1-16.

47. Chen, W.G. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2 / W.G. Chen, A.E. West, M.E. Greenberg, E.C. Griffith, Y. Lin // Science. 2003. - Vol. 302. - P. 885-889.

48. Chinnadurai, G. CtBP, an unconventional transcriptional corepressor in development and oncogenesis / G. Chinnadurai // Mol. Cell. 2002. - Vol. 9, №2-P. 213-224.

49. Chiurazzi, P. Pharmacological reactivation of inactive genes: the fragile X experience / P. Chiurazzi, G. Neri // Brain Res. Bull. 2001. - Vol. 56, № 3-4.-P. 383-387.

50. Chuang, L.S. Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl / L.S. Chuang, H.I. Ian, T.W. Koh et al. // Science. -1997.-Vol. 227.-P. 1996-2000.

51. Clark, S.J. Spl binding is inhibited by (m)Cp(m)CpG methylation / S.J. Clark, J. Harrison, P.L. Molloy // Gene. 1997. - Vol. 195. - P. 67-71.

52. Cohen, S.N. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA / S.N. Cohen, A.C.Y. Chang, L. Hsu // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. - Vol. 69, № 8. - P. 2110-2114.

53. Colvis, C.M. Epigenetic mechanisms and networks in the nervous system / C.M. Colvis, Y.D. Pollock, R.H. Goodman et al. // J. Neurosci. 2005. - Vol. 25, №45.-P. 10379-10389.

54. Cress, W.D. Histone deacetylases, transcriptional control, and cancer / W.D. Cress, E. Seto //J Cell Physiol. 2000. - Vol. 184, № 1. - P. 1-16.

55. Curradi, M. Molecular mechanisms of gene silencing mediated by DNA methylation / M. Curradi, A. Izzo, G. Badaracco // Mol. Cell. Biol. 2002. -Vol. 22, №9.-P. 3157-3173.

56. De Smet, Ch. Promoter-dependent mechanism leading to selective hypomethylation within the 5' region of gene MAGE-A1 in tumor cells / Ch. De Smet, A. Loriot, T. Boon // Mol. Cell. Biol. 2004. - Vol. 24. - P. 47814790.

57. Detich, N. Valproate induces replication independent active DNA demethylation / N. Detich, V. Bovenzi, M. Szif// J. Biol.Chem. - 2003. -Vol. 274, № 30. - P. 27586-27592.

58. Di Chiara, G. Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats / G. Di Chiara, A. Imperado // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 5274-5278.

59. Dilts, R.P. Autoradiographic localization of mu-opioid and neurotensin receptors within the mesolimbic dopamine system / R.P. Dilts, P.W. Kalivas // Brain Res. 1989. - Vol. 488. - P. 311-327.

60. Doherty, M.D. NMDA receptors in nucleus accumbens modulate stress-induced dopamine release in nucleus accumbens and ventral tegmental area / M.D. Doherty, A. Gratton // Synapse. 1997. - Vol. 26, № 3. - P. 225-234.

61. Dunkley, P.R. Tyrosine hydroxylase phosphorylation: regulation and consequences / P.R. Dunkley, L. Bobrovskaya, M.E. Graham et al. // J. Neurochem. 2004. - Vol. 91, № 5. - P. 1025-1043.

62. Ehrenhofer-Murray, A.E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair / A.E. Ehrenhofer-Murray // Eur. J. Biochem. 2004. -Vol. 271, № 12.-P. 2335-2349.

63. Fazzio, T.G. Chromatin remodeling in vivo: evidence for a nucleosome sliding mechanism / T.G. Fazzio, T. Tsukiyama // Mol. Cell. 2003. - Vol. 12.-P. 1333-1340.

64. Fischle, W. Enzymatic activity associated with class II HDACs is dependent on a multiprotein complex containing HDAC3 and SMRT/N-CoR / W. Fischle, F. Dequiedt, M.J. Hendzel, M.G. Guenther, M.A. Lazar // Mol. Cell. 2002. - Vol. 9, № 1. - P. 45-57.

65. Fischle, W. Histone and chromatin cross-talk / W. Fischle, Y. Wang, C.D. Allis//Curr. Opin. Cell Biol.-2003.-Vol. 15, №2.-P. 172-183.

66. Frey, U. Dopaminergic antagonists prevent long-term maintenance of posttetanic LTP in the CA1 region of rat hippocampal slices / U. Frey, H. Schroeder, H. Matthies // Brain Res. 1990. - Vol. 522. - P. 69-75.

67. Frey, U. The effect of dopaminergic D1 receptor blockade during tetanization on the expression of long-term potentiation in the rat CA1 region in vitro / U. Frey, H. Matthies, K.G. Reymann // Neurosci. Lett. 1991. - Vol. 129. - P. 111-114.

68. Fuks, F. DNA methyltransferases get connected to chromatin / F. Fuks, W.A. Burgers, T. Kouzarides // Trends Genet. 2002. - Vol. 18, № 6. - P. 275-277.

69. Gainetdinov, R.R. Effects of a psychostimulant drug Sydnocarb on rat brain dopaminergic transmission in vivo / R.R. Gainetdinov, T.D. Sotnikova, T.V. Grekhova, K.S. Rayevsky // Eur. J. Pharmacol. 1997. - Vol. 340. - P. 53-58.

70. Gao, L. Cloning and functional characterization of HDAC 11, a novel member of the human histone deacetylase family / L. Gao, M.A. Cueto, F. Asselbergs, P. Atadja // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 25748-25755.

71. Gardiner-Garden, M. CpG islands in vertebrate genomes / M. GardinerGarden, M. Frommer//J. Mol. Biol. -1987. Vol. 196, № 2. - P. 261-268.

72. Gizang-Ginsberg, E. Nerve growth factor regulates tyrosine hydroxylase gene transcription through a nucleoprotein complex that contains c-fos / E. Gizang-Ginsberg, E.B. Ziff//Genes Dev. 1990. - Vol. 4. - P. 477-491.

73. Goldstein, M. Antibodies to a segment of tyrosine hydroxylase phosphorilated at serine 40 / M. Goldstein, K.Y. Lee, J.Y. Lew et al. // J. Neurochem. 1995. -Vol. 64.-P. 2281-2287.

74. Gowher, H. DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine / H. Gowher, O. Leismann, A. Jeltsch // EMBO J. 2000. - Vol. 19. - P. 69186923.

75. Greenamyre, J.T. N-methyl-D-aspartate antagonists in the treatment of Parkinson's disease / J.T. Greenamyre, C.F. O'Brien // Arch. Neurol. 1991. -Vol. 48.-P. 977.

76. Hagerty, T. Identification of a glucocorticoid-responsive element in the promoter region of the mouse tyrosine hydroxylase gene / T. Hagerty, W.W. Morgan, N. Elango, R. Strong // J. Neurochem. 2001. - Vol. 76, № 3. - P. 825-834.

77. Hakansson, K. Regulation of striatal tyrosine hydroxylase phosphorylation by acute and chronic haloperidol / K. Hakansson, L. Pozzi, A. Usiello et al. // Eur. J. Neurosci. 2004. - Vol. 20, № 4. - P. 1108-1112.

78. Hamiche, A. Histone tails modulate nucleosome mobility and regulate ATP-dependent nucleosome sliding by NURF / A. Hamiche, J.-G. Kang, C. Dennis, C. Wu // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. - Vol. 98, № 25. - P. 1431614321.

79. Haycock, J.W. Phosphorylation of tyrosine hydroxylase in situ at serine 8, 19, 31 and 40 / J.W. Haycock // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 165. - P. 1162811691.

80. Haycock, J.W. Stimulation-dependent phosphorylation of tyrosine hydroxylase in rat corpus striatum / J.W. Haycock // Brain Res. Bull. 1987. -Vol. 19,№6.-P. 619-622.

81. He, H. Global effects of histone modifications / H. He, N. Lehming // Briefings in functional genomics and proteomics. 2003. - Vol. 2, № 3 - P. 234-243.

82. Holler, M. Spl transcription factor binds DNA and activates transcription even when the binding site is CpG methylated / M. Holler, G. Westin, J. Jiricny, W. Schaffner// Genes Dev. 1988. - Vol. 2. - P. 1127-1135.

83. Horn, P.J. Chromatin higher order folding-wrapping up transcription / P.J. Horn, C.L. Peterson // Science 2002. - Vol. 297. - P. 1824-1827.

84. Hsieh, J. Chromatin remodeling in neural development and plasticity / J. Hsieh, F.H. Gage // Curr. Opin. Cell. Biol. 2005. - Vol. 17. - P. 664-671.

85. Iguchi-Ariga, S.M. CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation / S.M. Iguchi-Ariga, W. Schaffner // Genes Dev. 1989. - Vol. 3, № 5. - P. 612-619.

86. Irvine, R.A. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation / R.A. Irvine, I.G. Lin, C-L. Hsieh // Mol. Cell. Biol. 2002. -Vol. 22,№ 19.-P. 6689-6696.

87. Ivanova, T. Estrogen regulates tyrosine hydroxylase expression in the neonate mouse midbrain / T. Ivanova, C. Beyer, G.K. Kumar et al. // J. Neurobiol. -2003.-Vol. 54.-P. 638-647.

88. Iversen, S.D. Interactions between excitatory amino acids and dopamine systems in the forebrain: implications for schizophrenia and Parkinson's disease / S.D. Iversen // Behav. Pharmacol. 1995. - Vol. 6, № 5-6. - P. 478491.

89. Iwawaki, T. Identification of potential Nurrl response element that activates the tyrosine hydroxylase gene promoter in cultered cells / T. Iwawaki, K. Kohno, K. Kobayashi // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - Vol. 274.-P. 590-595.

90. Jaenisch, R. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals / R. Jaenisch, A. Bird // Nature Gen. 2003. - Vol. 33. - P. 245-254.

91. Jenuwein, T. Translating the histone code / T. Jenuwein, C.D. Allis // Science. -2001.-Vol. 293.-P. 1074-1080.

92. Jeong, H. Regulation of the transcriptional activity of the tyrosine hydroxylase gene by androgen receptor / H. Jeong, M.S. Kim, J. Kwon et al. // Neurosci. Lett. 2006. - Vol. 396, № 1. - P. 57-61.

93. Jepsen, K. Biological roles and mechanistic actions of co-repressor complexes / K. Jepsen, M.G. Rosenfeld // J. Cell Sci. 2002. - Vol. 4. - P. 689-698.

94. Johnston, M.V. Neurobiology of Rett Syndrome / M.V. Johnston, B. Mullaney, M.E. Blue //J. Child Neurol. 2003. - Vol. 18 - P. 688-692.

95. Jost, J.P. Mechanisms of DNA demethylation in chicken embryos / J.P. Jost, M. Siegmann, L. Sun, R. Leung // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 9734-9739.

96. Kass, S.U. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation / S.U. Kass, N. Landsberger, A.P. Wolffe // Curr. Biol. -1997.-Vol. 7, № 3 P. 157-165.

97. Kim, H.-S. Regulation of the tyrosine and dopamine p-hydroxylase genes by the transcription factor AP-2 / H.-S. Kim, S.J. Hong, M.S. LeDoux et al. // J. Neurochem. 2001. - Vol. 76. - P. 280-294.

98. Kim, H.-S. Regulation of the tyrosine hydroxylase gene promoter by histone deacetylase inhibitors / H.-S. Kim, J.-S. Park, S.-J. Hong et al. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003. - Vol. 312, № 4. - P. 950-995.

99. Kim, S.M. Regulation of human tyrosine hydroxylase gene by neuron-restrictive silenser factor / S.M. Kim, J.W. Yang, MJ. Park et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol. 346, № 2. - P. 426-435.

100. Kornberg, R.D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA / R.D. Kornberg, D. Roger// Science. 1974. -Vol. 184. - P. 868-871.

101. Kornberg, R.D. Chromatin structure: oligomers of the histones / R.D. Kornberg, J.O. Thomas // Science 1974. - Vol. 184. - P. 865-868.

102. Kornberg, R.D. Structure of chromatin / R.D. Kornberg // Ann. Rev. Biochem. 1977. - Vol. 46.-P. 931-954.

103. Kornberg, R.D. The nucleosome / R.D. Kornberg, A. Klug // Scientific American. 1981. - Vol. 244. - P. 52-64.

104. Kornhuber, J. Psychogenicity and N-methyl-D-aspartate receptor antagonism: implications for neuroprotective pharmacotherapy / J. Kornhuber, M. Weller // Biol. Psychiatry. 1997. - Vol. 41, № 2. - P. 139-144.

105. Kumar, A. Chromatine remodeling is a key mechanism underlying cocain-induced plasticity in striatum // A. Kumar, K.-H. Choi, W. Renthal et al. // Neuron. 2005. - V. 48. - P. 303-314.

106. Kumer, S.C. Intricate regulation of tyrosine hydroxylase activity and gene expression / S.C. Kumer, K.E. Vrana // J. Neurochem. 1996. - Vol. 67, № 2. p. 443-462.

107. Kuo, M.H. Roles of histone acetyltransferases and deacetylases in gene regulation / M.H. Kuo, C.D. Allis // BioEssays. 1998. - Vol. 20. - P. 615626.

108. Laemmli, U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophag T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

109. Lander, E.S. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome / E.S. Lander, L.M. Linton, B. Birren, C. Nusbaum, M.C. Zody et al. // Nature. 2001. - Vol. 409. - P. 860921.

110. Lapa, G.B. 2-amino-adamantane derivative Ladasten enchances in vivo dopamine synthesis and release in rat striatum / G.B. Lapa, G.I. Kovalev // Eur. Neurosychopharmacol. -2005. Vol. 15. - P. 271-272.

111. Lee, W.S. Inhibition of DNA methylation by caffeic asid and chlorogenic asid, two common catecholcontaining coffee polyphenols / W.S. Lee, B.T. Zhu // Carcinogenesis. 2006. - Vol. 27. - P. 269-277.

112. Lee, W.S. Mechanisms for the inhibition of DNA methyltransferases by Tea catechins and bioflavonoids / W.S. Lee, J.Y. Shim, B.T. Zhu // Mol. Pharm. -2005.-Vol. 68, №4.-P. 1018-1030.

113. Legube, G. Regulating histone acetyltransferases and deacetylases / G. Legube, D. Trouche // J. EMBO 2003. - Vol. 4. - P. 944-947.

114. Li, E. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality / E. Li, T.H. Bestor, R. Jaenisch // Cell. 1992. - Vol. 69. -P. 915-926.

115. Li, J. Dopamine D2-like antagonists induce chromatin remodeling in striatal neurons through cyclic AMP-protein kinase A and NMDA receptor signaling / J. Li, Y. Guo, F.A. Schroeder et al. // J. Neurochem. 2004. - Vol. 90. - P. 1117-1131.

116. Lin, X. Reversal of GSTP1 CpG island hypermethylation and reactivation of GSTP1 expression in human prostate cancer cells by treatment with procainamide / X. Lin, K. Asgari, M.J. Putzi et al. // Cancer Res. 2001. -Vol. 61.-P. 8611-8616.

117. Liu, Y. Multiple domains are involved in the targeting of the mouse DNA methyltransferase to the DNA replication foci / Y. Liu, E.J. Oakeley, L. Sun, J.P. Jost // Nature. 1998. - Vol. 26. - P. 1038-1045.

118. Lunyak, V.V. Corepressor-dependent silencing of chromosomal regions encoding neuronal genes / V.V. Lunyak, R. Burgess, G.G. Prefontaine et al. // Science. 2002. - Vol. 298. - P. 1747-1752.

119. Lyko, F. DNA methylation in Drosophila melanogaster / F. Lyko, B.H. Ramsahoye, R. Jaenisch // Nature. 2000. - Vol. 408. - P. 538-540.

120. Maj, J. Der Wirkung von Memantin aufzentrale Neurotransmitter systeme. Eine Zusammenfassungder / J. Maj // Arzneim. Forsch. - 1982. - Bd. 32 (II), № 10.-S. 1256-1259.

121. Marks, P.A. Histone deacetylase inhibitors as new cancer drugs / P.A. Marks, V.M. Richon, R. Breslow et al. // Curr. Opin. Oncol. 2001. - Vol. 13. - P. 477-483.

122. Martinowich, K. DNA Methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation / K. Martinowich, D. Hattori, H. Wu, S. Fouse, F.He // Science. 2003. - Vol. 302. - P. 890-893.

123. McDaid, J. Methamphetamine-induced sensitization differentially alters pCREB and AFosB throughout the limbic circuit of the mammalian brain / J. McDaid, M.P. Graham, T.C. Napier // Mol. Pharmacol. 2006. - Vol. 70, № 6. - P. 2064-2074.

124. Meehan, R. R. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs / R.R. Meehan, J.D. Lewis, S. McKay, E.L. Kleiner, A.P. Bird // Cell. 1989. - Vol. 58, № 3 p. 499-507.

125. Melvin, A.J. Hypomethylation of the interferon-gamma gene correlates with its expression by primary Tlineage cells / A.J. Melvin, M.E. McGurn, S.J. Bort, C. Gibson, D.B. Lewis // Eur. J. Immunol. 1995. - Vol. 25, № 2. - P. 426-430.

126. Mizoguchi, K. Amantadine increases the extracellular dopamine levels in the striatum by re-uptake inhibition and by N-methyl-D-aspartate antagonism / K. Mizoguchi, H. Yokoo, M. Yoshida et al II Brain Res. 1994. - Vol. 662, № 1-2.-P. 255-258.

127. Moresco, R.M. New perspectives on neurochemical effects of amantadine in the brain of parkinsonian patients: a PET (1 l)C.raclopride study / R.M. Moresco, M.A. Volonte, C. Messa et al. // J. Neural. Transm. - 2002. - Vol. 109, № 10.-P. 1265-1274.

128. Moy, L.Y. Cyclin-dependent kinase 5 phosphorylates serine 31 of tyrosine hydroxylase and regulates its stability / L.Y. Moy, L.H. Tsai // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, № 52. - P. 54487-54493.

129. Nakashima, A. Interactions between Egrl and API factors in regulation of tyrosine hydroxylase transcription / A. Nakashima, A. Ota, E.Z. Sabban // Mol. Brain Res. 2003. - Vol. 112. - P. 61-69.

130. Nan, X. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex / X. Nan, H.H. Ng, C.A. Johnson et al. // Nature. 1998. - Vol. 393. - P. 386-389.

131. Nathan, D. Histone modifications: now summoning simulation / D. Nathan, D.E. Sterner, S.L. Berger // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. - Vol. 100, № 23. -P. 13118-13120.

132. Neely, K.E. Histone acetylation and chromatin remodeling: which comes first / K.E. Neely, J.L. Workman //Mol. Genet. Metab. 2000. - Vol. 76, № 1. -P. 1-5.

133. Ng, H.H. DNA methylation and chromatin modification / H.H. Ng // Curr. Opin Genet. Dev. 1999. - Vol. 9. - P. 158-163.

134. Nowak, S.J. Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci / S.J. Nowak, V.G. Corces // Trends Genet. 2004. - Vol. 20, № 4. -P. 214-220.

135. Nyce, J.W. Drug-induced DNA hypermethylation: a potential mediator of acquired drug resistance during cancer chemotherapy / J.W. Nyce // Mutation Res.-1997.-Vol. 386.-P. 153-161.

136. Okano, M. Cloning and characterization of a family of novel mammalian. DNA (cytosine-5) methyltransferases / M. Okano, S. Xie, E. Li // Nat. Genet.- 1998.-Vol. 19, №3,-P. 219-220.

137. Okano, M. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for. de novo methylation and mammalian development / M. Okano, D.W. Bell, D.A. Hader, E. Li // Cell. 1999. - Vol. 99, № 1. - P. 247-257.

138. Okuse, K. Induction of cholinergic and adrenergic differentiation in N-18 cells by differentiation agents and DNA demethylating agents / K. Okuse, N. Mizuno, I. Matsuoka et al. // Brain Res. 1993. - Vol. 626. - P. 225-233.

139. Oswald, J. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote / J. Oswald, S. Engemann, N. Lane et al. // Curr. Biol. 2000. - Vol. 10, № 8. -P. 475-478.

140. Papanikolaou, N.A. Ability of Egrl to activate tyrosine hydroxylase transcription in PC 12 cells / N.A. Papanikolaou, E.L. Sabban // J. Mol. Chem.- 2000. Vol. 275. - P. 26683-26689.

141. Papeschi, R. Amantadine may stimulate dopamine and noradrenaline receptors / R. Papeschi // Neuropharmacol. 1974. - Vol. 13, № 1. — P. 7784.

142. Paroush, Z. Dynamics of demethylation and activation of the alpha-actin gene in myoblasts / Z. Paroush, I. Keshet, J. Yisraeli, H. Cedar // Cell. 1990. -Vol. 63, №6.-P. 1229-1237.

143. Patankar, S. A novel basal promoter element is required for expression of the rat tyrosine hydroxilase gene / S. Patankar, M. Lazaroff, S.O. Yoon, D.M. Chikaraishi // J. Neurosci. 1997. - Vol. 17, № 11. - P. 4076-4086.

144. Peeters, M. Hypersensitivity of dopamine transmission in the rat striatum after treatment with the NMDA receptor antagonist amantadine / M. Peeters, G. Page, J.M. Maloteaux, E. Hermans // Brain. Res. 2002. - Vol. 949, № 1-2. -P. 32-41.

145. Peterson, C.L. Histones and histone modifications / C.L. Peterson, M.A. Laniel // Curr. Biol. 2004. - Vol. 14. - P. 546-551.

146. Petkov, V.D. Effects of meclofenoxate, adafenoxate and citicholine on learning and memory in rats / V.D. Petkov, A.H. Mosharrof, V.V. Petkov // Psychopharmacol. 1988. - Vol. 96, № 1. - P. 44.

147. Phiel, C.J. Histone deacetylase is a direct target of valproic acid, a potent anticonvulsant, mood stabilizer and teratogen / C.J. Phiel, F. Zhang, E.Y. Huang et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 36734-36741.

148. Pradhan, S. The retinoblastoma gene product interacts with maintenance human DNA(cytosine-5)-methyltransferase and modulates it activity / S. Pradhan, G.D. Kim // EMBO J. 2002. - Vol. 21. - P. 779-788.

149. Prokhortchouk, A. The pi20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor/ A. Prokhortchouk B. Hendrich, H.

150. Jorgensen, A. Ruzov, M. Wilm // Genes Dev. 2001. - Vol. 15, № 1. - P. 1613-1618.

151. Rabey, J.M. Effecacy of memantine, an NMDA receptor antagonist, in the treatment of Parkinsonys disease / J.M. Rabey, P. Nissipeatu, A.D. Korczyn, // J. Neural. Thansm. Park. Dis. Dement. Sect. 1992. - Vol. 4. - P. 277-282.

152. Ramchandani, S. DNA methylation is a reversible biological signal / S. Ramchandani, S.K. Bhattacharya, N. Cervoni et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 6107-6112.

153. Razin, A. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing a three-way connection / A. Razin // EMBO J. - 1998. - Vol. 17. - P. 4905-4908.

154. Razin, A. DNA methylation and gene function / A. Razin, A.D. Riggs // Science 1980.-Vol. 210.-P. 604-610.

155. Ritz, M.C. Cocaine receptors on dopamine transporters are related to self-administration of cocaine / M.C. Ritz, R.J. Lamb, S.R. Goldberg, M.J. Kuhar // Science. 1987. - Vol. 237. - P. 1219-1223.

156. Robertson, K.D. DNA methylation in health and disease / K.D. Robertson, A.P. Wolffe // Nat. Rev. Genet. 2000. - Vol. 1. - P. 11 -19.

157. Robinson, T.E. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction / T.E. Robinson, K.C. Berridge // Brain Res. Rev. 1993. -Vol. 18, №3.-P. 247-491.

158. Roskoski, R. Jr. Phosphorylation of rat tyrosine hydroxylase and its model peptides in vitro by cyclic AMP-dependent protein kinase / R. Roskoski Jr., P. Ritchie // J. Neurochem. 1991. - Vol. 56. - P. 1019-1023.

159. Roth, S.Y. Histone acetyltransferases / S.Y. Roth, J.M. Denu, C.D. Allis // Ann. Rev. Biochem. -2001.- Vol. 70. P. 81 -120.

160. Salvatore, M.F. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ / M.F. Salvatore, J.C. Waymire, J.W. Haycock // J. Neurochem. -2001.-Vol. 79.-P. 349-360.

161. Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual / J. Sambrook, P. MacCallum, D. Russel // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. -2344 p.

162. Satoh, J. The constitutive and inducible expression on Nurd, a key regulator of dopaminergic neuronal differentiation, in human neural and non-neural cell lines / J. Satoh, Y. Kuroda // Neuropathology. 2002. - Vol. 22, № 4. - P. 219-232.

163. Schmitz, Y. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission / Y. Schmitz, M. Benoit-Marand, F. Gonon, D. Sulzer // J. Neurochem. 2003. -Vol. 87. - P. 273-289.

164. Seiden, L.S. Ampetamine: effects on catecholamine systems and behavior // L.S. Seiden, K.E. Sabol, G.A. Ricaurte // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -1993.-Vol. 33.-P. 639-677.

165. Semenza, G.L. Regulation of gene expression by HIF-1 / G.L. Semenza, L.A. Shimoda, N.R. Prabhakar // Novartis Found Symp. 2006. - Vol. 272. - P. 28.

166. Sheng, M. Membrane depolarization and calcium induce c-fos transcription via phosphorylation of transcription factor CREB / M. Sheng, G. McFadden, M.E. Greenberg // Neuron. 1990. - Vol. 4. - P. 571-582.

167. Singer-Sam, J. X chromosome inactivation and DNA methylation / J. SingerSam, A.D. Riggs // EXS. 1993. - Vol. 64. - P. 358-384.

168. Sousa, K.M. Microarray analyses support a role for Nurrl in resistance to oxidative stress and neuronal differentiation in neural stem cells / K.M. Sousa, H. Mira, A.C. Hall et al. // Stem Cells. 2006. - Vol. 12. - P. 511 -519.

169. Spanagel, R. Memantine-indused dopamine release in the prefrontal cortex and striatum of the rat a pharmacokinetic microdyalysis study / R. Spanagel,

170. B. Eilbacher, R. Wilke // Eur. J. Pharmacol. 1994. - Vol. 262, № 1-2. - P. 21-26

171. Stallcup, M.R. Role of protein methylation in chromatin remodeling and transcriptional regulation / M.R. Stallcup // Oncogene 2001. - Vol. 20. - P. 3014-3020.

172. St-Arnaud, R. Transcriptional coactivators potentiating AP-1 function in bone / R. St-Arnaud, I.I. Quelo // Front. Biosci. 1998. - Vol. 3. - P. 838-848.

173. Stein, R. Clonal Inheritance of the Pattern of DNA Methylation in Mouse Cells / R. Stein, Y. Gruenbaum, Y. Pollack, A. Razin, H. Cedar // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. - Vol. 79. - P. 61-65.

174. Strahl, B.D. The language of covalent histone modifications / B.D. Strahl,

175. C.D. Allis // Nature. 2000. - Vol. 403. - P. 41-45.

176. Sulzer, D. Amphetamine redistributes dopamine from synaptic vesicles to the cytosol and promotes reversy transport / D. Sulzer, T.K. Chen, Y.Y. Lau et al. //J. Neurosci.- 1995. -Vol. 15.-P. 4102-4108.

177. Sun, B. c-Fos is the essential for the response of the tyrosine hydroxylase gene to depolarization or phorbol ester / B. Sun, A.W. Tank // J. Neurochem. -2003.-Vol. 85,№6.-P. 1421-1430.

178. Sun, B. Overexpression of c-Fos is sufficient to stimulate tyrosine hydroxylase (TH) gene transcription in rat pheochromocytoma PC 18 cell / B. Sun, A.W. Tank // J. Neurochem. 2002. - Vol. 80, № 2. - P. 295-306.

179. Suzuki, T. Identification of ATF2 as a transcriptional regulator for the tyrosine hydroxylase gene / T. Suzuki, T. Yamakuni, M. Hagiwara, H. Jchinose // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 43. - P. 40768-40774.

180. Szyf, M. Cellular and viral DNA hypomethylation associated with induction of Epstein-Barr virus lytic cycle / M. Szyf, L. Eliasson, V. Mann, G. Klein, A. Razin // Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. - Vol. 82. - P. 8090-8094.

181. Szyf, M. DNA demethylation and cancer: therapeutic implications / M. Szyf, P. Pakneshan, S.A. Rabbani // Cancer Lett. 2004. - Vol. 211, № 2. - P. 133143.

182. Szyf, M. DNA methylation properties: consequences for pharmacology / M. Szyf// Trends Pharmacol. Sci. 1994. - Vol. 15, № 7. - P. 233-238.

183. Szyf, M. Towards a pharmacology of DNA methylation / M. Szyf // Trends Pharm. Sci. 2001. - Vol. 22, № 7. - P. 350-354.

184. Takahashi, T. Inhibitory effect of MK-801 on amantadine-induced dopamine release in thé rat striatum / T. Takahashi, H. Yamashita, Y.X. Zhang, S. Nakamura // Brain Res. Bull. 1996. - Vol. 41, № 6. - P. 363-367.

185. Takai, D. Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22 / D. Takai, P.A. Jones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99, № 6. - P. 3740-3745.

186. Tazi, J. Alternative chromatin structure at CpG islands / J. Tazi, A. Bird // Cell. 1990. - Vol. 60. - P. 909-920.

187. Thomassin, H. Glucocorticoid- induced DNA demethylation and gene memory during development / H Thomassin, M. Flavin, M.-L. Espinas et al. // EMBO J. 2001. - Vol. 20. - P. 1974-1983.

188. Thorne A.W. The structure of ubiguitinated histone H2B / A.W. Thorne, P. Sautiere, G. Briand, C. Crane-Robinson // J. EMBO 1987. - Vol. 6. - P. 425-479.

189. Torres, G.E. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function / G.E. Torres, R.R. Gainetdinov, M.G. Caron // Nat. Rev. Neurosci. 2003. - Vol. 4, № l.-P. 13-25.

190. Tsankova, N.M. Sustained hippocompal chromatine regulation in a mouse model of depression and antidepressant action / N.M. Tsankova, 0. Berton, W. Renthal et al. // Nat. Neurosci. 2006. - Vol. 9, № 4, P. 519-525.

191. Turker, M.S. The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells / M.S. Turker // Semin. Cancer Biol. -1999. -Vol. 9,№5.-P. 329-337.

192. Turnbull, J.F. DNA methylase: purification from ascites cells and the effect of various DNA substrates on its activity / J.F. Turnbull, R.L. Adams // Nucl. Acids. Res. 1976. - Vol. 3. - P. 677-695.

193. Turner, B.M. Histone acetylation and an epigenetic code / B.M. Turner // BioEssays. 2000. - Vol. 22. - P. 836-845.

194. Vignali, M. Distribution of acetylated histones resulting from Gal4-VP16 recruitment of SAGA and NuA4 complexes / M. Vignali, D.J. Steger, K.E. Neely, J.L. Workman // J. EMBO- 2000. Vol. 19. - P. 2629-2640.

195. Villar-Garea, A. DNA demethylating agents and chromatin-remodelling drugs: which, how and why? / A. Villar-Garea, M. Esteller // Curr. Drug Metab.-2003.-Vol. 4, № 1. P. 11-31.

196. Von Voigtlander, P.F. Dopamine: release from the brain in vivo by amantadine / P.F. Von Voigtlander, K.E. Moore // Science. 1971. - Vol. 174.-P. 408-410.

197. Wade, P.A. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation / P.A. Wade, A. Gegonne, P.L. Jones, E. Ballestar, F. Aubry // Nat. Genet. 1999. - Vol. 23. - P. 62-66.

198. Walters, C.Z. Differential distribution of CREB in the mesolimbic dopamine reward pathway / C.Z. Walters, Y.C. Kuo, J.A. Blendy // J. Neurochem.2003.-Vol. 87,№5.-P. 1237-1244.

199. Weaver, I.C. Epigenetic programming by maternal behavior / I.C. Weaver, N.Cervoni, F.A.Champagne, S. Sharma, M. Szyf et al., // Nat. Neurosci.2004. Vol. 7, № 8. - P. 847-854.

200. Weiss, A. DNA demethylation in vitro: involvement of RNA / A. Weiss, H. Cedar, I. Keshet, A. Razin // Cell. 1996. - Vol. 86, № 5. - P. 709-718.

201. Weiss, A. The role of DNA demethylation during development / A. Weiss, H. Cedar // Genes Cells- 1997. Vol. 2. - P. 481 -486.

202. Wesemann, W. Effect of 1-aminoadamantanes on the MAO activity in brain, liver, and kidney of the rat // W. Wesemann, O. Ekenna // Arzneimittelforschung. 1982. - № 32. - Vol. 10.-P. 1241-1243.

203. West, A.R. Desensitization of 5-hydroxytryptamine-facilitated dopamine release in vivo / A.R. West, M.P. Galloway // Eur. J. Pharmacol. 1996. -Vol. 298, №3.-P. 241-245.

204. Wong, M. The mechanism of histone HI cross-linking by poly(ADP-ribosylation). Reconstitution with peptide domains / M. Wong, M. Smulson, J. Allan // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259, № 12. - P. 7963-7969.

205. Workman, J.L. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation / J.L. Workman, R.E. Kingston // Ann. Rev. Biochem. 1998. - Vol. 67. - P. 545-579.

206. Worm, J. DNA methylation: an epigenetic pathway to cancer and a promising target for anticancer therapy / J. Worm, P. Guldberg // J. Oral. Pathol. Med. -2002.-Vol. 31.-P.443-449.

207. Wyczechowska, D. The effects of cladribine and fludarabine on DNA mehtylation in K522 cells / D. Wyczechowska, K.V. Fabianowska-Majewska // Biochem. Pharmacology. 2003. - Vol. 65. - P. 219-225.

208. Xie, S. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family / S. Xie, Z. Wang, M. Okano et al. // Gene. 1999. - Vol. 236, № l.-P. 87-95.

209. Yang, C. Identification and characterization of potential cis-regulatory elements governing transcriptional activation of the rat tyrosine hydroxylase gene / C. Yang, H.-S. Kim, H. Seo, K.-S. Kim // J. Neurochem. 1998. - Vol. 71.-P. 1358-1368.

210. Yang, X.-J. Class II histone deacetylases: from sequence to function, regulation, and clinical implication / X.-J. Yang, S. Gregoire // Mol. Cell. Biol. 2005. - Vol. 25. - P. 2873-2884.

211. Yoder, J.A. A candidate mammalian DNA methyltransferase elated to pmtlp of fission yeast / J.A. Yoder, T.H. Bestor // Hum. Mol. Genet. 1998. -Vol.7,№2.-P. 279-284.

212. Yoon, S.O. Isolation of two E-box binding factors that interact with the rat tyrosine hydroxylase enhancer / S.O. Yoon, D.M. Chikaraishi // J. Biol. Chem.- 1994.-Vol. 269, №28.-P. 18453-18463.

213. Zambrano, P.A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes / P. Zambrano, B. Segura-Pacheco, E. Perez-Cardenas et al. // BMC Cancer. 2005. - Vol. 5, № 1. - P. 1471-2407.

214. Zhang, L. Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting / L. Zhang, E.E. Eugeni, M.R. Parthun, M.A. Freitas // Chromosoma 2003. - Vol. 112. - P. 77-86.

Информация о работе

Садовников, Сергей Валентинович
кандидата биологических наук
Уфа, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биосинтез тирозингидроксилазы и механизмы его регулирования в клетках головного мозга крыс под действием ладастена - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы