Особенности экспрессии генов в мозге крыс в условиях неполной глобальной ишемии под действием пептидов семакс и Pro-Gly-Pro

Ставчанский, Василий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности экспрессии генов в мозге крыс в условиях неполной глобальной ишемии под действием пептидов семакс и Pro-Gly-Pro
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспрессии генов в мозге крыс в условиях неполной глобальной ишемии под действием пептидов семакс и Pro-Gly-Pro"

На правах рукописи

СТАВЧАНСКИЙ Василий Васильевич

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МОЗГЕ КРЫС В УСЛОВИЯХ НЕПОЛНОЙ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕПТИДОВ СЕМАКС И РРО-С1_У-РЯО

03.01.03 - Молекулярная биология

1 6 ОЕЗ Ш1

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005011502

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человек Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институ молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН

Дергунова Людмила Васильевна

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН

Лимборская Светлана Андреевн

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИ генетика»

Носиков Валерий Вячеславович

Ведущая организация:

Генинг Леонид Владимирович

Федеральное государственно бюджетное учреждение наук Институт биологии гена РА

Защита диссертации состоится «'О » марта 2012 г. в 14-00 часов на заседай Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научн исследовательский институт генетики и селекции промышленны микроорганизмов» по адресу: 117545, Россия, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. Тел: (495)315-3747.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФП> «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекци промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан « » февраля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование транскриптома - одна из актуальных проблем современной молекулярной биологии. Основными задачами транскриптомики, изучающей совокупность транскриптов всех генов, экспрессирующихся в какой-либо клетке или ткани в определенные моменты функционирования, - являются изучение их структуры, пространственного и временного распределения. Анализ содержания транскриптов позволяет исследовать особенности функционирования отдельных генов, оценить их степень участия в том или ином физиологическом процессе, их вовлеченность в развитие заболеваний. Особенно важен анализ транскриптома при патологических процессах, так как он не только позволяет оценить роль отдельных генов в патогенезе болезни, но и дает возможность разработки новых терапевтических подходов для ее лечения.

Одним из состояний, для которых исследование транскриптома представляет особую важность, является ишемия головного мозга, возникающая вследствие снижения мозгового кровотока и последующего дефицита кислорода и глюкозы. Церебральная ишемия вызывает драматические изменения в экспрессии генома и запускает разветвлённую систему генетических программ, от исхода которых зависит судьба нервных клеток в пораженной области. Для исследований транскриптома при ишемических процессах широко используются экспериментальные модели ишемии. С их помощью стало возможным проводить анализ изменений, происходящих в экспрессии генов - мишеней на уровне мРНК в ответ на ишемию или терапевтическое воздействие. Изменение экспрессии генов при лекарственном воздействии указывает на возможные механизмы терапевтического действия и может быть полезно для создания новых лекарств и совершенствования существующей стратегии лечения заболеваний.

семакса до конца не ясен. Ранее, в целом ряде работ было показано влияние семакса на функционирование системы нейротрофинов и их рецепторов. Нейротрофинами называют группу близких по происхождению секреторных белков - факторов роста, обеспечивающих выживание, рост и дифференцировку нейронов. Эти протеины ответственны за выбор нервными клетками генетических программ выживания/апоптоза в критических патологических условиях. Также было показано, что эти факторы, прежде всего BDNF, являются мощными природными нейропротекторами, защищающими нервные клетки от повреждающего воздействия ишемии. Анализ экспрессии нейротрофинов и их рецепторов может не только помочь в уточнении деталей патологических процессов, происходящих в ишемизированном мозге, но и оценить эффективность терапевтических процедур. На данный момент точно не известно, как в условиях глобального дефицита глюкозы и кислорода применение семакса действует на экспрессию нейротрофинов и их рецепторов в различных участках мозга. Особенно важно знать характер таких изменений во времени, прежде всего в первые часы после начала ишемии.

Принимая во внимание выраженные ноотропные свойства семакса, а также его участие в нейропротекции при ишемии, необходимо исследовать его влияние на экспрессию мРНК не только генов системы нейротрофинов, но и других генов, активно участвующих в реакции генома на ишемию. Среди них могут быть гены, белковые продукты которых участвуют в процессах воспаления, глутаматной эксайтотоксичности, пролиферации глии, программируемой смерти клеток и т.д.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение влияния препарата семакс и его С-концевого фрагмента PGP на морфологию нервной ткани и экспрессию мРНК генов нейротрофинов Ngf, Bdnf, Nt-З, рецепторов нейротрофинов TrkA, TrkB, TrkC, p75, a также генов Egrl, Cplx2, VegfA и Npylr в условиях неполной глобальной ишемии головного мозга крыс. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Провести гистологическое и иммуногистохимическое исследование головного мозга крыс в норме и в условиях выбранной модели ишемии.

2. Изучить влияние семакса и PGP на морфологию нервной ткани и пролиферативную активность клеток головного мозга крыс в норме и при ишемии.

3. Определить изменения относительного содержания мРНК генов Ngf, Bdnf, Nt-

3, TrkA, TrkB, TrkC, p75, Egrl, Cplx2, VegfA и Npylr в различных структурах мозга крыс, подвергнутых неполной глобальной ишемии, спустя 30 мин, 1, 2,

4, 8,12 и 24 ч после операции.

4. Определить изменения относительного содержания мРНК исследуемых генов под действием семакса или PGP у животных, подвергнутых ишемии.

5. Провести сравнительный анализ эффектов семакса и PGP в условиях эксперимента.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые была подробно изучена временная динамика изменений относительного содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в лобной коре, гиппокампе и мозжечке крыс, подвергнутых неполной глобальной ишемии в течение 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24ч и в присутствии пептидов семакс или PGP. В работе было показано, что действие семакса на транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов при ишемии наиболее выражено в гиппокампе - участке мозга, наиболее страдающем от недостатка кислорода и глюкозы. В гиппокампе крыс семакс способствовал активации синтеза мРНК подавляющего большинства анализируемых генов нейротрофинов и их рецепторов. Эффект препарата па экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов проявлялся уже через 15 мин после введения и был наиболее выражен спустя 12 ч после окклюзии общих сонных артерий. В рамках работы было исследовано воздействие семакса и PGP на экспрессию других генов, ответственных за важнейшие процессы жизнедеятельности клеток и являющихся возможными мишенями терапевтического действия семакса. Впервые было показано разнонаправленное влияние семакса и ишемии на содержание мРНК гена VegfA в лобных долях коры и гиппокампе крыс. Установлено, что эффекты семакса и PGP на экспрессию мРНК большинства генов в экспериментальных условиях различаются. Отличается не только набор генов, изменяющих свою экспрессию, но и временные интервалы, в которые эти изменения обнаружены, а также их продолжительность и глубина.

Впервые изучено воздействие семакса и PGP на морфологию нейронов и нейропиля в норме и в условиях неполной глобальной ишемии, а также проведена оценка пролиферативного статуса стволовых клеток мозга в этих условиях. Сравнительное морфофункциональное исследование действия семакса и PGP на головной мозг животных контрольных групп свидетельствует, что оба пептида активируют капиллярную сеть и однотипно влияют на морфологию нейронов. Показано, что из двух препаратов только семакс оказывает нейропротекторное действие, снижая выраженность ишемического повреждения нейронов и предупреждая развитие локальных очагов деструкции нервной ткани. Впервые обнаружена стимуляция семаксом пролиферативной активности клеток герминативных зон, что создает предпосылки для усиления репаративной регенерации поврежденных клеточных и тканевых структур головного мозга в условиях ишемии.

Результаты проведенного исследования эффектов семакса и PGP в условиях неполной глобачьной ишемии представляют научно-практический интерес. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследования вместе с данными о динамике изменений содержания мРНК генов нейротрофинов и их

рецепторов имеют существенное значение для выяснения механизма нейропротекторного действия семакса. Полученные результаты могут оказаться важными не только для терапевтического применения семакса, но и для анализа новых препаратов пептидной природы, обладающих ноотропными и нейропротекторными свойствами.

Кроме того, в результате работы были получены важные данные о состоянии тканей головного мозга и экспрессии целого ряда генов в условиях неполной глобальной ишемии мозга крыс. Эта модель ишемии вызывает глубокие изменения в метаболизме клеток мозга, затрагивая в той или иной степени все его участки. Полученные результаты расширяют наши представления о данной модели, что дает возможность для её использования при оценке нейропротекторных свойств новых препаратов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи и 10 материалов симпозиумов и конференций.

Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Американского Общества Генетики Человека (АБЬЮ) в 2004 и 2007 гг., Европейского Общества Генетики человека (Е8НО) 2005, 2007, 2008 и 2009 гг., на Российском симпозиуме «Белки и пептиды» в 2007 г., съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г., VI Съезде Российского общества медицинских генетиков, изложены на конкурсе работ на стипендию фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, ИМГ РАН, 2007 г). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 23 января 2012 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 25 января 2012 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 249 источников, среди которых 26 источников отечественной и 223 источника зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на \Ч£ страницах машинописного текста и содержат 16 таблиц и 16 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Исследования выполнены на самцах крыс (п=84) линии \Vistar 2-х месячного возраста массой около 200 г, которые содержались в условиях естественного

освещения и свободного доступа к еде и воде. Необратимую двустороннюю окклюзию общих сонных артерий (модель «неполная глобальная ишемия мозга») проводили стандартно: под эфирным наркозом через срединный разрез мягких тканей передней поверхности шеи выделяли обе общие сонные артерии и одновременно перевязывали их шелковой лигатурой (Яковлева и соавт., 1999). Операция занимала не более 5 мин. Через 15 мин после легирования сосудов крысам внутрибрюшинно вводили одно из веществ: семакс, пептид Pro-Gly-Pro (PGP) или физраствор. В качестве контроля для ишемизированных (ишем.) крыс, получавших физраствор, использовали ложнооперированных (л/о) крыс. Таких животных под наркозом подвергали аналогичной операции, но, выделив общие сонные артерии, разрезанные ткани ушивали без легирования сосудов. В качестве препарата им вводили физраствор. Таким образом, все крысы были распределены на четыре группы: л/о животные с введенным физраствором, ишем. животные с введенным физраствором, ишем. животные, получавшие семакс и ишем. животные, получавшие PGP. Каждая группа в свою очередь была распределена на временные подгруппы: животных выводили из эксперимента через 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после окклюзии. В каждой подгруппе было не менее 3 животных. Дополнительное введение препаратов животным, не выведенным из эксперимента, проводилось через 1, 2, 4 и 8 ч после наложения лигатур (рис. 1).

ГРУППА ВВЕДЕ ННОЕ В ЕЩЕСТВО

ложнооперированные физраствор

ишемизированные физраствор

ишемизированные + семакс семакс

ишемизированные + PGP PGP

на о.5ч

-п1ч

-©2ч

1 -декапитация

| -инъекция

-а 4ч

семакс - 10 мкг/100 г PGP - 3,75 мкг/100 г

-:„;8ч

-J 12 ч

-124ч

15мин

1час

4ч

8ч

Рисунок 1. Схема эксперимента.

Семакс применяли из расчета 10 мкг/100 г; PGP - 3.75 мкг/ЮО г веса крысы. Крыс декапитировали под действием эфириого наркоза. Для гистологических исследований использовали срезы тканей мозга крыс, подвергнутых глобальной ишемии спустя 30 мин и 24 ч после окклюзии и введения препаратов. Кроме того, для более точного анализа действия пептидов были добавлены дополнительные контрольные группы: интактные и л/о животные которым вводили семакс или PGP.

Анализ уровня мРНК исследуемых генов в отделах мозга крыс проводили с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. (Bustin, Nolan, 2004). В качестве референсного гена использовался ген Gapdh, по отношению к количеству мРНК которого нормировалось содержание исследуемых транскриптов. Определение относительного уровня мРНК исследуемого гена и статистическая обработка данных проводилась с помощью программы REST (Relative Expression Software Tool), которая определяет достоверность различий между опытными и контрольными группами с помощью критерия рандомизации (Pfaffl et all., 2001, 2002). Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.

Гистологическое и гистохимическое исследование срезов мозга крыс

Сравнительное морфофункциональное исследование действия семакса и PGP на головной мозг животных контрольных групп (т.е. групп без ишемии - с ин гактными и л/о животными) свидетельствовало, что оба пептида активировали капиллярную сеть и однотипно влияли на морфологию нейронов. На рис. 2 изображена ткань таламуса у животных без введения пептидов (рис. 2, А) и через 15 минут после применения семакса (рис. 2, Б). На рис. 2, В можно наблюдать раскрытие капилляров в полиморфном слое коры под действием семакса. Принципиальных различий в действии семакса и PGP нами не обнаружено. Влияние пептидов было однонаправленным и сопровождалось повышением содержания базофильной субстанции в цитоплазме нейронов и похожими микроструктурными изменениями нейроииля. Не исключено, что семакс и PGP однонаправленио влияют на некоторые нейрометаболические и секреторные процессы в головном мозге. Однако в ранний период после применения семакс более эффективно влиял на экспрессию белка PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), тогда как PGP оказывал более пролонгированное действие на изменение нейропиля и повышение содержания базофильной субстанции в крупных нейронах. Необходимо отметить, что в настоящее время для изучения функциональной морфологии и оценки пролиферативного статуса клеток широко применяют иммуногистохимическое выявление ядерных белков, принимающих участие в подготовке клеточного деления (Iatropoulos, Williams, 1996).

К числу таких надежных маркеров относится PCNA, который широко используют для изучения процессов репарации и нейрогенеза в нервной системе (Johnson et al., 2004; Цыб и др., 2009). Судя по усилению экспрессии этого белка в ядрах клеток мозга контрольных животных, семакс оказывает стимулирующее

■ „ , Ш „иШШ Щ

** " Ж. * ,

в® ® к - £ т * у с

»V • щ* - ...

' ' • ЯМНЮ :> оШ ~

• г

* •«• щ*. * V- -

4 'Л . ' 4 а»

1 * ,.^ * > • 1 г V / у# *' / *

* ^ 'V ^Л • Л

* . I' у ' ' ■ **

* > ' * « А» ' \ • ч • I

Рисунок 2. Гистологическое исследование тканей мозга в условиях эксперимента.

А - морфология нейронов таламуса здоровых животных. Б - увеличение плотности капилляров в таламусе через 15 мин после введения семакса здоровым животным. В - раскрытие капиллярной сети в полиморфном слое коры через 15 мин после введения семакса здоровым животным. Г - морфология нейронов наружного зернистого слоя коры здоровых животных. Д - ишемическое повреждение нейронов наружного зернистого слоя коры через 30 минут после окклюзии сосудов. Е -ишемическое повреждение нейронов наружного зернистого слоя коры через 30 мин после окклюзии сосудов и введения семакса (живые клетки указаны стрелками). Гематоксилин-эозин. Об х280.

влияние на пролиферативный потенциал репопулирующих элементов нервной ткани. У крыс с острым нарушением мозгового кровообращения, вызванного двусторонней перевязкой сонных артерий, ишемические повреждения нервной ткани проявляются на фоне сосудистых нарушений. При микроскопическом исследовании обращали внимание стаз (застой) крови в капиллярах, заполнение расширенных венул агрегированными эритроцитами, появление очагов отека нейропиля и тяжей гиперхромных нейронов с перицеллюлярным отеком. По сравнению со здоровыми животными (рис. 2, Г) в коре лобно-теменной области мозга определялись очаговые ишемические повреждения нейронов (рис. 2, Д). У ишем. крыс, получавших семакс, через 30 мин. после окклюзии сосудистые нарушения менее выражены, чем у животных на фоне введения физраствора. Наряду с суправитально измененными «темными» клетками определялись сравнительно небольшие локусы ишемически поврежденных нейронов (рис. 2, Е). Через 24 ч поражение головного мозга прогрессирует от небольших локусов поврежденных нейронов до диффузных очагов ишемического инсульта с глубокими деструктивными изменениями и гибелью нервных клеток. В настоящее время считается, что среди многочисленных идентифицированных механизмов критическую роль в ишемическом повреждении мозга играют следующие факторы: избыточная активация глутаматных рецепторов, накопление внутриклеточных катионов кальция; избыточная выработка свободных радикалов, а также индукция апоптоза. Есть основания считать, что прерывание распространения патологических каскадов позволит защитить, по крайней мере, часть мозговой ткани (Cheng et al„ 2004). Теоретически нейропротектор должен быть антагонистом сразу нескольких повреждающих факторов (Ginsberg, 2003).

Результаты проведенных нами исследований позволяют заключить, что в остром периоде формирования ишемии из двух изученных пептидов только семакс оказывает нейропротекторное действие, снижая выраженность ишемического повреждения нейронов и предупреждая развитие локальных очагов деструкции нервной ткани. Защитное действие семакса на нервную ткань может реализовываться несколькими путями. Во-первых, в условиях нарушения мозгового кровообращения гистологически регистрируемым действием семакса в нашем эксперименте являлось снижение признаков сосудистого стаза. Согласно имеющимся данным, антитромботическое и антикоагуляционное действие семакса может играть существенную роль в условиях ишемического повреждения (Ашмарии и др., 2005). Препятствуя агрегации эритроцитов и развитию нарушений кровообращения в микроциркуляторном русле при снижении перфузии крови в мозге, семакс, по-видимому, способствует усилению оксигенации нервной ткани и предупреждает дальнейшее развитие вторичных деструктивных реакций. Во-вторых, усиление экспрессии PCNA в ядрах зпендимоцитов, нейроглии и эндотелия сосудов после введения семакса животным как контрольных, так и опытных групп

свидетельствует о пролиферотропном (влияющим на клеточное деление) действии этого пептида на клетки, принимающие непосредственное участие в трофическом обеспечении нервной ткани. Примечательно, что усиление экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток регистрировалось уже через 15 мин после введения семакса как в контроле, так и в остром периоде нарушения мозгового кровообращения. Есть основания полагать, что семакс влияет на экспрессию генов раннего реагирования и тем самым запускает каскады сигнальной транедукции, стимулирующие в том числе и пролиферацию клеток. И, наконец, немаловажное место может иметь трофическое действие этого пептида за счет воздействия на экспрессию генов факторов роста, обеспечивающих жизнедеятельность клеток, непосредственно принимающих участие в регуляции гомеостаза нервной ткани.

Несмотря на однонаправленное влияние семакса и PGP на капиллярную сеть, пролиферативную активность клеток и морфологию нейронов, в раннем периоде нарушения мозгового кровообращения нейропротекторного свойства PGP мы не обнаружили. В отличие от семакса стимулирующие действие PGP на активацию пролиферации прогениторных клеток выявлялось в более поздние сроки. Учитывая эти особенности действия PGP, нельзя исключить возможный отсрочено-пролонгированный эффект данного пептида на мобилизационно-адаптационные и репаративные процессы в нервной ткани.

Аналнз экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге крыс с ишемией

Ишемия вызывает изменения функционирования большого числа генных семейств (Гусев, Скворцова, 2001). Клеточный ответ при ишемии представляет собой сложное взаимодействие конкурирующих генетических программ, отвечающих за выживание и гибель нервных клеток. В связи с этим встает вопрос всестороннего изучения экспрессии генов при ишемии. Одним из подходов является анализ содержания мРНК в различных областях ишемизированного мозга через определенные интервалы времени, который позволяет оценить участие тех или иных генов-мишеней в механизмах церебральной ишемии. Экспрессию мРНК генов нейротрофинов Bdnf, Nt-3, Ngf и рецепторов нейротрофинов TrkA, TrkB, TrkC и р75 анализировали в лобной коре, мозжечке и гиппокампе крыс в течение суток спустя разные промежутки времени после окклюзии общих сонных артерий. В качестве контроля использовали л/о животных. В мозжечке изменялась экспрессия мРНК небольшого числа генов. Экспрессия гена Nt-З снижалась через 2 ч, а гена Bdnf через 8 и 12 ч после операции. Наряду с этим отмечалось повышение уровня мРНК ТгкС (2 ч), увеличение экспрессии генар75 через 2 ч, а затем снижение через 24 ч. В лобной коре были выявлены изменения экспрессии большего числа генов, в основном, рецепторов нейротрофинов. При этом отмечалось как снижение, так и повышение относительного содержания мРНК (табл. 1).

Таблица I. Анализ изменения содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в лобной коре крыс при неполной глобальной ишемии и приеме пептидов. Цифры отражают, во сколько раз отличается относительный уровень транскриптов указанного гена в мозге опытных животных с ишемией от такового у контрольных крыс. Цветом выделены значения, отражающие положительный характер изменения экспрессии. Представлены только статистически достоверные различия (р<0.05).

0.5ч 1ч 24 4ч 8ч | 12ч 24ч

ишемия (конт роль: л/о+физраствор)

Ngf

Bdnf

Nt-3 0.47 ± 0.13

ТгкА 0.72 ±0.10 1.48 + 0.23 1.62 + 0.20

ТгкВ 2-7(0 + 0.59

ТгкС 1.71+0.33 0.76 ± 0.09

р75 0.55 + 0.07 0.38 + 0,12

ишемия+семакс (контроль: ишемия+физраствор)

Ngf

Bdnf

Nt-3 0.55 + 0.10 1.71 +0..-9

ТгкА 0.59 + 0.11

ТгкВ 0.48 ± 0.11 0.48 + 0.10 0.61 +0.11

ТгкС 0.43 ± 0.06

Р75 0.3 ± 0.09 0.42 ± 0.16

ишемия+PGP (конт роль: ишемия+физраство Р)

Ngf 0.46 ± 0.10

Bdnf 1.56 ±0.24 0.47 + 0.07

Nt-3 0.69 + 0.1 0.56 + 0.07 2.55 + 0.73

ТгкА 0.58 + 0.1 1.44 ±0.22

ТгкВ 3.161 0.61 2.43 + 0 32

ТгкС 1.39 ± 0.17 1.98 ±0.61

Р75 1,93 + 0.35

Наиболее заметно ишемия подействовала на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в гиппокампе (табл.2). Снижение относительного содержания мРНК Nt-3, ТгкВ, ТгкС, р75 и ТгкА наблюдалось уже в течение первого часа после окклюзии, а через 8 и 12 ч отмечено значительное снижение экспрессии большинства

анализируемых генов. При этом через 1 ч после окклюзии в ответ на ишемию в гиппокампе крыс существенно (более чем в 3 раза относительно контроля) вырос

Таблица 2. Анализ изменения содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в гиппокампе крыс при неполной глобальной ишемии и приеме пептидов. Цифры отражаю!, во сколько раз отличается относительный уровень транскриптов указанного гена в мозге опытных животных с ишемией от такового у контрольных крыс. Цветом выделены значення, отражающие положительный характер изменения экспрессии. Представлены только статистически достоверные различия р<0.05.

0.5ч 14 2ч 4ч 8ч 12ч 24ч

ишемия (конт роль: л/о+физраствор)

Ngf 1.60 + 0.15 0.47 ±0.10 0.55 ±0.07

Bdnf 3.26 ± 0.43 0.44 ±0.08 0.26 ± 0.04

Nt-3 0.62 ±0.10 0.49 ± 0.05 0.56 ±0.11 0.39 ±0.06

TrkA 0.55 ± 0.06 0.71 + 0.08 2.39 + 0.22 0.31 ±0.05 0.36 ± 0.06 2.25 + 0.28

TrkB 0.45 ±0.03

TrkC 0.62 ± 0.05 0.73 ± 0.07 1.70 ±0.15 0.55 ±0.08 0.51 ±0.07 1.40 + 0.11

p75 0.51 ±0.05 0.59 ±0.10

ишемия+семакс (контроль: ишемия+физраствор)

Ngf 1.70 ±0.19 2.81 ±0.26

Bdnf 2.43 ± 0.30 2.03 ± 0.14 1.30 +0.13 3.63 ± 0.4

Nt-3 1.87 ± 0.20 3.07 + 0.43

TrkA - 0.63 + 0.09 3.76 ± 0.50 0.39 ± 0.02

TrkB 2.41 ± 0.20 0.70 ± 0.07

TrkC 1.93 + 0.27 1.72 + 0.21

p75 3.03 ± 0.24 2.97 ± 0.83 1.80 + 0.19

Ngf ишемия+PGP (конт роль: ишемия+физраство Р)

0.69 ±0.04 1.35 ±0.19

Bdnf 1.44 ±0.19

Nt-3 0.38 ±0.05 1.82 ±0.37 2.15 ± 0.32 2.76 ±0.14

TrkA 0.46 + 0.06 1.93 + 0.27 0.63 + 0.03

TrkB 1.93 ±0.26 0.79 + 0.11 1.62 ± 0.23

TrkC 0.65 ± 0.08 1.48 ±0.26

p75 2.57 ± 0.27 2.13 + 0.17

уровень мРНК Bdnf. Описанное в других работах увеличение экспрессии гена Bdnf в ответ на ишемию связывали с репаративно-адаптационными процессами, протекающими в повревденной ткани головного мозга (Kokaia. 1998; Lee, 2002).

Снижение уровня экспрессии одних генов и увеличение других, вероятно, обусловлено сочетанием повреждающих и адаптационных процессов, происходящих в мозге после повреждения. Минимальные изменения, выявленные в мозжечке, были обусловлены тем, что в этом участке мозга в условиях неполной глобальной ишемии кровоснабжение осуществляется за счет базиллярной артерии (Н'щисМ е1 а1, 1997). В использованной нами модели, наиболее выраженные изменения экспрессии генов наблюдались в гиппокампе. Полученные данные согласуются с мнением, что в условиях глобальной ишемии именно эта область мозга в наибольшей степени страдает от недостатка кислорода и глюкозы (БгеЪег е1 а!., 1995; Нагикип, ВкапЬт], 2006).

Влияние семакса на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в головном мозге крыс, подвергнутых действию неполной глобальной ишемии

Семакс вводили крысам внутрибрюшинно через 15 мин, 1, 4 и 8 ч после наложения лигатур на общие сонные артерии. В качестве контроля использовали животных с ишемией, получавших физраствор. Такое сравнение позволяет обнаружить эффект пептида на экспрессию мРНК выбранных генов у ишем. животных. В условиях эксперимента под воздействием семакса относительное содержание мРНК ТгкА в мозжечке снижалось через 8 ч, а мРНК Вс1п/ -увеличивалось через 12 ч после окклюзии. Кроме того, наблюдалось разнонаправленное действие этого пептида на экспрессию гена р75. Через 2 ч она снижалась, а через 8 ч превышала показатели в контроле. Таким образом, в мозжечке крыс введение семакса оказало незначительное влияние на экспрессию выбранных генов. В лобной коре крыс, подвергнутых ишемии, введение семакса не влияло на уровень мРНК и но приводило к снижению экспрессии гена N1-3 почти в 2 раза через 1 ч и увеличению в 1.7 раза через 24 ч после окклюзии. Большая часть изменений в лобной коре крыс, получавших семакс, выражалась в более низком уровне мРНК рецепторов нейротрофинов по сравнению с ишем. животными, получавшими физиологический раствор (табл. 1). Можно отметить, что в двух случаях (ТгкВ через 8 ч и ТгкА через 12 ч после операции) семакс снизил влияние ишемии на активацию экспрессии этих генов в указанные промежутки времени. Кроме того, обращает на себя внимание снижение уровня мРНК рецепторов нейротрофинов ТгкВ и ТгкС более чем в два раза по сравнению с контролем уже через 30 мин после окклюзии и спустя всего 15 мин после введения семакса. Через 1 ч после окклюзии отличий в уровне экспрессии этих генов между контрольными и опытными животными не обнаружено, что говорит о непродолжительности данного эффекта семакса в лобной коре. Данные, полученные с помощью радиорецепторного метода, говорят, что места возможного рецепторного связывания семакса локализованы по большей части в гиппокампе и мозжечке, но пе в коре головного мозга (Въюноеа и соав., 2006, Шевченко и соавт., 2006). Эти результаты наводят на мысль о возможной причине непродолжительности действия

семакса в этом отделе мозга. Кроме того, снижение содержания мРНК рецепторов нейротрофинов может быть обусловлено лиганд-рецепторным взаимодействием нейротрофинов и их рецепторов в первые 30 мин неполной глобальной ишемии мозга у крыс, получавших семакс.

При введении семакса наиболее заметные изменения б экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов наблюдались в гиппокампс, и в подавляющем большинстве случаев это было усиление экспрессии (табл. 2). Как свидетельствуют наши результаты, наиболее существенным было повышение экспрессии гена Bdnf. Можно отметить 2-3-кратное увеличение активности этого гена, ранее начало, а также продолжительность действия семакса. Имеются многочисленные данные, что нейротрофины, прежде всего BDNF, положительно влияют на состояние нервной ткани при ишемии. Уровень белка BDNF тесно коррелирует с устойчивостью к ишемичсскому повреждению различных областей головного мозга (Zhang, 2001; Almeida, 2005). Таким образом, активация экспрессии мРНК Bdnf пая воздействием семакса может обеспечивать защиту и выживание клеток гиппокампа при ишемии. Введение семакса животным в условиях ишемии приводило к заметному увеличению в гиппокампе уровня экспрессии и других генов нейротрофинов. Так, экспрессия гена Nt-3 увеличивалась через 1 и 12 ч, а гена Ngf-через 12 и 24 ч после наложения лигатур. Следует отметить, что наиболее высокий уровень мРНК нейротрофинов под действием семакса детектировался спустя 12 ч после окклюзии сосудов, когда в гиппокампе контрольных животных, подвергнутых ишемии, наблюдалось максимальное подавление экспрессии этих генов (табл. 2). Уровень экспрессии генов рецепторов нейротрофинов в гиппокампе ишем. крыс, получавших семакс, изменялся не так однозначно, как генов нейротрофинов. При этом в ряде случаев повышение активности генов рецепторов предшествовало увеличению экспрессии генов соответствующих нейротрофинов. Так, через 30 мин после операции возрастала экспрессия мРНК гена ТгкВ, спустя час после окклюзии - гена Bdnf, а вслед за увеличением экспрессии генов ТгкЛ и ТгкС (8 ч после окклюзии) наблюдалась активация соответствующих им генов Ngf и Nt-3 (12 ч после окклюзии) (табл. 2). Взаимодействуя с высокоаффинными рецепторами Trk, нейротрофины способствуют реализации программы выживания нервных клеток, а также усилению трофического действия, обеспечению синаптогенеза и нейропластичности на клеточном уровне. Поэтому коэкспрессия нейротрофинов и их рецепторов рассматривается как мощнейший механизм нейропротекции при ишемии. Наши результаты показали, что семакс индуцирует экспрессию мРНК генов 'нейротрофинов и рецепторов нейротрофинов, подавленную при ишемическом повреждении, и, таким образом, создает условия для выживания нейронов. Под действием семакса при ишемии в гиппокампе активировалась экспрессия гена р75: содержание его мРНК возрастало через 2, 4 и 12 ч после наложения лигатур (табл. 2). Показано, что функционирование этого рецептора во многом зависит от

гуморальных факторов и клеточного окружения. Так, его активация под действием предшественников нейротрофинов может вызывать апоптоз, тогда как взаимодействие с рецепторами Trk в присутствии нейротрофинов, наоборот, обеспечивает выживание нервной клетки (Huang, Reichardt, 2001, 2003). Следовательно, и снижение, и увеличение экспрессии мРНК этого рецептора в зависимости от условий может быть как благоприятным, так и негативным фактором для процессов восстановления нервной ткани от последствий ишемии.

Таким образом, в гиппокампе крыс в условиях ишемии семакс способствовал активации синтеза мРНК подавляющего большинства анализируемых генов. Проведенный ранее поиск мест связывания семакса на цитоплазматической мембране показал, что этот препарат специфически связывается с мембранами мозжечка и гиппокампа, тогда как в базальных ганглиях и коре головного мозга мест специфического связывания не обнаружено. Можно предположить, что активация экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов в гиппокампе крыс под действием семакса обусловлена специфическим связыванием его с рецепторами, локализованными на мембранах клеток гиппокампа. Ранее было показано, что в условиях фокальной ишемии мозга крыс, вызванной окклюзией средней мозговой артерии, наблюдается стимуляция семаксом экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов в участке лобной коры, включающем очаг ишемии (Dmitrieva et al, 2010). По всей вероятности, семакс активирует экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов преимущественно в том участке мозга, где она наиболее подавлена. В использованной нами модели ишемии наибольшее повышение относительной экспрессии генов под действием семакса было обнаружено именно в гиппокампе, где ишемическое повреждение приводило к подавлению экспрессии изучаемых генов.

Влияние PGP на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в головном мозге крыс, подвергнутых ишемии

Для анализа воздействия PGP иа уровень экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов в мозге животных использовали животных с ишемией, получавших физраствор. В лобной коре и гиппокампе при введении PGP, как и при введении семакса, изменялась экспрессия большого числа генов, однако эффект этих пептидов совпал лишь частично (табл. 1, 2). Под действием PGP в лобной коре крыс изменения проявлялись преимущественно в первые часы после операции и выражались в активации транскрипции ряда генов (Bdnf, ТгкВ, ТгкС, р75). В гиппокампе основные изменения экспрессии генов нейротрофинов и их рецепторов, вызванные PGP, были выявлены преимущественно через 4 ч после окклюзий и далее. Вслед за снижением экспрессии ряда генов (Ngf, Nt-3, ТгкА через 4 ч и ТгкВ, ТгкС через 8 ч), спустя 12 ч после операции под действием PGP усиливалась экспрессия всех проанализированных генов. Важно отметить, что в гиппокампе ишем. крыс, защитное действие PGP, включающее в себя активацию генов

нейротрофинов и их рецепторов, проявилось преимущественно через 12 ч после окклюзии сосудов.

Как известно, семакс достаточно быстро деградирует под действием эндогенных пептидаз. Пептид PGP, защищающий молекулу семакса от деградации, является источником наиболее стабильных продуктов деградации семакса - дипептидов PG и GP. Логично предположить, что часть эффектов семакса обусловлена за счет PGP. В работах, посвященных изучению эффектов семакса и PGP в системе in vitro, нейропротекторные свойства PGP наблюдались в культурах нервных клеток в условиях окислительного стресса и глутаматной токсичности (Мартынова и соав., 2009; Сторожевых и соав., 2007). По нашим данным, несмотря на выявленное совпадение отдельных эффектов семакса и PGP на экспрессию ряда исследованных генов, в большинстве случаев пептиды обладают разными свойствами (табл. 1, 2). Наиболее заметно эти различия детектируются в первые часы ишемии. По сравнению с семаксом для пептида PGP характерца более выраженная активация экспрессии мРНК рецепторов нейротрофинов в клетках лобной коры крыс и менее выраженная в гиппокампе. Эти данные являются результатом действия сразу нескольких важных свойств пептидов. Во-первых, связывание семакса более эффективно протекает в тканях гиппокампа, а не в лобной коре и, во-вторых, продукты деградации PGP имеют бблыную стабильность. Мы не обнаружили выраженного нейропротекторного действия PGP при гистологическом исследовании. В отличие от семакса PGP не влиял на уровень мРНК Bdnf в первые часы ишемии в гиппокампе. Кроме того, пептид PGP обладает определенной активностью в отношении экспрессии некоторых из изученных генов. Например, увеличение содержания мРНК гена ТгкВ наблюдалось во всех тканях. Спустя 12 ч после окклюзии под воздействием PGP так же, как и при введении семакса, в гиппокампе животных выявлено увеличение экспрессии мРНК большинства исследованных нами генов нейротрофинов и их рецепторов. Однако амплитуда этих изменений была больше под влиянием ссмакса.

Анализ экспрессии мРНК генов VeefA, Eerl, Cpbc2 и Nyylr

В целях исследования молекулярного механизма действия семакса и PGP, наши исследования были дополнены изучением особенностей функционирования нескольких других генов, активно экспрессирующихся в мозге. Одним из критериев выбора анализируемых генов являлось участие их белковых продуктов в патогенезе ишемии и возможном терапевтическом эффекте семакса при воздействии на экспрессию этих генов. В число исследованных нами генов вошли VegfA, Egrl, Cplx2 и Npylr.

VEGF-A - один из членов семейства структурно близких между собой белков, которые являются лигандами для семейства рецепторов VEGF. Этот сигнальный протеин известен, прежде всего, как фактор, индуцирующий активный рост клеток эндотелия, формирование новых капилляров и выживание незрелых кровеносных

сосудов (Ferrara el al., 2003). Активация транскрипции VegfA является важной частью скоординированного ответа генома на ишемию. Способность VEGF-A стимулировать ангиогенез и оказывать прямые нейротрофические эффекты делает его подходящей мишенью для терапевтического воздействия при ишемии. Однако имеются сведения, что кроме адаптационного действия на отсроченные процессы ангиогенеза и васкуляризации в ишемизированном мозге, этот фактор принимает участие в ранних патологических процессах воспаления и отека мозга (Zhang et al., 2000; Ribatti, 2005). Механизмы увеличения проницаемости сосудов и активации микроглии, которые запускаются при ангиогенезе, в момент острого развития ишемии оказывают негативное действие на состояние нервной ткани (Ма et al., 2011). Наши результаты показали, что ишемия вызывает значительное и продолжительное увеличение экспрессии мРНК VegfA в гиппокамие и лобной коре крыс (табл. 3, 4).

Таблица 3. Анализ изменения содержания мРНК генов VegfA, Egrl, Npylr и CpLx.2 в лобной коре крыс при неполной глобальной ишемии и приеме пептидов. Цифры отражают, во сколько раз отличается относительный уровень транскриптов указанного гена в мозге опытных животных с ишемией от такового у контрольных крыс. Цветом выделены значения, отражающие положительный характер изменения экспрессии. Представлены только статистически достоверные различия р<0.05.

0.5ч 1ч 2ч 4ч 8ч 12ч 24ч

ишемия (контроль: л/о+физраствор)

VegfA 2.52 ± 0.46 2.52 ± 0.40 3.00+ 0.43

Egrl 0.63 ± 0.03 1.78 ± 0.33 0.37 + 0.07 0.58 ±0.08

Npylr

Cplx-vi 1.92 ± 0.22 0.16 + 0.02

Cplx-v2 0.33 + 0.04

ишемия+семакс (контроль: ишемия+физраствор)

VegfA 0.48 ± 0.09 0.55 + 0.08 0.52 + 0.12

Egrl 2.12 + 0.31 0.42 ± 0.04

Npylr

Cplx-vi 1.42 + 0.10 0.27 ± 0.03 1.80 ± 0.2

Cplx-v2 ' S6 + 0 1.70 ± 0.11 0.59 + 0.05

ишемия+PGP (контроль: ишемия+физраствор)

VegfA 0.57 ± 0.10

Egrl 1.77 + 0.14 0.30 + 0.02 2.0 + 0.32

Npylr 1.52 ±0.09

Cplx-vl 0.50 ± 0.05 1.53 ± 0.11 0.32 + 0.02 2.14 + 0.42 1.63+0.16

CplX'V2 0.52 + 0.04 1.72 ±0.25

Таблица 4. Анализ изменения содержания мРНК генов Уед/А, Е§г1, 1Уру1г и Ср!х2 в гиппокампс крыс при неполной глобальной ишемии и приеме пептидов. Цифры отражают» во сколько раз отличается относительный уровень транскриптов указанного гена в мозге опытных животных с ишемией от такового у контрольных крыс. Цветом выделены значения, отражающие положительный характер изменения экспрессии. Представлены только статистически достоверные различия р<0.05.

0.5ч 1ч 2ч 4ч 8ч I 12ч 24ч

ишемия (контроль: л/о+физраствор)

VegfA 2.70 ± 0.20 1.S1 ±0.20

Egrl 0.54 + 0.06 2.01 + 0.12 0.26 + 0.03

Npylr 0.43 ± 0.05

Cplx-vl 0.46 ± 0.09 0.23 ±0.03

Cplx-v2 0.56 ±0.05 0.33 ± 0.07 0.50 ± 0.05

ишемия+семакс (контроль: ишемия+физраствор)

VegfA 0.59 + 0.08 0.19 ±0.02 3.84 + 0.40

Egrl 1.81 ±0.16 0.57 ± 0.07 4.01 + 0.17

Npylr 2.16 + 0.3 1.64 ±0.17

Cplx-vl 0.51+0.06 2.8 ± 0.24

Cplx-v2 1.87 + 0.18

ишемия+PGP (контроль: ишемия+физраствор)

VegfA

Egrl 0.27 ± 0.04 2.27 + 0.12 0.49 ± 0.06

Npylr 2.13 + 0.27 1.78 ±0.15 0.44 ± 0.05 0.58 ±0.05

Cplx-vl 0.41 + 0.03 1.94 + 0.17 2.01 ± 0.4?

Cplx-v2 0.60 + 0.06

Увеличение относительного содержания мРНК VegfA у крыс с ишемией наблюдали через 4 и 8 ч после окклюзии. Под воздействием семакса в нашем эксперименте было обнаружено снижение содержания мРНК VegfA в гиппокампе и лобной коре (табл. 3, 4). Следует отметить, что влияние семакса на экспрессию мРНК VegfA являлось одним из наиболее выраженных среди эффектов, выявленных нами. Таким образом, можно предположить, что один из путей терапевтического действия семакса связан с влиянием на функционирование системы диганда VEGF-A и его рецепторов. Эффект семакса на экспрессию мРНК VegfA можно охарактеризовать как нормализующий: семакс препятствовал увеличению содержания мРПК VegfA, вызванного ишемией и, таким образом, приближал его к уровню мРНК этого гена у л/о животных. Введение PGP практически не оказало значительного влияния на содержание транскриптов этого гена. Это может говорить о том, что действие

семакса на экспрессию VegfA скорее всего опосредованно структурной частью семакса, ведущей свое происхождение из АКТГ (4-7).

Транскрипционный фактор EGR1 (early growth response 1) относится к белкам, участвующим в регуляции клеточного цикла и дифференцировки. Основная особенность экспрессии этого белка заключается в быстром ответе на стимулы, такие как ишемия, гипоксия и стресс (Revest, 2005; Tureyen et al., 2008). Кроме того, изменения экспрессии Egrl связывали с процессами обучения, консолидации и формирования долговременной памяти, синаптической пластичности и пролиферации (Bozon et al, 2003; Cheval et al, 2011). Транскрипционный фактор EGR1 активирует экспрессию целого ряда генов, белковые продукты которых принимают участие в процессе воспаления, являющегося одной из основных причин отсроченной гибели нейронов при ишемии (Vemuganti et al., 2007; Tureyen, 2008). Наши результаты показывают, что процессы активации\дезактивации транскрипции этого гена в структурах лобной коры и гиппокампа претерпевают многократные изменения в течение эксперимента (табл. 3, 4). Возможно, это связано с чередованием во времени процессов развития ишемических нарушений и адаптационной компенсации. Кроме того, известно, что пик экспрессии этого гена в ответ на стимул формируется очень быстро, уже в течение первых 30 мин, и также быстро может затухать (Sukhatme et al, 1988; Yan, 2000). Такие резкие изменения экспрессии, по-видимому, лежат в основе резких колебаний уровня мРНК этого гена в нашем эксперименте. Можно отметить, что количество зафиксированных статистически значимых изменений относительного уровня мРНК Egrl было максимальным по сравнению с другими изученными генами. Аналогичная картина наблюдается при введении ишем. животным пептидов семакс и PGP. Оба пептида в течение суток вызывали разнонаправленные изменения относительного содержания мРНК Egrl в лобной коре и гиппокампе животных. Полученные данные говорят о том, что пептиды воздействуют на экспрессию гена Egrl при ишемии в лобной коре и гиппокампе, однако сложно говорить о характере и значимости этого влияния. По-видимому, необходимо провести дополнительные исследования генов, транскрипция которых активируется посредством EGR1.

Рецептор NPY1R относится к большому семейству рецепторов, ассоциированных с G-белком. Ген, кодирующий его аминокислотную последовательность, обладает высоким уровнем экспрессии в тканях головного мозга. Участие рецептора NPY1R в процессах ишемии в настоящий момент недостаточно изучено. Связываясь со своим лигандом - нейропептидом Y, этот рецептор способен обеспечивать пресинаптическое ингибирование высвобождения нейротрансмиттеров в центральной и периферической нервной системе, вазоконстрикцию, а также физиологические эффекты в ЦНС - поиск пищи и уменьшение чувства страха (Lundberg, 1996; Wettstein et al., 1995). С точки зрения нашего исследования, наиболее интересны эффекты активации этого рецептора на

пролиферативную активность в субвентрикулярной зоне, хемокинез, функционирование сосудов, а также его противоэксайтотоксические свойства (Decressac et al, 2009; Thiriet et al, 2011). Обнаружено, что активация рецептора NPY1R усиливает ишемическое повреждение у крыс с фокальной ишемией путем избыточного синтеза NO (Chen et al, 2002). С другой стороны, показано, что уменьшение плотности этого рецептора увеличивает размер зоны инфаркта (Cheung et al, 2000). Можно констатировать, что влияние системы нейропептида Y и его рецепторов на функционирование нейронов при ишемии требует дальнейшего изучения. Сравнение уровней экспрессии мРНК этого гена у л/о и ишем. крыс в нашем эксперименте показало, что экспрессия этого гена слабо меняется условиях глобальной ишемии (в лобной коре изменений не зафиксировано, а в гиппокампе было обнаружено снижение содержания мРНК Npylr только через 1 час после окклюзии) (табл.3, 4). Это, возможно, говорит о том, что этот рецептор почти не участвовал в патологических и репарационных процессах в условиях модели. При введении пептидов ишем. животным, обращает на себя внимание активирующие действие PGP на содержание мРНК этого гена в первые часы ишемии. Вполне возможно, что увеличение экспрессии мРНК этого гена в ответ на введение семакса частично обусловлено эффектами его С-концевого фрагмента PGP. Действие семакса на экспрессию мРНК гена Npylr в гиппокампе через 1 ч после окклюзии компенсирует изменения вызванные ишемией в это же время. В целом можно сказать, что экспрессия этого гена при ишемии и введении семакса меняется слабо по сравнению с профилем экспрессии других исследованных генов.

Комплексины - семейство небольших цитозольных белков, которые регулируют высвобождение нейротрансмиттера путем экзоцитоза. Существует два типа комплексинов - Cplxl и Ср1х2, которые представлены в ингибирующих и возбуждающих синапсах соответственно. Эти белки взаимодействуют с рецепторным комплексом SNARE, который ответственен в клетке за слияние мембран (Pabst, 2000). Показано, что комплексины моделируют процесс экзоцитоза. Изменение экспрессии гена Cplx2 при ишемии изучено плохо, хотя известно, что важнейшие звено в механизме развертывания ишемического повреждения ткани мозга - глутаматная эксайтотоксичиость - частично обеспечивается высвобождением глутамата в составе синаптических везикул. Также показано, что Cplx2 активно экспрессируется не только в нейронах, но и в астроцитах, которые принимают важное участие в регуляции оборота глутамата (Hazeîl, Wang,, 2011). Было обнаружено, что увеличение экспрессии Cplx2 приводит к нарушениям ^ высвобождения глутамата с последующими патологическими последствиями (Hazeîl, 2007; Farooqui et al, 2008.). Следует отметить, что функции комплексинов связаны с регуляцией экзоцитоза не только глутамата, но и других важных медиаторов и трофических факторов.

Ранее нами была уточнена структурная организация гена комплексина 2 (CPLX2) располагающегося на 5 хромосоме человека. Были выявлены новые участки концевых экзонов, обнаружены альтернативные варианты транскриптов этого гена у человека и крысы. Принимая во внимание тот факт, что белок CPLX2 может участвовать в развертывании глутаматной эксайтотоксичности и других нарушениях, связанных с экзоцитозом активных молекул, представлялось важным исследовать особенности экспрессии транскриптов Cplx vJ и Cplxjyl в условиях нашей модели. Наши результаты показали, что неполная глобальная ишемия вызывает снижение экспрессии обоих транскриптов в лобной коре и гиппокампе по сравнению с л/о животными (табл. 3, 4). В лобной коре значительное снижение содержания транскриптов детектировалось через 24 ч после окклюзии. В гиппокампе снижение содержания транскриптов Cplxvl наблюдалось чуть раньше, уже через 2 ч после начала ишемии. Максимальное снижение относительной экспрессии обоих транскриптов было обнаружено в гиппокампе через 12 часов после окклюзии. Как видно из табл. 3 к 4, ишемия вызывает схожие изменения экспрессии обоих транскриптов. При этом негативные изменения наступают в гиппокампе раньше, чем в коре, что коррелирует со степенью повреждения этих тканей. В лобной коре ишем. животных введение семакса привело к однонаправленным изменениям экспрессии обоих транскриптов гена Cplx2. Также обращает на себя внимание тот факт, что семакс компенсировал изменения содержания транскрипта Cplxjyl, вызванные ишемией через 8 и 24 часа после окклюзии. При введении PGP не наблюдалось продолжительных изменений относительной экспрессии транскрипта Cplx_y2 ни в сторону увеличения, ни в сторону уменьшения. Относительное содержание транскрипта Cplx_vl, напротив, обладало большей вариативностью, что, возможно, связанно с его более низким уровнем экспрессии, по сравнению с Cplxj>2. Положительное влияние PGP на экспрессию транскриптов гена Cplx2 было наиболее заметным через 12 и 24 часа после окклюзии. Можно заключить, что введение пептидов препятствует развитию изменений экспрессии гена Ср1х2, вызванных ишемией через 8, 12 и 24 часа после окклюзии. Схожий характер изменений экспрессии транскриптов гена Cplx, выявленный в эксперименте, вероятно связан с общностью механизмов регуляции их экспрессии.

выводы

1. Семакс и PGP активируют капиллярную сеть в мозге крыс и оказывают однонаправленное влияние на морфологию нейронов и нейропиля. В условиях неполной глобальной ишемии головного мозга крыс из двух изученных пептидов только у семакса показано нейронротекторное действие.

2. Неполная глобальная ишемия, вызванная окклюзией общих сонных артерий, приводит к незначительному изменению экспрессии генов иейротрофинов и их рецепторов в мозжечке, более заметному - в лобной коре и существенному изменению - в гиппокампе крыс. Наиболее заметное снижение уровня экспрессии этих генов в гиппокампе выявлено через 8 и 12 часов после операции.

3. В гиппокампе животных выраженное протекторное действие семакса и PGP на экспрессию генов иейротрофинов и их рецепторов проявилось спустя 12 часов после окклюзии сосудов, когда ишемическое повреждение привело к существенному их снижению.

4. В условиях ишемии под действием семакса в гиппокампе животных выявлено увеличение экспрессии генов иейротрофинов, при этом наиболее заметный и продолжительный во времени эффект наблюдается для гена Bdnf.

5. Под действием PGP в лобной коре крыс при ишемии выявлено увеличение уровня мРНК генов рецепторов иейротрофинов, а под действием семакса -преимущественно снижение.

6. В гиппокампе и лобной коре крыс ишемия приводит к увеличению экспрессии гена VegfA, оказывает разнонаправленное во времени действие на экспрессию гена Egrl, сопровождается стойким снижением экспрессии гена Cplx2 в гиппокампе животных и минимальным воздействием на экспрессию гена Npylr.

7. Влияние семакса на экспрессию генов VegfA, Egrl и Cplx2 в условиях модели в большинстве случаев противоположно воздействию ишемии, а действие PGP при этом преимущественно отличается от эффектов семакса.

8. Защитное действие семакса в условиях используемой модели может быть обусловлено компенсаторным влиянием на те гены, экспрессия которых

1 изменяется при ишемии.

Список публикаций по теме диссертации Статьи

1. Raevskaya N.M., Dergunova L.V., Vladychenskaya I.P., Stavchansky V.V., Oborina M.V., Poltaraus A.B, Limborska S.A. Structural organization of the human complexin 2 gene (CPLX2) and aspects of its functional activity. Gene 2005 359:127-37

2. Stavchansky VV, Yuzhakov W, Botsina AY, Skvortsova VI, Bondurko LN, Tsyganova MG, Limborska SA, Myasoedov NF, Dergunova LV. The Effect of Semax and Its C-End Peptide PGP on the Morphology and Proliferative Activity of Rat Brain Cells During Experimental Ischemia: A Pilot Study. J Mol Neurosci 2011,45:177-185

3. В. В. Ставчанский, Т. В. Творогова, А. Ю. Боцина, В. И. Скворцова,С. А. Лимборская, Н. Ф. Мясоедов, JI. В. Дергунова. Семакс и его С-концевой фрагмент PGP влияют на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов в условиях неполной глобальной ишемии мозга крыс. Молекулярная биология, 2011,45,5:1-10

Материалы симпозиумов и конференций

4. Dergunova L., Stavchanskii V., Botsina A., Platonova I., Tvorogova Т., Shaykhutdinova E, Skvortsova V., Limborska S. Anlysis of BDNF expression in rats treated with Semax and PGP under the brain experimental ischemia The American Journal ofHuman Genetics 2004. V.75, p.1267.

5. Stavchansky V.V., Dergunova L.V., Botsina A.Y., Platonova I.A., Tvorogova T.V., Shaykhutdinova E.F., Voloshenyuk E.L., Skvortsova V.l., Limborska S.A. Semax increases BDNF expression in ischemized rat brain. European Journal of Human Genetics 2005. V.13,p.364.

6. Platonova I.A., Dergunova L.V., Shaykhutdinova E.F., Stavchansky V.V., Tvorogova T.V., Botsina A.Y., Voloshenyuk E.L., Skvortsova V.l., Limborska S.A. Semax and PGP increases BDNF expression in ischemized "rats brain". Cerebrovascular Diseases 2005. V.19 p.23.

7. Stavchansky V.V., Dergunova L.V., Yuzhakov V.V., Tvorogova T.V., Skvortsova V.l., Limborska S.A. Semax exerts vasotropic and neuropritective effects in experimental brain ischemia. European Journal ofHuman Genetics 2007. V.15, P.183.

8. Stavchansky V.V., Dergunova L.V., Botsina A.B., Tvorogova T.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A. Neurotrophins and their receptors: mRNA expression in ischemic brain under the treatment with neuropeptides Semax and its C-terminal tripeptide PGP. Annual meeting of The American Society of Human Genetics 2007. P.517, abstract 2769/F.

9. Ставчанский B.B., Дергунова JI.B., Боцина А.Ю., Творогова Т.В., Скворцова В.И., Лимборская С.А. Исследование нейропротекторных свойств препаратов Семакс и PGP в условиях экспериментальной глобальной ишемии головного мозга крыс. Материалы стендовых сообщений III Российского симпозиума «Белки и пептиды» 2007. Пущино, С.93.

10.Ставчанский В.В., Дергунова Л.В., Боцина А.Ю., Творогова Т.В.,Скворцова В.И., Лимборская С.А. Семакс и PGP изменяют экспрессию мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в гиппокампе крыс при глобальной ишемии мозга. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 2008. Новосибирск, №183, стр.117.

11.Stavchansky V.V., Dergunova L.V., Botsina А.В, Tvorogova T.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A Effect of Semax treatment on expression of the neurotrophins and their receptors in ischemic rat hippocampus. European Journal of Human Genetics 2008. P. 105.

12.Stavchansky V.V., Dergunova L.V., Maksimov I.M., Botsina A.Y, Tvorogova T.V., Skvortsova V.I., Limborska S.A. Effect of Semax and PGP on expression of Vegf in ischemic rat brain. European Journal of Human Genetics 2009. V.17, P.307.

13.Ставчанский B.B., Дергунова Л.В., Боцина А.Ю., Творогова Т.В., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Влияние нейротропного препарата семакс на экспрессию мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в различных отделах головного мозга крыс, подвергнутых глобальной ишемии. VI Съезд Российского общества медицинских генетиков 2010. С.170—171.

Подписано в печать: 31.01.2012

Заказ № 6592 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ставчанский, Василий Васильевич, Москва

и.

61 12-3/Ь/У

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

На правах рукописи

Ставчанский Василий Васильевич

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МОЗГЕ КРЫС В УСЛОВИЯХ НЕПОЛНОЙ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕПТИДОВ

СЕМАКС И PRO-GL Y-PRO

Молекулярная биология 03.01.03

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, Л. В. Дергунова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор С. А. Лимборская

Москва 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................6

Актуальность проблемы.....................................................................................................6

Цель и задачи........................................................................................................................8

Научная новизна..................................................................................................................9

Практическая значимость работы.................................................................................10

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................11

Экспрессия генов и ее регуляция....................................................................................11

Эпигенетическая регуляция. Модификации ДНК.....................................................!......12

Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции.....................................................13

Посттранскрипционная регуляция экспрессии мРНК......................................................19

Проблемы изучения транскриптома..............................................................................21

Реакция генома на ишемию.............................................................................................26

Особенности взаимодействия нейротрофических факторов и их рецепторов......29

Использование нейропептидов для нейропротекции. Семакс и PGP.....................35

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................43

Модель неполной глобальной ишемии..........................................................................43

Гистологическое исследование.......................................................................................45

Анализ экспрессии генов..................................................................................................47

Выделение тотальной РНК..................................................................................................47

Спектрофотометрическое определение количества РНК................................................48

Электрофоретическое разделение суммарной РНК в 1.5% агарозном геле в

денатурирующих условиях.................................................................................................48

Синтез одноцепочечной кДНК...........................................................................................49

Полимеразная цепная реакция. Электрофорез продуктов ПЦР В ПААГ......................49

Полимеразная цепная реакция в реальном времени.........................................................52

Полуколичественный анализ уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР и статистическая обработка результатов..............................................................................52

РЕЗУЛЬТАТЫ.........................................................................................................57

Гистологическое исследование.......................................................................................57

Изменения морфологии нервной ткани у крыс из контрольных групп после введения семакса и PGP.......................................................................................................57

Изменения морфологии нервной ткани у крыс из экспериментальных групп

после введения семакса и PGP............................................................................................60

Пролиферативная активность клеток головного мозга после введения пептидов........65

Анализ относительного содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов...........................................................................................................................70

Влияние неполной глобальной ишемии на экспрессию мРНК генов нейротрофинов Ngf, Bdnf, Nt-3 и их рецепторов ТгкА, ТгкВ, ТгкС, р75 в

различных отделах головного мозга крыс.........................................................................71

Влияние семакса на экспрессию мРНК генов нейротрофинов Ngf, Bdnf Nt-3 и их

рецепторов ТгкА, ТгкВ, ТгкС, р75 в различных отделах головного мозга крыс............76

Влияние PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов Ngf, Bdnf, Nt-3 и их

рецепторов ТгкА, ТгкВ, ТгкС, р75в различных отделах головного мозга......................82

Сравнение изменений экспрессии мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов в эксперименте при введении семакса и PGP......................................................................88

Анализ экспрессии мРНК генов VegfA, Egrl, Cpbc2 и Npylr у

экспериментальных животных.......................................................................................88

Анализ относительного содержания мРНК гена VegfA в лобной коре и

гиппокампе крыс..................................................................................................................88

Анализ относительного содержания мРНК гена Egrl в лобной коре и

гиппокампе крыс..................................................................................................................92

Анализ относительного содержания транскриптов мРНК гена Cplx2 (Cplx2_vl и

Cplx2_v2) в лобной коре и гиппокампе крыс....................................................................94

Анализ относительного содержания мРНК гена Npylr в лобной коре и гиппокампе крыс..................................................................................................................97

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................................................100

Модель «неполная глобальная ишемия головного мозга»......................................100

Гистологическое исследование головного мозга крыс............................................102

Экспрессия мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов......................................106

Действие ишемии на экспрессию мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов.......106

Влияние семакса на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов....................108

Влияние PGP на экспрессию генов нейротрофинов и их рецепторов..........................114

Экспрессия мРНК генов VegfA, Egrl, Npylr и Cplx2.................................................117

ВЫВОДЫ................................................................................................................125

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................126

БЛАГОДАРНОСТИ..............................................................................................146

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATP - аденозинтрифосфорная кислота

BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор мозга

CPLX2 (Complexin2) - комплексны 2

DEPC - диэтилпирокарбонат

dNTPs - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

Egrl (early growth response 1) - транскрипционный фактор, генов раннего ответа

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа

HIF-1 (Hypoxia-inducible factor 1) - фактор индуцируемый при гипоксии

iNOS - индуцибельная NO-синтетаза

1Р3 - инозитол-1,4,5 - трифосфат

NGF (Nerve Growth Factor) - фактор роста нервов

NMDA - N-метил-В-аспартат

NOS - NO-синтетаза

Nt-3 (Neurotrophin 3) - нейротрофин 3

NPY1R (Neuropeptide Y receptor Yl) - рецептор Y1 нейропептида Y p75 - низкоафинный рецептор нейротрофинов

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) - ядерный антиген пролиферирующих клеток

TEMED - N,N,N,N-TeTpaMeTHfl3mneHflHaMHH

TrkA (Tyrosine kinase receptor A) - тирозинкиназный рецептор, тип A

TrkB (Tyrosine kinase receptor В) - тирозинкиназный рецептор, тип В

TrkC (Tyrosine kinase receptor С) - тирозинкиназный рецептор, тип С

VEGF A (Vascular endothelial growth factor A) - фактор роста сосудистого

эндотелия А

АКТГ - адренокортикотропный гормон АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

СРБ - С-реактивный белок

ГАМК - у-аминомасляная кислота

ДАГ - диацилглицерин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ - интерлейкин

ишем. - ишемизированные

кДНК - комплементарная ДНК

л/о - ложнооперированные

ЛУК - ледяная уксусная кислота

мРНК - матричная (информационная) РНК

мяРНК - малые ядерные РНК

ОТ - обратная транскрипция

п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФНО - фактор некроза опухоли

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

В настоящее время активно исследуется возможность использования синтетических пептидов - аналогов природных регуляторных молекул для лечения многих заболеваний. Лекарственные препараты, изготовленные на их основе, обладают такими свойствами как высокая эффективность, быстрота наступления эффекта и длительность воздействия, а также отсутствие побочных явлений. К числу препаратов, используемых для лечения заболеваний, в основе которых лежат нарушения мозгового кровообращения, относится семакс - синтетический гептапептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, N-конец которого содержит фрагмент АКТГ(4-7), а С-конец - пептид Pro-Gly-Pro (PGP). Семакс обладает широким спектром терапевтических свойств, важнейшим из которых является нейропротекция. Пептид PGP, изначально использовавшийся для пролонгирования действия семакса путем препятствия его преждевременного взаимодействия с эндогенными эндопептидазами, обнаруживает и самостоятельные регуляторные свойства. Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизм действия семакса до конца не ясен. Ранее, в целом ряде работ было показано влияние семакса на функционирование системы нейротрофинов и их рецепторов. Нейротрофинами называют группу близких по происхождению секреторных белков - факторов роста, обеспечивающих выживание, рост и дифференцировку нейронов. Эти протеины ответственны за выбор нервными клетками генетических программ выживания/апоптоза в критических патологических условиях. Также было показано, что эти факторы, прежде всего BDNF, являются мощными природными нейропротекторами, защищающими нервные клетки от повреждающего воздействия ишемии. Анализ экспрессии нейротрофинов и их рецепторов может не только помочь в уточнении деталей патологических процессов, происходящих в ишемизированном мозге, но и оценить эффективность терапевтических процедур. На данный момент точно не известно, как в условиях глобального дефицита глюкозы и кислорода применение семакса действует на экспрессию нейротрофинов и их рецепторов

в различных участках мозга. Особенно важно знать характер таких изменений во времени, прежде всего в первые часы после начала ишемии.

Цель и задачи

Целью настоящей работы являлось изучение влияния препарата семакс и его С-концевого фрагмента PGP на морфологию нервной ткани и экспрессию мРНК генов нейротрофинов Ngf, Bdnf, Nt-3, рецепторов нейротрофинов ТгкА, ТгкВ, ТгкС, р75, а также генов Egrl, Npylr, VegfA и Cplx2 в условиях неполной глобальной ишемии головного мозга крыс. Для этого были поставлены следующие задачи:

3. Определить изменения относительного содержания мРНК генов Ngf, Bdnf, Nt-3, ТгкА, ТгкВ, ТгкС, р75, Egrl, Cplx2, VegfA и Npylr в различных структурах мозга крыс, подвергнутых неполной глобальной ишемии спустя 30 мин, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после операции.

5. Провести сравнительный анализ эффектов семакса и PGP в условиях эксперимента.

Научная новизна

В рамках работы было исследовано воздействие семакса и PGP на экспрессию других генов, ответственных за важнейшие процессы жизнедеятельности клеток и являющихся возможными мишенями терапевтического действия семакса. Впервые было показано разнонаправленное влияние семакса и ишемии на содержание мРНК гена VegfA в лобных долях коры и гиппокампе крыс. Установлено, что эффекты семакса и PGP на экспрессию мРНК большинства генов в экспериментальных условиях различаются. Отличается не только набор генов, изменяющих свою экспрессию, но и временные интервалы, в которые эти изменения обнаружены, а также их продолжительность и глубина.

семакса и PGP на головной мозг животных контрольных групп показало, что оба пептида активировали капиллярную сеть и однотипно влияли на морфологию нейронов. Показано, что из двух препаратов только семакс оказывает нейропротекторное действие, снижая выраженность ишемического повреждения нейронов и предупреждая развитие локальных очагов деструкции нервной ткани. Впервые обнаружена стимуляция семаксом пролиферативной активности клеток герминативных зон, что создает предпосылки для усиления репаративной регенерации поврежденных клеточных и тканевых структур головного мозга в условиях ишемии.

Практическая значимость работы

Результаты проведенного исследования эффектов семакса и PGP в условиях неполной глобальной ишемии представляют научно-практический интерес. Результаты гистологического и иммуногистохимического исследования вместе с данными о динамике изменений содержания мРНК генов нейротрофинов и их рецепторов имеют существенное значение для выяснения механизма нейропротекторного действия семакса. Полученные результаты могут оказаться важными не только для терапевтического применения семакса, но и для анализа новых препаратов пептидной природы, обладающих ноотропными и нейропротекторными свойствами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Экспрессия генов и ее регуляция

Экспрессия генов - фундаментальный биологический процесс, в результате которого генетическая информация, содержащаяся в ДНК, реализуется в виде конечного продукта. На этапе транскрипции наследственная информация переписывается на молекулы РНК, при этом большая часть этих молекул уже является конечным продукт

Информация о работе

Ставчанский, Василий Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Особенности экспрессии генов в мозге крыс в условиях неполной глобальной ишемии под действием пептидов семакс и Pro-Gly-Pro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы