Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов

Мартынова, Кристина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов"

На правах рукописи

МАРТЫНОВА Кристина Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОРОТКИХ ГЛИЦИН- И ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ

03.00.23 - биотехнология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2008

003458568

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в Отделе химии физиологически активных веществ Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор химических наук Швец Виталий Иванович

кандидат химических наук Шрам С.И.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Коваленко Леонид Владимирович

доктор биологических наук Гудашева Татьяна Александровна

Ведущая организация:

Институт химической физики им. H.H. Семенова Защита состоится 29 декабря 2008 г в 15 часов

на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан^ ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, и

кандидат химических наук /( — Лютик А.И.

ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность работы. В настоящее время все большее внимание привлекают короткие пептиды, аминокислотные последовательности которых состоят только из остатков глицина и пролина. Было обнаружено, что такие пептиды, получившие название глипролины, образуются в организме в результате внутри- и эксграклеточиого катаболизма коллагена, эластина и родственных белков, а также в процессе протеолитического расщепления белков, поступающих с пищей (Ашмарин И.П., 2002). В настоящее время также получены различные синтетические аналоги этих природных пептидов. Глипролины обладают рядом биологических активностей, представляющих большой практический интерес. В частности, они влияют на систему свертывания крови, модулируют работу иммунной и нервной систем, обладают противоязвенным действием (Гудашева Т. А., 1999; Samonina G.E., 2000; Пасторова В.Е., 2003).

Создан также целый ряд комбинированных пептидов путем сочленения биологически активных фрагментов пептидов/белков и коротких пептидов-глипролинов. Образующиеся в результате пептиды, как правило, обладают высокой устойчивостью к протеазам и сохраняют активности предшественников. Одним из таких пептидов является семакс - AKTT(4-7)-Pro-Gly-Pro (Ашмарин И.П., 2001). Установлено, что семакс обладает ярко выражешшм ноотропным и нейропротективным действием. Созданные на основе семакса препараты применяются для лечения последствий гипоксии и ишемии головного мозга, инсультов и черепно-мозговых травм.

В настоящее время механизмы действия глипролинов и их мишени мало изучены. Важной задачей также является создание синтетических аналогов глипролинов с высокой стабильностью, эффективностью и селективностью действия. В связи с этим актуальным представляется проведение структурно-функциональных исследований глипролинов и их синтетических аналогов на модельных системах. Такие исследования целесообразно проводить на моделях in vitro с использованием клеточных культур.

1 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: АТФБК - л-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота, АТФБ - л-азидо-тетрафторбензоил, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ОС - окислительный стресс, ТФМАД -(трифторметил)арилдиазирин, DCC - дициклокарбодиимид, DMF - M,N-диметилформамид, HOBT - гидроксибензотриазол, IIOSu -jV-гидроксиеукцинимид, TEA - триэтиламин, THF - тетрагидрофуран.

Т.П., 2007). Эта данные дают основание рассматривать глипролины в качестве потенциальных нейропротекторов. Однако систематических исследований нейропротективных свойств глипролинов ранее не проводилось.

Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было выявление характерных особенностей строения коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов, проявляющих нейропротективное действие на моделях повреждения нейронов т vitro, а также получение фотоаффинных зондов, пригодных для поиска специфических мишеней таких пептидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние пептида Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культивируемых недифференцированных и нейронально дифференцированных клеток феохромоцитомы крысы PC 12 и фибробластов из эмбрионов крысы Rat-2 в условиях окислительного стресса.

2. Исследовать зависимость цитопротективной активности ряда синтетических глипролинов от их структуры.

3. Исследовать связывание радиоактивномеченных пептидов Pro-Gly-Pro и семакса с культивируемыми клетками PC 12.

4. Получить и охарактеризовать фотоактивные арилазидные и диазириновые производные Pro-Gly-Pro и семакса.

5. Сравнить биологические активности Pro-Gly-Pro, семакса и их фотоактивных производных на клеточной модели окислительного стресса.

Научная новизна и приктическая значимость работы. Выполненная работа существенно расширяет имеющиеся сведения о глипролинах как потенциальных нейропротекторах. Получены новые сведения о взаимосвязи между структурой коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов и их биологической активностью. Показано, что эндогенные пептиды Pro-Gly-Pro и ЛГ-ацетил-Pro-Gly-Pro в условиях ОС оказывают цитопротективное действие на перевиваемые культуры клеток крысы вне зависимости от их происхождения. Установлено, что наличие С-концевой последовательности Gly-Pro является необходимым условием для проявления цитопротективного действия коротких синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов на культуру клеток PC 12 в условиях ОС. Впервые получены фотоактивные производные пептидов Pro-Gly-Pro и семакса. Показано, что по своим фотохимическим и биологическим свойствам синтезированные фотоактивные соединения и их радиоактивномеченные аналоги могут быть использованы в качестве зондов для поиска мишеней глипролинов.

Апробация диссертации. По результатам работы опубликовано две статьи в научных рецензируемых журналах. Материалы исследования были представлены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006, 2008), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 30-ом Европейском пептидном симпозиуме (Хельсинки, 2008), Конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008), 12-ой Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008), и на семинаре Отдела химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 102 страницах, содержит 38 рисунков, 3 схемы и 13 таблиц. Список литературы включает 138 ссылок.

Настоящая работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Программы Президента РФ «Ведущие научные школы» (проекты № НШ-2150.2003.4 и № НШ-5638.2006.4) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 080401760).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование влияния пептида Pro-Gly-Pro и его производных па выживаемость перевиваемых культур клеток крысы в условиях окислительного стресса

Проводившиеся ранее в различных лабораториях исследования биологических свойств глипролинов показали наличие целого ряда активностей, которые могут быть выявлены как на моделях in vivo (противоязвенное действие, провоспалительная активность), так и in vitro (хемотаксис нейтрофилов, агрегация тромбоцитов, цитопротективное действие при ОС). При выборе тест-системы основным критерием была возможность оценки нейропротективного действия исследуемых пептидов.

Основная часть работы была выполнена на культуре клеток феохромоцитомы крысы РС12, имеющих нейроэндокринную природу (Tishler S.A. and Green L.A., 1978). В присутствии фактора роста нервов эти клетки способны дифференцироваться в клетки нейронального типа. В целом ряду исследований была показана идентичность процессов, происходящих в клетках PC 12 и в нейронах при повреждении различными стимулами (Tishler S.A. and Green L.A., 1978; Mesner P.W. et al., 1992).

Рис. 1. Культура недифференцированных (А) и нейронально дифференцированных (Б) клеток РС12. Увеличение - х 100.

Поэтому культуру РС12 широко используют для изучения процессов дифференцировки, гибели и регенерации нейронов.

В работе использовали как нейронально дифференцированную, так и недифференцированную культуры клеток РС12 (рис. 1). На этих культурах моделировали гибель нейронов, вызванную ОС. Известно, что этот процесс является одной из основных причин гибели нейронов при различного рода патологиях центральной и периферической нервных систем. В частности, ОС является одним из этапов патогенеза ишемического инфаркта головного мозга. ОС вызывали 30-минутной инкубацией клеток в среде, содержащей 1-1.5 мМ Н2О2 (другие условия приведены в подписи к рис. 2). Такое воздействие запускало патологические процессы в клетке, что, в конечном счете, приводило к ее гибели по некротическому пути. О некротическом характере повреждений свидетельствовало нарушение целостности клеточных мембран, которое хорошо выявлялось при окрашивании красителем трипановым синим. Количество некротических клеток резко возрастало на 3-ий час культивирования (рис. 2).

Исследовали влияние трех пептидов, содержащих последовательность Рго-С1у-Рго (Рго-СНу-Рго, АГ-ацетил-Рго-Яу-Рго и МеЮ1и-Н18-РЬе-Рго-01у-Рго - семакса) на выживаемость культивируемых клеток феохромоцитомы крысы РС12. Эти и другие использованные в работе пептиды были получены в виде ацетатных солей Л.А. Андреевой из Отдела химии физиологически активных веществ ИМГ РАН.

Известно, что пептиды Рго-СНу-Рго и ТУ-ацетил-Рго-Иу-Рго способны вызывать хемотаксис нейтрофилов при введении в легкие мыши липополисахаридов (ПасМох 1999). Причем этот эффект обусловлен взаимодействием пептидов с интерлейкиновыми рецепторами СХСИ 1 и 2 типов.

О -1-1-,-,-

0 1 2 3 4 5

Время инкубации после удаления Н2Ог, ч

Рис. 2. Развитие некротических изменений в культуре клеток РС12 после 30-минутной инкубации с 1.5 мМ Н202.

Условия культивирования: 15.8x1o3 клеток/см2, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 37°С в атмосфере 5% С02

В то же время бьшо показано, что Pro-GIy-Pro увеличивает выживаемость клеток РС12 в условиях ОС и замедляет развитие дизрегуляции уровня внутриклеточного Са2+ в зернистых нейронах мозжечка крысы при сверхактивации глутаматных рецепторов (Сафарова Э.Р., 2003; Сторожевых Т.П., 2007).

Аналогичные эффекты были выявлены и в отношении пептида семакса, имеющего С-концевую последовательность Pro-Gly-Pro. В этой связи бьшо интересно сравнить действие всех этих пептидов на выживаемость клеток РС12 на модели ОС. Следует отметить, что клетки РС12 не содержат рецепторы CXCR 1 и 2 типов и рецепторы меланокортинов, являющихся потенциальными мишенями пептида семакса (Solea F., 19S9; Danik М., 2003).

Бьшо обнаружено, что все три пептида обладали дозозависимым цитопротективным действием в культурах как недифференцированных, так и нейронально дифференцированных клеток РС12 (рис. 3). При этом не было выявлено существенных различий в характере и эффективности их действия. По-видимому, модификация пептида Pro-Gly-Pro с jV-конца позволяет сохранить активность исходного пептида.

Так как исследованные пептиды содержали последовательность Pro-Gly-Pro и при этом не демонстрировали существенных различий в активности, то можно предположить, что они связываются с одной и той же клеточной мишенью.

Концентрация Рто-Оу-Рю, м<М

Концентрация Рго-Эу-Рго, мкМ

Концентрация №ацетап-Рго-С1у-Рго. мкМ

Концентрами М-ацетип-гто-О^-Рго мкМ

Рис. 3. Влияние пептидов Рго-01у-Рго (А, Г) Л'-ацетил-Рго-Иу-Рго (Б, Д) и семакса (В) на выживаемость недифференцированных (А-В) и нейронально дифференцированных (Г, Д) клеток РС12.

Н2О2 - 1.5 мМ, 30 мин. *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с контролем ((-тест Стыодента для выборок с равными дисперсиями).

Концентрация семакса. м*М

Полученные данные также свидетельствуют о том, что эффективность действия пептидов на недифференцированные и нейронально дифференцированные клетки РС12 существенно не отличается. Поскольку биологическое действие глипролинов также было продемонстрировано на различных органах и тканях, следовательно, мишени действия таких пептидов могут присутствовать и на других типах клеток.

Для проверки этого предположения исследовали действие Рго-01у-Рго, Л'-ацетил-Рго-01у-Рго и семакса на выживаемость клеток фибробластов из эмбриона крысы 1Ш-2 в условиях ОС, индуцированного Н2О2.

Концентрация Pro-Gly-Pro. мкМ

Концентрация W-ацетип-Pro-Gly-Pro, ккМ

Рис. 4. Цитопротективное действие пептидов Pro-Gly-Pro (Л), ЛГ-ацетил-Pro-Gly-Pro (Б) и семакса (В) на клетки фибробластов из эмбриона крысы Rat-2 в условиях ОС.

Н2О2 - 1 мМ, 30 мин.

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с контролем (t-тест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями).

юо

Концентрация семакса. мкМ Обнаружено, что в условиях ОС Pro-Gly-Pro и его производные оказывали цитопротективное действие и на культуру фибробластов Rat-2 (рис. 4). Однако в отличие от культур клеток PC 12 концентрационные зависимости имели максимумы активности. Наибольшие эффекты для Pro-Gly-Pro, ЛГ-ацетил-Pro-Gly-Pro и семакса наблюдались при концентрациях 10, 1 и 0.2 мкМ, соответственно.

Полученные данные позволяют предположить, что способность Pro-Gly-Pro и его N-замещенных производных увеличивать выживаемость клеток не имеет выраженной нейроспецифичности. Кроме того, очевидно, что подобным действием могут обладать и другие глипролины, а также их синтетические аналоги.

2. Структурно-функциональное исследование синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов на модели окислительного стресса

Исследовали цитопротективное действие пептидов Рго-01у, Рго-^у-Рго, Рго-С1у-Рго-СТу, Рго-СТу-Рго-01у-Рго, Рго-СТу-Рго-Рго-гау-Рго, Оу-Рго, ау-Рго-СТу-Рго, 01у-Рго-Яу-Рго-Иу-Рго. Выбра1шые для исследования пептиды в соответствии со структурой были условно разделены на три группы: 1) - (О1у-Рго)„; 2) - (Рго-01у)„ и 3) - (Рго-Яу-Рго),.

без ОС

без пептидов -без пептидов

в1у-Рго (С1у-Рго)2 (С1у-Рго)3

Рго-С1у (Рго-С1у)2

(Рго-ау)2-Рго -Рго-ау-Рго -(Рго-61у-Рго)2 -

О 25 50 75 100 125 150 175

Количество поврежденных клеток (в % от контроля)

Рис. 5. Влияние коротких глипролинов на выживаемость клеток РС12 в условиях окислительного стресса.

Н2О2 - 1.5 мМ, 30 мин. Концентрация пептидов - 5 мкМ.

** р<0.01, ***р<0.001 (1-тест Стьюдента для выборок с различающимися дисперсиями).

Для оценки цитопротективного действия пептидов использовали стандартную тест-систему на основе культуры недифференцированных клеток РС12. Пептид Рго-СЛу-Рго был использован в качестве вещества сравнения.

Показано, что исследуемые пептиды в концентрации 5 мкМ по-разному влияли на выживаемость клеток (рис. 5). Пептиды Рго-О1у-Рго, 01у-Рго, (С1у-Рго)2 и (01у-Рто)з, уменьшали количество поврежденных клеток по сравнению с контролем (инкубация без пептида), (Рто-О1у-Рго)2 увеличивал число поврежденных клеток, а в случае пептидов Рто-01у, (Рто-СНу)-; и (Рго-О1у)2-Рго достоверно значимых отличий по сравнению с контролем выявлено не было. Таким образом, помимо пептида Рго-01у-Рп> цитопротективным действием обладали все пептиды со структурой (Сг1у-Рго)„.

Достоверное снижение процента поврежденных клеток пептиды Рго-01у-Рго, (01у-Рго)2 и (01у-Рто)3 вызывали уже при концентрации 0.2 мкМ (рис. ЗА и 6). Существенных различий в активности этих пептидов во всем исследованном диапазоне концентраций выявлено не было.

.. .....

I--1 ***

:............... ..............................- II-1 ***

~ И—1 ***

***

Концентрация С1у-Рго, мкМ

Концентрация (СЗ(у-Рго)г, мкМ

Рис. 6. Цитопротективное действие пептидов Йу-Рто (А), (йу-Рто)2 (Б) и (йу-Рто)з (В) на клетки РС12 в условиях ОС.

Н202-1.5 мМ, 30 мин. ♦р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с контролем (игест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями).

Концентрация (С1у-Рго)3, мкМ

Проведенное попарное сравнение выявило лишь более высокую активность пептидов Йу-Рго и Рго-йу-Рго по сравнению с активностью (йу-Рго)2 и (С1у-Рго)з в концентрациях 0.2 и 100 мкМ.

Поскольку все пептиды, состоящие из повторяющегося фрагмента Йу-Рго, а также Рго-йу-Рго и его Л'-замещенные производные обладали цитопротекгавной активностью, то, очевидно, что наличие С-концевой последовательности Йу-Рго является необходимым условием для проявления защитного действия на клетки в используемой нами модели. Исключением из правила являются пептиды (Рго-йуЭг-Рго и (Рго-йу-РгоЬ. Возможно, в этих случаях конформация //-концевой части молекулы затрудняет взаимодействие пептида с мишенью.

3. Поиск мест специфического связывания пептидов Рго-йу-Рго и семакса с клетками РС12

Одним из подходов, применяемых при поиске и характеристике мишеней биологически активных веществ, является радиорецепторный анализ. Ранее уже предпринимались попытки охарактеризовать сайты связывания Рго-йу-Рго и семакса на мембранах различных отделов мозга крысы (Оо1оЮу О.У., 2006; Вьюнова Т.В., 2006.). Показано, что места связывания семакса локализованы преимущественно в гиппокампе, а

Рго-Иу-Рго - в базальных ядрах (Вьюнова Т.В., 2008). Однако пока не установлено, к какому типу рецепторов они относятся.

Как указывалось ранее, в клетках РС12, оказавшихся чувствительными к глипролинам, отсутствуют нейрональные меланокортиновые рецепторы и рецепторы СХСШ и 2 типов. В связи с этим нам представлялось интересным охарактеризовать сайты связывания глипролинов и семакса на клетках РС12.

В проводимых экспериментах использовали радиоактивномеченные пептиды (О-3Н] Рго-01у-Рго (6 Ки/ммоль) и [Рп>7-3Н] семакс (130 Ки/ммоль), синтезированные в Отделе химии физиологически активных веществ ИМГ РАН.

Исследовали связывание радиоактивномеченных пептидов с культурами дифференцированных и недифференцированных клеток РС12, а также с суспендированными клетками РС12. При работе с суспензией клеток основной проблемой являлось наличие высокого неспецифического связывания радиоактивномеченных пептидов с фильтрами, которое не удалось предотвратить традиционными методами. Поэтому в дальнейшем мы проводили эксперименты только с прикрепленными культурами клеток. При этом исследования проводились как с шггактными, так и с подвергнутыми действию ОС клетками.

Влияние ингибиторов протеаз на стабильность Рго-С1у-Рго и семакса < культуре клеток РС12

На первом этапе подбирали условия инкубации, при которых не наблюдалось бы значительной деградации пептидов. В условиях, использованных для проведения радиорецепторного анализа, содержание радиоактивномеченных пептидов семакса и Рго-С1у-Рго снижалось за счет деградации на 30 и 18% соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Влияние ингибиторов протеаз на деградацию пептидов в культуре клеток РС12.

№ Содержание [3Н]семакса, % Содержание 13Н1Рго-ау-Рго, %

1 Инкубация без клеток 99±1 100±1

2 Инкубация с клетками РС12 71±2*" 82±2"

3 +о-фенантролин (0.13 мМ) 90±3Ш 81±1

+о-фенантролин (0.13 мМ) 88±1™ 82±1

4 + РМЯК (0.3 мМ)

**р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с образцами, не содержащими клеток (1-тест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями)

шр<0.001 по сравнению с образцами, содержащими клетки и не содержащими ингибиторы (1-тест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями)

Условия: РС12 - 840 тыс., 1 мл ОМЕМ с 25 мМ Иерее, 37°С, 5% С02, время инкубации -1ч. Концентрация пептидов - 20 мкКи/мл.

Период времени после индукции ОС Период времени после индукции ОС

Рис. 7. Действие Рго-01у-Рго (А) и семакса (Б) иа клетки РС12 в различные периоды времени после индукции окислительного стресса.

Н202- 1.5 мМ, 30 мин.

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с контролем (Пест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями).

Добавление в среду инкубации о-фенантролина, связывающего 2-х валентные ионы в активном центре протеаз, приводило к снижению протеолитического гидролиза семакса, но не влияло на скорость деградации Рго-СНу-Рго. Внесение в среду дополнительно ингибитора сериновых протеаз РМОТ (фенилметилсульфонилфторида) не приводило к снижению степени деградации пептидов. Основываясь на этих данных, при исследовании связывания семакса с клетками РС12 в среду инкубации добавляли о-фенантролин.

Изменение чувствительности клеток РС12 к действию Рго-С1у-Рго и семакса на разных сроках после индукции окислительного стресса

Так как инкубация клеток с пептидами длится всего 60 мин, необходимо было установить, в какой период времени после индукции ОС пептиды Рго-С1у-Рго и семакс оказывают наибольшее цитопротективное действие на культивируемые клетки. Для этого немеченые пептиды добавляли в культуру, сразу и через 1 и 2 ч после окончания инкубации с Н2О2. После 60-минутной инкубации производили отмывку пептидов. Из полученных данных следует, что наибольшую активность пептиды проявляли в период времени с 1 по 2 ч после окончания инкубации клеток с Н2О2 (рис. 7). Действие Рго-О1у-Рго на культуру РС12 наблюдалось также со 2 по 3 ч инкубации.

Связывание радиоактивномечениых Рго-Ыу-Рго и семакса с клетками РС12

При инкубации радиоактивномечениых пептидов Рго-01у-Рго (100 нМ) и семакса (50 нМ) с интактными недифференцированными клетками РС12 не было обнаружено специфического связывания пептидов (табл. 2).

Таблица 2. Связывание меченых тритием пептидов Рго-С1у-Рго и семакса с культурой шггактных недифференцированных клеток РС12.

№ Пептиды Связанный радиоактивномеченый пептид

расн./мин | %

Инкубация без клеток

1 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ) 2338±244 lOOtlO

2 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ) + 1948±238 82±9

Pro-Gly-Pro (10 мкМ)

Инкубация с интактными недифференцированными клетками PC 12

3 [JH] Pro-Gly-Pro (100 нМ) 2015±332 100±16

4 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ) + 1667±47 83±2

Pro-Gly-Pro (10 мкМ)

5 [3Н] семакс (50 нМ) 12869±2555 100±20

6 [3Н] семакс (50 нМ) + 11183±5049 96±24

семакс (5 мкМ)

Условия: 840 тые.клеток, 1 мл БМЕМ с 25 мМ Нерев, 37°С, время инкубации - 1ч. [3Н] семакс - 6.5 мкКи/мл (50 нМ). [3Н] Рго-йу-Рго - О.бмкКи/мл (100 нМ).

При исследовании связывания Рго-01у-Рго (100 нМ) с нейронально

дифференцированной культурой РС12 обнаружили 4-х кратное возрастание общего

связывания пептида с клетками по сравнению с образцами, не содержащими клеток (табл.

3).

Таблица 3. Связывание меченого тритием пептида Рго-Иу-Рго с культурой нейронально дифференцированных клеток РС12 подвергшихся ОС.

№

Пептид

Связанный радиоагегивномеченый пептид

расп/мии_I_%

Инкубация без клеток

1 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ) 2901±680 100±23

2 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 nM)f 2168±523 , Pro-Gly-Pro (10 мкМ)

Инкубация с интактными нейронально дифференцированными клетками PC 12

3 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ) 11818±1070*** 100±9

4 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ)+ 11889*1634 Pro-Gly-Pro (10 мкМ) U J

Инкубация с нейронально дифференцированными клетками PC 12, подвергшимися ОС

5 [3Н] Pro-Gly-Pro (100 нМ) 1556Ш77'" 100±1

6 14808±175* 95±1 Pro-Gly-Pro (10 мкМ)____

***р<0.001 по сравнению с образцами, не содержащими клеток (Ьтест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями).

*р<0.001 по сравнению с образцами, содержащими 100-кратный избыток немеченого Рго-Йу-Рго (1-тест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями).

Условия: 3.7 млн. клеток, 1 мл ВМЕМ с 25 мМ Иерея, 37°С, время инкубации- 1ч. [3Н] Рго-01у-Рго - О.бмкКи/мл (100 нМ).

При этом связывание в присутствии 100-кратного избытка немеченого Рго-01у-Рго также возрастало. Подобное увеличение связывания пептида, по-видимому, было обусловлено увеличением количества клеток в образцах и площади занимаемой ими поверхности.

Отсутствие различий при инкубации клеток в присутствии и отсутствии 100-кратного избытка немеченых пептидов может быть обусловлено низкой концентрацией центров связывания на поверхности клеток. А увеличение связывания радиоактивномеченного Рто<|1у-Рго с нейронально дифференцированными клетками РС12 может свидетельствовать в пользу предположения о внутриклеточной локализации мишени действия пептида. Высокий уровень связывания в присутствии 100-кратного избытка немеченого пептида в этом случае может быть объяснен тем, что значительное количество пептида, проникшего в клетку в течение 60-минутной инкубации, не может быть отмыто быстрыми промывками на холоду в течение 15 с.

Таким образом, методом классического радиорецепторного анализа не были выявлены мишени глипролинов на клетках РС12. Поэтому для поиска и характеристики сайтов специфического связывания этих пептидов необходимо в дальнейшем использовать другие подходы.

4. Синтез и характеристика фотоаффинных производных Рго-Оу-Рго и семакса

Для выделения и идентификации мишеней глицин- и пролинсодержащих пептидов может быть использован метод фотоаффшшого мечения. Этот метод позволяет получить не только общие характеристики мест специфического связывания лигандов (константу диссоциации, количество мест специфического связывания и др.), но и идентифицировать белок-мишень. В основе фотоаффинного мечения лежит получение ковалентных сшивок между рецептором и присоединенным к нему фотоактивным лигандом под действием облучения, и последующая идентификация меченых продуктов. Для получения фотоактивного лиганда необходимо введение в пептид фотолабилыюй группы, которая активируется под действием облучения с образованием высокореакционноспособного интермедиата, способного атаковать различные группы атомов.

Синтез фотоактиепых производных Рго-С1у-Рго и семакса

При получении фотоактивных производных модификацию пептидов проводили с //-конца, поскольку в этом случае потеря биологической активности, как следовало из предыдущих результатов, была менее вероятна.

В качестве предшественников фотоактивных групп были использованы арилазиды, поскольку последние являются самыми распространенными фотоактивными соединениями вследствие их стабильности в темноте, простоты синтеза и доступности предшественников.

Арилазидные зонды

Трифторметиларилдиазириновый зонд

-к

■г

■р

N3 (XV)1

1*1- Ма-Ии-Ни-РЬе-Рго-гау-Рго

(XVIII)

И,- МеКЯи-Нв-РЬе-Рго-Оу-Рго (XXI)

(XXII)

Яг Рго-Оу-Рго

Иг Рго-Иу-Рго

Рис. 8. Структуры синтезированных фотоаффинных зондов семакса и Рго-Иу-Рго.

Нами были получены фотоактивные пептиды на основе фторированных арилазидов (АТФБ-производные) (рис. 8). Введение электроноакцсгггорных заместителей в бензольное кольцо позволяет увеличить скорость фотолиза, и, таким образом, снизить вероятность повреждения биологического объекта. Кроме того, нами было также получено фотоактивное (трифторметил)арилдиазириновое (ТФМАД) производное Рго-Иу-Рго.

На этапе отработки методики получения фотоактивных производных семакса получали соединение с незамещенной арилазидной группой. Синтез зонда семакса осуществляли в три стадии (схема 1).

На первом этапе проводили шпрозилирование л-аминобензойной кислоты на холоду с последующей обработкой азидом натрия. Затем проводили конденсацию полученной п-азидобензойной кислоты с семаксом по методу активированных эфиров с получением А'-сукцшшмидаого эфира п-азидобензойной кислоты в качестве промежуточного продукта. В этом случае выход зонда по данным ВЭЖХ составил 29%. Других продуктов присоединения Л'-сукцшшмидного эфира и-азидобензойной кислоты к пептиду обнаружено не было. Приведенная схема была использована для получения коньюгатов семакса с я-азидо-тетрафторазидобензойной кислотой (АТФБК). В этом случае выход модифицированного пептида составил 33%.

2Нумерация соединений приведена в соответствии с таковой в диссертации.

Х=Р (XV) 33%ь Х=Н (XVIII) 29%ь

Схема 1. Получение л-азцдобензойных производных семакса.

* Выход относительно амино- и азидобензойных кислот;ь выход относительно семакса.

Использование метода активированных эфиров и метода смешанных ангидридов, с тионилхлоридом в качестве активирующего агента, оказалось неэффективным при проведении синтеза фотоактивного пептида из незащищенного Рго-01у-Рго вследствие низкой химической реактивности вторичной аминогруппы остатка пролина, а также образования большого количества побочных продуктов. Поэтому в качестве исходного соединения был взят защищенный по карбоксилу бензиловый эфир пептида. Модификацию Рго-С1у-Рго-ОВ?Л проводили карбодиимидным методом с использованием 1-гидроксибензотриазола для предотвращения рацемизации (схема 2). Выход защищенного производного составил 76% (относительно АТФБК). Защитную группу удаляли щелочным гидролизом в метаноле. Целевой продукт был получен с выходом 64% (относительно АТФБК), Таким же методом было получено фотоактивное ТФМАД-производное Рго-Иу-Рго. Однако в этом случае выход целевого продукта составил 24% (диазиринил-трифторметил-бензойной кислоты). Все полученные соединения были проанализированы с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии (табл. 4).

Фотолиз фотоактивных производных Рго-ау-Рго и семакса

При облучении УФ-светом в 50% водном метаноле АТФБ-производные легко подвергались фотолизу (рис. 9А, 9Б). При этом наблюдалось снижение интенсивности характерных для фторированных арилазидов пиков поглощения в области 260 нм с

увеличением времени облучения. Распад фотоактивной группы при облучении подтверждался данными ВЭЖХ (рис. 9Г)-

ГЛ (XIX)

\ .со— ж/

со-ны-^ Л

со-овя

новт

к>4

тня

гюс

СО-Ш

СО-Н-, /

Л .со-ш

со-ны-^ \

(XXIII)

49%

СО—ОВг!

СНзОН

у,-

ЫаОН

СНзОН

„СО— ш^/

№ОН

.СО—Ш^/

(XXI)

97»/.

СООН

(XXIV)

77%

Схема 2. Синтез фотоактивных производных Рго-01у-Рго.

После облучения УФ светом в течение 60 с содержание фотоактивных соединений в растворе существенно снижалось. При этом наблюдали образование нескольких продуктов фотолиза. Облучение в тех же условиях ТФМАД-производного Рго-Яу-Рго также приводило к его фотолизу, что сопровождалось снижением интенсивности галса поглощения в области 350 нм (рис. 9В).

Таблица 4. Физико-химические характеристики полученных фотоактивных производных Рго-Оу-Рго и семакса.

Соединение Кол-во, Чистота ВЭЖХ" Молек.

мг (ВЭЖХ, • 1Выхода, ион

%). мин [М1

АТФБ-семакс 1.7 95 11.5 1031.13

(XVIII)

АТФБ-Рго-Яу- 194.4 95 12.7 487.07

Рго (XXI)

ТФМАД-Рго- 93.7 95 15 482.07

С1у-Рго (XXII)

ВЭЖХ-анализ: колонка РгогиоэЛ 12Ста(, (2x75 мм, 5 мкм); элюент А - 0.2 М 1лСЮ4, 0.05 М НСЮ4; эгаоент Б -метанол; градиент Б - 30-100%, 30 мин; скорость элюции - 0.2 мл/мин.

240 200 280 300 320 340 360 330 400 Длина волны, им

Длина волны, ни

0.10

В 0.0В

| 0.04

0,00

<0 12 14 К 14

280

300 320 340 МО Длина волны, нм

ЭвО

400

Рис. 9. Изменение спектров поглощения л-азидотетрафторбензойных производных Рго-Gly-Pro (XXI) (А), семакса (XVIII) (Б) и диазиршювого производного Pro-Gly-Pro (XXII) (В) при УФ-облучешш в течение 120 с. Г - ВЭЖХ л-азидотетрафторбензойного производного семакса (XVIII) до (1) и после (2) УФ-облучешш в течение 60 с.

Концентрация веществ - 38.5 мкг/мл.

Условия облучения; УФ-лампа PHILIPS Hg TUV 15W/G15T8. Расстояние от образца до источника излучения -15 см. Растворитель метанол-вода (1:1). Условия приведены в подписях к табл.4.

На основании полученных данных были рассчитаны константы скоростей фотолиза

и времена полураспада фотоактивных групп. Кинетика реакций описывалась уравнением

первого порядка. Константы скоростей фотохимических реакций для полученных

фотоактивных пептидов при выбранных условиях являлись величинами одного порядка и

составляли ок. 10"2 с"1.

Значения периодов полураспада составили для АТФБ-производных Pro-Gly-Pro и

семакса 75 и 67 с, соответственно, а для ТФМАД-производного Pro-Gly-Pro - 133 с.

Спектральные характеристики полученных соединений представлены в таблице 5.

Проведенные исследования показали, что полученные фотоактивные соединения

обладают малыми временами полураспада, и, следовательно, являются подходящими

реагентами для метода фотоаффинного мечения.

Таблица 5. Спектральные и фотохимические характеристики полученных фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса

(XVIII)

АТФБ-Pro-Gly- 260 17821 9.2±1.3 75±12 Pro (XXI)

ТФМД-Pro-Gly- 350 404 5.2±0.5 133±14

Pro (XXII)_

б - Коэффициент молярной экстинкции М" см"; Тх/г - время полураспада зонда, с;

к - константа скорости фотохимической реакции первого порядка, с"1;

Условия ВЭЖХ приведены в подписях к табл.4.

Взаимодействие фотоактивного производного семакса с бычьим сывороточным альбумином

Известно, что бычий сывороточный альбумин (БСА) часто выполняет функцию

переносчика различного рода пептидов. Для многих из них, например, гасгринов,

показано наличие мест специфического связывания на БСА (Galardy R.E., 1974). Поэтому

было интересно использовать фотоаффинный зонд для исследования взаимодействия

глицин- и пролинсодержащих пептидов с БСА.

Смесь белка с АТФБ-семаксом в молекулярном соотношении 1:0, 1:6 и 1:10

инкубировали в течение 30 мин в фосфатно-солевом буфере при комнатной температуре,

а затем подвергали облучению УФ-светом.

При анализе полученных образцов методом SDS-элекгрофореза в

полиакриламидном геле не наблюдали смещения полосы БСА в область больших

молекулярных весов (рис. 10). В связи с этим можно предположить, что на БСА

отсутствуют места специфического связывания семакса, и, следовательно, полученное

фотоакгивное производное семакса обладает избирательностью действия.

5. Оценка биологической активности тстрафторарилазндных производных Pro-Gly-Pro и семакса

Одним из основных требований при конструировании фотоаффинных зондов является сохранение ими структурных элементов прототипа, необходимых для связывания с рецептором.

Соединение Хшах, нм

Т., kxio1, 'Ту,, с М'см"1 с"1

АТФБ-семакс

260 9548 10.3±0.4 67±3

67.0 «

12 3 4

Рис. ТО. Электрофоретический анализ БСА после УФ-облучения в присутствии фотоактивного производного семакса.

1 - стандарт молекулярной массы, 2,3,4 - смесь БСА с фотоактивным производным семакса в молекулярных соотношениях 1:10, 1:6 и 1:0 после инкубации в течение 30 мин при 27°С и УФ-облучения в течение 1 мин. Условия облучения приведены в подписях к рис. 9.

Поскольку молекулярные мишени глицин- и пролинсодержащих пептидов неизвестны, то для контроля за сохранением функционально важных элементов структуры пептида-прототипа были использованы биологические тесты.

Для оценки биологической активности полученных фотоактивных АТФБ-производных Рго-О1у-Рго и семакса использовали стандартную тест-систему. Исследовали влияние АТФБ-пептидов в концентрациях 0.2-100 мкМ на выживаемость РС12 (рис. 11).

В концентрации 0.2 мкМ фотоактивное производное семакса достоверно снижало количество поврежденных клеток.

Концентрация фотоактивных производных, мкМ

Рис. 11. Зависимость цитопротективного действия АТФБ-производных Рго-О1у-Рго и семакса от концентрации.

Н202 - 1.5 мМ, 30 мин. *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с контролем (1-тест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями)

С увеличением концентрации фотоактивного пептида до 10 мкМ происходило снижение его цитопротективной активности, а при концентрации 50 мкМ - процент некротических клеток даже увеличивался по сравнению с контролем.

Напротив, фотоактивное производное Рго-СЯу-Рто во всех исследованных концентрациях снижало количество поврежденных клеток: в концентрации 1 мкМ -примерно на 30%, а в концентрациях 10 и 100 мкМ - на 40% от контроля.

Далее было проведено сравнение цитопротективной активности Рго-Яу-Рто, семакса и их фотеакгивных производных (табл. 5). Было выявлено, что производное семакса в концентрации 10 мкМ обладает меньшей цитопротективной активностью, чем исходный пептид. Фотоактивное производное Рго-С1у-Рго в концентрации 10 мкМ демонстрировало такую же активность, как и исходный пептид, а в концентрации 50 мкМ даже несколько увеличивало эффективность действия Рто-Яу-Рто (10 мкМ). При совместном действии семакса (10 мкМ) и его фотоактивного производного (50 мкМ) наблюдали снижение эффекта семакса почти в 2 раза.

Таблица 5. Влияние л-азидо-тетрафторбензойной кислоты и я-азидо-тетрафторбензойных производных на цитопротективную активность пептидов Рго-01у-Рго, семакса

Вещества (концентрация) Количество поврежденных клеток (в % от контроля)

Без веществ (контроль) 100±12

семакс (10 мкМ) 52±9*"

АТФБ-семакс (10 мкМ)

семакс (10 мкМ)+АТФБ-ссмакс (50 мкМ) 75±16"*Ш

Без веществ (контроль) 100±13

Рго-О1у-Рго (10 мкМ) 64±8*"

ЛТФБ-Рго-О1у-Рго (10 мкМ) 64±8'"

Рго-Иу-Рго (10 мкМ)+АТФБ-Рто-01у-Рто 60±8*"

(50 мкМ)

Без веществ (контроль) 100±7

семакс (10 мкМ) 68±9"

семакс (50 мкМ) 62±11"

АТФБК (10 мкМ) 113±20

АТФБК (50 мкМ) 92±20

семакс (10 мкМ)+ АТФБК(10 мкМ) 80±8*

семакс (50 мкМ)+ АТФБК(50 мкМ) 92±1*

Н2О2- 1.5 мМ, 30 мин. Контроль-инкубация клеток без добавок АТФБК и пептидов.

*р<0.05, м*р<0.001 по сравнению с исходным пептидом (1-тест Стьюдента для

выборок с равными дисперсиями)

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 по сравнению с контролем (Мест Стьюдента для выборок с равными дисперсиями)

Кроме того, оценивали действие АТФБК, обладающей высокой липофилыюсгью, на клетки РС12. Согласно полученным данным, кислота не обладала цитотоксическим действием в концентрациях 10 и 50 мкМ, однако, значительно снижала цитопротективную активность семакса.

Таким образом, исследования на культуре РС12 свидетельствуют о том, что полученные модифицированные пептиды, также как и исходные прототипы, обладают цитопротективной активностью в условиях ОС.

Полученные фотоактивные производные пептидов способны к быстрому фотолизу под действием УФ-света и обладают биологической активностью, присущей их исходным прототипам в модели ОС, а, следовательно, удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к фотоаффинным зондам. Поэтому данные зонды представляют собой удобный инструмент для поиска и идентификации рецепторов глицин- и пролинсодержащих пептидов на культуре РС12 с использованием метода фотоаффинного мечения.

В работе показано, что пептид Рго-Иу-Рго и его производные оказывают цитопротективное действие при ОС не только на нейронально дифференцированные, но и на недифференцированные клетки РС12, а также на культуру фибробластов эмбрионов крысы Ла1-2.

На основании полученных результатов можно предположить, что мишень этих пептидов не является нейроспецифичной. И поскольку на клетках РС12 отсутствуют известные рецепторы глипролинов и семакса (интерлейкиновые и меланокортиновые рецепторы), то, очевидно, что цитопротективные эффекты этих пептидов реализуются через пока еще не охарактеризованные мишени.

Проведенные структурно- функциональные исследования коротких синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов позволили выявить зависимость их цитопротективной активности от наличия последовательности Йу-Рго на С-конце пептида. Этот вывод подтверждают и другие данные, полученные в работе, в частности данные по активности ^-замещенных производных Рго-С1у-Рго. Полученные результаты могут быть использованы для проведения компьютерного конформациошюго анализа и конструирования новых пептидов, обладающих цитопротективным действием.

Проведение классического радиорецепторного анализа не выявило мест специфического связывания Рго-01у-Рго и семакса на нейронально дифференцированных и недифференцированных клетках РС12. В этой связи использование метода

фотоаффинного мечения фотоактивными радиоакгавномеченными зондами представляется наиболее перспективным для поиска молекулярных мишеней. В работе был осуществлен синтез ряда фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса. Полученные соединения охарактеризованы, исследованы их фотохимические и биологические свойства. Полученные данные указывают на возможность их использования в качестве зондов для фотоаффинного мечения. Это было подтверждено в модельных экспериментах по фотоаффинному мечению бычьего сывороточного альбумина.

Таким образом в работе были получены принципиально новые сведения о биологических свойствах коротких глицин- и лролинсодержащих пептидов и о взаимосвязи их структуры и цитопротективной активности при ОС. Кроме того, в работе разработаны методологические подходы для обнаружения и характеристики молекулярных мишеней, обуславливающих нейропротективное действие глипролинов и семакса.

ВЫВОДЫ

1. Способность эндогенного пептида Pro-Gly-Pro и его Л'-замещенных производных увеличивать выживаемость клеток в условиях окислительного стресса не имеет выраженной нейроспецифичности.

2. Наличие С-концевой последовательности Gly-Pro является необходимым условием для проявления цитопротективного действия коротких пептидов, состоящих из остатков глицина и пролила (глипролинов) на культивируемых клетках феохромоцитомы PC 12 в условиях окислительного стресса.

3. Методом классического радиорецепторного анализа не выявлены места специфического связывания пептидов Pro-Gly-Pro и АКТГ (4-7)-Pro-Gly-Pro (семакса) с клетками PC 12.

4. Получены и охарактеризованы фотоаффинные арилазидные и диазириновые производные пептидов Pro-Gly-Pro и семакса, пригодные для использования в качестве фотоаффинных зондов при поиске мишеней глипролинов.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мартынова К.В., Кириллова Ю.Г., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И., Швец В.И. Синтез фотоаффинных арилазидных производных семакса // Вестник МИТХТ. -

2007. - Т. 2. - №4. - С. 78-82.

2. Мартынова К.В., Нагаев И.Ю., Шрам С.И., Швец В.И., Мясоедов Н.Ф. Синтез и характеристика фотоактивных арилазидных производных пептидов семакса и Pro-Gly-Pro // Вестник МИТХТ. - 2008. - Т. 3. - №5. - С. 96-100.

3. Мартынова К.В., Нечаева A.B., Климова П.А., Андреева Л.А., Шрам С.И., Мясоедов Н.Ф. Исследование нейрогропной активности синтетических глипролинов в культуре клеток феохромоцитомы крысы РС12. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург. Цитология. - 2006 г. - Т. 48. - №9. - С. 779.

4. Мартынова К.В., Кириллова Ю.Г., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И.// III Российский симпозиум «Белки и пептиды», г. Пущино. 2007 г. Синтез фотоаффинных арилазидных производных семакса. С. 28.

5. Шрам С.И., Мартынова К.В., Силачев Д.Н., Апшуллин Я.В., Мясоедов Н.Ф. // «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» г. Санкт-Петербург. 2008. Изучение нейропротективных свойств коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов). С. 163-164.

6. Shram S., Martynova К., Kümo va Р., Andreeva L., Pinelis V., Myasoedov N. Synthesis and neuroprotective properties of short peptides consisting solely from glycine and proline residues. // 30 th European Peptide Symposium. Helsinki. Journal of Peptide Science. -

2008. - Suppl. to V. 14. - №8. - 2008. - P. 102.

7. Мартынова K.B., Ефремова JI.B., Шрам С.И., Мясоедов Н.Ф. Культура клеток РС12 как объект для изучения нейропротекторного действия пептидов. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург. Цитология. - 2008 г. - Т. 50. - №9. - С. 815.

8. Данюкова Т.Н., Мартынова К.В., Шрам С.И. Сравнительное исследование цитопротективного действия пептидов Pro-GIy-Pro и N-auemrc-Pro-Gly-Pro при окислительном стрессе. // 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», г. Пущино. 2008 г. С. 126.

9. Мартынова К.В., Андреева Л.А., Климова П.А., Кириллова Ю.Г., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шрам С.И., Швец В.И., Мясоедов Н.Ф. Структурно-функциональное исследование глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов) как потенциальных нейропротектров // Биоорганическая химия. В печати.

Подписано в печать 27.11.08 Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел. (495) 785-00-38 www.autoref.webstolicaru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Мартынова, Кристина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Свойства пептидных фотоаффинных зондов.

1.1. Структурные требования к фотоаффинным зондам.

1.2. Фотоактивные производные арилазидов.

2. Фотоаффинное мечение.

2.1. Характеристики поглощения фотоактивных зондов.

2.2. Аппаратурное оформление.

2.3. Условия облучения.

2.4. Необходимые контрольные эксперименты.

2.5. Анализ продуктов фотоаффинного мечения белков.

3. Синтез фотоактивируемых арилазидных зондов.

4. Сравнение эффективности использования зондов с различными типами фотоактивных групп.

5. Проблемы и ограничения метода фотоаффинного мечения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Синтез фотоактивных производных семакса и Pro-Gly-Pro.

2.2. Фотолиз фотоактивных соединений.

2.3. Мечение бычьего сывороточного альбумина п-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензил-Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (XVII).

2.4. Культивирование клеток.

2.5. Радиорецепторный анализ.

2.6. Определение степени деградации семакса и Pro-Gly-Pro в культуре клеток РС12.

2.7. Моделирование окислительного стресса в культуре клеток РС

2.8. Моделирование глутаматной экзайтотоксичности в культуре первичных нейронов мозжечка.

2.9. Определение уровня внутриклеточного Са2+.

2.10. Определение жизнеспособности клеток в культуре РС12.

2.11. Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Тест-системы для исследования нейропротективного действия глицин- и пролинсодержащих пептидов.

1.1. Модель гибели клеток под действием окислительного стресса.

1.2. Модель глутаматной экзайтотоксичности.

2. Исследование влияния пептида Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость перевиваемых культур клеток крысы в условиях окислительного стресса.

2.1. Влияние Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культуры клеток РС12.

2.2. Влияние Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культуры Rat-2.

3. Структурно-функциональное исследование синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов на модели окислительного стресса.

4. Поиск мест специфического связывания пептидов Pro-Gly-Pro и семакса с клетками РС12.

4.1. Влияние ингибиторов протеаз на стабильность Pro-Gly-Pro и семакса в культуре клеток.

4.2. Выбор оптимальной среды для проведения радиорецепторного анализа.

4.4. Связывание радиоактивномеченых Pro-Gly-Pro и семакса с клетками РС12.

5.1. Синтез фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса.

5.2. Фотолиз фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса.

5.3.Взаимодействие фотоактивного производного семакса с бычьим сывороточным альбумином.

6. Оценка биологической активности тетрафторарилазидных производных Pro-Gly-Pro и семакса.

6.1. Цитопротективное действие фотоактивных производных на модели окислительного стресса.

6.2. Нейропротективное действие фотоактивных производных в модели глутаматной экзайтотоксичности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов"

Как известно, многие вещества пептидной природы служат регуляторами важных физиологических процессов в организме. В организме человека и животных эти пептиды контролируют ряд важнейших физиологических систем: нервную, иммунную, сердечнососудистую, пищеварительную, дыхательную и др. [1]. Несмотря на интенсивные исследования регуляторных пептидов в течение последней четверти XX века, функции многих из них остаются во многом неясными. Важное место среди регуляторных пептидов занимают эндогенные регуляторы ЦНС - нейропептиды. Эта категория включает свыше 600 пептидов [2]. Физиологическая активность нейропептидов во много раз превышает аналогичное действие непептидных соединений. Многие нейропептиды проявляют выраженные нейропротективные и нейротрофические свойства [3]. Эти пептиды, в отличие от белковых факторов роста, легко проникают через гематоэнцефалический барьер, поэтому исследование свойств и функций нейропептидов и их синтетических аналогов имеет важное значение с точки зрения разработки новых лекарственных веществ.

В настоящее время все большее внимание привлекают пептиды, содержащие в своей аминокислотной последовательности остатки глицина и пролина. Предполагается, что источником этих пептидов в организме является коллаген и родственные белки, как эндогенного происхождения, так и поступающие с пищей [4]. Было показано, что глицин-и пролинсодержащие пептиды обладают рядом биологических активностей, представляющих большой практический интерес. Так, например, пептиды Pro-Gly, Gly-Pro, Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly способны подавлять процессы свертывания крови [58]; Pro-Gly, Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly - защищать слизистую желудка от различных ульцерогенных воздействий и поддерживать ее гомеостаз [9-11], пептиды Pro-Gly-Pro и Gly-Pro - нормализовать поведение при стрессорных воздействиях [12], а циклический пептид Pro-Gly - оказывать когнитивное действие [13].

Присоединение глицин- и пролинсодержащих последовательностей к С-концу ряда биологически активных пептидов позволило увеличить их устойчивость к действию протеаз. При этом было обнаружено, что эффекты регуляторного фрагмента дополняются эффектами глицин- и пролинсодержащей последовательности [14-16]. Примером такого комбинированного пептида является семакс.

Ранее было показано, что пептид Pro-Gly-Pro оказывал цитопротективное действие на нейронально дифференцированные клетки феохромоцитомы крысы PC 12 при окислительном стрессе (ОС) [17], а также препятствовал развитию отсроченной Са2+-дизрегуляции, индуцированной глутаминовой кислотой [18]. Эти данные дают основание рассматривать глипролины в качестве потенциальных нейропротекторов. Однако систематических исследований нейропротективных свойств глипролинов ранее не проводилось. Также нам представлялось интересным получить фотоаффинные зонды глипролинов для последующего поиска и идентификации специфических мишеней глипролинов на нейрональных клетках.

Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было выявление характерных особенностей строения коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов, проявляющих нейропротективное действие на моделях повреждения нейронов in vitro, а также получение фотоаффинных зондов, пригодных для поиска специфических мишеней таких пептидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние пептида Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культивируемых недифференцированных и нейронально дифференцированных клеток феохромоцитомы крысы РС12 и фибробластов из эмбрионов крысы Rat-2 в условиях окислительного стресса.

2. Исследовать зависимость цитопротективной активности ряда синтетических глипролинов от их структуры.

3. Исследовать связывание радиоактивномеченых пептидов Pro-Gly-Pro и семакса с культивируемыми клетками PC 12.

4. Получить и охарактеризовать фотоактивные арилазидные и диазириновыс производные Pro-Gly-Pro и семакса.

5. Сравнить биологические активности Pro-Gly-Pro, семакса и их фотоактивных производных на клеточной модели окислительного стресса и глутаматной экзайтотоксичности.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Метод фотоаффинного мечения часто используется для изучения взаимодействий биологически активных лигандов с их рецепторами. Так, в предметном указателе (General Index) базы данных Chemical Abstracts этот термин был ранее расположен под заголовком «Аффинность» вместе с родственными терминами, такими как аффинное мечение и аффинная колонка. Однако впоследствии (начиная с 1992 г.) с увеличением числа публикаций, связанных с использованием метода фотоаффинного мечения, этот подход был выделен в самостоятельный раздел.

Использование метода фотоаффинного мечения позволяет получить не только общие характеристики мест специфического связывания лигандов (константу диссоциации, количество мест специфического связывания и др.), но и идентифицировать белок-мишень. В основе данного метода лежит получение ковалентных сшивок между рецептором и присоединенным к нему фотоактивным лигандом под действием облучения, и последующая идентификация меченых продуктов. Для получения фотоактивного лиганда (так называемого зонда) необходимо введение в пептид фотолабильной группы, которая активируется под действием облучения с образованием высокореакционноспособного интермедиата, способного атаковать различные группы атомов.

Зонды, используемые в фотоаффинном мечении, состоят из распознающей части (радиоактивномеченого пептида), взаимодействующей с лиганд-связывающим участком белка и фотоактивной (фотолабильной) группы, которая при облучении УФ светом образует химически активный интермедиат, формирующий ковалентные связи внутри или вблизи этого участка. Предполагается, что при модификации природного лиганда фотоактивной группой сохраняются основные структурные элементы, определяющие сродство лиганда к рецептору [19].

В ходе развития метода фотоаффинного мечения были предложены различные фотоактивные группы, наиболее распространенными из которых являются арилазидные, фенилдиазириновые и кето-группы. Такое разнообразие фотоактивных групп позволяет проводить облучение при различных длинах волн и получать различную эффективность мечения [20-22], рнс. 1. фотоактивная группа I L hv ковалентная сшивка N3 азид о карбонил

N: нитрен О возбужденный карбонил

N N диазирин диаз о-группе карбен

Рис, 1. Основные фотоактивные группы и генерируемые ими активные интермедиаты [22].

Поскольку использование того или иного класса фотоаффинных групп имеет свои преимущества и недостатки, то их выбор должен осуществляться на основе поставленной задачи и с учетом свойств объекта исследования. Во многих случаях выбор исследователей останавливается на зондах на основе ари л азидов, являющихся самыми распространенными фотоактивными соединениями вследствие их стабильности в темноте, простоты синтеза и доступности предшественников.

X. Свойства пептидных фотоаффинных зондов

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мартынова, Кристина Владимировна

выводы

1. Способность эндогенного пептида Pro-Gly-Pro и его //-замещенных производных увеличивать выживаемость клеток в условиях окислительного стресса не имеет выраженной нейроспецифичности.

2. Наличие С-концевой последовательности Gly-Pro является необходимым условием для проявления цитопротективного действия коротких пептидов, состоящих из остатков глицина и пролина (глипролинов) на культивируемых клетках феохромоцитомы PC 12 в условиях окислительного стресса.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мартынова К.В., Кириллова Ю.Г., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И., Швец В.И. Синтез фотоаффинных арилазидных производных семакса // Вестник МИТХТ.

2007. - Т. 2. - №4. - С. 78-82.

3. Мартынова К.В., Нечаева А.В., Климова П.А., Андреева JI.A., Шрам С.И., Мясоедов Н.Ф. Исследование нейротропной активности синтетических глипролинов в культуре клеток феохромоцитомы крысы PC 12. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург. Цитология. - 2006 г. - Т. 48. - №9. - С. 779.

5. Шрам С.И., Мартынова К.В., Силачев Д.Н., Агниуллин Я.В., Мясоедов Н.Ф. // «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» г. Санкт-Петербург. 2008. Изучение нейропротективных свойств коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов). С. 163-164.

6. Shram S., Martynova К., Klimova P., Andreeva L., Pinelis V., Myasoedov N. Synthesis and neuroprotective properties of short peptides consisting solely from glycine and proline residues. // 30 th European Peptide Symposium. Helsinki. Journal of Peptide Sciencc.

2008. - Suppl. to V. 14. - №8. - 2008. - P. 102.

7. Мартынова K.B., Ефремова JI.B., Шрам С.И., Мясоедов Н.Ф. Культура клеток PC 12 как объект для изучения нейропротекторного действия пептидов. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург. Цитология. - 2008 г. - Т. 50.-№9.-С. 815.

8. Данюкова Т.Н., Мартынова К.В., Шрам С.И. Сравнительное исследование цитопротективного действия пептидов Pro-Gly-Pro и ]М-ацетил-Рго-01у-Рго при окислительном стрессе. // 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», г. Пущино. 2008 г. С. 126.

9. Мартынова К.В., Андреева JI.A., Климова П.А., Кириллова Ю.Г., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шрам С.И., Швец В.И., Мясоедов Н.Ф. Структурно-функциональное исследование глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов) как потенциальных нейропротектров // Биоорганическая химия. В печати.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показано, что пептид Pro-Gly-Pro и его производные оказывают цитопротективное действие при ОС не только на нейронально дифференцированные, но и на недифференцированные клетки PC 12, а также на культуру фибробластов эмбрионов крысы Rat-2.

Проведенные структурно- функциональные исследования коротких синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов позволили выявить зависимость их цитопротективной активности от наличия последовательности Gly-Pro на С-конце пептида. Этот вывод подтверждают и другие данные, полученные в работе, в частности данные по активности iV-замещенных производных Pro-Gly-Pro. Полученные результаты могут быть использованы для проведения компьютерного конформационного анализа и конструирования новых пептидов, обладающих цитопротективным действием.

Проведение классического радиорецепторного анализа не выявило мест специфического связывания Pro-Gly-Pro и семакса на нейронально дифференцированных и недифференцированных клетках PC 12. В этой связи использование метода фотоаффинного мечения фотоактивными радиоактивномеченными зондами представляется наиболее перспективным для поиска молекулярных мишеней. В работе был осуществлен синтез ряда фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса. Полученные соединения охарактеризованы, исследованы их фотохимические и биологические свойства. Полученные данные указывают на возможность их использования в качестве зондов для фотоаффинного мечения. Это было подтверждено в модельных экспериментах по фотоаффинному мечению бычьего сывороточного альбумина.

Таким образом в работе были получены принципиально новые сведения о биологических свойствах коротких глицин- и пролиисодержащих пептидов и о взаимосвязи их структуры и цитопротективной активности при ОС. Кроме того, в работе разработаны методологические подходы для обнаружения и характеристики молекулярных мишеней, обуславливающих нейропротективное действие глипролинов и семакса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Мартынова, Кристина Владимировна, Москва

1. И.П. Ашмарин / Элементы патологической физиологии и биохимии (Избранные разделы). Москва. Изд. МГУ. 1992. - 192 с.

2. Нейрохимия. Под ред. И.П. Ашмарина и П.В. Стукалова. Москва. Изд. Института биомедицинской химии РАМН. 1996. - 470 С.

3. Е.И. Гусев, В.И. Скворцова / Ишемия головного мозга. Москва. Изд. Медицина. -2001.-327 С.

4. И.П. Ашмарин и др. / Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2002. - №. 1. — С. 24-27.

5. В.Е. Пасторова, JI.A. Ляпина, Т.Ю. Смолина, И.П. Ашмарин / Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты некоторых пролинсодержащих пептидов. // Известия АН. Серия биологическая. 1998. - Т. 3. - С. 390-394.

6. В.Е. Пасторова, Л.А. Ляпина, К.А. Черкасова, И.П. Ашмарин / Пептиды как ингибиторы коагуляции тромбина и агрегации тромбоцитов. //Успехи физиологических наук. 1999. - Т.30. - С. 80-91.

7. V.E. Pastorova, L.A. Liapina, I.P. Ashmarin / Prevention of thrombus formation with glyprolines on various models of prethrombotic state and thrombosis in rats. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2003. - V. 136. - Iss. 4. - P. 364-367.

8. A.V. Trufanova et al. / Histomorphological characteristics of accelerated healing of acetate ulcers under the effect of glyprolines. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. - V. 144. - Iss. 2. - C. 258-260.

9. И.П. Ашмарин, Г.Е. Самонина, Н.Я. Железняк, З.В. Бакаева / Протекторное действие пептида PGP на слизистую оболочку желудка. // Доклады академии наук. 1999. - Т. 368. - №5. - С. 709-710.

10. G. Samonina et al. / Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simple proline-containing peptides. // Pathophysiology. 2000. - V. 7. - Iss. 1. - P. 69-73.

11. C.E. Бадмаева и др. / Действие глипролинов на стрессогенные расстройства поведения у крыс. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -2005. Т. 91. - №5. - С. 543-550.

12. Т.А. Gudasheva et al. /Novel endogenous dipeptide cycloprolyl-glycine is similar to pyracetam in selectivity of their mnemotropic effect. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1999.-V. 128.-Iss. 10.-P. 411-413.

13. И.П. Ашмарин, Н.Г Левицкая, A.A. Каменский, Н.Ф. Мясоедов / Семакс новое лекарственное средство для коррекции кровообращения мозга, гипоксических состояний и повышения умственной трудоспособности. // Фарматека. - 1997. -№. 4.-С. 32-33.

14. И.П. Ашмарин / Прогнозируемые и неожиданные физиологические эффекты олигопептидов (глипролинов, аналогов АКТГ4.10, тафцина и тиролиберина) //

15. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. — 2001. Т. 87. - №2. - С. 1471-1476.

16. М.В. Маслова и др. / Коррекция анте- и постнатальной гипоксии пептидными гормонами. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2002. - Т. 88,-№2.-С. 184-190.

17. Э.Р. Сафарова / Фармакологическое исследование цитопротекторного действия нейротропных пептидов. / Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва. ГУ НИИ Фармакологии им. Закусова РАМН. 2003. - С. 93.

18. A.N. Eberle / The melanotropins. Chemistry, physiology and mechanism of action. Karger, Basel. Switzerland. 1988. - P. 542.

19. H. Bayley, and J.R. Knowles / Photoaffinity labeling. // Methods of Enzymology 1977. -V. 46.-P. 69-114.

20. J. Brunner / Use of photocrosslinkers in cell biology. // Trends in Cell Biology. 1996. -6.-Iss. 4.-P. 154-157.

21. Y. Hatanaka, and Y.Sadakane / Photoaffinity labeling in drug discovery and developments: chemical gateway for entering proteomic frontier. // Current Topics of Medicinal Chemistry. 2002. - V. 2. - Iss. 3. - P. 271-288.

22. G. Dorman, and G.D. Prestwich / Using photolabile ligands in drug discovery and development. // Trends in Biotechnology. 2000. - V. 18. - Iss. 2. - P.64-77.

23. S.A. Fleming / Chemical Reagents in Photoaffinity Labelling. // Tetrahedron. 1995. -V. 51.-Iss. 46.-P. 12479-12520.

24. N. Soundararajan and M.S. Platz / Descriptive photochemistry of polyfluorinated azide derivatives of methyl benzoate. // Journal of Organic Chemistry. 1990. - V. 55. - P. 2034-2044.

25. F. Kotzyba-Hibert, I. Kapfer, and M. Goeldner / Recent Trends in Photoaffinity Labelling. // Angew. Chem. Int. Engl. 1995. - V. 34. - P. 1296-1312.

26. M. McRobbie / Competitive cyclisations of singlet and triplet nitrenes. Part I.

27. Cyclisation of l-(2-nitrenophenyl)pyrazoles. // Tetrahedron Letters. 1976. - V. 17. - P. 925-928.

28. K. Kanakarajan et al. / Application of Low-Temperature Methods to Photoaffinity Labeling. // Journal of American Chemical Society. 1988. - V. 110. - P. 6536-6541.

29. К.А. Chehade, and H.P. Spielmann / Facile and efficient synthesis of 4-azidotetrafluoroaniline: a new photoaffinity reagent. // Journal of Organic Chemistry. -2000. V. 65. - Iss. 16. - P. 4949-4953.

30. M.J.T. Young and M.S. Platz / Mechanistic analysis of the reactions of (pentafluorophenyl)nitrene in alkanes. // Journal of Organic Chemistry. —1991. V. 56. -Iss. 22. - P. 6403-6406.

31. R. Рое et al. / Remarkable catalysis of intersystem crossing of singlet (pentafluorophenyl)nitrene. // Journal of American Chemical Society. -1991.-V. 113.-Iss. 8.-P. 3209-3211.

32. J. F.W. Keana and S.X. Cai / New Reagents for Photoaffinity Labeling: Synthesis and Photolysis of Functionalized Perfluorophenyl Azides. // Journal of Organic Chemistry.1990. V. 55. - P. 3640-3647.

33. S.X. Cai et al. / Chlorinated phenyl azides as photolabeling reagents. Synthesis of an ortho,ortho'-dichlorinated arylazido PCP receptor ligand. // Bioconjugate Chemistry. -1993. V. 4. - Iss. 6. - P. 545-548.

34. K. Nikolics, E. Szonyi, J. Ramachandran / Photoaffinity labeling of pituitary GnRH receptors: significance of the position of photolabel on the ligand. // Biochemistry. -1988. V. 27. - Iss. 5. - P. 1425-1432.

35. M.J. Torres and M.S. Platz / A formal CH insertion reaction of an aryl nitrene into an alkyl CH bond. Implications for photoaffinity labelling // Tetrahedron Letters. 1986. -V. 27.-P. 791-794.

36. Y. Watanabe et al. / Synthesis and characterization of a photoaffinity probe possessing biotinyl and azidobenzoyl moieties for IP-3.affiniated protein. // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 1991. -V. 1. -P. 399-402.

37. D.M. Kolpashchikov / Superselective labelling of proteins: approaches and techniques. // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2003. - V. 21. - Iss. l.-P. 55-64.

38. A.N. Eberle, P.N. de Graan, J. Girard / Nitrene and carbene generating photolabels for photoaffinity labelling of MSH receptors on pigment cells. / In Peptides. Stockholm: Almqist and Wiksel. 1984. - P. 391-395.

39. J. Mazella, C.Y. Kwan, P. Kitabgi, J.P.Vincent / Covalent labeling of neurotensin receptors in rat gastric fundus plasma membranes. II Peptides. 1985. - V. 6. - Iss. 6. -P. 1137-1141.

40. P.N. de Graan, and A.N. Eberle / Irreversible stimulation of Xenopus melanophores by photoaffinity labelling with p-azidophenylaianinel3-alpha-melanotropin. // FEBS Letters. 1980,-V. 116.-Iss. l.-P. 111-115.

41. A.N. Eberle / Photoaffinity labelling of MSH receptors on Anolis melanophores: irradiation technique and MSH photolabels for irreversible stimulation. // Journal of Receptor Research. 1984.-V. 4.-Iss. 1-6.-P. 315-329.

42. B.S. Cooperman, and D.J. Brunswick / On the photoaffinity labeling of rabbit muscle phosphofructokinase with 02'-(ethyl-2-diazomalonyl)adenosine 3':5'-cyclic monophosphate. // Biochemistry. 1973. - V. 12. - Iss. 21. - P. 4079-4084.

43. A.E. Ruoho, H. Kiefer, P.E. Roeder, S.J. Singer / The mechanism of photoaffinity labeling. // Proceedings of National Academy of Science USA. 1973. - V. 70. - Iss.9. -P. 2567-2571.

44. Чард Т. / Радиоиммунологические методы. Москва. Изд. Мир. 1981. -247 С.

45. JI.A. Остерман / Использование радиоактивных изотопов. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Москва. Изд. Мир. 1983. - С. 155-268.

46. B.A.Gilbert, R.R. Rando / Modular Design of Biotinylated Photoaffinity Probes: Synthesis and Utilization of a Biotinylated Pepstatin Photoprobe. // Journal of American Chemical Society. 1995. - V. 117.-P. 8061-8066.

47. P. Matsudaira / Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. // Journal of Biological Chemistry. 1987. - V.262.-Iss. 21.-P. 10035-10038.

48. H.H. Rasmussen et al. / Microsequencing of proteins recorded in human two-dimensional gel protein databases. // Electrophoresis. 1991. - V. 12. - Iss. 11. - P. 873882.

49. J.F. Resek, and A.E. Ruoho / Photoaffinity labeling the beta-adrenergic receptor with an iodoazido derivative of norepinephrine. // Journal of Biological Chemistry. 1988. - V.263. -Iss. 28. -P. 14410-14416.

50. G. Chen, B.N. Pramanik, U.A. Mirza / Applications of LC/MS in structure identifications of small molecules and proteins in drug discovery. // Journal of Mass Spectrometry. -2007 V. 42. - Iss. 3. - P. 279-287.

51. E.P. Lau, B.E. Haley, R.E. Barden / Photoaffinity labeling of acyl-coenzyme A:glycine N-acyltransferase with p-azidobenzoyl-coenzyme A. // Biochemistry. 1977. - V. 16. — Iss. 12.-P. 2581-2585.

52. C. Garbay-Jaureguiberry et al. / Highly selective photoaffinity labeling of mu and delta opioid receptors. // Proceedings of National Academy of Science USA. 1984. - V. 81.-Iss.24.-P. 7718-7722.

53. A.N. Eberle, R. Schwyzer/ Synthese von D-Alanin',4'-azido-3',5'-ditritio-L-phenylalanin2, norvalin4.-a-melanotropin als Photoaffinitatsprobe fur Hormon-Receptor-Wechselwirkungen. // Helvetica Chimica Acta. 1976. - V. 59. - P. 2421-2431.

54. J.M. Pezzuto, and S.M. Hecht / Amino acid substitutions in protein biosynthesis. Poly(A)-directed polyphenylalanine synthesis. // Journal of Biological Chemistry. -1980. V. 255. - Iss. 3. - P. 865-869.

55. W.T. Miller, and E.T. Kaiser / Probing the peptide binding site of the cAMP-dependent protein kinase by using a peptide-based photoaffinity label. // Proceedings of National. Academy of Science USA. -1988. V. 85. - Iss. 15. - P. 429-5433.

56. W. Fischli et al. / The synthesis of 4'-azido-3',5'-ditritio-l-phenylalanine peptides as "photo-affinity probes" for ligand-receptor interaction // Helvetica Chimica Acta. 1976. -V. 59. - Iss. 3.-P. 878-879.

57. E. Escher, and R. Schwyzer / p-Nitrophenylalanine, p-azidophenylalanine, m-azidophenylalanine, and o-nitro-p-azido-phenylalanine as photoaffinity labels. //FEBS Letters. 1974. - V. 46. - Iss. 1. - P. 347-350.

58. R. Aggeler, R.A. Capaldi / Cross-linking of the gamma subunit of the Escherichia coli ATPase (ECF1) via cysteines introduced by site-directed mutagenesis. // Journal of Biological Chemistiy. 1992. - V. 267. - Iss. 30. - P. 21355-21359.

59. A.N. Eberle / Photoaffinity labelling of peptide hormone receptors. // Journal of Receptor Research. 1983. - V. 3. - Iss. 1-2. - P. 313-326.

60. C.C. Yip, C.W. Yeung, M.L. Moule / Photoaffinity labeling of insulin receptor of rat adiopocyte plasma membrane. // Journal of Biological Chemistry. 1978. - V. 253. - Iss. 6.-P. 1743-1745.

61. K. Sutoh, and F. Matsuzaki / Millisecond photo-cross-linking of protein components in vertebrate striated muscle thin filaments. // Biochemistry. 1980. - V. 19. - Iss. 16. - P. 3878-3882.

62. T.T. Ngo, C.F. Yam, H.M. Lenhoff, J. Ivy / p-Azidophenylglyoxal. A heterobifunctional photoactivable cross-linking reagent selective for arginyl residues. // Journal of Biological Chemistry. 1981. - V. 256. - Iss. 21. - P. 11313-11318.

63. E.H. Escher, and G. Guillemette / Photoaffinity labeling of the angiotensin II receptor. 3. Receptor inactivation with photolabile hormone analogues. // Journal of Medicinal Chemistry.-1979.-V. 22.-Iss. 9.-P. 1047-1050.

64. C.C. Yip, C.W. Yeung, M.L. Moule / Photoaffinity labeling of insulin receptor proteins of liver plasma membrane preparations.//Biochemistry. — 1980.-V. 19.-Iss. I.-P. 70-76.

65. C.L. Hew, J. et al. / Affinity-labeled peptides obtained from the combining region of protein 460. Light chain labeling patterns using dinitrophenyl based photoaffinity labels. // Biochemistry. 1973. - V. 12. - Iss. 23. - P. 4685-4689.

66. C.S. Kuhn, J. Lehmann, and J. Steck/ Syntheses and properties of some photolabile в-thioglycosides. Potential photoaffinity reagents for в-glycoside hydrolases. // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - Iss. 9. - P. 3129-3134.

67. E. Escher, E. Laczko, G. Guillemette, D. Regoli / Biological activities of photoaffinity labeling analogues of kinins and their irreversible effects on kinin receptors. // Journal of Medicinal Chemistry. 1981.-V. 24.-Iss. 12.-P. 1409-1413.

68. C.S. Swindell et al. / Characterization of two taxol photoaffinity analogues bearing azide and benzophenone-related photoreactive substituents in the A-ring side chain. // Journal of Medicinal Chemistry. 1994. - V. 37. - Iss. 10. - P. 1446-1449.

69. J.N. Pitts, H.W. Johnson, T. Kuwana/ Structural effects in the photochemical processes of ketones in solution. // Journal of Physical Chemistry. 1962. V. 66. - P. 2456-2461.

70. P.R. Buckland, R.D. Howells, C.R. Rickards, S.B. Rees / Affinity-labelling of the thyrotropin receptor. Characterization of the photoactive ligand. // Biochemical Journal. -1985. V. 225. - Iss. 3. - P. 753-760.

71. T. Abe, Y. et al. / Interaction of atrial natriuretic peptide with its receptors in bovine lung membranes. // Journal of Biological Chemistry. 1995. - V. 270. - Iss. 13. - P. 7672-7678.

72. B. Chatrenet et al. / Topography of toxin-acetylcholine receptor complexes by using photoactivatable toxin derivatives. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. -1990. V. 87. Iss. 9. - P. 3378-3382.

73. R.E. Galardy, L.C. Craig, J.D. Jamieson, M.P. Printz / Photoaffinity labeling of peptide hormone binding sites. // Journal of Biological Chemistry. 1974. — V. 249. - Iss. 11.-P. 3510-3518.

74. C. Icard-Liepkalns, and P. Bochet / Photoaffinity labeling of a 33 kDa protein subunit of the delta-opioid receptor in neuroblastoma and hybrid cell lines. // FEBS Letters. 1988. - V. 233. - Iss. 1. - P. 167-172.

75. J.E. Gerst, J. Sole, E. Hazum, Y. Salomon / Identification and characterization of melanotropin binding proteins from M2R melanoma cells by covalent photoaffinity labeling. // Endocrinology. 1988. - V. 123. - P. 1792-1797.

76. C. Shigeno et al. / Interaction of human parathyroid hormone-related peptide with parathyroid hormone receptors in clonal rat osteosarcoma cells. //. Journal of Biological Chemistry. 1988. - V. 263. - Iss. 34. - P. 18369-18377.

77. R.G. Jr. Hammonds, M. Westphal, C.H. Li / Beta-endorphin: photoaffinity labelling of a non-opioid binding site in a human neuroblastoma. // Biochemical and Biophisical Research Communications. 1985. - V. 128. - P. 1310-1314.

78. P. Berhanu. / Internalized insulin-receptor complexes are unidirectionally translocated to chloroquine-sensitive degradative sites. Dependence on metabolic energy. // Journal of Biological Chemistry. 1988. - V. 263. - Iss. 12. - P. 5961-5969.

79. E. Carnazzi et al. / Efficient photoaffinity labeling of the rat Via vasopressin receptor using a linear azidopeptidic antagonist. // European Journal of Biochemistry. 1997. - V. 247.-P. 906-913.

80. C.R. Kemnitz, W.L. Karney, W.T. Borden / Why Are Nitrenes More Stable than Carbenes? // Journal of American Chemical Society. 1998. - V. 120. - P. 3499-3503.

81. U.K. Laemmli / Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - Iss. 5259. - P. 680-685.

82. J.M. Darbon, J. Userly, P. Leymarie / Correlation between protein phosphorylation and progesterone synthesis in bovine luteal cells stimulated by lutropin. // European Journal of Biochemistry. 1981. - V. 119. - P. 237-243.

83. Б.И.Ходоров и др.. / Митохондриальная деполяризация играет доминирующую роль в механизме нарушения нейронального кальциевого гомеостаза, вызванного глутаматом. // Биологические мембраны. Т. 18. - №6. - С. 419-430.

84. О.Ю. Реброва / Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. / Москва. Изд. МедиаСфера. 2002. - 312 С.

85. G.R. Jackson et al. / Nerve growth factor effects on pyridine nucleotides after oxidant injury of rat pheochromocytoma cells. // Brain Research. 1992. - V. 592. - Iss. 1-2. - P. 239-248.

86. D.B. Hinshaw, et al. / ATP depletion induces an increase in the assembly of a labile pool of polymerized actin in endothelial cells. // American Journal of Physiology. 1993. -V. 264.-Iss. 5.-P. 1171-1179.

87. D.B. Hinshaw et al. / ATP and microfilaments in cellular oxidant injury. // American Journal of Pathology. 1988. - V. 132. - Iss. 3. - P. 479-488.

88. D.B Hinshaw et al. / A cellular model of oxidant-mediated neuronal injury. // Brain Research. 1993,-V. 615.-Iss. l.-P. 13-26.

89. P.S. Kellerman / Exogenous adenosine triphosphate (ATP) preserves proximal tubule microfilament structure and function in vivo in a maleic acid model of ATP depletion. // Journal of Clinical Investigation. 1993. - V. 92. - Iss. 4. - P. 1940-1949.

90. Ф. Xyxo. / Нейрохимия. Основы и принципы. Москва. Изд. Мир. 1990. - 384 С.

91. D.G. Nicholls /Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal cultures. // Current Molecular Medicine. 2004. - V. 4. - Iss. 2. - P. 149-177.

92. B. Khodorov / Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2004. - V. 86. - Iss. 2. - P. 279-351.

93. R.F. Castilho / Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. // Journal of Neuroscience. 1998. - V. 18. - Iss. 24. - P. 1027710286.

94. Б.И. Ходоров и др. / Митохондриальная деполяризация играет доминирующую роль в механизме нарушения нейронального кальциевого гомеостаза, вызванного глутаматом. // Биологические мембраны. 2001. - Т. 18. - №6. - Р. 419-430.

95. A.M. Surin et al. / Arachidonic acid enhances intracellular [Ca2+]i increase and mitochondrial depolarization induced by glutamate in cerebellar granule cells. // Biochemistry. 2006. - V. 71. - Iss. 8. - P. 864-870.

96. Haddox J.L. et al. / Bioactivity of peptide analogs of the neutrophil chemoattractant, N-acetyl-proline-glycine-proline. // 1999. V.40. - Iss. 10. - P. 2427-2429.

97. N.M. Weathington / A Novel Peptide CXCR Ligand Derived from Extracellular Matrix Degradation During Airway Inflammation. // Nature Medicine. 2006. - V.12. - Iss. 3. -P. 317-323.

98. N.M. Weathington / Reply to a Novel Peptide CXCR Ligand Derived from Extracellular Matrix Degradation During Airway Inflammation. // Nature Medicine. 2006. - V. 12. -Iss. 6.-P. 603-604.

99. E.R. Safarova, S.I. Shram, Y.A. Zolotarev, N.F. Myasoedov / Effect of Semax peptide on survival of cultured rat pheochromocytoma cells during oxidative stress. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2003. - V. 135. - Iss. 3. - P. 268-271.

100. F. Solca et al. / The receptor for alpha-melanotropin of mouse and human melanoma cells. Application of a potent alpha-melanotropin photoaffinity label. // Journal of Biological Chemistry. 1989.-V. 264. - Iss. 4. - P. 14277-14281.

101. S.A. Tishler and L.A. Green / Morphologic and Cytochemical Properties of a Clonal Line of Rat Adrenal Pheochromocytoma Cells Which Respond to Nerve Growth Factor. // Laboratory Investigation. 1978. - V. 39. - Iss. 2. - P. 77-89.

102. D.N. Dixon / Comparative Studies of PC12 and Mouse Pheochromocytoma-Derived Cell Lines as Models for the Study of Neuroendocrine Systems. // In Vitro Cellular and Developmental. Biology. -Animal. 2005. - V. 41. - P. 197-206.

103. A.S. Tischler, J.F. Powers, J. Alroy / Animal models of pheochromocytoma. // Histology and Histopathology. 2004. - V. 19. - P. 883-895.

104. P.W. Mesner, T.R. Winters, S.H. Green / Nerve growth factor withdrawal-induced cell death in neuronal PC 12 cells resembles that in sympathetic neurons. // Journal of Cell Biology. 1992. - V. 119. - Iss. 6. - P. 1669-1680.

105. P.W. Mesner, C.L. Epting, J.L., Hegarty, S.H. Green / A timetable of events during programmed cell death induced by trophic factor withdrawal from neuronal PC 12 cells. // Journal of Neuroscience. 1995. - V. 15. - Iss. 11. - P. 7357-7366.

106. M.M. Halleck, J.H. Richburg, F.C. Kauffman / Reversible and irreversible oxidant injury to PC12 cells by hydrogen peroxide. // Free Radical Biology and Medicine. 1992. - V.12. - Iss. 2. - P. 137-44.

107. Z. Zhang et al. / Impairment of integrin-mediated cell-matrix adhesion in oxidant-stressed PC 12 cells. // Brain Research. 1994. - V. 662. - Iss. 1-2. - P. 189-97.

108. W.C. Topp / Normal rat cell lines deficient in nuclear thymidine kinase. // Virology. -1981.-V. 113.-Iss. l.-P. 408-411.

109. Dolotov O.V. et al. / The binding of Semax, ACTH 4-10 heptapeptide, to plasma membranes of the rat forebrain basal nuclei and its biodegradation. // Bioorganicheskaya Khimiia. 2004. - V. 30. - Iss. 3. - P. 241-246.

110. T.V. V'yunova et al. / Specific binding of semax in different regions of the rat brain. // Doklady Biological Sciences. 2006. -V. 410. - P. 376-377.

111. T.V. V'yunova et al. / Binding of tripeptide Pro-Gly-Pro labeled at the C-terminal proline residue to plasma membranes of the rat forebrain. // Doklady Biological Sciences. -2008.-V. 419.-P. 95-96.

112. S.-Y. Han and Y.-A. Kim / Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis. // Tetrahedron. 2004. - V. 60. - P. 2447-2467.

113. K.B. Мартынова и др. / Синтез фотоаффинного арилазидного производного семакса. // Вестник МИТХТ. 2007. Т. 2. - №4. - С. 78-82.

114. F. Thunecke et al. / Kinetic study of the cis-trans isomerisation of peptidyl-proline dipeptides. // Journal of Chromatography. A. 1996. - V. 744. - Iss. 1-2. - P. 259-272.

115. T. Munequmi, A. Shimoyama / Development of homochiral peptides in the chemical evolutionary process: Separation of homochiral and heterochiral oligopeptides. // Chirality. -2003. — V.15. — Suppl. SI.-P. S108-S115.

116. М.В. Тараненко, М.Т. Мчелидзе / Изучение кинетики фотолиза соединений, содержащих арил(трифторметил)диазириновую группу. // Вестник Московского Университета. Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43. - №1. - С. 47-50.

117. Y. Hatanaka, Н. Nakayama, Y. Kanaoka / Diazirine-bazed Photoaffinity Labelling: Chemical Approach to Biological Interfaces. // Rewies on Heteroatom Chemistry. 1996. -V. 14.-P. 213-243.1. БЛАГОДАРНОСТИ

118. Московская академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова:акад. РАМН, д.х.н. Швецу В.И. к.х.н. Кирилловой Ю.Г.

119. Институт молекулярной генетики РАН:акад. РАН, д.х.н. Мясоедову Н.Ф., к.х.н. Шраму С.И., д.х.н. Шевченко В.П., к.х.н. Нагаеву И.Ю.,

120. Андреевой Л.А., к.х.н. Шевченко К.В.

121. Институт педиатрии научного центра здоровья детей РАМН:д.м.н. Пинелису В.Г., к.х.н. Сурину A.M.

Информация о работе

Мартынова, Кристина Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы