Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов

Бантыш, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов"

На правах рукописи

Бантыш Ольга Борисовна

Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина С и его гомологов

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 5МАР 2015

Москва 2015

005561070

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Защита диссертации состоится 21 апреля 2015 года на утреннем заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

http://www.genebiology.ru/dissertation/dis-7/Bantysh-dissertation.pdf

Научный руководитель: Северинов Константин Викторович,

доктор биологических наук, профессор.

Официальные оппоненты: Колб Вячеслав Адамович,

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов биосинтеза белка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института белка Российской академии наук.

Гельфанд Михаил Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научным вопросам Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. А.А.Харкевича Российской академии наук.

2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

^¿^^^Любовь Сергеевна Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. По данным Всемирной организации здравоохранения, одной из серьезнейших проблем, стоящей перед человечеством, является развитие устойчивости бактериальных патогенов к антимикробным препаратам, широко применяющимся в медицинской практике. Поиск новых потенциальных антибиотиков, а также улучшение свойств уже известных антимикробных соединений - актуальная задача, стоящая перед учеными всего мира. Одним из перспективных направлений в этой области является изучение бактериоцинов и микроцинов - антимикробных соединений на основе пептидов, синтезируемых на рибосомах, и, в частности, микроцина С.

Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик, продуцируемый кишечной палочкой и активный против многих бактерий. За синтез микроцина С и устойчивость клеток-продуцентов к этому антибиотику ответственны продукты шести генов. Пять из них mccABCDE организованы в оперон, транскрибируемый с общего промотора. Ген тссА кодирует гептапептид-предшественник микроцина С (MRTGNAN). Продукты генов тссВ, mccD и тссЕ обеспечивают созревание микроцина: внесение пост-трансляционных модификаций в пептид МссА. При этом белок МссВ является первым и наиболее важным участником этого процесса: в ходе двустадийной реакции он аденилирует пептид МссА по С-концевому остатку аспарагина. В результате образуется микроцин С с молекулярной массой 1092 Да (МсС1092), который способен ингибировать рост бактериальных клеток. Микроцин С - это антибиотик действующий по принципу Троянского коня: он проникает в клетки за счет облегченного транспорта, обеспечиваемого пептидной частью. В цитоплазме клетки пептидная часть микроцина С разрушается под действием пептидаз широкого спектра действия. В результате чего высвобождается токсин - аспартил-аденилат, который представляет собой аналог активированной аминокислоты. Этот токсин ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу, тем самым блокируя жизненно важный клеточный процесс - синтез белка.

До сегодняшнего дня единственным известным организмом, способным продуцировать микроцин С, была кишечная палочка. О существовании других микроцин С-подобных соединений не было известно. В то же время потенциальные гомологи микроцинового оперона были предсказаны ранее (Severinov К. at al., 2007). Наша работа посвящена структурно-функциональному

анализу микроцина С Escherichia coli, изучению его гомологов из различных бактерий, а также созданию новых, не существующих в природе антибиотиков на основе микроцина С. Новые микроцин С-подобные соединения, изученные в данной работе, за счет измененной пептидной части, обладают способностью проникать в бактериальные клетки посредством различных транспортных путей, что открывает перспективы использования таких пептид-нуклеотидов против различных патогенов.

Цели и задачи исследования.

Целями данной работы было: 1) подтвердить существование ранее предсказанных аналогов микроцина С, закодированных в /исс-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli, и продемонстрировать антибактериальную активность таких соединений, а также 2) установить принципиальную возможность использования микроцин С синтазы МссВ Escherichia coli для создания новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной пептидной частью.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Получить рекомбинантные белки - гомологи микроцин С синтазы МссВ Escherichia coli из организмов Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsortii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. и продемонстрировать их аденилат-трансферазную активность в присутствии предсказанных пептидных субстратов.

2. Наработать пептид-нуклеотиды, отличные от микроцина С Е. coli и продемонстрировать их антибактериальное действие на клетки Е. coli.

3. Определить набор субстратов, которые способны аденилироваться белком МссВ Е. coli in vitro и провести сравнительное исследование активности полученных пептид-аденилатов.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

В данной работе впервые были экспериментально подтверждены биоинформатически предсказанные пептид-нуклеотидные соединения, кодируемые отсс-подобными оперонами из Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. Впервые была продемонстрирована антибактериальная активность этих соединений. На основании анализа структуры фермент-субстратного комплекса белка МссВ Е. coli с его природным пептидным

субстратом MccA (MRTGNAN), впервые получены синтетические варианты микроцина С Е. coli. Некоторые из полученных синтетических аналогов обладали повышенной антибактериальной активностью. Получены новые микроцин С-подобные соединения, способные проникать в бактериальные клетки посредством различных транспортных путей, что позволяет решить проблему возникновения устойчивости к действию этих соединений за счет часто встречающихся мутаций, нарушающих лишь один из транспортных путей. Также впервые был разработан и апробирован высокоэффективный способ внесения пост-трансляционной модификации (аденилирования) в белковые молекулы, содержащие на своем С-конце последовательность пептида MccA Е. coli, с помощью белка МссВ Е. coli. Этот способ можно применять в лабораторной практике для внесения специфических меток (например, радиоактивных) в белковые молекулы, а полученные новые природные и синтетические антибактериальные соединения могут быть использованы для создания новых антибактериальных препаратов на их основе.

Методология и методы исследования.

Работа выполнена на современном оборудовании, с применением методов молекулярной биологии, биохимии, микробиологии и биоинформатики.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментально подтверждены сделанные ранее биоинформатические предсказания о существовании пептид-нуклеотидных соединений, подобных микроцину С Е. coli, и закодированных в геномах Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp., а также показано, что такие гомологи микроцина С обладают антибактериальной активностью по отношению к клеткам Е. coli и действуют по механизму, аналогичному описанному ранее для микроцина С Е. coli.

2. Белок МссВ Е. coli аденилирует пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с заменой N-концевого остатка метионина на аминокислоты с крупными гидрофобными боковыми радикалами, также как и пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с дополнительными аминокислотами на N-конце. Удлинение пептидного субстрата до определенного предела стимулирует эффективность узнавания ферментом МссВ и антибактериальные свойства получаемых аналогов микроцина С.

3. MccB E. coli можно использовать для концевого аденилирования белков, несущих на своём С-конце последовательность MRTGNAN, in vitro и in vivo.

Степень достоверности и апробация результатов.

По результатам диссертационной работы было опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в международных рецензируемых журналах и 5 тезисов конференций. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 14-17 ноября, 2011, Москва, Россия; 2) "XXIV Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 7-9 февраля, 2012, Москва, Россия; 3) "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты", 13 апреля, 2012, Москва, Россия; 4) 22nd IUMBB & 37th FEBS Congress, 4-9 September, 2012, Seville, Spain; 5) "IX молодежная школа-конференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", 21-23 октября, 2013, Москва, Россия.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа включает в себя разделы "Общая характеристика работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты работы", "Обсуждение полученных результатов", "Выводы", "Список используемой литературы". Работа изложена на 159 страницах машинописного текста. В диссертации процитировано 93 работы; диссертация содержит 45 рисунков и одно приложение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты исследования и их обсуждение

1. Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового оперона.

Ранее в работе Северинова и соавторов было предсказано существование микроцин С-подобных оперонов в различных бактериях (Severinov К. at al., 2007). Из опубликованного в упомянутой работе списка организмов, несущих на плазмидах или в геноме потенциальные гомологи генов микроцинового кластера, мы выбрали Bartonella washoensis Sb944nv, Helicobacter pylori (плазмиды HPP12 и pHPM8) и Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 (Грамм-отрицательные бактерии), Lactobacillus johnsonii NCC 533 и Streptococcus thermophilus LMD-9 (Грамм-положительные бактерии), а также цианобактерию Synechococcus sp. CC9605 (Цветная вставка 1, Рис.1).

Потенциальные гены тссА, как правило, располагаются в непосредственной близости от открытой рамки считывания (далее ОРС) гомолога МссВ. Все кодируемые предсказанными генами тссА пептиды содержат на С-конце остаток аспарагина, аналогично МссА Е. coli (Табл. 1). При этом предсказанные пептиды имеют длину 7 аминокислот, т.е. как и МссА Е. coli, в случае Bartonella, Helicobacter, Lactobacillus и Streptococcus, а у Yersinia и Synechococcus длина этих пептидов значительно больше.

Таблица 1. Последовательности предсказанных пептидов МссА, закодированных в оперонах, найденных у различных бактерий, гомологичных »icc-оперону Е. coli.

С-концевой аспарагин выделен жирным шрифтом.

Оргаиизм MccA

Escherichia coli pMccC7 плазмида MRTGNAN

Bartonella washoensis Sb944nv MDHIGFN

Helicobacter pylori плазмиды HPP12 и pHPM8 MKLSYRN

Lactobacillus johnsonii NCC 533 MHRIMKN

Streptococcus thermophilus LMD-9 MKGTILN

Yersinia pseudotuberculosis IP 32953 MYQVGIILSIKCN

Yersinia pseudotuberculosis PB 1/+ MHQSEIKLTKRLKIKRVDVNKVKEQQKKVLECGAATCGGGSN

Synechococcus sp. CC9605 MTQPNDRQLSNEELSDVÄAGLFRRTFFKPRTSRKTLLQPKRLD KVAKNQLWADMMN

2. Энзиматический синтез аденилированных МссА пептидов in vitro.

Белок МссВ Е. coli - это важнейший участник синтеза микроцина С. Он вносит первую и наиболее важную пост-трансляционную модификацию -аденилирует пептид-предшественник МссА (MRTGNAN) с образованием микроцина С 1092 (МсС1092, Mw=1092 Да). Для проверки энзиматической активности предсказанных гомологов белка МссВ, мы применилиописанный ранее метод in vitro синтеза МсС1092 (Roush R.F. at al., 2008). В основе метода лежит использование рекомбинантного фермента МссВ для модификации химически синтезированного пептида МссА в присутствии АТФ. Мы получили очищенные рекомбинантные белки гомологи МссВ из Н. pylori (плазмиды рНРМ8 и НРР12), S. thermophilus LMD-9, L. johnsonii NCC 533, В. washoensis Sb944nv и

Synechococcus sp. CC9605, а также укороченную версию гомолога MccB Y. pseudotuberculosis IP32953, в которой отсутствовал не охарактеризованный С-концевой метилазный домен специфичный только для этого белка (полноразмерный белок в использованной системе плохо нарабатывался). Предсказанные пептидные субстраты МссА были получены методом твердофазного химического синтеза. Исключение составил предполагаемый МссА пептид Synechococcus sp. (длиной 56 аминокислот, далее а.к.), который был получен экспрессией в Е. coli. Он отличался от предсказанного МссА Synechococcus sp. тем, что вместо N-концевого метионина нес три дополнительные аминокислоты (SGS) и имел длину 58 а.к. Полученные МссВ белки протестировали на способность аденилировать соответствующие пептидные субстраты в присутствии АТФ. В качестве отрицательного контроля использовали реакционные смеси без добавления АТФ. Продукты реакций анализировали с помощью MALDI-TOF MS (времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией вещества с помощью матрицы и лазерного излучения) (некоторые результаты представлены на Рис. 2).

Предсказанные гептапептидные гомологи МссА из В. washoensis Sb944nv (MDHIGFN), S. thermophilus LMD-9 (MKGTILN) и L. johnsonii NCC 533 (MHRIMKN) узнаются и аденилируются соответствующими ортологами МссВ. Также гомолог МссВ из Synechococcus sp. СС9605 узнает и аденилирует свой предсказанный субстрат (Рис. 2). Однако, нам не удалось получить аденилированного продукта в реакции с предсказанным МссА из Y. pseudotuberculosis IP32953 (Табл. 1) (Severinov К. at al., 2007). В более поздней аннотации генома близкородственного организма Y. pseudotuberculosis РВ1/+ (NC_010634.1), у которого также предсказаны вероятные гомологи генов тсс-оперона, предложена альтернативная ОРС, которая кодирует пептид длиной 42 а.к. с С-концевым остатком аспарагина (YP_001872354.1) (Табл. 1). Аналогичный ген можно найти в геноме Y. pseudotuberculosis IP32953. Такой пептид аденилировался рекомбинантным гомологом МссВ Y. pseudotuberculosis IP32953. Таким образом мы подтвердили более позднее биоинформатическое предсказание и опровергли сделанное ранее предсказание для фермент-субстратной пары МссА-MccB Y. pseudotuberculosis. Все другие предсказания фермент-субстратных пар оказались верными. Стоит заметить, что все МссВ-подобные белки были строго специфичны по отношению к пептидному субстрату.

-АТФ

+АТФ 763.5

Escherichia coli

-АТФ

776.5 Streptococcus thermophilus LMD-9

+АТФ

■АТФ

6697 Synechococcus sp. CC9605

+АТФ

1100 m1г ..........6600" ~ ~ 6ecig ~ .........7óó0 "

Рисунок 2. Продукты реакции in vitro аденилирования предсказанных пептидов MccA гомологами МссВ. Представлены масс-спектры некоторых продуктов реакции. "+АТФ" -пептиды инкубировали с соответствующим ферментом МссВ и с АТФ, "-АТФ" - контрольные реакции без АТФ. Массы исходных пептидов и продуктов реакции (+329 ед.м. относительно массы исходного пептида) обозначены цифрами над соответствующими пиками. Звездочкой "*" обозначены пики, соответствующие массам интермедиатов реакции.

Практически во всех реакциях, в которых мы наблюдали образование аденилированного продукта, на масс-спектрах также обнаруживался пик с массой на 18 ед.м. меньшей массы исходного пептида (Рис. 2). Этот пик соответствует образованию интермедиата - сукцинимидного производного соответствующего МссА, что является указанием на то, что механизм энзиматической реакции у всех исследованных гомологов сходен с описанным ранее для МссВ Е. coli (Roush R.F. at al., 2008), т.е. является универсальным. Мы полагаем, что наличие аденилат-трансферазной активности у МссВ-подобных ферментов по отношению к своим пептидным субстратам говорит в пользу функциональной активности оперонов, гомологичных оперону генов синтеза микроцина С Е. coli.

3. Биологическая активность аденилированных пептидов.

Мы предположили, что полученные микроцин С-подобные соединения обладают антибактериальной активностью, аналогично МсС1092. Мы протестировали эти пептид-аденилаты на способность угнетать рост клеток Е. coli. Для этого образцы (10 мкл) реакционных смесей, содержащих аденилированные пептиды (см. выше), наносили на газон клеток Е. coli В. В качестве отрицательного контроля использовали изогенный штамм Е. coli, в котором был делетирован ген yejB, кодирующий одну из субъединиц транспортера YejABEF, отвечающего за вход микроцина С в клетку (Novikova М. at al., 2007). Результаты суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Антибактериальная активность полученных in vitro соединений, подобных МсС1092. "+" - образование зон ингибирования роста клеток, "-" - отсутствие зон ингибирования. Для рекомбинантного МссА из Synechococcus sp. СС9605 три гетерологичные N-концевые аминокислоты отмечены жирным шрифтом. "*" - результаты, полученные с использованием синтетических пептидов, соответствующих 25 и 20 аминокислотным С-концевым фрагментам МссА Synechococcus sp. СС9605. В строке "Микроцин В" показаны результаты, полученные при нанесении на газоны клеток микроцина В Е. coli (использовался, как контроль на SbmA-зависимый, YejABEF-независимый транспорт). Скобками обозначены пробы, в которых количество исходного пептида, взятого для реакции аденилирования, было, как минимум, на порядок меньше по сравнению с остальными реакциями.

Источник Аденилированный пептид E. coli В E. coli В AyejB E. coli В AsbmA

Е. coli MRT GNAD-AM P + - +

В. washoensis Sb944nv MDHIGFD-AMP - - -

Н. pylori Р12 MKLSYRD-AMP + - +

L. johnsonii NCC 533 MHRIMKD-AMP + - +

S. thermophilus LMD-9 MKGTILD-AMP + - +

Y. pseudotuberculosis PB1/+ MHQSEIKLTKRLKIKRVDVNKVKE QQKKVLECGAATCGGGSD-AMP SGSTQPNDRQLSNEELSDVAAGLF - - -

Synechococcus sp. CC9605 RRTFFKPRTSRKTLLQPKRLDKVA KNQLWADMMD-AMP

Synechococcus sp. CC9605* SRKTLLQPKRLDKVAKNQLWADMM D-AMP + + -

Synechococcus sp. CC9605* LQPKRLDKVAKNQLWADMMD-AMP - - -

E. coli Микроцин В + + -

Реакции, содержащие аденилированные пептиды из Е. coli, S. thermophilus, L. johnsonii и H. pylori, ингибируют рост клеток Е. coli В дикого типа, но не оказывают угнетающего действия на рост клеток Е. coli В AyejB (Табл. 2). Это указывает на сходный с МсС1092 Е. coli механизм проникновения в клетки этих соединений посредством транспортера YejABEF (Novikova М. at al., 2007).

Полноразмерный аденилированный рекомбинантный пептид МссА Synechococcus sp. не ингибировал рост клеток Е. coli В. Мы предположили, что такой пептид слишком велик, чтобы проникнуть в клетку через пептидный

транспортер. Поэтому мы протестировали укороченные версии пептида МссА Synechococcus sp.: синтетические пептиды, соответствующие С-концевым фрагментам МссА Synechococcus sp. СС9605 длиной 25, 20, 15 и 10 а.к. МссВ узнает и аденилирует только пептиды длиной 20 и 25 а.к. (данные не представлены). При этом пептид-аденилат с длиной пептидной части 25 а.к. ингибирует рост как клеток дикого типа, так и мутантных клеток Е. coli В AyejB (Табл. 2). Интересно, что клетки Е. coli В AsbmA, устойчивые к действию микроцина В (неродственного антибиотика, с длиной пептидной части 43 а.к.), также оказались устойчивы к действию этого пептид-аденилата (Табл. 2). Таким образом микроцин С-подобное соединение из Synechococcus sp. с пептидной частью длиной 25 а.к. проникает в клетки посредством транспортера SbmA, а не YejABEF.

Продукты реакций аденилирования пептидов МссА из В. washoensis Sb944nv и Y. pseudotuberculosis IP32953 не образовывали зон ингибирования роста. Мы предположили, что эти соединения либо не проникают в клетку, либо не подвергаются протеолизу в цитоплазме кишечной палочки с высвобождением токсина, ингибирующего аспартил-тРНК-синтетазу. Описанные ниже опыты подтвердили последнее предположение.

4. Активность аденилированных пептидов in vitro.

Показав антибактериальную активность полученных пептид-аденилатов, мы

решили удостовериться, совпадает ли их внутриклеточная мишень с мишенью

микроцина С1092. Для этого протестировали способность полученных соединений

ингибировать аспартил-тРНК-синтетазу in vitro, аналогично микроцину С Е. coli. Аликвоты реакционных смесей, содержащих соответствующие пептид-аденилаты, добавляли к S30 экстрактам клеток Е. coli BW25113. В качестве отрицательного контроля добавляли реакционные смеси без АТФ. Экстракты инкубировали в течение 15 минут (время достаточное для протеолиза пептидной части МсС1092)

(Metlitskaya A. et al., 2006, Kazakov Т. et al., 2008). Активность аспартил-тРНК-

синтетазы регистрировали измеряя включение радиоактивно меченного аспартата

14C-Asp во фракцию тРНК (Рис. 3).

Добавление к S30 клеточному экстракту реакционной смеси, содержащей

аденилированный пептид Е. coli (MRTGNAN-AM®), уменьшает включение 14С-Asp во фракцию тРНК аспартил-тРНК-синтетазой приблизительно на один

порядок относительно контроля. Сопоставимое уменьшение включения HC-Asp во

® 0.8 i ф

2 0.6 с x ш

8 0.4

z Л

p 0.2 s о о

к 0

■

сУ . с

Г ^

/г

фракцию тРНК наблюдалось при использовании пептид-аденилатов других микроорганизмов.

Рисунок 3. Ингибирование аспартил-тРНК-синтетазы различными аналогами

МсС1092. Представлено

относительное включение ,4С-Asp во фракцию тРНК: ерш нерастворимой в кислоте фракции при добавлении к S30 экстракту реакции, содержащей пептид-аденилат, нормировали на ерт нерастворимой в кислоте фракции при добавлении к S30 экстракту отрицательного

контроля.

Исключение составили реакционные смеси, содержащие аденилированные пептиды из В. washoensis и У. pseudotuberculosis, которые слабо ингибировали активность аспартил-тРНК-синтетазы (соответственно, около 50% и 90%). Вероятно, это связано с замедленным, по сравнению с МсС1092 Е. coli, протеолитическим процессингом пептидной части пептид-аденилатов В. washoensis и Y. pseudotuberculosis в S30 экстрактах Е. coli BW25113. Для проверки этого предположения мы сравнили скорость процесса деградации немодифицированных пептидов МссА В. washoensis и Е. coli в S30 экстрактах Е. coli В W25113с помощью масс-спектрометрии (Рис. 4).

После первых 5 минут инкубации у обоих пептидов с приблизительно одинаковой эффективностью отщепляется N-концевой метионин (Mw£co/,(RTGNAN) = 632 Да, MwaWlo<,„Jis(DHIGFN) = 702 Да). Через 15 минут инкубации в клеточном экстракте масс-пик, соответствующий пептиду МссА Е. coli с отщепленным N-концевым метионином практически не идентифицируется, также как и другие продукты его протеолиза, что соответствует известному значению времени, необходимому для ингибирования аспартил-тРНК-синтетазы. Напротив, через 15 минут после начала эксперимента пептид MDHIGFN (Mw = 833 Да) В. washoensis Sb944nv и его производное DHIGFN, потерявшее N-

концевой метионин, сохраняются. Масс-пики, соответствующие дальнейшим стадиям протеолиза пептида В. washoensis Sb944nv за счет действия N-концевых пептидаз, обнаруживаются только через 60 минут инкубации с клеточным экстрактом. Полученные данные следует рассматривать как качественные, тем не менее, они объясняют низкий уровень ингибирования ферментативной активности аспартил-тРНК-синтетазы пептид-аденилатом из В. washoensis Sb944nv (Рис. 3).

Рисунок 4. Сравнение скорости протеолиза 0 мин пептидов МссА из Е. coli и В. washoensis Sb944nv в клеточных экстрактах Е. coli.

Смесь пептидов Е. coli MRTGNAN (Mw=763

Да) и В. washoensis MDHIGFN (Mw=833 Да)

5 мин дыла добавлена к S30 клеточным экстрактам

Е. coli BW25113. В определенные моменты

времени (отмечены справа) отбирались

аликвоты и анализировались с помощью

MALDI-TOF MS. Представлены полученные

масс-спектры. Над пиками исходных

_пептидов показаны их массы в ед.м.. Сдвиги

масс, соответствующие отщеплению 60 мин J

аминокислот с N-конца, показаны

горизонтальными линиями, в центре которых

__ приведено название отщепленного

500 600 700 800 900 1000 m/z

аминокислотного остатка.

5. Биологическая активность аминопропилированных микроцин С-подобных соединений.

Микроцин МсС1149, несущий дополнительную аминопропильную группу, по сравнению с вариантом, не несущим аминопропила (МсС1092), проявляет значительно большую антибактериальную активность по отношению к Е. coli, а микроциновый токсин (негидролизуемый аспартил-аденилат), с аминопропильной группой ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу приблизительно в 10 раз более эффективно, чем токсин без такой группы (Metlitskaya A. at al., 2009). Мы сравнили антибактериальную активность аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii и его аналога, полученного энзиматически in vitro. Для этого очищенный аденилированный пептид MHRIMKD-АМФ модифицировали в реакции с ферментами MccD и МссЕ Е. coli in vitro (ферменты для аминопропилирования любезно предоставлены Дубилей С.А. и Куликовским

763.5 833.5

[ill.

702^5_ 833,5

632,5 763,5

702ß_ 833,5

763,5

1 [Li .

А.Д.). Следует заметить, что содержащий аминопропил пептид-аденилат L. johnsonii, по всей видимости, не существует в природе, так как соответствующий тсс оперон не содержит генов-гомологов mccD и тссЕ. Аминопропилированный пептид-аденилат и не аминопропилированный контроль наносили на газон Е. coli В в четырех последовательных разведениях антибиотика. После нескольких часов инкубации клеток при температуре 37 °С наблюдали образование зон ингибирования роста (Рис. 5). Аминопропилированный аналог микроцина С L. johnsonii проявляет как минимум в 4 раза большую антибактериальную активность, по сравнению с природным не аминопропилированным MHRIMKD-АМФ.

L.j.McC1315

L.j.McC1258

Рисунок 5. Сравнение антибактериальных активностей микроиин С-подобных соединений L. johnsonii, несущих аминопропильную модификацию и без неё. Фотография газона клеток Е. coli В: зоны ингибирования роста, образовавшиеся при нанесении на газон реакционной смеси, содержащей MHRIMKD-AM® (Mw=1258 Да) (L.j.McC1258) и аминопропилированный пептид MHRIMKD-AM® (Mw=1315 Да) (L.j.McC1315 ).Концентрации микроцин С-подобных соединений указаны сверху.

6. Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз.

Ранее было показано, что семейство белков МссВ филогенетически близко семейству РааА (белок PaaA Pantoea agglomerans участвует в биосинтезе антибиотика пантоцина А). Как и МссВ, белок РааА модифицирует остаток аспарагина, но не концевой, а расположенный внутри аминокислотной последовательности своего пептидного субстрата. И МссВ, и РааА являются представителями суперсемейства ThiF/HesA/MoeB/El фосфотрансфераз или Е1-суперсемейства (Burroughs A.M. et al., 2009). Мы построили общее филогенетическое древо гомологов белков МссВ и РааА путем систематического анализа последовательностей полностью секвенированных бактериальных геномов (на момент февраль-март 2013 года) (Цветная вставка 2, Рис. 6).

5 мкМ 2.5 мкМ 1.25 мкМ 0.63 мкМ

тссА тссВ тссС mccD тссЕ mccF

j Escherichia coli

YP_ooi649248.i ^p ooi6mt* i yp 00164925QJ yp 001649251.1 yp_ooi649252.i

Bartonella washoensis Sb944nv

MCQ_00089Tt> MCQ 0009070

I S Helicobacter pylori P12 p las mid HPP12

YPO02302209.1 YP_00230220S.1

I Helicobacter pylori plasm id pHPM8

NT_858078.1 NP 858077.1

ф I ^>1 \ Lactobacillusjohnsonii NCC 533

NP_964036.1 NP_964037.1

ф I \ Streptococcus thermophilus LMD-9

YP_821226.1 YP_821225.1

Ф 1 -^t ^L ^ pseudotuberculosis

YP_070407.1 YP_070408.1 YP.070411.1 YP_070412.1 YP_070413.1 IP 32953

=>=>=C>' ^>1 Si S[Zj>I S Synechococcussp. CC960S

VP_382787.1 YP_382788.1 YP_382789.1 YP 382790.1 VP 382791.1 ЧТ 382792.1 VP 382793.1

Рисунок 1. Гены микроцинового кластера Е. coli и их потенциальные гомологи, кодируемые другими бактериями (по Bantysh О. at al., 2014). В верхнем ряду представлена схема генов микроцинового кластера Е. coli. Отдельные гены показаны толстыми цветными стрелками (тссА - красным, тссВ — желтым, тссС - зеленым, mccD - розовым, тссЕ -фиолетовым, mccF - синим), под которыми расположены их идентификаторы в базе данных белковых последовательностей. Ниже представлены кластеры генов-гомологов из различных микроорганизмов. Гены, не имеющие гомологии с известными генами тсс-кластера Е. coli, показаны серым. Голубым показаны гены Synechococcus sp., кодирующие АВС-транспортер. Дополнительный метилазный домен, кодируемый гомологом тссВ Y. Pseudotuberculosis показан коричневым.

Внешняя группа

•ylotoxicus NVH 391-98 218895955 liadllus cereus (¡9X42 289167486 Streptococcus mitis B6 289166245 Legionella longheachae NSW 150 226310261 Brevibacillus brevis NBRC 100599

384189734 Bacillus thuringicnsis scrovar chinensis CT-43 55820624 Streptococcus themophilus LMG 18311

95977200 Streptococcus equi MGCS10565 379006333 Sulfobacillus acidophilus DSM 10332

332668873 Ccllulomonas Hmi ЛТСС 484 37526106 Photorhabdus lumincscens subsp. laumondii TTOI 195978991 Streptococcus equi MGCS 10565 283457224 Rothia mucilaginosa DY-18

433603995 Saccharothrix espanaensis DSM 44229 428281764 Bacillus subtilis subsp. nntto BEST 195 213693010 Bifidobacterium longumJCM 1222 296268376 Thcnnobispora bispora DSM 43833 384432132 Thermus thcnnophilus SG0-5JPI7-I6

,-<08187910 Pintonea vagons < PaaA

- 253988231 Photorhabdus asymbiotica

158320355 Alkaliphilus oremlandii OhILAs 251791484 Dickeya zcac Ech 1591 158320356 Alkaliphilus oremlandii OhILAs

161505215 Salmonella enlerica z2i str. RSK2980 154688130 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 426409029 Psendomonas sp. UW4 160881698 Clostridium phytofermentans ISDg 297528722 Gcobacillus sp. C56-T3

222142570 Maerococcus eascolyticus JCS5402 75416 Lscherichia coli MccB 493979925 Bartonella washoensis Sh944m 113460167 Haemophilus somnus I29PT 203288823 Borrelia duttonii Ly

42518106 Lactobacillus johnsonii NCC533 210135772 Helicobacter pylon I' 12 6628607 Streptococcus ¡hemophilus I.MD-9

GNAT+

MVRWYLRYNISFRS MHILMYQVKSLRRTGFPVLLNFUNQLIKEML

MLNKHISK

MNKPQIGILFNHKGMQ MTAGVILDNQNNASRSN

MLLLLNAYLKSH MEKTIISAKNVAVEKTSEEDOTAVRAAVIFA

McbC

DMT-»

DMT«

ThlF-like

TMF-fflt»

ThlF-like

MFS

MTase

MFS+ MFS+ MFS+

392404904 rumenella pan a DSM 21527

11596217 1

78214014 Synechocoi

icudotubcrculimis IP32953 ^ sp. CC9605

MccF I I MFS*

MIKFSTLSQRISAITEÉNAMYTKGOVIVLS MRLNYYLDISFNILMFLCLTNSLNFIYGYICKVFIVKFI

MENNKKEVLDILDFVOIDIAYTINEPGRN MRTGNAN MDHIGFM MRGRRLN MRGKTLH MHRIMKN MKLSYRN MKGTILN

MYQVGIILSIKCN RKTLL0PKRLDKVAKH0LWADMMN

308173717 Bacillus am\ loliquefaciens DSM 7C " -) 16669519 Arthrobacter 'sp. FB24

Рисунок 6. Филогенетическое древо предсказанных членов семейства МссВ/РааА и их генное окружение. Бутстреп-значения указаны слева от узлов, в конце каждой ветви указан идентификатор белковой последовательности в базе NCBI и название организма, из которого она происходит (красным выделены GI белков МссВ и РааА, их пептидные субстраты и организмы, в геномах которых они закодированы). Синим - белки, исследованные в работе. Справа представлены аминокислотные последовательности пептидов-предшественников: красным - микроцина С и пантоцина, синим - подтвержденные МссА-подобные пептиды, коричневым - предсказанные нами пептиды. Сокращения: ABC-транспортер семейства ABC, MFS - транспортер семейства MFS, DMT - транспортер семейства DMT; белки, ответственные за устойчивость: zincin - Zn2+ - зависимые протеазы, S8 - семейство сериновых протеаз S8, MccF - сериновые протеазы S66 семейства, GNAT - ацетилтрансферазы семейства GNAT; белки, участвующие в созревании микроцина: ThiF-like - белки семейства ThiF/HesA/MoeB/E 1, MTase -семейство SAM-зависимых метилтрансфераз, McbC - оксидоредуктаза микроцина В.

Цветная вставка 3

А Б

Рисунок 7. Анализ структуры комплекса фермента МссВ с пептидным субстратом. А.

Общий вид гомодимера МссВ Е. coli в комплексе с пептидным субстратом МссА (PDB: 3H9Q). Пептид МссА выделен красным овалом. Б. Положение пептида МссА дикого типа (MRTGNAN) и моделирование положений его мутантных аналогов в активном центре фермента МссВ. Показана первая аминокислота пептида МссА. расположенная в гидрофобном кармане. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании метионина MRTGNAN (I) изображены в виде сфер. Смоделировано положение N-концевой части пептидов, полученных заменой метионина МссА на 2) фенилаланин. 3) лейцин. 4) изолейцин. 5) валин и 6) глицин. Субъединицы МссВ показаны зеленым и голубым, МссА - в виде белых палочек, атомы кислорода, азота и серы представлены красным, синим и желтым соответственно.

Рисунок 8. Положение субстрата МссЛ в активном центре белка МссВ Е. соИ. А. Общий вид гомодимера белка МссВ в комплексе с пептидным субстратом. Мономерные субъединицы МссВ окрашены зеленым и синим, показаны в виде сетчатых поверхностей и элементов вторичной структуры. МссА изображен в виде палочек розового цвета (выделен красным овалом). Б. Часть активного центра МссВ со связанным пептидным субстратом со стороны конца МссА. Субъединицы гомодимера окрашены синим и зеленым и изображены в виде сплошной поверхности. Атомы кислорода, азота и серы окрашены красным, синим и желтым соответственно. Представленные рисунки получены наложением разрешенных кристаллических структур белка МссВ (РЭВ: ЗН5Ы, ЗН9.1) с помощью ПО РуМо1.

Так как El-суперсемейство имеет очень сложную эволюционную историю мы анализировали не только аминокислотную последовательность, но и доменную организацию и генное окружение каждого представителя, попавшего в выборку. Важнейшим критерием отбора последовательностей были: наличие N-концевого участка, который формирует большую часть пептид-связывающего домена "пептидные клещи", характерного для МссВ, и наличие в генном окружении последовательностей, которые могли бы кодировать потенциальные гомологи других белков, участвующих в синтезе микроцинов и/или устойчивости к ним. Мы предполагаем, что практически все гомологи, вошедшие в полученное нами филогенетическое древо, участвуют в синтезе микроцин С-подобных соединений или других модифицированных пептидных антибиотиков, подобных пантоцину или ранее не описанных. Мы также предсказали ряд коротких ОРС, возможно, кодирующих пептиды-предшественники неописанных ранее микроцинов и других антибиотиков.

7. Поиск субстратов белка МссВ Е. coli путем трехмерного моделирования.

Мы провели анализ опубликованных кристаллических структур белка МссВ с помощью программного обеспечения PyMol, уделив особое внимание положению первой и последней аминокислот пептида MRTGNAN в активном центре фермента. Остаток метионина Mi пептида МссА находится в гидрофобном кармане, сформированном аденилирующим доменом фермента (остатками 1243, V245, W326, НЗЗЗ, R322 и Q335 белка МссВ). Мы предположили, что аналог МссА с заменой метионина Mi на неполярную аминокислоту с достаточно крупным боковым радикалом, также будет связываться в активном центре МссВ и, возможно, аденилироваться ферментом (Цветная вставка 3, Рис. 7).

Пептид MRTGNAN в комплексе МссВ-МссА лежит в борозде, сформированной двумя субъединицами белка МссВ (Regni С.А. at al., 2009). При этом N-конец МссА обращен наружу, в сторону "выхода" этой борозды на поверхность фермента, контактирующего с внешней средой (Цветная вставка 4, Рис. 8). Мы предположили, что удлинение пептида с N-конца, возможно, не будет препятствовать его связыванию с ферментом, а дополнительные аминокислотные остатки будут расположены на поверхности фермента вдали от активного центра.

Для проверки наших предположений мы выбрали ряд пептидов для биохимических тестов (Табл. 3). Выбранные пептиды можно разбить на несколько

групп: 1) пептиды с заменой метионина Mi на другую гидрофобную аминокислоту с алифатическим или ароматическим боковым радикалом, а также неполярный глицин; 2) пептиды с заменой Mi на заряженную или полярную аминокислоту; 3) пептиды с удлиненной с N-конца аминокислотной цепью МссА; 4) пептиды с заменой С-концевого аспарагина на близкую по структуре или химической природе аминокислоту (аспартат или глутамин).

8. Тестирование различных пептидных субстратов белка MccB in vitro.

Для проверки биоинформатических предсказаний применили метод синтеза аденилированных пептидов in vitro (см. выше). В качестве положительного контроля использовали пептид МссА Е. coli (MRTGNAN). Продукты реакции проанализировали с помощью ВЭЖХ (С 18 обратно-фазовой хроматографии) и MALDI-TOF MS. Результаты масс-спектрометрического анализа представлены на рисунке 9 и суммированы в таблице 3.

-АТФ 731 5

-АТФ 834 5

GGGMRTGNAN

800 lOGO I2W

ТОО SOO 1 ТОО ~

WO" ~ "1100................... 1300" тй

Рисунок 9. Продукты реакций аденнлирования in vitro синтетических пептидов ферментом MccB Е. coli. Представлены масс-спектры некоторых продуктов реакции. "+АТФ" - пептиды инкубировали с соответствующим ферментом МссВ и с АТФ, "-АТФ" - контрольные реакции без АТФ. Массы исходных пептидов и продуктов реакции (+329 ед.м. относительно массы исходного пептида) обозначены цифрами над соответствующими пиками. Звездочкой "*" обозначены пики, соответствующие массе сукцинимидных производных исходных пептидов.

Таблица 3. Аденилирование различных пептидов ферментом MccB in vitro и антибактериальная активность полученных МсС1092-подобных соединений. "Образование аденилированного продукта": (+) - пептиды аденилируются МссВ, (-) - пептиды в реакцию с МссВ не вступают. "Антибактериальный эффект": (+) - образование зон ингибирования роста на газоне клеток, (-) - отсутствие образования зон ингибирования роста. "N/A" - не удалось выделить достаточные количества аденилированного пептида.

Пептид

Образование аденилированного продукта

Антибактериальный эффект Антибактериальный эффект на клетки К coli В на клетки £. coli В.lyi'jll

MRTGNAN GMRTGNAN GGMRTGNAN GGGMRTGNAN GGGGGGMRTGNAN

GRTGNAN GGGGGGRTGNAN

ARTGNAN VRTGNAN LRTGNAN IRTGNAN FRTGNAN GGFRTGNAN

N/A

NRTGNAN DRTGNAN QRGTNAN ERTGNAN KRTGNAN

MRTGNAD MRTGNAQ

Пептиды с заменой С-концевого остататка аспарагина на близкую по размерам (аспартат) или физико-химическим свойствам (глутамин) аминокислоты (МЯТСИАО, МИТСЫЛО) при инкубации с ферментом МссВ не образуют аденилированного продукта (Табл. 3). Эти данные согласуются с известной специфичностью белка МссВ к аспарагину, расположенному на С-конце субстрата МссА. Пептиды с заменой метионина М] на неполярные фенилаланин, лейцин и изолейцин (РИТСЫАМ, LRTGNAN и НОТгМАЫ) аденилируются ферментом МссВ (Рис. 9). Пептид УЯТвЫЛЫ модифицируется ферментом МссВ незначительно:

пик, соответствующий аденилированному продукту на масс-спектре едва заметен, также как и пик, соответствующий сукцинимидному интермедиату реакции (Рис. 9). Пептиды, содержащие на месте N-концевого метионина неполярную аминокислоту с относительно небольшим размером бокового радикала (ARTGNAN, GRTGNAN), ферментом не модифицируются. Также не аденилируются пептиды, несущие полярную или заряженную аминокислоту на N-конце (NRTGNAN, DRTGNAN, QRTGNAN, ERTGNAN, KRTGNAN) (Табл. 6).

Пептиды, аналогичные пептиду МссА дикого типа, но содержащие дополнительные остатки глицина на N-конце (GMRTGNAN, GGMRTGNAN, GGGMRTGNAN, GGGGGGMRTGNAN), а также удлиненный на два остатка глицина пептид, несущий вместо метионина фенилаланин (GGFRTGNAN), узнаются и аденилируются МссВ Е. coli. Таким образом, присутствие дополнительных аминокислотных остатков на N-конце не препятствует взаимодействию МссА с МссВ. Для того чтобы оценить степень сродства различных пептидных субстратов к ферменту МссВ, мы провели измерение выходов продуктов реакции аденилирования с помощью метода ВЭЖХ. Выход реакции оценивали по площади хроматографического пика (Хтах=260 нм), соответствующего времени выхода аденилированного продукта. Количество исходного пептида в реакционной смеси рассчитывали с помощью метода, описанного в работе Барама и соавторов (Азарова И.Н. и соавт., 2006). Соответствие каждого хроматографического пика тому или иному компоненту реакционной смеси подтверждали с помощью масс-спектрометрии. Результаты измерений для некоторых пептидов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Относительный выход конечного продукта в реакции аденилирования различных пептидных субстратов ферментом МссВ. Значения, полученные для каждого пептида в отдельности, нормировались на значения, полученные для пептида дикого типа (MRTGNAN).

Таким образом выход реакции аденилирования с пептидами, удлиненными с Ы-конца на несколько остатков глицина, выше, чем с пептидом дикого типа. Замена Ы-концевого метионина на фенилаланин (FRTGNAN) приводит к

Пептид Относительный выход аденилированного продукта

MRTGNAN 1.00

GMRTGNAN 2.96

GGMRTGNAN 6.56

GGGMRTGNAN 8.48

GGGGGGMRTGNAN 5.88

FRTGNAN 0.52

GGFRTGNAN 11.26

снижению выхода аденилированного продукта по сравнению с пептидом дикого типа, а удлинение такого пептида на два глицина с N-конца увеличивает выход аденилированного продукта.

9. Биологическая активность аденилированных пептидов.

Мы протестировали антибактериальную активность новых пептид-аденилатов. Для этого по 10 мкл реакционных смесей, содержащие аденилированные пептиды (см. выше), наносили на газон клеток Е. coli В и £ coli В IsyejB. Через несколько часов инкубации в термостате наблюдали образование зон ингибирования роста (Табл. 3).

Клетки Е. coli В чувствительны ко всем микроцин С-подобным соединениям, полученным в наших экспериментах in vitro, за исключением аденилированного пептида VRTGNAN, количество которого в реакционной смеси было, по всей видимости, слишком мало для ингибирования роста бактериальных клеток. Напротив, клетки Е. coli В AyejB устойчивы к действию всех аденилированный пептидов (Табл. 3). То есть синтезированные аналоги микроцина С проникают внутрь бактериальной клетки посредством той же транспортной системы, что и МсС1092. Размеры зон ингибирования роста различались в зависимости от аминокислотной последовательности аденилированного пептида. Это может быть связано как с различной эффективностью аденилирования пептидных субстратов ферментом МссВ, так и с различной эффективностью их проникновения в чувствительные клетки и скоростью процессинга в цитоплазме.

10. Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С.

Для количественного сравнения антибактериальной активности аденилированных пептидов с МсС1092 мы провели очистку продуктов реакции с помощью ВЭЖХ. Пики, соответствующие аденилированным пептидным продуктам, собрали в отдельные фракции (Рис. 10, А), чистоту которых подтвердили с помощью масс-спектрометрии. Очищенные аденилированные продукты нанесли на газон клеток Е. coli В в нескольких последовательных разведениях. В качестве стандарта использовали аденилированный пептид дикого типа MRTGNAN (Рис. 10, Б, В).

GGMRTGNAN+ MccB + АТФ 1 2

GGMRTGNAN +МссВ -АТФ I 1

16.0 16.5 Время удержания (мин.)

.s ja

jr ^ ^ ^ Ж Jp

4 MKM 2 mkM 1 mkM | 0.5 mkM j

ö1 e*

Рисунок 10. Сравнение антибактериальной активности аденилированных пептидов.

А. Разделение продуктов реакции аденилирования пептида GGMRTGNAN ферментом МссВ с помощью С18 обратно-фазовой хроматографии ВЭЖХ: исходный пептид (1) и его аденилированный продукт (2). Антибактериальная активность аденилированных пептидов, удлиненных с N-конца на 1, 2, 3 и 6 глицинов (Б), а также пептидов с заменой N-концевого метионина на фенилаланин (В) по сравнению с аденилированным пептидом MRTGNAN (МсС1092).

Результаты трех независимых измерений площадей зон ингибирования роста Е. coli представлены на рисунке 11. Как следует из рисунка, удлинение пептида дикого типа с N-конца уже на один остаток глицина приводит к увеличению его антибактериальной активности почти в 4 раза. Далее, по мере увеличения длины аденилированного пептида антибиотическая активность постепенно падает. Аденилированный пептид с заменой N-концевой аминокислоты метионин на фенилаланин (FRTGNAD-AMO) проявляет схожую антибактериальную активность с МсС1092, а его удлиненный вариант (GGFRTGNAD-АМФ) проявляет антибактериальную активность почти в 3,5 раза большую, по сравнению с пептидом дикого типа (MRTGNAD-АМФ).

Рисунок 11. Размер зон ингибирования роста на газоне клеток Е. coli В при концентрации

аденилированных

измерений.

усредненные

результаты трех

независимых

пептидов 2 мкМ.

Представлены

11. In vitro аденилирование белка, содержащего на С-копце пептид MRTGNAN.

Мы показали, что фермент МссВ способен аденилировать пептиды длиной до 13 аминокислот, содержащие на своем С-конце последовательность MRTGNAN. Мы решили проверить, будет ли МссВ модифицировать белок, несущий на своём С-конце последовательность MRTGNAN. Мы получили химерный белок МВР (Maltose binding protein) слитый с С-концевой последовательностью MRTGNAN через линкер из четырех остатков глицина. Между С-концевым пептидом GGGGMRTGNAN и МВР в таком белке расположен сайт узнавания протеазы Фактор Ха (Рис. 12, А). Такой химерный белок мы назвали MBP-pepN.

Белок MBP-pepN добавили к ферменту МссВ в присутствии [а-32Р]-АТФ. В качестве отрицательного контроля использовали аналогичную реакцию, но без добавления субстрата MBP-pepN. По окончании инкубации реакционные смеси разделили на денатурирующий ПААГ с помощью электрофореза (Рис. 12, Б). Как видно, в присутствии субстрата MBP-pepN фермент МссВ переносит радиоактивную метку с молекулы АТФ на белок MBP-pepN. Таким образом пептид MRTGNAN способен узнаваться и аденилироваться ферментом МссВ даже при наличии у него на N-конце такой крупной молекулы как МВР. Чтобы убедиться, что аденилирование происходит по С-концевому аспарагину слитого белка MBP-pepN, полученный результат подтвердили также с помощью метода масс-спектрометрии: после реакции MBP-pepN с ферментом МссВ и АТФ, очищенный белок обработали протеазой Фактор Ха и проанализировали продукты

протеолиза (Рис.12, В). Анализ показал, что белок МВР-рерИ в этих условиях модифицируется ферментом МссВ по С-концу.

А В

МВР

Фактор Ха

LGÍEGRISEFGGGGMRTGNAN-CQOH

(1)

(2)

1796.5 +АТФ

1467 5

1300 .......ÍS0Q 1700' *.............1900 тй

li§ZJ MBP-pepN

- MBP-pepN

- МссВ

1796.5 MBP-pepN + МссВ

1^75 ' ' *15Ö0

Рисунок 12. Аденилирование белка MBP-pepN ферментом МссВ in vitro и in vivo.

А. Схема белка MBP-pepN. Б. Результаты разделения продуктов реакции аденилирования белка MBP-pepN ферментом МссВ в присутствии [а-32Р]-АТФ в денатурирующем ПААГ с помощью электрофореза: радиоавтограф (1) и окрашенный Кумасси фрагмент того же геля (2). Результаты масс-спектрометрического анализа продуктов реакции аденилироваиия белка MBP-pepN ферментом МссВ in vitro (В) и in vivo (Г).

12. In vivo аденилирование белка, содержащего па С-конце пептид MRTGNAN.

Мы также протестировали способность МссВ аденилировать белок MBP-pepN in vivo. Для этого мы получили генетическую конструкцию на основе вектора pCOLADuet, кодирующую белок МссВ и MBP-pepN одновременно. Такой конструкцией трансформировали клетки Е. coli BL21(DE3) и индуцировали синтез обоих белков. В качестве контроля использовали аналогичную конструкцию, в которой отсутствовала ОРС, кодирующая фермент МссВ. Через 5 часов после начала индукции из клеток выделили рекомбинантный белок MBP-pepN с помощью аффинной хроматографии с использованием амилозной смолы. Очищенный белок подвергли протеолитическому расщеплению протеазой Фактор Ха. Продукты протеолиза проанализировали с помощью масс-спектрометрии.

Результаты эксперимента представлены на рисунке 12, Г. Из этого рисунка следует, что белок MBP-pepN количественно аденилируется ферментом MccB in vivo.

ВЫВОДЫ

2. Полученные природные гомологи микроцина С из Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. обладают антибактериальной активностью по отношению к клеткам Е. coli, и действуют по механизму, аналогичному описанному ранее для микроцина С Е. coli.

3. Белок MccB Е. coli аденилирует пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с заменой N-концевого остатка метионина на аминокислоты с крупными гидрофобными боковыми радикалами.

4. Белок MccB Е. coli эффективно аденилирует пептидные субстраты на основе пептида МссА (MRTGNAN), с дополнительными аминокислотами на N-конце. Удлинение пептидного субстрата до определенного предела стимулирует эффективность узнавания ферментом МссВ и антибактериальные свойства получаемых аналогов микроцина С.

5. MccB Е. coli можно использовать для концевого аденилирования белков, несущих на своём С-конце последовательность MRTGNAN, in vitro и in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в научных журналах;

1. Bantysh О, Serebryakova М, Makarova KS, Dubiley S, Datsenko KA, Severinov K. Enzymatic synthesis of bioinformatically predicted microcin C-like compounds encoded by diverse bacteria // MBio. - 2014,- Vol. 5(3).- P. e01059-14.

2. Kulikovsky A, Serebryakova M, Bantysh O, Metlitskaya A, Borukhov S, Severinov K, Dubiley S. The molecular mechanism of aminopropylation of Peptide-nucleotide antibiotic microcin С // J Am Chem Soc. - 2014 - Vol. 136(31). - P. 11168-75.

Материалы конференций:

1. Бантыш О.Б., Северинов К.В. Получение синтетических аналогов природного микроцина С в системе in vitro. Сборник тезисов "Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", конкурс молодых ученых. Россия, Москва, 14-17 ноября 2011,(2), с. 8.

2. Бантыш О.Б., Северинов К.В. Получение синтетических аналогов природного микроцина С в системе in vitro. Тезисы докладов и стендовых сообщений "XXIV Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Россия, Москва, 7-9 февраля 2012, с. 33.

О. Бантыш, К. Северинов. Изучение синтеза микроцина С Е. coli и его предполагаемых гомологов, кодируемых другими бактериями, в системе in vitro. "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты", конференция молодых ученых. Россия, Москва, 13 апреля 2012,. с. 5. О. Bantysh, М. Serebryakova and К. Severinov. Synthesis of E. coli microcin С and its homologs encoded by other bacteria in an in vitro system. Abstracts of the 22nd IUMBB & 37th FEBS Congress. Spain, Seville, 4-9 September, 2012, p. 414. О.Б. Бантыш, К.В. Северинов. Синтез микроцина С Е. coli и его гомологов из других организмов в системе in vitro. Тезисы IX молодежной школы-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микроциологии". Россия, Москва, 21-23 октября, 2013, с. 55.

Заказ № 86-Р/02/2015 Подписано в печать 18.02.15 Тираж 75 экз. Усл. пл. 1,4

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 i )) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru

Информация о работе

Бантыш, Ольга Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2015
ВАК 03.01.03

Автореферат

Похожие работы