Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ генетических детерминантов, определяющих синтез микроцинов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетических детерминантов, определяющих синтез микроцинов"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Р Г Б ОД

На правах рукописи УДК 579.252

БАСВК ЕВГЕНИЯ ИВАНОВНА

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ СИНТЕЗ МЖРОЦИНОВ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1994-

Работа выполнена б Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор И.А.Хмель

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор С.В.Каменева

доктор биологических наук, профессор А.А.Прозоров

Ведущая организация: ВНШ эпидемиологии и микробиологии

им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится " " И/ЛА^рА- 1994" года в часов' на заседании специализированного .совета Д098.12.01.при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНШГенетика. Автореферат разослан " Ч "О*г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

В настоящее время изучение-структуры и функций илазмид относится к наиболее интенсивно развивающемуся направлению генетики микроорганизмов. Плазмиды определяют такие важные свойства' бактерий, как способность к передаче генетического материала, устойчивость к различным лекарственным препаратам, синтез специфических веществ с антибактериальным действием. Из азтибиотиков, синтезируемых бактериями семейства Enterobacteriaceae, наиболее изученными являются колицины; это крупные белки (молекулярная масса от 18 до 90 кДа) с узким спектром действия - гаи подавляют рост бактерий, близкородственных штамму-продуценту. Продукция колицинов и иммунитет к ним определяется плазмидами. Синтез ко-лиданов в большинстве клеток популяции зарепрессирован; индукция, синтеза происходит спонтанно, с невысокой частотой , или может быть вызвана действием агентов, повреждающих ДНК и кнгибирующих ее репликацию (Konisky et al., 1982; Рекеш и др., 1^7).

Кроме колицинов, энтеробактерии продуцируют тшасе микроцины - низкомолекулярные вещества пептидной природы с широки.) спектром действия (Asensio et al., 1976). Синтез микроцинов, в отличие от колицинов, конститутивен и не индуцируется ДНК-тропными агентами. В настоящее время описаны.7 типов микроцииор, различающихся по перекрестному иммунитету, химическому строению, механизму и спектру антибиотического' действия (Baquero, Moreno, 1984; Lavina et al., 1990; Salomon and Farias, 1992). Известно, что в большинстве изученных случаев синтез микроцинов и иммунитет к ним детерминируются плазмидными генами.

Наиболее подробно изучен микроцин В17 - представитель микроцинов типа В. Имеются сведения о химической структуре микроци-на (Davagnino et al., 1986), исследованы генетические детерминанты его синтеза и иммунитета к нему клеток-продуцентов. Установлено, что мишенью его действия в чувствительных клетках является ДНК-гираза (Vizan et al., 1991). Однако, многте вопросы в отношении микроцина В17 и генов, ответственных за его синтез и иммунитет, остаются невыясненными.

Несколько аспектов исследований микроцинов и генетических детерминантов, определяющих их синтез, представляет несомненный

- г -

интерес. Микроцины - новая группа слабо изученных пептид-содер-жащих веществ с антибактериальным действием; в процессе их изучения могут быть выявлены принципиально новые структуры антибактериальных пептидов. Они- могут быть использованы как модельные• объекты для исследования биосинтеза, экспорта из клетки и транспорта пептидов в бактериальные клетки. Большой интерес представляет изучение новой группы специфических плазмидных генов, их организации и регуляции их функционирования. Сравнительное изучение плазмид, определяющих продукцию микроцинов, важно для понимания эволюции внехромосомных генетических элементов и эволюции микроорганизмов.

Важен также и экологический аспект изучения микроцинов; он включает, прежде всего, выяснение вопроса о роли продукции микроцинов в антагонистических взаимоотношениях бактерий в природных популяциях. Немногочисленные данные по этому вопросу, имеющиеся в литературе, свидетельствуют о том, что синтез микроцинов обеспечивает селективные преимущества клеткам бактерий и способствует их колонизации (Baquero and Moreno, 1984). Изучение микроцинов открывает новые перспективы в создании препаратов для борьбы с патогенными микроорганизмами и коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных на основе высокоактивных штаммов-антагонистов. ' ' '

Пель работы. Целью работы является изучение генетических детерминантов, связанных с синтезом микроцинов в клетках E.coll.

Конкретными задачами работы были:

- скрининг штаммов, синтезирующих низкомолекулярные антибиотики - микроцины, и изучение распространенности продукции микроцинов среди бактерий кишечной группы;

- выяснение роли плазмид в синтезе микроцинов;

- исследование организации и экспрессии генетических детерминантов синтеза микроцинов В2 и С51;

'- сравнительный анализ генетических систем, определяющих синтез различных микроцинов.

Научная новизна.

- Проведен скрининг штаммов, синтезирующих низкомолекулярные антибиотики широкого спектра действия - микроцины ; выделены активные продуценты микроцинов двух типов;

- выяснено, что микроцины, продуцируемые выделенными штаммами E.coli, являются пептидами или их производными;

- установлена роль плазмид в детерминировании синтеза мик-роцинов и иммунитета к ним у большинства исследованных штам-' мов-продуцентов;

- проведено клонирование и картирование плазмидных генов, участвующих в синтезе микроцина В2 и обеспечении иммунитета к нему;

- показана высокая консервативность генов, определяющих синтез трех известных микроцинов типа В, продуцируемых штаммами E.coli, выделенными в географически отдаленных районах из различных организмов;

- с помощью ксмплементационного анализа показано, что три плазмидных гена участвуют з синтезе микроцина С51 и, по крайней мере, два гена-необходимы для экспрессии иммунитета к микроцину;'

- определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, детерминирующего частичный иммунитет к микроцину С51.

Практическая ценность полученных в работе данных связана с возможностью использования плазмид, детерминирующих синтез микроцинов, для создания штаммов бактерий, антагонистически подавляющих рост патогенных энтеробактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на плано-воотчетных конференциях по ГНТП "Новейшие методы биоинженерии" (1991, 1992 г. Пущино; 1993 г. Москва), на отчетных конференциях Института молекулярной генетики РАН за 1991-1993 гг. и на семинарах Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст иллюстрирован рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ " '

Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе, были получены из коллекции Института молекулярной генетики РАН. Мик-роциногенные штаммы E.coli, синтезирующие микроцины В17 и С7, а также штаммы с мутациями ompR и ompF генов были любезно предоставлены проф. Пагсли, Франция. Для выделения штаммов-продуцентов микроцинов были использованы изоляты энтеробактерий из фекалий здоровых детей и взрослых. Штаммы бактерий, использованные при изучении спектра антибиотической активности микроцинов, получены из коллекций Института молекулярной генетики РАН, Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, .ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи и ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. Штамм Т27 был получен от Н.Л.Райковой из- Свердловска.

Питательные среды: минимальная среда, описанная ранее (Хмель и др., 1981), эта же среда, обогащенная дрожжевым экстрактом (Difco, 0,32), и глюкозой (0,22); агаризованная среда" того же состава (1,52 агара), жидкая среда LB и та же среда с 1,52 агара (Миллер, 1976).

Определение продукции микроцинов проводили, как описано ранее (Khmel et al., 1987). На колонии штаммов, выращенных уколом в течение 1-2 суток и убитых парами хлороформа, накладывали целлофановую мембрану и сверху засевали индикаторный штамм в 3 мл 0,7% агара (1 - 2х107 клеток из культуры в экспоненциальной фазе роста). О'продукции ыикроцина судили по появлению зон задержки роста на газоне индикаторного штамма после 5-24 часов роста культуры при 37 °С. Таким же способом, но без целлофана, определяли продукцию колицинов.

Антибиотики добавляли в среду в следующих концентрациях: ампициллин, канамицин, стрептомицин, налидиксовая кислота - 100 мкг/мл; тетрациклин - 10 мкг/мл; хлорамфеникол 20 мкг/мл.

Конъюгацию штаммов E.coli проводили, как описано (Миллер, 1976).. . ^

Выделение и очистку плазмидной ДНК, трансформацию E.coli

плазмидной ДНК, рестрикцию, лигирование, электрофорез ДНК в ага-розном геле проводили в соответствии с методами, подробно описанными в .(Sanbrook et.al., 1989).. ...

Чувствительность микроцинов к действию ферментов определяли как описано (Курепина и др., 1990).

Плазмидные мутации с помощью инсерций транспозона'Тп5 получали, вводя Тп5 из фага- ЛЬ221 0гт29 РаиВО гех::Тп5 в штамм Е..со11 MKD5208(рВЕЮЗ) (Хмель и др., 1981) .

Иммунитет клеток к микроцину определяли как описано (Курепина и др., 1990).

Определение активности микроцина в клетках и культуральной среде проводили, как описано (Басюк и др., 1994).

Блот-гибридизашда проводили на нитроцеллплозных фильтрах по методу Саузерна (Southern,1975). Мечение ДНК с помощью ник-трансляции и гибридизацию ДНК с олигснуклеотидной смесью проводили по (Sambrook et ai., 1989).

Определение нуклеотидной последовательности ДЙК плазмиды pUHAB проводили автоматически по методу Сэягера с использованием плазмид pTZ18U и. pTZ19LL

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение штаммов, продуцирующих микроцины.

Согласно литературным данным, до 15% бактерий семейства Entcrobacteriaceae, выделенных из фекалий новорожденных детей, продуцируют микроцины (Asensio et al., 1976).

При скрининге штаммов энтеробактерий, синтезирующих микроцины, были проанализированы изоляты из фекалий здоровых людей (1549 изолятов от новорожденных детей, 21505 изолятов от детей старте 6 лет и взрослых людей), а также 52 штамма E.coli, выделенных из фекалий 8-4-недельных ягнят. В результате было выделено 13 активных продуцентов микроцинов, Еключая описанный ранее продуцент микроцина С51. Работа проводилась совместно с Лабораторией генетики вирулентности бактерий, руководимой В.М.Бояда-ренко, ВНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Штаммы-продуценты 15, *20, 43К, Т1 были выделены И.М. Манохиной из этой лаборатории.. ,

- б -

Проведенные исследования показали, что способность продуцировать микроцины встречается достаточно редко в популяциях энте-робактерий, значительно реже, чем способность синтезировать ко-лицины. Изоляты,- образующие микроцины, обнаруживались в среднем у одного из 20 исследованных здоровых людей (обычно анализировали 150-200 изолятов кишечных бактерий у одного человека). Результаты, полученные нами в этой работе й-ранее (Khmel et al., 1993),' противоречат данным Asensio с соавторами (Asensio et al., 1976) о широком распространении продукции микроцинов среди кишечных бактерии. Не исключено, что авторы этой работы ошибочно принимали за микроция аминокислоту валин (или его производное), которая выделяется в среду, по нашим данным, у 10-15% изолятов знтеръбактерий в 'количестве, достаточном для подавления роста клеток E.coli К12; на бактерии других штаммов E.coli и других видов семейства Enterobacteriaceae валин не действует (Khmel et al-, 1987; Glover, 1962).

Синтез микроцинов у всех продуцентов был более выражен на среде с драажевым экстрактом. Во всех случаях было обнаружено, что микроцины проходили через целлофан; это показывает, что их молекулярная масса ниже 10 КПа.'

Природа и спектр действия микроцинов.

Микроцины, образуемые штаммами 43К, И, 15, 20, S2, R51, MB инактивировались протеолитическими ферментами. Определение чувствительности к ферментам проводилось непосредственно, на поверхности твердой питательной среды. В экспериментах мы использовали проназу, трипсин, химотрипсин, протеиназу К, субтилизин и термолизин. На основании полученных данных был сделан вывод, что микроцины являются пептидами или их производными.

Изучение перекрестного иммунитета выделенных'нами штаммов к продуцируемым этими штаммами микроцинам показало, что обнаруженные микроцины относятся к двум типам.

Штаммы E.coli 15, 20, Tl, 43К, S2, М21, V6, L5, Т27 образуют микроцины I типа; при этом наблюдается их перекрестный иммунитет со штаммом-продуцентом микроцина типа В - В17 (BZB2283). Ко II типу относятся микроцины, образуемые штаммами R51, MB, К22 и К14; они подавляли рост клеток, продуцирующих микроцины типа В, и проявляли перекрестный иммунитет в отношении штамма - про-

дуцента микроцина С7 (РАР1409). Эти микроцины мы отнесли к типу С. Клетки штамма MB были устойчивы к микроцинам обоих типов.

Более подробно нами были изучены микроцины из штаммов 15, S2, Т1, 20, 43К, R51, MB. Все они были активны против грамотри-цательных бактерий различных таксономических групп (табл.1). Наиболее широким был спектр действия микроцинов из штаммов R51 и MB - они подавляли также рост некоторых грамположительных бактерий . Микроцины типа В различались по антибактериальной активности. Микроцины, продуцируемые клетками штаммов 15 и S2, проявляли существенно более широкий спектр действия, чем .микроцины штаммов TI, 20 и 43К . Эти данные показывают, что микроцины типа В из выделенных наш штаммов-продуцентов, по-видимому, различаются, несмотря на сходство в перекрестном иммунитете; они могут быть отнесены к разным подгруппам.

Спектр действия микроцинов из штаммов К22, К14, М21, Т27, V6 и L5 изучен менее подробно. Исходя из полученных данных, наиболее широким спектром действия обладал микроцин из штамма К22 (микроцин типа С). Микроцины типа В из штаммов М21, V6, L5 инги-бировали рост грамотряцательных бактерий, в том числе штаммов Е. coli, Salmonella, Shigella. Они не- действовали на штаммы Citrobacter, Serratia, Proteus, Pseudomonas.

Плазмиды штаммов- продуцентов и их роль в детерминировании •■ синтеза микроцинов.

Клетки выделенных нами штаммов - продуцентов микроцинов содержали от одной до. 5 плазмид .. Чтобы определить их роль в синтезе микроцинов, были проведены опыты по передаче-' плазмид в клетки реципиентов с помощью конъюгации и трансформации.

Елазкидкая ДНК из штаммов Т1 и S2 была передана трансформацией в клетки E.coli с селекцией по устойчивости к стрептомицину. В результате были отобраны клоны, содержащие по одной плаз-миде величиной около 70 т.п.н. (плазмиды рТ1 и рВ2 соответственно). Эти плазмиды, кроме синтеза микроцинов, детерминировали также устойчивость к стрептомицину. Плазьоща рВ2, кроме того, определяла продукцию колицина. Плазмиды были очень.сходны по молекулярной массе и по размеру рестрикционных фрагментов, хотя были получены из штаммов, выделенных из различных источников.

Табл.1. Антибактериальная активность штаммов-продуцентов

микриданов.

Штаммы-продуценты микроцинов

ieuT-KyjujTypu 15 S2 T1 20' 43K R51 MB

E.coli B + + + + + + +

E.coli TGI + + + + + + +

Salmonella typhimurium LT2 + + +- +- + + ■ + '

Salmonella enteritidis + + + + + + +

Salmonella reading + +

Salmonella Kirkee + + +- + + +

Salmonella rostock + + + + + + +

Shigella flexneri 2a 98 ' + + + + + + +

Enterobacter aerogenes 59/26 - + T + + + +

Enterobacter aerogenes 3/43 + + - - - -

Enterobacter cloacae A-185 + + + - - - --

Hafnia alvei 3032 + + - - - - -

Klebsiella pneumoniae K13 - - + +

Klebsiella pneumoniae K14 + + - - - + +

Klebsiella pneumoniae K22 + + - - - + +

Klebsiella pneumoniae K1 + + + + + + +

Citrobacter freundii CA31 + +- f- - + + +

Citrobacter freundii 49/11 + + + + - + +

Citrobacter freundii 62/82 + + + + + + " +

Serratia marcescens 1060 - - - - - + +

Serratia marcescens 1010 - - - - - + +

Yersinia enterocolitica 09 - - - - - + +

Yersinia enterocolitica 03 - - - - - + +

Proteus vulgaris 171-2016 - - - - - - -

Proteus vulgaris 249 - - - - - -

Pseudomonas aeruginosa TC-16 . +- +- +- +- +- + +

Bacillus megaterium TH +- - - - - + - +

Bacillus megaterium THS +- • - - - • • +

Bacillus cereus B-370 - - - - - — +

Штамм 15 содержал 3 плазмиды, которые были разделены при

конъюгациокном переносе; синтез микроцина детерминировала плаз-мида (90 т.п.н.), определяющая также устойчивость к ампициллину.

Синтез микроцина С51, образуемого клетками штамма R51, как было показано ранее " , 'определялся плазмидой рС51 (Курепина'и др., 1990).

Способность продуцировать микроцин в штамме 20 также была связана с плазмидой, но с какой именно, пока неясно.

В настоящее Еремя нам не удалось установить локализацию генов, ответственных за синтез микроцинов в штаммах MB и 43К.

Клетки штамма Т27 содержали несколько плазмид. В результате конъюгации было показано, что плазмида рВ27 размером 60 т.п.н. определяет синтез микроцина В27 и иммунитет к нему, а также~~де-терминирует устойчивость к ампициллину, тетрациклину и канамици-ну.

Согласно полученным данным, по крайней мере в шести из изученных восьми штаммов-продуцентов микроцинов продукция последних контролируется плазмидой. Кроме генов, детерминирующих продукцию микроцинов, эти плазмиды могут нести также гены устойчивости к различным антибиотикам, гены, определяющие продукцию колицинов и др. Таким образом, гены детерминирующие синтез микроцинов, функционируют в различном генетическом окружении.

. Клонирование и картирование генов¡ определяющих синтез

микроцина В2.

В литературе детально описан единственный представитель микроцинов типа В - В17 (Davagnino et al., 1985; Herrero and Moreno, 1986; Vizan et al., 1991; Genniloud et al., 1986). Нами выделены штаммы E.colí, продуцирующих два других микроцины типа В, причем о принадлежности микроцинов к этому типу судили лишь по критерию перекрестного иммунитета штаммов-продуцентов. Представляло интерес выяснить, сходны ли различные микроцины этого типа и генетические детерминанты, определяющие их синтез и иммунитет к микроцинач. Для сравнительного изучения были взяты продуценты микроцинов, выделенные в географически отдаленных областях: продуцент В2 был выделен в Москве, В27 - в Свердловске {Сибирь), В17 - в Испании (Asensio et al., 1976). Кроме того, продуценты микроцинов были получены из разных организмов (В2 бил

- 10 -

изолирован из фекалий человека, В27 - теленка).

Гены, определяющие синтез микроцина В2 и иммунитет к нему, были клонированы."С этой целью плазмида рВ2 была частично гидро-лизована эндонуклеазой., Sau ЗА с последующим дотированием с ДНК pBR325, гидролизованной BamHl. В результате получили рекомби-нантную плазмиду рВЕ108, которая содержала фрагмент плазмиды рВ2 размером 7,3 т.п.н". и определяла синтез микроцина В2 и иммунитет к нему. Физическая карта плазмиды рВЕ108 показана на рис. 1.

Для дальнейшего изучения локализации генов, определяющих синтез микроцина и иммунитет, мы получили ряд делеционных производных плазмиды рВЕ108 (рис. 1). Определение фенотипа клеток TG1, несущих дедеционные плазмиды, показало, что область ДНК, содержащая гены синтеза микроцина В2 и иммунитета к нему, расположена между Smal и-EcoRI(1) сайтами. Гены, определяющие иммунитет к микроцину, расположены в KpnI(2)-EcoRI(l) фрагменте. Более точно локализация генетических детерминант синтеза микроцина В2 и иммунитета к нему была установлена при анализе мутантных плазмид, полученных при встраивании в рВЕ108 транспозона Тп5.

Мы проанализировали 21 клон с мутантными плазмидами, из них 6 были mc+lmm+, 13 - mic~imm+ и 2 - mic~imm~. Не было обнаружено ни одной мутантпой плазмиды; определяющей фенотип mic+imm~. Возможно, клетки, несущие такие плазмиды, нежизнеспособны, т.к. могут быть убиты собственным микроцином. На рис. 1 показано расположение сайтов инсерщш транспозона Тп5 на карте клонированного фрагмента с указанием фенотипа клеток, несущих мутантные плазмиды.

Нарушение синтеза микроцина происходило при встраивании Тп5 в область ДНК,■ находящуюся слева от EcoRI (1)-сайта. При этом мутации, локализованные во фрагменте ДНК между SalGI и EcoRI (1) вели также к потере иммунитета клетками, содержащими мутантные плазмиды. Инсерции Тп5, находящиеся правее- сайта EcoRI(1),. не влияли ни на синтез микроцина, ни на экспрессию иммунитета. На продукцию микроцина Б2 и иммунитет к нему не влияла также мутация N 10, расположенная на расстоянии 0,2 т.п.н. левее Smal сайта. .

На основании анализа мутантных и делеционных плазмид нами был сделан вывод, что для синтеза микроцина В2 и иммунитета к нему необходима область ДНК размером 4.2 т.п.н., расположенная между инсерцией Tn5 N 10 и EcoRI (1) сайтом . Гены иммунитета

находятся во фрагменте Kpnl(2)-EcoRI(l) размером 1,< т.п.н.

2

kb

Sm Н: Pv Н2 Bg Pi K2 S

_I_-1_i , I_!_I_

El _l_

P2

t

10

Mic

Ki tttt

Mic

IïTJTf

tttt t t t t t t

V- pBE108 E2 (B2) tt

I mm"

Mic.

pBEl

pSE2 pUBl pUB2 'pUB3

Sm i_

Ki

K2

K2

K2 s

K2

El

t-1

_!

El

Mic" Imm+

Mic Imm Micnim"1' Mic~Imm+ Mic~ImT

Ркс.1. Картирование М1с+-фрагмента плазмиды pBE108. Стрелками показано расположение сайтов инсерцяй транспозона Тг.5. Обозначения: Mic+ - синтез микроцина. - иммунитет к экзо-

генному микроцину; В - BglII; Е - EcoRI; H - Hind III; К - Kpnl; P - PstI; Pv - PvuII; S - SalGl; Sm - Smal.

Синтез шжроцинов В2 и В27 в штаммах с мутациями генов отр.

Ранее было показано, что продукт гена отрИ участвует в регуляции синтеза микроцина В17, активируя транскрипция микроцино-выу. генов в стационарной фазе роста глеток(Негпапс1ег-СМсо ^ а1. , 1986).

Нас интересовало, участвует ли белок ОтрИ в регуляции син-

теза других микроцинов типа В. С этой целью мы исследовали синтез микроцинов В2 и В27 в штаммах с мутациями гена отрИ. Поскольку мутации в этом гене влияют на синтез главных белков-пори-нов наружной мембраны ОшрЯ и ОгпрС, мы изучили-также продукцию микроцинов в штаммах с мутациями отрР и отрС, приводящими к отсутствию этих белков , чтобы выявить непосредственную роль белка ОтрР в регуляции синтеза микроцинов В2 и В27.V

Из данных, приведенных в таблице 2, видно,"что мутации генов отрС и сшрр не влияли на синтез микроцинов В2 и В27. Синтез микроцина В2 не зависел от продукта гена отр!?, тогда как продукция микроцина В27 в штаммах с мутациями отрй была снижена. Чтобы определить, влияет ли белок Отр!? на синтез микроцина В27 или на его экспорт из клеток, мы сравнивали антибактериальную активность микроцина В27 в клеточном экстракте и культуральной среде ошр+ и ошр" штампов. Оказалось, что активность микроцина В27 была снижена как в культуральной среде, так и в клеточном экстракте в случае штаммов с мутациями отрЯ генов. Следовательно, продукт гена отрР влияет непосредственно на синтез микроцина В27.

Табл.2. Синтез микроцинов В2 и В27 в штаммах с с мутациями отр генов.

штамм характеристика диаметр зон подавления роста E.coli В, мм

рВЕ108 pVB27

МС4100 ОшрК+ 24 35

МН225 ОтрС" 42 35

МН450 ОтрР" 36 35

ЫН2472 ОтрГ^ОшрС" 20 13

(отрК472)

BZB1011 ОтрК+ 20 " 34

РАР1402 ОтрР~ОтрС~ 20 15

(отр!?: :Тп5)

Таким образом, мы -обнаружили различия в регуляции синтеза исследуемых микроцинов типа В - В2 и В27. Отсутствие зависимости

синтеза микроцина В2 от белка OmpR показывает, что продукт этого гена не является абсолютно необходимым для регуляции продукции микроцинов типа В.

Действие микроцинов В2, В27 и С51 на штаммы с мутациями гесА и 1ехА генов.

Известно, что микроцин В17 ингибирует ДНК-гиразу бактериальной клетки (Vizan et al., 1991), блокируя репликацию ДНК, при этом происходит деградация ДНК и индукция системы SOS-репарации СНеггего and Moreno, 1986). Механизм индукции SOS-системы основан на взаимодействии продуктов генов гесА и lexA (Little and Mount, 1982).

Мы исследовали действие двух обнаруженных нами микроцинов типа В, а также микроцина типа С - С51 на клетки штаммов Е. col i с мутациями гесА и lexA ( табл. 3 ) . Было показано, что эти мутации увеличивают чувствительность клеток к действию микроцинов В2 и В27. Аналогичный эффект описан для.микроцина В17 и подтвержден в наших опытах. По-видимому, все три микроцина типа В обладают сходным механизмом действия.

Табл.3. Действие микроцинов С51, В2 и В27 на штаммы с мутациями

гесА и lexA генов.

Диаметр зон подавления роста индикаторного Штамм Микро- штамма E.coli, (мм)

ЦИН В : ABl157 : :recA+lexA+: AB2463 : гесА : : PAM5715 : lexA : : JC411 : гесА+: JC1553 гесА

TGI(рВЕ108) В2 • 26 20 30 22 16 30

TGI(pVB27) В27 14 8 20 14 6 18

BZB2283 В17 10 б • 18 8 4 10

TGI(pUHAB) С51 24 14 14 8 10 10

В то же время, мутации гесА и lexA генов не увеличивали чувствительность бактериальных клеток к микроцину С51. Следова-

тельно. он обладает отличным от микроцинов типа В механизмом действия.

Устойчивость мутантов ompF и отрС-к•действию микроцинов.

О механизмах проникновения микроцинов в клетки бактерий практически ничего не известно. В этом плане представляло интерес выяснить, какие продукты хромосомных геноЕ участвуют в процессе проникновения изучаемых нами микроцинов в клетку. С этой целью мы исследовали действие микроцинов из штаммов S2, Т27, R51, 15, 20, 43К, Т1 на клетки штаммов E.coli с мутациями в генах ompR и ошрГ, так как известно, что эти мутации приводят к резистентности к микроцину В17 (Pugsley, 1985).

Клетки птаммов-продуцентов высевали уколами на поверхность твердой питательной среды; мутантные.штаммы использовали в качестве индикаторов. Было показано, что микроцины всех штаммов-продуцентов не действовали на клетки с мутациями геноз ompR (штамм РАР1402) и ompF (штамм РАР308), нарушающими синтез главных белков-поргаов наружной мембраны OmpF и ОтрС. Этот факт свидетельствует, по-видимому, о сходстве систем, ответственных за проникновение 2 чувствительную клетку микроцинов различных типов.

Сравнительный анализ фрагментов ДНК, определяющих синтез микроцинов типа В и С и иммунитет к ним.

Сравнительный анализ физических карт клонированных фрагментов, содержащих гены синтеза микроцинов В2, В27 и изученного ранее микроцина 317, показал большое сходство этих карт (рис.2). Локализация 10 рестрикционных сайтов в этих фрагментах была идентична. Сходна и локализация генетических детерминантов синтеза и-иммунитета микроцинов В2 и В17.

С помощью блот-гибридизацик мы установили гомологию нуклео-•тидных последовательностей плазмиды рМссВ17 и фрагмента ДНК, содержащего гены синтеза микроцина В2 и иммунитета к нему. Наблюдалась также гомология нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, несущих гены микроцинов В2 и В27 . Кроме того, мы сек-венировали HindiII-SmaI фрагмент плазмиды рВЕ108. Его последовательность полностью совпала с последовательностью аналогичного

фрагмента плазмиды рММ104, определяющей синтез микроцина В17 ((ЗепПоиа еЬ а1., 1989). Таким образом, наблюдается высокая кон-

.0- . 1 . 2. . 3 4 5.6. 7 8 9

I-1-1-1-1-1-1-1-1-1 .кЬ

В ' Бш Н1 Ру Нг Вг Р К2 5 Е1

-1--1-1--1_]-1__1-1--рММ102

К1 (В17)

Р1 В 5т Нг Ру Нг В^ Р2 Кг Б Ег Рз _|-1-1-1-1__—1-и-1—1-1-- руВ27

Кх . . (В27)

Бт Н1 Ру Н2 Вг Р1 Кг Б Еа Рг

-1—I—Н—I-II ' I-1-Ч- рВЕ108

Кг Е2 (В2)

Рис. 2. Физические карты фрагментов ДНК, определяющих синтез микроцинов В2, В17, В27. Физическая карта клонированного Фрагмента ДНК, определяющего синтез микроцина В27, получена Безруковым В.М. в нашей лаборатории. Обозначения: В - ВатН1; В^ -В&11; Е - ЕсоИ;. Н - .Н1пс1111К - Крп1;_Р - Рэи; Ру - Руи11; Бт - Бта1.

сервативность генов микроцинов типа В из штаммов, выделенных в географически отдаленных районах. Полученные результаты дают основание думать, что гены различных микроцинов типа В имеют общее происхождение. Они организованы в кластеры, включающие гены синтеза микроцинов и иммунитета к ним, и передаются на плазмидах.

Сходство микроциновых генов при существенном различии плаз-мид, в составе которых они могут перемещаться в популяциях бактерий, может свидетельствовать в пользу предположения, что гены микроцинов локализованы или были локализованы в составе транспо-зонов . Это предположение нуждается в экспериментальной проверке.

Представляло интерес также выяснить, имеется ли гомология генов, определяющих синтез микроцинов типов В и С. Нельзя было исключить, что эти генетические системы содержат сходные компоненты. Мы провели блот-гибридизацию фрагментов ДНК, несущих гены

синтеза микроцинов С7 и С51, и фрагментов ДНК, ответственных за синтез микроцинов В2, В17 и В27. Гомологии фрагментов ДНК, детерминирующих синтез микроцинов типа В и С, не было обнаружено. Следовательно, это совершенно-различные генетические'системы.

Комплементационный анализ мутаций влияющих на синтез микроцина С51.

Гены синтеза микроцина С51 и иммунитета к нему были клонированы ранее на плазмидных векторах . С помощью анализа делеци-онных и мутантных плазмвд (рис. 3) был определен минимальный фрагмент, необходимый для продукции микроцина - 5 т.п.н. (Курепи-на и др., 1990)

С целью изучения плазмидных генов, определяющих продукцию микроцина С51, был проведен комплементационный анализ плазмидных мутаций, приводящих к отсутствию синтеза микроцина в клетках. Для анализа пары совместимых плазмид, содержащих различные фрагменты ДНК, клонированные в векторах pUC19 и pACYC184, вводили в клетки штамма E.coli UB1637 с мутацией гесА56 для предотвращения гомологичной рекомбинации.

Только одна комбинация делеционных М1с~-плазмид, pUKH+pAHA, приводила к восстановлению способности клеток синтезировать мик-роцин . Никакой комплементации не наблюдалось, когда была использована комбинация плазмид pUKH: :Тп5(23) и рАНА. Эти данные показывают, что в синтезе микроцина участвуют по меньшей мере два генетических детерминанта - один локализован в области мутации 23 и второй - во фрагменте pUHAB, входящем в плазмиду рАНА (табл. 4).

В комплементационных экспериментах с мутантными плазмидами, содержащими инсерции Тп5, локализованные по всей длине клонированного М1с+-фрагмента, ни в' одном случае не наблюдалось восстановления Miс+-фенотипа. Эти данные позволяют предположить, что гены,- ответственные за синтез микроцина, организованы в оперон и транскрибируются с общего промотора.

Интересно, что комбинация плазмид pUHBr и pAST::Tn5 3-3 приводила к восстановлению продукции микроцина в.клетках. Это означает, что один из генов, участвующих в синтезе микроцина, расположенный в области Тп5-инсерщш 3-3, транскрибируется в пределах Hindi 11С I) - Hindi II(2) - фрагмента. Однако, поскольку

6

10

11

_L-

Hi CPiRI SC H2

-Li-uij_11 , 1 *

?зК P4

PV с

E BS

T2

micA micB micC

ь ?т f . К

RI _J2

Н2 1 RI 1 ь

йгг

pUKH Mic~ Imm= plIHBn Mic" Imnr pUHBr Mic" Imnr"

Hi

u

Hi

H2

?2

RI H2

?2

X/S

_I

X/S

3-3 8-10 2-7 2-4 8-6 9-5

Auf 'f Tj i utfu'

CPiRI SC H2

1111 11 , 1 ^

РзК P4

II I

pUHA Mio" Iinm" В

pAHA Mic" Imm" В

pAST Hic^ Imm pASH Mic" limn"

PY С E BS

I I " ' I '

t t t t t t t ttttt ttt t t t t t t

20 47 17 54 209 77 61 86 69

tfc+ Mic" 4 Mic+

Imm

Imm

Imm±

Imm

KRI

tt H

Iim+

Рис. 3. Делеционные и мутантные производные плазмиды pUHAB. Стрелками показано расположение сайтов инсерций транспозона Тп5. Обозначения: Mic+ - синтез микроцина. Imm+ - иммунитет к экзогенному микрошшу; 1шпг± - частичный иммунитет к микроцину; В -BamHI; С - Clal ; Е - EcoRI; Н - Hlnd III; К - Kpnl; Р - Pstl; Rv - PvuII; ; S - Smal; mlcA, micB, micC - предположительная локализация генов, участвующих в синтезе микроцина.

Табл. 4. Комплементация плазмидных мутаций, влияющих на синтез • микроцина С51 и иммунитет к нему бактериальной клетки. ••

Пары совместимых плазмид

---------------------------------------------------. феНОТИП

Плазмиды, содержащие Плазмиды, содержащие

вектор pUC19 вектор pACYC184

рШАВ: :Tn5 69 pAST:: Tn5 3-3 Mic+lmm+

pUHAB: :Tn5 86, 54, 77 PAST:: Tn5 3-3 Mic-Imm-

pUHAB: :Tn5 20, 54, 61 pAST:: Tn5 8-10 Mic-

pUHAB: :Tn5 20•, 54 pAST:: :Tn5 2-7 Mic-

pUHAB: :Tn5 17, 47, 54, 209 pAST:: Tn5. 2-4 Mic-

pUHAB: :Tn5 17, 47, 54, 209 pAST:: : Tn5 8-6 Mic-

pUHAB: :Tn5 17, 20, 47, 54, 209 pAST:: :Tn5 9-5 Mic-

pUKH pAST Mic+lnwH-

pUKH pAHA Mic+ImnH-

pUKH pASH Mic+lmm+

pUHBn pAHA Mic-Imm-

pUHBn .. PASH Mic-Imm-

pUHBr pAHA Mic-Imm+

pUHA pAHBr Mic-1mm-

pUKH:: Tn5 55 pAHA Mic+lroti+

pUKH:: Tn5 23 pAHA Mic-1mm-

pUHAB: :Tn5 17 pAHA Mic-

pUHBr pAST:: : Tn5 3-3 Mic+Imm+

pUKH pAST: :Tn5 8-6 Mic-

pUHAB: : :Tn5 86 pAHA Mic-

p'JHAB: :Tn5 4 pAHA Mic-

не происходит восстанозления продукции' микроцина при введении в клетку плазмид рАНА и рШВг, вероятно, в синтезе микроцина принимает участие еще один детерминант, локализованный слева от Тп5-инсерции 55 в районе плазмиды, включающем Н1п<11Ш2)-сайт.

Если действительно гены, определяющие продукцию микроцина, организованы в оперон, то, по-видимому, транскрипция их происхо-

дит справа налево ( рис.3 ). Об этом свидетельствует восстановление М1с+-фенотипа при введении в клетку плазмид pAST::Tn5 3-3 и pÜHBr. При обратном направлении транкрипции инсерция 3-3 мешала бы транскрипции генов, расположенных'в правой части плазмиды.

Таким образом, мы показали, что с продукцией микроцина С51 связаны три плазмидных гена. ' • ■

Полный иммунитет к микроцину наблюдается при совмещении в клетке делеционных плазмид рАНА, не определявшей иммунитет, и pUHBr или pUKH, обеспечивавших частичный иммунитет. Мутация 23 в плазмиде pUKH, расположенная . в пределах

HindiП(1)-Н1псН11(2)-фрагмента, мешала восстановлению 1тт+-фе-нотипа. Эти данные показывают, что иммунитет к микроцину определяется по крайней мере двумя генетическими детерминантами - один из них локализован в HindiП(1)-Н1пйП1(2)-фрагменте, второй -во фрагменте, расположенном справа от Hindi 11(2)-сайта, точнее, в районе сайта Kpnl или правее него.

Локализация структурного гена микроцина С51.

Для определения локализации структурного гена пептидной части микроцина С51 мы провели гибридизацию рестрицированных плазмид pUHAB и pAST, определяющих синтез микроцина С51, с двумя олигонуклеотидными смесями, соответствующими известной последовательности пептидной части микроцина С51 и синтезированными с учетом вырожденности генетического кода. Ранее б нашей лаборатории было установлено, что в состав микроцина С51 входят 7 аминокислот - Met-Arg-Thr-Gly-Asn-Ala-Asp (Kurepina et al., 1993).

Для гибридизации плазмиду pUHAB рестрицировалии Hindi 11; Kpnl; Hindlll+Kpnl; KpnI+Smal. В результате получили гибридиза- • цию олигонуклеотидной смеси с правым Kpnl фрагментом плазмиды . Плазмиду pAST обрабатывали Hindi 11, при этом олигонуклеотидная смесь гибридизовалась с HindiIi-фрагментом плазмиды pAST размером 8,6 т.п.н. Плазмиды pUKH и pUHBr, не содержащие правого 8,4 т.п.н. Kpnl-фрагмента плазмиды pUHAB , не гибридизовались с олигонуклеотидной смесью. Следовательно, можно предположить, что структурный ген.пептидной, части микроцина С51 расположен справа от Kpnl сайта (рис. 3). Полученные нами результаты могут служить косвенным подтверждением того, что синтез пептидной части микроцина может происходить на рибосомах, подобно синтезу микроцина

- 20 -

В17 и лантибиотика низина (Kolter and Moreno, 19S2).

Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего гены иммунитета к микроцину С51.

Для дальнейшего изучения генетических детерминантов, связанных с иммунитетом к микроцину С51, нами была начата работа по определению нуклеотидной последовательности М1с+-фрагмента плаз- " миды pUHAB. В рамках этой работы была определена нуклеотидная последовательность фрагмента, связанного с экспрессией частичного иммунитета к микроцину (1845 н.п., между Hindi П(2)-сайтом и 200 н.п. левее сайта Seal). Секвенирование проводилось совместно с A.A. Володиным.

При компьютерном анализе мы не обнаружили в секвенированном фрагменте последовательностей сходных с каноническими последовательностями промоторов. Это согласуется с"полученными данными о том, что экспрессия частичного иммунитета возможна только при определенной ориентации этого фрагмента, когда используется промотор вектора.

Компьютерный анализ полученной последовательности показал наличие одной функционирующей рамки считывания, кодирующей пеп^ тид 3,6 кДа. Возможно, это один из белков, связанных с иммунитетом к микроцину С51.

Обнаружена, также протяженная последовательность (501 н.п.), содержщая терминаторный кодон и не имеющая инициаторного кодона в пределах секвенированного фрагмента. Она может кодировать С-концевую- область белка, содержащую 167 аминокислот. Начало ге- ■■ на и регуляторная область может находиться правее Hindi П(2)-сайта. ' •

В дальнейшей работе необходимо идентифицировать конкретные белки, кодируемые секвенированной нами нуклеотидной последовательностью, и установить их функциональную роль.

Glu Gly lie Asp lie Ser Glu Ser Ala Val Met Val Ala Asn Glu

0 5'.. GAS GGT ATT GAT ATA TCT GAA TCA GCT GTA ATG GTG GCA AAT GAA

Lys Ala Lys Lys Leu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Lys Туг Tyr Val

46 AAG GCA AAA AAG CTT AAG GCT AAT AAT -TTA TTG AAA TAT TAT GTA

Ala Asp Ala Cys Àsp Leu Pro Phe Glu Asp Asn Thr Phe Thr His

91 GOT GAT GCT TGT GAT TTA CCA TTT GAA GAT AAC ACT TTT АСА CAT

Val leu Gly Gly Cys Asn Phe Ala Phe lie Sin Asn Arg Leu lie 136 GTT CTO GGT GGA TGT AAT TTT GCA TTT ATA CAA AAT CSG TTÁ ATA

181

226

271

316

361

406

451

496

541

586

631

676

721

766

811

856

Ala Leu Asn Glu Thr His Arg Cys Leu Asn His Met Gly Ser Met GCC TTG AAT GAA ACT CAT CGA TGT TTA AAC CAC ATG GGA AGC ATG

Cys lie Ser Asn Phe Туг Туг Arg Arg Lys Ile Ser Asp Lys Leu TGÜ ATT TCA AAT TTT TAT TAC AGG CGT AAA' ATA TCA GAT AAA CTT

Ile Asn Asp Val Туг Asn Ala Ile Asn Phe Arg Pro Asn Pro Leu АТС AAT GAT GTA TAT AAT GCA ATA AAT TTC AGA CCC AAT CCT TTG

Trp Thr Leu Glu Туг Trp His Gin Phe Phe Ser Glu Arg Phe Thr. TGG ACT TTG GAA TAC TGG CAT CAG TTT TTT TCT GAA AGA TTT ACT

Leu Val Ser Glu Glu Asn His Glu Met Glu Ser Gin Ser Glu Asp CTG GTT TCA GAA GAA AAT CAT GAG ATG GAA TCT CAA AGT GAA GAT

Glu Leu Lys Ala Asp Ile.Туг Asp Туг Ile Phe Asn Arg Asn Glu GAG TTA AAA GCC GAT ATT TAT GAT TAC ATT TTC AAT AGA AAT GAG

Phe Thr-Lys Gly Leu Met Val His Phe Arg Met Туг Phe Leu Arg TTT АСА AAA GGT TTA ATG GTT CAC TTC AGA ATG TAT TTT TTG AGA

Asp Phe Term

GAT TTT TAA AAA TAC GCA GAC CAT TAA ATA TCC AAA GAC ATT АТС AGG GAG TTA CAT TGC AAA TAT GGC GCA AAA AAT AAC ACC АТС TAA AAT TGT TAA АСА TGC CCG GGA GTT AAT TAT TAA GGG GAT TGA АТС GGG CGA TAA CTC ATT TGT CAT TTT TÇ5A TGT AGA TGG AGC TCT GGA GCG TCT GGA АСА TTA CAG GTG TCA ACT TAA GAG TTT TTT CCC CAA CAG CAG TAT CGC ATA TTC ATA TAA GTC AAA TAA TCT GGC АСА ATG GTG CCA GAT TAT CTC TCA GGT AAA GGT TTG TAT GCA GAG GTG TGC TCT GTT GAT GAA ATG AAC CTC GCT AAA AGA GAC GGT TTT AAC CGG

ATT GTT TTT GAT GGC CCT TTA AAA AAA ACG AGT GAA СТА TTA AAG

901 GCA ATA 6A6 ATT GGG GCA TTA ATT GAA 6TT.......ВАС AAT ATT EAT GAA

946 . TGT AAA .AGA CTT AAT GAA СТА-TGT AAA TTG CAT AAG'TTG ACA TGT 991 AGA ATT CAT TTG AGA TTA TCG CAT TAC TAT GAT GAT AAT TTA TCA

SD

1036 AGA TTT GGC TTA TCT GAA AGT GAG GCT ATT AAT TTA CTG GAG ATG

Met Ile Ser Lys Ser Glu Туг Leu Ile Leu Asp Gly Phe Ile Туг 1081 TTG АТС AGT AAG TCA GAG TAT CTC ATT TTA GAC GGG TTC ATT TAC

Met Leu Ala Leu Ile Туг Pro Met Arg Lys Lys Туг Val Lys Leu 1126 ATG TTG GCT СТА АТС TAC CCA ATG CGG AAA AAA TAT GTA AAG CTG

Leu Туг Ser Ile Met Ser Term 1171 TTA TAC AGT АТС ATG AGT TGA TTC TTA GGT ATA TGC CAG ATG ATG

12Í6 GCA CTC TTA АТС TTG GTA GTG GGA TAC CTC TAG AGT CGA CCT GCA

1261 GAT TCT TTC TCA GCA TCC AGT GAT AAC CCA ACT CCA TGT CCG GAG

1306 TAT TTTTCT CAT CGA TAT ATG ATA CAA TAA AAA ATT GCT TCG GTA

1351 CTG TAT GTG ATA AAT GGA ACT ATA TTT TTG AAC CTG GGA GAC АТС

1396 TCG TCG AAG ATT TGG СТА CTT TAT AGG GAA AGT TAT TAG TAC TAA

1441 AAA CAG GTA TGG TGT TAA AGT TGC TCA AAC TAA CAT TGG TAT AAA

' 1486 CTG GAT ACG TTC GAT CAG AAA TTG GGA CCA TTC ATT TAC ATT GTT

1531 TCA TAA TCA TAA CCA TAT TTC AGA TGA TAA АТС TGA TGA GTA TAT

1576 TAT TGC TGG ATT CAA TTG CTT TGA ATG TGA TTG CTT GTT TCC TTC

1621 AGT TAT TCT TCC CAG TAA CTT АТС TGA TTA TTT ATT TTC TGT TCG

1666 AGG GTG TGG TGC TIA TGA TAT GCA AAC AGG AAA CCA GTG GAC GCG

1711 ' T-AA- TCT-TTA TGC TGT ATA TAC CAT AAC AAA TGA TGT TGT TAA TAT

1756 TAT CTC TTA CGC CAT CAG АТС AAG GAT TCA CAG AAG-AGA ACT TGA

1801 TTT CCG GAA GTA TGA TGG GAA TAA AAG TAA ATG ATG AGA TTA CAT.

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pUHAB, связанного с экспрессией частичного иммунитета. Сверху над строкой указана аминокислотная последовательность, кодируемая предполагаемыми генами.

ВЫВОДЫ.

1. В результате скрининга штаммов энтеробактерий, полученных из различных источйиков,' выделено 13 активных" продуцентов микронинов. Определен спектр действия микроцинов. Показано, что все они являются пептидами или их производными.

2. Установлено, что в 6 из 8 изученных штаммов синтез микроцинов определяется плазмидами.

3. Показано, что синтез микроцина В2 определяется плазмидой рВ2 размером 70 т.п.н. Проведено клонирование и картирование генов синтеза микроцина В2 и иммунитета к нему. Установлено, что минимальный фрагмент ДНК, необходимый для синтеза микроцина В2 и иммунитета, равен 4,2 т.п.н. Иммунитет обеспечивается фрагментом ДНК 1,4 т.п.н.

4. Показано, что на синтез микроцина В2 не влияет продукт хромосомного гена ошрИ, в то время как синтез микроцинов В27 и С51 зависит от продукта этого гена.

5. Установлено, что мутации-гесА.и 1ехА геноз увеличивают. . чувствительность клеток Е.соН к действию микроцинов В2 и В27, однако не влияют на их чувствительность к микрошну С51. Мутации огпрГ и ото!? генов приводят к резистентности клеток к действию этих микроцинов.

6. Показана высокая консервативность геноЕ, определяющих синтез трех известных микрошнов типа В, продуцируемых штаммами E.coli, выделенными в географически отдаленных районах из различных организмов.

7. С помощью" компл'ементационного анализа показано^ что в синтезе микроцина С51 участвуют три гена, которые предположительно организованы в оперон. Для экспрессии полного иммунитета к микроцину необходимы по крайней мере два гена. Определена вероятная локализация структурного гена пептидной части микроцина С51.

8. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК., обеспечивающего частичный иммунитет клетки-продуцента к микроцину С51.

СПИСОК РАБОТ опубликованных автором по теме диссертации

N.E.Kurepina, Е. I.Basyuk, A.Z.Metliskaya, D.A.Zaitsev, 1.A.Khmel.Cloning and Mapping of the Genetic Determinants for Microcin C51.Production and Immunity. MGG, 1993, V. 241, P. 700-706.

• ■ I.A.Khmer, Y.M.Bondarenko," I.M.Manokhina," E:I.Basyuk, A.Z.Metliskaya, V.A.Lipasova, Y.M.Romanova. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of В and С types. FEMS Microbiology Letters, 1993, V. Ill, p. 269-274.

БасюкЕ.И., Курепина H.E., Метлицкая А.З., Хмель И. А. Плаз-мидные гена, участвующие е синтезе микроцина С51. Генетика, 1994, Т. 30, С. 445-451.

Васюк Е.И., Безруков В.М., Липасова В.А., Хмель И.А. Клонирование и анализ генетических детерминантов, определяющих продукцию микроцинов В2 и В27. Генетика, 1994, Т. 30, С. 731-739.

Хмель И. А., Манохина И.М., БасюкЕ.И., Метлицкая А.З., Липасова В.А., Романова Ю.М., Бондаренко В.М. Характеристика энте-

робактерий, продуцирующих антибиотики широкого спектра действия микроцины. Генетика, 1993, Т. 29, С. 768-776.

BasyukE.I.', Besrukov Y.M., Fomenko D.E.,' Volodin A.A., Rhine 1 l.A. Cloning and characterization of the genetic determinants for microcins B2 and B27. Plasmid, в печати.