Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического контроля синтеза микроцина R51 - антибиотика широкого спектра действия

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического контроля синтеза микроцина R51 - антибиотика широкого спектра действия"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

КУРЕПИНА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ СИНТЕЗА МИКРОЦИНА R51 - АНТИБИОТИКА ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Москва -1992

Работа выполнена в Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетихн РАН.

Научний руководитель: доктор биологических наук И.й.Хмель

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Р.С.(акулов доктор биологических наук Л.С.Чернин

Ведуцая организация - Институт общей генетики РАН

Зацита состоится 1992 года в часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д 098.12.01 при Всесовзном нацчно-исследовгтельском институте генетики и селекции промниленных микроорганизмов по адресу: 113345 Москва, 1-й Дороянмй проезд, д.1.

£ диссертацией мовно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИгенетика.

Автореферат разослан

1992 года.

Учений секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

И. Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теми.

Проблема взаимодействия бактерий различных таксономических групп в природных экологических системах имеет больеое теоретическое н практическое значение. В частности, такая сложная и многофункциональная экосистема, как микрофлора желудочно-кишечного тракта человека и жипотных, в норке работает лишь при условии определенного качественного и количественного равновесия бактериальных видов. Вмешательство в Функционирование этой системы, приводяцее к изменение спектра видов бактерий, может иметь непредсказуемые последствия. Тем не менее, в ряде случаев возникает необходимость коррекции состава мккрофлоры. Для принятия разумных реаений необходимо четко представлять механизмы взаимодействий между бактериями, влиявцие на видовой состав микробных сообществ.

Суцественнуп роль в процессах антагонистических отноаений микроорганизмов и динамики видового состава играет синтез вецеств с антибиотическим действием. С 1925 года известна антибиотики энтеробактеркй - холнцнни; это полипептидн с аол. массой от 10 до 90 кДа, подавлявшие рост клеток, близкородственных зтамму-продуценту. Среди антибиотиков, синтезируемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. особое положение занимает сравнительно мало изученная группа низкомолекулярных вецеств, проявлявших вирокий спектр ингнбирувчего действия по отновенив к больвому числу бактериальных видов - иикроцины fflsensio et al, 19761. В настоячее время описаны Й типов микроцинов. отличавшихся по структуре молекул, характеру действия на чувствительные клетки и по спектру антибиотической активности [Daquero,19841. Сравнительно подробно изучен иикроцкн В17 , единственный представитель микроцинов группы В. Имеятся сведения ой основных биохимических свойствах этого микроцнна, исследованы генетические детерминанты его синтеза и иммунитета к ному клеток-продуцентов, предложена модель механизма действия микроцина В17 на клеточные иияени Шзггего et al, 198b J. Истановлено, что больнинство микроцинов детерминируется

плазмидники генами, проводятся исследования их организации н экспрессии. Однако, многие вопросы даже в отношении хорою изученного микроцина В17 и генов, ответственных за его синтез и иммунитет, оставтся невыясненными.

Цель работн. Цельв работы является скрининг втаммов, синтозирув*их низкомолекулярные антибиотики - микроцины и изучение распространенности их синтеза среди бактерий кивечной групп»; определение физико-химических свойств обнаруженного микроцина Rül. синтезируемого клетками E.coli R31. и изучение особенностей механизма его действия на чувствительные клетки; исследование особенностей организации и экспрессии генетических детерминант синтеза микроцина R5I и иммунитета к нему, а также изучение возможностей практического использования атаммов, синтезирувщих микроцин R51.

Научная новизна.

Проведен скрининг втаммов. скнтезируоцих низкомолекулярные антибиотики - микроцина. Показано, что способность к синтезу микроцинов встречается редко в популяциях клеток энтеробактерий. значительно pese, чем продукция колицинов. Обнаружено, что описанный ранее антибиотик иикроцинового типа тифимурицин синтезируемый клетками Salaonella typhUurlu« LT2 IBen-Gurion et al. Í9H21, в действительности является аминокислотой валииоы или его производным, ß результате скрининга энтеробактерий отобран природный изолят, втамм E.coll R51, способный синтезировать антибиотик с наиболее вироким из известных никроцг.аов спектром действия. Получены данные о некоторых физико-химических свойствах микроцина ( он термостабилен, устойчив к экстремальным значениям pH и инактивнруется при действии ряда протеолитических ферментов), охарактеризован спектр действия микроцина. Показано, что микроцин R31 является пептидом или содержит пептид в составе молекулы.

Установлено. что при действии микроцина R51 на чувствительные клетки происходит подавление синтеза ЛИК, РНК и белка.

Показано, что синтез микроцина R51 и иммунитет к нему детерминируется калокопийной конъвгативной плазмидой с иол.массой 25 Ид. Синтез микроцина конститутивен и не детален для клетки-продуцента. Осуществлено клонирование генов синтеза иикроцина R51 и иммунитета на фаэмндннх и плазмидных векторах. С помоцьв делеционного анализа производных плазмид и мутагенеза при инсерциях транспозоиа Тп5 картированы гены, определявдие

- 3 -

сиитез микроцина п иммунитет к пеку.

Выявлена зависимость синтеза микроцина R51 от хромосомного гена oepR.

Практическая значимость.

С использованием плазмиды. определяема синтез микроцина R51, сконструирован втамм Е.col 1 - антагонист болезнетворных бактерий. На основе этого итамма разработан препарат " Ронакол", который иовет бить использован в ветеринарии и, возможно, н медицине для профилактики и лечения колнбактериозои и других заболеваний «елудочно-кнмечного тракта человека и вивотннх, вызванных патогенными знтерсбактериями.

Таким образом, полцченные нами результаты дапт реальные предпосылки для практического применения втамиов, синтезирущих низкоиолекулярный антибиотик микроцин R51.

Структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, вклвчавцей описание материалов и методов, излошеине экспериментальных результатов. обсу»дение результатов,и выводов. Работа содервит 108 страниц мачинописного текста, вклпчает 11 рисунков, h таблиц. Список литературы включает fOá наименований.

йппробация диссертации.

Материалы работы били представлены на Всесоизний конференции "Молекулярные механизмы генетических процессов" С Москва. 1Э90). на IX Всесопзном симпозиуме по иаправлсшнжу изыскании лекарственных веаеств (Рига, 1391 г.), на лабораторных семинарах Отдела микробиологии н молекулярной генетиин Гарвардской медицинской «коли С Бостон. СИП) и Института общественного здоровья (Иьв-Иорк, Cífl), а такве на лабораторных семинарах Отдела молекулярно-генетических основ биотехнология Института молекулярной генетики РАН

МАТЕРИЙЛИ И ИЕТОДН,

Втаммы бактерий и плазмиды. использованные в работе, были получены из коллекции Института молекулярной генетики РйН. Иикроциногенные ятаммы E.coll, синтезируйте иикроцины В17 и С7, и К. pnemoniae были лвбезно предоставлены проо. Нагели,

Франция. Для выделения мнкроциногенных «таймов били использованы изоляты янтеробактерий из фекалий здоровых детей. Ятаммы бактерий, использованные при изучении спектра антибиотической активности микроцина R51, получены . из коллекции Института молекулярной генетики РАН и из коллекции Государственого НИН стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. fl.fi.Тарасевкча. Патогенные ятаммы E.coli были получены из коллекций Института эпидемиологии и микробиологии им П.®.Такалей и Института экспериментальной ветеринарии им Я.Р.Коваленко.

Питательные среды: минимальная среда, описанная ранее (Хмель и др.. 13811. эта se среда, обогащенная дрожжевым экстрактом (IHfco,0,3z ) и глвкозой (0,2Х), агаризованная среда того ве состава (1.5Х агара), LB-бульон и 1,5Z LB агар Шиллер, 197В1.

Определение продукции микроцинов проводили на твердой минимальной среде, как описано (Хмель и др.,19871.

Антибиотики добавляли в среду в следупщих концентрациях: ампициллин, канаыицин, стрептомицин, налидиксовая кислота - 100 мкг/мя: тетрациклин - 10 мкг/мл: хлорамфеникол - 20 мкг/мл;

Коньвгацив атлмиов E.coli (проводили, как описано (Киллер, 19701. Анализ плазмидной ДНК ( вклпчавщий выделение и очистку плазмидной ДНК, трансформации клеток E.coli плазмидной ДНК. рестрикция. лигирование, электрофорез ДИН в агарозком геле) вели в соответствии с методами, подробно описанными в (Маниатис и др..19821.

Чувствительность кикроцина к действии ферментов определяли как описано /Курелина и др., 1990J, накяацчиав т чавки с выросяими колониями полоски фильтровальной бумаги, смоченные раствором соответствуйте™ фермента. Использовались следувщие концентрации ферментов: трипсин, хиыотрипсин, пепсин, проназа. рибонуклеаэа. дезоксирибонуклеаза (Reanal) - 4 мг/мл (в трис-НС1 0,01 Н, рН 7,4): термолизин (Slesa) - 2.4 мг/мл (в 25 вН трис-НС1, 25 вМ СаС 1, pll 8,0): субтилизин (Slgaa) - 2 мг/кл (в том вп буфере), протеиназа К - 4 вг/мл(о трис-НСi 0.01Й. рН 0,0).

Териостабильность кикроцина определяли. как описано (Курепина с др.. 19901 инкубируя чапкн с колониями стаииа -прпяиппитп. стерилнзовапниыи парами хлороформа, при 75-C0l>C g тачание Í часа перед засевоа индикаторного втдымл. Препарат очищенного кикроцина инкубировали в 0,1 И ацетате натрия 10 мин при 90°С перед нанесешь:; на газон чувствительных клеток.

Выделение фаговой ДНК и упаковки Фаговой ДНК о капеид фага In 'Л tro проводили согласно методаа, опяслпныа с I »анкаткс, и др.. 19Я2. Яниопский и др., 19В7 I.

Выделение иикроцина R51 осуществляли из агаризованной минимальной среды после инкубации на ней клеток атамиа E.collTGl(pBH43), нанесенных на поверхность целлофана, в течение 48 час. Агаризованнуп среду заморааивали при - 70°С, оттаивали, центрифугировали при lBOOOg. супернатант пропускали через колонку, упакованнуп обраяеннофазовым сорбентом íС10). Препарат микроцина элпировали градиентом метанола, лиофильно высуяивали и растворяли в деионизованной воде.

Получение плазмидных мутаций с поаояьв инсерций транспозона Тп5 проводили, вводя ТпЗ из ®ara\b221 0аа29 РааВО гех::ТпЗ, как описано [Хмель и др.. 19811. в ятамм E.colt KRH22ü(pUHAB) или Е .col 1 KRH220C ptlST).

Определение иммунитета клеток к иикроцина проводили двумя способаии на агаризованной минимальной среде.

1) Подсевали клетки испытуемого ятакиа з качество газона к колония«'микроциногенного «таима, вирацешшм уколом.

2) Наносили препарат частично очинённого микроцина на газон клеток испытуемого ятамма.

Тест на комплементации проводили в клетках атамма E.coli ИВ1б37гесА, котрансформируя их двумя совместимыми плазиидами, вклпчав^ини гены синтеза микроцина и иммунитета . одна из которых содеряала вектор рИС19, другая - pflCYC184.

Для определения действия микроцина на синтез макромолекул в чувствительных клетках предаественники ДНК. РНК и белка, меченые тритием, добавляли к разведенной культуре, достигшей логарифмической фазы роста. После внесения микроцина пробы отбирали через определенные интервалы времени, осаядали на нитроцеллплозных фильтрах (Mllllpore, НАНР45) к подсчитывали количество включившихся в макромолекулы предаественников. Одновременно отбирали пробы для подсчета колонни-образупцих единиц (КОЕ).

Испытания препарата "Ромакол" проводились на базе Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии кн Я.Р.Коваленко.

РЕЗУЛЬТАТ!! И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение антибиотической активности ятакиа SaleoneíJa typhlaurlUH LT2.

Согласно опубликоваинни данный, атамм Safaonslla typlnaurina LT2 синтезирует вещество, названное тифнмурицинои, с.чодное с

микроцинаии. Действие тифимурицина было показано только в отношении клеток различных втаммов E.coli К12 IBen-Gurlon,19821.

Ти$имурицин был взат нами в качестве примера уже описанного микроцимг. сходного по свойствам с микроцинои 015; другими известными микроцинами мы в начале навих иследованнй не располагали. По намим данным мол. масса тифимурицина не превышает 250 Да. он термостабилен, активность его не падала при действии протеаэ (проназы. трипсина, химотрнпсинз, субтилизина и термолизина) и при выдерживании в условиях экстремальных pll (1,0 - 12,0; Зч>. Зоны ингибирования роста Е.coll вокруг колоний S.typhleiiriua LT2 отсутствовали или уменьвались. когда в столбик 0.7Z агара был добавлен 1-мстионин в конечной концентрации SO мкг/мл .

Однако п отличие от ыикроцина (115 ингибирущее действие тифниурицина подавлялось не только 1-метиончном, но в значительно больвпй степени 1-изолейцином: уме при концентрации его в среде 23 мкг/мл зоны ингибирования отсутствовали.

При определении спектра действия тифимурицина мы показали, что он ннгибнрует рост различных втаммов E.coli К12. но на действует на клетки F..coll В. E.coli С, E.coli F. а такве на Salsonella, Klebsiella, Shigella, Staphylococcus.

Эти данные дали основание предполагать, что тифимурицин в действительности является 1-валином, так как известно, что эта акинокислота ннгибирцет рост E.coli К12 и что ее действие подапляотся изолейцином Ide Felice,19741.

Вы показали, что «там* S. typhi вигtui LT2 действительно выделяет валин или его производное в культуральнуи «идкость;

1) Добавление в среду препарата тифимурицина позволяло ауксотрофномц по валину втаммц E.coli ТК610 расти на минимальной среде с необходимыми добавками, но без валина.

2) Полученные нами мутанты E.coli К12, резистентные к тифимурицину, были остойчивы к 1-валину и наоборот, мутанты, устойчивые к валину, были резистентнн такве к тифимурицину.

3) Среди мутантов, устойчивых к валину, били описаны мутанты, синтезирующие валин в выделявшие его в среду; мутации были картированы в leu-thr области карты E.coli Юе. Felice et al, 1974). Иы показали, что часть полученных нами мутаций, приводящих к устойчивости клеток к тифимурицину и к синтезу его клетками, такве картируется в leu-thr области.

В процессе работы нами было установлено, что обнарувенная в втамве S.typhlBurlui LT2 плазмида 60 ИДа не имеет никакого отновения к синтезу вещества с антибиотической активностьп. как это предполагалось ранее IKendaza.tSBS; Leeolne,19851.

Выделение втамма, продуцирувчего микроцин.

При проверке 6000 иэолятов кивечных бактерий из различных источников ( выделенных в основном от здоровых детей в возрасте от нескольких дней до 7 лет) был отобран иэолст, ннгнбирувчий рост клеток E.coll В, устойчивых к валииу. а также других итаммов E.coll: E.coll ULI, E.coll С. E.coll F и др. Этот втамы по ряду физиологических признаков был отнесен к виду Escherichia coll и обозначен как R51. Добавление в среду, на которой инкубировали нтамм R51, изолейцина (25-100 мкг/мл), а также других аминокислот и различных питательных добавок не снимало его антибиотической активности; зто свидетельствует о том, что антибактериальнув активность втамма R51 нельзя объяснить продукцией валина.

Чтобы определить. индуцибелен или конститутивен синтез микроцина R51. клетки E.coll R51 обрабатывали митомицином С. При этом не обнаружено увеличения количества мнкроцнна ни в концентрированном супернатанте, полученном при центрифугировании клеток, ни в клетках, разруяенных ультразвуком. По-видимому, синтез микроцина конститутивен в отличие от синтеза колицинов. Этот вывод подтверждается также тем. что мутации в генах recft и !ехА, препятствуйте индукции синтеза колицинов, не влияет на синтез микроцина R51.

Микроцин R51 ингибировал рост всех проверенных лабораторных втаммов E.coll С E.coll К12. E.coll С, Е. coli В. E.coll F) и выделенных из природных источников, в том числе патогенных: 18 видов рода Salaonella и других энтеробактерий, а также Pseudoaonas, ftgrobacterius и в меньвей степени грамполовительних Bacillus BegaterluB, Bacillus puallus и Bacillus subt ills (табл.1).

Чувствительными к микроцину R51 оказались атаммы E.coll, синтезирувцие микроцин 017 и колицин Со1U-K30 (колицины типа U теперь принято относить к викроцинам), а такие втама Klebsiella pneuBonlae, еннтезирувчий микроцин Е492. Втамм-продуцент иикроцина R51 проявлял перекрестный иммунитет к микроцнну С?.

Били подобраны условия роста для максимального синтеза микроцина R51 клетками продуцирувцего втамма.

йы показали, что микроцин R51 оказывал бактерицидное действие на клетки втамма E.coll В.

- в -

Таблица 1.

Действие микроцина R51 на бактерии различных таксономических групп.

Бактерии Радиус зоны подавления

роста, ми

Escherichia coll ( 67 ) 5 23

Shigella flexnerl 10 - 12

Salaonella ( 18 ) e - 15

Klebsiella ( 2 ) 3

Citrobacter ( 3 ) 4 - e

Enterobacter (31 0 - 8

Proteus ( 2 ) 3 - 10

Serratia B^rcesceng 8

flgrobacterlua tuiefaclans ( 2 ) i - 2

Erulnla carotovora 4 - 3

Bacillus «eßaterlua ( 2 ) 4 - s

Bacillus puailus ( 1 ) 2 - 3

Yersinia ( 2 V 3 - 7

Клетки E.coll R31 росли уколами на минимальной среде с гяскозой ( си. "Иетоды" ). В графе "Бактерии" в скобках указано количество проверенных «тамыов.

Характеристика ииироцина R31. При изучении действия различных протеолмтических фграентов i:a ингибиторнув активность микроцниа Р-51 било показано, что активность микроцниа исчезает при действии на него трипсина, яикотрнпсина, протеинази К. проназ С, Е, Р я субтилизкна; она сохраняется при дейстпяк териояизина. РНКаза и ¿¡.¡¡¡Uisa пс сказававт никакого действие (¡а антибиотический эффект ииироцина. Из этих данник следуот. что микроцмн R51 является пептядзк илк небольвии белкой с мод.кассой менее 10 кД (о чем свидетельствует его способность проходить через целлофановой кенбрани> или содержит пептид е состаое вслекули,

В даяьнейзея в работе, проведенной совместно с со грудника«'. Института Вноорганачсской химии и ВНИИ по изысканна новы* антибиотиков, было показано, что кол. касса кикроцина по канны*;

насс-спектраметрнческого анализа составляет 1178 Да, аминокислот: аргинин, треонин, аяаиин. глицин и аспарагиновув кислоту.

Микроцин RS1 термостабилен: он не раэруаается при инкубации 0,1М растворе уксусной кислоты в течение 10 пни при 100°С.

он содервит в аспарагин или

в

Клонирование плазмидних генсв. определявших синтез микроцина RS1.

В втамме E.coll R51 была обнарувена плазмида, названная нами pR51, с мол.массой приблизительно 23 МДа, которая присутствовала в клетке в количестве 1-2 копий. В экспериментах по совместной передаче плазмид pR51 и RSF1010 в процессе конъвгацни было показано, что именно плазмида pR5I определяет синтез микроцина R31 и иммунитет к нему

хозяйских клеток.

Было осуществлено

клонирование генов синтеза микроцина R51 и иммунитета к нему на фазмидном и плазмидних векторах. Ыы использовали фазмндный вектор pSL5, обладавший болькой векторной емкостьв - до 20 т.п.нЛФонатейн и др., 13861. Был проведен частичный гидролиз ДНК плазмиды pR51 эндонуклеазой Sau3fl, с последующим лигированием полученных фрагментов с ДНК фазмиды pSL5, гндролизованной по уникальному сайту SalGI с достройкой концов фрагментом Кленова (рис.1).. Поддермивая рекомбинантный фаэмидний вектор в форме плазмиды, определили клон.

синтезирувянЯ микроцин R51. Рекомбинантная плазмида из этого клона была обозначена pRX3. ДНК pRH3 была подвергнута расщепленнв

рестриктазой Baalll, которая точно вырезает

последовательность плазмида

Рис.1. Схема клонирования плазыидных гонов, оппеделявяих синтез микроцина R51 и ииму -нитет к нему.

rate tora

мелпяи пуош S..3*

fwmisiici

Д0СТРС1М -ШУЛ- MH1ÍCS

»»гннш шнем ЛХГВРвеями

одкош'и SITÍC I МПСМ *ЙГЙ л

ЗШ1Ш1 IKTOI E.CSU «TI4

ms:is*|u б кита i.cou tsi

0ТШ ESSiift SIC*

в

ГДООШ jBtall

ШСИ «PfiríEfiTfi 13 Т.П.!!.

mtfcíÉiK

T

ГСИСМРГР.ЦМ ÜfETDÍÍ Í.CCU TSt

- 10 -

рШИ9, входящей в состав фазмидного вектора pSL5.

Таких образом, нами была получена рекомбинантная плазмнда (названная pUMS), состоящая из вектора pUC!9 и клонированных генов, ответственных за синтез микроцина R51. Рестрикционный анализ п^аэынди pUH5 показал, что размер встроенного фрагмента равен 12,3 т.п.н. При переклонировании фрагмента о составе вектора pDH325 была получена плазмнда рВМ43.

При планировании микроциновых генов в мудьтикопийных векторах наблвдается эффект дозы генов, определявших синтез микроцина. на его продукции.

Минимизация фрагмента, определявшего синтез микроцина R51.

В целях уменьвення размера клонированного фрагмента в серии последовательных манипуляций из пдазмиды pUHS была делегирована oOiacTb величиной 2,4 т.п.н., расподовенная на одном из концов фрагвента. Полученная плазыида была обозначена pUllflB, построена ее физическая карта !рис,2). В процессе этой работы была сконструирована серия делеционных производных пдазмиды pUHDB на основе векторов pUCIS к pflCVClЯ4. фенотип которых указан на рис2. Анализ фенотипов дедеционных плазмид показал, что для продукции микроцина необходимы Hind! П( 1 J-lllndl 11(2) и Hindi IK 2 )-8ав!И фрагменты пдазмиды рШШП, причем взаимное располовение этих фрагментов долвно быть сохранено. Изменение ориентации фрагмента Hindi 11(1) -HindiIK2) приводит к отсутствии синтеза микроцина (плазмнда pflBfl).

Иммунитет к викроцинц отсутствовал в клетках, несуцих пдазмиды с делециями левого Hindi IK 1ï-Pst1 фрагмента (плазмнда pUPB), Hindi I ! ( 1 J-lllndl 11(2) фрагмента (пдазмиды pUIIfl и pftlifl) н Hindi IK I )-EcoRl фрагмента (плазмида pUER).

Сниженный уровень иммунитета набдздали в клетках с пдазмидой pUK.il (при дедеции правого Kpnl-Baalll фрагмента), и в клетках с плазмидой pUHBr, содервацей вектор pUC19 с фрагментом HlndlIK 1 )-lilndIII(2), клонированным в обратной по сравнения с исходной ориентации. По-видимому, в последнем сдучао клонированные гены попадавт под контроль вневнего промотора (геноп lac или.Ыа). так как при клонировании этого фрагмента в pUC1П в исходной' ориентации нлн о составе pflCYC184 иммунитета клеток на наблвдается. Геи Isa, расподовенный на фрагменте HlndlIK 1 )-HIndIII(2) транскрибируется, следовательно, справа налево (по ходу карты).

Полученные нами данные показывает, что для вираяения полного иииунитота к мнкроцкну нообходкыы генетические

H,

..XJL-1________i_______1— ' I /__?» a

---■-,-■«'„ -ЛГТГ"

----------J rUbH M e W

Уз_ У ,инк ■ ihm-

_ÎL___Ï' rUHBa Vie Imm-

и___& ,uiii Ис" и«'

Ц___$J Me Ьо."

Ч»____...? ринА м*- 1мм~

Ь_J .VF» NCc- IMM-

tj. _ flT

H,

h,

"i-

R1

H,

•J, 3

■Й

-3 pAILA

^AHBs ,лн8»

_? ^AAB

_В f ABA

•AST

;asu

Mkr- N«-M/c" UW Mic*

Mie' Imm* Mic" Imm* MIC-ïmh' m'c" ihh"

Phc.Z. «язнческая карта плазкидн pUHflB и ее делеционных ггроизвожных. Стрелкой отмечено направление транскрипции гена lac PUC19. Обозначение фенотипов мутантиых клонов: М1с+ - синтез микроцина R31, 1ва+ - иммунитет к экзогенному микроцину, 1жа+— частичный &гаднатет к йякроцкиу.

н

И,

-4=

гМ

ср. RI sc pjl

M I я/ П>

} tn Util

JLL

кус ' I / ..

C SSKRJ

M M i

I I Ml liMitf i i

M 3D» 77 M f1

;viîr

i t

Mic'

и \ I

h,

t-WM*

Рис. 3. Располоаение сайтов инсерций транспозона Тп5 на Фрагменте ДНК. содержащем гены синтеза микроцина R51 и иммунитета к нему, клонированном в рлСУСШ (вверху) и pliC 19 (внизу). Обозначение фенотипов мутантнах клонов: К1с+ - синтез микроцина R51. 1ая+ - иммунитет к экзогенному иикроцану, Ini+- - частичный иммунитет к инхроцину.

детерминант, локализованные н в Hindi IK 1 )-HindII I<2> Фрагменте, ив правом Hindi 11(2)-ВавН1 фрагменте. Частичный иммунитет к иикроцииц шлет быть обеспечен фрагментом Hindi IК1 )-lflndIII(2).

Получение мутантных плазмид с поиольа инсерций транспозона Тп5.

Для определения точной локализации генов, ответственных за синтез микроцина и иммунитет к пеыу, были проведена эксперименты по выключению этих генов при встраивании транспозона Тп5 в ДНК рекоабинантных плазиид на основе рШЛЗ и рЛСУС164. Среди клонов с ыутантнаии плазмидаки встречались а1с-1«а-, а1с-1в«+ (1аа+-) и а1с+ 1ва+. Не было обнаруаено ни одной мут 1тной плазиндв типа в!с+ 1вя-. Эозиоено. клетки, несущие такие пдазииды, не кизнеспособны. т.к. они могут быть убиты собственным никроцикох.

На рис.3 показано расположение сайтов встраивания транспозона на карте фрагиента, клонированного в векторе р11С19 (плазмкда рОНПВ) и рАСШ84 (плазмида рПБТ. сконструированная на основе рАПВ, у которой делетнрован фрагмент 3.7т.п.н. влево от ВавШ-сайта). Мовно видеть, что нарувение синтеза микроцина происходит при встраивании Тп5 в область плазмидк, локализованную на карте фрагмента Н1псЛ 11 с 1 )-ВааН1 между 1 и О т.п.н., т.е. минимальный фрагиент ДНК, содерваяий генетическую информация для синтеза «нкрофша, составляет около 5 т.п.н. Внутри этой области не было ни одного случая инсерций Тпб! которые не нарувалн бн продукции никроцика.

Иммунитет к микроциид полностью отсутствовал, когда инсерций Тп5 били локализованы в клонированном Фрагненте в положении 1.4-1.0 т.п.н. и 4.6-5,8 т.п.н. Встройки Тп5 в положениях 3,3 - 4,6 т.н.и. приводили к сниаенип уровня нимцнитета; остаточный иккцннтет клеток, несущих эти мутанткые плазынды, был даяе ниже, чем иммунитет клеток с плазмидой р11КН.

Мы получили такяр. ТпС-цутанты плазмнды pUK.ll (рис.4). Две 1ь8-ыутации были локализованы вблизи сайта рестрикции ЕсоШ ¡1,2 и 1.45 т.п.н, относительно карты мутаций в плазвкде рШШВ). Третья идтация (3.2 т.п.н.) приводила к нейольяому снижение дровпя иммунитета по сравнении с иммунитетом, определяемый плазмидой рЦКН.

II, ОД R1 SCa Eli, Р,К Рис.4. Расположение

I_' ■J I ?i/ ГI I_1 г [_ сайтов инсерций транспозона

--1---,—,---д- Tr5 на плазандс pUKH.

I Обозначение фенотипов

вутаитных клонов: !»•+- -)мм; Jilid частичный иммунитет к

микроцину R31.

тт

- 13 -

Таким образом, изучение фенотипа клеток E.coll, несущих делеционнае и мутантные плазмиды, показывает, что для выраяення полного иммунитета клеток к микроцину необходим весь фрагмент от ■ 1,2 до 5,0 т.п.н., т.е. около 4,8 т.п.н. длиной. Более низкий уровень иммунитета определяется фрагментом HlndlIKI) -Hindi IK 2) размером 2,7 т.п.н. Судя по локализации 1»а+ и 1вв мутаций в этом фрагменте, для выражения частичного иммунитета необходим фрагмент ДНК величиной 1,8 -1,9 т.п.н.

На основании анализа полученных данных ыохно сделать вывод, что иммунитет к ыикроцину определяется, по неньаей меро, двумя генетическими детерминантами. Область плазмиди 1,2 - 1.0 т.п.н. абсолатно необходима для выражения иммунитета, т.к. инсерции Тп5 в этой области пяазмид pUHftB и pUKH полностьв скииапт иммунитет к микроцину. Коню думать, что в этой участке фрагмента HlndlIKI)- IIindi 11(2) расположен структурный ген, обеспечивавший невысокий уровень иыиунитата, когда он функционирует в составе плазиид pUHBr или рШ1. Если в плазмиде рШШг lea ген считиваетса. по-видимому, с виевнего промотора, то в плазмиде pUKH транскрипция с этого поомотора должна происходить в противоположно» направлении; 1 этоа случае собственный промотор должен находиться в самоа фрагменте HindiIК2) -Kpnl.

Второй генетический детериинант, участвувщий в определении иммунитета к микроцину. вклвчает участок, локализованный в области Kpnl - сайта (5,25 -5,8), но фрагмент плазнидн pUHflO (EcoRI - ЙавШ), содервачий эту область и входящий в состав плазмндн pUER , иммунитета к микроцину не определяет.Здесь аозот находиться регуляторная область гена(оо) 1ав, сбеспечиааЕг/ш более эффеитивнув экспрессии иммунитета, чем в плязмидах pUKli к plWB. Не псклвчено также. что в этой области локализован структурный ген :чакого-то компонента, принянавцего такяа участии з вырааенкя иммунитета к микроцину.

Инсерцкн Тп5 а область 5.25 - 5,75 т.п.н. иниат одну непонятнуэ п настоящее вреия особенность - otra поятюеть® ппгябирупт иммунитет к микроцину, определяемый пдазкпдой рШШ. хотя, ин га показали, плззанда pOXif Moser определить частячшФ иавунктот. Зти даштз аогут объясняться тси, что:

i) чнсзрцнй ТпЗ оказывают полярное действие на.экссресск? тек л с прэйотарэ. кдхэпячегося во -эрзгкепте UlndlliCl I -fen!, *«н 2) регдатори.ш область гена Irs э пяазкнхо rBÜH зягсчаат какой-то зчастоп вектора рОГЛЗ.

- 14 -

Комплементациошшй анализ мутацтных плазмид.

Вутантные плазмиды. полученные при инсерциах тракспозона Тг.5 в ДНК плазмид pUHAB и pAST. а такве делеционные производные этих плазмид были использованы для проведения комплементационного анализа микроциновых генов. D клетки втаваа E.coll гесА вводились две плазииды. сконструированные на основе совместимых векторов рОС19 и рАСУС1В4.

На рис.Э цифрами помечены иутантные плазииды, которые были взяты для проведения коыплементационного анализа с указанием стрелкой сайта кнсерций транспозона Тпэ. Б табл.2 представлены данные по определении фенотипа клонов, представлявших собой частичные диплоиды по иикроциновым генам. Сочетание в одной клетке двух плазыяд с инсерциями TnS в различных областях ынкроциновнх генов не приводило ни в одном случае к восстановлении исходного фенотипа Мсс+1ва+. По-видиному, это ковно объяснить тем. что при встраивании TnS наблвдается полярный эффект транспозона на функционирование генов, располовенных на значительном расстоянии от ннсерционного сайта.

Такая ситуация возаовна в

Ннсерционные мутанты

pflST::Tn5 I pUHftB::Тп5

"3=3 ""

3-3 3-3

8-10 8-10

2-7 2-7

2-4

8-6 9-5

39 8В

34. 77

09

20,54,01

69 20,54

17.47.54, 77.2Й9

17.209,47.54 69

17.20.47. §4 ,¿09

Фенотип

Н1с+ 1ввч HlC- 1ВЕ+-Hlc- 1вв>

Н1с+

Н1с-

Н1с+ Н1с-

М1с-

случае, если гены, связанные с синтезом микроцина, транскриЗи-рувтся с общего промотора, составляя одни оперон.

М1с-И1с+

HI с-

I

Делецнонные мутанты I

"pUKH pASA ЙТсГТввГ

pASH

pUHBn

pUHBr pUllfi

pASA pASH

pAilA

pAHBr

Hlc- Ub-

Mlc-И1с

Ica+-lit

Таблица 2.

Результаты коыплеыентационного анализа делецношшх производных и Тп5-кутантнкх плазмид. содер-хавих гены синтеза микроцина RS1 и иммунитета к нему.

При использовании делециошшх вариантов восстановление исходного фенотипа Исс+Iaat происходило только лияь при одновременно* введении в клетку плазмид pUKfl и pflllfl, или pUKH и pflSfl. На основании этих данных моано предполояить. что, по крайней вере, два генетических детерминанта участвупт в синтезе иикроцика.

Действие микроцина R51 на клетки вталма E.coll В.

коп-во

КОЕ

3 р

2Р

ИМ1Ь-

too"

ТО1 12

8

+МСС -•

\J

/ /-Moo

20 40 60

__ 0-°Z°

90 вргми.МИИ о

иА

■нМсс

20

40

-Ml-

н\иу . ■"им

'Ю1 5

4

3

2

I

/

у

имп^ -Too

•10J

25

-Мсо 20

15 10 5

+ Мсс

.X'

60 wemh.MH.

У^-Мсо

/

20

40

60 120 О вгемя.мин

у

V

L

20

40

+Мсс

-II-

60 " КО

ВРЕМЯ, МИН

Рис.5. Действие шшроцина R51 на внживаеиость пдоток E.coll (ft), на включение 3И-нсчоных предвествешжков в ДНК (В), РНК(С), белок (0). Яикроцин (ЯссИдобавляли в количестве 5 мил на 2,0 ал клеточной суспензии. KOF. • колонии образивцие единиц«.

- 16 -

Клетки втамиа E.coll D, чувствительные к ыикроцину R31, достигвие начала логарифмической фазы роста культуры, обрабатывали частично очицешшы препаратом микроцина. При этом наблидалось значительное сниаение уровня синтеза ДНК, РНК и белка (рис.5 ), что выраяалось в уменьяении количества вклйчиввихся предшественников ( 'Н-тимидииа. 'Н-уридкна и 311-лейцина, соответственно) в макромолекулы. При использованных концентрациях ыикроцкна R51 проявлялось его бактерицидное действие на чувствительные клетки.

Зависимость синтеза микроцина от гена ospR.

Было показано, что синтез микроцина «51 зависит от продукта гена окрК, участвущего в регуляции транскрипции генов синтеза пориноо вневней мембрана клеток E.coll ospC к оврК. В клетках мутанта. у которого ген oapR был инактивирован инсерцией трвнснозопа Тп5, микроцин не обнаруяивался в отличие от клеток изогенного втаыма.

Чтобы определить, влияет ли продукт гена oapR на синтез микроцина или на его экспорт из клеток в культуральнув видкость, ыы анализировали активность микроцина в клетках и в сконцентрированном в 20 раз супернагапте, полученном после центрифугирования клеток. Активность микроцина в втамме с мутацией по гену ospR не сбнарувивалась ни в культуральной акккости, ни в экстрактах из клеток. В то же время в втамме oapR микроцин был идентифицирован и в той. и в другой фракции. Эти данные показывавт, что продукт гена ospR участвует непосредственно в синтезе микроцина R51.

Место микроцина R31 среди микроциноо различных типов.

Обнаруженный нами микроцин, синтезируем исходно в клетках E.coll R51. а также в клетках E.coll TGI и E.coll ULI при клонировании генов. определявших его синтез, в составе ыультикопийных векторов, проявляет свойства, которке не позволяй! отохдестькть его ни с однин кз известных тиг.оя кикроцншш IBaquerо,1904 i.

По нагим дашшы. ыекду етаыиааи, иинтвзирд«щк«и цикроцины С7 и R51, существует перекрестный иммунитет. Этот признак является веский основанием для того, чтобы отнести викроцин R5Î к группе С. Кроме того, рестрикционная карта области, вклвчаацей гинн синуеза ÜccP.äi и иммунитета к нему, сходна с картой генов

- 17 -

инироцина С7, за некоторым исклачением.

Однако, в ходе исследований били выявлены некоторые свойства микроцина R51, которые отличают этот антибиотик от иикроцина С7 (например. спектр антибиотической активности, действие на чувствительные клетки, структура молекул).

Можно предположить, что аикроцина С7 и R51 на самоа деле являптся представителями одной группы, возможно, это микроцина единого происхождения, которые претерпели некоторые изменения в последовательности ДНК. кодирупцей их синтез. в процессе зполвции.

Практическое применение втаммоп, синтезируацих микроцин R51.

Результаты, полученные при изучении микроцина R51, дали нам основание предполагать, что спосо(5ность втамиов к синтезу микроцина может быть использовала для коррекции состава микрофлоры аелудочно - кинечного тракта животных человека.

Предварительные данные, полученные нами, показали, что плазмнда, определявшая синтез микроцина со столь вироким спектром действия, иояет быть использована для конструирования штаммов, применяемых о медицине и ветеринарии для нормализации киаечной микрофлоры.

С использованием плазмидных генов, детерминируицих синтез микроцина 851. был сконструирован втамм E.coll с сильным антагонистическим действием на энтеропатогенные бактерии. На основе этого нтамма разработан препарат "Рокакоя", способствугщий профилактике и лечении заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, вызванных патогешшни энтеробактериякн. При выпаивании- телят, больных колибактернозоя, суспензией "Рокакол* наблпдалось значительное уменьшение смертности заболсввих животных; кроие того, заболевание проткало о легкой форме, для лечения его не требовалось применение иедккамнтов. Во всех случаях использования препарата пеОлвдаяся подозитолышА эффект <габл.З). Препарат "Рокакол" прозе* комиссионная проверку во DIIHU контроля ветеринарии* ярппярятоп к рекомендован для аирокнх испитаний.

Таблица 3.

Результаты испытаний препарата "Ромакол" в нескольких опитных хозяйствах Московской области.

I I I I

Опытное количество I Из них I Смертность I

хозяйство Юбследованннх1________________I___________I

I телят 1здоровых1больных1обцая I X I _________I_____________I________I_______I_______I____I

1. опыт 7 7 А V Л V Л V

контроль 10 1 9 0 0

2. опыт 139 9 0.5

контроль 70 32 42

3. опыт 75 42 33 1 1.3

контроль 35 7 28 6 14,3

4. опыт 10 8 г* 0 0

контроль 10 0 10** 0 ü

5. опыт 10 9 7* 1 е.з

контроль 16 4 12** 4 25

* заболевание средней тявести

** заболевание в острой форме

Не всклочено, что кикроцин Я51 может найти практическое применение и в качестве антибиотика, выделенного в чистом виде.

выводи.

(.Проведен скрининг природных нтаммов, синтезирующих низкоыолекулярные антибиотики - микроцины. Показано, что тифимурицин, синтезируемый клетками Saleonella typhleurlue LT2, и отнесенный к микроцинаа, в действительности является аминокислотой ваянной или ее производным.

2.Выделен втамм Е.coll R51, синтезируоций микроцин R51, -антибиотик внрокого спектра действия. Определены некоторые Физико-химические свойства никроцина. Показано, что микроцин R51 является пептидом или содеряит пептид в составе молекулы.

3.Показано, что синтез микроцина R31 и иммунитет к нему детерминируется малокопийиой конъвгативной плазиидой с мол.массой 25 Ид. Осуществлено картирование и клонирование генов синтеза микроцина и иммунитета на мультикопиЧных и малокопийных векторах.

4.Показано, что на синтез микроцина RS I влияет продукт хромосомного гена o»pR.

З.Зстановлено, что при действии микроцина R51 на чувствительные клетки втамма E.coll В происходит ингибирование синтеза ДНК, РНК и белка.

О,Сконструирован отамм E.coll, продуцент микроцина R51. перспективный для применения в ветеринарии и медицине с цельп профилактики и лечения кинечиых заболеваний сельскохозяйственных яивотных и человека.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Курепина Н.Е., Хнель H.ft. Никроцины: природа и генетическое детерминирование. Нолек.генетика. ыикробиол. вирусолог. 1988. Т.4. С. 3-9.

2. Хмель И.Я.. Липасова В.П.. Курепина Н.г... Рекев Й.Н.. Колот H.H. О природе тифтнурицина - вещества, образуемого Salaonella typhlaurlua LT2, и связи его синтеза с криптяческой плазмидой. Иолекулярная генетика, микробиология и вирусология, 198?. 2. 27-30.

3. Khael I.ft., Llpasowa U.U.. Kureplna H.E., Rekesh П.H.. Kolot K.N. The nature of typhlaurlcln. the antibiotic substance produced by Salaonella typhlaurlua LT2. Htcroblos Letters, 1387. 30. 33-38.

4. Курепина U.E., Хыель И.ft., Липасова В.ft., Зайцев Д.ft. Ннкроцин R51 и плазмида, определявшая его синтез, Иолекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1990, N3. 27-34.

3. Курепина U.E., Хмель И.О., Пкпасова В.ft., Зайцев Д.ft.. Колот H.H., Реке« fl.il., Потаиан Я.ft. 0 способности ккяечкнх бактерий синтезировать низкоколекуяарные антибиотические вещества - микроцинн. D кн. "Иолекулярная биология и генетика плазмид". Тезисы XI Совещания по программе "Плазмида", 1386. 3334.

б. Хмель И.ft.. Курепина U.E., Липасова В.ft., Зайцев Д.ft., Соколова II.Я. Генетические детерминанты синтеза микроциноп -антибиотиков «нрокого спектра действия, продуцируемых яияечиыми бактериями. Тезнсн Uli Всесовзного сиапоз. " Нолекндяршле механизмы генетических процессов", Иосква, 1990. 290-231.

7. Хнель 9.(1., Нетлицкая (1.3., Курепина U.E., Аипасова

В.Й., Зайцев fi.fi. Новый микроцин - антибиотик широкого спектра действия: изучение природы, генетических детерминант синтеза, конструирование втаммов-продуцентов. Тезисы доклада IX Всесоюзного симпозиума по направленному изыскании леарствениых вецеств.Рига, 1991 г., стр.41.

8. Соколова H.ft., Хмель И.ft., Ёегидевич З.А., Евглевская Н.И., Горская Е.II., Курепина Н.Е. Профилактика колибактериоза телят втаммом продуцентом никрсцкна. "Ветеринария" 1931, N 1, 24-25,

3. Курепина 11.t., Йетлицкая Й.З.. Хмель й.н. Картировании плазмидных генов, определявших синтез микроцина R51 и иммунитет к нему. "Генетика" 1991, Н.?. стр.

10. Kurepina (I.E., Ketlltskaja ft.Z., LIpasova U.fl., Basjuk E.I., Zaitsev D.ft., Khael I.ft. Cloning and sapping of plasaid genes responsible for alcrocin R51 synthesis and lasunlty. Kolec. Gen. Genet.,1992, in press.

Подл, в печ. Об.04.92 г. Тираж 100 экз. Заказ » 13968

Централизованная типография ГА "Союзстройматериалов"