Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов

Пантелеева, Алиса Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов"

На правах рукописи

UU30B7G70

Пантелеева Алиса Анатольевна

ГЕНЫ ПРОДУКЦИИ МИКРОЦИНА Escherichia coli S5/98, ИХ ЭКСПРЕССИЯ И ВЛИЯНИЕ НА АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ

ШТАММОВ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Боровск - 2006

003067670

Диссертационная работа выполнена в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова и ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Научный руководитель: доктор биологических наук

Алешин Владимир Вениаминович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Рябых Владимир Павлович

кандидат биологических наук Ботвичко Ирина Васильевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится " 7 " февраля 2007 г., в К) часов на заседании диссертационного совета Д.006.030.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 249013, Калужская область, г. Боровск, п. Институт, ВНИИФБиП с.-х. животных

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан •во*

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.П. Лазаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Явление антагонизма между бактериями, в большинстве случаев, обусловлено синтезом бактериоцинов (Cursino et al., 2002). В отличие от обычных антибиотиков бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, так как активны против бактерий того же вида или родственных видов. Среди бактериоционов кишечных палочек различают колицины и микроцины: они отличаются по химическим свойствам (размеру молекул) и условиям синтеза, которые отражаются на поведении штаммов-продуцентов в микробном сообществе. Интерес к бактериоцинам Escherichia coli связан с важной ролью этой бактерии в качестве компонента микрофлоры кишечника человека и животных. Роль продукции колицинов в обеспечении конкурентоспособности Е. coli в условиях кишечника остается спорной, поскольку они, подавляя рост конкурентов, отрицательно сказываются на жизнеспособности самого продуцента. Экология микробных популяций, в которых присутствуют микроциногенные штаммы, практически не изучена. Весьма актуальным является изучение динамики смешанной микробной популяции, в которой присутствуют продуценты нескольких бактериоцинов и штаммы, различающиеся чувствительностью к ним, так как совмещение в клетке продукции нескольких бактериоцинов с различной регуляцией синтеза, возможно, позволит создать высокоэффективные пробиотические препараты с широким спектром антагонистической активности и увеличить диапазон условий, адекватных их применению.

Препараты на основе кишечной палочки используются в основном для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника. В настоящее время в России известные препараты пробиотиков разработаны на основе штамма Е. coli Ml7, который является производным штамма Е. coli, используемого для получения препарата «Mutaflor» (Altenhoefer et al., 2004; Grozdanov et al., 2004). Однако, в отличие от исходного штамма, коммерческий штамм Е. coli М17 утратил способность к синтезу антибиотических веществ и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы (Шемчук, 1983). Поэтому оправданы мероприятия по разработке новых пробиотических штаммов или восстановлению антагонистической активности уже существующих штаммов, таких как Е. coli М17.

Цель работы. Целью данной работы являлось: - изучить влияние продукции антибиотического вещества природного штамма-антагониста Е. coli S5/98 на конкурентоспособность бактерий в смешанных культурах in vitro и пищеварительном тракте опытных животных;

- проверить возможность совмещения детерминант продукции разных бактериоцинов и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов;

- оценить антагонистическую активность изогенных штаммов - производных пробиотического штамма Е. coli Ml 7, обусловленную сконструированными рекомбинантными плазмидами;

- исследовать динамику производных штамма Е. coli Ml7 в смешанных популяциях in vitro и в природных популяциях;

- разработать стратегию применения пробиотических штаммов на основе Е. coli.

Экспериментальные задачи:

- клонировать гены, ответственные за продукцию микроцина в перспективном пробиотическом штамме Е. coli S5/98 и иммунитет к нему;

- создать рекомбинантные штаммы, одновременно продуцирующие микроцин штамма Е. coli S5/98 и колицин ColEl, или несущие детерминанты устойчивости к нему;

- провести физиологическую характеристику созданных штаммов в чистых культурах, изучить спектр их бактерицидной активности и устойчивости к собственным и чужеродным бактериоцинам;

- провести эксперименты по введению созданных штаммов в кишечник телят, изучить их конкурентоспособность и влияние на состав эндогенной микрофлоры;

- разработать методику количественного определения рекомбинантных штаммов продуцентов бактериоцинов в кишечном содержимом с помощью полимеразной цепной реакции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей работе клонирован новый микроцин типа В.

Обнаружено, что сверхэкспрессия некоторых генов хромосомы Е. coli обеспечивает устойчивость штаммов Е. coli к микроцину типа В.

Впервые на основе родительской плазмиды ColEl получены новые плазмиды pColdelAp, pPAL2, pPAL3, pPAL4, pPAL5, в том числе плазмиды pPAL4 и pPAL5 с совмещенными детерминантами микроцина В5 и колицина El, а также рекомбинантные штаммы -производные пробиотического штамма Е. coli Ml7, содержащие сконструированные плазмиды. Показана возможность совмещения детерминант продукции колицина El и микроцина В5 и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов.

Изучена конкурентная динамика природного микроциногенного штамма и полученных рекомбинантных штаммов в искусственных смешанных популяциях, а также в кишечнике опытных животных. Предложена теоретическая модель динамики микроциногенных популяций в гомогенной среде.

Впервые показано, что штамм Е. coli, одновременно продуцирующий микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника жвачных животных. Введение этого штамма не оказывает заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору. кишечника животных, но повышает общее содержание в кишечнике бактерий группы кишечной палочки, подавляя при этом развитие патогенных представителей этой группы.

Предложены стратегии применения пробиотических штаммов, суть которых состоит: 1) в направленном формировании кишечной микрофлоры с первых часов жизни животного; 2) применении искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией антагонистических веществ или комбинированного пробиотического препарата, сочетающего несколько штаммов с различными свойствами, в том числе антагонистическими.

Апробации работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях "4th Joint INRA-RRI Symposium on gut microbiology" (Клермон Феран, Франция) в июне 2004 года и "Plasmid biology 2004" (Корфу, Греция) в сентябре 2004 года, на III Съезде ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" в июне 2004 года, докладывались на семинарах НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Диссертационная работа была апробирована на открытом заседании отдела эволюционной биохимии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ 1 ноября 2006 года.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем диссертации - 123 страницы, включая 18 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 185 ссылок, в том числе 23 на русском языке.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были антагонистический нетоксичный природный штамм Е. coli S5/98, выделенный проф. Таракановым Б.В. из желудочно-кишечного тракта свиней в лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта ГНУ ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных. В экспериментах по конкурентной динамике микроорганизмов использовались штаммы - продуценты бактериоцинов: Е. coli М17 (р74) и E.coli BZB 2283, продуцирующие микроцины С51 и В17 соответственно, которые были любезно предоставлены нам проф. Хмель И.А., заведующей Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН. Для совмещения в одном штамме генов продукции комплекса бактериоцинов мы использовали рскомбинантную илазмиду pColap, нсмобилизуемуго производную нлазмиды ColEl (Лившиц и др., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клопировапие детерминантов, связанных с продукцией антибиотического вещества природного штамма Е. coli S5/98 и иммунностью к нему

Микробиологические исследования природного штамма-антагониста Е. coli SS/98 показали, что его антибиотическое вещество представляет собой микроцин типа В. Кроме того, доказано отсутствие экскреции Е. coli S5/98 каких-либо других антибиотических факторов.

Исследование устойчивости Е. coli S5/98 к антибиотикам (хлорамфеникол - 20 мкг/мл, ампициллин - 50 мкг/мл, канамицин - 20 мкг/мл, стрептомицин - 40 мкг/мл, тетрациклин - 10 мкг/мл) показало отсутствие в этом штамме соответствующих детерминантов устойчивости к антибиотикам.

Выделение ДНК из клеток природного изолята Е. coli S5/98 методом щелочного лизиса с модификациями не обнаружило плазмид в этом штамме. Таким образом, синтез микроцина в клетках штамма Е, coli S5/98 обусловлен хромосомой или гигантской плазмидой размером свыше 100 т.н.п. Однако, известно, что синтез описанных микроцинов типа В и иммунитет к этим микроцинам связан с генами, находящимися в составе плазмид (Хмель и др., 1999; Destoumieux-Garzon et al., 2002).

Клонирование микроциновых генов и генов иммунности к микроцину осуществляли по методике, основанной на получении банка генов на векторах мини-Mu, соединенных с плазмидным репликоном pMBl (Groisman, Casadaban, 1986). Для этого были лизогенизированы два штамма: Е. coli S5/98 и лабораторный штамм Е. coli НВ101. На основе лизогенного штамма Е. coli S5::Muck с помощью фаголизата штамма F.. coli МС1040 (Mu d5005) был получен двойной лизоген Е. coli S5::MueW (Mud5005). Полученная после термоиндукции двойного лизогена фаговая библиотека была скринирована трансдукцией в штамм Е. coli HB101::Muc/i с последующей селекцией на чашках, содержащих микроцин штамма Е. coli S5/98. Среди трансдуктантов HB101;:Mucts (Mud5005), устойчивых к микроцину штамма Е. coli S5/98, был отобран один клон Е. coli HB101::Mucts(Mud5005-13), который кроме устойчивости к исследуемому микроцину также подавлял рост реципиентного штамма Е. coli HB101::Muc(i в опытах по отсроченному антагонизму.

Рестриктный анализ фазмиды Mud5005-13 с использованием эндонуклеаз рестрикции HindlU, Крп\, Pstl, BglW, £coRI, Mlul, Seal, Xhol показал, что размер клонированного фрагмента в составе Mud5005-13 превышает 30 т. п. н., и структура ДНК части клонированной последовательности похожа на структуру генетических детерминант микроцина В17.

Фрагмент фазмиды Mud5005-13 размером »860 н.п,, полученный в результате ее гидролиза рестриктазой Mndlll, мы клонировали в составе плазмиды pUC19 и определили его нуклеотидную последовательность с использованием универсальных плазмидных праймеров.

Мы обнаружили гомологию клонированных последовательностей с генами тсЬВ и тсЬС, вовлеченных в продукцию микроцина D17 (рис. 1).

pRlCO ...gggaagt-cagaatgatgcctgcggcatcggcqctgaccgtacggtcaaacca... i I I I II I I I I I I I I I II III I И I I III II II II II II I IIIIII1- |

S5/98 ...gggaagtgcagaatgafcacctgcggcatcagcactcacagtgcgntcaaacca...

pRIOD ...gtaagtgacaggccgtgca...

IIIIIIII I I I I I I I I I I I-S5/33 ...gtaagtgacaggccgtgca...

Hmdlll Kpn\ H/ndlll

Kpn I

EcoRI

вектор' !»

, Ч'4'S

ш.

вектор

pMccB17 ...ddLglcoLgggCcidacLlacLtüagttactgiiaaaäataccaaatgacactaccagcattgg...

...I I I I I I I I I II I II I I I I I I II I I II I I I I I I I III I II I I I I III II I II I II I III I I II... S5/98 ...aatgtcctgggcaaacttacttcagttactgaaaaaataccaaatgacactaccagcattgg...

pMccB17 ...aggcactggaacctgttgctacatgtaatactcagtcactctaccgaa ...I III II III III III III III III I III I U III II U W U U 11 H S5/98 ...aggcactggaacctgttgotacatgtaatactcagtcactctaccgaa

pMccB17 gcctgtccggtggggattcggaacgtcttggtaaaccccätt...

I I I II! II I III III I I I I I I III I I I I I I I I I I I I I I III I...

S5/98 gcctgtccggtggggattcggaacgtcttggtaaaccccatt...

Рис. 1. Структура фазмиды Mud5005-13

Кроме того, определены пуклеотидные последовательности, фланкирующие микроциновые гепы в составе фазмиды Mud5005-13. Для этого мы использовали праймеры к векторной части фазмиды Mud5005. При поиске с помощью программы BLAST, обнаружено сходство с генами плазмид энтеробактерий из группы IncFII, которое было наибольшим с открытыми рамками с неидентифицированной функцией yciB и yciA плазмиды R100 (документ в GenBank АР000342). В плазмиде R100 эти гены соседствуют, а в исследуемом штамме Е. coli S5/98 они разделены ипсерцией, содержащей гены синтеза микроцина и иммунности к нему (рис. 1).

Для минимизации клонированной на Mud5005-13 последовательности микроциновых генов, по сайту EcoRl в вектор pBluescript SK был клонирован фрагмент фазмиды размером около 9 т. п. и., который придавал рекомбинантным бактериям способность продуцировать микроцин типа В, названный нами микроцин В5. Плазмида названа pPALl (табл. 2).

2. Анализ структуры клонированного фрагмента

С помощью универсальных плазмидных праймеров была определена первичная структура флангов фрагмента £соМ плазмиды рРАЫ. Их проверка с помощью программы

BLAST относительно базы nr показала, что с одной стороны клонированный фрагмент имеет гомологию с последовательностью единственного документа в GenBank Х07875, представляющей собой фрагмент природной плазмиды рМссВ 17, несущей гены иммунности к микроцину В17. Определенный нами фрагмент перекрывается с генами mcbF и mcbG последовательности рМссВ 17. В этой области у прочитанной нами последовательности имеется две особенности. Первая - наличие одного дополнительного нуклеотида по сравнению с последовательностью Х07875, приходящегося на кодирующую рамку mcbF. Этот нуклеотид обеспечивает предсказываемый сдвиг рамки относительно секвенированного ранее гена mcbF в области, близкой к 3' концу гена. В результате 18 С-коицевых остатков белка McbF, предсказанного из последовательности Х07875, расходятся с предсказанными из определенной нами последовательности. Тогда как в последовательности Х07875 гены mcbF и mcbG перекрываются, в нашей последовательности рамка mcbF короче на четыре триплета и гены не перекрываются (рис. 2), а транслируются в одной рамке. Принимая во внимание гомологичность нуклеотидных последовательностей микроцинов типа В, мы допускаем, что в документе Х07875 содержится незначительная ошибка. Есть и другие мнения по поводу расхождения в последовательности гена иммунного белка mcbF микроцинов В5 и В17. В настоящее время практически ничего неизвестно об эволюции микроцинов. К микроцинам можно применить механизм эволюции, предложенный для относительно редких нуклеазных колицинов, модификация которых начинается с мутации в гене иммунности, благодаря которой клон с мутантным геном устойчив к собственному колицину, колиципу исходного варианта (с интактным геном иммунности) и к некоторым другим похожим колицинам (Riley, Wertz, 2002). Возможно, последние четыре триплета в гене mcbF ж влияют на иммунную функцию McbF.

McbF INRySDMSDFIQSNNETTQKRHLLKKLWEQETDTWI*

Frame 2 INRXSDMSDFIQSNNETTPEKAFIKEVMGTGD * HMD IIEKRITKRHLSES...

McbG MDIIEKRITKRHLSES...

Рис. 2. Фрагмент транслированной в одной из рамок (Frame 2) определенной нами последовательности в сравнении с предсказанными аминокислотами McbF (С-конец) и McbG (N-конец). * - стоп-кодон

Вторая, более существенная особенность субклонированной последовательности из фазмиды Mud5005-13 заключается в том, что в ней ген mcbG не полный: сайт клонирования EcoRI привел к удалению из последовательности 119 триплетов.

3, Субклоиирование гена иммунности к микроцину BS

Используя последовательность генов иммуниости к типовому микроцину В17 из документа GenBank Х07875, мы сконструировали праймеры mcbGd - 5'-atcacaaaacgacacctca-3' и

mcbGr + линкер ВатШ - 5'-cgcgaattcggatccgtctactcacctcatcccc-3' и амплифицировали с фазмиды Mud5005-13 недостающий фрагмент гена mcbG. Для клонирования мы ввели в один из амплификационных праймеров сайт рестриктазы ВатШ, которого не имеется на клонированном фрагменте ДНК, а для интеграции амплифицированного фрагмента в состав частичной последовательности гена mcbG воспользовались уникальным сайтом Nrul, расположенным вблизи сайта клонирования jEcoRI. Для этого плазмида pPALl и амплнфикат с полной последовательностью гена mcbG были обработаны эндонуклеазами рестрикции Nru\ и ВатШ. Сайт ВатШ является уникальным на pPALl и находится в составе полилинкера. Сайт ВатШ, который, согласно документу GenBank М24253 находится в регуляторной области микроцинового промотора рМссВ17, в нуклеотидиой последовательности В5 отсутствует. Лигирование полученных фрагментов восстановило полную последовательность генов, связанных с иммунностью к микроцину типа В. Плазмида с полной последовательностью генов, связанных с продукцией микроцина В5 и иммунностью к нему получила название pPAL2 (табл. 2).

4. Устойчивость к микроцину В5

Путем скрининга фаговой библиотеки Е. coli S5/98 на векторе Mud5005 были отобраны 15 микроцинустойчивых, но не производящих микроцин клонов, из которых были выделены фазмиды. Проведен рестриктный анализ выделенных фазмид. Все они имеют разный размер и разную рестриктную карту. Трансформация фазмидных ДНК в микроцинчувствительпые штаммы, лизогенные по Muc/i, показала, что устойчивость к микроцину обусловлена именно фазмидами. Фазмиды из пяти клонов были секвенировны с двух концевых фазмидных праймеров MudR и MudL. Оказалось, что пять встроенных фрагментов являются разными участками хромосомы Е. coli К.-12, размерами от 9 до 22 т.п.н., последовательности двух из них перекрываются между собой (рис. 3). Судя по результатам рестриктного анализа, действительный размер клонированных последовательностей соответствует размерам соответствующих фрагментов хромосомы Е. coli К-12 согласно документу GenBank NC 000913.

Мы провели анализ генетических карт клонированных фрагментов с целью указания генов, повышенная экспрессия которых, предположительно, причастна к устойчивости рскомбинантных бактерий к микроцину типа В.

Неспецифическая устойчивость отобранных клонов к микроцину типа В обеспечивается по-видимому увеличением копий некоторых генов хромосомы Е. coli, функции которых можно разделить на три группы: 1) деградация микроцина (продукты генов yhiP и рг1С)\ 2) секреция микроцина (белки ЕшгА и TolC, продукты генов yjcR и yjcP соответственно); 3) поддержание функционирования репликативного аппарата (priВ, гесА).

Фазмцца №3 (alaS-srID Ecolil: вставка 8.5 т.п.н, Фазмида №6 (csrA-ascB E.coli): вставка 22 т.п.н.

Mud5005 csrA alaS recX recA ygaD mltB srlA srIE srIB srtD gutM ascF ascB Mud5005

Фазмзда №S (nrfC-alsE E.co!i): вставка 14 т.п.н.

Mud5005 nrfC nrfD nrfE nrtF nrfG gltP yjcO fdhF yjcP yjcQ yjcR yjcS alsK alsE Mud5005

ввжшсшшоао&в

Фазмида №10 (upsA-yhiF E-Coli); вставка 14 т л и

Mud5005 uspA yhiP prfC yhiR gor arsR ai-sB arsC yhiS sip yhiF Mud5005

ВЯЯЧ^^^

Фазмцда №11 (yjfO-yjfZ E.col¡); вставка 10.5т.п.н.

MudSOOS yjfO vifp u!aR ulaG ulaA uíaS ulaC ulaD ulaE ulaF yjfY tpsF pnB rpsR yjfZ Mud5005

■¡¡¡жтахюоосхо^^

И - прочитанные нуклеотидные последовательности фазмид;

п - гены хромосомы Е. coli, предположительно обеспечивающие устойчивость к микроцину типа В.

Рис. 3. Структура фазмид Mud5005 с детерминантами устойчивости к микроцину типа В

Кроме того, обнаружено, что использование в качестве чувствительной культуры к микроцину В5 штамма Е. coli DH5a, мутантного по субъединице А ДНК-гиразы, приводит к появлению устойчивых к этому микроцину бактерий (рис; 4). Известно, что мишенью для микроцинов типа В является С-концевая область субъединицы В ДНК-гиразы. (Vizan ei al., 1991; Хмель, 1999). Показано, что точечные мутации в В субъединице ДНК-гиразы, полученные сайт-специфическим мутагенезом, сообщают устойчивость к микроцину В17 (del Castillo et al., 2001). Возможно, мутации в гене субъединицы А ДНК-гиразы уменьшают чувствительность бактерий к микроцину типа В.

Рис. 4. Фотография зоны подавления роста, образованной микроциногенным штаммом Е. coli DH5a(pPAL2) на среде Vi ТА. Чувствительная культура в верхнем слое -Е. coli DH5a. Белые «точки» вокруг Е. coli DH5a(pPAL2) внутри зоны подавления роста - мутантные клетки, производные штамма Е. coli DH5a, устойчивые к микроцину В5

5. Динамика штамма Е. coli S5/98 в смешанных культурах

Для селекции штамма Е. coli S5/98 в смешанных культурах мы маркировали его детерминантами устойчивости к стрептомицину. Штамм Е. coli S5 Sm был получен путем

трансдукции в Е. coli S5/98 гена rpsLIQ из лабораторного штамма Е. coli НВ101 с использованием PI фаголизатов (Миллер, 1976).

В качестве индикаторных культур использовали штаммы-продуценты микроцинов С и В и колицина El: £. coli М17(р74) - продуцент микроцина С51; Е. coli BZB 2283 - продуцент микроцина В17; Е. coli TG 1 (pColap) - продуцент колицина Е1.

Для постановки опыта по динамике штамма Е. coli S5 Sm в смешанных культурах мы провели эксперимент по перекрестной устойчивости Е. coli S5 Sm и индикаторных штаммов (табл. 1). Продукцию микроцина оценивали на среде М9, а колицина- на среде 2YT.

Табл. 1.

Чувствительность штаммов-продуцентов к бактериоцинам, синтезируемым различными __культурами

Индикаторные штаммы Штаммы-продуценты бактериоцинов

E. coii S5 Sm E. coli BZB E. coli Ml7 E. coli TGI

2283 (p74) (pColap)

Е. coli S5 Sm — — +15 мм +5 мм

Е. coli BZB 2283 — — +28 мм +5 мм

Е. coli Ml 7(p74) +18 мм +20 мм — +3 мм

E. coli TGI (pColap) +10 мм +8 мм +20 мм —

Смешанные культуры составляли с учетом скорости роста штаммов. Кривые роста штаммов: Е. coli S5 Sm, Е. coli М17(р74), Е. coli BZB 2283, Е. coli TGl(pColap) на богатой и минимальной средах представлены на рис. 5.

0 2 4 6 8 10 12 М 1 2 3 4 3 6

Продолжительность культивирования, час Продолжительность культивирования, час

- - Кривая роста E.coli TGI(pColap) —&—Кривая роста E.coli М17(р74)

— в — Кривая роста E.coli BZB 2283 — О- Кривая роста E.coli S5 Sm

А Б

Рис. 5. Кривые роста штаммов Е, coli'. М17(р74), BZB 2283, S5 Sm и TGl(pColap). А на минимальной среде (М9); Б на богатой среде (2YT)

Отдельно взятая смешанная культура была составлена из двух штаммов: Е. coli S5 Sm и одного из индикаторных штаммов в соотношении 1:2 соответственно. Эксперименты проводили на богатой (2YT) и минимальной ( М9) средах. Всего было исследовано три варианта смешанных культур:

Е. coli S5 Sm : Е. coli TGl(pColap);

Е. coli S5 Sm : E. coli M17(p74);

E. coli S5 Sm : E. coli BZB 2283.

На срсде 2YT смешанные культуры тестировали через 3, 8, 26, 38 и 54 часа с начала культивирования. Пересев культур в свежие среды производился одни раз через 26 часов после начала опыта. При этом в каждую пробирку с 5 мл свежей среды 2YT вносили по 40 мкл смешанных культур.

На среде М9 смешанные культуры тестировали через 24, 48, 72 и 96 часов с начала культивирования. Пересев культур в свежие среды не производили.

Количество клеток штамма Е. coli S5 Sm определяли путем перекалывания колоний, выросших на среде без антибиотика, на селективную среду, содержащую стрептомицин.

В опыте по перекрестной устойчивости Е. coli S5 Sm и индикаторных штаммов было показано, что Е. coli S5 Sm чувствителен к некоторым из них. Однако, в смешанных культурах за счет микроциногении и высокой скорости роста Е. coli S5 Sm быстрее других выходит в стационарную фазу роста, во время которой и происходит активный синтез микроцина, оказывающего бактерицидное действие на индикаторные культуры (рис. 6).

0 10 20 30 40 50 60 Продолжительность культивирования, час

О 20 40 60 80 100 120 Продолжительность культивирования, час

—©— Выживаемость штамма Е. coli S5 Sm в смешанной культуре Е. coli S5 Sm/ E.coliTG(pCoIap) —в—Выживаемость штамма Е. coli S5Sm в смешанной культуре Е coli S5 Sm/E coli MI7(p74) —t* —Выживаемость штамма Е. coli S5 SmB смешанной культуре Е. coli S5 Sm/E. cotiBZB2283

Рис. 6. Жизнеспособность штамма Е. coli S5 Sm в смешанных культурах, %. А - на богатой среде (2YT); Б - на минимальной среде (М9).

Интересна конкурентная динамика штаммов в условиях богатой среды. Сразу же после инокуляции штаммов происходит стремительное увеличение численности клеток штамма Е. coli S5 Sm. За первые три часа культивирования относительное содержание клеток штамма Е. coli S5 Sm во всех вариантах смешанных культур увеличивается от исходного значения 33% до 70% и больше. При этом изменение в соотношении каждой пары конкурирующих штаммов обусловлено только лишь преимуществом в скорости роста Е. coli S5 Sm. При замедлении роста смешанных культур это соотношение начинает меняться в обратную сторону для всех трех пар штаммов. По-видимому, на этом этапе проявляется антагонистическая активность штаммов, обусловленная синтезом бактериоцинов. Синтез бактериоцинов индуцируется увеличением плотности культуры, начиная с конца логарифмической фазы роста. Постепенное уменьшение относительного содержания клеток штамма Е. coli S5 Sm продолжалось до тех пор, пока смешанные культуры не были пересеяны в свежую среду. Известно, что для активности колицина необходима высокая концентрация колициновых молекул в среде от 140 молекул до 2400 молекул колицина El на клетку и выше в зависимости от эффективности связывания колициновых молекул рецепторами чувствительных клеток. Кроме того, одна летальная единица колицина El составляет в среднем 100 молекул, связанных с бактериальной клеткой (Farid-Sabet, 1982). Известно также, что синтез колицина El характеризуется низкой продукцией колициновых молекул из расчета на одну клетку (Gordon, Riley, 1999). Резкое снижение концентрации колицина El штамма Е. colt TGl(pColap), из-за пересева смешанной культуры, а также высокая скорость роста штамма Е. coli S5 Sm изменяют картину конкуренции между этими двумя штаммами. Увеличение соотношения штаммов Е. coli TGl(pColap) и Е. coli S5 Sm в пользу последнего происходит до тех пор, пока в среде культивирования не накопится достаточное количество колициновых молекул для бактерицидного действия колицина El штамма Е. coli TGl(pColap). Кроме того, богатая среда способствует накоплению колицина.

Для бактерицидного действия микроцина достаточно небольшой его концентрации. Минимальная ингибирующая концентрация микроцина типа С составляет меньше 0,5 мг/л (Baquero, Moreno, 1984). Видимо поэтому пересев смешанной культуры штаммов Е. coli М17(р74) и Е. coli S5 Sm в свежие среды никак не отражается на ее динамике. Штамм Е. coli М17(р74) подавляет штамм Е. coli S5 Sm до полного исчезновения последнего.

Интересна также динамика популяции, состоящей из двух штаммов Е. coli S5 Sm и Е. coli BZB 2283 с одинаковым типом бактериоцинов. При описанной выше перекрестной устойчивости этих штаммов друг к другу наблюдается преобладание штамма Е. coli S5 Sm над штаммом Е. coli BZB 2283. Совершенно очевидно, что антагонистическая активность не имеет отношения к конкурентной динамике в этой искусственной популяции и соотношение штаммов

с одним типом бактериоцина зависит от скорости роста конкурирующих штаммов, а также от внутриклеточных характеристик, таких как уровень экспрессии плазмидных генов, регуляция числа копий в клетке, стабильность репликонов и других.

В проведенном эксперименте остается неясным, есть ли вклад бактериоциногении в динамику смешанных популяций на минимальной среде, или же конкурентоспособность штамма Е. coli S5 Sra обусловлена только лишь высокой скоростью роста. Как видно из рис. 6, на бедной среде штамм Е. coli S5 Sm доминирует во всех опытных вариантах.

Анализируя результаты эксперимента по изучению поведения природного изолята Е. coli S5/98 в смешанных культурах, можно сказать, что, итог конкуренции штаммов обусловлен не только бактериоцинами, так как в этом эксперименте использовались гетерогенные культуры, отличающиеся многими свойствами, например, скоростью роста. Известно, что различные вещества, экскретируемые клетками, выполняют коммуникативные функции. Одни и те же экзометаболиты по-разному действуют на разные штаммы: индуцируют рост одного штамма, поддерживают культуру клеток этого штамма в условиях голодания, но при этом ингибируют рост другого штамма (Vakhitov, Petrov, 2006).

Таким образом, изучение антагонистической активности штаммов, обусловленной бактериоцинами, необходимо проводить в изогенных штаммах с идентичным спектром экзометаболитов, и одинаковыми векторными системами, экспрессирующими гены антибиотиков.

В связи с этим появилась необходимость клонировать нуклеотидную последовательность, отвечающую за синтез микроципа штамма Е. coli S5/98.

6.1. Конструирование векторов

Для совмещения в одном штамме генов продукции микроциоггои и колициноп мы воспользовались плазмидой pColap, полученной ранее ¡«мобилизуемой производной плазмиды ColEl (Лившиц и др., 2000). Однако в ходе наших экспериментов была обнаружена плохая выживаемость штамма Е. coli S 5/98 (pColap). Мы предполагаем, что это связано с усиленной индукцией колициновых генов в этом штамме, что ведет к гибели большого числа клеток. Для проверки этого предположения и устранения негативных последствий мы с помощью рестриктаз Psll и Stul удалили ген cea, а вместе с ним и другие гены, необязательные для репликации плазмиды pColap. Полученная плазмида названа pColdelAp (рис. 7).

Затем в сайт Nrul плазмиды pColdelAp, локализованный в последовательности гена kil, встроили ген устойчивости к канамицину, который предварительно был вырезан из плазмиды pUC4K с помощью рестриктазы Hindi. Полученная плазмида pPAL3 обеспечивает реципиентным клеткам иммунность к колицину El, но не обеспечивает продукции колицина, однако и не приводит к гибели клеток, связанной с такой продукцией.

Таким образом, мы имеем две векторные плазмиды, одна из которых обеспечивает продукцию колицина Е1 (рСо!ар), а другая - только иммунность к нему (рРАЪЗ).

rej>

Рис. 7. Конструирование плазмид pColdelAp и рРАЬЗ

6.2. Конструирование плазмид с генами бактерпоципов двух типов

Для манипуляций с клонированными генами микроцина В5 в плазмиду pPAL2 был введен второй сайт ВатШ. Для этого в уникальный сайт Xhöl плазмиды pPAL2 после тупления выступающих концов был встроен линкер ВатШ. Фрагмент, содержащий полную последовательность генов микроцинового оперона, была вырезан с помощью рестриктазы ßowHI и встроен в векторы pColap и рРАЬЗ. Для этого в уникальный сайт Mul векторов pColap и pPAL3 после тупления концов был введен синтетический линкер ВатШ (рис. 8).

Таким образом, были получены рекомбинантные плазмиды рРАЬ4 и рРАЬ5, несущие детерминанты антибиотических веществ двух типов: микроцина и колицина.

Рис. 8. Конструирование плазмид рРАЬ4 и рРАЬ5

Свойства рекомбинантных плазмид

Плазмида Генетические признаки Свойства

pColap cea-kil(ColEl), imm(ColEl), exc, Ap' продукция колицина Е1, устойчивость к колицину Е1 и ампициллину

pColdelAp kil(ColEl), imm(ColEl), АрГ устойчивость к колицину Е1 и ампициллину

pPALl mcbABCDEF, Apr продукция микроцина В5, частичная устойчивость к микроцину В5, устойчивость к ампициллину

pPAL2 mcbABCDEFG, Apr продукция микроцина В5, устойчивость к микроцину В5 и ампициллину

pPAL3 imm(colEl), Km', Ap' устойчивость к колицину Е1, канамицину и ампициллину

pPAL4 cca-kil(ColEl), imm(ColEl), exc, Ap', mcbABCDEFG продукция колицина Е1, устойчивость к колицину Е1, продукция микроцина В5, устойчивость к микроцину В5 и ампициллину

pPAL5 imm(ColEl), Km', Ap', mcbABCDEFG устойчивость к колицину Е1, продукция микроцина В5, устойчивость к микроцину В5, ампициллину и канамицину

7. Исследование поведения рекомбинантных штаммов кишечной палочки - продуцентов комплекса антибиотических факторов in vitro

Для изучения свойств полученных векторов мы трансформировали их в пробиотический штамм Е. coli М17. Тем самым, была получена коллекция четырех изогенных штаммов: Е. coli M17(pColap); Е. coli M17(pPAL3); Е. coli M17(pPAL4); Е. coli M17(pPAL5). Штаммы E. coli M17(pPAL4) и E. coli M17(pPAL5) несут генетические детерминанты сразу двух типов бактериоцинов: микроцина В5 и колицина El, совмещенных на одном репликоне.

Предварительно была проверена перекрестная устойчивость полученных штаммов на разных средах культивирования и сегрегационная стабильность плазмид.

Из полученных данных (табл. 3) следует, что все рекомбинаитные штаммы на основе Е. coli Ml7 ингибируют рост своего бесплазмидного реципиента. Они также угнетают рост индикаторной культуры Е. coli DH5a. По результатам опыта можно сказать, что в штаммах-продуцентах двух антибиотических факторов, экспрессия колицина не влияет на продукцию микроцина. Кроме того, совмещение продукции микроцина и колицина в одном штамме позволяет получать стабильно микроциповые зоны подавления роста индикаторных культур на богатой среде (ТА).

Перекрестная устойчивость штаммов Е. coli Ml7, Е. coli M17(pColap); _ Е. coli M17(pPAL4); Е. coli M17(pPAL5)

Индикаторные штаммы Штаммы-продуценты бактериоцинов

Е. coli M17(pPAL4) Е. coli MI7(pPAL5) Е. coli М17 Е. coli M17(pColap)

Е. coli DH5oc (Ул ТА) +16 мм (ТА)+12 мм (Vt ТА) +16 мм — (1/4 ТА) — (ТА) +3 мм

Е. coli M17(pPAL4) (1Л ТА) — (ТА) — (% ТА) — (ТА) — — СТА) —

Е. coli Ml7(pPAL5) (% ТА) — (ТА)- (% ТА) — (ТА)- — (ТА) —

E. coli МП (14 ТА) +11 мм (X ТА) +11 мм — (1/4 ТА) — (ТА) +2 мм

E. coli M17(pColap) ('А ТА) +11 мм ('Л ТА) +11 мм — (ТА)-

В скобках указана среда, на которой появляется указанная зона подавления роста; « + » -подавление роста; « — » - отсутствие подавления роста.

Путем пересева клеток полученных штаммов в неселективных условиях в течение 7 суток на богатой (2YT) и бедной (М9) жидких средах, установлена высокая стабильность полученных конструкций, которая обеспечивается репликоном, а также антибиотической селекцией против клеток, утративших плазмиду с генами иммунности.

Также мы трансформировали рекомбинантные плазмиды pColap, pPAL2, pPAL3, pPAL4, pPAL5 в штамм E. coli DH5a. На рис. 9 видны зоны подавления роста, образованные штаммами Е. coli DH5a(pPAL4), Е. coli DH5a(pPAL5), Е. coli DH5a(pColap) на среде 2YT. Индикаторная культура в верхнем слое - штамм Е. coli DH5a. Штамм-продуцент микроцина В5 Е. coli DH5a(pPAL2) не образует зону подавления роста индикаторной культуры на богатой среде 2YT. На рис. 9 видно, что совмещение детерминантов продукции и иммунности микроцина В5 и колицина El в штаммах Е. coli DH5a(pPAL4) и Е. coli DH5a(pPAL4) не препятствует продукции микроцина В5 на богатой среде. О продукции колицина El штаммом Е. coli DH5a(pPAL4) косвенно свидетельствует отсутствие резистентных мутантов в зоне подавления роста индикаторной культуры, наблюдавшихся в случае микроцину В5 как единственного антагонистического фактора (ср. рис. 4 и 9). Зоны подавления роста у штаммов с совмещенной продукцией микроцина В5 и колицина El выглядят как микроцшювые. Они широкие (11-30 мм), имеют размытую границу, по, в отличие от последних, характеризуются отсутствием мутантных бактерий. Колициновые зоны с ровным четким краем и радиусом 2-5 мм.

Рис. 9. Фотографии чашки с зонами подавления роста, образованные штаммами Е. coli DH5a(pColap), Е coli DH5a(pPAL4) и Е. coli DH5ct(pPAL4) (комментарии в тексте)

7.1. Динамика популяций штаммов производных Е. coli М17 в смешанных культурах

В Смешанные культуры было взято одинаковое коли честно клеток штаммов Е. coli Ml 7, i Е. coli M)7(pPAL4) и Е. coli M17(pPAL5). В каждый опытный вариант на 5 мл среды брали но 20 мкл ночных культур. Эксперимент проводили на богатой (2YT) и минимальной (М9) средах. Состав смешанных культур определяли через 4 (2YT) и б (М9) часов и па 1, 2, 3, 6, 10 сутки от начала культивирования. Пересев культур в свежие среды производили один раз на 3 сутки после начала опыта. Количество клеток каждого штамма определяли путем перекалывания колоний, выросших на среде без антибиотика на селективную среду, содержащую маркерный антибиотик ампициллин. При этом клетки Е. coli, не выросшие на селективной среде, считались исходным бесилазыидным штаммом Е. coli М17.

На рис, 10А видно, что исходный штамм Е. coli MI7 не обнаруживается в смешанной KjJib'type уже через сутки кум>ти»нрования, Низкая жюненюсобяость £. coli MIT обусловлена его чувствительностью к колшшну El штамма Я coli M17(pPAL4) и микроцииу BS штаммов Е. coli Ml7(pPAL4) и Е. coli M17(pPAL5). Штамм Е. coli М17(pPAL5) не производит ко линии, но обладает устойчивостью к нему. Этим, по-видимому, объясняется равное соотношение штаммов, содержащих рекомбипаптиые илазмиды, в первые сутки культивирования, Затем это соотношение Изменяется в сторону доминирования штамма Е coli М17(рРА1.5) над Е. coli М17(рРА1.4). Известно, что синтез кояицина сопряжен с лизисом клеток продуцентов. Таким образом, в культуре постоянно происходит гибель некоторого количества клеток Е coli М 17(рРД1_4), связанная с продукцией колицина, аналогичной убыли клеток Щ coli М17(pPAL5) не предполагается. Количество кол и ни па, образующегося в популяции продуцента, определяется количеством этого бактерисжина, которое необходимо для подавления роста или исчезновения штаммов конкурентов. Кроме того, в штамме Е. coli M17(pPAL4) ми к родии 135 помимо своей высокой бактерицидной активности, запуская SOS-ответ клетки (Herrero,

Мошю, 1986) выступает в роли индуктора синтеза кояицина 0J. Известно, что синтез колицияа El индуцируется условиями или факторами, запускающими SOS-ответ клетки, который в свою очередь и »активирует репрессор колицинового онерона белок Lex Л. В штамме Е coli Ml7(pPAL5) отсутствует продукция колицина, запускающего механизм преждевременной гибели клеток. Устойчивость к колицину штамма Е. coli Ml7(pPAL5) и богатая среда обеспечивают активный синтез колицина в штамме Е. coli M17(pPAL4), усиливая лизис клеток последнего.

А Б

Рис. 10. Диаграммы, отражающие выживаемость и соотношение клеток штаммов Е. coli Ml 1, Е. coli M17{pPAL4); Е. coi i M! 7(pPAL5) в смешанной культуре на богатой среде (2YT) (А) и на минимальной среде М9 (В)

На бедной среде (рис. 10Б), также как и на богатой, происходит полной исчезновение исходного штамма Е. coli Ml7 в смешанной культуре в течение первых 24 часов культивирования. Однако соотношение двух других штаммои Е. coli M17(pPAL5) и F.. coli MI7(pPAL4) со временем изменяется в пользу колициногенного. Причины этого не ясны. Обычно, Иммунный белок к колицину El в клетке синтезируется конститутивно, и его количества достаточно для зашиты клеток от эндогенного и экзогенного колицнна. Однако «веются сообщении, что экспрессия оперона cea - kil регулируется уровнем транскрипции гена imm, чья последовательность перекрывается с генами cea - kil, но транскрипция происходит в противоположном направлении (Zhang et al., 1988; Bishop el al.. 1985). Возможно, имеет место обратный эффект . В отсутствии олерона cea- kil иа плаз мидах, трансляция imm мРНК частично подавлена контрфанскриптом, образующимся с промотор! генов ceu-kil, сохранившегося в составе pPAL5. Однако, скорее всего, в неблагоприятной ДЛЯ синтеза колицнна бедной

культуралыюй среде кодициногения не играет роли в конкуренции между штаммами. Это предположение основано на результатах эксперимента по перекрестной устойчивости штаммов на среде М9 (табл. 3).

Применяя к этому эксперименту существующие теоретические модели динамики смешанной бактериальной культуры, в которой взаимодействуют штамм-продуцент колицина и чувствительный к этому колицину штамм, можно сказать, что штамм Е. coli Ml7 обладает преимуществом перед штаммами Е. coli M17(pPAL5) и Е. coli M17(pPAL4), так как не расходует ресурсы на синтез бактериоцинов и обеспечение иммунности к ним. Антагонистическая активность штаммов Е. coli M17(pPAL5) и Е. coli M17(pPAL4) в отношении чувствительной культуры штамма Е. coli М17 при замедлении роста популяции говорит о том, что она обусловлена вторичными метаболитами. Бактериоциновая природа этой активности подтверждается тем, что 24-х часовая смешанная культура почти не содержит штамма Е. coli М17, тогда как изогенные штаммы продуценты микроцина В5 и колицина El в присутствуют в равном соотношении. Учитывая различающиеся стратегии синтеза этих двух бактериоцинов, можно ожидать, что подавление чувствительной культуры на богатой среде в первую очередь обусловлено бактерицидным действием колицина El, а на бедной микроциком В5. Однако, вполне вероятно, что в условиях неструктурированной среды и на богатой и на бедной средах чувствительный штамм Е. coli М17 погибает вследствие «кинетики одного удара» микроцина В5. Известно, что в отличие от колицина El, для активности микроцина не требуется большого количества его молекул, и продукция микроцина В5 не сопряжена с гибелью клеток-продуцентов. На рис. 10А видно, что в 24-х часовой смешанной культуре па богатой среде, способствующей синтезу колицина El, после антагонистической активности в отношении чувствительной культуры Е. coli Ml 7 продуцент колицина штамм Е. coli M17(pPAL4) и устойчивый к колицину штамм Е. coli M17(pPAL5) присутствуют в равных соотношениях. Это косвенно указывает на то, что инструментом антагонистической активности в данном случае был бактериоцин, синтез которого не сопряжен с лизисом клеток-продуцентов, а именно микроцин В5. Кроме того, результаты эксперимента по перекрестной устойчивости изогенных рекомбинантных штаммов Е. coli Ml7 (табл. 3) показали, что совмещение продукции микроцина В5 и колицина El в штамме Е. coli M17(pPAL4) позволило получить стабильные микроциновые зоны подавления роста индикаторных культур на богатой среде (ТА).

Таким образом, в связи с утратой пробиотическим штаммом Е. coli М17 антагонистических свойств мы предлагаем восстановить его конкурентоспособность с помощью рекомбинантных плазмид, детерминирующих продукцию двух бактериоцинов (микроцина В5 и колицин El), а также устойчивость к ним.

Полученные плазмиды восстанавливают утраченные антагонистические свойства штамма Е. coli Ml7. Это позволит создать пробиотические препараты с повышенной антагонистической активностью и эффективные на фоне приема антибиотиков.

Предполагается, что искусственно сконструированные штаммы, сочетающие генетические детерминанты продукции антагонистических веществ обоих типов (колицинов и микроцинов) будут обеспечивать высокий уровень антагонизма пробиотического препарата против природных энтеропатогенных штаммов независимо от типов кормления сельскохозяйственных животных.

Как вариант применения сконструированных плазмидных векторов, разработана схема удаления генов устойчивости к антибиотикам: ампициллину и канамицину. Таким образом, для получения пробиотических препаратов возможно использование разных производных полученных, плазмид.

9. Эксперименты на животных

Полученные в этой работе штаммы использовались в экспериментах на животных, проводимых совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта ГНУ ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных РАСХН под руководством проф. Б.В. Тараканова. Для продуцента микроцина В5 Е. coli S5 Sm и продуцента двух бактериоцинов: колицина El и микроцина В5 Е. coli S5(pColap) показана длительная персистенция в пищеварительном тракте жвачных животных с установившимся типом рубцового пищеварения и подавление ими лактозоотрицательных штаммов Е. coli и Salmonella spp., а также достоверное увеличение титров энтерококков. Однако в опытах с телятами-молочниками отмечена низкая эффективность воздействия этих штаммов на кишечную микрофлору (Тараканов и др., 2003). В случае штамма Е. coli S5 Sm быстрая элиминация из популяции, по-видимому, обусловлена подавлением синтеза микроцина в богатой среде кишечного содержимого телят, находящихся на молочном вскармливании. Низкая инвазивная способность колициногенного штамма Е. coli S5(pColap) скорее всего обусловлена повышенным уровнем продукции колицина в этом штамме, которая сопряжена с лизисом клеток-продуцентов.

Исходя из результатов опытов на животных, в которых участвовали штаммы Е. coli S5 Sm и Е. coli S5(pColap), для следующего эксперимента был выбран микроциногенный штамм Е. coli Ml 7 (pPAL5), устойчивый к колицину El. Было проведено два опыта по одной и той же схеме, в каждом из которых участвовало по три теленка. Количество клеток Е. coli в кишечном содержимом определяли перед применением препарата (фоновое содержание), в последний день приема (4-х суточный прием) и на 1, 3 и 5 дни отмены препарата.

Учет производили высевом на селективную для кишечных палочек среду Эндо без антибиотиков, а также среду Эндо с ампициллином (50 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл) для обогащения штаммом Е. coli М17 (pPAL5). Колонии Е. coli М17 (pPAL5), выросшие на среде с антибиотиками, диагностировали ПЦР с номощыо праймеров к структурной части микроциновых генов 5'-gca gca acg gtt gta gtg gt-3' и 5'-gtc aac tcc tga agt cgc cg-3'. При расчете учитывали долю антиботикорезситентных бактерий в общем титре Escherichia.

Установлено, что задаваемый микроциногенный штамм Е. coli Ml 7 (pPAL5) сохраняется, по меньшей мере, до пяти суток в пищеварительном тракте телят (табл. 4). При этом наблюдается очень большая дисперсия в его содержании: от долей процента до 60% от всех выделенных Escherichia.

Табл. 4

Относительное содержание клеток штамма Е. coli M17(pPAL5) в кишечном содержимом

телят

теленок №1 теленок №2 теленок №3

4-х дневная дача препарата 5,0% 17,0% 55,8%

1 -ый день отмены 2,6% 0,3% 65,4%

3-ий день отмены 0,4% 0,4% 32,8%

5-ый день отмены 6,0% 0,2% 60,0%

У разных животных также отличается динамика изменения численности задаваемого штамма: она либо поддерживается на стационарном (высоком или низком) уровне (животные № 1 и 3), либо происходит резкое снижение титра сразу после отмены препарата (теленок № 2). Можно предполагать, что эти различия связаны с особенностями резидентной микрофлоры каждого животного, которая, таким образом, оказывается значительной.

Для практических целей применения живых культур микроорганизмов можно рекомендовать разработку двух стратегий. По одной из них необходимо направленное формирование микрофлоры с первых часов жизни, которое уменьшит гетерогенность животных по этому показателю и сделает более предсказуемым динамику численности пробиотических штаммов в пищеварительном тракте. Альтернативная стратегия может быть основана на признании начальной гетерогенности конкурентных условий в пищеварительном тракте отдельных животных и, соответственно, слабой предсказуемости результатов приживаемости того или иного задаваемого штамма. В этом случае выход может состоять в применении искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией антагонистических веществ или комбинированного пробиотического препарата, сочетающего несколько штаммов с различными свойствами, в том числе антагонистическими., с тем, чтобы наиболее конкурентоспособный в данных условиях штамм колонизировал кишечный тракт.

выводы

1. Клонирован кластер генов из штамма Е, coli S5/98, ответственный за продукцию микроцина В5 и иммунитет к нему. В его составе выявлены ключевые гены, детерминирующие биосинтез В 5 и устойчивость к нему. На флангах кластера обнаружены последовательности, гомологичные плазмидам IncFII энтеробактерий. Таким образом, установлено плазмидное происхождение микроцина В5.

2. Показано наличие у штаммов Е. coli множественных диспергированных по геному локусов, способствующих устойчивости к микроцину типа В. Предложено участие продуктов генов yhiP и prlC в деградации микроцина типа В, белков EmrA и TolC в его секреции, а белка PriB в поддержании функционирования репликативного аппарата в присутствии микроцина типа В.

3. Показана возможность совмещения детерминант продукции колицина El и микроцина В 5 и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов.

4. Доказано, что синтез бактериоцинов является оружием в конкуренции между штаммами и способствует выживанию бактерий в микробных сообществах. Установлено, что в неструктурированной среде не может поддерживаться полиморфизм продуцентов бактериоцина и чувствительных к этому бактериоцину штаммов. Скорость вытеснения чувствительной культуры из популяции определяется типом бактериоцина: для микроциногеппых штаммов она выше, - чем для колициногенных. Предложена теоретическая модель динамики мякроциногенных популяций в гомогенной среде.

5. Впервые показано, что штамм Е. coli, одновременно продуцирующий микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника жвачных животных. Введение этого штамма не оказывает заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору кишечника животных, но повышает общее содержание в кишечнике бактерий группы кишечной палочки, подавляя при этом развитие патогенных представителей этой группы.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яковлева A.A., Алешин В.В., Тараканов Б.В. Длинные прямые повторы в составе искусственной нлазмиды pLF5 как фактор сбалансированной структурной нестабильности. Актуальные проблемы биотехнологии в животноводстве. Тезисы докладов. Боровск: Издательство ВНИИФБиП с.-х. животных. 2000. С. 449-450.

2. Яковлева A.A., Алешин В.В., Тараканов Б.В. Структурная нестабильность некоторых искусственных нлазмид и гетерологичная экспрессия с их промотора. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2001. Т. 2. С. 33-36.

3. Тараканов Б.В., Яковлева A.A., Николичева Т.А, Комкова Н.М., Манухина А.И., Алешин В.В. Вектор pLF22 для экспрессии генов молочнокислых бактерий. Микробиология. 2004. Т. 73. №2. 170-175.

4. Тараканов Б.В., Яковлева A.A., Алешин В.В. Характеристика энтеробактерий, продуцирующие низкомолекулярные антибиотики микроцины. Микробиология. 2004. Т. 73. №2. С. 150-155.

5. Яковлева A.A., Тараканов Б.В., Алешин В.В. Новый микроцин типа В и неспецифическая устойчивость к нему. Тезисы докладов III Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва. 6-12 июня 2004. Т. 1. С. 367.

6. Тараканов Б.В., Алешин В.В., Николичева Т.А., Комкова Н.М., Полякова Л.Л., Яковлева A.A. Исследование закономерностей формирования микробиоты кишечного тракта сельскохозяйственных животных под воздействием пробиотичсских штаммов -продуцентов микроцинов. Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. Калуга: Эйдос. 2004. Вып. 5.

7. Yakovleva A.A., Aleshin V.V., Tarakanov B.V. New B-type microcin and non-specific resistance to it. Reproduction, Nutrition, Development. 2004. Vol. 44. Suppl. 1. "4"' joint INRA-RRI Symposium on gut microbiology", special issue.

8. Yakovleva A.A., Aleshin V.V. Structural non-stability of some pLF plasmids and heterologous expression from their promoter. Plasmid. 2005. V. 53. № 1. P 75.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 27.12.2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пантелеева, Алиса Анатольевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Ы.Колицииы

1.1.1. Иммунность к собственному колицину

1 1 2 Защита от колицинов

1 1 3 Эволюция колицинов

1.1 4 Колицин El 13 1.2. Микроцины

1 2 1 МикроцинВП

1.2 2. Механизм действия микроцина В17 21 1 2.3. Иммунитет к микроцину В17 22 1 2 4. Регуляция экспрессии микроциновых генов 22 1.2.5. Устойчивость к микроцину типа В 25 1 2 6. Другие микроцины типа В

1 3. Экологическая роль колицинов и микроцинов

13.1. Теоретические модели изучения экологии бактериоцинов 30 1 3 2. Экспериментальные модели изучения экологии бактериоцинов

1 4 Применение колицинов и микроцинов

1 4 1 Пробиотики

1 4.2. Пробиотики на основе Е coli

Глава 2 Материалы и методы

2 1 Бактериальные штаммы, плазмиды, бактериофаги 43 2 2 Среды и условия культивирования 45 2 3 Установление продукции бактериоцина 46 2 4. Определение типа бактериоцина 47 2 5 Селекция на бактериоцинах 47 2 6 Трансформация клеток Е coli 48 2 7 Трансдукция бактерий

2 7 1 Приготовление лизатов 49 2 7 2 Трансдукция с использованием PI фаголизатов

2 8 Электротрансформация бактерий

2 9. Манипуляции с ДНК

2 9 1. Выделение плазмидной ДНК 50 2.9 2 Очистка плазмидной ДНК

2.9.3. Концентрирование ДНК

2.9.4. Электрофорез в агарозном геле 52 2.9 5. Выделение фрагментов ДНК из агарозы

2.10. Картирование ДНК

2.11. Клонирование

2.11.1. Дефосфорилирование ДНК

2.11.2. Лигирование 54 2.11 3. Превращение выступающих S'-kohuob в тупые 55 2.11.4. Превращение выступающих З'-концов в тупые 55 2.11 5. Встраивание линкеров 56 2.11.6. Клонирование генов, связанных с продукцией и иммунностью к микроцину

2.11 6 1. Приготовление фаголизатов Ми

2.11 6 2. Трансдукция с использованием фаголизатов Ми

2.11.6 3. Конструирование двойного лизогена

2.11.6 4 Получение банка генов

2 12 Полимеразная цепная реакция и подбор праймеров

2 13. Секвенирование ДНК

2 14 Объекты исследования

Глава 3 Результаты и обсуждение

3 1 Антагонистические свойства штамма Е coli S5/

3 11. Генетическое маркирование штамма Е coli S5/98 63 3 1 2. Перекрестная устойчивость штамма Е coli S5 Sm и индикаторных культур 64 3.1 3 Кривые роста штамма Е coli S5 Sm и индикаторных культур 64 3 1 4 Конкурентная динамика штаммов-продуцентов разных бактериоцинов 66 3 1 5 Получение штамма-продуцента микроцина и колицина

3 2 Исследование генов штамма Е coli S5/98, связанных с продукцией микроцина и иммунностью к нему

3 2 1 Клонирование микроциновых генов

3 2 2 Структура клонированного фрагмента

3 2 3 Субклонирование генов иммунности к микроцину В

3 3 Устойчивость к микроцину типа В

3.4 Получение изогенных рекомбинантных штаммов кишечной палочки -продуцентов комплекса антибиотических факторов

3.4.1. Конструирование векторов

3.4 2. Конструирование илазмид с генами бактериоцинов двух типов 83 3 5 Исследование поведения рекомбинантных штаммов кишечной палочки -продуцентов комплекса антибиотических факторов in vitro

3.5.1. Стабильность рекомбинантных плазмид в штамме Е coli Ml7 85 3 5 2. Перекрестная устойчивость штаммов производных Е coli М17 86 3 5.3. Динамика популяций штаммов производных Е coli М17 в смешанных культурах

3 6. Моделирование динамики микроциногенной популяции в гомогенной среде

3 7 Эксперименты на животных

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов"

В настоящее время пробиотики (медицинские или ветеринарные препараты, основанные на живых культурах микроорганизмов) широко используются для лечения и профилактики различных заболеваний человека и животных Проведено множество исследований свойств, механизмов действия, эффективности, безопасности различных пробиотиков in vitro и in vivo Вместе с тем, мало изучен вопрос, касающийся динамики пробиотических штаммов в лабораторных и природных экосистемах. Динамика популяции микроорганизмов зависит от многих факторов Прежде всего, это состав популяции и свойства экосистемы. Одним из важных механизмов, позволяющих штамму поддерживаться в популяции, является ее антагонистическая активность в отношении конкурирующих с ней штаммов. Явление антагонизма между бактериями, в большинстве случаев, обусловлено синтезом бактериоцинов (Cursino et al., 2002) В отличие от обычных антибиотиков бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, так как активны против бактерий того же вида или филогенетически родственных видов. Бактериоцины обнаружены почти во всех видах бактерий, 99% бактерий могут продуцировать, по меньшей мере, один бактериоцин (Klaenhammer, 1988). До сих пор недостаточно известно о роли бактериоцинов в микробных сообществах (Montalto, et al, 2002) Некоторые ученые убеждены, что бактериоцины не являются оружием в конкуренции между штаммами, а выполняют какую-то другую функцию, например, функцию защиты от бактериофагов (Feldgarden et al, 1995)

Большое количество разнообразных по свойствам бактериоцинов образуется представителями семейства энтеробактерий Интерес к бактериоцинам Escherichia coli связан с важной ролью этой бактерии в качестве компонента микрофлоры кишечника человека и животных Бактериоцины Е coli могут быть разделены на две группы колицины и микроцины. Колицины представляют собой полипептиды с молекулярной массой от 30 до 70 кДа, активные в отношении энтеробактерий Микроцины - группа низкомолекулярных антибиотиков (меньше 10 кДа) Они представляют собой рибосомально синтезируемые пептиды, активные в отношении относительно широкого круга грамотри-цательных бактерий (Baquero, Moreno, 1984)

Регуляции синтеза микроцинов и колицинов отличается первые синтезируются при голодании, а вторые - при избытке в среде субстратов Роль продукции колицинов в обеспечении конкурентоспособносш Е coli в условиях кишечника остается спорной, поскольку они, подавляя рост конкурентов, отрицательно сказываются на жизнеспособности самого продуцента.

Попытки исследования экологической роли микроцинов и колицинов в смешанных культурах in vitro ограничиваются такими действующими в кишечнике факторами, как гетерофазность среды и наличие бактерий помимо Е coli Однако, решение этой проблемы не теряет актуальности с точки зрения экологии бактерий, а также создания пробиотических штаммов.

Существует несколько математических моделей, описывающих динамику микробной популяции, в которой присутствуют продуценты колицинов Экспериментальных работ по экологии колицинов не так много Результаты некоторых из них противоречат результатам теоретических работ (Gordon, Riley 1999) Экология микробных популяций, в которых присутствуют микроцино-генные штаммы, практически не изучена

Весьма актуальным является изучение динамики смешанных популяций, в которых присутствуют продуценты нескольких антибиотиков и штаммы, различающиеся чувствительностью к ним. Изучение этого вопроса важно, так как совмещение в клетке продукции нескольких бактериоцинов с различной регуляцией синтеза, возможно, позволит создать высокоэффективные пробиотиче-ские препараты с расширенным спектром антагонистической активности и расширить диапазон условий, адекватных их применению.

Препараты на основе кишечной палочки используются в основном для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника. В настоящее время в России известные препараты пробиотиков разработаны на основе штамма Е coli Ml7, который является производным штамма Е coli, используемого для получения препарата «Mutaflor» (Altenhoefer et al, 2004; Grozdanov et al, 2004) Однако, в отличие от исходного штамма, коммерческий штамм Е coli Ml7 утратил способность к синтезу антибиотических веществ и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы (Шемчук, 1983) Поэтому оправданы мероприятия по разработке новых пробиотических штаммов или восстановлению антагонистической активности уже существующих штаммов, таких как Е coli Ml7

На основе штамма Е coli Ml7, в который была введена плазмида р74 с генами синтеза микроцина С51, уже создан пробиотический штамм «Ромакол», успешно прошедший производственные испытания (Соколова, Хмель, 2001)

Однако, «Ромакол» - до сих пор единственный коммерческий препарат, в котором использовано свойство микроциногении (Тараканов, 1998) В настоящее время не имеется препаратов, способных воздействовать на неохваченную ро-маколом часть спектра патогенных бактерий или пригодных для поочередного с ромаколом применения (что необходимо в целях предотвращения селекции в условиях хозяйств устойчивых форм патогенов). Это обусловливает актуальность поиска перспективных штаммов энтеробактерий - продуцентов бакте-риоцинов и их исследование.

Обнаружено, что микроциногенные штаммы Е coli характеризуются длительной персистенцией в желудочно-кишечном тракте жвачных животных с устоявшимся типом рубцового пищеварения, но при этом низкой эффективностью их воздействия на кишечную микрофлору телят-молочников (Тараканов и др, 2003, Тараканов и др., 2004). Известно, что на богатых средах, к которым можно отнести кишечное содержимое животных на этапе молочного вскармливания, более активно экспрессируются гены синтеза колицинов Можно предполагать, что это обеспечивает штаммам-продуцентам колицинов преимущество над продуцентами микроцинов в кишечном тракте молодняка В связи с указанными особенностями экспрессии генов колицинов и микроцинов и экологическими последствиями таких различий, возникает практическая задача получения штамма, способного синтезировать антибиотические факторы обоих типов Можно предполагать, что такой штамм будет обеспечивать высокий уровень антагонизма пробиотического препарата в отношении природных энтеро-патогенных штаммов независимо от типа кормления получающих его сельскохозяйственных животных

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Пантелеева, Алиса Анатольевна

Выводы

1. Клонирован кластер генов из штамма Е coli S5/98, ответственный за продукцию микроцина В5 и иммунитет к нему. В его составе выявлены ключевые 1ены, детерминирующие биосинтез В5 и устойчивость к нему. На флангах кластера обнаружены последовательности, гомологичные плазмидам IncFII энтеробактерий. Таким образом, установлено плазмид-ное происхождение микроцина В5.

2. Показано наличие у штаммов Е coli множественных диспергированных по геному локусов, способствующих устойчивости к микроцину типа В Предложено участие продуктов генов yhiP и prlC в деградации микроцина типа В, белков EmrA и TolC в его секреции, а белка PriB в поддержании функционирования репликативного аппарата в присутствии микроцина типа В.

3. Показана возможность совмещения детерминант продукции колицина El и микроцина В5 и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов

4 Доказано, что синтез бактериоцинов является оружием в конкуренции между штаммами и способствует выживанию бактерий в микробных сообществах Установлено, что в неструктурированной среде не может поддерживаться полиморфизм продуцентов бактериоцина и чувствительных к этому бактериоцину штаммов Скорость вытеснения чувствительной культуры из популяции определяется типом бактериоцина. для микроциногенных штаммов она выше, чем для колициногенных Предложена теоретическая модель динамики микроциногенных популяций в гомогенной среде

5 Впервые показано, что штамм Е coli, одновременно продуцирующий микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника жвачных животных Введение этого штамма не оказывает заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору кишечника животных, но повышает общее содержание в кишечнике бактерий группы кишечной палочки, подавляя при этом развитие патогенных представителей этой группы

Заключение

Обобщая полученные данные и результаты других работ по экологической роли бактериоцинов можно сказать, что продуценты микроцинов и коли-цинов играют важную роль в становлении микробной популяции, а также оказывают влияние на состав и соотношение микроорганизмов в установившемся микробном сообществе.

Установлено, что в неструктурированной среде не может поддерживаться полиморфизм продуцентов бактериоцина и чувствительных к этому бакте-риоцину штаммов. Это согласуется с математической моделью Франка, в которой описывается динамика конкуренции между продуцентами бактериоцинов и чувствительными штаммами (Frank, 1994) При этом скорость вытеснения чувствительной культуры из популяции зависит от типа бактериоцина, условий культивирования и особенностей конкурирующих штаммов Однако получены и противоречащие модели Франка результаты. Оказалось, что относительное содержание чувствительного штамма и штамма-продуцента в популяции не определяется исходным относительным содержанием штаммов Кроме того, небольшое количество клеток-продуцентов бактериоцина может вторгаться в устоявшуюся популяцию чувствительных клеток в неструктурированной среде Этот результат противоречит также теоретической модели, предложенной Чао и Левиным (Chao, Levin, 1981) Расхождение результатов теоретического моделирования и экспериментальных работ говорит о том, что положенная в основу теоретических исследований экологической роли бактериоциногении разница затрат, требующихся на синтез инструментов антагонистической активности не определяет исход конкуренции штаммов, и соответственно не играет решающей роли в динамике микробной популяции, по крайней мере в неструктурированной среде

Конкурентная динамика штаммов с разным типом бактериоцинов определяется в первую очередь типом бактериоцина Для смешанных популяций штаммов с разным типом колицина самым важным параметром является количество синтезируемого колицина на клетку (Gordon, Riley, 1999) Исход конкуренции микроциногенного и колицнногенного штаммов зависит от условий среды на богатой среде побеждает колициногенный штамм, на бедной - микроциногенный Динамика популяции, в которой присутствуют штаммы с одинаковым типом бактериоцина, определяется соотношением скоростей роста конкурирующих штаммов, а также внутриклеточными характеристиками, такими как уровень экспрессии плазмидных генов, регуляция числа копий в клетке, стабильность репликонов и другими. При этом поддерживается полиморфизм штаммов Конкурентная динамика продуцента бактериоцина и устойчивого к этому бактериоцину штамма определяется типом бактериоцина. Если речь идет о колицине, то состояние, к которому приходит популяция, где присутствуют продуцент колицина и устойчивый к колицину штамм, зависит от условий среды В благоприятной для синтеза колицина богатой среде побеждает устойчивый штамм. В данном случае исход конкуренции между штаммами определяют затраты, связанные с продукцией колицина, а именно лизис клеток-продуцентов. Богатая среда и устойчивость конкурирующего штамма усиливают синтез колицина и лизис клеток. В неблагоприятной для синтеза колицина бедной среде колициногения не играет роли в конкуренции между штаммами

Тот факт, что продуценты бактериоцинов не оставляют шанса на выживание чувствительных культур, свидетельствует о том, что синтез бактериоцинов является оружием в конкуренции между штаммами и способствует выживанию бактерий в микробных сообществах

Большая доля колициногенных штаммов, обнаруженных среди патогенов указывает на вклад бактериоциногении в обеспечении инвазии продуцента в устоявшееся микробное сообщество Кроме того, высокий уровень бактериоциногении штаммов, выделенных из фекалий новорожденных детей и животных, и возрастное сокращение таких штаммов свидетельствует о роли бактериоцинов в становлении микробных популяций. Большое разнообразие и распространение бактериоцинов, и еще большее распространение и селекция устойчивости к этим бактериоцииам указывают на защитную функцию колициногении - предотвращение колонизации кишечника болезнетворными микробами. Об этом свидетельствуют увеличение количества антагонистических штаммов в ответ на введение «чужого» продуцента бактериоцинов в опытах на животных (Тараканов и др , 2006 (в печати))

Обсуждение вопроса экологической значимости колицинов в научном мире возникло в связи с обнаружением синтеза колициновыми плазмидами других адаптивных факторов Некоторые ученые считают, что положительная селекция колициновых плазмид обусловлена присутствием в их составе генов, детерминирующих защитные антифаговые системы, или последовательностей вирулентных факторов, таких как аэробактин (Waters et al, 1991) Другим аргументом противников экологической роли колициногении в повышении конкурентоспособности штаммов-продуцентов является отсутствие положительной селекции интегрированных в хромосому колициновых генов. Как нам кажется, плазмидная локализация детерминант колицинов имеет преимущество в постоянно меняющихся условиях среды. Плазмиды обеспечивают большее число копий колициновых генов Кроме того, мшрация плазмид с адаптивными генами обеспечивает динамичность популяции, увеличивает ее стабильность и резистентность.

Полученные результаты по конкурентной динамике микроциногенных штаммов свидетельствуют о высокой эффективности продукции микроцинов Кроме того, чувствительность штамма Е coli S5/98 ко всем тестерным антибиотикам указывает на компенсаторное действие микроцина В5 факта продукции этого бактериоцина достаточно для выживания штамма в природных сообществах.

Высокие инвазивные качества микроциногенных штаммов и широкий спектр их антагонистической активности дают основание говорить о перспективности применения их продуцентов для регуляции популяций грамотрица-тельных бактерий в кишечнике человека и животных, а также использования генов, связанных с синтезом микроцинов и устойчивости к микроцинам для увеличения антагонистической активности уже существующих пробиотиков.

В настоящее время существует только один коммерческий препарат, в котором использовано свойство микроциногении. Это препарат «Ромакол», основанный на рекомбинантном штамме Е coli М17(р74) - продуценте микроцина С51 (Соколова, Хмель, 2001) Он используется для лечения дисбактериозов животных По результатам экспериментов по перекрестной устойчивости штаммов-продуцентов микроцинов и индикаторных культур шгамм Е coli М17(р74) подавляет многие штаммы музейных сальмонелл, а также активен в отношении лактозоположительных штаммов Е coli (Соколова, Хмель, 2001). Продуцент микроцина типа В штамм Е coli S5/98 высокоэффективен в отношении сальмонелл, лактозоположительных и лактозоотрицательных кишечных палочек, а также подавляет некоторые штаммы рода Klebsiella (Тараканов и др , 2004, Тараканов и др, 2005, Тараканов и др , 2006 (в печати)) Известно, что среди лактозоотрицательных Е coli доля потенциально патогенных штаммов больше, чем среди лактозоположительных. Поэтому оправдана разработка новых или усовершенствование уже существующих пробиотических штаммов, антагонистическая активность которых обусловлена синтезом микроцина типа В с целью направленного воздействия на патогенную микрофлору, не охваченную препаратом «Ромакол».

В связи с утратой пробиотическим штаммом Е coli Ml7 антагонистических свойств мы предлагаем восстановить его конкурентоспособность с помощью рекомбинантных плазмид, детерминирующих продукцию двух бактерио-цинов (микроцина В5 и колицин El), а также устойчивость к ним На основе не-мобилизуемой производной плазмиды ColEl получены рекомбинантные пла*-миды, несущие гены, связанные с продукцией микроцина В5 и устойчивостью к нему (pPAL4, pPAL5), а также гены колицина El (pPAL4) и детерминанты устойчивости к этому колицину (pPAL4, pPAL5) Плазмиды маркированы детерминантами устойчивости к ампициллину (pPAL4, pPAL5) и канамицину (pPAL5).

Полученные плазмиды восстанавливают утраченные антагонистические свойства штамма Е coli Ml7. Это позволит создать пробиотические препараты с повышенной антагонистической активностью и эффективные на фоне приема антибиотиков.

Как вариант применения сконструированных плазмидных векторов, разработана схема удаления генов устойчивости к антибиотикам- ампициллину и канамицину Таким образом, для получения пробиотических препаратов возможно использование разных производных полученных плазмид.

В связи со значительными различиями в эффективности воздействия пробиотических штаммов на кишечную микрофлору, связанную с особенностями резидентной микрофлоры каждого животного, для практических целей применения живых культур микроорганизмов можно рекомендовать разработку двух стратегий По одной из них необходимо направленное формирование микрофлоры с первых часов жизни, которое уменьшит гетерогенность животных по этому показателю и сделает более предсказуемым динамику численности про-биотических штаммов в пищеварительном тракте. Наряду с преимуществами (предсказуемой динамикой), эта стратегия имеет недостаток Так, при появлении патогенного микроорганизма, способного преодолеть защитные свойства искусственно сформированной микрофлоры, он может распространиться сразу среди многих животных, вызвав массовое заболевание. Альтернативная стратегия может быть основана на признании начальной гетерогенности конкурентных условий в пищеварительном тракте отдельных животных и, соответственно, слабой предсказуемости результатов приживаемости того или ино1 о задаваемого штамма. В этом случае выход может состоять в применении искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией антагонистических веществ или комбинированного пробиотического препарата, сочетающего несколько штаммов с различными свойствами, в том числе антагонистическими, с тем, чтобы наиболее конкурентоспособный в данных условиях штамм колонизировал кишечный тракт.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пантелеева, Алиса Анатольевна, Москва

1. Алешин В.В , Семенова Е В , Тараканов Б В , Лившиц В А Семейство челночных векторов для молочнокислых и других грамположительных бактерий, основанных на репликоне плазмиды pLF1311 Микробиология 2000 Т. 69(1). С. 75-80.

2. Басюк Е.И , Безруков В М., Липасова В А , Хмель И А Клонирование и анализ генетических детерминантов, определяющих продукцию микроци-нов В2 и В27. Молекулярная генетика. 1994. Т. 30(6). С. 731-739.

3. Ганусов В В., Брильков А В., Печуркин Н.С. Популяционная динамика бактериальных плазмид Математическое моделирование 2001. Т 13(1) С 77-98

4. Лившиц В А., Чеснокова В Л , Алешин В.В., Сокуренко Е В , Далин М В , Кравцов Э Г , Быков В А. Штамм бактерий Escherichia coli M17/pColap для получения пробиотического препарата. 2000. Описание изобретения к патенту РФ. RU 2144954 С1

5. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М "Мир". 1984.

6. Маянский А Н Дисбактериоз. иллюзии и реальность Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2(2). С 61-64

7. Миллер Дж Эксперименты в молекулярной генетике. М. "Мир". 1976.

8. Соколова Н А., Хмель И А. Пробиотик ромакол и его использование в ветеринарии. Ветеринария 2001. №11. С. 46-49.

9. Тараканов Б В. Использование пробиотиков в животноводстве Калуга 1998

10. Тараканов Б В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных Ветеринария. 2000. №1 С. 47-54.

11. Тараканов БВ, Николичева Т. А , Алешин В.В, Комкова НМ Влияние продуцента микроцина типа В на телят. Ветеринария. 2005.

12. Тараканов Б.В , Николичева Т.А., Алешин В В , Комкова Н М Микрофлора кишечника и здоровье телят при применении продуцента микроцина типа В. Ветеринария (в печати)

13. Тараканов Б В., Николичева Т.А , Алешин В В , Комкова Н М Микроцины и их воздействие на экологию бактерий в кишечнике мышей. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук (в печати)

14. Тараканов Б В , Яковлева А А., Алешин В В Характеристика энтеробакте-рий, продуцирующих микроцины низкомолекулярные антибиотики Микробиология 2004 Т 73(2) С. 150-155.

15. Тараканов Б.В., Яковлева А.А., Николичева Т.А., Комкова Н М., Манухи-на А.И., Алешин В В Вектор pLF22 для экспрессии генов в молочнокислых бактериях Микробиология. 2004 Т73(2) С 170-175.

16. Хмель И А Микроцины пептидные антибиотики энтеробакгерий генетический контроль синтеза, структура, механизм действия Генетика 1999. Т. 35(1) С. 5-16

17. Хмель И А , Метлицкая А 3 , Фоменко Д Э , Катруха Г С., Басюк Е И , Ку-репина Н Е , Липасова В А , Безруков В.М. Микроцины новые пептидные антибиотики энтеробактерий и генетический контроль их синтеза. Молекулярная биология 1999 Т. 33(1) С.113-119.

18. Чемерис А В , Ахунов Э Д, Вахитов В А Секвенирование ДНК М "Наука" 1999 144-133.

19. Шемчук Л Ф Стандартизация колибактерина Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук М 1983 С 16

20. Яковлева А А , Алешин В В , Тараканов Б.В Структурная нестабильность некоторых искусственных плазмид и гетерологичная экспрессия с их промотора Докл. Российской Академии сельскохозяйственных наук 2001 №2. С. 33-36

21. Aguilar A., Perez-Diaz J.С., Baquero F, Asensio С Microcin 15m from Escherichia coll. mechanism of antibiotic action Antimicrob. Agents Chemother 1982. V. 21(3) P 381-386.

22. Allah N., Afif H , Couturier M , Van Melderen L. The highly conserved TldD and TldE proteins of Escherichia coh are involved in microcin B17 processing and in CcdA degradation J Bactenol 2002. V. 184(12) P 3224-3231

23. Appel K., Haken W Every planar map is four colorable. A M.S. Contemporary Math. 1989. V. 98.

24. Asensio С , Perez-Diaz J C. A new family of low molecular weight antibiotics from Enterobacteria. Biochemical and biophysical research communications 1976 V. 69(1) P. 7-14

25. Bachvarov D R , Ivanov I G Large scale purification of plasmid DNA Prep Biochem 1983. V. 13(2). P. 161-166

26. Baquero F , Moreno F The microcins FEMS Microbiol. Lett 1984 V. 23. P 117-124

27. Baquero F., Bouanchaud D, Martinez-Perez MC, Fernandez C. Microcin plasmids: a group of extrachromosomal elements coding for low-molecular-weight antibiotics in Escherichia coh J. Bacteriol. 1978. V. 135. P. 342-347.

28. Baquero M.R., Bouzon M, Varea J., Moreno F. sbmC, a stationary-phase induced SOS Escherichia coh gene, whose product protects cells from the DNA replication inhibitor microcin В17. Mol Microbiol. 1995. V 18(2) P 301-311.

29. Benedetti H , Frenette M , Baty D , Kmbiehler M , Pattus F, Lazdunski J.C. Individual domains of colicins confer specificity in colicin uptake, in poreproperties and in immunity requirements J Mol Biol 1991. V. 217. P 429-439

30. Birnboim H С , Doly J A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic Acids Res. 1979 V 7(6) P. 1513-1523

31. Bishop L J , Bjes E S , Davidson V.L , Cramer W A. Localization of the immunity protein-reactive domain in unmodified and chemically modified COOH-terminal peptides of colicin El J Bacteriol 1985 V 164 P. 237-244.

32. Blum G, Marre R, Hacker J. Properties of Escherichia coll strains of serotype 06. Infection 1995 V. 23(4). P. 234-236.

33. Braun V, Pilsl H, Gross P. Colicins* structures, modes of action, transfer through membranes, and evolution Arch Microbiol. 1994 V. 161(3) P. 199-206 Review.

34. Braun V., Patzer S I, Hantke K Ton-dependent colicins and microcins modular design and evolution. Biochimie. 2002. V. 84(5-6) P 365-380.

35. Brendel V., Perelson A S. Quantitative model of ColEl plasmid copy number control J.Mol.Biol. 1993. V 229(4) P. 860-872.

36. Bruand C., Le Chatelier E, Ehrlich S.D., Janniere L. A fourth class of theta-replicating plasmids: the pAM beta 1 family from gram-positive bacteria Proc. Natl. Acad Sci USA. 1993. V 90(24) P 11668-11672

37. Chan P T , Ohmori H., Tomizava J., Lebowitz J. Nucleotide sequence and gene organization of ColEl DNA The Journal of Biological Chemistry. 1985 V 260(15) P. 8925-8935

38. Chao L , Levin B R Structured habitats and the evolution of anticompetitor toxins in bacteria Proc. Natl Acad Sci. U S A. 1981. V 78(10) P. 6324-6328

39. Chumchalova J., Smarda J Human tumor cells are selectively inhibited by colicins. Folia Microbiol (Praha) 2003 V. 48(1). P. 111-115.

40. Cocconcelli P S , Elli M, Riboli B , Morelli L Genetic analysis of the replication region of the Lactobacillus plasmid vector pPSC22 Res Microbiol 1996 V 147(8) P 619-624

41. Collins M D , Gibson G R Probiotics, prebiotics, and synbiotics approaches for modulating the microbial ecology of the gut. Am. J. Clin Nutr 1999 V. 69(5) P 1052-1057 Review

42. Connell N., Han Z , Moreno F , Kolter R An E coli promoter induced by the cessation of growth Mol Microbiol 1987. V. 1(2) P. 195-201

43. Cursino L , Smajs D., Smarda J , Nardi R M , Nicoli J R , Chartone-Souza E , Nascimento A M. Exoproducts of the Escherichia coll strain H22 inhibiting some enteric pathogens both in vitro and in vivo. J. Appl Microbiol 2006 V 100(4). P. 821-829.

44. Cursino L, Smarda J., Chartone-Souza E., Nascimento A. Recent updated aspects of colicins of Enterobacteriaceae. Brasil J. Microbiol 2002 V 33. P. 185-195.

45. Czaran T.L., Hoekstra R.F. Killer-sensitive coexistence in metapopulations of micro-organisms Proc. Biol Sci. 2003 V. 270(1522) P 1373-1378.

46. Czaran T.L., Hoekstra R F., Pagie L. Chemical warfare between microbes promotes biodiversity. Proc. Natl Acad. Sci USA. 2002. V. 99(2) P. 786-790

47. Davies J.K., Reeves P. Genetics of resistance to colicins in Escherichia coll K-12: cross-resistance among colicins of group A. J. Bacteriol 1975. V. 123(1) P 102-117

48. Delgado M A , Rintoul M R , Farias R N., Salomon R A Escherichia coll RNA polymerase is the target of the cyclopeptide antibiotic microcin J25. J Bacteriol V 183(15) P. 4543-4550

49. Destoumieux-Garzon D , Peduzzi J., Rebuffat S Focus on modified microcins structural features and mechanisms of action Biochimie. 2002 V 84(5-6) P. 511-519 Review

50. Djordjevic G.M, Klaenhammer T.R Positive selection, cloning vectors for gram-positive bacteria based on a restriction endonuclease cassette Plasmid 1996.V. 35(1) P.37-45.

51. Durrett R , Levin S. Allelopathy in Spatially Distributed Populations J Theor Biol. 1997. V 185(2). P. 165-171

52. Dykes G A , Hastings J.W. Selection and fitness in bacteriocin-producing bacteria. Proc. Biol. Sci. 1997. V 264(1382) P 683-687.

53. Ebina Y., Takahara Y., Kishi F., Nakazawa A., Brent R. LexA protein is a repressor of the colicin El gene J. Biol. Chem. 1983. V. 258(21). P. 13258-13261.

54. Elmer G.W. Probiotics: "living drugs". Am. J. Health Syst. Pharm. 2001 V 58(12). P. 1101-1109. Review.

55. Fang A., Demain A L Influence of aeration and carbon source on production of microcin B17 by Escherichia coh ZK650. Appl. Microbiol Biotechnol. 1997. V. 47(5). P. 547-553.

56. Farid-Sabet S. Interaction of I-labeled colicin El with Escherichia coll J Bacterid. 1982 V. 150(3) P. 1383-1390

57. Feldgarden M , Golden S , Wilson H., Riley M.A. Can phage defence maintain colicin plasmids in Escherichia colli Microbiology. 1995 V. 141(11) P. 29772984.

58. Feldgarden M , Riley M A. High levels of colicin resistance in Escherichia coh. Evolution 1998. V. 52. P. 1270-1276

59. Feldgarden M , Riley M A The phenotypic and fitness effects of colicin resistance in Escherichia coh K-12 Evolution 1998 V. 53 P. 1019-1027

60. Finlay B B , Frost L S , Paranchych W Localization, cloning, and sequence determination of the conjugative plasmid ColB2 pilin gene. J. Bactenol 1984 V. 160(1) P 402-407

61. Finnegan J , Sherratt D Plasmid ColEl conjugal mobility: the nature of bom, a region required in cis for transfer. Mol Gen Genet. 1982. V 185(2) P. 344351

62. Frank S Spatial polymorphism of bactenocins and other allelopathic traits Evol Ecol 1994 V 8 P 369-386

63. Franz C M , Holzapfel W H , Stiles M E Enterococci at the crossroads of food safety7 Int J Food Microbiol 1999. V. 47(1-2) P. 1-24. Review.

64. Fredericq F. Colicins. Annu. Rev Microbiol 1957. V. 11 P 7-22

65. Fuller R Probiotics in man and animals J. Appl. Bacteriol 1989 V. 66(5) P 365-378. Review.

66. Fuqua C., Parsek M R., Greenberg E P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing Annu Rev Genet 2001. V. 35. P. 439-468 Review.

67. Garcia-Bustos J.F., Pezzi N., Mendez E. Structure and mode of action of micro-cin 7, an antibacterial peptide produced by Escherichia coh Antimicrob Agents Chemother. 1985. V. 27(5). P. 791-797.

68. Garrido M.C., Herrero M , Kolter R , Moreno F. The export of the DNA replication inhibitor Microcin B17 provides immunity for the host cell. EMBO J. 1988. V. 7(6) P. 1853-1862.

69. Genilloud 0., Moreno F , Kolter R. DNA sequence, products, and transcriptional pattern of the genes involved in production of the DNA replication inhibitor microcin B17. J. Bacteriol. 1989. V. 171(2) P.1126-1135.

70. Gonzalez-Pastor J.E., San Millan J L , Castilla M A , Moreno F. Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7. J. Bacteriol. 1995. V. 177(24) P.7131-7140.

71. Gorbach S L. Probiotics and gastrointestinal health. Am J.Gastroenterol 2000. V 95(1) P. 2-4

72. Gordon D.M , O'Brien C L Bacteriocin diversity and the frequency of multiple bacteriocin production in Escherichia coli Microbiology. 2006. V 152(11) P 3239-3244.

73. Gordon D.M , Riley M A , Pinou T. Temporal changes in the frequency of colicinogeny in Escherichia coli from house mice Microbiology. 1998 V. 144(8) P. 2233-2240

74. Gordon D M , Riley M A. A theoretical and empirical investigation of the invasion dynamics of colicinogeny Microbiology. 1999 V 145(3) P. 655-661

75. Groisman E A , Casadaban M J Mini-mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing J Bacteriol. 1986 V 168(1) P 357364

76. Grompone G , Bidnenko V , Ehrlich S.D., Michel B PriA is essential for viability of the Escherichia coli topoisomerase IV parE10(Ts) mutant J. Bacteriol 2004 V 186(4) P 1197-1199

77. Grozdanov L., Raasch C., Schulze J., Sonnenborn U., Gottschalk G , Hacker J., Dobrindt U. Analysis of the genome structure of the nonpathogenic probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917. J. Bacteriol 2004 V. 186(16) P 54325441.

78. Hardy KG. Cohcinogeny and related phenomena Bacteriol Rev 1975 V 39(4) P. 464-515. Review

79. Harkness R E., Braun V. Colicin M inhibits peptidoglycan biosynthesis by interfering with lipid carrier recycling J Biol. Chem 1989. V 264(11). P. 61776182.

80. Hernandez-Chico C , San Millan J.L , Kolter R, Moreno F Growth phase and ompR regulation of transcription of microcin B17 genes J Bacteriol 1986 V. 167(3). P. 1058-1065.

81. Herrero M., Moreno F Microcin B17 blocks DNA replication and induces the SOS system in Escherichia coli J Gen Microbiol. 1986. V. 132(2) P. 393-402.

82. Housden N G., Loftus S.R., Moore G R., James R., Kleanthous C Cell entry mechanism of enzymatic bacterial colicins: porin recruitment and the thermodynamics of receptor binding. Proc. Natl Acad Sci. U S A. 2005 V. 102(39) P 13849-13854.

83. Itoh T., Tomizawa J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColEl DNA by ribonuclease H Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1980 V. 77(5). P. 2450-2454.

84. James R , Kleanthous C , Moore G R The biology of E colicins paradigms and paradoxes Microbiology 1996 V 142. P 1569-1580.

85. Kerr B., Riley M A , Feldman M.W., Bohannan B J Local dispersal promotes biodiversity in a real-life game of rock-paper-scissors. Nature 2002 V 418(6894) P.171-174

86. Klaenhammer T R Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie. 1988. V. 70. P 337-349

87. Klaenhammer T R Probiotic bacteria today and tomorrow J Nutr. 2000 V 130(2) P 415-416 Review

88. Kleerebezem M Quorum sensing control of lantibiotic production, nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis. Peptides. 2004. V 25(9) P. 14051414 Review

89. Kolter R, Moreno F Genetics of ribosomally synthesized peptide antibiotics Annu Rev Microbiol 1992 V 46 P. 141-163

90. Lakey JH, Slatin S.L. Pore-forming colicins and their relatives Curr Top Microbiol Immunol. 2001. V. 257 P. 131-161

91. Lavina M., Gaggero C , Moreno F. Microcin H47, a chromosome-encoded microcin antibiotic of Escherichia coh J. Bacteriol. 1990. V 172(11) P. 65856588.

92. Lavina M., Pugsley AP., Moreno F. Identification, mapping, cloning and characterization of a gene (sbmA) required for microcin B17 action on Escherichia coh K12 J. Gen. Microbiol 1986. V. 132(6) P. 1685-1693.

93. Lazdunski C, Bouveret E., Rigal A, Journet L., Lloubés R, Benedetti II Colicin import into Escherichia coh cells requires the proximity of the inner membranes and others factors. Int. J. Med. Microbiol. 2000 V 290. P. 337-344

94. Lenski R.E., Riley M.A Chemical warfare from an ecological perspective Proc Natl. Acad. Sci USA 2002. V. 99(2) P 556-558.

95. Lindeberg M , Cramer W A Identification of specific residues in colicin El involved in immunity protein recognition. J. Bacteriol 2001 V. 183(6) P 21322136

96. Liu J Microcin B17* posttranslational modifications and their biological implications Proc. Natl Acad. Sci USA. 1994. V. 91(11) P. 4618-4620. Review

97. Lomovskaya O , Kawai F , Matin A. Differential regulation of the mcb and emr operons of Escherichia coll role of mcb in multidrug resistance. Antimicrob Agents Chemother 1996 V.40(4) P. 1050-1052

98. Lomovskaya O, Lewis K, Matin A EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pump EmrAB J. Bacteriol. 1995. V. 177(9) P 2328-2334

99. Lotz W Effect of guanosine tetraphosphate on in vitro protein synthesis directed by El and E3 colicinogenic factors J Bacteriol. 1978 V. 135. P 707-712

100. Lu F M , Chak K F Two overlapping SOS boxes in ColEl operon are responsible for the viability of cells harboring the Col plasmid Mol Gen Genet 1996. V 251 P 407-411

101. Luoma S., Peltoniemi K , Joutsjoki V , Rantanen T , Tamminen M , Heikkinen I., Palva A. Expression of six peptidases from Lactobacillus helveticus in Lacto-coccus lactis. Appl Environ Microbiol. 2001. V 67(3). P. 1232-1238

102. Madison L L , Vivas E.I., Li Y M., Walsh C.T., Kolter R. The leader peptide is essential for the post-translational modification of the DNA-gyrase inhibitor mi-crocinBl 7. Mol. Microbiol 1997. V. 23(1). P 161-168

103. Majamaa H., Isolauri E Probiotics- a novel approach in the management of food allergy. J. Allergy Clin Immunol 1997. V. 99(2) P 179-185.

104. Mao W., Siegele D.A. Genetic analysis of the stationary phase-induced mcb op-eron promoter in Escherichia coli. Mol Microbiol. 1998. V. 27(2) P. 415-424.

105. Martinez J.L., Perez-Diaz J.C. Isolation, characterization, and mode of action on Escherichia coli strains of microcin D93. Antimicrob. Agents Chemother. 1986. V. 29(3). P 456-460.

106. McCracken A., Turner MS , Giffard P., Hafner L.M., Timms P Analysis of promoter sequences from Lactobacillus and Lactococcus and their activity in several Lactobacillus species. Arch Microbiol. 2000 V. 173(5-6) P 383-389.

107. Metchnikoff E The Prolongation of Life: Optimistic Studies Mitchell C. edited London: W Heinemann 1907 P. 161-183.

108. Michiels J , Dirix G, Vanderleyden J , Xi C. Processing and export of peptide pheromones and bactenocins in Gram-negative bacteria Trends Microbiol. 2001 V. 9(4) P. 164-168. Review

109. Montalto M., Arancio F., Izzi D., Cuoco L , Curigliano V., Manna R , Gasbarrini G. Probiotics: history, definition, requirements and possible therapeutic applications. Ann. Ital Med. Int 2002. V. 17(3) P. 157-165 Review.

110. Moreno F., Gonzalez-Pastor J.E., Baquero M.R., Bravo D 1 he regulation of mi-crocin B, C and J operons Biochimie. 2002. V. 84(5-6). P. 521-529 Review

111. Mrda Z., Zivanovic M, Rasic J., Gajin S., Somer L., Trbojevic S , Majoros J., Petrovic Z. Therapy of Helicobacter pylori infection using Lactobacillus acidophilus. Med Pregl. 1998 V. 51(7-8) P 343-345.

112. Neu HC The crisis in antibiotic resistance. Science 1992. V 257(5073) P 1064-1073. Review

113. O'Brien G.J., Chambers S.T, Peddie B., Mahanty H K. The association between colicinogenicity and pathogenesis among uropathogenic isolates of Escherichia coli. Microb. Pathog. 1996 V. 20(3). P. 185-190.

114. Ozeki E.T., Stocker H., De Margerie H. Production of colicin by single bacteria Nature. 1959. V. 184. P. 337-339.

115. Pagie L., Hogeweg P. Colicin diversity: a result of eco-evolutionary dynamics J. Theor. Biol. 1999. V. 196(2). P. 251-261

116. Pavlova S I., Kilic A O, Topisirovic L , Miladinov N., Hatzos C., Tao L. Characterization of a cryptic plasmid from Lactobacillus fermentum KC5b and its use for constructing a stable Lactobacillus cloning vector. Plasmid. 2002 V 47(3) P. 182-192

117. Petering D H , Byrnes R W , Antholine W E. The role of redox-active metals in the mechanism of action of bleomycin. Chem Biol. Interact 1990. V. 73(2-3) P 133-182. Review.

118. Pierrat OA, Maxwell A Evidence for the role of DNA strand passage in the mechanism of action of microcin B17 on DNA gyrase Biochemistry. 2005 V. 44(11) P. 4204-4215.

119. Pinou T, Riley MA Nucleotide polymorphism in microcin V plasmids Plasmid 2001 V 46(1) P 1-9

120. Poey ME, Azpiroz MF, Lavma M Comparative analysis of chromosome-encoded microcins Antimicrob Agents Chemother. 2006. V. 50(4) P. 14111418

121. Pons A M , Lanneluc I, Cottenceau G, Sable S. New developments in non-post translationally modified microcins Biochimie 2002 V 84 P. 531-537

122. Pouwels P.H., Leer R.J., Boersma W.J. The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization' development and preliminary characterization of vector systems for targeted delivery of antigens J. Biotechnol. 1996 V 44(1-3) P 183-192.

123. Reeves P. The bacteriocins. Bacterid. Rev. 1965. V. 29. P 24-45 Review

124. Rembacken BJ., Snelling AM., Hawkey PM, Chalmers DM, Axon AT Non-pathogenic Escherichia coll versus mesalazine for the treatment of ulcerative colitis: a randomised trial. Lancet. 1999 V 354(9179) P. 635-639

125. Riley M.A., Gordon D.M The ecological role of bacteriocins in bacterial competition Trends Microbiol. 1999 V 7(3). P. 129-133 Review.

126. Riley M A. Molecular mechanisms of bacteriocin evolution Ann Rev Microbiol. 1998.V. 32 P. 255-278.4

127. Riley M.A , Gordon DMA survey of Col plasmids in natural isolates of Escherichia coli and an investigation into the stability of Col-plasmid lineages J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138(7) P. 1345-1352.

128. Riley M.A , Wertz J.E. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu Rev. Microbiol. 2002. V. 56 P. 117-137 Review.

129. Riley M A , Pinou T, Wertz J.E, Tan Y , Valletta C M Molecular characterization of the klebicin B plasmid of Klebsiella pneumoniae. Plasmid 2001. V. 45(3) P 209-221

130. Riley MA, Tan Y, Wang J Nucleotide polymorphism in colicin El and la plasmids from natural isolates of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci. USA. 1994 V. 91(23) P. 11276-11280

131. Riley M A Molecular mechanisms of colicin evolution. Mol Biol. Evol. 1993 V 10(6) P 1380-1395

132. Riley M A Positive selection for colicin diversity in bacteria. Mol Biol Lvol 1993 V 10(5) P 1048-1059

133. Riley, M A , Gordon, D M The ecology and evolution of bacteriocins J Ind Microbiol 1996 V 17 P 151-158

134. Rodriguez-Sainz MC., Hernandez-Chico C., Moreno F A his\ Tn5 mutation affects production of microcins B17, C7, and H47 and colicin V J Bactenol 1991. V. 173(21). P. 7018-7020.

135. Rodriguez-Sainz M.C , Hernandez-Chico C., Moreno F Molecular characterization of pmhA, an Escherichia coli chromosomal gene required for the production of the antibiotic peptide MccBl 7. Mol Microbiol. 1990. V. 4(11) P 1921-1932

136. Sabik J.F., Suit J L., Luria S E. cea-kil operon of the ColEl plasmid J Bacteriol. 1983 V. 153(3). P. 1479-1485

137. Salles B., Weisemann J.M., Weinstock G.M. Temporal control of colicin El induction J. Bacteriol 1987. V 169. P. 5028-5034.

138. San Millan J.L, Hernandez-Chico C , Pereda P , Moreno F Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin B17 production and immunity J Bacteriol. 1985. V. 163(1) P. 275-281.

139. San Millan J.L., Kolter R , Moreno F. Evidence that colicin X is microcin B17 J. Bacteriol. 1987. V 169(6) P. 2899-2901.

140. San Millan J.L , Kolter R , Moreno F. Plasmid genes required for microcin B17 production J. Bacteriol 1985. V 163(3). P 1016-1020.

141. Sano Y, Matsui H, Kobayashi M, Kageyama M Molecular structures and functions of pyocins SI and S2 in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol 1993. V 175(10). P. 2907-2916

142. Saunders SE, Burke J F. Rapid isolation of miniprep DNA for strand se-quensing Nucl. Aci Research 1990. V. 18(16). P. 4948

143. Smajs D., Pilsl H , Braun V Colicin U, a novel colicin produced by Shigella boydu J Bactenol 1997. V 179(15). P 4919-4928.

144. Smarda J, Smajs D Colicins exocellular lethal proteins of Escherichia coli Fol Microbiol 1998 V 43 P 563-582.

145. Smarda J , Smajs D Colicins exocellular lethal proteins of Escherichia coli. Fol Microbiol 1998 V 43 P 563-582.

146. Strobel M , Nomura M Restriction of the growth of bacteriophage BF23 by a colicine I (col I-P9) factor Virology. 1966 V. 28(4). P. 763-765.

147. Sullivan A , Edlund C , Nord C E Effect of antimicrobial agents on the ecological balance of human microflora Lancet Infect. Dis 2001. V. 1(2). P 101-114 Review

148. Sullivan A , Nord C E Probiotics in human infections J Antimicrob. Chemother 2002 V 50(5) P 625-627 Review164165166167.168169,170.171.172173174175176177

149. Szajewska H., Kotowska M , Mrukowicz J Z., Armanska M , Mikolajczyk W Efficacy of Lactobacillus GG in prevention of nosocomial diarrhea in infants J Pediatr 2001. V 138(3). P. 361-365

150. Vaughan E E , Mollet B. Probiotics in the new millennium Nahrung 1999. V 43(3) P. 148-153 Review

151. Vieira J., Messing J The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers Gene 19821. V 19(3) P 259-268

152. Vizan J L , Hernandez-Chico C , del Castillo I, Moreno F. The peptide antibiotic microcin B17 induces double-strand cleavage of DNA mediated by E coll DNA gyrase EMBO J 1991 V 10(2) P. 467-476

153. Vollaard E J, Clasener H A Colonization resistance. Antimicrob Agents Chemother 1994 V 38(3) P 409-414 Review.

154. Waters V.L., Crosa J.H. Colicin V virulence plasmids Microbiol Rev 1991 V 55(3). P. 437-450 Review.

155. Womble D D , Rownd R H Genetic and physical map of plasmid NR1 comparison with other IncFII antibiotic resistance plasmids Microbiol Rev 1988 V 52(4). P. 433-451. Review.

156. Xiong A., Gottman A., Park C , Baetens M., Pandza S , Matin A The EmrR protein represses the Escherichia coli emrRAB multidrug resistance operon by directly binding to its promoter region Antimicrob. Agents Chemother. 2000 V 44(10) P. 2905-2907

157. Yamada M., Ebina Y., Miyata T, Nakazawa T., Nakazawa A Nucleotide sequence of the structural gene for colicin El and predicted structure of the protein. Proc. Natl. Acad. Sei USA 1982. V. 79(9) P. 2827-2831.

158. Yorgey P., Davagnino J , Kolter R. The maturation pathway of microcin B17, a peptide inhibitor of DNA gyrase Mol Microbiol. 1993. V. 9(4). P. 897-905

159. Yorgey P., Lee J., Kordel J., Vivas E., Warner P., Jebaratnam D., Kolter R Post-translational modifications in microcin B17 define an additional class of DNA gyrase inhibitor. Proc Natl. Acad. Sei USA. 1994. V 91(10) P. 4519-4523

160. Zhang SP., Yan LF, Zubay G. Regulation of gene expression in plasmid ColEl: delayed expression of the hi gene. J. Bacteriol. 1988. V. 170(12) P. 5460-5467.

161. Zmder N D Resistance to colicins E3 and K induced by infection with bacteriophage fl Proc Natl Acad Sei. U S A 1973 V. 70(11) P 3160-31641*ехЛ сайт I1. V12411. Со1Е1 6646 п.н. «гштто И1. Вф1ЛЛ111. В*рН 18411. ВзрН!1. ЬехА сайт1. ЯЫ 33761. М1и| 2491

Информация о работе

Пантелеева, Алиса Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Гены продукции микроцина Escherichia coli S5/98, их экспрессия и влияние на антагонистические свойства рекомбинантных штаммов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы