Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видоспецифические ингибиторы бактериальной РНК-полимеразы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Видоспецифические ингибиторы бактериальной РНК-полимеразы"

На правах рукописи

Юзенкова Юлия Викторовна

Видоспецифические ингибиторы бактериальной РНК-полимеразы

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Отдела молекулярной генетики клетки Института молекулярной генетики РАН (Москва), а также в Институте им. Ваксмана Университета Ратгерс (Waksman Institute, Rutgers University, USA).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В. Г. Никифоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.В.Машко

кандидат биологических наук Л.В.Генинг

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН им В.А.Энгельгардта

Защита состоится «_»_2004 г. в_на заседании

диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ Генетика».

Автореферат разослан «___»_

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

В Л. Щербакова

Актуальность темы. Транскрипцию, то есть синтез РНК на матрице ДНК, осуществляют в клетке сложные многосубъединичные ферменты - РНК полимеразы. Дня настройки процесса адаптации к различным физиологическим условиям активность РНК полимераз регулируется разнообразными белковыми и небелковыми факторами.

Важным достижением в почти 50-летней истории изучения РНК-полимераз стало получение трехмерной структуры РНК-полимеразы бактерии Thermus aquaticus, что позволило приписать известные функции определенным структурным элементам, а также начать изучать неизвестные ранее белковые домены. Тем не менее, кристаллическая структура отражает только одну из возможных конформаций фермента. Поэтому информация на основе структурных данных может быть применима лишь с и шестыми ограничениями к мобильному ферменту, никл работы которого сопровождается конформационными изменениями. Наряду с изучением механизмов базальной транскрипции, можно изучать модуляцию транскрипции разнообразными траснкрипционными факторами. Неоспоримыми достоинством этого подхода можно считать то, что исследуются заведомо функциональные состояния фермента, а полученные данные дают информацию о механизмах регуляции его активности. Количество известных транскрипционных факторов постоянно растет, многообразие механизмов и специфичность их действия способствуют углублению понимания процесса транскрипции.

Более того, ингибиторы бактериальной транскрипции представляют собой большой и практически невостребованный пул потенциальных антибиотиков. Не исключено,что в ближайшее время, в связи с очевидной проблемой катастрофического увеличения количества устойчивых штаммов бактерий, они и производные на их основе найдут применение в терапии различных заболеваний.

Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение механизма действия двух видоспецифичных ингибиторов бактериальной транскрипции. В работе ставились следующие задачи:

1. Изучить действие белка р7 бактериофага Хр10 на РНК-полимеразу бактерии Xanthomonas oryzae. Предсказать роль р7 в регуляции транскрипции фагового генома.

2. Изучить механизм ингибирования РНК-полимеразы Escherichia coli антибактериальным пептидом микроцином J25.

РОС. кгччнлАлиаля

БИЬ

Q3

ОТЕКЛ гооУ'вк^

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе исследован механизм -ингибирования РНК-полимеразы Xanthomonas oryzae белком р7 бактериофага Хр10. Этот уникальный бифункциональный транскрипционный фактор ингибирует инициацию и терминаиию транскрипции, связываясь с N-концевым районом ($'субъединицы. В работе был изучен механизм антитерминации, вызываемой белком р7. Механизм действия этого белка уникален среди изученных факторов транскрипции - он способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрипционного пузыря. Необходимо отметить, что Xanthomonas oryzae - это бактерия, поражающая рис, основную сельскохозяйственную культуру азиатского региона. Изучение механизма подавления транскрипции этой бактерии, возможно, позволит эффективнее бороться с ней и снизит экономические убытки. В работе изучен механизм ингибирования различных функций РНК-полимеразы Escherichia coli бактерицидным пептидом микроцином J25. Впервые экспериментально была подтверждена приписываемая вторичному каналу функция размещения З'-конц» транскрипта в арестованном состоянии. Получены мутации устойчивости к этому антибиотику. Изучение действия, а также анализ частоты возникновения мутаций устойчивости полезны при оценке перспективности микроцина и его производных для разработки антибиотиков на его основе. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста и содержит 35 рисунков. Библиография включает в себя 194 названия, в том числе 1 русское и 193 иностранных.

Глава 1. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы Xanthomonas oryzae белком р7 бактериофага Хр10.

Введение. Xanthomonas oryzae - это грам-отрицательная бактерия, которая вызывает хлороз листьев риса (White et al., 1995). Известно несколько фагов, заражающих X.oryzae. Один из них - литический бактериофаг Хр10, принадлежащий к семейству Syphoviridaea класса Podoviridae. В работе (Liao et al, 1986а) было показано, что РНК-полимераза X. oryzae, выделенная из зараженных фагом клеток бактерий, не содержит в своем составе а-субъединицы и не активна в реакции промотор-зависимой транскрипции.

р7 связывается с кор-ферментом и не является анти-сигма фактором. В работе (Nechaev et al., 2002) было показано, что РНК-полимераза, выделенная из зараженных фагом Хр10 клеток, действительно не активна. Однако, вопреки литературным данным, оказалось, что количество -субъединицы в этих препаратах остается стехиометрическим, при этом было также обнаружено, что в этих препаратах РНК-полимеразы X. oryzae, содержится прочно связанный с ней белок массой 7kDa (названный р7).

В

А

1 234 5 <789 10 1113- 123

Рис 1. р7 образует комплекс с корферментом РНКП Хо/угае. А. Кор- и халофермент РНК полимеразы были нанесены на №-Ш"Л агарозу в присутствии или в отсутствие р7 (дорожки 1, 4, 7, 10, обозначенные на рисунке Р). Нес вязавшийся материал (дорожки 2, 5, 8, II, обозначенные Н) был отобран, гранулы агарозы были промыты, затем связанные белки были элюированы буфером, содержавшим 100мМ имидазол (дорожки 3,6, 9, 12, обозначенные Е). Фракции были нанесены на денатурирующий ПЛАТ. В. Р7 не влияет на стабильность холофермента Хогугае. Халофермент был собран в отсутствии (дорожка 2) или в присутствии р7 (дорожка 3), Пробы наносились на нативный ПЛАТ. На дорожку 1 нанесена для контроля ст-субъединица.

Было высказано предположение о том, что именно белок р7, связанный с РНК-полимеразой, подавляет ее активность, и вряд ли является анти-сигма фактором. Чтобы проверить эти предположения, были поставлены эксперименты по связыванию белка р7 с кор- и холоферментами РНК-полимеразы Х.огутде. Для этого был использован рекомбинантный белок р7, содержащий на ]]-конце гексагистидиновый якорь, который позволяет специфически сорбировать белок на №-]ГА-агарозе. Предполагалось, что белки, взаимодействующие с р7, будут оставаться на никелевой агарозе. Результаты этого эксперимента, представленные на рис. 1, показали, что и кор- и холофермент остаются на №-агарозе в присутствии, но не в отсутствие р7. Следовательно р7 связывается с кор-ферментом и не является антисигмой, так как р7, сигма и кор способны образовывать тройной комплекс.

Чтобы определить, какая из субъединиц РНК-полимеразы Хогуте принимает участие в связывании р7, гены гроА, гроВ и гроС, кодирующие соответственно, субъединицы а, р и р' были клонированы в вектор рЕТ15Ь.

Рекомбинантные субьединицы были суперпродуцированы в Е.соИ и использованы для гибридных (Х.огутде/Ксо1;)) сборок РНК-полимераз. Затем РНК-лолимеразы, представляющие собой разные комбинации субъединиц были

проверены в тесте по инициации транскрипции Т7А1 промоторного фрагмента ДНК в присутствии или отсутствие р7 и йр2 - белка фага Т7, который специфично ингибируетРНК-полимеразу Е.соИ, связываясь с-субъединицей. Результаты этого опыта представлены на рис. 2А. Только полимеразы, содержащие Р'-субъединицу Хогуте, были чувствительны к действию р7. Следовательно, р7 ингибирует инициацию транскрипции, связываясь с -субъединицей РНК-полимеразы. Затем фрагмент -субъединицы, с которым связывается р7, был определен методом давней Вестерн-гибридизации - р'-субъединицу было решено фрагментировать и определить минимальный • фрагмент, который пометится при инкубации с меченым р7. Сначала сайт связывания р7 был определен с точностью до половины -субъединицы. Для этого были использованы клонированные ] - и С-концевые участки -субъединицы, граница между которыми соответствует естественному разрыву архебактериальной -субъединицы. В качестве контроля были использованы целые Р- и-£убъединицы. Результаты эксперимента, приведенные на рис. 2В пока или, что р7 связывается целой Р'-субъединицей (что

согласуется с результатами, полученными при изучении химерных ферментов), а

также с ее ^концевым участком. Затем для более точного определения сайта связывания р7 этот ^концевой участок был разбит еще на несколько фрагментов. На том же рисунке видно, что при - последовательном укорочении Р'-субъединицы последний фрагмент, который метится при связывании с р7 - это фрагмент, соответствующий положениям 1-240. При усечении этого фрагмента с Оконца еще на 120 аминокислот связывание пропадает. Также не связывается с р7 фрагмент 60-240. По-видимому, р7 связывается в районе между аминокислотами 1-60 р'-субъедипицы.

А В

гт тг- ~тг~ ТГ" ~тг~ "■В" ТГ

I• 1е Ее

1« X* I а ьс ее Ее Се

— • * т л тт- * т

* ш + . --+ ш ♦ -- - ♦ • + • — +

I !!! 11

123 4 5 4 7 8

Рве 2. Рябов (ммокислот 1-60 {Г-субъеданнпы является местом связывания р7. А.

Контрольные н химерные горфермеяггы РНК полиыераз были собраны из смеси обозначенных на рисунке субъединиц, принадлежащих £со/< или Х.огугас, инкубированы с гигти кратным ыоларным избытком а7® и использованы в эксперименте по синтезу тримера СрАри на промоторном фрагменте Т7А1 в присутствии ¿р2 (дорожки 2, 5, 8, 11, 14, 17) или р7 ( дорожки 3,6,9, 12, 15,18). В. Очищенные р'-субъедииица н ее фрагменты были нанесены на 2 идентичных денатурирующих полиакриламндных геля. Один был окрашен Кумасси Я - он показан на верхней панели, белки из второго были Электра перенесены на РОВУ мембрану, которая затем была инкубирована в растворе, содержащем меченый р7 - ее радиоавтограф показан на нижней панели. С. Схематичное изображение всех использованных для картирования сайта связывания р7 фрагментов р'-субъединицы. Пептиды изображены в виде прямоугольников, те пептиды, которые метились при связывании с меченым р7, выделены серым, те, которые не метились - оставлены незакрашенными.

Р7 препятствует образованию открытого комплекса РНК-полимеразой Х.опгие. Влияние р7 на образование открытого промоторного комплекса изучалось в эксперименте по замедлению в геле меченого промоторного фрагмента . При связывании промоторного фрагмента ДНК с РНК-полимеразой образуется комплекс со значительно меньшей элекгрофоретической подвижностью, чем сам фрагмент, что

позволяет разделять в геле комплексы и свободную ДНК. В эксперименте, результаты

которого приведены на рис. 3А, открытый комплекс был получен при инкубации

промоторного фрагмента с РНК-полимеразой при 25°С в присутствии гепарина

(который разрушает закрытые промоторные комплексы и не влияет на открытые).

Рис 3. А. На рисунке приведены результаты эксперимента по

замедлению в геле меченого фрагмента ДНК,

содержащего промотор ХР* Лромогорные комплексы были получены при 25°С. Контрольная реакция не содержала белка (дорожка IX на дорожку 2 нанесен комплекс РНК-полимеразы с промоторным фрагментом, на дорожке 3 к

РНК шшимеразе был добавлен р7 после добавления ДНК, на дорожке 4 - до добавления ДНК. В. р7 ннгнбнрует реакцию абортивного синтеза специфично относительно твоя промотора. Тримерная РНК СрАрЦ была синтезирована на промоторе Т7А1, принадлежащему к классу -10/-35 (дорожка 1 - без р7, дорожка 2 - в присутствии р7) и на промоторе §а1Р1, принадлежащему к классу промоторов с удлиненной -10 областью (дорожка 3 - без р7, дорожка 4 - в присутствии р7).

Если р7 добавлялся к полимеразе после ДНК, то открытый комплекс образовывался, если до - то нет. Следовательно, р7 препятствует формированию открытого промоторного комплекса РНК-полимеразой Х.огутде, не разрушая уже сформированные открытые промоторные комплексы.

Оказалось, что р7 менее эффективен на galPl промоторе, относящемся к классу промоторов с удлиненной -10 областью, чем на промоторе Т7А1, который относится к классу -10/-35 промоторов (рис 3В).

р7 подавляет терминацию транскрипции РНК-полимеразой Х.огу7ме. Чтобы убедиться в том, что действие р7 на РНК-полимеразу исчерпывается ингибированием на стадии инициации, был изучен эффект р7 на элонгацию и терминацию транскрипции РНК-полимеразой Х.огутде. В качестве контрольного фермента была использована РНК-полимераза E.co/í Матрица представляла собой фрагмент ДНК, содержащий Т7А1 промотор и р-независимый терминатор Сначала, используя ограниченный набор субстратов, получали транскрипционные комплексы, остановленные в положении +20. Затем добавляли все субстраты в присутствии или отсутствиер7.

А

гакп -

»» - - и-4.*-

ш _»

1114

В

»» «« -I* г»—» -I»

С**»"—• иг»-»

РНКП

НТФ

I« 11 |iMMi ■ laifi •

20мср -» А _ . ai

Р7

12 3 4

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. р7 препятствует термняацин Хлгугяе РНКП. А. Тройной элонгационныЯ комплекс, содержащий 20 мерную РНК был получен с использованием ограниченного набора субстратов и ферментов Kcoli (дорожка 1) и Xoryzae (дорожка 4) на фрагменте ДНК, содержащем промотор Т7А1 и терминатор tm . Затем к комплексам были добавлены все субстраты в отсутствие ( дорожки 2 и 5 ) или в присутствии р7 (дорожки 3 в 6). В. р7 продолжает оказывать антитерминирующее действие на РНКП в присутствии терминационного фактора NusA. Транскрипционные комплексы, остановленные в положении +20 были получены так же, как в предыдущем эксперименте. Затем к комплексам были добавлены все субстраты в присутствия в отсутствие факторов ( дорожка IX в присутствии р7 ( дорожка 2), NusA (дорожка 3) или обоих факторов (дорожка 4).

Результат оказался неожиданным - во-первых, полимераза X. oryzae была способна элонгировать в присутствии р7, а во-вторых, р7 оказывал на нее специфическое антитерминирующее действие (рис. 4А). Фактор-независимые терминаторы бактерий состоят из двух необходимых элементов - шпильки и последовательности нескольких U в транскрипте. Считается, что РНК-полимераза задерживается, транскрибируя poly(dA) последовательность. Последующее формирование РНК шпильки дестабилизирует тройной комплекс, возможно, уменьшая длину РНК-ДНК гибрида и вызывая высвобождение РНК. Следовательно, р7 может действовать несколькими способами - предотвращая паузирование в терминаторной области, подавляя образование шпильки в транскрипте или влияя на стабильность РНК-ДНК гибрида. Затем было проверено, может ли терминационный фактор NusA E.coli снять антитерминирующий эффект р7. NusA усиливает эффективность терминации, способствуя образованию терминационной шпильки (Gusarov and Nudler, 2001). NusA оказывал воздействие на РНК-полимеразу X.oryzae и усиливал терминацию на tR2 терминаторе с 36 до 63 %.(рис. 4В, дорожки 1 и 3). Добавление р7 приводило к

полному исчезновению терминированного продукта как в присутствии, так и в отсутствие ]иА. Значит, р7 либо преодолевает или подавляет активность ]ЧиэА, либо

действует не на шпильку.

РнсЛ. В присутствии р7 РНК-папимераза не делает паузы в сайте термннацни. А.

Последовательность »кодирующей цепи ДНК матрицы -1« начиная со стартовой точки транскрипции. Линией над последовательностью обозначен участок, соответствующий шпильке в транскрише. Стрелками обозначены позиции относительно последнего основания, участвующего в формировании шпильки. ТП-терминированные продукты, ПП-полноразмерный продукт. В. К иммобилизованному комплексу,

полученному на этой ызггрнце н содержащему Нмерную РНКбыли добавлены нуклеотндтрифосфаш до конечной концентрации 100мкМ в отсутствие р7 (дорожки 2-4) или в присутствии р7 (дорожки 5-7). Через 20 секунд реакции были либо остановлены ( дорожки 2 и 5, обозначенные как «с+о»\ либо разделены на супернатаит (4 и 7, обозначенные как «с») и осадок (3 и 6, обозначенные как «о» )- Продукты разделены в 20% денатурирующем геле и обозначены так же, как части А.

р7 способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрибирующей полимеразы.. Для. более детального исследования механизма действия р7 на терминацию транскрипции использовались матрица, предоставленная Н.Комиссаровой, последовательность и вторичная структура транскрипта с которой изображена на рис 5А. Матрица сконструирована так, что терминатор ^ поднесен к самому началу транскрибируемой последовательности. Матричная цепь ДНК содержала на 5'-конце биотин, что позволяло получать и изучать иммобилизованные на зернах стрептавидиновой агарозы остановленные элонгационные комплексы. Прежде всего было проверено действие р7 на образование терминационной шпильки в транскрипте. В основании стебля шпильки терминатора ^ находятся гуанозины. Судить о том, сформирована шпилька или нет, можно по чувствительности этих гуанозинов к действию РНКазы Т1, поскольку этот фермент специфически расщепляет по остаткам гуанозинов только одноцепочечную РНК. Если шпилька сформирована, то гуанозины образуют Уотсон-Криковские пары с расположенными в противоположной цепи цитозинами и устойчивы к действию РНКазы Т1, если шпилька не образовалась, то РНК расщепляется. При добавлении в реакцию ограниченного набора субстратов

полимераза останавливалась в позициях h -2, h +5 и h+8 относительно шпильки (hairpin), и к остановленному комплексу добавлялась РНКаза Т1. Никакого различия в наборе продуктов расщепления транскрипта с р7 от комплексов без р7 не наблюдалось Таким образом, не удалось показать, что р7 влияет на образование терминационной шпильки в транскрипте (данные не приведены).

Затем было проверено действие р7 на высвобождение транскрипта из тройного комплекса в точке терминации. Для этого на той же матрице был получен остановленный элонгационный комплекс, содержащий 13-мерную РНК. Затем к комплексу добавлялись все нуклеотидтрифосфаты и через 20 секунд реакционная смесь делилась на супернатант и осадок.

На рис 5В заметно, что РНК-полимераза X.oryzae, (как и полимераза E.co!i по литературным данным) терминировала в положениях h+7 и h+8 относительно шпильки, то есть часть транскриптов по достижении этого размера высвобождалась из комплекса с полимеразой и переходила в раствор. Полимеразы, преодолевшие положение терминации, доезжали до конца матрицы, и полноразмерные транскрипты соответствующего размера практически полностью переходили в раствор. В присутствии р7 РНК-полимераза не делала пауз в положениях h+7 и h+8, а проезжала дальше по матрице на 1-3 положения. Доля терминированных в нужном положении транскриптов ничтожна. Было сделано предположение о том, что р7 способствует заплетанию ДНК-дуплекса позади транскрибирующей полимеразы, таким образом толкая ее и не давая остановиться в точке терминации. Если эта гипотеза верна, то можно предполагать, что во-первых, связанный с полимеразой р7, подталкивая ее, дестабилизирует элонгационный комплекс, что в условиях отсутствия субстратов должно приводить к диссоциации РНК из состава комплекса; во-вторых, р7 не должен действовать на комплексы, в которых заплетание дуплекса ДНК непосредственно позади транскрипционного пузыря невозможно. Эффект р7 на стабильность тройных комплексов был изучен на нуклеиновокислотных скаффолдах, структура которых изображена на рис. 6А. Матричная цепь ДНК несла на 5' конце биотин, что позволяло связывать ее со зернами стрептавидин-агарози. РНК была радиоактивно помечена по 5'- концу. Скаффолд1 имитировал нормальный элонгационный комплекс, в нем РНК образует с матричной ДНК гибрид длиной в 9 нуклеотидов, нематричная и матричная цепи ДНК образуют дуплекс позади транскрипционного пузыря. Скаффолды 2, 3, 4, 5, содержали в ДНК позади транскрипционного пузыря 1, 2, 3 или 4 неспаренных основания. Скаффолд 6 отличался от скаффолда 1 тем, что у него отсутствовала

нематричная цепь позади транскрипционного пузыря. Скаффолды были собраны, к половине комплексов был добавлен р7, затем комплексы инкубировались в буфере, содержащем 1М №С1, потом реакционная смесь разделялась на супернатант и осадок, и эти фракции наносились на ПЛАТ.

Рис.6. Влияние р7 на стабильность элонпшмоннш комплексов различной струиггуры. А.

Схематичное изобажение использованных в

эксперименте нукленновокяслотных скаффоддов. РНК

изображена в виде жирной линии, ДНК- в виде тонких, комплементарные основания - в виде черточек, нехомплеменгарные- в виде жирных блоков. Показана только часть ДНК вокруг транскрипционного пузыря. Общая длина ДНК - 45 оснований. В. Гистограмма, отражающая сравнительную стабильность данных тройных комплексов в присутствии р7. Стабильность оценивалась как количество меченой РНК, оставшейся в составе тройного комплекса после получасовой инкубации комплекса в 1М ЫаС1 по сравнению с начальным количеством РНК. На диаграмме приведены отношения стабильности комплексов с р7 к собственной стабильности комплексов, без р7.Скаффолды были собраны, к половине комплексов был добавлен р7, затем комплексы инкубировались в буфере, содержащем 1М ЫаС1, потом реакционная смесь разделалась на супернатант и осадок, и эти фракции наносились на ПЛАТ.

Результаты эксперимента приведены на рис. 6В, где относительная стабильность комплексов представлены в виде гистограммы. В этом эксперименте было показано, что наиболее устойчивы в присутствии р7 скаффолды без нематричной цепи позади транскрипционного пузыря, а также с транскрипционным пузырем, удлиненным еще на 4 основания позади полимеразы. Поскольку в точности неизвестно, сколько основании ДНК должно быть неспарено, чтобы предотвратить заплетание дуплекса позади транскрибирующей полимеразы, влияние р7 на терминацию было изучено на матрицах с различным расстоянием от задней границы РНК-ДНК гибрида до заднего дуплекса ДНК. Дм этого были выбраны структуры, собственная стабильность которых была одинаково высокой по результатам предыдущего опыта. Опыт был поставлен на нуклеиновокислотных скаффолдах, структура которых изображена на рис 7А. Скаффолд 1 был контрольным, скаффолд 2 - имел 2 неспаренных основания, скаффолд

3 - 4. На рис 7 показан радиоавтограф геля, в котором были разделены продукты транскрипции. Показано (рис. 7В), что на разных матрицах в присутствии р7 распределение транскриптов вокруг точки терминации было разным - если на матрице с нормальным задним дуплексом с одинаковой эффективностью образовывались продукты И+7, И+8, Ь+9 и И+10, то на матрице с 3мя неспаренными основаниями доминировал продукт И+8 на фоне присутствия трех остальных, а на матрице с 4мя неспаренными основаниями -только И+7 и И+8, причем их относительные количества было такими же, как и без р7. Эти данные полностью согласуются с гипотезой о том, что р7 способствует заплетанию заднего дуплекса ДНК.

.... - чи

h-S

vt_

u

Г штшиаитгаллшлкгипяслшх I111 ■ »ттавпаклоитАсмаишс ■ гсслташасшщ.! i |ц|ц.тцтсбс)|1хй|тлтптата»тст«тгеи »

yCCTATCAATt^T-A<*XAAACG*r.CATTAt^nrr^^V4AAATAAACCTACX3rn^:ATCrCTACrrG •

CGCCUGCUCC 1

В

кпрш» ' комжл< шл2 Ш4

Р7 • 1 ♦ -

ПП-

ТП-

rm*

Рнс.7. p7 способствует зшишю заднего дуплекса ДНК. А. Последовательности РНК, матричной и нематричных цепей ДНК скаффоддов, использованных для опыта в части В. Линией над последовательностью обозначен участок, соответствующий шпильке в транскрипте. Стрелками обозначены позиции относительно последнего основания, участвующего в формировании шпильки. TIl-тсрминированные продукты, ПП-полноразмерный продукт. Некомллеменгарные основания в нематричной цепи ДНК обведены черными прямоугольниками В. К собранным скаффоддам были добавлены нуклеотцдгрифосфаты в отсутствие(дорожкн 1, 3, 5 ) или в присутствии р7 ( 2, 4, 6 ). Скаффолды обозначены следующим образом - компл - тот, где цепи ДНК полностью комплементарны друг другу, mm2 ( mismatch 2) - 2 неспаренггых основания в ДНК, mm4 - 4. Продукты реакции разделены в 23% денатурирующем ПААГ.

Р7 участвует в регуляции транскрипции генома фага Хр10. Геном бактериофага Хр10 представляет собой линейную дцДНК. Размер генома около 43000 пар оснований, в каждой цепи ДНК закодирована примерно половина вирусных генов. Левое плечо

содержит гены, транскрипция которых направлена вправо, а правое плечо - в основном гены, транскрибирующиеся влево. Между двумя кластерами генов, транскрибирующихся в противоположных направлениях, находится область размером примерно в 1000 ( с 42097 по 43181) п.о., внутри которой отсутствуют явные рамки считывания. В этой области было обнаружено несколько консенсусных последовательностей потенциальных промоторов бактериальной РНК-полимеразы. Чтобы картировать сайты связывания бактериальной полимеразы внутри предполагаемой регуляторной области, фрагмент ДНК, соответствующий позициям 42903-43267, был амплифицирован в ходе ПЦР и использован для КМпО4 футпринтинга. Этот метод позволяет определить положение реакционно способных тиминов в области локального плавления ДНК. В присутствии очищенной РНК-полимеразы Х.огугае. на ДНК появлялись 3 таких расплавленных области (рис. 8A). Было определено положение этих областей в последовательности регуляторной области. Оказалось, что эти области совпадали с расположением -10 консенсусного элемента промотора. 3 найденных промотора были обозначены Р1-РЗ. Затем было подтверждено направление транскрипции с промоторов этой регуляторной области. Для этого был поставлен опыт по транскрипции целого фрагмента ДНК, который использовался для футпринтинга, а также его 2 половин, внутри одной из которых расположены предполагаемые ранние, внутри второй - поздний промотор. Судя по результатам, показанным на рис. 8С , можно заключить, что транскрипция с промоторов Р1 и Р2 направлена влево (и эти промоторы ранние), а транскрипция с промотора РЗ направлена вправо (и он поздний). Эффект, который р7 оказывает на инициацию транскрипции, зависит от типа промотора (рис.ЗВ). Заманчиво предположить, что р7 может переключать транскрипцию с одного типа промоторов на другой и позволять полимеразе читать поздние гены, преодолевая терминаторы. Если это так, то транскрипция с промоторов поздних генов должна быть устойчива к действию р7. Действительно, р7 ннгибирует образование открытого комплекса на промоторах Р1 и Р2 и практически не влияет на РЗ. Таким образом, ориентация и свойства промотора РЗ позволяют считать его промотором поздней транскрипции. Интересно, что все 3 промотора регуляторной области относятся к промоторам с удлиненной -10 областью и содержат характерный мотив TG перед собственно -10 областью. РЗ дополнительно имеет и -35 консенсусный элемент.

в

ГС А 37 •

»

РНКП с -т +

Р7 -м-

Р3^£

пр

"Г1

[П1П

I::

пав яп»

матриа 1 2 3 М

р7 -I*

• —

I 2 3 4 5 6 7

Р1 ря 11 РЯ _С_

1 23 4 5 б

Рис.8. Обняружение промоторов, узнаваемых РНКП Х-Огу^е в межгенном сегменте генома фага Хр10. А. Фрагмент ДНК, соответствующий позициям генома 42903-43267, был инкубирован с полимеразой при 37° С (дорожки 3-5) или при 0* С (дорожка 6), в присутствии р7 (дорожка 4). На дорожке 5 в пробу был добавлен гепарина после образованна промоторного комплекса. На дорожке 2 представлена эта ДНК без полимеразы, на дорожке 1 - она же, расщепленная по остаткам аденина и гуанина. После образования комплексов к пробам на дорожках 2-6 был добавлен КМпО«. Продукты реакции были разделены в ПЛАТ и выявлены при радиоавтографии геля. В. Последовательность генома фага в окрестностях предполагаемых промоторов. Приведена последовательность нематричной цепи ДНК промоторов Рь Ра и Р). Чувствительные к действию КМпО« тимнны (или аденины, напротив которых находятся чувствительные тимины в комплементарной цепи) выделены курсивом. Ниже приведены консенсусные последовательности -10 и -33 областей областей промоторов ЕсоН. С. На промоториых фрагментах фага Хр)0, схематично представленных на рисунке, была поставлена реакция транскрипции в присутствии (дорожки 2,4,6) или в отсутствие р7 (1,3,3). Матрица 1 идентична той, которая использовалась для КМпО« футттринтинга. На дорожку 7 в качестве маркера длины нанесены продукты транскрипции известного размера (терминированный продукт 77 оснований, полноразмерный - 97), полученные на промоторном фрагменте Т7А1 с терминатором

Почему р7 в разной степени ингибирует образование открытого комплекса на этих 3 промоторах, принадлежащих, по существу, к одному классу? Для ответа на этот вопрос реакция футпринтннга была повторена в условиях, ослабляющих силу взаимодействия РНК-полимеразы с промотором, а именно, в присутствии конкурентного ингибитора гепарина и при низкой температуре. Результаты этого эксперимента, представленные на рис. 8А пока и.1161 ют, что, образование комплекса на Р1 подавляется при низкой

температуре, а на Р2 - в присутствии гепарина. И только РЗ относительно устойчив при любых из использованных условий. По-видимому, чувствительность к действию р7 тем выше, чем меньше собственная стабильность промоторного комплекса. Полученные данные позволяют частично понять принципы регуляции транскрипции фагового генома и приписать р7 некоторые функции. Вероятно, р7 переключает бактериальную РНК-полимеразу на транскрипцию поздних генов и позволяет ей транскрибировать структурные гены, преодолевая терминаторы по ходу транскрипции. Глава2. Изучение молекулярного механизма ннгибирования РНК-полимеразы микроцином J25.

Недавно группой аргентинских ученых был открыт микроцин J25 - новый ингибитор активности РНК-полимеразы E.coli (Delgado et aL, 2001). Микроцин J25 - кодируемый плазмидой ииклопептид, состоящий из 21 немодифицированного аминокислотного остатка. Плазмида содержит 4 гена (mcjA, -В, -С, -D), необходимых для синтеза и секреции микроцина. McjA кодирует 58 аминокислотный пептид-предшественник, продукты генов McjB и McjC принимают участие в созревании пептида. McjD кодирует белок, придающий бактериям устойчивость к антибиотику. Последовательность этого белка гомологична последовательности ABC транспортеров - АТРаз, производящих энергию для трансмембранного транспорта молекул. Предполагается, что mcjD, участвуя в активной секреции антибиотика, позволяет поддерживать его внутриклеточную концентрацию ниже токсического уровня. Микроцин синтезируется бактериями в стационарной фазе роста в бедной среде, таким образом давая производящим его бактериям селективное преимущество в борьбе за субстраты. У E.coli было найдено большое количество спонтанно возникших мутаций устойчивости к микроцину J25. Большинство из них картировано в генах, кодирующих компоненты клеточной оболочки. (Salomon and Farias, 1995). По-видимому, эти мутации уменьшают проницаемость клеточной стенки для микроцина, и он практически не проникает в клетки этих мутантов.

Неожиданно одна из мутаций устойчивости была обнаружена в гене, кодирующем субъединицу РНК-полимеразы. Этот факт позволил сделать предположение о том, что именно РНК-полимераза является внутриклеточной мишенью микроцина, и ингибирование этого фермента определяет бактерицидное действие микроцина. Действительно, активность РНК полимеразы E.coli in vitro (в тесте по включению меченого УТФ в кислотонерастворимую фракцию транскриптов) уменьшалась в

присутствии микромалярных концентраций микроцина (Delgado et al, 2001). Наши аргентинские коллеги не изучали фермент с заменой Т9311 из-за отсутствия-технических средств.

РНК-полимераза является мишенью действия микроцина J25. РНК-полимераза из клеток микроцин-устойчивого штамма SBG231 была выделена в нашей лаборатории и использована для опытов по in vitro транскрипции. Результаты эксперимента (данные не приведены, см также рис. 7) показали, что мутантный фермент действительно устойчив к микроцииу. Было сделано предположение о том, что положение 931 является частью сайта связывания микроцина, и замена аминокислоты в этом положении нарушает связывание. Если это верно, то можно найти дополнительные мутации устойчивости к микроцину в районах РНК-полимеразы, пространственно близких к месту первой обнаруженной мутации.

Мутации устойчивости к микроцнну J25 расположены • в консервативных сегментах G. G' и F В'-субьеднницы. Отбор мутантов, устойчивых к действию микроцина, производился следующим образом - плазмидами, экспрессируюшими мутантный rpoC трансформировались клетки чувствительного к микроцину штамма Е.сой DH5ca. После подращивания с рскомбинантных колоний делалась реплика на чашку со средой, содержавшей микроцин. Из клеток устойчивых клонов выделялась плазмидная ДНК. Эта ДНК повторно трансформировалась в клетки штамма DH5a, чтобы подтвердить, что устойчивость клеткам придает плазмидный ген rpoC. В качестве чувствительного и устойчивого контролей использовалить плазмиды, экспрессируюшие соответственно гроС дикого типа и гроС с мутацией, приводящей к замене T93II.

Сначала мутации устойчивости попробовали найти в положениях, непосредственно примыкающих к положению 931, где картируется первая из известных мутаций устойчивости. 4 кодона гроС - 928, 929,930 и 931 были подвергнуты исчерпывающему комбинаторному ПЦР-мутангенезу. Микроиин-устойчивые замены были получены только в положении 931 - T931N и T931L. В положениях 928-930устойчивых мутантов получить не удалось. Этот результат может объясняться либо тем, что аминокислотные остатки в этих положениях не принимают участия в связывании микроцина, либо тем, что РНК-полимеразы с заменами в этих положениях неактивны. В поисках микроцин-устойчивых мутантов с заменами справа от сайта первоначальной мутации было проверено еще несколько плазмид. Плазмиды pRW308 с мутациями в гроС,

приводящими к заменам Т934М и И936У, и к двойной замене К933И Л946У были получены ранее для отбора мутаций, изменяющих терминационные свойства РНК-полимеразы (WeiIbaecher е! а1., 1994) и предоставлены И.Толухоновым. 2 другие -0921Р и Е9358 - сайт специфическим мутагенезом позиций 921 и 935 (Ер$Ма1п е! а1.,2002) и предоставлены В.Эпштейном. Заменой устойчивости оказалась только замена Б9358.

В опубликованной структуре фермента ТЪг 931 расположен в основании в-петли и непосредственно контактирует с аминокислотными остатками в положениях 1137 и 1138. Эти кодоны в плазмидном гене гроС были подвергнуты исчерпывающему комбинаторному мутагенезу, при этом был обнаружен один устойчивый мутант -

L1138T. Еще одна мутация устойчивости - Gl136D - была найдена среди полученных error-prone ПЦР клонов библиотеки, первоначально предназначавшейся для отбора мутаций гроС, изменяющих терминационные свойства РНК-полимеразы и предоставленных Р.Ландиком (R.Landick). Для поиска мутаций в районе F была использована предоставленная Р.Ландиком библиотека полученных error-prone ПЦР плазмид, экспрессирующих Р'-субъединицы с заменами в положениях 544-875. Были найдены следующие замены : S733P, L783G, а также двойная замена L746P F773I. Таким образом, сайт связывания микроцина был обрисован. Мутации устойчивости были найдены в консервативных районах G, G' и F -субъединицы. Аминокислотные остатки, замены которых приводят к устойчивости к антибиотику, располагаются на внутренней поверхности вторичного канала, ведущего от каталитического центра к поверхности фермента. При моделировании возможного комплекса РНК-полимеразы с микроцином, пептид стерически вполне укладывается у входа во вторичный канал. На основе структурных данных вторичному каналу приписывается несколько функций. Предполагается, что он направляет субстраты в активный центр, а также принимает З'-концевой участок РНК в составе арестованного тройного комплекса (Komissarova and Kashlev, 1997). Показано, что З'-концевой нуклеотид транскрипта сшивается с районом G (Markovtsov et al., 1996), образующим стенку канала. Факторы расщепления транскрипта GreA и GreB стимулируют эндонуклеазную активность РНК-полимеразы, действуя тоже через вторичный канал (Koulich et al.,1997).

Если микроцин связывается у входа и блокирует вторичный канал , то изучение воздействия этого антибиотика на активность РНК-полимеразы поможет прямо подтвердить или опровергнуть гипотезы о роли вторичного канала в функции РНК-полимеразы. Возможны и другие предположения о механизме действия микроцина - он может алостерически связываясь, изменять константы связывания субстратов или влиять на скорость катализа. Действие микроцина было изучено в наборе функциональных тестов, отражающих активность РНК-полимеразы на различных стадиях транскрипционного цикла.

Микроцин ингибирует присоединение нуклеотида по смешанному типу. Затем была поставлена задача определить тип ингибирования полимеразной реакции микроцином по отношению к субстратам реакции - нуклеотидтрифосфатам. Знание типа ингибирования позволило бы подтвердить или опровергнуть гипотезу о том, что

наблюдаемые эффекты микроцина связаны с тем, что он препятствует доступу субстратов через вторичный канал. Если ингибирование носит конкурентный характер, то это означает, что микронин обратимо связывается с сайтом связывания субстрата или закрывает вход во вторичный канал. Если ингибирование неконкурентное, то сайты связывания микроцина и субстрата с ферментом не перекрываются. Для определения типа ингибирования необходимо оценить эффект микроцина на один акт реакции - включение в транскрипт одного нуклеотида.

Сначала тип ингибировання был определен для реакции абортивного синтеза, когда димер удлиняется на один нуклеотид, и синтезирующийся тример высвобождается из комплекса с полимеразой, которая может синтезировать следующий продукт. Как показано на рис. 10, микроцин влиял и на Км и на Ушах, то есть реакцию абортивного синтеза микроцин ингибировал по смешанному типу, что по-видимому, свидетельствует о том, что сайты связывания субстрата и микроцина перекрываются, но не полностью.

Рве 10. Млерошш ¿25 внгябнрует полнмеразную реакцию по смешанному механизму относительно сутстрата реакции. А. График зависимости количества тримерного продукта СрАрЦ синтезированного РНК полимеразой на промоторном фрагменте Т7А1 в отсутствие или в присутствии указанных концентраций микроцина Й5 от концентрации УТФ. Количественные данные были получены при обсчете ПААГ геля, в котором были разделены продукты реакции, в программе Ьго@еОиапи В. График, построенный по тем же данным в обратных координатах.

Микроцнн уменьшает скорость элонгации транскрипции. Эффект микроцина на элонгацию изучался в транскрипции фрагмента ДНК, содержащего Т7А1 промотор и транскрибируемый. участок длиной 170 нуклеотидов и терминатор Сначала, используя ограниченный набор субстратов, получали остановленный комплекс, содержащий 20-мерную РНК. Потом реакционная смесь делилась на 2 части, к одной

из которых добавлялся микроцин. Затем в реакцию добавлялись все 4 нуклеотидтрифосфата и через определенные промежутки времени отбирались аликвоты. В присутствие микроцина лолноразмерный продукт транскрипции появлялся позднее, чем в контроле без микроцина (рис. 11А), ср. дорожки 5 и 12. И, по-видимому, такое общее замедление происходит в основном за счет увеличения продолжительности пауз с коротким временем полужизни. Такие паузы РНК полимераза делает при транскрипции на любой матрице и они, по-видимому, являются особенностями, внутренне присущими процессу транскрипции как таковому. Микроцин не вызывал появления новых пауз, но увеличивал продолжительность существующих, которые РНК-полимераза делает, транскрибируя данную ДНК.

Микроцин уменьшает скорость пирофосфоролиза. В присутствие пирофосфата РНК-полимераза осуществляет реакцию, обратную реакции полимеризации -отщепляет нуклеотищрифосфаты с 3'-конца транскрипта (Кийй е! а1.,1994). Реакция пирофосфоролиза была поставлена на остановленном комплексе с 12 мерной РНК, синтезированной на Т7А1. К части комплексов добавлялся микроцин, а затем ко всем —

100 мкМ пирофосфат. Через промежутки времени, обозначенные на рисунке 11В, из реакционной смеси отбирались аликвоты. В отсутствие микроцина наблюдалось постепенное укорочение первоначальной РНК и накопление 7 мерного продукта. Более короткие продукты высвобождаются из тройного комплекса с полимеразой (Korzheva et al.,1999) и поэтому не могут участвовать в реакции и укорачиваться дальше. В присутствии микроцина скорость реакции пирофосфоролиза значительно меньше. Микроцин замедляет впадение ТРОЙНОГО элонгационного комплекса в арестованное состояние Для изучения влияния микроцина на арест транскрипции использовался тройной комплекс, полученный на Т7А1 промоторе, содержащий 27 мерную РНК. Показано (Komissarova and Kashlev 1997), что такой комплекс чрезвычайно склонен впадать в арестованное состояние. В эксперименте был получен 27мер, затем к части комплексов был добавлен микроцин, реакционные смеси инкубировались при 37°С, и через промежутки времени, указанные на рис. ЮЛ, оттуда отбирались аликвоты.

Ряс. 12. Мпфоцшн J2S вагвбярует ввадеаве элонгяциовного комплекса в арестованное состояние. А. Тройной комплекс, содержащий 27 мерную РНК был получен при шагания по матрице, содержавшей промотор T7AI с использованием ограниченного набора субстратов. Затем комплексы были инкубированы при 37е С обозначенное время, поп»< к ним добавлялся ЦТФ в присутствия ( дорожки frS ) или в отсутствие (дорожки 3-S ) микроцина J25, что позволяло РНК, З'конец которой еще находился в активном центре фермента, удлиниться до ЗОмера. На дорожке 1 показана 27 мерная РНК, на дорожке 2 - 30-мерная РНК, полученная и 27 мерной в комплексе, который не инкубировался 37е С. В. График, построенный по количественные данным, которые были получены при обсчете радиоавтографа геля с использованием программы ImageQuant

К этим аликвотам добавлялся ЦТФ, что позволяло той доле транскриптов, которая еще не впала в арест, удлиняться до 30 нуклеотидов. На графике, приведенном на рис. 12В, видно, что без микроцина к 8 минуте инкубации 70% комплексов уже арестована, тогда как с микроцином за то же время только 12% комплексов впало в арест.

Микроцин подавляет стимулируемое ОтеА Фактором растепление т ранскрипта и

не влияет на собственную эндонуклеазную активность РНК-полимеразы. ПРИ определенных условии РНК-полимераза сдвигается по матрице назад против хода транскрипции, при этом 3' конец транскрипта теряет связь с каталитическим центром фермента и просовывается во вторичный канал. Это приводит к аресту транскрипции. РНК-полимераза способна осуществить эндонуклеолитическое расщепление транскрипта, при этом образуется новый 3' конец транскрипта и полимераза возвращается к продуктивной элонгации. Реакция расщепления происходит в щелочных условиях среды, а при физиологических рН необходимы стимулирующие факторы ОтеА и ОтеБ.

Рве. 13. А. Микроом 425 подавляет эинонуклеолипчеекое растепление Транскрипта,

стимулируемое СгеА.

Транскрипционные комплексы были собраны на минимальном скаффодде, содержащем 13 мерную радиоактивно меченую РНК. Затем комплексы инкубировались в присутствие увеличивающихся концентраций СгсА без (дорожки 2-5) или с добавлением микроцина 125 (дорожки 6-1 ОХ Продукты реакции разделялись в денатурирующем ПААГ. В. Микроцин Л5 не влияет на эвдонукяеолилческое расщепление транскрипта,

осуществляемое самой

■кмнмеразой. Сдвинутый назад комплекс, содержащий 27мерную меченую РНК, поученный на промоторном фрагменте Т7А1 инкубировал« при рН 9.3 в отсутствие (дорожки 1-4) или в присутствии микрооииа ¿25 (дорожки 5-8). Продукты реакции разделялись в денатурирующем ПААГ.

Эндонуклеолитическое расщепление транскрипта, вызываемое ОтеА было изучено на нуклеиновокислотном скаффолде, имитирующем структуру нормального элонгационного комплекса, описанном в работе (КотгЬеуа е! а1.,2001). Скаффолд содержал 13-нуклеотидную РНК, радиоактивно меченую по 5'-концу. Под действием ОтеА от 13 нуклеотидной РНК отщеплялся 2 нуклеотидный фрагмент, нерадиоактивный и невидимый на геле, и образовывался 11 нуклеотидный продукт (рис. 13А). В присутствии микроцина реакция расщепления была практически

В

мяк ронян .125 - +

СгсА -

13мер-» Нмер-* *

1 2 3 4 5 (7 19 11

микроцин 125 - +

крема вря рН Я!

27мер-» 16мер->

12345*78

полностью подавлена. В щелочных условиях РНК-полимераза способна осуществить эндонуклеотическое расщепление транскрипта без вспомогательных факторов. На рис. 13В приведены результаты эксперимента по расщеплению 27мерной РНК в составе арестованного комплекса при рН 9,5. При инкубации комплекса при 37°С в щелочных условиях от 27 мерной РНК отщеплялся фрагмент длиной 11 нуклеотидов и образовывался 16 мерный продукт. Микроцин не влияет на эту реакцию. Результаты можно интерпретировать следующим образом - когда РНК полимераза сдвинулась назад по матрице сравнительно недалеко и из вторичного канала высовывается маленький кончик транскрипта ( как в случае 13мерной РНК ) микроцин может связаться у выхода из канала и не дать связаться фактору GreA, подавляя расщепление. В случае 27мерного арестованного комплекса, когда полимераза сдвинулась назад далеко, торчащий из канала фрагмент РНК велик настолько, что препятствует связыванию микроцина, поэтому реакция расщепления РНК в таком комплексе не подавлена в присутствии микроцина.

Структура микроцина представляет собой не кольцо, а лассо. В последнее время несколькими группами были получены и опубликованы (Wilson et al.,2003; Bayro et al.,2003; Rosengren et al.,2003) данные, позволившие опровергнуть принятую до недавнего времени модель структуры микроцина. Первым фактом, породившим сомнения в истинности существующей структуры было то, что синтетический циклопептид, полученный и любезно предоставленный Даусоном (Dawson), оказался неактивен in vivo (данные не приведены) и in vitro (рис.14). На основании анализа данных по масс-спектроскопии и ЯМР- спектроскопии природного микроцина группами Дарста (Darst) и Мьюера (Muir) было выдвинуто предположение о наличии амидной связи между N-концевым остатком Gly и ^-карбоксилом Glu8. To есть по этой новой модели микроцин представляет собой не кольцо, а лассо. В ходе совместных усилий лабораторий Северинова и Дарста по разрешению структуры микроцина мной была проверена in vitro активность производных структуры в отношении РНК-полимеразы E.coli. Синтетический циклопептид с природной последовательностью был предоставлен Даусоном, синтетический циклопептид с заменой Serl8Cys, синтетический линейный пептид и синтетический лассовидный предоставлены Дарстом. Расщепленный термолизином продукт был получен мной. На рис.14 приведены данные по активности всех проверенных в работе пептидов различной структуры.

1 2.3456789 1011

Очевидно, что только дикий микроцин, а также продукт расщепления термолизином, активны по отношению к РНК-полимеразе.

По новой модели ковалентная структура микроцина представляет собой все-таки лассо, но природный микроцин свернут таким образом, что хвост оказывается просунутым в кольцо, причем, учитывая данные об исключительной стабильности микроцина, эта структура чрезвычайно устойчива. Предполагается, что боковые группы расположенных на конце этого хвоста остатков Phe и туг, находящиеся в одной плоскости и по разные стороны кольца,, торчат в разные стороны и играют роль своеобразных распорок, мешающих свободному движению хвоста относительно кольца.

Изучение структуры и механизма созревания микроцина может привести к открытию новых интересных ферментативных механизмов, а также позволит разработать новые более эффективные производные на его основе.

Выводы.

1) Белок р7, кодируемый бактериофагом Хр10, связывается с РНК-полимеразой бактерии Xanthomonas oryzae и ингибирует инициацию транскрипции.

2) р7 связывается in vitro с кор и холоферментом РНК-полимеразы, с изолированной ß'-субъединицей, а также с полипептидом, содержащим аминокислотные остатки 1-240 ß'-субъединицы. При этом он не связывается с пептидом, содержащим аминокислотные остатки 60-240. Таким образом, р7 связывается с РНК полимеразой в районе 1-60 положений ß'-субъединицы.

3) р7 препятствует формированию открытых промоторных комплексов, но не разрушает уже сформированные открытые комплексы. Р7 в разной степени ингибирует транскрипцию с промоторов разного типа.

4) р7 не влияет на элонгацию и препятствует терминации транскрипции РНК полимеразой Xanthomonas oryzae. Вероятно, он способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрибирующей полимеразы либо прямо, либо опосредованно.

5) РНК-полимераза E.coli чувствительна к действию бактерицидного пептида микроцина J25. Полимераза с определенными аминокислотными заменами в районах G, G' и F ß'-субъединицы приобретает устойчивость к этому антибиотику.

6) Микроцин J25 не влияет на связывание РНК-полимеразы с ДНК. Микроцин J25 ингибирует активность РНК полимеразы на различных стадиях транскрипции, ингибируя реакции присоединения нуклеотида в абортивной инициации, пирофосфоролиза и расщепления транскрипта, стимулируемое GreA фактором. Биохимия ингибирования и ориентация положений, в которых возникают мутации устойчивости к микроцину J25, позволяют заключить, что этот пептид связывается у входа во вторичный канал и блокирует транспорт компонентов к активному центру фермента.

7) Полученные в работе данные свидетельствуют в пользу того, что структура микроцина J25 представляет собой не кольцо ( по опубликованным ранее данным ), а лассо.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

Adelman K, Yuzenkova J, LaPorta A, Zenkin N, Lee J, Lis J, Borukhov S, Wang M, Severinov K (2004) Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic microcin J25. Mol Cell. 146):753-62.

Wilson KA, Kalkum M, Ottesen J, Ynzenkova J, Chait BT, Landick R, Muir T, Severinov K, Darst SA. (2003) Stracture of raicrocin J25, a peptide inhibitor ofbacterial RNA polymerase, is a lassoed tail. J Am Chem Soc. 125(41): 12475-83.

Yuzenkova J, Nechaev S, Berlin J, Rogulja D, Kuznedelov K, Imnan R, Mushegian A, Severinov K. (2003) Genome ofXanthomonas oryzae bacteriophage Xpl0: an odd T-odd phage. J Mol Biol. 330(4):735-48.

Yuzenkova J, Deigado M, Nechaev S, Savalia D, Epshtein V, Artsimovitch I, Mooney RA, Landick R, Farias RN, Salomon R, Severinov K. (2002) Mutations of bacterial RNA polymerase leading to resistance to microcin j25. J Biol Chem. 277(52):50867-75.

Nechaev S, Yuzenkova Y, Niedziela-Majka A, Heyduk T, Severinov K. (2002)A novel bacteriophage-encoded RNA polymerase binding protem inhibits transcription initiation and abolishes transcription termination by host RNA polymerase. J Mol Biol. 320(1 ): 11-22.

* 168 34