Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена - пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена - пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов"

на правах рукописи

БАГЛИКОВА Кермен Евгеньевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОЯЗВЕННЫХ ЭФФЕКТОВ ДЕРИВАТОВ КОЛЛАГЕНА - ПРОЛИН - И ГИДРОКСИПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХОЛИГОПЕПТИДОВ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03 00 13 - физиология

ооз

Москва - 2007

003162297

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова, Заведующий - доктор биологических наук, профессор А А Каменский

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Г Е Самонина доктор химических наук Ю А Золотарев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В Б Кошелев доктор биологических наук, Т А Гудашева

Ведущая организация: Томский Государственный Университет

Защита состоится 5 ноября 2007 г в 15 час. 30 мин на заседании диссертационного совета Д501.001 93 при Московском государственном университете им М В Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 5 октября 2007г

Ученый секретарь совета, доктор биологических наук

Б А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в гастроэнтерологии, распространенность язвенной болезни по-прежнему не имеет тенденции к снижению, а возникающие осложнения зачастую угрожают жизни больного и требуют хирургического вмешательства

Поэтому большое значение отводится проблеме поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) при воздействии на нее различных повреждающих факторов Особое внимание уделяется роли регуляторных пептидов (РП) в процессе поддержания гомеостаза СОЖ

Современные экспериментальные исследования направлены на поиск полифункциональных препаратов, в том числе и РП, воздействующих на различные патогенетические факторы, лежащих в основе патологий желудочно-кишечного тракта, в том числе и язвенной болезни, и в наименьшей мере вызывающие побочные эффекты

Данная работа посвящена изучению поддержания гомеостаза СОЖ большим кругом представителей нового класса регуляторных пептидов -глипролинов- GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp, в том числе изученные ранее GP, PG, PGP

Эндогенным источником глипролинов является коллаген, содержащий значительное количество глицина, пролина и гидроксипролина Гидролиз молекулы коллагена может приводить к образованию различных как пролин-, так и гидроксипролинсодержащих пептидов В связи с этим, представляет интерес исследование влияния широкого круга глипролинов, являющихся фрагментами коллагена, на устойчивость слизистой оболочки желудка к действию таких повреждающих факторов как этанол и стресс, а также на формирование и заживление ацетатной язвы, то есть выявление протекторных и лечебных противоязвенных свойств этих пептидов

Изучение противоязвенных эффектов глипролинов PGP, PG и GP ранее проводились, в основном, при их внутрибрюшинном введении В диссертационном исследовании мы рассматривали протекторные и лечебные противоязвенные эффекты различных глипролинов (ГП) как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном введении и изучали изменение величины и/или направленности влияний ГП на гомеостаз СОЖ

Из литературы (Tarnawski et al, 2005) известно, что язва желудка и воспаление тесно взаимосвязаны Воспаление СОЖ не просто ассоциировано с язвообразованием, но часто играет важную роль, как в появлении, так и в заживлении язв Для каждого этапа воспалительной реакции характерно преобладание той или иной клеточной популяции Так, острые этапы воспаления (альтерация и экссудация) характеризуются преобладанием активно фагоцитирующих лейкоцитов - макрофагов и нейтрофилов Размножение клеточных элементов (пролиферация) связано с активной деятельностью фибробластов, синтезирующих структурные

компоненты внеклеточного матрикса и ответственных за восстановление соединительно-тканного каркаса В связи с этим, мы провели цитологический анализ влияния глипролинов на процессы формирования и заживления хронической язвы и экспериментальный перитонит

К сожалению, в настоящее время в литературе нет точных данных о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролинов, за исключением cPG, обнаруженного в мозге крыс (Гудашева и др, 1996) До конца не изучена динамика распределения глипролинов в организме при различных способах введения и пути их деградации Возможное использование глипролинов, и, прежде всего PGP, в качестве лекарственных препаратов требует целенаправленных исследований их метаболизма

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение влияния дериватов коллагена — пролин - и гидроксипролинсодержащих олигопептидов - GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp и пептидного гидролизата коллагена (ILL К) - на гомеостаз СОЖ, выяснение противовоспалительных эффектов некоторых глипролинов, изучение метаболизма PGP и его биодеградации при различных способах введения.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи

1. В экспериментах на животных исследовать влияние GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp на устойчивость слизистой оболочки желудка к действию таких повреждающих факторов как этанол и стресс, а также на формирование и заживление ацетатной язвы, то есть выявить протекторные и лечебные противоязвенные свойства этих глипролинов

2 Сопоставить противоязвенные эффекты глипролинов при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введениях

3. Изучить противоязвенные свойства пептидного гидролизата коллагена (111 К), содержащего и некоторые исследуемые нами глипролины (PG, GP, PGP и PGHyp).

4 Определить возможность противовоспалительных эффектов глипролинов при гистологическом и цитологическом исследовании формирования и заживления ацетатной язвы, и при изучении цитологического состава брюшного экссудата крыс на модели экспериментального перитонита

5 Выяснить особенности распределение меченного тритием PGP по разным органам при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном способах введениях и его биодеградацию в крови и желудке у крыс

Научная новизна. Впервые продемонстрированы и сопоставлены гастропротекторные и лечебные свойства широкого круга глипролинов -

фрагментов коллагена - при внутрибрюшинном (в дозе 3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочном (в дозе 0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введении на трех экспериментальных моделях язвообразования этаноловой, стрессорной и ацетатной Сопоставлены противоязвенные эффекты пролинсодержащих пептидов и их гидроксипролинсодержащих аналогов Впервые проведено исследование процессов регенерации в зоне повреждения СОЖ, вызванных уксусной кислотой Обнаружена способность глипролинов уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта в период формирования и заживления ацетатной язвы, что может быть одним из механизмов, обуславливающих их противоязвенные свойства Последний эффект выявлен и для пептидного гидролизата коллагена Для PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита показано снижение воспалительной реакции организма в ответ на внутрибрюшинное введение 1 % уксусной кислоты

Впервые исследована фармакокинетика PGP в первые минуты (3-12 минуты) после его введения. Изучено распределение меченого PGP и/или его пептидных метаболитов по органам крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введениях Обнаружена наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани в желудке, превышающая в несколько раз содержание в крови и других органах, что дает возможность говорить о тропности PGP и/или его метаболитов к тканям желудка Определены пути деградации PGP в крови и в желудке при различных способах введения, основным метаболитом трипептида является GP

Практическое значение. Накопленные в течение ряда лет данные о противоязвенной активности PGP и его влиянии на различные механизмы поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка свидетельствуют о необходимости его предклинических исследований в качестве противоязвенного препарата. Профилактические и лечебные противоязвенные свойства показаны и для пептидного гидролизата коллагена Это открывает перспективы поддержания гомеостаза СОЖ и его коррекции путем применения фракций белков соединительной ткани в виде пищевых добавок

Факт накопления PGP и/или его метаболитов в желудке и обнаружение их в мозге при всех способах введения предполагает возможность корректирующего влияния глипролинов как непосредственно на слизистую оболочку желудка, так и через нервные центральные и периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на кафедре физиологии человека и животных МГУ (2003-2007), международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов 2004" и "Ломоносов 2005", IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); V и VI Славяно-Балтийском научном форуме (Санкт-Петербург,

2003 и 2004), I-П-Ш Российских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва-Санкт-Петербург-Пущино, 2003-2005-2007), V съезде гастроэнтерологов России (Москва, «Анахарсис», 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи -Дагомыс, 2005), II International conference "Neurohumoral and cellular regulatory mechanisms of digestion proccesses" (Kyiv, 2005), 29 European Peptide Symposium (Gdansk, Poland, 2006); ), XX Физиологическом съезде (Москва, 2007); межинститутской конференции молодых ученых "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды" (Санкт-Петербург, 2007); V Всероссийской конференции "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2007)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 14 - статьи.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из традиционных разделов, содержит 24 рисунка и 21 таблицу. Список литературы включает 316 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов Общий объем диссертации - 207 страниц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследуемые препараты: Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Gly, Pro-Gly-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro и пептидный гидролизат коллагена (ПГК) [Институт молекулярной генетики РАН], Gly-Hyp, Hyp-Gly [Bachem], Hyp, Hyp-Gly-Pro, Pro-Gly-Hyp [институт биоорганической химии им М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова].

I. Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена — пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов (глипролинов).

В экспериментах были использованы самцы белых беспородных крыс (этаноловая и ацетатная модели язвообразования, изучение распределения и биодеградации PGP m vivo, исследование противовоспалительной активности глипролинов) и крысы линии Wistar (стрессорная модель вызова язв) массой 200-250 грамм. Во всех случаях перед экспериментом животные подвергались 18-часовой пищевой депривации, а в случае этаноловой модели язвообразования лишались еще и воды Все эксперименты с животными выполнялись в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларации о гуманном отношении к животным

Используемые методы повреждения СОЖ{Рис. 1).

-этаноловая модель - внутрижелудочное введение 96° этанола в объеме 1 мл/200 г веса животного Исследуемые пептиды вводили за час до ульцерогенного фактора в объеме 0,5 мл/200г веса животного внутрибрюшинно (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочно (0,37 и 3,7

мкмоль/кг) Умерщвление животных осуществляли через час после введения этанола,

-стрессорная модель - 30-ти минутное неизбегаемое плавание при tBOiu=21-22°C. Исследуемые пептиды вводили за час до стресса пр той же схеме, что и на этаноловой модели язвообразования Животных умерщвляли через час после окончания действия стрессогенного фактора;

-ацетатная модель - аппликация ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка по методу Окабе (Okabe et al, 1971) Пептиды вводили один раз в день в течение трех дней, начиная со дня аппликации внутрибрюшинно (3,7 мкмоль/кг) (исследование влияния глипролинов на формирование ацетатной язвы) и с 4-6-й дни после вызова ацетатной язвы внутрибрюшинно (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочно (3,7 и 0,37 мкмоль/кг) на фоне уже сформировавшейся язвы (исследование влияния глипролинов на заживление язвы) Умерщвление животных осуществляли на 4-й или 7-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты.

Во всех экспериментах с вызовом повреждений СОЖ животные контрольной группы получали соответствующие объемы физиологического раствора Анализ повреждений в желудках проводили сразу после умерщвления животных Площадь повреждений подчитывали с помощью бинокулярной лупы с окулярмикрометром Противоязвенное действие препарата оценивали по отношению площади повреждений у опытных животных к площади повреждений у контрольных крыс в процентах В связи с тем, что в экспериментах на стрессорной модели язвообразования в контрольных группах наблюдался значительный разброс исходных данных, мы нормировали все значения (каждое значение контрольной и опытной группы делили на среднюю, принятую за 100%, величину контроля и умножали на 100%) II. Выяснение противоязвенных эффектов пептидного гидролизата

коллагена.

Исследование противоязвенных эффектов пептидного гидролизата коллагена (ПГК) проводили на тех же моделях язвообразования На этаноловой и стрессорной модели вызова язв ПГК вводили внутрижелудочно в дозе 0,1 и 1 мг/кг в объеме 0,5 мл/200 грамм На ацетатной модели ПГК вводили внутрибрюшинно и внутрижелудочно в дозе 1 мг/кг с 4-6-й дни после аппликации ледяной уксусной кислоты на фоне уже сформировавшейся язвы

III. Исследование противовоспалительной активности глипролинов и пептидного гидролизата коллагена.

III I Цитологическая оценка влияния PGP, PG и GP на формирование аиетатной язвы

После определения площади язвы ткань в районе язвенного дефекта разрезали по средней линии на 2 части Одну часть фиксировали в 10% забуференном формалине После фиксации препарат заливали парафином,

делали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином Вторую часть язвы использовали для получения цитологических препаратов На чистое обезжиренное стекло прикладывали различными участками поверхности язвы, 30 минут высушивали на воздухе, а затем фиксировали в смеси Никифорова (20-30 мин), окрашивали гематологическим красителем по Романовскому-Гимза Полученные препараты использовали для качественной и количественной оценки степени воспаления в зоне язвенного дефекта. В каждом препарате анализировали 100-200 клеток лейкоинфильтрационного компонента

III 2 Гистологическая и цитологическая оценка влияния исследуемых глипролинов и пептидного гидролизата коллагена на заживление ацетатной язвы

Из 3-4-х желудков для каждой серии опытов со средними значениями повреждения вырезали ткань с язвой и фиксировали в растворе Карнуа (6 частей 70% этанола. 3 части хлороформа 1 часть ледяной уксусной кислоты), который готовили непосредственно перед применением. Спустя два часа препарат помещали в 70% раствор этилового спирта Резку на микротоме вдоль язвы (толщина 5 мкм) и окрашивание препаратов гематоксилин-эозином по стандартной методике осуществляли в НИИ Морфологии человека РАН Каждый срез был исследован по качественным и количественным гистологическим характеристикам, таким как клеточный состав (макрофаги, нейтрофилы и фибробласты) и стадия воспаления, а также архитектура СОЖ Подсчет макрофагов, нейтрофилов и фибробластов проводили при увеличении хЮО под иммерсией с помощью микроскопа LOMO Микмед-1, так, чтобы суммарное количество клеток было равно 100 Микрофотографии гистологических препаратов делали с помощью специальной фотоустановки OLYMPUS при увеличении хЗОО или хбОО

III 3 Исследование противовоспалительной активности PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита

Острую экссудативную реакцию (перитонит) у крыс (после 18-часового голодания) вызывали внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты (1мл/100г массы тела) Исследуемые препараты и физиологический раствор вводили за 1 час до введения раствора уксусной кислоты Через 3 часа после введения уксусной кислоты у умерщвленных животных вскрывали брюшную полость и собирали экссудат В экссудат добавляли лимоннокислый натрий из расчета 1г/1л выпотной жидкости, чтобы предотвратить свертывание и захват в сгусток клеточных элементов (Кост, 1975) Экссудат центрифугировали («Jonan», 3500 об/мин), из осадка готовили мазки, красили и сушили на аппарате Неша-Тес 2000 фирмы Bayer. Окрашенные препараты просматривали на микроскопе (Zeiss Axiolab) с малым увеличением (объектив хЮО, окуляр хЮ) с иммерсионной системой (терпеновое масло) Микроскопическое исследование проводили, подсчитывая процентное соотношение

отдельных видов лейкоцитов В расчет брали соотношение количества нейтрофилов, плазмоцитов, макрофагов и эозинофилов

IV. Изучение распределения и биодеградации PGP в организме крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введении.

Получение меченого PGP

Меченый тритием PGP (f3H]PGP) был синтезирован в Институте Молекулярной Генетики РАН при использовании реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), происходящей в твердых органических соединениях под действием спилловер-водорода (СВ)

Подготовка образцов для проведения хроматографического анализа биодеградации меченых пептидов

[3H]PGP (1мКи) вводили внутрибрюшинно, внутрижелудочно, внутривенно и интраназально из расчета 1мКи на животное в объеме 200 микролитров Животных умерщвляли через 3, 6 и 12 минут после введения пептида Кровь собирали из яремных вен, мозг, тело желудка, сердце, часть печени и почки промывали в охлажденном физиологическом растворе, подсушивали фильтровальной бумагой и сразу замораживались в жидком азоте Собранные образцы тканей, предварительно взвесив, гомогенизировали в 10мл ацетонитрила, содержащего 1% трифторуксусной кислоты и центрифугировали в течение 30 минут (8000об/мин) Полученный супернатант высушивали при температуре 40°С в роторном испарителе Упаренные образцы заливали 1 мл метанола и откручивали на малой центрифуге в течение 15 минут Для сцинтилляционного анализа использовали 10 микролитров образца, которые добавляли к 5 мл сцинтиллятора Ready Gel, и определяли уровень радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике Beckman LS-9800 Процент от введенной радиоактивности рассчитывали на 1 грамм ткани органа

Анализ биодеградации пептидов с использованием ВЭЖХ Методика определения содержания меченого пептида и его метаболитов основана на определении радиоактивности хроматографических пиков соответствующих немеченых фрагментов, предварительно введенных в исследуемый образец перед разделением и выделенных по данным УФ-детекции (масса меченого пептида и его [3Н]метаболитов, подвергнутых хроматографическому разделению по данной методике, слишком мала для их непосредственного наблюдения с помощью УФ-детекции) Разделение смеси пептидных фрагментов проводили методом ВЭЖХ на колонке Kromasil С18 - 5 Dm (4 х 150 мм) при 20°С В качестве детектора использовали спектрофотометр Beckman модели 165 (Altex) при одновременной детекции на длинах волн 254 и 280 нм

Полученные образцы пептидных экстрактов из тканей (объем 40 мкл) смешивали с 30 мкл раствора исследуемого немеченого пептида и его метаболитов (по 5 мкг каждого пептида), подвергали градиентному злюированию и определяли радиоактивность продукта каждого из пиков в сцинтилляционном счетчике. Содержание [3H]PGP и его метаболитов в ткани определяли из данных по содержанию радиоактивности в пептидной фракции и молярной радиоактивности соответствующего фрагмента, рассчитанной из распределения метки в пептиде.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Повышают устойчивость слизистой оболочки желудка к действию этанола, как при внутри брюшинном, так и при внутри желудочном способах введения, помимо изученных ранее PG и PGP, еще GPGP к GPGPGP (Рис. 1). При внутрибрюшинном введении противоязвенные эффекты PG, PGP, GPGP и GPGPGP составили 71, 72, 64 и 60% соответственно; при внутрижелудочном (3,7 мкмоль/кг) - 83, 64, 72 и 65%. Однако в дозе 0,37 мкмоль/кг активность проявляли только PGP и GPGPGP.

Следует отметить, что противоязвенные эффекты пептидов при внутри желудочном введении, не уступали таковым при внутрибрюшинном введении, что позволяет говорить об относительной устойчивости глипролинов к действию протеаз желудочного сока.

PG РСР UPGP GPÜPIJP

Рис. 1. Противоязвенные эффекты глипролинов на этаноловой модели язвообразования при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг) (А) и внутркжелудочном (Б) введении. На этом и последующих рисунках: "1" -3,7 мкмоль/кг, "2" - 0,37 мкмоль/кг. *Р<0,05 **Р<0Ж ***Р<0,001 к контролю.

Ни один из исследуемых гидроксипролиновых пептидов (GHyp, HypG, HypGP, PGIIyp) не проявлял достоверную протекторную противоязвенную активность на этаноловой модели язвообразования ни

при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг), ни при внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введении.

Стрессорные язвы, возникающие через 1 час после 30-минутного плавания животного в изолированной клетке (tB0Jb,=21'аС), имеют вад точечных кровоизлияний, которые в литературе рассматриваются как стрессорные язвы (Tuncel étal,, î 998; Yelken et al., 1999).

Среди про л и н со держа щ их пептидов повышали устойчивость СОЖ к действию стресса при внутри брюшинном введении (3,7 мкмоль/кг) GP, PGP, GPGP, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP. При вну трижелудочноад введении в этой же дозе эффективно уменьшали плошадь стрессорных повреждений GP, PG, PGP и GPGPGP. Тенденцию к наибольшей эффективности продемонстрировал PGP (50%), а к наименьшей - GPGPGP (33%). В дозе 0,37 мкмоль/кг противоязвенная активность выявлена для GP, PGP, GPGP и GPGPGP - 5Ц 57, 40 и 65% соответственно (Рис. 2Б).

! 2 12 стер GPGPCI*

Рис, 2. Противоязвенные эффекты п рол ин содержащих глипролинов на стрессорной модели язвообразования при внутри брюгпшшом (3,7 мкмоль/кг) (Л) и внутрижелудочном (Б) введении. Обозначения те же, что инарис. 1. *р0,05 **Р<0,01 ***Р<0,001

Исследование влияния гидроксипролиновых пептидов на устойчивость СОЖ к действию стресса показало, что большинство из исследованных нами пептидов (GHyp, HypGP и PGHyp), за исключением HypG, обладают протекторной противоязвенной активностью на стрессорной модели язвообразования как при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг), так и при внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) способе введения (Рис, 3).

Таким образом, на стрессорной модели язвообразования, патогенез которой обусловлен преимущественно центральными механизмами

ульцерогенеза, противоязвенную активность при внутрибрю шинном введении из всех исследуемых пептидов проявляют: GP, PGP, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP, PGHyp. Максимальный протекторный противоязвенный эффект - у GPGPGP (72%) и GHyp (65%), минимальный - у GPGP (27%) и PGPGP (34%). При внутрижелудочном введении в соответствующей дозе эффективнее всех уменьшают площадь стрессорных повреждений дипептид GHyp (61%) и трипептиды HypGP (59%) и PGP (50%), а в дозе 0,37 мкмоль/кг максимальная противоязвенная активность -у GPGPGP - 65%, HypGP (62%) и PGP (57%),

Рис. 3. Противоязвенные эффекты гидр о ксштро ли нсодерж ащих глипролинов на стрес сорной модели язвообразования при внутри брюшинном (А) и внутрижелудочном (Б) введении. Обозначения те же, чтои нарис. 1. *Р<0,05 **Р<0,01 ***Р<0,001 к контролю.

GHyp HvpG HypGP PGHyp

GHyp

HypG HypGP PGHyp

Итак, нами было выявлено, что устойчивость СОЖ к действию таких ульцерогенных факторов как этанол и стресс, поддерживается не всеми исследованными нами гдипролинами, включая и гидроксипролины. Повышают гомеостаз СОЖ к воздействию этанола только 4 пептида, но гораздо большее число глйпролинов увеличивают устойчивость СОЖ к стрессорному фактору.

Эффективнее всех повышали устойчивость СОЖ к действию обоих ульцерогенных факторов (этанол и стресс) PGP и GPGPGP. Следует отметить относительную стабильность этих пептидов к действию протеаз желудочного сока. Это проявляется в том, что не только внутрибрюпшнное, но и внутрижедудочное введение PGP и GPGPGP сопровождается значительным протекторным противоязвенным эффектом.

Выяснив, что только некоторые глипролины повышают устойчивость СОЖ к действию ульнерогенных факторов, следовало рассмотреть, все ли исследуемые глипролины обладают лечебным противоязвенным свойством.

Наиболее удобной моделью для исследования лечебных эффектов; то есть эффектов, влияющих на формирование и заживление язвы, является ацетатная модель новообразования но методу Окабе (Okabe et al., 1971).

Согласно ранее проведенным экспериментам и сведениям литературы максимальный размер ацетатной язвы выявляется к 4-м суткам с момента ее вызова (Бакаева, Самонина, 2005).

Работа, выполненная совместно с С.Е. Жуйковой, показала, что на 4-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка на слизистой желудка у контрольных животных наблюдались язвы, часто с прободением, средней площадью 39,6±7,9 мм2. Внутрибрюшинное введение GP, PG и PGP в дозе 3,7 мкмоль/кг однократно в течение первых 3-х дней сопровождалось значительным уменьшением площади язв на 67, 60, и 57 % соответственно.

сч 50

контроль PC GP PGP

Рис. 4. Влияния внутрибркшшнного введения PG, GP, PGP (3,7 мкмоль/кг) на формирование ацетатной язвы. *Р<0,05 **Р<0,01 к контролю.

Таким образом, все три пептида значительно тормозят формирование ацетатной язвы. Наибольший противоязвенный эффект выявлен для дипелтида GP - 67%.

Внутрибрюшинное или внутри желудочное введение глипролипов однократно в течение 3-х дней (с 4-6-й дни после аппликации кислоты) влияет уже не на формирование язвы, а на ее заживление.

У животных контрольной группы на 7-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты на СОЖ видны одиночные язвы, чаще округлой формы; поверхность язвенного поражения отделялась от пограничной слизистой оболочки ярко выраженным демаркационным воспалительным валиком. В некоторых случаях на дне язвенных кратеров обнаруживалось гнойно-некротическое содержимое. У животных контрольной труппы в

20% случаев отмечались спайки с близлежащими органами, чаще всего с печенью. Внутрибртошинное (3,7 мкмоль/кг) или вкутрижелудочное (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введение всех исследуемых нами глипролинов приводило к ускорению заживления ацетатной язвы. Наибольшим лечебным противоязвенным эффектом среди всех исследуемых пептидов при внутрибрюшинном введении (3,7 мкмоль/кг) обладали ОР (96%), ОНур (69%) и НурС (62%); при внутрижелудочном введении в дозе 3,7 мкмоль/кг - РОРС (62%), РвРРСР (62%) и РйНур (59%); при внутфиже луд очном введении в дозе 0,37 мкмоль/кг — ОРОР (79%), ОНур (73%) и РОР (72%).

Рис. 5. Влияние трехдневного (4-6-й дни) внутрибрюшинного введения глипролинов (3,7 мкмоль/кг) на заживление ацетатной язвы,

*Р<0,05 **Р<0,01 **"Р<0,001 к контролю.

Таким образом, на ацетатной модели язвообразования эффективны все ■

исследуемые нами глипролины, тогда как на этаноловой и стрессорной I

моделях язвообразования противоязвенный эффект проявляли далеко не <

все пептиды. Это может быть связано с различными механизмами {

патогенеза этаноловой, стрессорной и ацетатной модели вызова язв. ;

Однако следует учесть, что при исследовании протекторных |

противоязвенных эффектов глипролинов пептиды вводили однократно, ) тогда, как при изучении лечебных эффектов все исследуемые пептиды вводили не менее 3-х раз.

о

Рис, 6. Влияние трехдневного (4-6-й дни) внутр иже дудочного введения глипролинов (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) на заживление ацетатной язвы. - 3,7 мкмоль/кг П1;-^;! - 0,37 мкмоль/кг А**Р<0,001 к контролю.

Как отмечалось ранее в обзоре литературы, большинство из исследованных пептидов являются фрагментами коллагена. Поэтому в следующих сериях экспериментов мы изучали возможность пептидного гидролизата коллагена повышать устойчивость СОЖ к воздействию этанола и стресса и ускорять заживление уже сформировавшейся язвы.

Пептидный гидролизат коллагена, полученный кислотным гидролизом 4М соляной кислотой образцов желатина при повышенной температуре, содержит тридцать 2-4-членных индивидуальных пептидов с молекулярными массами 174-420 Да, таких как PGP, PG, GP, HypGP и др. Внутрижелудочное введение ПГК в дозе 1 мг/кг приводило к значительному снижению площади как этаноловых (81,5%), так и стрессорных повреждений (50%) (Рис. 7). На стрессорной модели язв «образования противоязвенная активность выявлена и для меньшей дозы гидролизата - О, I мг/кг.

Полученные результаты свидетельствуют о возможном двунаправленном влиянии ПГК как на центральные, так и на периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ.

Следует предположить, что высокая активность гидролизата на этаноловой модели обусловлена вкладом именно пролинсо держащих пептидов, таких как PGP и PG, а не гидроксипролиновых пептидов, которые на данной модели язвообразовшшя не обладали протекторной противоязвенной активностью. Не исключено, что в противоязвенной активности ПГК принимают участие не только упомянутые выше глипролины, но и другие пептиды гидролизата коллагена, противоязвенная активность которых на данный момент еще не изучена.

^контроль ЕЭПГК (1м г/кг) 0 контроль ЁЭПГК(1 мг/кг) □ ПГК (0,1мг/кг) В ПГК (0,1 мг/кг)

Рис. 7. Влияние внутри ж елудо чш ГО введения ПГК (0,1 и 3 мг/кг) на этаноловое (А) и етрессорное (Б) яззообразование. **Р<0,01 ***р<0,001 к контролю.

Были исследованы и лечебные противоязвенные эффекты ПГК. Пептидный гидролизат в дозе 1 мг/кг, как при внутри брюшин ном, так и при внутр иже луд очном введении с 4-6-й дни с момента вызова ацетатной язвы, почти вдвое уменьшает её площадь по сравнению с контролем.

контроль ПГК(1мг/кг) ' контроль ПГК {1 мг/кг)

Рис. 8. Влияние внутри брюшинного (А) и анутрижелудочного (Б) введения ПГК в дозе 1 мг/кг на заживление ацетатной язвы. *Р<0,05 *"*Р<0,001 к контролю.

Таким образом, пептидный гидролизат коллагена не только повышает устойчивость СОЖ к действию этанола и стресса, но и проявляет лечебную противоязвенную активность, которая практически не уступает таковой у глипролиновых пептидов.

Известно, что в клинической практике гастроэнтерологов очень часто возникает необходимость воздействовать на процессы регенерации в гастродуоденальной зоне, способствуя прекращению процесса воспаления (Логинов и др., 1998; Горопова, 2006). Терапия язвенной болезни желудка направлена не только на восстановление эпителиального слоя слизистой поверхности и подлежащей соединительной ткани, но и структурных

элементов стенки желудка, и, прежде всего, на восстановление базальных мембран и внеклеточного матрикса, Все это может быть достигнуто путем усиления миграции и пролиферации коллаген-продуцирую щей способности клеток. В следующих сериях экспериментов мы провели гисто морфологи чес кое и цитологическое исследование влияния глипролинов и пептидного гидролизатз коллагена на формирование и заживление ацетатной язвы.

Оценка с помощью цито грамм степени выраженности воспалительного процесса в зоне язвенного дефекта показала, что на 4-й день после индукции язв у контрольных животных в цитологических отпечатках обнаруживались лимфоциты и нейтрофилы, с преобладанием последних. В цитограммах, полученных от животных, которым вводили PGP и GP (Рис. 9), количество нейтрофилов было достоверно меньше по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении воспаления в области язвенного дефекта и, вероятно, может объяснить способность этих 2-х пептидов в значительной степени замедлять формирование ацетатной язвы. Для PG не было выявлено подобной зависимости: возможно, способность PG замедлять формирование язвы, в меньшей степени связана с влиянием на клеточный (нейтрофильный) компонент ацетатной язвы.

£ 60 ■ Щ

3 50 -s

t 40 ■

% 30 х

3 20

контроль

PGP

Рис. 9. Влияние PGP, PG и GP на количество нейтрофилов в цитологических препаратах отпечатков с поверхности ацетатных язв. *Р<0,05 к контролю.

На гистологических препаратах ацетатной язвы контрольных животных, полученных на 7-й день после аппликации уксусной кислоты, наблюдалось разрушение эпителия и подлежащих тканей вплоть до гладкомышечкого слоя. Цитологический анализ выявил, что наиболее многочисленными клетками в области язвенного дефекта являются нейтрофилы - до 61 (из 100 клеток); фибробластов, соответствующих стадии пролиферации, было почти в два раза меньше (до 34 из 100 клеток).

В гистологических препаратах срезов язвы у опытных животных, вне зависимости от водимого препарата (PGP, GPG, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypG, HypGP и ПГК), зачастую наблюдали полную регенерацию Эпителия и желез СОЖ. Цитологический анализ выявил на месте

регенерирующей слизистой в наибольшем количестве фибробласты, продуцирующих коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса, что свидетельствует о преобладании регенераторных процессов по сравнению с контролем (Рис. 10).

А

I 6

т еэ т 0.

а. 0.

а и СЭ

0. 0. 5.

о О О

а. а.

а

а.

<?

с. О

а.

а а. О а.

а.

О

а.

О о. О

В

Рис. Ю. Влияние трехдневного {4-6-й дни) внутри желудочного введения глипролинов {3,7 мкмоль/кг) и ПГК (1 мг/кг) на количество макрофагов (А), фибробластов (Б) и нейтрофилов (В) в цитологическом препарате ацетатной язв и крысы. ***Р<0,001 к контролю.

Таким образом, на фоне введения глипролинов и пептидного гидролизата коллагена значительно снижалось количество нейтрофилов и увеличивалось количество фибробластов, что свидетельствует о преобладании регенераторных процессов, обеспечивающих восстановление соединительно-тканного каркаса. Это достигается также и путем ускорения процессов очищения зоны повреждения от некротических масс, образования грануляционной ткани и скорости эпителизации язвенных дефектов.

Обнаруженный на ацетатной модели язвообразования противовоспалительный эффект глипролинов был подтвержден нами и на модели экспериментального перитонита, вызванного внутрибрюшинным введением 1% уксусной кислоты.

Обобщенные результаты по исследованию противоязвенной активности пептидов на всех исследуемых нами моделях язвообразования представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Противоязвенная активность исследуемых глипролинов на 3-х экспериментальных моделях язвообразования

Пептид Этаноловая Стоессопная Ацетатная

в/б в/ж в/б в/ж в/б в/ж

3,7 3,7 0,37 3,7 3,7 0,37 3,7 3,7 0,37

СР 0 0 - + + + +++ ++ +

Рв +++ +++ 0 0 + - + + ++

РвР +++ ++ ++ + + ++ + + +++

вРв 0 0 0 0 0 0 + + +

вРСР ++ +++ 0 + 0 + + + +++

РСРв 0 0 0 0 0 0 0 ++ +

РвРСР 0 0 0 + 0 0 + ++ +

СРСРвР ++ ++ ++ +++ + ++ ++ + +

РСРРвР 0 0 0 + 0 0 ++ ++ +

СНур 0 0 0 ++ ++ + ++ ++ +++

Нурв 0 0 0 0 0 0 ++ + ++

НурвР 0 0 0 ++ -н- ++ ++ + +

РвНуо 0 0 0 ++ + 0 ++ ++ ++

Примечание: противоязвенный э( противоязвенный эфе противоязвенный эф| отсутствие противояз противоязвенная акт) >фект от 25-50% - "+". |)ект от 51-70% - "++". 1ект> 70%-"+++". венных эффектов - "0". ивность исследована не была -

Как видно из представленной таблицы, противоязвенным эффектом на 3-х моделях язвообразования обладают только PGP и GPGPGP. Просматривается тенденция к несколько большей эффективности GPGPGP при внутрибрюшинном введении, по сравнению с PGP, тогда как трипептид проявляет более выраженный лечебный противоязвенный эффект при внутрижелудочном введении в маленькой дозе (0,37 мкмоль/кг). Если сопоставить эффективность этих двух пептидов в перспективе создания противоязвенного препарата, то, преимущество должен иметь препарат, способствующий более быстрому заживлению язвы при пероральном введении даже в минимально используемой дозе, то есть PGP

В настоящем исследовании были изучены особенности распределения PGP и/или его метаболитов между органами, биодефадация трипептида, возможность проникновения PGP и его метаболитов через гематоэнцефалический барьер при различных способах введения.

Меченный тритием PGP, синтезированный в ИМГ РАН, вводили внутривенно, внутрижелудочно, интраназально и внутрибрюшинно Фармакокинетику и биодеградацгао пептида исследовали через 3, 6 и 12 минут Исследования распределения трипептида показали, что [3H]PGP обнаруживается в крови и исследуемых органах (мозге, желудке, сердце, печени и почках) уже через 3 минуты при всех способах введения Обращает на себя внимание факт высокого содержания меченого [3H]PGP в желудке практически для всех временных интервалов содержание PGP и/или его метаболитов в тканях желудка значительно превышает концентрацию пептида в крови и других исследуемых органах в 2-150 раз Этот эффект легко объясняется для внутрижелудочного введения, когда пептиды поступают непосредственно в данный орган Частичное сглатывание препарата при интраназальном введении может также приводить к значительному увеличению радиоактивности в желудке.

Обнаружение радиоактивной метки в мозге при всех способах введения свидетельствует о проникновении PGP и/или его метаболитов через гематоэнцефалический барьер и участии центральных механизмов в регуляторных влияниях пептидов Выявленные центральные эффекты глипролинов (влияние на стрессогенные нарушения поведения крыс, противоязвенные эффекты на стрессорной модели язвообразования) (Бадмаева и др, 2005) подтверждают это Наиболее эффективным по отношению к тканям мозга является внутрибрюшинный и внутривенный способы введения, обеспечивающие максимальное содержание метки в мозге (0,02-0,03% от всего введенного пептида на 1 грамм ткани), меньше всего пептида проникает в мозг при внутрижелудочном способе введения

Таблица 2.

Распределение [Н)3РСР в организме крысы внутрижелудочном (в/ж), внутрибрюшинном (в/б), интраназальном (и/н) и внутривенном (в/в) способах введения (в % от введенной радиоактивности на грамм ткани).

Введение Время, мин кровь мозг желудок сердце печень ПОЧКИ

В/В 3 0.200 0.010 0.230 0.040 0.040 0.800

6 0.110 0.010 0.200 0.040 0.040 0.300

12 0.100 0.020 0.200 0.030 0.100 0.300

В/Ж 3 0.004 0.010 0.600 0.010 0.010 0.004

6 0.020 0,002 0.600 0.060 0.040 0.100

12 0.040 0.003 0.200 0.030 0.010 0.020

И/Н 3 0.010 0.004 0.100 0.004 0.003 0.010

6 0.100 0.020 0.100 0.020 0.010 0.010

12 0,030 0,010 0,100 0,020 0,030 0,020

В/Б 3 0.100 0.010 0.300 0.100 0.200 0.100

6 0.100 0.020 0.300 0.030 0.100 0.200

12 0.100 0.030 0.200 0.100 0.100 0.500

Хроматографический анализ пептидной фракции желудка крысы показал, что для выбранного интервала времени в образцах крови присутствуют как исходный трипептид, так и его дипептидные метаболиты - PG и GP Через три минуты после введения [H]3PGP в желудке крысы обнаруживается, в основном целая молекула трипептида Биодеградация пептида в желудке протекает с преимущественным образованием дипептида GP PG образуется в 4-10 раз меньше Следует отметить, что и через 12 минут обнаруживается целая молекула PGP, что свидетельствует об относительной устойчивости трипептида (Таблица 3)

Таблица 3

Биодеградация меченного тритием PGP in vivo в желудке крысы при четырех

способах введения

Способ введения Время, мин Концентрация пептида, нМоль

PG GP PGP

ВВ 3 0.11 1.20 6.50

6 0.82 3.20 4.10

12 0.38 2.40 1.60

ВЖ 3 0.36 4.10 15.20

6 1.20 7.20 9.40

12 0.82 6.70 4.80

ИН 3 0.20 0.94 3.80

6 0.45 1.80 2.20

12 0.30 1.40 0.82

ВБ 3 0.21 1.20 7.50

6 1.30 4.10 4.80

12 0.65 2.90 2.50

В крови биодеградация PGP протекает сходным образом

Основываясь на полученных результатах можно предположить, что высокая протекторная противоязвенная активность PGP на этаноловой модели язвообразования связана с воздействием на СОЖ именно целой молекулы трипептида, а не ее метаболитов, так как GP не влияет на площадь этаноловых повреждений, a PG образуется в малом количестве, недостаточном, для проявления протекторной противоязвенной активности На стрессорной и ацетатной модели вызова язв противоязвенный эффект PGP складывается, скорее всего, из собственной противоязвенной активности и таковой GP. Накопление пептида и/или его метаболитов в желудке дает возможность предположить, что протекторные эффекты пептидов, также как и их терапевтическое влияние на уже развившуюся язву, могут осуществляться в результате прямого воздействия на СОЖ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Глипролины - фрагменты коллагена, состоящие из глицина, пролина и/или гидроксипролина - неоднозначно влияют на гомеостаз слизистой оболочки желудка. Наши эксперименты продемонстрировали, что представители семейства глипролинов PGP и GPGPGP обладают выраженным защитным и лечебным действием в отношении повреждений СОЖ, что было показано на этаноловой, стрессорной и ацетатной моделях вызова язв

Высокая противоязвенная активность на всех моделях язвообразования выявлена и для пептидного гидролизата коллагена

Факт накопления PGP и/или его метаболитов в желудке и обнаружение их в мозге при всех способах введения предполагает возможность корректирующего влияния глипролинов как непосредственно на слизистую оболочку желудка, так и через нервные центральные и периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ

Исследование процессов регенерации в зоне повреждения СОЖ, вызванных уксусной кислотой, выявило способность глипролинов уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта в период формирования и в период заживления ацетатной язвы, что может быть одним из механизмов, обуславливающих их противоязвенные свойства на данной модели язвообразования Последний эффект выявлен и для пептидного гидролизата коллагена Для PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита показано снижение воспалительной реакции организма в ответ на внутрибрюшинное введение 1 % уксусной кислоты

Приведенные нами экспериментальные данные позволяют рассматривать глипролиновые и гидроксипролиновые фрагменты коллагена в качестве важных эндогенных регуляторов состояния СОЖ Очевидна необходимость дальнейшего углубленного изучения этой регуляторной системы, как в фундаментальном, так и прикладном плане с

перспективой создания противоязвенных препаратов, обладающих минимальными побочными эффектами

ВЫВОДЫ

1. Глипролины - фрагменты коллагена, состоящие из глицина, пролина и/или гидроксипролина - неоднозначно влияют на гомеостаз слизистой оболочки желудка Протекторным противоязвенным эффектом, как при внутрибрюшинном, так и внутрижелудочном способах введения из вновь исследуемых глипролинов на этаноловой модели язвообразования обладают GPGP и GPGPGP, а повышают устойчивость СОЖ к действию стресса GPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP и PGHyp 2 Все исследованные глипролины GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP и PGHyp, включая PG, GP и PGP, ускоряют заживление ацетатной язвы, проявляя лечебное противоязвенное действие, как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном способах введения 3. Сопоставление противоязвенной активности всех исследуемых глипролинов на 3-х моделях язвообразования показало, что наиболее стабильные противоязвенные эффекты проявляют пептиды PGP и GPGPGP.

4 Высокая протекторная и лечебная противоязвенная активность на всех моделях язвообразования, сопоставимая с эффектами PGP и GPGPGP, выявлена и у пептидного гидролизата коллагена

5 Цитологический анализ клеток в зоне язвенного дефекта у животных, получавших внутрижелудочно один из глипролинов (PGP, GPG, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypG и HypGP) и пептидный гидролизат коллагена, на 7-й день после вызова ацетатной язвы выявил значительное увеличение числа фибробластов и снижение числа нейтрофилов и макрофагов, что позволяет говорить о способности глипролинов ускорять регенераторные процессы в области ацетатной язвы.

6 Изучение распределения меченного тритием PGP и/или его пептидных метаболитов при внутрибрюшинном, интраназальном, внутрижелудочном и внутривенном способах введения показало, что наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани, превышающая в несколько раз содержание в крови и других исследуемых органах, характерна для желудка Основным метаболитом PGP в крови и желудке является дипептид GP

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Самонина Г.Е, Жуйкова С Е, Бадмаева К.Е. Влияние коротких глипролинов на ацетатное язвообразование у крыс // Материалы 4-го Российского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро-2002" // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2002 № 2-3 С 385

2 Самонина Г Е , Мясоедов Н Ф , Жуйкова С Е., Бакаева 3 В , Бадмаева К.Е., Павлов Т С , Ашмарин И П Особенности противоязвенного действия

различных глипролинов и других пептидов, содержащих глипролины // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». 2002 С 690-691

3 Бакаева 3 В, Бадмаева К.Е., Сергеев И Ю. Самонина Г.Е. Влияние глипролинов на норадреналиновый тонус изолированного кольцевого сегмента аорты крысы//БЭБиМ 2003 Т 135 №4 С 390-393

4 Жуйкова С Е , Бадмаева К.Е., Самонина Г Е , Плесская Л.Г. Семакс и некоторые глипролиновые пептиды ускоряют заживление ацетатных язв И Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2003. № 2. С. 86-91.

5 Бадмаева К.Е., Васьковский Б В, Самонина Г Е Сопоставление противоязвенного действия дипептидов, содержащих пролин и оксипролин, на стрессорной модели язвообразования // Материалы 5-го Российского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро-2003" И Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2003 № 2-3 С 79.

6 Бадмаева К.Е., Васьковский Б В, Копылова Г Н, Самонина Г Е Сопоставление противоязвенного действия дипептидов, содержащих пролин или гидроксипролин, на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования II В кн.' Российский симпозиум по химии и биологии пептидов Тезисы докладов 2003 С. 59.

7. Бакаева 3 В, Бадмаева К.Е., Желязник Н Я, Самонина Г Е Протекторный эффект внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения PGP пептида на этаноловое эрозирование и ацетатное язвообразования у крыс // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2004. № 4 С 82-84

8 Бакаева 3 В, Бадмаева К.Е., Желязник Н Я, Самонина Г.Е Определение оптимального временного интервала для проявления противоязвенных свойств PGP на этаноловой модели язвообразования у крыс // Вестник Московского Университета Серия 16, биология 2004 № 3 С 22-24

9 Жуйкова С Е, Бадмаева К.Е., Бакаева 3 В, Самонина Г Е Противоязвенные эффекты трипептида PGP и его возможных метаболитов - PG,GP, глицина и пролина - на разных моделях вызова язв у крыс // Известия Академии Наук Серия биологическая 2004 № 5 С 585-587

10. Золотарев ЮА, Бадмаева К.Е, Самонина ГЕ Противоязвенные эффекты пептидного гидролизата коллагена // Материалы 6-го Российского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро-2004" // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга 2004 №2-3 С 173 11 Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е., Васьковский Б.В, Платонова Р Д Сопоставление противоязвенного действия пептидов, содержащих пролин или гидроксиролин на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования // Вестник Московского Университета. Серия 16, биология. 2004 № 4 С 7-9

12. Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е, Золотарев Ю.А, Зверкова ЮБ Влияние пептидного гидролизата коллагена на заживление ацетатных язв у крыс // Тезисы V съезда гастроэнтерологов России Москва. «Анахарсис» 2005 С 6-7

13. Бадмаева К.Е. Влияние желатина на этаноловое и стрессорное язвообразование у крыс // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» Москва 2004 С. 10.

14 Самонина ГЕ, Бадмаева К.Е., Бакаева ЗВ, Васьковский БВ, Ашмарин И П Роль гидроксипролиновых пептидов в реализации противоязвенных эффектов коллагена и его пептидного гидролизата // В кн • И Российского симпозиума по химии и биологии пептидов Тезисы докладов 2005 С 108

15 Золотарев ЮА, Бадмаева К.Е., Бадмаева СЕ, Самонина ГЕ., Копылова Г Н., Дадаян А К .Васьковский Б В , Ашмарин И П Короткие пептидные фрагменты коллагена, обладающие противоязвенной активностью // В кн.- II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов Тезисы докладов 2005 С 51

16 Самонина Г.Е , Бакаева 3 В , Бадмаева К.Е., Труфанова А В , Андреева Л А, Климова П А Эндогенные и синтетические глипролины и гомеостаз слизистой оболочки желудка // Научные труды I съезда физиологов СНГ Сочи-Дагомыс 2005. Т 2 № 58 С 22

17. Samonina GE, Ashmann IP, Badmaeva K.E., Bakaeva ZV, Vas'kovskiji B.V, Zolotarev Y A Role of Collagen Fragments in Gastric Homeostasis // II Internal Conf @Neuro-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes Kiev Abstract book 2005 P. 33

18 Ашмарин ИП, Самонина ГЕ, Бадмаева К.Е., Бакаева ЗВ Регуляторные фрагменты коллагена в гомеостазе слизистой оболочки желудка // Успехи физиологических наук 2006 Т 37. №2 С 11-18

19 Золотарев Ю А, Бадмаева К.Е., Бакаева 3 В , Самонина Г Е , Копылова Г Н, Дадаян А К , Зверков Ю Б , Васьковский Б.В , Ашмарин И П, Мясоедов Н.Ф Короткие пептидные фрагменты коллагена, обладающие противоязвенной активностью // Биоорганическая химия 2006 Т 32 № 2 С 89-94

20 Золотарев Ю А , Дадаян А К., Долотов О В , Козик В С , Кост Н В , Соколов О Ю , Дорохова Е М., Мешавкин В К, Габаева М В , Андреева Л А, Алфеева Л Ю., Павлов Т С , Бадмаева К.Е., Бадмаева С.Е, Бакаева 3 В , Самонина Г Е , Копылова Г Н, Васьковский Б В , Гривенников И А , Зозуля А А Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по специфическому связыванию и биодеградации in vivo и in vitro // Биоорганическая химия 2006 Т 32 №2 С 80-88

21 Zolotarev Y А, Vaskovsky В V, Badmaeva К.Е., Dadayan А К, Zverkov Y В , Garanin S К , Ashmann IР Short peptide fragments with antiulcer activity from a collagen hydrolisate // 29 Europe Peptide Symp 2006 Gdansk Poland

P 36

22. Банникова K.E., Труфанова А В, Бакаева 3 В, Самонина Г Е, Андреева Л А, Климова П А., Васьковский Б.В Влияние гидроксипролин -и пролинсодержащих глипролинов на этаноловое язвообразование // Вестник Московского Университета Серия 16, биология 2007 в печати

23 Труфанова А В., Багликова К.Е., Бакаева 3 В , Самонина Г Е, Гусева А А. Гистоморфологические особенности ускорения заживления ацетатных язв глипролинами // БЭБиМ. 2007 Т 144. № 8 С. 226-229

24 Бадмаева К.Е., Бакаева 3 В, Труфанова А В, Самонина Г Е Гистологические характеристики заживления ацетатной язвы желудка крыс глипролиновыми пептидами // XX Съезд Физиологического общества имени ИЛ. Павлова 2007 С 113.

25. Багликова К.Е. Влияние пептида PRO-GLY-PRO на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии // Межинститутская конференция молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» Санкт-Петербург 2007. 26 Самонина Г Е, Копылова Г Н, Багликова К.Е., Эдеева С Е , Бакаева 3 В , Умарова Б А , Труфанова А В Периферические и центральные механизмы поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка // Механизмы функционирования висцеральных систем Санкт-Петербург 2007

27. Эдеева С Е , Багликова К.Е., Копылова Г Н., Самонина Г Е , Умарова Б А, Бакаева 3 В , Платонова Р Д Влияние пептида Pro-Gly-Pro на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии и постгипоксические нарушения поведения // Вестник Московского Университета Серия 16, биология 2007 в печати

28 Ашмарин И П, Багликова К.Е., Эдеева С Е , Золотарев Ю А., Козик В С., Дадаян А.К, Дорохова Е М., Алфеева Л.Ю, Андреева JI А., Копылова Г.Н, Павлов Т С, Васьковский Б В , Соколов О Ю , Кост Н В , Зозуля А А , Самонина Г Е , Мясоедов Н Ф Сравнение распределения глипролинов в тканях крысы при разных способах введения // Биоорганическая химия в печати

29 Самонина Г Е, Андреева JI А, Багликова К.Е., Бакаева 3 В , Гусева А А, Васьковский Б В , Копылова Г Н, Труфанова А В , Умарова Б А Исследование противоязвенного действия глипролинов // III Российский симпозиум "Белки и пептиды" Пущино 2007 С 87.

30 Бакаева 3 В , Самонина Г Е., Умарова Б А, Копылова Г Н, Гончарова Е JI, Багликова К.Е. Исследование противовоспалительных свойств глипролинов на экспериментальной модели острого перитонита у крыс // Цитокины и воспаление 2008. № 1

31 Копылова Г Н, Самонина Г Е., Эдеева С.Е , Багликова К.Е., Умарова Б А, Платонова Р Д Влияние пептида PGP на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии и постгипоксические нарушения поведения // III Российский симпозиум "Белки и пептиды" Пущино 2007. С 77.

32 Zolotarev Y А, Vaskovsky B.V, Samonma G Е , Badmaeva К Е et al Short peptide fragments with antiulcer activity from a collagen hydrolizate // 2007. Peptides 2006, Proceedings of the 29 European Peptide Symposium ("Kenes International") P 660-661.

Заказ № 626 Объем 1 п.л. Тираж 100 экч.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 \vw\v.postator ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Багликова, Кермен Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Язвенная болезнь желудка

1.1. Общая характеристика заболевания

1.2. Агрессивные факторы желудочного сока

1.2.1. Соляная кислота

1.2.2. Пепсин

1.2.3. Тучные клетки

1.2.4. Helicobacter pylori

1.3. Защитные факторы слизистой оболочки желудка

1.3.1. Слизе - бикарбонатный барьер

1.3.2. Клеточные механизмы защиты слизистой оболочки желудка

1.3.3. Адекватный кровоток

1.3.4. Простагландины

1.3.5. Оксид азота (N0)

1.4. Фармакотерапия язвенной болезни. Современные подходы к лечению

1.5. Классификация язв желудка

1.6. Характеристика патогенетические факторов, лежащих в основе используемых экспериментальных моделей язвообразования

1.6.1. Механизмы повреждений на этаноловой модели язвообразования

1.6.2. Механизмы повреждений на стрессорной модели язвообразования

1.6.3. Механизмы повреждений на ацетатной модели язвообразования

II. Воспаление

II. 1. Альтерация

II.2. Экссудация

II.3. Пролиферация

III. Коллаген

III. 1. Структурно-функциональные особенности коллагена

III.2. Классификация семейства коллагенов

III.3. Другие компоненты внеклеточного матрикса

III.4. Типы коллагена в желудке

III.5. Биосинтез коллагена

III.6. Гидролиз коллагена. Характеристика семейства металлопротеиназ

III.6.1. Классификация металлопротеиназ. Субстратная специфичность ферментов

III.6.2. Регуляция активности металлопротеиназ

III.6.3. Другие ферменты, гидролизующие коллаген

IV. Глипролины

IV. 1. Общая характеристика семейства

IV.2. Физиологические эффекты глипролинов

IV.2.1. Влияние глипролинов на гемостаз

IV.2.2. Исследование глипролинов на гомеостаз слизистой оболочки желудка

IV.2.3. Влияние глипролинов на стрессогенные нарушения лимфотока в брыжейке крыс и секреторную активность тучных клеток

IV.2.4. Нейрофармакологические эффекты глипролинов

IV.2.5. Антигипоксические эффекты глипролинов

IV.2.6. Противовирусные и иммуномодулирующие свойства глипролинов

IV.2.7. Аналгетические эффекты глипролинов

IV.2.8. Хемоаттрактантные свойства глипролинов

IV.2.9. Другие эффекты глипролинов и глипролин-содержащих пептидов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов(глипролинов)

II. Выяснение противоязвенных эффектов пептидного гидролизата коллагена

III. Исследование противовоспалительной активности глипролинов и пептидного гидролизата коллагена

III. 1. Цитологическая оценка влияния PGP, PG и GP на формирование ацетатной язвы

III.2. Гистологическая и цитологическая оценка влияния исследуемых глипролинов и пептидного гидролизата коллагена на заживление ацетатной язвы

III.3. Исследование противовоспалительной активности PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита

IV. Изучение распределения и биодеградации PGP в организме крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введении

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена - пролин - и гидроксипролинсодержащих олигопептидов(глипролинов)

1.1. Изучение протекторных противоязвенных свойств глипролиновых пептидов

1.1.1. Влияние глипролиновых пептидов GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP и PGHyp на этаноловые повреждения слизистой оболочки желудка

1.1.2. Влияние глипролиновых пептидов PG, GP, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP и PGHyP на стрессорное язвообразование

1.2. Выяснение лечебных противоязвенных свойств глипролиновых пептидов

1.2.1. Влияние PGP, PG и GP на развитие ацетатной язвы

1.2.2. Влияние глипролиновых пептидов на заживление ацетатной язвы

II. Исследование противоязвенных эффектов пептидного гидролизата коллагена

II. 1. Протекторные противоязвенные эффекты пептидного гидролизата коллагена

II.2. Терапевтические эффекты пептидного гидролизата коллагена (ПГК)

III. Исследование противовоспалительной активности глипролинов и пептидного гидролизата коллагена

III. 1. Цитологическая оценка влияния PGP, PG и GP на формирование ацетатной язвы

III.2. Гистоморфологическое исследование особенностей ускорения заживления ацетатной язвы глипролинами и пептидным гидролизатом коллагена

III.3. Обнаружение противовоспалительных эффектов PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита

IV. Распределение и биодеградация меченного тритием PGP в организме крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введении

IV. 1. Исследование распределения PGP и/или его метаболитов при различных способах введения

IV.2. Изучение биодеградации меченного тритием PGP

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена - пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов"

Актуальность проблемы.

Несмотря на успехи в гастроэнтерологии, распространенность язвенной болезни по-прежнему не имеет тенденции к снижению, а возникающие осложнения зачастую угрожают жизни больного и требуют хирургического вмешательства.

Поэтому большое значение отводится проблеме поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) при воздействии на нее различных повреждающих факторов. Особое внимание уделяется роли регуляторных пептидов в процессе поддержания гомеостаза СОЖ.

Современные экспериментальные исследования направлены на поиск полифункциональных препаратов, в том числе и РП, воздействующих на различные патогенетические факторы, лежащих в основе язвенной болезни и в наименьшей мере вызывающие побочные эффекты.

Данная работа посвящена изучению противоязвенных свойств нового класса регуляторных пептидов - глипролинов: GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp.

Изученные ранее глипролины PGP, PG и GP обладают широким спектром физиологической активности: влияние на некоторые параметры гемостаза, повышение устойчивости СОЖ к воздействию повреждающих факторов (стресс, этанол, индометацин и др.) и заживление язвы, коррекция стрессогенных нарушений поведения, стабилизация тучных клеток, протекторное действие на систему микроциркуляции и др.

Выяснены и некоторые физиологические механизмы действия этих пептидов, направленные на поддержание гомеостаза слизистой оболочки желудка (влияние на желудочную секрецию, кровоток, лимфоток, тучные клетки и др.).

Эндогенным источником глипролинов является коллаген, содержащий значительное количество глицина, пролина и гидроксипролина. Гидролиз молекулы коллагена может приводить к образованию широкого круга как пролин -, так и гидроксипролинсодержащих пептидов. В связи с этим, представляет интерес исследование влияния широкого круга глипролинов на устойчивость слизистой оболочки желудка к действию таких повреждающих факторов как этанол и стресс, а также на формирование и заживление ацетатной язвы, то есть выявить протекторные и лечебные противоязвенные свойства этих пептидов.

Изучение противоязвенных эффектов глипролинов PGP, PG и GP ранее проводились, в основном, при внутрибрюшинном введении. В диссертационном исследовании мы рассматривали протекторные и лечебные противоязвенные эффекты широкого круга глипролинов (ГП) как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном введении и изучали изменение величины и/или направленности влияний ГП на гомеостаз СОЖ.

Выявление гастропротекторных свойств глипролинов имеет прямой выход в клиническую гастроэнтерологию, поэтому исследование противоязвенных эффектов пептидов per os является наиболее важным.

Из литературы известно, что язва желудка и воспаление тесно взаимосвязаны. Воспаление СОЖ не просто ассоциировано с язвообразованием, но часто играет важную роль, как в появлении, так и в заживлении язв. Для каждого этапа воспалительной реакции характерно преобладание той или иной клеточной популяции. Так, острые этапы воспаления (альтерация и экссудация) характеризуются преобладанием активно фагоцитирующих лейкоцитов - макрофагов и нейтрофилов. Размножение клеточных элементов (пролиферация) связано с активной деятельностью фибробластов, синтезирующих структурные компоненты внеклеточного матрикса и ответственных за восстановление соединительно-тканного каркаса. В связи с этим, мы провели цитологический анализ влияния глипролинов на процессы формирования и заживления хронической язвы и экспериментальный перитонит.

К сожалению, в настоящее время, в литературе нет точных данных о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролинов, за исключением cPG, обнаруженного в мозге крыс. До конца не изучена динамика распределения глипролинов в организме при различных способах введения и пути их деградации. Возможное использование глипролинов, и, прежде всего PGP, в качестве лекарственных препаратов требует целенаправленных исследований их метаболизма.

Цель исследования.

Целью настоящей работы является изучение влияния дериватов коллагена - пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов - GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp и пептидного гидролизата коллагена (ПГК) - на повреждения СОЖ различной этиологии; выяснение противовоспалительных эффектов некоторых глипролинов; изучение метаболизма PGP и его биодеградации при различных способах введения. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1) В экспериментах на животных исследовать влияние GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp на устойчивость слизистой оболочки желудка к действию таких повреждающих факторов как этанол и стресс, а также на формирование и заживление ацетатной язвы, то есть выявить протекторные и лечебные противоязвенные свойства этих глипролинов.

2) Сопоставить противоязвенные эффекты глипролинов при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введениях.

3) Определить, связано ли влияние на гомеостаз СОЖ пролинсодержащих пептидов, в частности PGP, с эффективностью действия аминокислот глицина или пролина.

4) Изучить противоязвенные свойства пептидного гидролизата коллагена (ПГК), содержащего и некоторые исследуемые нами глипролины (PG, GP, PGP и PGHyp).

5) Определить возможность противовоспалительных эффектов глипролинов при гистологическом и цитологическом исследовании формирования и заживления ацетатной язвы, и при изучении цитологического состава брюшного экссудата крыс на модели экспериментального перитонита.

6) Выяснить особенности распределение меченного тритием PGP по разным органам у крысы при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введениях.

7) Исследовать биодеградацию PGP в крови и желудке крыс in vivo при разных способах введения.

Научная новизна.

Впервые продемонстрированы и сопоставлены гастропротекторные и лечебные свойства широкого круга глипролинов - фрагментов коллагена -при внутрибрюшинном (в дозе 3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочном (в дозе 0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введении на трех экспериментальных моделях язвообразования: этаноловой, стрессорной и ацетатной. Сопоставлены противоязвенные эффекты пролинсодержащих пептидов и их гидроксипролинсодержащих аналогов. Впервые проведено исследование процессов регенерации в зоне повреждения СОЖ, вызванных уксусной кислотой.

Обнаружена способность глипролинов уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта в период формирования и в период заживления ацетатной язвы, что может быть одним из механизмов, обуславливающих их противоязвенные свойства. Последний эффект выявлен и для пептидного гидролизата коллагена. Для PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита показано снижение воспалительной реакции организма в ответ на внутрибрюшинное введение 1 % уксусной кислоты.

Впервые исследована фармакокинетика PGP в первые минуты (3-12 минуты) после его введения. Изучено распределение меченого PGP и/или его пептидных метаболитов по органам крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введениях. Обнаружена наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани в желудке, превышающая в несколько раз содержание в крови и других органах, что дает возможность говорить о тропности PGP и/или его метаболитов к тканям желудка. Определены основные пути деградации PGP в крови и в желудке при различных способах введения: основным метаболитом трипептида является GP.

Практическое значение.

Накопленные в течение ряда лет данные о противоязвенной активности PGP и его влиянии на различные механизмы поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка свидетельствуют о необходимости его предклинических исследований в качестве противоязвенного препарата. Профилактические и лечебные противоязвенные свойства показаны и для пептидного гидролизата коллагена. Это открывает перспективы поддержания гомеостаза СОЖ и его коррекции путем применения фракций белков соединительной ткани в виде пищевых добавок.

Факт накопления PGP и/или его метаболитов в желудке и обнаружение их в мозге при всех способах введения предполагает возможность корректирующего влияния глипролинов как непосредственно на слизистую оболочку желудка, так и через нервные центральные и периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Язвенная болезнь желудка /. Общая характеристика заболевания

Язвенная болезнь желудка — мультифакторное хроническое заболевание с циклическим рецидивирующим течением, склонное к прогрессированию и развитию осложнений, при котором в стенке этого органа образуется пептическая язва (реже 2 и больше). В патогенезе язвообразования первоопределяющую роль играет ацидопептическая агрессия (гиперсекреция соляной кислоты, пепсина, гастрина) и ослабление резистентности и регенераторной способности слизистой оболочки желудка в гастродуоденальной области (нарушение выработки слизи, снижение бикарбонатной секреции, нарушение желудочного кровотока и процессов клеточной регенерации) (Григорьев, 1986, 1990; Рысс, Звартау, 1998; Brooks et al., 1985). Язвы такого рода разрушают слизистую оболочку, а также расположенную под ней мышечную ткань. Они могут внезапно начать кровоточить, «съесть» всю стенку желудка (прободение) и тем самым вызвать перитонит (воспаление брюшины).

Заболевание имеет склонность к рецидивирующему течению (хорошо известны сезонные обострения язвенной болезни). Наиболее частыми осложнениями язвенной болезни являются кровотечения различной интенсивности, перфорация желудка и двенадцатиперстной кишки, пенетрирующие процессы. Иногда после нескольких обострений развивается стеноз привратника, отмечается перерождение язвы в рак (синдром Эллисона-Золлингера).

Язвенная болезнь желудка по распространению, тяжести течения, осложнениям, инвалидизации и смертности занимает особое место среди хронических заболеваний пищеварительного тракта. Болезнь широко распространена; в развитых странах она встречается у 3-5 % взрослого населения. У мужчин язвенная болезнь наблюдается чаще, чем у женщин. В происхождении . болезни имеют значение наследственная предрасположенность, психоэмоциональное напряжение, вредные привычки (нерациональное питание, никотин), алкоголизм, действие химических и токсических веществ, лекарственные воздействия, хеликобактерные инвазии и др. (Гребенев, Шептулин, 1995; Григорьев, 1997). Способствуют развитию язвенной болезни наследственная предрасположенность, врожденный дефицит антитрипсина и другие факторы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Багликова, Кермен Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Глипролины - фрагменты коллагена, состоящие из глицина, пролина и/или гидроксипролина - неоднозначно влияют на гомеостаз слизистой оболочки желудка. Протекторным противоязвенным эффектом, как при внутрибрюшинном, так и внутрижелудочном способах введения из вновь исследуемых глипролинов на этаноловой модели язвообразования обладают GPGP и GPGPGP, а повышают устойчивость СОЖ к действию стресса GPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP и PGHyp.

2. Все исследованные глипролины GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP и PGHyp, включая PG, GP и PGP, ускоряют заживление ацетатной язвы, проявляя лечебное противоязвенное действие, как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном способах введения.

3. Сопоставление противоязвенной активности всех исследуемых глипролинов на 3-х моделях язвообразования показало, что наиболее стабильные противоязвенные эффекты проявляют пептиды PGP и GPGPGP.

4. Высокая протекторная и лечебная противоязвенная активность на всех моделях язвообразования, сопоставимая с эффектами PGP и GPGPGP, выявлена и у пептидного гидролизата коллагена.

5. Цитологический анализ клеток в зоне язвенного дефекта у животных, получавших внутрижелудочно один из глипролинов (PGP, GPG, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypG и HypGP) и пептидный гидролизат коллагена, на 7-й день после вызова ацетатной язвы выявил значительное увеличение числа фибробластов и снижение числа нейтрофилов и макрофагов, что позволяет говорить о способности глипролинов ускорять регенераторные процессы в области ацетатной язвы.

6. Изучение распределения меченного тритием PGP и/или его пептидных метаболитов при внутрибрюшинном, интраназальном, внутрижелудочном и внутривенном способах введения показало, что наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани, превышающая в несколько раз содержание в крови и других исследуемых органах, характерна для желудка. Основным метаболитом PGP в крови и желудке является дипептид GP.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Короткие пептиды, содержащие глицин, пролин и/или гидроксипролин, выделены в отдельный класс регуляторных пептидов -глипролинов. Основным источником глипролинов является коллаген -белок соединительно-тканного матрикса. При анализе работ по структуре коллагена в альфа-цепях молекулы нами были выявлены не только PGP, PG и GP, но и другие глипролиновые последовательности.

Ранее проведенными работами было показано, что PGP, PG и GP повышают устойчивость слизистой оболочки желудка (СОЖ) к действию таких ульцерогенных факторов как этанол, стресс, индометацин, вещество 48/40 и проявляют лечебный противоязвенный эффект при внутрибрюшинном введении.

Представленная работа посвящена изучению противоязвенной активности широкого круга пролин-, глицин- и гидроксипролинсодержащих фрагментов коллагена: GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp, включая и ранее изученные, в основном, при внутрибрюшинном введении PGP, PG и GP.

Мы продемонстрировали, что при внутрибрюшинном введении повышают устойчивость СОЖ к действию этанола и стресса не только уже изученные глипролины, но и некоторые из впервые исследуемых глипролиновых пептидов. Так, повышают устойчивость СОЖ к действию этанола, то есть проявляют протекторный противоязвенный эффект, помимо изученных ранее PG и PGP, еще GPGP и GPGPGP. Такой же эффект к стрессорному воздействию проявляют не только GP и PGP, что было показано ранее, но и впервые была показана эффективность таких глипролинов, как: GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP и PGHyp.

Нами была показана возможность протекторных противоязвенных эффектов при внутрижелудочном введении такой же дозы пептидов, что и при внутрибрюшинном введении (3,7 мкмоль/кг) и дозы, на порядок меньшей - 0,37 мкмоль/кг, что позволяет говорить об относительной устойчивости глипролинов к действию протеаз желудочного сока. Из литературы известно, что повреждения СОЖ, возникающие на этаноловой модели язвообразования, обусловлены такими периферическими механизмами ульцерогенеза, как нарушение баланса между уровнем цистеиновых (тиоловых) протеаз и их ингибиторами, увеличением уровня внутриклеточного кальция, приводящее к различным метаболическим и секреторным нарушениям в СОЖ, снижением синтеза простагландинов, вызывающее уменьшение бикарбонатной секреции и слизеобразования и др. Однако, основным патогенетическим фактором следует полагать нарушение адекватного кровотока.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что пептиды PGP и PG, но не GP восстанавливают уменьшенный этанолом кровоток. Мы предположили, что противоязвенные эффекты и других эффективных в отношении этаноловых повреждений пептидов - GPGP и GPGPGP могут быть связаны с их возможным влиянием на кровоток в СОЖ. Не исключено, что отсутствие противоязвенных эффектов на этаноловой модели язвообразования со стороны GP, GPG, PGPG, PGPGP, PGPPGP и всех гидроксипролинсодержащих пептидов, вероятно, обусловлено их неспособностью влиять на уменьшенный ульцерогенным фактором (этанолом) кровоток в СОЖ.

Основным патогенетическим фактором на стрессорной модели язвообразования является гиперактивация гипоталамо-гипофизарной и симпатоадреналовой систем. Известно, что различные виды стрессогенного воздействия вызывают гиперактивацию тучных клеток, сопровождающуюся выбросом гистамина и других провоспалительных и вазоактивных факторов. Согласно сведениям литературы, вещества, оказывающие стабилизирующее воздействие на тучные клетки, обладают выраженным антиульцерогенным действием и предотвращают увеличение проницаемости кровеносных сосудов. С.А. Смирновой было показано стабилизирующее воздействие PGP, PG и GP на тучные клетки, активированные стрессом и протекторное действие этих пептидов в отношении постстрессорных нарушений в системе микроциркуляции.

Гиперактивация гипоталамо-гипофизарной и симпатоадреналовой систем может также вызывать и увеличение кислой секреции в СОЖ 3. В. Бакаевой и С.Е. Жуйковой с соавторами было показано, что PGP достоверно снижал максимальную, стимулированную раздражением блуждающего нерва, кислую секрецию у экспериментальных животных.

Мы предполагаем, что на стрессорной модели язвообразования противоязвенные эффекты не только PGP, PG и GP, но и других глипролиновых олигопептидов могут быть обусловлены влиянием на данные механизмы.

Как отмечалось ранее, ацетатная язва по своим временным и гистоморфологическим характеристикам наиболее приближена к язве, возникающей у человека.

Аппликация на серозную оболочку стенки желудка ледяной уксусной кислоты сопровождается развитием глубоких структурных повреждений, нарушением микроциркуляции в области воздействия ульцерогенного фактора и развитием воспалительного процесса.

Все исследуемые нами глипролиновые пептиды, включая и гидроксипролиновые, ускоряют заживление ацетатной язвы. Сопоставление противоязвенной активности пептидов при разных способах введения (в/б и в/ж) одной и той же дозы (3,7 мкмоль/кг) показало неоднозначность изменения величины их эффектов. Так, при внутрибрюшинном введении наибольший эффект выявлен у GP (96%), тогда как при внутрижелудочном введении такой же дозы его эффект был значительно ниже (54%). В то же время, относительно малоэффективный пептид PGPPGP и PGPG при внутрижелудочном введении максимально ускоряет заживление ацетатной язвы (более 60%). Особый интерес представляют эффекты пептидов при внутрижелудочном введении малой дозы (0,37 мкмоль/кг). Максимальной эффективностью в этой дозе обладали GPGP и PGP (более 70%). Сопоставление эффективности различных пептидов позволяет нам предположить тенденцию к неоднозначности направленности эффектов и их величины при изменении дозы и способа введения, что, скорее всего, свидетельствует о возможности влияния на разные механизмы патогенеза ацетатной язвы.

Зависимость эффективности всех изученных нами пептидов от способа и дозы введения проявляется на этаноловой, и на стрессорной моделях язвообразования.

Мы предположили, что одной из причин ускорения заживления ацетатной язвы глипролинами может быть их способность снижать воспаление в области язвы. Цитологический анализ влияния PGP, PG и GP на формирование ацетатной язвы показал, что PGP и GP достоверно снижают количество нейтрофилов в области язвы, что свидетельствует о противовоспалительной активности этих пептидов. Следует полагать, что и подтвержденное навди влияние пептидов PG, GP и PGP на формирование язвы, может быть обусловлено и противовоспалительной активностью этих пептидов.

Все исследуемые нами глипролины, включая и гидроксипролиновые пептиды, значительно снижают количество нейтрофилов и макрофагов в области язвы и увеличивают количество фибробластов, что свидетельствует о восстановлении соединительно-тканного каркаса и снижении воспалительной реакции.

Таким образом, мы видим, что противоязвенные эффекты различных глипролиновых пептидов - фрагментов коллагена - обеспечиваются целым комплексом механизмов, направленных на поддержание гомеостаза слизистой оболочки желудка: влиянием на желудочную секрецию, стабилизирующим воздействием на тучные клетки, влиянием на уменьшенный ульцерогенными факторами кровоток в СОЖ и противовоспалительной активностью пептидов. Вполне вероятно, что глипролины влияют на кровоток и через изменение реологических свойств крови. PGP, PG и GP при различных способах введения проявляют антикоагулянтную, фибринолитическую и антитромботическую активность (Ляпина и др., 2006).

Анализируя противоязвенную активность всех изученных глипролинов, следует отметить, что значительные противоязвенные эффекты на всех экспериментальных моделях вызова язв демонстрируют только PGP и GPGPGP. Эффекты PGP более стабильны и практически не зависят от способа введения. Следует отметить, что на ацетатной модели язвообразования при внутрижелудочном введении в дозе 0,37 мкмоль/кг, противоязвенные эффекты PGP несколько превышают эффекты гексапептида. Так как, для фармакологического применения препарата наиболее удобной является таблетированная форма, а также тот факт, что синтез трипептида является экономически более выгодным, то использование PGP в качестве противоязвенного средства является наиболее перспективным.

Закономерен вопрос, а не являются ли противоязвенные эффекты пептидов и PGP, в частности, результатом освобождения аминокислот при их деградации. Для оценки вклада аминокислот в противоязвенные эффекты PGP, мы сопоставили противоязвенные эффекты глицина, пролина и PGP на этаноловой, стрессорной, ацетатной и индометациновой моделях язвообразования (последняя модель - по данным литературы).

Было показано, что пролин, в отличие от PGP, малоэффективен как антиульцерогенный агент. Глицин уменьшает этаноловое, стрессорное и ацетатное язвообразование практически в той же мере, что и трипептид PGP. Однако, в отличие от PGP, глицин не эффективен при индометациновом язвообразовании: на этой модели он не только не уменьшают площадь повреждений, но даже несколько ее потенцирует (Рис. 22).

Отличаются эффекты глицина и PGP и на механизмы поддержания гомеостаза СОЖ.

Противоязвенные эффекты PGP обуславливаются многими механизмами, в том числе нормализацией уменьшенного ульцерогенными факторами (индометацин и этанол) кровотока в желудке, коррекцией микроциркуляторных нарушений лимфатических сосудов, нормализацией нарушенного стрессом поведения. Однако ни на один из этих механизмов глицин не оказывает никакого влияния. Кроме того, и возможность освобождения глицина при деградации PGP - невелика, так как основным метаболитом трипептида в крови, мозге и желудке является GP, полученный в результате отщепления N-концевого пролина.

Таким образом, наши данные и сведения литературы не позволяют рассматривать роль аминокислот (глицина и пролина) как определяющих факторов в противоязвенных эффектах PGP.

Проведенные исследования фармакокинетики и биодеградации PGP при различных способах введения (внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном) показали, что независимо от способа введения, PGP и/или его метаболиты обладают высокой тропностью к желудку практически для всех временных интервалов (3-12 минут). Максимальное содержание метки на 1 грамм ткани желудка превышает его концентрацию в других рассматриваемых органах более чем в 2 раза. Представляет для нас интерес и обнаружение в относительно значимых количествах меченого PGP в мозге. Эти факты позволяют полагать, что противоязвенные эффекты трипептида и/или его метаболитов обусловлены как их способностью влиять непосредственно на слизистую оболочку желудка, так и действием на центральном уровне. Не исключено, конечно, и возможное влияние на периферические рефлексы.

Анализ биодеградации пептида в крови и желудке показал, что его основным метаболитом является дипептид GP, которого образуется значительно больше, чем PG.

PGP и/или его метаболиты могут проникать в кровь из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде, что подтверждает ранее полученные результаты на кроликах (Жуйкова, 2003). Эти данные позволяют говорить о возможности поступления глипролинов в организм из внешнего источника - поступающих с пищей белков соединительной ткани -коллагена и эластина, подвергающихся действию различных пептидаз. Другим источником глипролинов может быть деградация вновь синтезированного коллагена с выходом из коллаген-синтезирующих клеток коротких (до 5-6 аминокислотных остатков) пептидов, в числе которых могут быть и глипролиновые фрагменты.

В связи с этим заслуживает особого внимания способность коллагена проявлять эффекты, присущие глипролинам. Ранее было показано, что добавление желатина к корму крыс перед индукцией этаноловых повреждений, уменьшает язвообразование примерно на 40%, то есть имеет сходный по величине противоязвенный эффект с PGP. Результаты наших экспериментов с пептидным гидролизатом коллагена (ПГК), полученного в институте Молекулярной Генетики РАН, продемонстрировали, что ПГК, также как и PGP, значительно повышает устойчивость СОЖ этаноловому или стрессорному воздействию и эффективно ускоряет заживление ацетатной язвы.

Очень интересен факт обнаружения противовоспалительной активности у ПГК, что, возможно, является одним из механизмов его противоязвенного действия. Как отмечалось ранее, в литературе уже имеется достаточное количество данных об использовании желатина и его гидролизатов для коррекции многих патологических состояний.

Таким образом, открываются перспективы применения и ПГК в качестве пищевой добавки.

К настоящему времени, пока еще мало изучены механизмы защиты слизистой оболочки желудка со стороны исследуемых пептидов, за исключением PGP и его дипептидных метаболитов PG и GP.

Мы показали, что для всех исследуемых глипролиновых фрагментов одним из механизмов противоязвенного действия может быть и их противовоспалительная активность.

Работа проводилась на базе Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Институте Молекулярной Генетики РАН и поддержана грантами РФФИ № 03-04-4668 и № 06-04-48833.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Багликова, Кермен Евгеньевна, Москва

1. Абелев Г.И. Основы иммунитета // Соросовский Образовательный журнал. 1996. N. 5. С. 4 -10.

2. Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. Пролин и простейшие пролинсодержащие фрагменты нейропептидов модулируют через центральные и периферические механизмы состояние СОЖ'// Нейрохимия. 1996. Т. 13. № 3. С. 209-214.

3. Адо А.Д., Новицкий В.В. Патологическая физиология // Томск. 2004. С. 152-177.

4. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., др. Молекулярная биология клетки // М. Мир. 1994. Т. 2. С. 487-512.

5. Ашмарин и др. Элементы патологической физиологии и биохимии // под ред. Ашмарина И.П. Москва. МГУ. 1997а. С. 54-76.

6. Ашмарин И.П. Глипролины в составе регуляторных пептидов (обзор) // Нейрохимия. 2007. Т. 24. № 1. С. 5-7.

7. Ашмарин И.П. Прогнозируемые и неожиданные эффекты олигопептидов (глипролинов, аналогов АКТГ4.ю, тафцина и тиролиберина) // Росс, физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2001. Т. 87. № 11. С. 1471-1476.

8. Ашмарин И.П., Бакаева З.В., Васьковский Б.В. и др. Высокостабильные регуляторные олигопептиды: опыт и перспективы применения // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2003. № 4. С. 2-5.

9. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов II Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2002. № 1. С. 24-27.

10. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова Т.В. К вопросу о развитии проблемы эффективности сверхмалых доз биологически активных соединений //Росс. хим. журнал. 1999. Т. XLIII. № 5. С. 21-28.

11. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза // Биохимия. 1998а. Т.63. вып. 2. С. 149-155.

12. Ашмарин И.П., Ляпина Л. А., Пасторова В.Е. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейств регуляторных пептидов // Вести. РАМН. 1996. № 6. С. 50-57.

13. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность // Биохимия. 1986. Т. 51. вып. 4. С. 531-545.

14. Ашмарин И.П., Пасторова В.Е., Ляпина Л.А. Влияние простейших пролинсодержащих пептидов на функциональную активность противосвертывающей системы и первичного гемостаза // БЭБиМ. 19986. Т.125. № 5. С.496-499.

15. Бадмаева С.Е., Копылова Г.Н., Абушинова Н.Н., Самонина Г.Е. и др. Влияние глипролинов на стрессогенные нарушения поведения крыс // Росс. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2005а. Т.91. № 5. С. 543550.

16. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И.Ю. Влияние глипролинов на норадреналиновый тонус изолированного кольцевого сегмента аорты крысы // БЭБиМ. 2003а. Т. 135. № 4. С. 390-393.

17. Бакаева З.В., Самонина Г.Е. Глипролины уменьшают развитие и ускоряют заживление ацетатных язв у крыс // Патофизиология и экспериментальная терапия. 2005. № 2. С. 25-27.

18. Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Гусева А.А. Влияние глипролинов на повреждения слизистой оболочки желудка крыс, вызванныекомпаундом 48/80 // 5-й Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург -Гастро 2003». 20036. № 2-3. С. 79.

19. Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Чудаков Л.И. Влияние глипролинов на базальное и стимулированное выделение кислоты и бикарбонатов в желудке крыс // Вопросы медицинской, биологической и фармацевтической химии. 2004в. № 2. С. 30-34.

20. Ганыпина Т.С., Козловский И.И. Влияние пептидного анксиолитика селанка на сердечно-сосудистую систему и дыхание // Экспериментальная и клиническая фармакология // 2005. № 4. С. 3335.

21. Гребенев А.Л., Шептулин А.А. Язвенная болезнь. М.: АО "Медицинская газета". 1995. С. 13-22

22. Григорьев П.Я. Диагностика и лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Москва. 1986. 224с.

23. Григорьев П.Я. Медикаментозная терапия и профилактика обострений и осложнений язвенной болезни // Русский Медицинский Журнал. 1997. Т. 5. № 22.

24. Григорьев П.Я. Язвенная болезнь: современное представление об этиологии, патогенезе и лечении // Москва. 1990. 205с.

25. Гудашева Т.А., Островская Р.У., Трофимов С.С., Воронина Т.А., Сколдинов А.П., Середенин С.Б. Новый эндогенный дипептид циклопролилглицин подобен пирацетаму по селективности мнемотропного эффекта // БЭБиМ. 1999. Т. 128. №10. С. 411-413.

26. ДельВалль Д. Язвенная болезнь // В кн.: Патофизиология органов пищеварения (пер. с англ.) / Под ред. Наточина Ю.В. М.: "Бином". С-Пб.: "Невский диалект". 1997. С. 43-63.

27. Дмитриева В.Г., Поварова О.В., Скворцова В.И. и др. Действие семакса и PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов BDNF NT-3 и их рецепторов TRKB, TRKC в условиях фокальной ишемии мозга // III Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2007. С. 68.

28. Дубынин В. А. Постнатальная нейротропная активность (3-казоморфинов (регуляция поведения взрослых и новорожденных млекопитающих). Автореферат диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. 2001. 47с.

29. Жуйкова С.Е., Самонина Г.Е. Гомеостаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщение 2. Роль ишемии в нарушении гомеостаза слизистой оболочки желудка // Успехи физиологических наук. 2002а. Т. 33. № 1. С. 77-87.

30. Жуйкова С.Е., Сергеев В.И., Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф. Влияние семакса на индометациновое язвообразование у крыс и один из возможных механизмов его действия // БЭБиМ. 20026. Т. 133. № 6. С. 665-667.

31. Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л. Роль молекул адгезии в патогенезе инфекции Helicobacter pylori // Российский журналгастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997. № 6. С. 3237.

32. Ивашкин В.Т., Шептулин А.А. Избранные лекции по гастроэнтерологии // М.: Медпресс-информ. 2002. 84с.

33. Исаев В.А., Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е., Гусева А.А., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. Ашмарин И.П. Новый подход к снижению массы тела // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2003. № 3. С. 45-47.

34. Каплан А.Я., Каменский А.А., Ашмарин И.П. и др. Применение малых регуляторных пептидов в анестезиологии и интенсивной терапии // Тез. Конференции. М.: 1991. С. 78-87.

35. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс // Физиология человека. 1992. Т. 18. № 5. С. 104-107.

36. Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л., Васильева О.С. Прогностическая значимость протеаз у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи // Бюллетень СО РАМН. 2005. № 2. С. 82-91.

37. Козловская М. М, Середенин С. Б, Козловский И. И, Вальдман Е. А, Андреева Л. А, Мясоедов Н. Ф. Сравнительное изучение фрагментов тафтсцина на показатели условной реакции пассивного избегания. // Химико-фармацевт. журнал. 2001. Т. 35. № 3. С. 3-5.

38. Конорев М.Р. Выбор оптимального антацидного препарата в клинической практике // Экспериментальная гастроэнтерология. Витебск. 2004. №4. С. 87-91.

39. Копылова Г.Н., Бадмаева С.Е., Левицкая Н.Г., Самонина Г.Е., Умарова Б.А., Гусева А.А. Влияние пептида Pro-Gly-Pro на изменения поведения крыс, вызванные воздействием стрессогенного фактора// БЭБиМ. 2004. Т.137. № 7. С. 9-12.

40. Копылова Г.Н., З.В.Бакаева, С.Е.Бадмаева, Б.А.Умарова, Г.Е.Самонина, А.А.Гусева. Терапевтические эффекты глипролинов (PGP, GP, PG) в отношении стрессогенных нарушений поведения крыс // БЭБиМ. 2007. Т. 143. № 2. С. 124-128.

41. Копылова Г.Н.; Смирнова Е.А., Санжиева Л.Ц., Умарова Б.А., Лелекова Т.В. Глипролины и семакс уменьшают стрессогенные нарушения микроциркуляции в брыжейке // БЭБиМ. 2003. Т. 136. №. 11. С. 497-499.

42. Левицкая Н.Г., Каменский А.А. Регуляторные пептиды // Природа. 2003. №10. С. 10-16

43. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю., Воскресенская О.Г., Андреева J1.A. Алфеева Л.Ю., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. Исследование нейротропной активности продуктов ферментативной деградации семакса// ДАН. 2000. Т. 372. № 2. С. 268-271.

44. Линднер Д.П., Коган Э.М. Тучные клетки как регулятор тканевого гомеостаза и их место в ряду биологических регуляторов // Архив патологии. 1976: Т. 42. № 8. Р. 1-6.

45. Логинов А.С. Язвенная болезнь и Hp: новые аспекты патогенетической терапии // М.: Медицина. 1993. 230с.

46. Логинов А.С., Звенигородская Л.А., Тутемен А.В. Эффективность нового пептидного препарата иммунофана в терапии длительно незаживающих язв желудка и 12-перстной кишки // Практикующий врач. 1998. №2. С. 18-20.

47. Логинов А.С., Ильченко А.А. Внутрижелудочная рН-метрия и терапия язвенной болезни антисекреторными препаратами Методические рекомендации. Москва. 1995. С.

48. Лопина О.Д., Котлобай А.А., Рубцов A.M. Молекулярные механизмы регуляции секреции соляной кислоты слизистой оболочки желудка // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997. Т. 7. №6. С. 15-19.

49. Никонов Е.Л. Клинико-патогенетические особенности различных видов антисекреторной терапии у больных кислото-зависимыми заболеваниями // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук // Москва. 2004. 28с.

50. Павлов Т.С., Самонина Г.Е. Противоязвенные эффекты селанка и его дериватов // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов / Тезисы стендовых сообщений. Москва. 2003. С. 85.

51. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Черкасова К.А., Ашмарин И.П. Пептиды как ингибиторы свертывающей активности тромбина и агрегации тромбоцитов // Успехи физиологических наук. 1999. Т. 30. №2. С. 80-91.

52. Полунин, Н.Л. Шеремет, С.М. Нуриева, Д.Л. Баяндин, Л.А. Андреева Применение отечественно препарата семакс в лечение заболеваний зрительного нерва различного генеза // VII Московская научно-практическая офтальмологическая конференция. 2003. С. 39.

53. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Из книги "Актуальные проблемы патофизиологии" под ред. Мороза Б.Б. // М.: "Медицина". 2000. С. 220-353.

54. Рысс Е., Звартау Э. Фармакотерапия язвенной болезни // М.: изд-во "Бином". 1998. С. 14-29.

55. Самонина Г.Е., Жуйкова С.Е. Гомеостаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщение 1. Механизмы поддержания адекватного кровотока в слизистой оболочки желудка // Успехи физиологических наук. 2001а. Т. 32. № 4. С. 60-72.

56. Сафарова Э.Р.,- Шрамм С.И., Золотарев Ю.А. и др. Влияние противоинсультного пептида семакс на выживание культивируемых клеток феохромацитомы крысы при окислительном стрессе // БЭБиМ. 2003. Т. 135. № 3. С. 309-313.

57. Сергеева К.А., Ленькова Н.А., Цукерман Б.М., Мальченко В. Е. Особенности кровообращения в области инфицированной раны // Хирургия. 1982. № 4. С. 23-25.

58. Середенин С.Б., Козловская М.М., Бледнов Ю.А. и др. Изучение противотревожного действия аналога эндогенного пептида тафцина на инбредных мышах с различным фенотипом эмоционально -стрессорной реакции//Журнал ВНД. 1998. Т 48. Вып.1. С. 153-159.

59. Смирнова Е.А. Протекторное действие глипролинов и семакса на стрессогенные нарушения микроциркуляции в брыжейке крыс // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук // Москва. 2004. 23с.

60. Соловьева Н. И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. № 4. С. 245-255.

61. Ставчанский В.В., Дергунова J1.B., Боцина А.Б. и др. Исследование нейропротекторных свойств препаратов семакс и PGP в условиях экспериментальной глобальной ишемии мозга // III Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2007. С. 60.

62. Струков А.И., Чернух A.M. Воспаление // БМЭ. 3-е издание. 1976. Т. 4. С. 413.

63. Тимофеева Н.М., Иезуитова Н.Н., Громова JI.B. Современные представления о всасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих // Успехи физиологических наук. 2000. Т. 31. № 4. С. 24-27.

64. Торопова А.А. Морфофункциональная характеристика экспериментальных повреждений желудка и их фитокоррекция // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2006. Улан-Удэ. 24с.

65. Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Смирнова Е.А, Гусева А.А., Жуйкова С.Е. Секреторная активность тучных клеток при стрессе влияние пептидов пролил-глицил-пролина и семакса // БЭБиМ. 2003. Т. 137. № 10. С. 371-373.

66. Учакина О.Н. Противовирусные и иммуномодулирующие свойства глипролинов // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2007. 113с.

67. Циммерман Я.С. Язвенная болезнь // Клин. мед. 1982. № 2. С. 101105.

68. Эдеева С.Е., Копылова Г.Н., Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Умарова Б.А., Гусева А.А. Протекторные и терапевтические эффекты глипролинов при психоэмоциональном стрессе, вызванным введением ХЦК^ // БЭБиМ. в печати.

69. Aihara Т., Fujishita Т., Kanatani К. et al. Impaired gastric secretion and lack of trophic responses to hypergastrinemia in M3 muscarinic receptor knockout mice // Gastroenterology. 2003. V. 125. P. 1774-1784.

70. Allen A., Flemstrom G.F., Garner A., Kivilaakso E. Gastroduodenal mucosal protection //Physiol. Reviews. 1993. V. 73. N. 4. P. 823-857.

71. Andersson K., Mattsson H., Larsson H. The role of gastric mucosal histamine in acide secretion and experimentally induced lesions in the rat //Digestion. 1990. V. 46. N. 1. P. 1-9.

72. Arakawa Т., Higuchi K., Fukuda T. et al. Prostaglandins in the stomach: an update // J. Clin. Gastroenterol. 1998 V. 27. P. 1-11.

73. Asokan R., Reddy G.K., Dhar S.C. Stydies on the intracellular degradation of newly synthesized collagen in 3-methylcholanthrene induced fibrosarcoma cells //Life. Sci. 1992. V.51. N. 13. P. 1065-1071.

74. Atay S., Tarnawsky A.S., Dubois A. Eicosanoids and the stomach // Prostaglandins Other Lipid mediat. 2000. V. 61. P. 105-124.

75. Ayala A., Chaudry I.H. Immune dysfunction in murine polymicrobial sepsis: mediators, macrophages, lymphocytes and apoptosis // Shock. 1996. N. 6. Suppl. l.P. 27-38.

76. Backwell F.R., Wilson D., Schweizer A. Evidence for a glycyl-prloline transport system in ovine enterocyte brush-border membrane vesicles // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V.125. N2. P. 561-565.

77. Bansil R., Stanley E., Tsukahara M., LaMont J. Mucin biophysics // Annu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 635-657.

78. Baragi V.M., Qiu L., Gunja-Smith Z. et al. Role of metalloproteinase's in the development and healing of acetic acid-induced gastric ulcer in rats // Scand. J. Gastroenterol. 1997. V. 35. N. 5. P. 419-426.

79. Berg R.A., Schwartz M.L., Crystal R.G. Regulation of the production of secretory ptoteins: Intracellular degradation of newly synthesized "defective"collagen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. N. 8. P. 4746-4750.

80. Berisio R., Granata V., Vitagliano L., Zagari A. Characterization of collagen-like heterotrimers implications for triple-helix stability // Biopolimers. 2004. V. 73. N. 6. P. 682-686.

81. Bickel M., Kauffman G. Gastric gel mucus thickness: effect of distention, 16,16-dimethyl prostaglandin e2, and carbenoxolone // Gastroenterology. 1981. V. 80. N. 4. P. 770-775.

82. Bienkowsky R.S. Intracellular degradation of newly synthesized collagen // Revis. Biol. Celular.1989. N. 21. P. 423-43.

83. Bienkowsky R.S., Cowan M.J., Mcdonald J.A., Crystal R.G. Degradation of newly synthesized collagen // J. Biol. Chem. 1978. V. 253. N.12. P. 4356-4363.

84. Bienkowsky R.S., Curran S.F., Berg R.A. Kinetcs of intracellular degradation of newly synthesized collagen // Biochemistry. 1986. V. 25. N 9. P. 245-2459.

85. Black P.H. Stress and inflammatory response: a rewiew of neurogenic inflammation // Brain, Behavior and Immunity. 2002. V. 16. P. 622-653.

86. Blandizzi C., Colucci R., Carignani D. et al. Positive modulation of pepsinogen secretion by gastric acidity after vagal cholinergic stimulation //J. Pharmacol. Exp. Therap. 1997. V. 283. N. 3. P. 1043-1050.

87. Blaser M.J. Hypothesis: the changing relationships of helicobacter pylori and humans: implications for health and disease // J. Infect. Dis. 2000. V. 181.N.2.P. 805-816.

88. Blaser M.J. In world of black and white, helicobacter pylori is gray // Ann. Intern. Med. 1999. V. 130. P. 695-697.

89. Bordi C., D'Adda Т., Azzoni C. et al. Hypergastrinemia and gastric enterochromaffin-like cells // Am. J. Surg. Pathol. 1995. V. 19. P. 8-19.

90. Bregonzio C., Armando I., Ando H., et al. Anti-inflammatory effects of angiotensin II ATI receptor antagonism prevent stress-induced gastric injury // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2003. V. 285. N. 2. P. 414-423.

91. Brown J.F., Hanson P.G., Whittle B.J. Nitric oxide donors increase mucus gel thickness in rat stomach // Eur. J. Pharmacol. 1992. V. 223. P. 103-104.

92. Brown J.F., Keates A.C., Hanson P.J. et al. Nitric oxide generators and cGMP stimulate mucus secretion by rat gastric mucosal cells // Am. J. Physiol. 1993. V. 265. Gastrointest. Liver Physiol. V. 28. P. 418-422.

93. Brzozowski Т., Konturek P., Konturek S. et al. Involvement of cyclo-oxygenase (COX)-2 products in acceleration of ulcer healing by gastrin and hepatocyte growth factor // J. Physiol. Pharmacol. 2000. V. 51. P. 751-773.

94. Byun H.G., Kim S.K. Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from Alaskan pollack skin // J. Biochem. Mol. Biol. 2002. V.35. N. 2. P. 239-243.

95. Castagliuolo I., Lamont J.T., Qiu B. et al. Acute stress causes mucin release from rat colon: role of corticotropin-releasing factor and mast cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1996. V. 271. P. 884-892.

96. Chen D., Zhao C.M., Dockray G.J. et al. Glycine-extended gastrin synergizes with gastrin 17 to stimulate acid secretion in gastrin-deficient mice // Gastroenterology. 2000. V. 119. P. 756-765.

97. Chen R.Y., Ross G., Chyu K. et al. Role of L-arginine -derived nitric oxide in cholinergic dilatation of gastric arterioles // Am. J. Physiol. 1993. V. 265. N. 6. P. 2110-2116.

98. Chiang T.M., Cole F., Woo-Rasberry V. Cloning, characterization, and functional studies of a 47-kDa platelet receptor for type III collagen // J. Biol. Chem. 2002. N. 277. P. 34896-34901.

99. Chiang T.M., Rinaldy A., Kang A.H. Cloning, characterization, and functional studies of a nonintegrin platelet receptor for type I collagen // J. Clin. Invest. 1997. N. 100. P. 514-521.

100. Cho C.H., Ogle C.W. A correlative study of the effects of zinc sulphate in stressed rats// Eur. J. Pharmacol. 1978. V. 48. N. 1. P. 97-105.

101. Chu M.-L., Conway D., Pan T.-C. et al. Amino acid sequence of triple helical domain of human collagen type VI // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. N. 35. P. 18601-18606.

102. Corbett M. E., Boyd E. J., Penston J. G., Wormsley K. G., Watt P. W., Rennie M. J. Pentagastrin increases pepsin secretion without increasing its fractional synthetic rate // Am. J. Physiol. 1995. V. 269. N. 3. P. 418-425.

103. Costa J.J., Harris A.G., Delano F.A., Zweifach B.W., Schmid G.W. Mast cell degranulation and parenchymal cell injury in the rat mesentery // Microcirculation. 1999. V. 6. N. 3. P. 237-244.

104. Coussens L.M., Werb Z. Matrix metalloproteinase's and the development of cancer // Chem. Biol. 1996. V.3. N. 11. P. 895-904.

105. Crowe S.E., Perdue M. H. Functional abnormalities in intestine associated with mucosal mast cells action // Immunol. 1992. V. 4. N. 2. P. 113-117.

106. Curry Т., Osteen J., Osteen K. The matrix metalloproteinase system: changes, regulation, and impact throughout the ovarian and uterine reproductive cycle // Endocrine Reviews. 2003. V. 24. N. 4. P. 428-465.

107. Dalton B.A., McFarland C.D., Underwood P.A., Steele J.G. Role of heparin binding domain of fibronectin in attachment and spreading of human bone-derived cells // J. Cell. Sci. 1995. V. 108. N. 5. P. 2083-2092.

108. Del Valle J., Tsunoda Y., Williams J., Yamada T. Regulation of Са2+., by secretagogue stimulation of canine gastric parietal cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1992a. V. 262. P. 420-426.

109. Del Valle J., Wang L., Gantz I., Yamada T. Characterization of H2 histamine receptor: linkage to both adenylate cyclase and Ca2+.j signaling systems // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1992b. V. 263. P. 967-972.

110. Dempsey R.J., Sailor K.A., Bowen K.K. et al. Stroke-induced progenitor cell proliferation in adult spontaneously hypertensive rat brain: Effect of exogenous IGf-1 and GDNF //J. Neurochem. 2003. N. 87. P. 586-597.

111. Dickson L.A., De Wet W., Di Liberto M. et al. Analysis of the promoter region and the N-propeptide domain of the human proalpha2 (I) collagen gene //Nucleic. Acis Res. 1985. V. 13. N. 10. P. 3427-3438.

112. Dimaline R., Evans D., Varro A., Dockray G. Reversal by omeprazole of the depression of gastrin cell function by fasting in the rat // J. Physiol. (Lond.). 1991. V. 433. P. 483-493.

113. MO.Eglen R.M. Nahorski S.R. The muscarinic M5 receptor: a silent or emerging subtype? // Br. J. Pharmacol. 2000. V. 130. P. 13-21.

114. Ernst H., Grunert S., Schneider H., Beck W., Brune K., Hahn E. Distribution of extracellular matrix proteins in indomethacin-induced lesions in the rat stomach. // Scand J Gastroenterol 1995. V. 30. N. 9. P. 847-853.

115. Fandriks L., Stage L. Simultaneous measurements of gastric motility and acid-bicarbonate secretions in the anaesthetized cat // Acta. Physiol. Scand. 1986. V. 128. N. 4. P. 563-573.

116. Flemstrom G. Effect of catecholamines, Ca+ and gastrin on gastric HCO3' secretion // Acta Physiol. Scand. Suppl.: Gastric ion transport. 1978. P. 81-90.

117. Flemstrom G., Isenberg J.I. Gastroduodenal mucosal alkaline secretion and mucosal protection //News Physiol. Sci. 2001. V.16. P. 23-28.

118. Fox G.J., Wang T.C. Inflammation, atrophy and gastric cancer // J. Clin. Invest. 2007. V. 117. P. 60-69.

119. Friis-Hansen L., Sundler F., Li Y. et al. Impaired gastric acid secretion in gastrin-deficient mice // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1998. V. 274. P. 561-568.

120. Furutani K., Aihara Т., Nakamura E. et al. Crucial role of histamine for regulation of gastric acid secretion ascertained by histidine decarboxylase-knockout mice //J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. V. 307. N. 1. P. 331-338.

121. Galli S.J., Wershil B.K., Bose R, Walker P.A., Szabo S. Ethanol-induced acute gastric injury in mast cells- deficient and cognetic normal mice//Am. J. Pathol. 1987. V. 128. N. 1. P. 131-140.

122. Gardner J.D., Slaan S., Barth J. B. Rabeprazole vs. omeprazole: omset, duration, and magnitude of gastric antisecretory effects // 8 United European Gastroenterology Week. Brussels. 2000. - Abstract. P. 43.

123. Garner A., Flemstrom G. Gastric НСО'з secretion in the guinea pig // Am. J. Physiol. 1978. V.234. N. 6. P. 535-541.

124. Gillessen A., Voss В., Rauterberg J., Domschke W. Distribution of collagen types I, III, IV in peptic ulcer and normal gastric mucosa in man. // Scand. J. Gastroenterol. 1993. V. 28. N.8. P. 688-689.

125. Glavin G., Szabo S. Experimental gastric mucosal injury: laboratory models reveal mechanisms of pathogenesis and new therapeutic strategies // FASEB J. 1992. V. 6. N. 3. P. 825-831.

126. Gronbech J., Lacy E. Role of gastric blood flow in impaired defense and repair of aged rat stomachs // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 1995. V. 269. P. 737-744.

127. Grund E.R., Reed J.D., Sanders DJ. The effect of sympathetic nerve stimulation on acid secretion, regional blood flows and oxygen usage by stomachs of anaesthetized cats // The Journal of Physiology. 1975. V. 248.1. 3. P. 639-647.

128. Guofeng X., Drachenberg C., Yamada M. et al. Cholinergic agonist-induced pepsinogen secretion from murine gastric chief cells is mediated by Mi and M3 muscarinic receptors // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005. V. 289. P. 521-529.

129. Gyomber E., Vattay P., Szabo S., Rainsford K. Role of early vascular damage in pathogenesis of gastric hemorrhagic mucosal lesions inducted by indomethacin in rats. // Int. J. Exp. Pathology. 1996. V. 77. N. 1. P. 16.

130. Hasebe Т., S. Harasawa, T. Miwa, T. Shibata, Inayama. Collagen and collagenase in ulcer tissue-1. The healing process of acetic acid ulcers in rats // Tokai. J. Exp. Clin. Med. 1987. V. 12. N. 3. P. 147-158.

131. Heinemann A., Jocic M., Herzeg G., Holzer P. Tachykinin inhibition of acid -induced gastric hyperemia in the rat // Br. J. Pharmacol. 1996. V. 119. N. 8. P. 1525-1532.

132. Helander K.G., Bamberg K., Sachs G. et al. Localization of mRNA for the muscarinic receptor in rat stomach // Biochem. Biophys. Acta. 1996. V. 1312. P. 158-162.

133. Hersey S.J., Sachs G. Gastric acid secretion // Physiol. Rev. 1995. V. 75. P. 155-189.

134. Hinkle K., Bane G., Jazayeri A., Samuelson L. Enhanced calcium signaling and acid secretion in parietal cells isolated from gastrin-deficient mice // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 2003. V. 284.N. l.P. 145-153.

135. Hodaboam C.M., Bissomette E.Y., Chin B.C., Befiis A.D., Wallace J.L. Prostaglandins inhibit inflammatory mediator release from rat mast cells // Gastroenterology. 1993. V. 104. N. 1. P. 122-129.

136. Hoffmann Т., Reinhold D., Kahne T. et al. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DP IV) by anti-DP IV antibodies and non-substrate X-X-Pro- oligopeptides ascertained by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. А. Г995. V. 716. N. 1-2. P. 355-362.

137. Holm L., Perry M.A. Role of blood flow in gastric acid secretion // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1988. V. 254., Issue 3. P. 281-293.

138. Holzer P. Neuronal emergency system in the stomach // Gastroenterology. 1998. V. 114. N. 4. P. 823-839.

139. Holzer P. Role of sensory nerves in gastroprotection // Abstract of XXXIII Internat. Congr. Physiol. Sci. 1997. St. Peterburg. P.L009.03.

140. Holzer P., Guth P.H. Neuropeptide control of rat gastric mucosal blood flow. Increase by calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal polypeptide, but not substance P and neurokinin A // Circulation Research. 1991. V. 68. P. 100-105.

141. Holzer P., Pabst M., Lippe I. et al. Afferent nerve-mediated protection against deep mucosal damage in the rat stomach // Gastroenterology. 1990. V. 98. P. 838-848

142. Hou W., Li Z., Gordon R., Chan K. et al. Cathepsin К is a critical protease in synovial fibroblast-mediated collagen degradation // Am. J. of Pathology. 2001. N. 159. P. 2167-2177.

143. Hulmes D.J. -The collagen superfamily-diverse structures and assemblies // Essays Biochem. 1992. V. 27. P. 49-67.

144. Ichikawa Т., Ishihara K., Kusakabe T. et al. Distinct effects of tetragastrin, histamine, and CCh on rat gastric mucin synthesis and contribution of NO // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. 138-146.

145. Ichikawa Т., Ishihara K., Saigenji K., Hotta K. Stimulation of mucus glycoprotein biosynthesis in rat gastric mucosa by gastrin // Biochem. Pharmacol. 1993. V. 46. P. 1551-1557.

146. ImbermanM., Oppenheim F., Franzblau C. The appearance of free hydroxyproline as the major product of degradation of newly synthesized collagen in cell culture// Biochim.Biophys. Acta. 1982. V.719. N. 3. P. 480-487.

147. Ioudina M., Uemura E. A three amino acid peptide, Gly-Pro-Arg, protects and rescues cell death induced by amyloid beta-peptide // Exp. Neurol. 2003. V. 184. N. 2. P. 923-929.

148. Ishihara K., Hotta K. Comparison of the mucus glycoprotein's present in the different layers of rat gastric mucosa // Сотр. Biochem. Physiol. A. Physiol. 1993. V. 104B. P. 315-319.

149. Jain R.N., Samuelson L.C. Transcriptional profiling of gastrin-regulated genes in mouse stomach // Physiol. Genomics. 2007. V. 29. P. 1-12.

150. Kafienah W., Bromme D., Buttle D., Croucher L., Hollander A. Human cathepsin К cleaves native type I and II collagens at the N-terminal end of the triple helix // Biochem. J. 1998. V. 331. N. 3. P. 727732.

151. Kageyama T. Pepsinogens, progastricsins and prochymosins: structure, function, evolution and development // Cell. Moll. Life Sci. 2002. V. 59. N. 2. P. 288-306.

152. Kajimura M., Reuben M.A., Sachs G. The muscarinic receptor gene expressed in rabbit parietal cells is the m3 subtype // Gastroenterology. 1992. V. 103. P. 870-875.

153. Kalia N., Brown N., Jacob S. et al. Studies on gastric mucosal microcirculation. 1. The nature of regional variations induced by ethanol injuiy//Gut. 1997. V. 40. P. 31-35.

154. Kaplan A., Silverberg M. Mediators of inflammation: an overview. In: Di Sabato (ed.) Methods in enzymology // New York: Acad. Press/ 1988. V. 163. P. 1-23.

155. Kato M, Asaka M., Ono S. et al. Eradication of Helicobacter pylori for primary gastric cancer and secondary gastric cancer after endoscopic mucosal resection // J. Gastroenterol. 2007. V. 42. P. 16-20.

156. Kato S., Hirata Т., Takeuchi K. Nitric oxide, prostaglandin and sensory neurons in gastric mucosal blood flow response during acid secretion in rats // Gen. Pharmacol. 1997. V. 28. N. 4. P. 513-519.

157. Kauffman G., Reeve J., Grossman M. Gastric bicarbonate secretion: effect of topical and intravenous 16,16-dimethyl prostaglandin E2 // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 1980. V. 239. P. 44-48.

158. Kawano S., Tsuji S. Role of mucosal blood flow: a conceptional review in gastric mucosal injury and protection // J. Gastroenterol. Hepatol. 2000. V. 15. P. 1-6.

159. Kawasaki G., Kato Y., Mizuno A. Cathepsin expression in oral squamous cell carcinoma: relationship with clinicopathologic factors // Oral. Surg. Oral. Med. Oral. Pathol. Oral. Radiol. Endod. 2002. V. 93. N. 4. p. 446-454.

160. Keates A., Hanson P. Regulation of mucus secretion by cells isolated from the rat gastric mucosa //The Journal of Physiology. 1990. V. 423. N. 1. P. 397-409.

161. Keogh J., Allen A., Garner A. Relationship between gastric mucus synthesis, secretion and surface gel erosion measured in amphibian stomach in vitro // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1997. V. 24. N. 11. P. 844-849.

162. Kim S., Byun H., Park P., Shahidi F. Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides purified from bovine skin gelatin hydrolysates // J. Agric. Food. Chem. 2001. N. 49. P. 2992-2997.

163. Kirton С., Wang Т., Dockray G. Regulation of parietal cell migration by gastrin in the mouse // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002. V. 283. N. 3. P. 787-793.

164. Kitagawa H., Takeda F., Kohey H. Effect of endothelium-derived relaxing factor on the gastric lesions induced by HC1 in rats // J. Pharmacol. Exp. Ther. // 1990. V. 253. N. 3. P. 1133-1137.

165. Kobayashi Т., Tonai S., Ishihara Y. et al. Abnormal functional and morphological regulation of the gastric mucosa in histamine H2 receptor-deficient mice // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. N. 12. P. 1741-1749.

166. Koh T.J., Goldenring J.R., Ito S. et al. Gastrin deficiency results in altered gastric differentiation and decreased colonic proliferation in mice //Gastroenterology. 1997. V. 113. P. 1015-1025.

167. Konturek S.J., Brzozowski Т., Pytko-Polonczyk J. et al. Exogenous and endogenous cholecystokinin protects gastric mucosa against the damage caused by ethanol in rats // Eur. J. Pharmacol. 1995. V. 273. P. 57-62.

168. Kramer R.Z., Bella J., Brodsky В., Berman H.M. The crystal and molecular structure of a collagen-like peptide with a biologically relevant sequence//J. Mol. Biol. 2001. V. 311. N. 1. P. 131-147.

169. Kromer W., Baron E., Beinborn M. et al. Characterization of the muscarine receptor type on paracrine cells activated by McN-A-343 in the mouse isolated stomach // Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. 1990. V. 341. P. 165-170.

170. Kubes P., Wallase J. Nitric oxide as a mediator of gastrointestinal mucosal injury? Say it ain't so // Mediators of inflammation. 1995. V.4. P. 397-405.

171. Kuropkat C., Plehn S., Herz U. Tumor marker potential of serum matrix metal loproteinase's in patients with head and neck cancer // Anticancer Res. 2002. V. 22. N. 4. P. 2221-2227.

172. Lamberts R., Creutzfeldt W., Struber H.G. et al. Long-term omeprazole therapy in peptic ulcer disease: gastrin, endocrine cell growth and gastritis //Gastroenterology. 1993. V. 104. P. 1356-1370.

173. Lambrecht N., Burchert M., Respondek M. et al. Role of calcitonin gene-related peptide and nitric oxide in the gastroprotective effect of capsaicin in the rat // Gastroenterology. 1993. V. 104. N. 5. P. 1371-1380.

174. Langhans N., Rindi G., Chiu M. et al. Abnormal gastric histology and decreased acid production in cholecystokinin-B/gastrin receptor-deficient mice // Gastroenterology. 1997. V. 112. P. 280-286.

175. Laskin D.L., Kimura Т., Sakakibara S. Chemotactic activity of collagenlike polypeptides for human peripheral blood neutrophils // J. Leukoc. Biol. 1986. V. 39. N. 3. P. 255-266.

176. Lassen A., Hallas J., Schaffalitsky de Muckadell O.B. The Risk of Missed Gastroesophageal Cancer Diagnoses in Users and Nonusers of Antisecretory Medication // Gastroenterology. 2005. V. 129. P. 1179— 1186.

177. Lau H.K., Ogle C.W. A comparative study of the gastric ulcerogenic effects of stress and rezerpine in rats with decreased stomach wall mast cells populations//Experientia. 1980. V. 36. N. 8. P. 995-996.

178. Le J., Perier C., Peyroche S., Rascle F., Blanchon M.A., Gonthier R., Frey G., Chamson A. Urine glycyl-L-proline increase and skin trophicity //Amino Acids. 1999. V.17. N. 3. P. 315-322.

179. Li Z.Q., Cabero J.L., Mardh S. Gastrin and carbachol require cAMP to elicit aminopyrine accumulation in isolated pig and rat parietal cells // Am. J. Physiol. 1995. V. 268. P. 82-89.

180. Ligumsky M., Sestieri M., Окоп E., Ginsburg I. Antioxidants inhibit ethanol-induced gastric injury in rat. Role of manganese, glycine, carotene // Scand. J. Gastroenterol. 1995. V.30. N. 9. P. 854-860.

181. Lippe I.T., Pabst M.A., Holzer P. Intragastric capsaicin enhances rat gastric acid elimination and mucosal blood flow by afferent nerve stimulation // Br. J. Pharmacol. 1989. V. 96. N. 1. P. 91-100.

182. Lloyd K.C.K., Raybould H.E., Tache Y., Walsh J.H. Role of gastrin, histamine, and acetylcholine in the gastric phase of acid secretion in anesthetized rats // Am. J. Physiol. 1992. V. 262. P. G747-G755.

183. Lyapina L.A., Pastorova V.E., Samonina G.E., Ashmarin LP. The effect of prolil-glycil-proline (PGP) peptide and PGP-rich substances on haemostatic parameters of rat blood // Blood Coagul. Fibrinolysis. 2000. Vol. 11. N. 5. P.409-414.

184. Masuda E., Kawano S., Nagano K. et al. Effect of intravascular ethanol on modulation of gastric mucosal integrity: possible role of endothelin-1 // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 1992. V. 262. P. 785-790.

185. Masuda E., Kawano S., Nagano K. et al. Role of endogenous endothelin in pathogenesis of ethanol-induced gastric mucosal injury in rats // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. 1993. V. 265. P. 474-481.

186. McQueen S., Hutton D., Allen A., Garner A. Gastric and duodenal surface mucus gel thickness in rat: effects of prostaglandins and damaging agents. Am. J. Physiol. 1983. V. 245. N. 3. P. 388-393.

187. Mei J., Bouras M., Erlanson-Albertsson C. Inhibition of insulin release by intraduodenally infused enterostatin-VPDPR in rats // Peptides. 1997. V. 18. N. 5. P. 651-655.

188. Mei J., Erlanson-Albertsson C. Role of intraduodenally administered enterostatin in rats: inhibition of food // Obes. Res. 1996. V. 4. N. 2. P. 161-165.

189. Mercer D.W., Klemm K., Cross J.M. et al. Cholecystokinin-induced protection against gastric injury is independent of endogenous somatostatin // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1996. V. 271. P. 692-700.

190. Merchant N.B., Goodman J., Dempsey D.T. et al. The role of calcitonin gene-related peptide and nitric oxide in gastric mucosal hyperemia and protection // J. Surg. Res. 1995. V. 58. N. 3. P. 344-350.

191. Mertz N.A., Hillings J., Eskerod 0., Bukhave K., Rask M.J. Muscarinic Mi receptor inhibition reduces gastroduodenal bicarbonate secration and promotes gastric prostaglandin E2 synthesis in healthy volunteers // Gut. 1995. V. 36. N. 4. P. 528-533.

192. Metcalfe D.D., Baram D., Mecori Y.A. Mast Cells // Physiological Reviews. 1997. V. 77. N. 4. P. 1033-1064.

193. Mizuno M., Kuboki Y. Osteoblast-related gene expression of bone marrow cells during the osteoblastic differentiation induced by type I collagen//J. Biochem. 2001. N. 129. P. 133-138.

194. Moran Т., Kinzig K. Gastrointestinal satiety signals II. Cholecystokinin // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2004. V. 286. P. 183-188.

195. Moskowitz R.W. Role of collagen hydrolysate in bone and joint disease // Semin. Arthritis Rheum. 2000. V. 30. P. 87-99.

196. Murphy G., Docherty A.J. The matrix metalloproteinase's and their inhibitors // 1992. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. V. 7. N. 2. P. 120-125.

197. Mutoh H. Adaptec cytoprotection in cultured rat gastric-mucus production cells. Role of mucus and prostaglandin synthesis // Dig. Dis. 1995. V. 40. N. 4. P. 872-878.

198. Nagase H. //Zinc Metalloproteinase's in Health and Disease//Ed. N.M. Hooper, Taylor & Francis Ltd., London, 1996. P. 153- 170.

199. Nagase H., Woessner J.F. Matrix metalloproteinase // J.Biol.Chem. 1999. V.274. Issue 31. P. 21491-21494.

200. Nagata A., Ito M., Iwata N. et al. G protein-coupled cholecystokinin-B/gastrin receptors are responsible for physiological cell growth of the stomach mucosa in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 11825-11830. •

201. Nakamura Т., Matsui M., Uchida К. et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor plays a critical role in parasympathetic control of salivation in mice // J. Physiol. 2004. V. 558. N. 2. P. 561-575.

202. Negulescu P.Д., Machen Т.Е. Intracellular Ca regulation during secretagogue stimulation of the parietal cell // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1988. V. 254. P. 130-140.

203. Netzel-Arnett S., Sang Q.X., Moore W.G. et al. Comparative sequence specificities of human 72- and 92-kDa gelatinases (type IV collagenases) and PUMP (matrilysin) // Biochemistry. 1993. V.32. N. 25. P. 6427-32.

204. Nieswandt В., Watson S. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? // Blood. 2003. V. 102. N. 2. P. 449-461.

205. Ota H., Katsuyama T. Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous layer // Histochem J. 1992. V. 24. N. 2. P. 86-92.

206. Overmier J.B., Murison R. Anxiety and helplessness in the face of stress predisposes, precipitates, and sustains gastric ulceration // Behav. Brain Res. 2000. V. 110. P. 161-174.

207. Pfeiffer C.J., Bulbena O., Esplugues J.V., Escolar G., Navarro C., Esplugues J. Anti-ulcer and membrane stabilizing actions of zinc acexamate// Arch. Int. Pharmacodin Ther. 1987. V. 285. N. 1. P. 148-157.

208. Pierce R.A., Deak S.B., Stolle C.A., Boyd C.D. Heterogeneity of rat tropoelastin mRNA revealed by cDNA cloning // Biochemistry. 1990. V. 29. N. 41. P. 9677-9683.

209. Pisegna J.R., Norton J.A., Slimak G.G. et al. Effects of curative gastrinoma resection on gastric secretory function and antisecretory drug requirement in the Zollinger-Ellison syndrome // Gastroenterology. 1992. V. 102. P. 767-778.

210. Postlethwaite A., Kang A. Collagen and collagen peptide-induced chemotaxis of human blood monocytes // J. Exp. Med. 1976. N. 143. P. 1299-1307.

211. Postlethwaite A., Seyer J., Kang A. Chemotactic attraction of human fibroblasts to type I, II and III collagens and collagen-derived peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1978. N. 75. P. 871-875.

212. Prinz C., Zanner R., Gratzl M. Physiology of gastric enterochromaffin-like cells //Annu. Rev. Physiol. 2003. V. 65. P. 371-382.

213. Raffaniello R.D., Raufman J.P. Carbachol activates protein kinase С in dispersed gastric chief cells // Biochem. J. 1994. V. 300. P. 21-24.

214. Ramshaw J.A., Shah N.K., Brodsky B. Gly-X-Y tripeptide frequencies in collagen: a context for host-guest triple-helical peptides // J. Struct. Biol. 1998. V. 122. N. 1-2. P. 86-91.

215. Raufman J.P. Gastric chief cells: receptors and signal-transduction mechanisms//Gastroenterology. 1992. V. 102. P. 699-710.

216. Raufman J.P. Peptic activity and gastroduodenal mucosal damage // Yale. J. Biol. Med. 1996. V. 69. P. 85-90.

217. Raufman J.P., Kasbekar D.K., Jensen R.T. et al. Potentiation of pepsinogen secretion from dispersed glands from rat stomach // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1983. V. 245. P. 525-530.

218. Raufman J.P., Malhotra R., Raffaniello R.D. Regulation of calcium-induced exocytosis from gastric chief cells by protein phosphatase-2B (calcineurin)//Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1357. P. 73-80.

219. Raufman J.P., Sutliff V.E., Kasbekar D.K. et al. Pepsinogen secretion from dispersed chief cells from guinea pig stomach // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1984. V. 247. P. 95-104.

220. Ray A., Henke P.G., Sullivan R.M. Noradrenergic mechanisms in the central amygdalar nucleus and gastric stress ulcer formation in rats // Neurosci. Lett. 1990. V. 110. P. 331-336.

221. Reinhold D., Wrenger S., Bank U. et al. CD26 mediates the action of HIV-1 Tat protein on DNA synthesis and cytokine production in U937 cells // Immunobiology. 1996. V. 195. N. 1. P. 119-128.

222. Rennard S.I., Stier L.E., Crystal R.G. Intracellular degradation of newly synthesized collagen //J. Invest. Dermatol. 1982. V. 79. Suppl 1: P.77-82.

223. Richter С., Tanaka Т., Yada R. Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases: pepsinogen, progastricsin and prochymosin // Biochem. J. 1998. V. 335. N. 3. P. 481-490.

224. Rioux K.P., Wallace J.K. Mast cells activation augments gastric mucosal injury through leucotriene-dependent mechanism// Am. J. Physiol. 1994. V. 266. N. 5. P. 863-869.

225. Sachs G., Shin J., Briving C. et al. The pharmacology of the gastric acid pump: the H+,K+ ATPase // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997. V. 35. P. 277 305.

226. Samonina G., Ashmarin I., Lyapina L. Glyproline peptide Family: review on bioactivity and possible origins // Phatophysiology. 2002. V. 8. P. 229-234.

227. Samonina G., Lyapina L., Kopylova G., Pastorova V., Bakaeva Z., Jeliaznik N., Zuykova S., Ashmarin I. Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simple proline-containing peptides // Patophysiology. 2000. N. 7. P. 69-73.

228. Santoro S.A. Identification of a 160,000 Dalton platelet membrane protein that mediates the initial divalent cation-dependent adhesion of platelets to collagen // Cell. 1986. N 46. P. 913-920.

229. Saura J., Curatolo L., Williams C.E., Gatti S., Benatti L., Peeters C. et al. Neuroprotective effects of Gly-Pro-Glu, the N-terminal tripeptide of IGF-1, in the hippocampus in vitro // Neuroreport. 1999. V. 10. N. 1. P. 161-164.

230. Sawada M., Dickinson C.J. The G cell // Annu. Rev. Physiol. 1997. V. 59. P. 273-298.

231. Sevak R., Paul A., Goswami S., Santani D. Gastroprotective effect of beta-3 adrenoreceptor agonists ZD 7114 and CGP 12177A in rats // Pharmacol. Res. 2002. V. 46. N. 4. P. 351-356.

232. Shah N.K., Ramshaw J.A., Kirkpatrick A. et al. A host-guest set of triple-helical peptides: stability of Gly-X-Y triplets containing common nonpolar residues//Biochemistry. 1996. V. 35. N. 32. P. 10262-10268.

233. Shanin M., Gillessen A., Pohle T. et al. Gastric ulcer healing in the rat: kinetics and localization of de novo procollagen synthesis // GUT. 1997. V.41.P. 187-194.

234. Sinclair N.F., Ai W., Raychowdhury R. et al. Gastrin regulates the heparin-binding epidermal-like growth factor promoter via a PKC/EGFRdependent mechanism // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2004. V. 286. P. 992-999.

235. Singh G., Singh L., Raufman G.P. Y2 receptors for peptide YY and neuropeptide YY on dispersed chief cells from guinea pig stomach // Am. J. Physiol. 1992. V. 262. N. 4. P. 756-762.

236. Staatz W.D., Fok K.F., Zutter M.M. et al. Identification of a tetrapeptide recognition sequence for the alpha 2 beta 1 integrin in collagen // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. Issue 12. P. 7363-7367.

237. Staatz W.D., Rajpara S.M., Wayner E.A. et al. The membrane glycoprotein Ia-IIa (VLA-2) complex mediates the Mg++-dependent adhesion of platelets to collagen // J. Cell Biol. 1989. N. 108. P. 19171924.

238. Steffensen В., Xu X., Martin P.A., Zardeneta G. Human fibronectin and MMP-2 collagen binding domains compete for collagen binding sites and modify cellular activation of MMP-2 // Matrix. Biol. 2002. V. 21. N. 5. P. 399-414.

239. Suganuma Т., Katsuyama Т., Tsukahara M. et al. Comparative histochemical study of alimentary tracts with special reference to the mucous neck cells of the stomach // Am. J. Anat. 1981. V. 161. P. 219238.

240. Sutliff V.E., Rattan S., Gardner J.D., Jensen R,T. Characterization of cholinergic receptors mediating pepsinogen secretion from chief cells // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 1989. V. 257. P. 226-234.

241. Takako S., Fassler R., Hohenester E. Laminin: the crux of basement membrane assembly // JCB. 2004. V. 164. N. 7. P. 959-963.

242. Takeuchi K., Ishihara Y., Kunimi H., Okabe S. Effects of New mast cells stabilizer, on gastric secretion and various acute gastric lesions in rats //Agents Actions. 1984. V. 14. N. 5-6. P. 637-642.

243. Takeuchi K., Kato S., Takehara K. et al. Role of nitric oxide in mucosal blood flow response and the healing // Digestion. 1997. V. 58. N. 1. P. 1924.

244. Takeuchi K., Ueshima K., Okabe S. Stimulation of gastric bicarbonate secretion by an analog of thyrotropin-releasing hormone, YM-14673, in the rat//J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. V. 256. N. 3. P. 1057-1062.

245. Tanaka M. Effect of medical vagotomy and sympathectomy on gastric mucosal prostaglandins in water immersion restrain rats // Nippon. Shokakibuo. Gakkai. Zasshi. 1995. V. 92. N. 8. P. 1133-1142.

246. Tarnawski A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing // Dig. Disease and Sciences. 2005. V. 50. Suppl. 1. P. 2433.

247. Tarnawski A., Holander D., Stachura J. et al. Vascular and microvascular changes key factors in the development of acetic acid-induced gastric ulcers in rats // J Clin Gastroenterol. 1990. V. 12. P. 148157.

248. Tarnawski A., Stachura J., Krause W.J. et al. Quality of gastric ulcer healing: a new, emerging concept // J. Clin. Gastroenterol. 1991. V. 13. P. 42-47.

249. Tatsugushi Y., Fukuda M., Ishizaki N. et al. Localization of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in normal human and rabbit stomachs // J. Cell. Biochem. 2004. V. 92. N. 3. P. 481490.

250. Tepperman B.L., Whittle B.J. Comparison of the neuropeptide Y and noradrenaline on rat gastric mucosal blood flow and integrity // Br. J. Pharmacol. 1991. V. 102. N. 1. P. 95-100.

251. Tsutsui S., Shinomura Y., Higashiyama S. et al. Induction of heparin binding epidermal growth factor-like growth factor and amphiregulin mRNAs by gastrin in the rat stomach // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 235. P. 520-523.

252. Tuncel N., Erkasap N., Ahinturk V. et al. Protective effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on stress-induced gastric ulceration in rats // Annals of the New York Academy of Sciences. 1998. V. 865. P. 309-322.

253. Vural K.M., Oz M.C., Liao H. et al. Membrane stabilisation in harvested vein graft storage; effects on adhesion molecule expression and nitric oxide synthesis // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1999. V. 16. N. 2. P. 150-155.

254. Wallace J., Ma L. Inflammatory mediators in gastrointestinal defense and injury // Experimental Biology and Medicine. 2001. V. 226. P. 10031015.

255. Walsh J.H. Gastrointestinal hormones // In: Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Johnson L.R. New York: Raven. 1994. P. 9-11.

256. Wess J. Molecular biology of muscarinic acetylcholine receptors // Crit. Rev. Neurobiol. 1996. V. 10. P. 69-99.

257. Wilkes J.M., Kajimura M., Scott D.R. et al. Muscarinic responses of gastric parietal cells // J. Membr. Biol. 1991. V. 122. P. 97-110.

258. Wilson L.M., Baldwin A.L. Effects of environmental stress on the architecture and permeability of the rat mesenteric microvasculature // Microcirculation. 1998. V. 5. N. 4. P. 299-308.

259. Wu J., Fujioka M., Sugimoto K. et al. Assessement of effectiveness of oral administration of collagen peptide on bone metabolism in growing and mature rats // J. Bone Miner. Metab. 2004. N. 22. P. 547-553.

260. Wu S., Giraud A., Mogard M. et al. Effects of inhibition of gastric secretion on antral gastrin and somatostatin gene expression in rats // Am. J. Physiol. 1990. V. 258. P. 788-793.

261. Xie G., Drachenberg C., Yamada M., et al. Cholinergic agonist-induced pepsinogen secretion from murine gastric chief cells is mediated by Mi and M3 muscarinic receptors // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005. V. 289. P. 521-529.

262. Yao, D.F.; Zhang, Y.F.; Zhou, Y.F. Effects of Ejiao (colla corii asini) on the hemodynamics, hemorheology and microcirculation during endotoxin shock in dogs // Zhong guo Zhong Yao Za Zhi. 1989. V.4. P. 44-46.

263. Yelken В., Dorman Т., Erkasap S. et al. Clonidine pretreatment inhibits stress-induced gastric ulcer in rats // Anesth. Analg. 1999. V. 89. N. 1. P. 159-162.

264. Yokotani K., Okuma Y., Osumi Y. Inhibition of vagally mediated gastric acid secretion by activation of central prostanoid EP3 receptors in urethane-anaesthetized rats // Br. J. Pharmacol. 1996. V. 117. N. 4. P. 653-656.

265. Yoshika M., Erickson R., Woodley J.F. et al. Role of rat intestinal brush border membrane angiotensin-converting enzyme in dietary protein digestion // Amer. J. Physiol. Gastroenterol. 1987. V. 253. P. 781-786.

266. Zeng N., Walsh J.H., Kang T. et al. Selective ligand-induced intracellular calcium changes in a population of rat isolated gastric endocrine cells // Gastroenterology. 1996. V. 110. P. 1835-1846.