Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние некоторых пролинсодержащих пептидов на гомеостаз слизистой оболочки желудка в экспериментах на животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых пролинсодержащих пептидов на гомеостаз слизистой оболочки желудка в экспериментах на животных"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи ЖУЙКОВА Светлана Евгеньевна

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ НА ГОМЕОСТАЗ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА ЖИВОТНЫХ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Специальность - 03.00.13 - Физиология

Москва - 2003

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных (заведующий - академик РАМН И.П. Ашмарин) Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант — доктор биологических наук, профессор

Г.Е. Самонина.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

В.И. Гриднева Р.У. Островская Т.С. Попова

Ведущая организация:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт питания.

Защита состоится 13 октября 2003 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д501.001.93. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 13 сентября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, докт. биол. наук г )(1 <1 Б.А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время появились основания для выделения в новое семейство регуляторных пептидов простейших пролин- и глицинсодержащих пептидов - глипролинов - в том числе PGP, PG, GP (Ашмарин и др., 2002). Их биоактивность связана с торможением ряда элементов кровесвертывания и тромбоза (Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин, Пасторова и др., 1998), поддержанием гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) (Абрамова и др. 1996; 1997; Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин, Самонина и др., 1999), регуляцией активности лейкоцитов (Haddox et al., 1999; Watanabe et al., 1994). Они также входят в состав ряда пептидов, относящихся к другим семействам регуляторных пептидов, например, энтеростатинов, ß-казоморфинов и др. (Ашмарин и др., 2002).

Глипролины имеют два вероятных источника образования - эндогенный и экзогенный (Ашмарин и др., 2002). Первый связан с синтезом коллагена в фибробластах и с его катаболизмом. Коллаген чрезвычайно богат аминокислотами пролином и глицином в последовательности PG, GP, в меньшей степени PGP, GGP, GPG (Мазуров, 1974; Хилькин и др., 1976). Известно, что перед секрецией из коллагенсинтезирующих клеток коллаген проходит стадию созревания, состоящую в частичном разрушении уже собранных полипептидов. При этом около 90% деградированной части коллагена секретиру-ется из клеток в виде малых пептидов, состоящих менее чем из 5 аминокислот (Bienkowski et al., 1978). Именно этот процесс может быть источником глипролинов, хотя прямых доказательств этому пока нет.

Катаболизм коллагена (а также другого белка, богатого GP и PG фрагментами - эластина), по-видимому, также может приводить к образованию глипролинов. Этот процесс в здоровом организме практически не изучен. На сегодняшний день существуют данные о значительном увеличении GP (и других дипептидов, содержащих на С-конце пролин или оксипролин) в моче при заболеваниях кожи (Faul! et al., 1976; Le et al., 1999) и об образовании PGP при разрушении сетчатки глаза (Pfïster et al., 1995).

Экзогенным источником глипролинов могут служить коллаген и эластин, поступающие в организм с пищей. Известно, что часть ди- и трипептидов проникают из кишечника в энтероциты в неизменном виде (Addison et al., 1975; Bai, Amidon, 1992). Есть прямые указания на проникновение в кровь из кишечника значительных количеств гидроксипролинсодержащих пептидов при приеме препаратов коллагена в форме желатина (Ашмарин и др., 2002).

Было показано, что прием желатина крысами в течение 5-10 дней, также как и пероральное введение PGP, приводит к уменьшению агрегации тромбоцитов (Ляпина и др., 2002). В связи с этим заслуживает изучения и способность коллагена в виде желатина проявлять не только антитромботические, но и гастропротективные качества,

По-видимому, экзогенными источниками глипролинов могут являться и искусственно синтезированные пептиды, имеющие в своем составе последовательность PGP, такие как семакс и селанк. Они были получены путем присоединения последовательности PGP к С-концу таких нестабильных in vivo регуляторных пептидов, как АКТГ4.7 и тафцин соответственно. Наличие пролита в молекулах синтетических пептидов привело к значительно большей их устойчивости к действию протеаз, что позволило существенно увеличить длительность действия пептидов и оптимально решить проблему реализации их лекарственного потенциала (Ашмарин и др., 1997; Бойко и др., 1998; Ро-tamanetal., 1991).

Изучение влияния семакса (MEHFPGP) на процессы кровесвертывания и тромбоза показало, что присоединение последовательности PGP к АКТГ4.7 не только усилило его изначальную биологическую активность, но и дополнило ее эффектами самого PGP. Так, in vivo семакс обладает несколько меньшей, чем у глипролинов, но достаточно выраженной антикоагулянтной, фибрино-литической и антитромбоцитарной ативностью. In vitro семакс нейтрален по отношению к параметрам гемостаза, что наводит на мысль о том, что для осуществления влияния на процессы фибринолиза и тромбоза необходим гидролиз семакса до PGP (Ашмарин и др., 1996; Ашмарин, 2001).

Защитные свойства глипролинов в отношении СОЖ ранее были показаны на крысах только для дозы 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении (Абрамова и др. 1996). До сих пор не были изучены ни физиологические механизмы действия этих пептидов на гомеостаз СОЖ, ни, тем более, молекулярные. В связи с этим, актуальными являлись исследования влияния глипролинов как на устойчивость СОЖ к повреждающим агентам, так и на основные параметры гомеостаза слизистой оболочки желудка: секрецию кислоты, пепсина, бикарбонатов, желудочный кровоток и т.д. Большой интерес представляло также изучение влияния на гомеостаз СОЖ семакса и выявление доли участия PGP в гастропротективных эффектах этого гептапептида.

В настоящее время в литературе нет данных о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролинов, за исключением цикло-PG (эндогенного анксиолитика), обнаруженного в мозге крыс и мышей (Гудаше-ва и др. 1996; Середенин и др., 2002; Gudasheva et al., 1996). Динамика концентраций глипролинов в тканях и жидкостях организма после их перораль-ного и парентерального введения также неизвестна. В связи с открывающейся перспективой использования глипролинов и/или их предшественников в качестве антитромботических и противоязвенных агентов назрела необходимость целенаправленных исследований этих концентраций как в экспериментах на животных, так и у людей.

С другой стороны хочется отметить, что актуальным является не только комплексное изучение глипролинов, как нового класса регуляторных пептидов, но и сама проблема сохранения целостности слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов. Это связано

с тем, что у людей язвенная болезнь относится к числу наиболее часто встречающихся заболеваний внутренних органов. По данным клиницистов ее распространенность среди взрослого населения составляет в настоящее время 7%-10%. Еще более высокой (14%-16%) оказывается частота язвенной болезни по материалам патологоанатомических исследований (Рысс, Звартау, 1998).

Широкая распространенность заболевания, хроническая форма болезни с постоянной угрозой осложнений, неэффективность современных лекарственных средств в плане предупреждения рецидивов, требует поиска более эффективных профилактических и лечебных противоязвенных средств. В связи с этим изучение гастропротективных свойств и механизмов действия глипролинов на гомеостаз СОЖ может иметь прямой выход в фармакологию. При этом несомненными преимуществами глипролинов и/или их источников перед другими лекарственными средствами могли бы стать комплексность воздействия, низкая токсичность, отсутствие привыкания и побочных эффектов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния глипролинов - пептида PGP и его метаболитов (PG и GP), а также вероятных источников глипролинов - коллагена и семакса - на повреждения СОЖ различной этиологии; определение основных механизмов действия PGP и семакса на гомеостаз желудка; изучение метаболизма PGP в организме при разных способах введения.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. В экспериментах на животных исследовать влияние PGP и его метаболитов - PG, GP, пролина и глицина - на целостность слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов.

2. Изучить возможность проявления защитных свойств глипролинов в отношении СОЖ при введении их в составе семакса и коллагена.

3. Для определения основных механизмов защитного действия глипролинов в отношении слизистой оболочки желудка исследовать влияние PGP и семакса на

• секрецию кислоты, бикарбонатов и пепсиногена в желудке;

• базальный и уменьшенный повреждающими факторами кровоток в СОЖ;

• базальную и стимулированную секрецию тучных клеток;

• процессы воспаления и регенерации при повреждении слизистой оболочки желудка.

4. Определить время жизни PGP в крови и основной путь его деградации при разных способах введения в организм.

5. Исследовать возможность проникновения PGP и его метаболитов через гематоэнцефалический барьер, а также возможность накопления их в тканях желудочно-кишечного тракта и перераспределения между органами при кратковременном иммобилизационном стрессе.

Научная новизна. В экспериментах на животных показаны гастропротек-тивные свойства PGP и его метаболитов - PG и GP — в широком диапазоне концентраций при воздействии различных повреждающих факторов. Впервые выявлены защитные свойства в отношении слизистой оболочки желудка веществ, имеющих в своем составе последовательность PGP — семакса и коллагена в форме желатина.

Установлено, что PGP и семакс уменьшают как базальную, так и вызванную раздражением блуждающего нерва секрецию соляной кислоты в желудке. Семакс одновременно уменьшает секрецию пепсиногена и кратковременно стимулирует базальную секрецию бикарбонатов.

Для PGP, PG и семакса обнаружена способность нормализовать желудочный кровоток, нарушенный ульцерогенными агентами.

Выявлено, что PGP, GP, PG и семакс активизируют процессы рубцевания и эпителизации в зоне повреждений СОЖ, вызванных уксусной кислотой. Для PGP и GP продемонстрирована способность уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта на 5-й день после аппликации уксусной кислоты.

Впервые показано, что PGP и семакс могут стабилизировать тучные клетки при стрессе.

С помощью меченого тритием PGP установлена относительно высокая устойчивость трипептида к гидролизу. Впервые получены прямые доказательства прохождения PGP через стенку кишечника в неизменном виде, определены основные пути его деградации при разных способах введения.

Показано проникновение радиоактивной метки в мозг и накопление ее в желудочно-кишечном тракте после внутрибрюшинного введения в виде [3H]PGP. Установлено, что кратковременный иммобилизационный стресс может изменять распределение радиоактивной метки между органами через 30 мин после введения [3H]PGP, увеличивая ее содержание в мозге и желудке и уменьшая в кишечнике.

Положения, выносимые на защиту. Представитель глипролинов PGP обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии. Его метаболиты — PG и GP -обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP - центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипептидов.

Наличие в составе пептидов и белков последовательности PGP может наделять их биоактивностью глипролинов, что убедительно показано для семакса и коллагена в форме желатина.

Гастропротективный эффект глипролинов и семакса носит комплексный характер. Он связан с уменьшением повреждающих факторов желудочного

сока (кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как кровоток и бикарбонаты.

Величина противоязвенного эффекта PGP сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин. Несомненным преимуществом PGP перед амилином является то, что последний имеет ярковыраженную гормональную активность, что может приводить к побочным эффектам при его использовании.

PGP относительно устойчив к гидролизу в желудочно-кишечном тракте и внутренних средах организма. Он способен в неизменном виде проникать из кишечника в кровь. Основным устойчивым метаболитом PGP в организме является дипептид PG. Обнаружение радиоактивной метки в мозге после системного введения меченого тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая ее концентрацию в мозге и желудке.

Практическое значение. Показанное в экспериментах на животных гас-тропротективное действие может дать обоснование необходимости предкли-нических исследований PGP и/или его метаболитов - PG и GP - в качестве противоязвенных препаратов. Высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочного тракта в неизменном виде, сохранение противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение препарата в виде удобных для приема человеком таблети-рованных и капсулированных форм. Положительное влияние PGP и его метаболитов на широкий спектр механизмов, принимающих участие в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка (секрецию, кровоток, воспалительные процессы) делает их применение независимым от этиологии и типа патогенетических факторов, приведших к язвообразованию.

В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролкнов - коллагена (в виде желатина) - открываются широкие перспективы профилактики нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем рехулирования пищевого рациона человека и/или применения белков соединительной ткани в виде пищевых добавок.

Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До сих пор этот пептид применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического перепарата. Наличие у него гастропротективных свойств сделало возможным применение семакса в комплексной терапии язвенной болезни (Иваников и др., 2002).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлении на XVII съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998); Конференции Международного общества гастроэнтерологов и гепатологов (Испания, 1998); Международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999); II объединенной Всероссийской и всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург - Гастро-2000" (Санкт-Петербург, 2000); II Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000); VI Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2000); Международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева (Санкт-Петербург, 2001); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические науки - клинической гастроэнтерологии» (Ессентуки 2001); III Российском научном форуме "Санкт-Петербург - Гастро-2001" (Санкт-Петербург, 2001); XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); Всероссийской конференции, посвященной 95-летию со дня рождения В.А. Пегеля (Томск, 2001); IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,

2002); IV Российском научном форуме "Санкт-Петербург - Гастро-2002" (Санкт-Петербург, 2002); заседаниях кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 1999, 2002), заседаниях кафедры медико-биологических дисциплин Глазов-ского государственного педагогического института (Глазов, 1998, 1999,

2003).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 240 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 362 источника, из них 88 отечественных и 274 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 52 рисунками, содержит 11 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование защитных свойств изучаемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка при воздействии различных повреждающих факторов

Эксперименты проводили на самцах белых беспородных крыс массой 250-300 г после 24 ч голодания при свободном доступе к воде. В работе были использованы три разные модели, отличающиеся по основным механизмам, приводящим к нарушению целостности СОЖ — этаноловая, индометацино-вая и иммобилизационный водоиммерсионный холодовой стресс. На этано-ловой модели повреждения СОЖ вызывали внутрижелудочным введением 96° этанола в дозе 1 мл/200 г веса. Индометацин вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. Для создания стресса животных, иммобилизованных в положении лежа на спине, погружали в воду с температурой 16°С на 3 часа. Жи-

вотных умерщвляли через 1 ч после введения спирта, через 3 часа после введения индометацина или начала стресса. Тяжесть повреждений в желудках оценивали с помощью бинокулярной лупы с окуляр-микрометром, определяя суммарную площадь геморрагических областей в мм2.

PGP и его возможные метаболиты - PG, GP, пролин и глицин, растворенные в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно в дозе 3,7 мкмоль/кг (1; 0,6; 0,6; 0,4; и 0,3 мг/кг соответственно) за 1 ч до стресса или введения этанола, через 10 мин после введения индометацина. В качестве позитивного контроля на этаноловой модели были использованы атропин и новый панкреатический гормон амилин в дозах, оказывающих выраженный противоязвенный эффект - 1 мг/кг (Tamok et al., 1986) и 0,5 мкг/кг (Герман и др., 1997) соответственно. Вещества сравнения вводили внутрибрюшинно по той же схеме, что и PGP. Контрольные животные вместо растворов пептидов получали эквивалентный объем физиологического раствора.

На этаноловой и стрессорной моделях язвообразования была также изучена дозозависимость защитных свойств пептидов. Пептиды PGP, PG и GP вводили по той же схеме, что и в предыдущих опытах в эквимолярных концентрациях - 0,2; 0,5; 1,6; 3,7; 5,3 и 53 мкмоль/кг (для PGP это 0,04 - 14,3 мг/кг; для дипептидов 0,03 - 9 мг/кг). Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора.

При пероральном введении были изучены защитные свойства PGP (3,7 мкмоль/кг) и возможного источника глипролинов - желатина (частично разрушенного коллагена) - на этаноловой модели язвообразования. PGP вводили за 1 ч до индукции этаноловых повреждений внутрижелудочно. Желатин применяли в качестве пищевой добавки. Опытные животные в течение 7 дней получали комбикорм, смешанный с желатином в соотношении 9:1 (примерно 712 г/кг желатина в сутки), после чего у них вызывались этаноловые повреждения. Опытные животные питались комбикормом без желатина.

Защитные свойства еще одного возможного донора PGP — семакса (MEHFPGP) - в отношении СОЖ были изучены на всех трех используемых моделях язвообразования. Семакс вводили по той же схеме, что и PGP в дозе 50 мкг/кг (0,06 мкмоль/кг), для которой ранее были показаны выраженные антиамнестические и антигипоксические свойства (Ашмарин и др., 1997; Каплан и др., 1992; Яснецов и др., 1998). На этаноловой модели была изучена также зависимость защитных эффектов семакса от дозы вводимого препарата. Были использованы дозы 12,5; 25; 50 и 100 мкг/кг.

Изучение возможных механизмов защитного действия пептидов в отношении слизистой оболочки желудка

Возможные механизмы действия на гомеостаз СОЖ были изучены для PGP, семакса и амилина (в качестве вещества сравнения) в дозах, оказывающих выраженные противоязвенные эффекты - 1 мг/кг, 50 мкг/кг и 0,5 мкг/кг соответственно.

Влияние PGP, семакса и амилина на базальную и стимулированную раздражением блуждающего нерва секрецию кислоты и бикарбонатов в желудке наркотизированных крыс изучали с применением компьютеризированного метода непрерывного измерения рН и РСОг раствора, орошающего слизистую оболочку желудка при его интралюминальной перфузии (Золотарев и др., 1996; Guttu etal., 1991).

Одновременно в желудочном перфузате определяли количество пепсино-гена спектрофотометрически гемоглобиновым методом (Blandizzi et al., 1997) в собственной модификации.

Базальный и нарушенный ульцерогенными агентами желудочный кровоток наркотизированных крыс на фоне введения физраствора, PGP и его возможных метаболитов (PG, GP, пролина и глицина в дозах, эквимолярных дозе 1 мг/кг PGP), а также семакса и амилина измеряли методом водородного клиренса (Демченко 1976; Самонина и др. 1999). Нарушение кровотока вызывали подкожным введением индометацина (25 мг/кг) или внутрижелудоч-ным введением этанола (0,7 мл, 96°).

Было изучено также влияние PGP, семакса и амилина на состояние туч-ноклеточной популяции у крыс в норме и после стимуляции стрессом. Для оценки секреторной активности тучных клеток использовали морфометриче-ский анализ функционального состояния тучноклеточной популяции в пленочных препаратах, полученных из образцов брыжейки и подкожной клетчатки, фиксированных в формалине и окрашенных специфическим красителем гепарина - толуидиновым синим (Линднер и др., 1980; Умарова, 2000).

Для изучения влияния пептидов на скорость заживления повреждений в СОЖ и степень воспаления в области язвенного дефекта, была использована ацетатная модель язвообразования по S.Okabe и соавт. (1971) в собственной модификации. Оценку площади язв, гистологический и цитологический контроль (определение степени заживления, процентного соотношения клеток лейкоинфильтрационного компонента и степени сохранности нейтрофилов) в области язвенного дефекта проводили на 5 или 10 день после аппликации на серозную оболочку желудка ледяной уксусной кислоты.

Пептиды PGP, PG и GP в эквимолярных концентрациях (3,7 мкмоль/кг) и семакс в дозе 50 мкг/кг (0,06 мкмоль/кг) вводили внутрибрюшинно один раз в день, начиная со дня операции. Контрольные животные по той же схеме получали инъекции физиологического раствора.

Изучение метаболизма PGP в организме

Для изучения метаболизма PGP в организме кроликов и крыс был использован меченый тритием PGP, полученный в Институте молекулярной генетики РАН методом высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена водорода на тритий (Золотарев и др., 2000).

Кроликам [3H]PGP (80 Ки/ммоль) вводили из расчета 200 мкКи на животное в смеси с немеченым пептидом (1 мг/кг) тремя разными способами: внутрибрюшинно и внутрижелудочно в виде водного раствора, и перорально 10

в виде сухого препарата в капсулах, нерастворимых в желудке. Кровь (2,5 мл) собирали из ушной вены в пробирку с гепарином (25 Ед/мл крови) через 15, 30, 60, 180 и 300 мин после введения пептида. Экстрагирование PGP, PG и GP из плазмы проводили путем последовательного смешивания с 80% аце-тонитрилом и метанолом.

Выделение [3H]PGP и его метаболитов - [3H]PG и [3H]GP - из полученных образцов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометром Beckman 165 при длинах волн 220 и 254 нм, колонкой «Kromasil» (4x150 мм), зернение 5 мкм при 20°С. Полученные образцы в смеси с PGP, PG и GP (по 10 мкг каждого пептида) подвергали градиентному элюированию в смеси элюэнтов А (0,1% трифторуксусная кислота) и В (80% метанол в элюэнте А) с выделением пиков PGP, PG, и GP. Использовали градиент от 0% до 13% элюэнта В за 22 мин. Количественное содержание PGP, PG и GP в экстрактах из плазмы крови рассчитывали по данным содержания радиоактивности под каждым из пиков. Кроме того, для оценки количества радиоактивной метки, связанной с аминокислотами, образовавшимися после деградации введенного PGP и включенными в собственные белки плазмы крови, измерялась суммарная радиоактивность белковых фракций, осажденных при центрифугировании.

Крысам [3H]PGP (190 Ки/ммоль) вводили внутрибрюшинно или внутри-желудочно (20 мкКи на животное) в смеси с немеченым пептидом (1 мг/кг). Кровь, мозг, желудок, кишечник, печень забирали на холоду через 15, 30, 60, 180 и 300 мин после введения пептида. Половину животных перед умерщвлением подвергали кратковременному (10 мин) иммобилизационному стрессу путем фиксации их в положении лежа на спине.

Экстрагирование PGP и его возможных метаболитов проводили аналогично вышеописанному. В плазме крови был проведен анализ количества метки, связанной собственно с трипептидом методом ВЭЖХ, как это описано выше.

Препараты

В работе были использованы короткие пептиды PG и GP, фирмы Sigma (США), пептиды PGP и семакс, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН, аминокислоты глицин и пролин фирмы Reanal (Венгрия), крысиный амилин фирмы Bachem California (США) был предоставлен профессором Дж. Купером из Оклендского университета (Новая Зеландия), ин-дометацин фирмы "TroyaPharm" (Болгария), уретан фирмы ICN (США), атропина сульфат фирмы Sigma (США).

Статистическая обработка

Статистическую обработку результатов проводили с помощью теста ANOVA из компьютерного пакета программ STATISTICA. Различия считались значимыми при р<0,05. Данные представляли в виде среднего + стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование защитных свойств изучаемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка при воздействии различных повреждающих факторов

Гастропротективные эффекты PGP (1 мг/кг (3,7 мкмоль/кг), внутрибрю-шинно) в экспериментах на крысах были продемонстрированы на всех трех использованных моделях вызова повреждений СОЖ: этаноловой, индомета-циновой и стрессорной. PGP уменьшал площадь повреждений желудка у опытных животных по сравнению с контрольными примерно на 60% (рис. 1).

На этаноловой модели язвообразования для сравнения защитных свойств PGP в отношении СОЖ с таковыми у уже известных препаратов были использованы атропин и амилин. Атропин - М-холинолитик с выраженной антисекреторной и противоязвенной активностью, показанной как в экспериментах на животных, так и при лечении людей с язвенной болезнью (Рысс, Звартау, 1998; Tarnok et al., 1986). В связи с тем, что вещества пептидной природы в настоящее время в клинике для лечения язвенной болезни практически не применяются, в качестве пептидного вещества сравнения нами

Рис. 1. Влияние эквимолярных концентраций PGP и его метаболитов на этаноло-вые (А), индометациновые (Б) и стрессорные (В) повреждения СОЖ у крыс.

Доза всех веществ 3,7 мкмоль/кг. Отрицательные величины свидетельствуют об увеличении язвообразования у опытных крыс по сравнению с контрольными. * Р<0,05 ** Р<0,01 *** Р<0,001 по отношению к контролю, # Р<0,05 по отношению к PGP и PG (на рис. А), по отношению к PGP и GP (на рис. В). п=21-28 в каждой группе.

был выбран новый панкреатический гормон амилин, для которого были показаны выраженные противоязвенные эффекты на разных моделях язвообра-зования в экспериментах на животных (Герман и др., 1997; Guidobono, 1998).

Сравнение противоязвенных свойств PGP с атропином и амилином в дозах, для которых ранее были показаны выраженные гастропротективные эффекты (1 мг/кг, 1 мг/кг и 0,5 мкг/кг соответственно) показало, что PGP на этаноловой модели защищал СОЖ от повреждений примерно в 2 раза эффективнее, чем атропин (р<0,05) и показывал тенденцию к более выраженному противоязвенному действию по сравнению с амилином (р>0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Сравнение защитных свойств PGP, атропина и амилина в отношении повреждений СОЖ, вызванных этанолом.

Доза PGP-1 мг/кг, атропина- 1 мг/кг, амилина-0,5 мкг/кг. * Р<0,05; ** Р<0,005 по отношению к контролю, # - Р<0,05 по отношению к PGP. п=10-12 в каждой группе.

В дозе 1 мг/кг при ежедневном введении PGP также ускорял заживление язв желудка, вызванных аппликацией уксусной кислоты (рис. 3). Изучение дозозависимости гастропротективных эффектов трипептида в диапазоне концентраций 0,2-53 мкмоль/кг на этаноловой и стрессорной модели язвообразо-вания показало, что противоязвенные эффекты PGP проявляются при дозе 0,5 мкмоль/кг и мало меняются при увеличении дозы в 10-100 раз (рис. 4).

40

контроль

Рис. 3. Влияние PGP, PG, GP и семакса на ацетатное язвообразование у крыс через 5 дней после аппликации кислоты.

* Р<0,05; ** Р<0,01 по сравнению с контролем. п=7-21 в каждой группе.

го

г

г 11«

о

% " » ■ • 1А * к>' \

----- 'Y ; _

OJ М 1,« 9.7 «.»

Ц2 0,5 3,7 5,3 ДЙП, ишаль/в-

Рис. 4. Дозозависимость влияния пептидов PGP, PG и GP на этаноловое (А) и стрессорное (S) язвообразование у крыс.

* Р<0,05 Р<0,01 *** Р<0,001 по отношению к контролю; # Р<0,05 по отношению к PGP и PG (на рис. А)', к PGP и GP (на рис. £). п—10-33 для каждой дозы.

В связи с тем, что в организме при гидролизе PGP могут появляться как PG и GP, так и пролин и глицин, возникает вопрос о возможном участии этих дипептидов и аминокислот в защитных свойствах трипептида PGP в отношении СОЖ. Для оценки вклада аминокислот и дипептидов в противоязвенные эффекты PGP в настоящем исследовании на трех разных моделях вызова повреждений СОЖ (этаноловой, индометациновой и стрессорной) было осуществлено изучение влияния внутрибрюшинного введения пролина и глицина в дозах, в молярном выражении сопоставимых с ранее вводимой дозой PGP - 1 мг/кг (3,7 мкмол/кг). Кроме того, были изучены гастропротек-тивные свойства PG и GP в дозе 3,7 мкмоль/кг на индометациновой и ацетатной модели язвообразования, и в диапазоне концентраций 0,2-53 мкмоль/кг - на этаноловой и стрессорной.

Было показано, что в отличие от PGP, исследуемые дипептиды и аминокислоты в эквимолярных PGP дозах проявляют дифференцированное воздействие на язвообразование, которое зависит от дозы вводимого препарата и вида повреждений (рис. 1,4).

Так, PG в дозах 0,5-3,7 мкмоль/кг, уменьшая этаноловое язвообразование примерно в 2 раза, малоэффективен как ангиульцерогенный агент во время стресса (рис. 1, 4). GP, напротив, в этих дозах уменьшает стрессорные повреждения СОЖ более чем на 70%, при этом площадь этаноловых повреждений он не только не уменьшает, но и проявляет тенденцию к их увеличению (рис. 1,4). Увеличение дозы пептидов до 53 мкмоль/кг приводит к тому, что разница между PGP, PG и GP в эффективности защиты СОЖ от повреждений, вызванных этанолом и стрессом, исчезает. Все три пептида в этой дозе уменьшают площадь повреждений примерно на 60-70% (рис. 1, 4). Одинаковую противоязвенную активность проявляют PGP, GP и PG в дозе 3,7 мкмоль/кг и при индометациновом язвообразовании (рис. 1).

Что касается ацетатного язвообразования, то величина защитного эффекта зависит от времени применения пептидов. На 5 день введения исследуемых препаратов (что соответствует 5 дню после индукции ацетатных язв) по эффективности противоязвенного воздействия пептиды располагались в следующем порядке: PG>GP>PGP. PG уменьшал среднюю площадь язв у опытных животных по сравнению с контрольными примерно на 80%, PGP - на 60% (рис. 3). На 10 день после индукции язв наблюдалось значительное заживление язв и у контрольных животных: средняя площадь язв уменьшалась с 26,9+5,3 мм2 у пятидневного контроля до 6,3+0,9 мм2 у десятидневного. После десяти дней введения пептида наиболее значительное ускорение заживления наблюдалось у крыс, получающих GP. Средняя площадь язв в этой группе животных составляла 2,0+1,0 мм2.

Что касается аминокислот, то пролин в дозе 3,7 мкмоль/кг обладает противоязвенной активностью (в 2 раза меньшей, чем у PGP) только на этаноло-вой модели язвообразования (рис. 1). Глицин уменьшает этаноловое и стрес-сорное язвообразование практически в той же мере, что и PGP, но неэффективен при введении индометацина: на этой модели он, как и пролин, не только не уменьшает площадь повреждений, но даже несколько ее увеличивает (р>0.05) (рис. 1).

Таким образом, часть гастропротективных эффектов PGP может быть связана с высвобождением глицина, или со способностью PGP, PG и GP взаимодействовать с рецепторами глицина. С другой стороны, исследования показали, что PGP, PG, GP отличаются друг от друга и от аминокислот про-лина и глицина по своим противоязвенным эффектам на разных моделях вызова язв, что может свидетельствовать в пользу наличия у глипролинов собственных рецепторов. Возможно, из-за жесткой структуры пролина, молекулы PGP, PG и GP отличаются по своей конформации и, соответственно, по сродству к рецепторам, чем и обуславливается разница в их воздействии на организм.

Наиболее стабильное и хорошо выраженное защитное действие PGP в отношении СОЖ на всех изученных моделях язвообразования, по-видимому, может быть связано как с действием самого трипептида в целом, так и с удачным сочетанием противоязвенных свойств всех его возможных метаболитов. Полученные данные могут служить обоснованием необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов - PG и GP - в качестве новых противоязвенных препаратов.

При длительном приеме лекарств наиболее удобными для человека являются те из них, которые можно применять перорально. В связи с этим в следующей серии экспериментов PGP в дозе 1 мг/кг вводили за 1 ч до введения этанола внутрижелудочно. Было показано, что и при этом способе введения у трипептида сохраняются выраженные противоязвенные эффекты (рис. 5) вполне сопоставимые с таковыми при энтеральном введении PGP (рис. 1).

1 - контроль 2-PGP З-тлпин

Рис. 5. Влияние PGP и желатина, применяемых в качестве пищевых добавок на этаноловые повреждения СОЖ у крыс.

* Р<0,05 по отношению к своему контролю. п=12-20 в каждой группе.

Теоретически источником глипролинов при поступлении в организм с пищей и переваривании в желудочно-кишечном тракте могут служить белки соединительной ткани - эластин и коллаген (Ашмарин и др., 2002; Ашмарин, Каразеева и др., 1998). В связи с этим на этаноловой модели язвообразования в настоящей работе были изучены защитные свойства в отношении СОЖ желатина (частично разрушенного коллагена). Наши эксперименты показали, что добавление желатина к корму крыс в соотношении 1:9 в течение 7 дней перед индукцией этаноловых повреждений, уменьшает язвообразование примерно на 40%, то есть имеет сходный по величине противоязвенный эффект с PGP, вводимым внутрижелудочно за 1 час до этанола (рис. 5). Существует большая вероятность того, что защитный эффект желатина в отношении СОЖ связан с расщеплением его белков в том числе и до GP, PG и PGP, и частичным всасыванием их в неизменном виде в кровь.

Кроме соединительнотканных белков, источниками глипролинов могут быть, по-видимому, и другие белки, имеющие в своем составе последовательность PGP, такие как казоморфины, энтеростатины и синтетические производные АКТГ4.7 и тафцина - семакс и селанк (Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин и др., 2002).

Изучение влияния семакса на гомеостаз СОЖ в наших экспериментах показало, что семакс, как и PGP, обладает способностью защищать СОЖ от повреждений, вызванных различными ульцерогенными агентами - этанолом, индометацином, стрессом, уксусной кислотой. В дозе 50 мкг/кг (0,06 мкмоль/кг) семакс уменьшал площадь повреждений СОЖ у опытных животных, по сравнению с контрольными, на 50-80% (рис. 3, 6). Уменьшение или увеличение дозы семакса в 2 раза на этаноловой модели язвообразования практически не изменяло противоязвенных свойств пептида (рис. 6).

Гастропротективные эффекты семакса проявляются в дозах, в молярном отношении гораздо меньших, чем у PGP. Так, на этаноловой модели вызова язв, семакс уменьшал площадь повреждений в интервале доз 0,01-0,12

мкмоль/кг (12,5-100 мкг/кг) (рис. 6), тогда как противоязвенные эффекты PGP на этой модели выявлялись только при дозах, равных или больших 0,5 мкмоль/кг (рис. 4). Это свидетельствует о том, что, в отличие от влияния на гемостаз, где для осуществления влияния на процессы фибринолиза и тромбоза необходим гидролиз семакса до PGP (Ашмарин и др., 1996; Ашмарин, Пасторова и др., 1998; Черкасова и др., 2001), защита семаксом СОЖ от повреждений связана, по-видимому, не только с разрушением семакса до PGP, но и определяется действием гептапептида в целом.

До сих пор семакс использовался в клинике в основном в качестве анти-амнестического и антигипоксического препарата при ишемических инсультах (Гусев и др., 1997; Мясоедов и др., 1999; Хугаева, Александрии, 1997). Наличие у него гастропротективных свойств делает возможным использование семакса в комплексной терапии язвенной болезни. На основании полученных нами данных были проведены первые исследования семакса в качестве дополнительного лечения при язвенной болезни желудка у человека. Было показано, что добавление семакса к стандартным схемам лечения ускоряет рубцевание длительно незаживающих язв и у человека (Иваников и др., 2002).

доза, мкмоль/кг

0 контроль ■самакс 0,06 игаоль/кг

Рис. 6. Влияние семакса на этаноловые (А) стрессорные (Я) и индометациновые (В) повреждения СОЖ у крыс.

* Р<0,05; ** Р<0,01; ***Р<0,001 по отношению к контролю. п=12-27 в каждой группе.

Изучение возможных механизмов защитного действия исследуемых пептидов в отношении СОЖ

До настоящего времени механизм действия глипролинов на гомеостаз СОЖ практически не был изучен.

Ни у кого не вызывает сомнения, что повреждения СОЖ возникают при нарушении равновесия между факторами кислотно-пептической агрессии желудочного содержимого и элементами защиты СОЖ (Рысс, Звартау, 1998; Höjgaard et al., 1996). Агрессивное звено язвообразования включает в себя повышение выработки соляной кислоты и пепсина. Ослабление защитных факторов слизистой оболочки желудка может возникать в результате снижения выработки и нарушения качественного состава желудочной слизи, уменьшения концентрации бикарбонатов, ухудшения процессов регенерации и нарушения кровоснабжения СОЖ (Рысс, Звартау, 1998; Allen et al., 1993; Flemström, Isenberg, 2001).

Особо хочется отметить, что даже в тех случаях, когда язвы развиваются на фоне нормальной секреции кислоты и пепсина, антисекреторные препараты имеют выраженный лечебный эффект (Рысс, Звартау, 1998). В связи с этим, в первую очередь представляло интерес изучение влияния PGP и се-макса на желудочную секрецию и сравнение его с таковым у амилина, для которого ранее уже были показаны антисекреторные эффекты в отношении секреции соляной кислоты (Герман и др., 2001; Лукъянцева, 2002; Guidobono et al., 1994) и который был выбран в качестве вещества сравнения.

Настоящее исследование подтвердило антисекреторную активность амилина в отношении как базальной, так и стимулированной электрическим раздражением блуждающего нерва продукции HCl (рис. 7). Показано, что PGP и семакс в антиульцерогенных дозах (1 мг/кг и 50 мкг/кг соответственно) также уменьшают секрецию соляной кислоты. При этом максимальный антисекреторный эффект этих пептидов в отношении базальной секреции несколько превышает таковой у амилина и примерно одинаков с амилином в отношении секреции, вызванной раздражением блуждающего нерва (рис. 7).

Вдо введения впервые 40 мин В1-. раздражение В2-« раздражения

Ввторые 40 мин

Рис. 7. Влияние PGP, семакса и амилина на базальную (¡4) и стимулированную (Б) секрецию соляной кислоты в желудке наркотизированных крыс.

* Р<0,05; ** Р<0,01 по отношению к контролю. п=5-8 в каждой группе.

Особенностью действия PGP и семакса является то, что развитие максимального антисекреторного эффекта при изучении базальной секреции кислоты требует довольно длительного времени (примерно 50-60 мин после введения). Вероятно, это связано с последствиями запуска отставленных во времени каскадных механизмов, приводящих к все большему подавлению секреции HCl. С другой стороны, значительное ингибирующее влияние на секрецию кислоты, вызванную раздражением блуждающего нерва, проявляется у PGP и семакса уже через 5-15 мин после введения (рис. 7). Возможно, что у изученных пептидов существуют разные пути подавления базальной и стимулированной раздражением блуждающего нерва секреции HCl.

Изучение влияния исследуемых пептидов на желудочную секрецию показало, что семакс и амилин одновременно с продукцией соляной кислоты подавляют базальную и стимулированную секрецию пепсиногена. PGP такой способностью не обладал (рис. 8).

Рис. 8. Влияние PGP, семакса и амилина на базальную (А) и стимулированную (Б) секрецию пепсиногена в желудке наркотизированных крыс.

Количество пепсиногена пропорционально количеству определяемого в пробах пепсина, в который он превращался в условиях наших экспериментов (30 мин при 37°С и рН=2,5). * Р<0,05 по отношению к контролю. п=5-8 в каждой группе.

Известно, что пепсин играет роль патогенного фактора при развитии язвенной болезни, расщепляя белки желудочной слизи и мембран клеток СОЖ (Raufinan, 1992). Многие исследования посвящены относительной роли кислоты и пепсина в язвообразовании. В большинстве из них получены данные об определяющей роли именно пепсина, а не кислоты. Перфузия желудка возрастающими дозами соляной кислоты может и не приводить к повреждениям в желудке. Добавление пепсина даже при самой маленькой концентрации кислоты вызывает развитие язв в СОЖ (Nagashima, Samloff, 1985; Raufinan, 1996). Возможно, что именно разное влияние на секрецию пепсиногена является основным отличием в механизмах действия PGP и семакса. Как уже отмечалось выше, семакс защищает СОЖ от повреждений в дозах

(рис. 6), которые в молярном выражении гораздо меньше тех, при которых проявляются противоязвенные эффекты PGP (рис. 1,4).

Эксперименты не показали выраженного влияния амилина и PGP на ба-зальную секрецию бикарбонатов в желудке и выявили кратковременное активирующее действие на базальную бикарбонатную секрецию только у се-макса (рис. 9).

мин

■ контроль —•—семакс —*— PGP —о— амилин

Рис. 9. Влияние PGP, семакса и амилина на базальную секрецию бикарбонатов в желудке наркотизированных крыс.

Стрелкой обозначен момент введения пептидов. По оси ординат - продукция НСО'з, выраженная в % к исходному уровню (до введения препаратов). * Р<0,05 по отношению к контролю. п=5-8 в каждой группе.

Во время раздражения блуждающего нерва на фоне введения исследованных пептидов наблюдалось некоторое уменьшение секреции бикарбонатов (р>0,05), но не смотря на это, отношение суммарной продукции кислоты к суммарной концентрации бикарбонатов при введении и PGP, и семакса, и амилина оставалось достоверно меньшим, чем в контроле.

Таким образом, одним из возможных механизмов показанных противоязвенных эффектов PGP и семакса является снижение как базальной, так и вызванной раздражением блуждающего нерва секреции кислоты в желудке, которое сравнимо с таковым у амилина. Для семакса и амилина впервые показана способность одновременно с подавлением секреции кислоты снижать секрецию пепсиногена, что также уменьшает агрессивные свойства желудочного сока и защищает СОЖ от повреждений. Семакс, в отличие от PGP и амилина, может также увеличивать защитные компоненты желудочного сока через кратковременное увеличение базальной секреции бикарбонатов.

Как правило, одно лишь увеличение секреции кислоты и пепсина, без изменения защитных свойств СОЖ, не вызывает деструктивных изменений в 20

стенке желудка. Известно, что многие экспериментальные модели вызова язв, в том числе стресс, введение этанола и нестероидных противовоспалительных соединений, сопровождаются значительным нарушением микроциркуляции в СОЖ и что одним из возможных механизмов действия противоязвенных препаратов может быть улучшение желудочного кровотока, уменьшенного ульцерогенными агентами (Kalia et al., 1997; Katsura et al., 1994; Kawano et al., 1996; Sato et al., 1995). В связи с этим, было изучено влияние PGP и его возможных метаболитов (PG, GP, пролина и глицина), а также семакса и амилина на базальный и уменьшенный индометацином кровоток в желудке наркотизированных крыс.

Было показано, что введение PGP, семакса и аминокислот пролина и глицина не влияло на базальный кровоток. PG и GP несколько уменьшали его на 60 и 60-90 мин после введения соответственно. Амилин уменьшал базальный кровоток с 60 мин после введения на 35%. Падение кровотока под воздействием этого пептида сохранялось до конца эксперимента.

Введение индометацина вызывало достоверное и стойкое уменьшение кровотока в СОЖ (рис. 10). Введение через 10 мин после индометацина пептидов PGP и PG препятствовало действию индометацина и приводило к постепенному возвращению уровня кровотока практически к исходному уровню, семакс и пролин также препятствовали падению кровотока, но их эффективность была меньше, чем у PGP и PG. Для GP, глицина и амилина способность увеличивать уменьшенный индометацином кровоток в СОЖ не была обнаружена (рис. 10). PGP возвращал также к норме желудочный кровоток, уменьшенный внутрижелудочным введение спирта.

Рис. 10. Влияние PGP, его метаболитов (PG, GP, Р, G), а также семакса и амилина на желудочный кровоток, уменьшенный индометацином.

На рисунке представлены данные через 120 мин после введения исследуемых веществ на фоне действия индометацина. По оси ординат - уменьшение желудочного кровотока в процентах к базальному кровотоку (до введения препаратов). * Р<0,01; ** Р<0,001 по отношению к контролю (базальный кровоток), # Р<0,001 по отношению к уровню кровотока, уменьшенного индометацином. п=5-8 в каждой группе.

Таким образом, для PGP, PG и семакса улучшение нарушенного ульцеро-генными агентами желудочного кровотока может быть еще одним механизмом, с помощью которого эти пептиды защищают СОЖ от различных повреждений.

Влияние на желудочный кровоток глипролинов может быть связано с непосредственным влиянием на сосуды. На изолированном сегменте аорты крыс было показано, что все три пептида в широком диапазоне концентраций (Ю^-Ю-4 М) вызывают уменьшение норадреналинового тонуса сосудов. При этом они имеют разные механизмы действия. PGP и PG вызывают увеличение выработки NO эндотелием, a GP действует непосредственно на гладкомышечные клетки стенок сосудов (Бакаева и др., 2003).

Изменение желудочного кровотока может быть связано и с улучшением реологических свойств крови и усилением лимфотока. Так, PGP, PG и GP in vivo и iv vitro увеличивают скорость фибринолиза, уровень тканевого плаз-миногена, уменьшают количество ингибиторов плазмина (Lyapina et al., 2000; Ашмарин и др., 1996; 2002). Все исследованные глипролины усиливают частоту и амплитуду сокращений лимфатических сосудов брыжейки крыс (Ашмарин, Каразеева, Лелекова, 1999).

Остается неясным, почему GP, в отличие от PGP и PG, уменьшает ба-зальный желудочный кровоток и не изменяет кровоток, уменьшенный индо-метацином, несмотря на показанные для него антикоагуля нтно-фибринолитические свойства и способность расширять кровеносные сосуды. Такая же картина наблюдается и для амилина. Он уменьшает базальный кровоток, практически не влияя на кровоток, нарушенный индометацином (рис. 10). При этом обладает эндотелийнезависимым сосудорасширительным действием на изолированной аорте и брыжеечной артерии крыс и увеличивает амплитуду и частоту сокращений лимфатических сосудов брыжейки (Лукьянова, 2002).

В литературе нет данных, которые могли бы быть привлечены к объяснению механизмов действия пролина на желудочный кровоток. Что касается семакса, то ранее для этого пептида отмечали возможность улучшения мозгового кровотока при ишемии (Ашмарин и др., 1997; Хугаева, Александрии, 1997). Предполагают, что усиление кровоснабжения мозга, а также уменьшение боли мигренозного типа этим гептапептидом связано в основном с его спазмолитическим действием. Он уменьшает сосудистый тонус в бассейне внутренних сонных артерий, улучшает венозный отток (Королева и др., 1996). Эффекты возникают через 30 мин после введения, что может свидетельствовать об участии в спазмолитических эффектах семакса в том числе и образовавшегося в результате гидролиза гептапептида трипептида PGP. Вероятно, спазмолитический эффект пептида может проявляться не только в отношении мозговых сосудов, но и в отношении сосудов желудка.

Важнейшим элементом тканевого гомеостаза является деятельность тучных клеток. Они вырабатывают, сохраняют и секретируют большое количество биологически активных веществ, обладающих как про-, так и противо-

воспалительными свойствами, влияющих на иммунные процессы, тканевую репарацию и ангиогенез (Metcalfe et al., 1997). Имеются работы, демонстрирующие корреляцию между тяжестью повреждения слизистой оболочки желудка при ульцерогенных воздействиях и степенью секреторной активности тучных клеток, а также наличие у веществ, стабилизирующих тучные клетки, противоязвенных свойств (Gali et all., 1987; Rioux, Wallace, 1994; Takeuchi et al., 1986).

Ранее показано, что стрессорные воздействия приводят к резкому усилению секреторной активности тучных клеток (Умарова, 2000; Умарова и др., 1994; Overmier et al., 2000). В связи с этим нами было исследовано влияние PGP, семакса и амилина на базальную и активированную водоиммерсион-ным иммобилизационным стрессом активность тучных клеток с одновременной регистрацией степени повреждения СОЖ.

Ни PGP, ни семакс, ни амилин не изменяли базальную активность тучных клеток. Водоиммерсионный иммобилизационный стресс приводил к резкому увеличению индекса дегрануляции (отношению количества дегранулирован-ных клеток в популяции к общей сумме исследованных клеток) как в подкожной клетчатке, так и в брыжейке (рис. 11) и появлению повреждений в СОЖ. Введение исследуемых пептидов за 1 час до стресса приводило к достоверному уменьшению площади повреждений у опытных животных по сравнению с контрольными. Параллельно они предотвращали усиление секреторной активности тучных клеток: на фоне введения этих пептидов возрастание индекса дегрануляции под влиянием стресса было значительно меньше (рис. 11).

брыжейка подножная клетчатка

□ норма В контроль 0 амилин Всамакс OPGP

Рис. 11. Влияние PGP, семакса и амилина на секреторную активность тучных клеток после стресса.

За норму принимали индекс дегрануляции тучных клеток у нестрессированных животных, за контроль - стрессированных после введения физраствора. * Р<0,001 по отношению к контролю, # Р<0,05 по отношению к норме.

Таким образом, PGP и семакс не влияют на базальную секрецию тучных клеток, но обладают выраженным стабилизирующим действием на популяцию тучных клеток в подкожной клетчатке и брыжейке при стрессе. При этом эффективность их действия вполне сопоставима с таковой у амилина, для которого способность стабилизировать тучные клетки была показана ранее (Герман и др., 2001; Лукьянцева, 2002), и который был выбран в качестве позитивного контроля.

Снижение секреторной активности тучных клеток, вероятно, приводит к уменьшению высвобождения комплекса факторов, способствующих повреждению тканей: гистамина, фактора активации тромбоцитов, протеаз и др. Изученные вещества, следовательно, могут обладать противовоспалительным действием. Кроме того, представляется возможной регуляция секреции кислоты и пепсиногена в желудке, так как уменьшение выброса гистамина должно приводить к снижению стимуляции его Н2-рецепторов на главных и обкладочных (Hill et al., 1997) клетках СОЖ.

Известно, что вещества, уменьшающие воспаление в зоне повреждений СОЖ и усиливающие процессы пролиферации приводят к ускорению заживления язвенных дефектов (Allen et al., 1993; Bregonzio et al., 2003; Watanabe et al., 2002). В связи с этим было изучено влияние пептидов PGP, его метаболитов PG и GP, а также семакса на степень воспаления в зоне язвенного дефекта и скорость заживления повреждений СОЖ на модели ацетатных язв в желудке крыс. Гистологический и цитологический контроль язв проводили на 5 и 10 день после аппликации уксусной кислоты.

Как уже указывалось выше, пятидневное введение пептидных препаратов после индукции ацетатных язв приводило к значительному уменьшению площади повреждений у опытных животных по сравнению с контрольными (рис. 3). Гистологический контроль показал, что на 5 день после индукции язв у большинства контрольных животных наблюдались язвенные дефекты с разрушением тканей, проникающие до мышечного слоя стенки желудка или прободные язвы, с проникновением в другие органы, в основном в печень. Дно язв было покрыто обильным гнойно-некротическим налетом. В тканях наблюдался отек и воспалительный экссудат, основную массу которого составляли нейтрофильные лейкоциты.

Что касается опытных животных всех групп, то скорость развития репа-ративных процессов была различной у разных животных, но у большинства из них наблюдалось исчезновение большей части некротической ткани, развитие грануляционной ткани, частичное восстановление эпителия.

Оценка с помощью цитограмм степени выраженности воспалительного процесса в зоне язвенного дефекта показала, что на 5 день после индукции язв у контрольных животных в цитологических отпечатках нейтрофильный компонент составлял 37+10% от общего количества клеток воспалительного экссудата, 27+6% из них было разрушено (в норме эти показатели для СОЖ крыс составляли 9+1% и 3+2% соответственно) (рис. 12). В цитограммах,

полученных от животных, которым вводили пептидные препараты, количество нейтрофилов варьировало в зависимости от вида применяемого лечения. PGP и GP уменьшали количество нейтрофилов в отпечатках до 18+2% и 23+10% соответственно, одновременно значительно увеличивая их сохранность. GP и семакс также несколько увеличивали сохранность нейтрофилов, но их действие не было достоверным (рис. 12).

К десятому дню по гистологическому строению язвенные дефекты практически не отличались у контрольных и опытных животных - активация ре-паративных реакций приводила к развитию молодой соединительной ткани (рубцеванию) и значительной эпителизации поверхности язв. Различия состояли в площади и глубине оставшихся язвенных дефектов: у животных, получающих пептидные препараты, эти показатели были меньше.

Таким образом, все исследованные пептиды в той или иной мере ускоряют заживление ацетатных язв у крыс. Это достигается путем ускорения процессов очищения зоны повреждения от некротических масс, образования грануляционной ткани и скорости эпителизации язвенных дефектов. Кроме того, PGP и GP при введении их в течение 5 дней после аппликации уксусной кислоты обладают противовоспалительным действием - уменьшают относительное количество нейтрофилов и увеличивают их сохранность в области повреждения СОЖ (рис. 12).

А Б

во -г

количество нейтрофилов нейтрофилов

□ норма ^контроль 0PGP SPG BGP Нсемакс

Рис. 12. Влияние PGP, PG, GP и семакса на состав (А) и сохранность (Б) лейкоин-фильтрационного компонента в цитологических препаратах отпечатков с поверхности ацетатных язв у крыс на 5-й день после аппликации кислоты.

По оси ординат на рисунке А - процентное содержание нейтрофилов к общему количеству лейкоцитов в цитологических препаратах, на рисунке Б - количество разрушенных нейтрофилов в процентах к их общему количеству в отпечатках. За норму принимали показатели у здоровых животных, за контроль - у животных с язвами при введении физраствора. * Р<0,05; ** Р<0,01 по отношению к своему контролю, # Р<0,05 по отношению к норме. п=7-14 в каждой группе.

Подводя итоги, хочется отметить, что гастропротективное действие гли-пролинов и семакса иосит комплексный характер и связано с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (базальной и стимулированной секреции кислоты и пепсиногена), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как кровоток и бикарбонаты и ускорением скорости регенерации слизистой оболочки желудка.

Изучение метаболизма PGP в организме

В области практического применения эндогенные пептиды привлекают исследователей прежде всего тем, что действуют в очень маленьких концентрациях и практически не имеют побочных эффектов. Препятствием в их применении обычно служит небольшое время жизни в крови и разрушение в желудочно-кишечном тракте, что делает невозможным их применение в удобных для человека таблетированных и капсулированных формах.

В связи с обнаружением у PGP защитных свойств в отношении СОЖ, а, значит, и с появившейся перспективой его использования в медицинской практике, был изучен метаболизм пептида в экспериментах на кроликах при трех разных способах введения: внутрибрюшинном, внутрижелудочном и внутрикишечном.

Было показано, что при внутрибрюшинном введении пик концентрации PGP в плазме крови достигается через 30 мин (рис. 13) после введения и его содержание в плазме составляет примерно 4,5% от общего количества введенного пептида. Часть PGP (примерно 2% от введенного) сохраняется в неизменном виде в течение 5 ч после введения (рис. 13), что существенно превышает время существования в крови большинства других олигопептидов, время жизни которых обычно не превышает нескольких минут (Бойко и др., 1998; Bowyer et al., 1991). Длительное существование PGP в неизменном виде, по-видимому, объясняется наличием в его молекуле остатков пролина, который устойчив к действию протеаз (Ашмарин и др., 2002; Тимофеева и др., 2000; Cunningham, O'Connor 1997).

Изучение биологических эффектов PGP, PG и GP свидетельствовали о значительном совпадении направленности и силы воздействия на язвообра-зование и кровоток в желудке (рис. 1, 4), параметры гемостаза (Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Пасторова и др., 1998), тонус изолированной аорты крыс (Бакаева и др., 2003) у PGP с PG, а не с GP. Исследование метаболизма PGP подтвердило предположение, что основным метаболитом PGP является дипептид PG, т.е. деградация идет в основном за счет отщепления пролина с С-конца трипептида. GP образуется примерно в 3-4 раза меньше, чем PG (рис. 13).

Что касается образующихся при гидролизе PGP аминокислот, то известно, что они быстро утилизируются организмом для синтеза собственных

мин

мин

Рис. 13. Содержание PGP и его метаболитов - PG и GP - в плазме крови кроликов после внутрибрюшинного (А), внутрижелудочного (£) и внутрикишечного (В) введения [3H]PGP.

белков и пептидов. Так в отношении глицина показано, что через 2 часа после внутрибрюшинного введения 83,6% от введенного количества аминокислоты используется на синтез пептидов и белков, 16,4% - катаболизируется (Бродин, Янович, 1996). Наши эксперименты показали, что в первые 60 мин после введения PGP, количество метки в белках плазмы сопоставимо с суммарным количеством метки, связанной с PGP и его метаболитами - PG и GP. В дальнейшем радиоактивность осаждаемых белков возрастает, а количество метки, связанной с изучаемыми олигопептидами, наоборот, падает, то есть происходит дальнейшая деградация PGP и дипептидов до аминокислот и включение их в белки крови.

Главным препятствием на пути применения регуляторных пептидов в качестве лекарственных средств обычно служит их неустойчивость в крови и тканях организма. Показанная нами относительно высокая стабильность PGP, PG и GP в плазме крови открывает перспективы для успешного применения их в клинике.

Другим препятствием к применению регуляторных пептидов служит их быстрый гидролиз в желудке и кишечнике, что исключает возможность их энтерального введения. Проведенное нами исследование показало, что при внутрижелудочном и внутрикишечном введении (в капсулах, нерастворимых в желудке) меченого тритием PGP, в плазме крови обнаруживается интакт-ный трипептид. Максимальное его количество, наблюдаемое на 30-60 мин после введения, составляло примерно 1,5%-1,7% от введенного количества. В крови в течение 5 ч эксперимента обнаруживались также дипептиды PG и GP (рис. 13).

Внутрижелудочное, и внутрикишечное введения дают разное соотношение трипептида и его метаболитов. При внутрижелудочном введении PG в крови циркулирует примерно в 3 раза больше, a GP столько же, сколько и PGP, тогда как при внутрибрюшинном (через 60 мин после введения) и внутрикишечном введении концентрация PGP и PG в крови практически одинаковая, a GP - в три раза меньше (рис. 13). Различия в метаболизме изучаемого трипептида при разных способах введения, по-видимому, обусловлены тем, что при парентеральном введении препарат гидролизуется в основном и в первую очередь пептидазами плазмы крови, тогда как при пероральном введении образование метаболитов обусловлено их расщеплением протеаза-ми желудочно-кишечного тракта и эффектом "первого прохождения через печень".

В связи с тем, что PG и GP сами по себе обладают дифференцированным воздействием на слизистую оболочку желудка (PG более эффективен как противоязвенный агент при этаноловой модели язвообразования, a GP - при стрессорной) (рис. 4), полученные результаты могут в дальнейшем помочь в создании наиболее эффективных форм лекарственных препаратов, адаптированных к определенным видам поражений СОЖ.

Установленная высокая способность глипролинов проникать в кровь при внутрижелудочном введении объясняет факт сохранения конечных физиологических и лечебных эффектов при энтеральном введении PGP (рис. 5). Очевидна важность этого свойства глипролинов для лечебного их применения наиболее практичными способами.

Полученные нами данные о том, что PGP, PG и GP могут проникать в кровь из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде позволяют также косвенно подтвердить возможность поступления глипролинов в организм из внешнего источника - поступающих с пищей белков соединительной ткани - коллагена и эластина и объясняют защитные свойства желатина, примененного нами в качестве пищевой добавки для профилактики этаноловых повреждений в желудке (рис. 5).

Таким образом, открывается возможность воздействия на уровень глипролинов плазмы, а значит и осуществления их биологических эффектов посредством регуляции состава пищи. Введение синтетических глипролинов может быть предпочтительно в силу большей строгости дозирования, однако, и диетический путь заслуживает внимания, так как в этом случае язвооб-разование может быть подавлено наиболее простым путем - внутрижелу-дочным введением продуктов, состоящих преимущественно из соединительнотканных белков.

Гастропротективные эффекты глипролинов, по-видимому, могут осуществляться как на периферическом так и на центральном уровне. Обнаружение радиоактивной метки в мозге крыс после внутрибрюшинного введения меченого тритием PGP говорит о возможности проникновения изучаемого пептида и/или его метаболитов через гематоэнцефалический барьер и осуществления части эффектов глипролинов на центральном уровне (рис. 14).

0,12 т

кровь мозг печень дно кишечник

желудка

Рис. 14. Изменение уровня радиоактивной метки, введенной внутрибрюшинно в виде [3Н]РСР, в мозге и органах желудочно-кишечного тракта крыс после иммобили-зационного стресса.

Темные столбики - уровень радиоактивности до стресса, светлые - после стресса. * Р<0,05 по отношению к нестрессированным животным. п=6.

г I 1

Иммобилизационный стресс может изменять распределение радиоактивной метки между органами, вызывая ее аккумуляцию в мозге и дне желудка и уменьшая в кишечнике (рис. 14).

Известно, что большая часть стрессорных воздействий увеличивает кровоснабжение мозга, в то время как поступление крови в органы желудочно-кишечного тракта при стрессе уменьшается (Bryan et al., 1990; Kuwahira et al., 1993; Sorbye et al., 1994; Zang et al., 1997). Вполне вероятно, что увеличение радиоактивной метки в мозге и уменьшение ее в кишечнике связанно именно с феноменом изменения кровоснабжения этих органов во время стресса. С другой стороны, существуют сведения, что мозговой кровоток во время иммобилизационного стресса уменьшается (Dvorska et al., 1992; Sharma et al., 1986). При этом отмечается нарушение гематоэнцефалического барьера (Dvorska et al., 1992; Sharma et al., 1986), которое способствует большему проникновению пептидов в мозг (Sharma et al., 1986). Нарушение гематоэнцефалического барьера может быть применено в качестве еще одной версии для объяснения факта увеличения радиоактивной метки в тканях мозга во время стресса в наших опытах.

Факт накопления PGP и его метаболитов в тканях дна желудка вопреки отмеченному в литературе уменьшению кровоснабжения во время стресса (Sorbye et al., 1994; Zhang et al., 1997), возможно, говорит о существовании активного захвата PGP и его метаболитов и становится особенно важным, если предположить, что противоязвенные эффекты глипролинов могут осуществляться при непосредственном влиянии на ткани желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы по признакам сходной биологической активности и общему происхождению в отдельную группу регуляторных пептидов были выделены ди- и трипептиды, имеющие в своем составе аминокислоты про-лин и глицин, в том числе PGP, PG, GP и др. Они получили название глипролинов.

Наши эксперименты показали, что представитель глипролинов PGP (3,7 мкмоль/кг внутрибрюшинно) обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии, уменьшая площадь повреждений СОЖ примерно на 60% у опытных животных по сравнению с контрольными на этаноловой, индометациновой и стрессорной моделях язвообразования. Было показано также, что в этой дозе при ежедневном введении PGP ускоряет заживление язв желудка, вызванных аппликацией уксусной кислоты. Изучение дозозависимости гастропротек-тивных эффектов трипептида в диапазоне концентраций 0,2-53 мкмоль/кг на этаноловой и стрессорной модели язвообразования показало, что противоязвенные эффекты PGP проявляются при дозе 0,5 мкмоль/кг и мало меняются при увеличении дозы в 10-100 раз.

Метаболиты PGP - PG и GP - обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP -центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипептидов до 53 мкмоль/кг.

Величина противоязвенного эффекта PGP и его метаболитов сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин. Несомненным преимуществом гли-пролинов перед атропином и амилином является то, что, являясь фрагментами соединительнотканных белков, они обладают низкой токсичностью и практически не имеют побочных эффектов. Амилин имеет ярковыраженную гормональную активность, что может стать основным препятствием при его использовании в качестве противоязвенного агента. Показаны многочисленные побочные эффекты и для атропина (нарушение аккомодации, тахикардия, атония кишечника, головокружение и др.).

Исследование гастропротективных свойств аминокислот глицина и про-лина показало, что пролин малоэффективен как антиульцерогенный агент. Противоязвенные эффекты PGP, PG и GP могут быть частично связаны с высвобождением при их гидролизе глицина который, как показано в работе, обладает собственным противоязвенным действием на этаноловой и стрес-сорной моделях язвообразования. PGP, PG и GP, по-видимому, могут являться соединениями, транспортирующими глицин к тканевым мишеням.

С другой стороны, показано, что PGP, PG, GP отличаются друг от друга и от исследованных аминокислот как по своим противоязвенным эффектам на разных моделях вызова язв, так и по механизмам действия. Исходя из этого, можно предположить, что глипролины могут иметь собственные специализированные рецепторы в системах защиты слизистой оболочки желудка.

В пользу этого свидетельствует и показанная нами относительно высокая . стабильность глипролинов во внутренней среде организма. Исследования

метаболизма PGP в экспериментах на кроликах показали, что при внутри-брюшинном введении время полужизни трипептида в плазме крови составляет более 2 ч, пик концентрации достигается через 30 мин после введения и его содержание в плазме составляет примерно 4,5% от общего количества введенного пептида. Часть пептида (примерно 2% от введенного) сохраняется в неизменном виде и через 5 ч после введения.

Полученные нами данные свидетельствовали о большем совпадении направленности и силы воздействия на гомеостаз СОЖ у PGP с PG, меньшем -с GP. Опыты с применением [3H]PGP подтвердили, что основным метаболитом PGP является дипептид PG, т.е. деградация идет в основном за счет отщепления пролина с С-конца трипептида. GP образуется примерно в 3-4 раза меньше, чем PG.

Обобщая все сказанное, необходимо отметить, что защитное действие PGP в отношении СОЖ может быть связано как с действием самого трипеп-тида в целом, так и с удачным сочетанием противоязвенных свойств всех возможных метаболитов, что и приводит к появлению у этого трипептида наиболее стабильных и хорошо выраженных противоязвенных свойств на всех изученных моделях язвообразования.

Одним из основных препятствий к применению регуляторных пептидов служит их быстрая деградация в желудочно-кишечном тракте. Проведенные нами исследования показали, что при внутрижелудочном и внутрикишечном введении (в капсулах, нерастворимых в желудке) меченого тритием PGP, в плазме крови обнаруживается интактный трипептид. Максимальное его количество, наблюдаемое на 30 мин после внутрижелудочного и на 60 мин после внутрикишечного введений, составляло примерно 1,5%-1,7% от введенного количества [3H]PGP. В крови в течение 5 ч эксперимента обнаруживались также дипептиды PG и GP.

Полученные нами данные о том, что PGP, PG и GP могут проникать в кровь из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде позволяют косвенно подтвердить возможность поступления глипролинов в организм из внешнего источника - поступающих с пищей белков соединительной ткани - коллагена и эластина. Показано, что гастропротективные свойства сохраняются у PGP при пероральном введении и присущи вероятному источнику глипролинов - коллагену в форме желатина, применяемому в качестве пищевой добавки.

Кроме соединительнотканных белков, источниками глипролинов могут быть, по-видимому, и другие белки, имеющие в своем составе последовательность PGP, такие как казоморфины, энтеростатины и синтетические производные АКТГ4.7 и тафцина - семакс и селанк.

Наличие в составе пептидов и белков последовательности PGP не только увеличивает их устойчивость к гидролизу, но и может наделять их биоактивностью глипролинов, что убедительно показано для семакса (MEHFPGP) при изучении его влияния на гемостаз. Что касается гомеостаза слизистой оболочки желудка, то внутрибрюшинное введение семакса, так же как и PGP, защищает слизистую оболочку желудка от повреждений, вызванных различными ульцерогенными агентами. При этом семакс действует в гораздо меньших концентрациях, чем PGP, что может свидетельствовать о том, что защитное действие семакса в отношении слизистой оболочки желудка связано не только с гидролизом семакса до PGP, но и определяется действием семакса в целом.

Гастропротективное действие глипролинов и семакса носит комплексный характер. Оно связано с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (базальной и стимулированной секреции кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как кровоток и бикарбонаты и ускорением скорости регенерации слизистой оболочки желудка (рис. 15).

и>

Рис. 15. Влияние глипролинов и семакса на гомеостаз слизистой оболочки желудка ("весы Шея" в модификации с использованием собственных данных и данных других авторов).

Обнаружение радиоактивной метки в мозге после системного введения меченого тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая их концентрацию в мозге и донной части же.г1удка.

Показанное в экспериментах на животных гастропротективное действие может дать обоснование необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов - PG и GP - в качестве противоязвенных препаратов. Показанная высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде, сохранение противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение глипролинов в виде удобных для приема человеком таблетированных и капсулированных форм. Положительное влияние PGP и его метаболитов на широкий спектр механизмов, принимающих участие в поддержании гомео-стаза слизистой оболочки желудка (секрецию, кровоток, воспалительные процессы) делает их применение независимым от этиологии и типа патогенетических факторов, приведших к язвообразованию.

В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролинов - коллагена (в виде желатина) - открываются широкие перспективы профилактики и лечения нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем регулирования пищевого рациона человека и/или применения соединительнотканных белков в виде пищевых добавок.

Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До настоящего времени этот препарат применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического препарата. Наличие у него гастропротективных свойств делает возможным использование семакса в комплексной терапии язвенной болезни.

ВЫВОДЫ

1. PGP при внутрибрюшинном введении обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии. Его метаболиты - PG и GP - обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP - центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипеп-тидов.

2. Величина противоязвенного эффекта PGP сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин.

3. Глипролины обладают относительно высокой устойчивостью к гидролизу в желудочно-кишечном тракте и внутренних средах организма, которая вполне сопоставима с устойчивостью большинства традиционных фармакологических средств. Показано, что гастропротективные свойства сохраняются у PGP при пероральном введении и присущи вероятному источнику гли-пролинов - коллагену в форме желатина, применяемому в качестве пищевой добавки.

4. Защитные эффекты PGP, PG и GP в отношении слизистой оболочки желудка могут быть частично связаны с высвобождением при их гидролизе глицина, который, как показано в работе, обладает собственным противоязвенным действием на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования. С другой стороны, показано, что PGP, PG, GP отличаются друг от друга и от аминокислот пролина и глицина как по своим противоязвенным эффектам на разных моделях вызова язв, так и по механизмам действия на гомеостаз СОЖ.

5. Основным устойчивым метаболитом PGP в организме является дипеп-тид PG; GP образуется примерно в 3-4 раза меньше. Обнаружение радиоактивной метки в мозге после системного введения меченого тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая их концентрацию в мозге и дне желудка.

6. Пептид семакс, имеющий последовательность PGP на С-конце молекулы (MEHFPGP) при внутрибрюшинном введении, также как и PGP, защищает слизистую оболочку желудка от повреждений различной этиологии. Его противоязвенное действие осуществляется в гораздо меньших дозах, чем у PGP, то есть, связано не только с гидролизом его до PGP, но и с действием семакса в целом.

7. Гастропротективные эффекты глипролинов и семакса носят комплексный характер. Они связаны с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как синтез бикарбонатов и желудочный кровоток и ускорением скорости регенерации слизистой оболочки желудка.

8. Представленные в работе данные о гастропротективных свойствах глипролинов являются еще одним аргументом в пользу выделения коротких пролин- и глицинсодержащих пептидов в особый класс регуляторных пептидов со своей собственной биологической активностью и служат обоснованием необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов - PG и GP - в качестве новых противоязвенных препаратов.

9. Показанная высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде, сохранение

противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение глипролинов в виде удобных для приема человеком таблетиро-ванных и капсулированных форм.

10. В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролинов - коллагена (в виде желатина) - открываются широкие перспективы профилактики и лечения нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем регулирования пищевого рациона человека и/или применения соединительнотканных белков в виде пищевых добавок.

11. Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До настоящего времени этот препарат применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического перепарата. Наличие у него гастропротективных свойств делает возможным использование семакса в комплексной терапии язвенной болезни.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Самонина Г.Е., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е. Противоязвенные эффекты одного из простейших пролинсодержащих пептидов Pro-Gly-Pro на кислотной модели язвообразования // Материалы XVII съезда физиологов России. Ростов-на-Дону. 14-18 сентября 1998. С.502-503.

2. Samonina G., Ashmarin I., Natzvlishwilli N., Zuykova S. Acid and alkaline gastric secretions, Helicobacter and gastric mucosa homeostasis // Infectious pathogens in gastrointestinal and hepatic disorders: molecular biology, pathogenesis and therapeutic implications / Abstracts of the IRGH conference. Vail de Nuria. Spain. September 15th-19th. 1998. P.A10.

1. Самонина Г.Е., Жуйкова C.E.. Желязник Н.Я., Сергеев В.И., Ашмарин И.П. Влияние PGP и семакса на кислую секрецию и кровоток желудка как возможные механизмы поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка // Механизмы функционирования висцеральных систем / Материалы международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова. Санкт-Петербург. 23-25 сентября 1999. С.327.

4. Samonina G., Lyapina L., Kopylova G., Pastorova V., Jeliaznik N., Zuykova S„ Ashmarin I. Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simple proline-containing peptides // Pathophysiology. 2000. V.7, № 1. P.69-73.

5. Герман C.B., Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Жуйкова С.Е.. Лукьянце-ва Г.В. Панкреатический гормон амилин - мощный протектор слизистой оболочки желудка // Материалы 2-й объединенной Всероссийской и всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург - Гастро-2000". 20-22 сентября 2000 / Гастробюллетень. 2000. № 1-2. С. 18.

6. Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Жуйкова С.Е. Роль дипептидов Pro-Gly и Gly-Pro и их комбинации в противоязвенных эффектах Pro-Gly-Pro // Материалы 2-й объединенной Всероссийской и всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург - Гастро-2000". 20-22 сентября 2000 / Гастробюллетень. 2000. № 1-2. С. 83.

7. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Герман C.B., Умарова Б.А., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е.. Сергеев В.И., Лукьянцева Г.В., Смирнова Е.А., Лелекова Т.В. Эндогенные пептиды и гомеостаз слизистой оболочки желудка // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты) / Материалы I] Российского конгресса по патофизиологии. Москва. 9-12 октября 2000. С. 133.

8. Самонина Г.Е., Абрамова М.А., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е.. Копылова Г.Н., Сергеев В.И. Роль глицина и пролина в противоязвенных свойствах трипептида Pro-Gly-Pro // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты) / Материалы II Российского конгресса по патофизиологии. Москва. 9-12 октября 2000. С. 134.

9. Жуйкова С.Е.. Самонина Г.Е., Герман C.B., Копылова Г.Н., Смирнова Е.А. Панкреатический гормон амилин - эндогенный протектор слизистой оболочки желудка // Материалы 6-й Российской гастроэнтерологической недели. Москва. 23-27 октября 2000 / Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2000. Т. 10. № 5. С.20.

10. Жуйкова С.Е., Смирнова Л.А., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. Влияние семакса на гомеостаз слизистой оболочки желудка белых крыс // Бюл. экс-пер. биол. и мед. 2000. Т.129. № ю. С. 300-302.

11. Жуйкова С.Е. Синтетический аналог АКТГ4.ю - семакс - как возможный модулятор гомеостаза слизистой оболочки желудка в экспериментах на крысах // Механизмы функционирования висцеральных систем / Тезисы докладов международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева. Санкт-Петербург. 14-16 марта 2001. С. 128-129.

12. Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Жуйкова С.Е. Разнонаправленные влияния дипептидов Pro-Gly и Gly-Pro на повреждения слизистой оболочки желудка, обусловленные разными механизмами // Механизмы функционирования висцеральных систем / Тезисы докладов международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения A.M. Уголева. Санкт-Петербург. 14-16 марта 2001. С. 327.

13. Герман C.B., Жуйкова С.Е.. Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Хропы-1 чева Р.П. Воздействие панкреатического гормона амилин на желудочную

секрецию // Физиологические науки - клинической гастроэнтерологии / Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Ессентуки. 23-25 мая 2001. С.30-31.

14. Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Жуйкова С.Е.. Павлов Т.С., Сергеев В.И. Стабилизация кровотока желудка как один из механизмов противоязвенного свойства простейших пролинсодержащих пептидов // Материалы 3-го Российского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро-2001". Санкт-Петербург. 3-5 сентября 2001 / Гастробюллетень. 2001. № 2-3. С.751.

15. Жуйкова С.Е.. Бакаева З.В., Лукьянцева Г.В., Сергеев В.И., Сергеев И.Ю. Влияние некоторых пептидов на желудочный кровоток и вазомоторную функцию аорты крыс Н Тезисы докладов XVIII съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Казань. 23-25 сентября 2001. С.87.

/

16. Смирнова Е.А., Жуйкова С.Е., Копылова Г.Н., Умарова Б.А., Самонина Г.Е., Герман C.B. Стабилизация тучных клеток как один из возможных путей повышения устойчивости слизистой оболочки желудка к повреждающему действию стресса // Тезисы докладов XVIII съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. Казань. 23-25 сентября 2001. С.426-427.

17. Самонина Г.Е., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е.. Бакаева З.В., Копылова Г.Н., Гусева A.A. Роль метаболитов в противоязвенных эффектах три-пептида Pro-Gly-Pro // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях / Сборник статей Всероссийской конференции, посвященной 95-летию со дня рождения В.А. Пегеля. Томск. 18-19 декабря 2001. С.222-224.

18. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Сергеев В.И., Жуйкова С.Е.. Бакаева З.В. Коррекция желудочного кровотока как один из возможных механизмов противоязвенных эффектов коротких пролинсодержащих пептидов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2001. Т.87. № 11. С. 1488--1492.

19. Умарова Б.А., Смирнова Е.А., Лукьянцева Г.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Герман C.B., Жуйкова С.Е. Влияние амилина на секрецию тучных клеток как возможный механизм повышения устойчивости слизистой оболочки желудка // Бюл. экспер. биол. и мед. 2001. Т. 132. № 10. С.372-374.

20. Самонина Г.Е., Жуйкова С.Е. Гомеостаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщение 1. Механизмы поддержания адекватного кровотока в слизистой оболочке желудка // Успехи физиологических наук. 2001. Т.32. № 4. С. 60-72.

21. Герман C.B., Жуйкова С.Е.. Комаров Ф.И., Копылова Г.Н., Купер Г.Дж., Лукьянцева Г.В., Самонина Г.Е., Смирнова Е.А., Умарова Б.А. Панкреатический гормон амилин и целостность слизистой оболочки желудка // Вестник РАМН. 2001. № 12. С. 34-38.

22. Жуйкова С.Е.. Самонина Г.Е. Гомеостаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщение 2. Роль ишемии в нарушении гомеостаза слизистой оболочки желудка // Успехи физиологических наук. 2002. Т.ЗЗ. № 1. С.77-87.

23. Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф., Жуйкова С.Е.. Бакаева З.В., Бадмае-ва К.Е., Павлов Т.С., Ашмарин И.П. Особенности противоязвеннного действия различных глипролинов и других пептидов, содержащих глипролины // Человек и лекарство / Тезисы докладов IX Российского национального конгресса. Москва 8-12 апреля 2002. С. 690-691.

24. Жуйкова С.Е.. Сергеев В.И., Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф. Влияние семакса на индометациновое язвообразование у крыс и один из возможных механизмов его действия // Бюл. экспер. биол. и мед. 2002. Т.133. № 6. С.665-667.

25. Самонина Г.Е., Жуйкова С.Е.. Бадмаева К.Е. Влияние коротких глипролинов на ацетатное язвообразование у крыс // Материалы 4-го Российского научного форума "Санкт-Петербург - Гастро-2002". Санкт-Петербург. 17-20 сентября 2002 / Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2002. № 2-3. С.385.

26. Ашмарин И.П., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е.. Копы-лова Г.Н., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Средство профилактики и лечения язв желудочно-кишечного тракта, способ лечения и способ профилактики язв желудочно-кишечного тракта // Патент на изобретение № 2191593. Заре-гестрирован 27 октября 2002.

27. Жуйкова С.Е.. Бакаева З.В., Самонина Г.Е. Дифференцированные противоязвенные эффекты возможных метаболитов пептида PGP - PG и GP - на этаноловой и стрессорной моделях вызова язв у крыс И Вестник Мое. Ун-та. Серия 16: «Биология». 2003. № 2. С. 20-22.

28. Жуйкова С.Е.. Хропычева Р.П., Золотарев В.А., Поленов С.А., Самонина Г.Е. Новые пептидные регуляторы желудочной секреции крыс (ами-лин, PGP и семакс) // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2003. №2. С. 86-91.

29. Васьковский Б.В., Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е.. Самонина Г.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Ляпина JI.A., Пасторова В.Е., Бакаева З.В. Изучение распределения [3H]PGP в организме крыс // Вестник биологической, медицинской и физической химии. 2003. № 3. С. 41-45.

30. Исаев В.А., Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е., Гусева A.A., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ашмарин И.П. Новый подход к проблеме снижения массы тела // Вестник биологической, медицинской и физической химии. 2003. № 3. С.45-47.

31. Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е.. Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Васьковский Б.В., Самонина Г.Е. Метаболизм пептида PGP при разных способах введения // Бюл. экспер. биол. и мед. 2003. Т. 135. № 4. С. 423-426.

32. Ашмарин И.П., Андреева Л.А., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е., Копылова Г.Н., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Способ лечения язвы желудка у животных // Решение о выдаче патента. Заявка 200212267/14 (023048). Приоритет от 12.08.2002.

»14224

Изд. лиц. ИД№ 06035 от 12.10.2001. Подписано в печать 04.09.2003. Напечатано на ризографе. Формат 60х84'/(6. Усл. печ. л. 2,33. Уч.-изд. л. 2,16. Тираж 100 экз. Заказ №827 - 2003 г.

Глазовский государственный педагогический институт 427621, г. Глазов, ул. Первомайская, 25

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Жуйкова, Светлана Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Гомеостаз слизистой оболочки желудка.

1.1. Повреждающие факторы желудочного сока.

1.1.1 Соляная кислота.

1.1.2. Пепсин.

1.2. Защитные факторы слизистой оболочки желудка.

1.2.1. Слизь.

1.2.2. Бикарбонаты.

1.2.3. Особенности эпителиального слоя.

1.2.4. Желудочный кровоток.

2. Нарушение гомеостаза слизистой оболочки желудка. Язвенная болезнь желудка у человека.

3. Характеристика некоторых коротких глицини пролинсодержащих пептидов.

3.1. Глипролины.

3.2. Семакс.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование защитных свойств изучаемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка при воздействии различных повреждающих факторов.

1.1. Изучение влияния PGP на повреждения слизистой оболочки желудка, вызванные этанолом, индометацином и стрессом.

1.2. Изучение защитных свойств возможных метаболитов

PGP - пептидов PG, GP и аминокислот G и Р.

1.3. Изучение зависимости защитных свойств PGP и его возможных метаболитов - PG и GP - от дозы вводимых препаратов.

1.4. Изучение защитных свойств семакса.

1.5. Изучение защитных свойств PGP и возможного экзогенного источника глипролинов — коллагена в форме желатина - при пероральном введении.

2. Исследование возможных механизмов . защитного действия изучаемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка.

2.1. Изучение влияние PGP, семакса и амилина на желудочную секрецию.

2.2. Изучение влияния пептидов на желудочный кровоток.

2.3. Изучение влияния PGP, семакса и амилина на секреторную активность тучных клеток.

2.4. Изучение влияния пептидов на степень воспаления и скорость заживления хронических язв.

3. Изучение метаболизма PGP в организме.

3.1. Изучение основных путей деградации PGP при разных способах введения.

3.2. Изучение особенностей поступления PGP и его метаболитов в мозг и органы желудочно-кишечного тракта в норме и после кратковременного стресса.

4. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние некоторых пролинсодержащих пептидов на гомеостаз слизистой оболочки желудка в экспериментах на животных"

Актуальность проблемы.

В последнее время появились основания для выделения в новое семейство регуляторных пептидов простейших пролин- и глицинсодержащих пептидов - глипролинов, - в том числе PGP, PG, GP (Ашмарин и др., 2002). Их биоактивность связана с торможением ряда элементов кровесвертывания и тромбоза (Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин, Пасторова и др., 1998), поддержанием гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) (Абрамова и др. 1996; 1997; Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин, Самонина и др., 1999), регуляцией активности лейкоцитов (Haddox et al., 1999; Watanabe et al., 1994). Они также входят в состав ряда пептидов, относящихся к другим семействам регуляторных пептидов, например, энтеростатинов, p-казоморфинов и др. (Ашмарин и др., 2002).

Глипролины имеют два вероятных источника образования -эндогенный и экзогенный (Ашмарин и др., 2002). Первый связан с синтезом коллагена в фибробластах и с его катаболизмом. Коллаген чрезвычайно богат аминокислотами пролином и глицином в последовательности PG, GP, в меньшей степени PGP, GGP, GPG (Мазуров, 1974; Хилькин и др., 1976). Известно, что перед секрецией из коллагенсинтезирующих клеток коллаген проходит стадию созревания, состоящую в частичном разрушении уже собранных полипептидов. При этом около 90% деградированной части коллагена секретируется из клеток в виде малых пептидов, состоящих менее чем из 5 аминокислот (Bienkowski et al., 1978). Именно этот процесс может быть источником глипролинов, хотя прямых доказательств этому пока нет.

Катаболизм коллагена (а также другого белка, богатого GP и PG фрагментами - эластина), по-видимому, также может приводить к образованию глипролинов. Этот процесс в здоровом организме практически не изучен. На сегодняшний день существуют данные о значительном увеличении GP (и других дипептидов, содержащих на С-конце пролин или оксипролин) в моче при заболеваниях кожи (Faull et al., 1976; Le et al., 1999) и об образовании PGP при разрушении сетчатки глаза (Pfister et al., 1995).

Экзогенным источником глипролинов могут служить коллаген и эластин, поступающие в организм с пищей. Известно, что часть ди- и трипептидов проникают из кишечника в энтероциты в неизменном виде (Addison et al., 1975; Bai, Amidon, 1992). Есть прямые указания на проникновение в кровь из кишечника значительных количеств гидроксипролинсодержащих пептидов при приеме препаратов коллагена в форме желатина (Ашмарин и др., 2002).

Было показано, что прием желатина крысами в течение 5-10 дней, также как и пероральное введение PGP, приводит к уменьшению агрегации тромбоцитов (Ляпина и др., 2002). В связи с этим заслуживает изучения и способность коллагена в виде желатина проявлять не только антитромботические, но и гастропротективные качества, присущие глипролинам.

По-видимому, экзогенными источниками глипролинов могут являться и искусственно синтезированные пептиды, имеющие в своем составе последовательность PGP, такие как семакс и селанк. Они были получены путем присоединения последовательности PGP к С-концу таких нестабильных in vivo регуляторных пептидов, как АКТГ4-7 и тафцин соответственно. Наличие пролина в молекулах синтетических пептидов привело к значительно большей их устойчивости к действию протеаз, что позволило существенно увеличить длительность действия пептидов и оптимально решить проблему реализации их лекарственного потенциала (Ашмарин и др., 1997; Бойко и др., 1998; Potaman et al., 1991).

Изучение влияния семакса на процессы кровесвертывания и тромбоза показало, что присоединение последовательности PGP к АКТГ4.7 не только усилило его изначальную биологическую активность, но и дополнило ее эффектами самого PGP. Так, in vivo семакс обладает несколько меньшей, чем у глипролинов, но достаточно выраженной антикоагулянтной, фибринолитической и антитромбоцитарной ативностью. In vitro семакс нейтрален по отношению к параметрам гемостаза, что наводит на мысль о том, что для осуществления влияния на процессы фибринолиза и тромбоза необходим протеолиз семакса до PGP (Ашмарин и др., 1996; Ашмарин, 2001).

Защитные свойства глипролинов в отношении СОЖ ранее были показаны на крысах только для дозы 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении (Абрамова и др. 1996). До сих пор не были изучены ни физиологические механизмы действия этих пептидов на гомеостаз СОЖ, ни, тем более, молекулярные. В связи с этим, актуальными являлись исследования влияния глипролинов как на устойчивость СОЖ к повреждающим агентам, так и на основные параметры гомеостаза слизистой оболочки желудка: секрецию кислоты, пепсина, бикарбонатов, желудочный кровоток и т.д. Большой интерес представляло также изучение влияния на гомеостаз СОЖ семакса и выявление доли участия PGP в гастропротективных эффектах этого гептапептида.

В настоящее время в литературе нет данных о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролинов, за исключением цикло-PG (эндогенного анксиолитика), обнаруженного в мозге крыс и мышей (Гудашева и др. 1996; Середенин и др., 2002; Gudasheva et al., 1996). Динамика концентраций глипролинов в тканях и жидкостях организма после их перорального и парентерального введения также неизвестна. В связи с открывающейся перспективой использования глипролинов и/или их предшественников в качестве антитромботических и противоязвенных агентов назрела необходимость целенаправленных исследований этих концентраций как в экспериментах на животных, так и у людей.

С другой стороны хочется отметить, что актуальным является не только комплексное изучение глипролинов, как нового класса регуляторных пептидов, но и сама проблема сохранения целостности слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов. Это связано с тем, что у людей язвенная болезнь относится к числу наиболее часто встречающихся заболеваний внутренних органов. По данным клиницистов ее распространенность среди взрослого населения составляет в настоящее время 7%-10%. Еще более высокой (14%-16%) оказывается частота язвенной болезни по материалам патологоанатомических исследований (Рысс, Звартау, 1998).

Широкая распространенность заболевания, хроническая форма болезни с постоянной угрозой осложнений, неэффективность современных лекарственных средств в плане предупреждения рецидивов, требует поиска более эффективных профилактических и лечебных противоязвенных средств. В связи с этим изучение гастропротективных свойств и механизмов действия глипролинов на гомеостаз СОЖ может иметь прямой выход в фармакологию. При этом несомненными преимуществами глипролинов и/или их источников перед другими лекарственными средствами могли бы стать комплексность воздействия, низкая токсичность, отсутствие привыкания и побочных эффектов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение влияния глипролинов — пептида PGP и его метаболитов (PG и GP), а также вероятных источников глипролинов — коллагена и семакса - на повреждения

СОЖ различной этиологии; определение основных механизмов действия PGP и семакса на гомеостаз желудка; изучение метаболизма PGP в организме при разных способах введения.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. В экспериментах на животных исследовать влияние PGP и его метаболитов - PG, GP, пролина и глицина — на целостность слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов.

2. Изучить возможность проявления защитных свойств глипролинов в отношении СОЖ при введении их в составе семакса и коллагена.

3. Для определения основных механизмов защитного действия глипролинов в отношении слизистой оболочки желудка исследовать влияние PGP и семакса на

• секрецию кислоты, бикарбонатов и пепсиногена в желудке;

• базальный и уменьшенный повреждающими факторами кровоток в СОЖ;

• базальную и стимулированную секрецию тучных клеток;

• процессы воспаления и регенерации при повреждении слизистой оболочки желудка.

4. Определить время жизни PGP в крови и основной путь его деградации при разных способах введения в организм.

5. Исследовать возможность проникновения PGP и его метаболитов через гематоэнцефалический барьер, а также возможность накопления их в тканях желудочно-кишечного тракта и перераспределения между органами при кратковременном иммобилизационном стрессе.

Научная новизна.

В экспериментах на животных показаны гастропротективные свойства PGP и его метаболитов - PG и GP - в широком диапазоне концентраций при воздействии различных повреждающих факторов. Впервые выявлены защитные свойства в отношении слизистой оболочки желудка веществ, имеющих в своем составе последовательность PGP - семакса и коллагена в форме желатина.

Установлено, что PGP и семакс уменьшают как базальную, так и вызванную раздражением блуждающего нерва секрецию соляной кислоты в желудке. Семакс одновременно уменьшает секрецию пепсиногена и кратковременно стимулирует базальную секрецию бикарбонатов.

Для PGP, PG и семакса обнаружена способность нормализовать желудочный кровоток, нарушенный ульцерогенными агентами.

Выявлено, что PGP, GP, PG и семакс активизируют процессы рубцевания и эпителизации в зоне повреждений СОЖ, вызванных уксусной кислотой. Для PGP и GP продемонстрирована способность уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта на 5-й день после аппликации уксусной кислоты.

Впервые показано, что PGP и семакс могут стабилизировать тучные клетки при стрессе.

С помощью меченого тритием PGP установлена относительно высокая устойчивость трипептида к протеолизу. Впервые получены прямые доказательства прохождения PGP через стенку кишечника в неизменном виде, определены основные пути его деградации при разных способах введения.

Показано проникновение радиоактивной метки в мозг и накопление ее в желудочно-кишечном тракте после внутрибрюшинного введения в виде [3H]PGP. Установлено, что кратковременный иммобилизационный стресс может изменять распределение радиоактивной метки между органами через 30 мин после введения [3H]PGP, увеличивая ее содержание в мозге и желудке и уменьшая в кишечнике.

Положения, выносимые на защиту.

Представитель глипролинов PGP обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии. Его метаболиты - PG и GP — обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP — центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипептидов.

Наличие в составе пептидов и белков последовательности PGP может наделять их биоактивностью глипролинов, что убедительно показано для семакса и коллагена в форме желатина.

Гастропротективный эффект глипролинов и семакса носит комплексный характер. Он связан с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как кровоток и бикарбонаты.

Величина противоязвенного эффекта PGP сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин. Несомненным преимуществом PGP перед амилином является то, что последний имеет ярковыраженную гормональную активность, что может приводить к побочным эффектам при его использовании.

PGP относительно устойчив к протеолизу в желудочно-кишечном тракте и внутренних средах организма. Он способен в неизменном виде проникать из кишечника в кровь. Основным устойчивым метаболитом PGP в организме является дипептид PG. Обнаружение радиоактивной метки в мозге после системного введения меченного тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая ее концентрацию в мозге и желудке.

Практическое значение.

Показанное в экспериментах на животных гастропротективное действие может дать обоснование необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов — PG и GP — в качестве противоязвенных препаратов. Высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочного тракта в неизменном виде, сохранение противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение препарата в виде удобных для приема человеком таблетированных и капсулированных форм. Положительное влияние PGP и его метаболитов на широкий спектр механизмов, принимающих участие в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка (секрецию, кровоток, воспалительные процессы) делает его применение не зависимым от этиологии и типа патогенетических факторов, приведших к язвообразованию.

В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролинов — коллагена (в виде желатина) - открываются широкие перспективы профилактики нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем регулирования пищевого рациона человека и/или применения белков соединительной ткани в виде пищевых добавок.

Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До сих пор этот препарат применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического перепарата. Наличие у него гастропротективных свойств сделало возможным применение семакса в комплексной терапии язвенной болезни (Иваников и др., 2002).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Жуйкова, Светлана Евгеньевна

выводы

1. PGP при внутрибрюшинном введении обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии. Его метаболиты — PG и GP - обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP - центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипептидов.

2. Величина противоязвенного эффекта PGP сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин.

3. Глипролины обладают относительно высокой устойчивостью к гидролизу в желудочно-кишечном тракте и внутренних средах организма, которая вполне сопоставима с устойчивостью большинства традиционных фармакологических средств. Показано, что гастропротективные свойства сохраняются у PGP при пероральном введении и присущи вероятному источнику глипролинов - коллагену в форме желатина, применяемому в качестве пищевой добавки.

4. Защитные эффекты PGP, PG и GP в отношении слизистой оболочки желудка могут быть частично связаны с высвобождением при их гидролизе глицина, который, как показано в работе, обладает собственным противоязвенным действием на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования. С другой стороны, показано, что PGP, PG, GP отличаются друг от друга и от аминокислот пролина и глицина как по своим противоязвенным эффектам на разных моделях вызова язв, так и по механизмам действия на гомеостаз СОЖ.

5. Основным устойчивым метаболитом PGP в организме является дипептид PG; GP образуется примерно в 3-4 раза меньше. Обнаружение радиоактивной метки в мозге после системного введения меченого тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая их концентрацию в мозге и дне желудка.

6. Пептид семакс, имеющий последовательность PGP на С-конце молекулы (MEHFPGP) при внутрибрюшинном введении, также как и PGP, защищает слизистую оболочку желудка от повреждений различной этиологии. Его противоязвенное действие осуществляется в гораздо меньших дозах, чем у PGP, то есть, связано не только с гидролизом его до PGP, но и с действием семакса в целом.

7. Гастропротективные эффекты глипролинов и семакса носят комплексный характер. Они связаны с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как синтез бикарбонатов и желудочный кровоток и ускорением скорости регенерации слизистой оболочки желудка.

8. Представленные в работе данные о гастропротективных свойствах глипролинов являются еще одним аргументом в пользу выделения коротких пролин- и глицинсодержащих пептидов в особый класс регуляторных пептидов со своей собственной биологической активностью и служат обоснованием необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов — PG и GP - в качестве новых противоязвенных препаратов.

9. Показанная высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде, сохранение противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение глипролинов в виде удобных для приема человеком таблетированных и капсулированных форм.

10.В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролинов — коллагена (в виде желатина) — открываются широкие перспективы профилактики и лечения нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем регулирования пищевого рациона человека и/или применения соединительнотканных белков в виде пищевых добавок.

11. Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До настоящего времени этот препарат применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического перепарата. Наличие у него гастропротективных свойств делает возможным использование семакса в комплексной терапии язвенной болезни.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее годы по признакам сходной биологической активности и общему происхождению в отдельную группу регуляторных пептидов были выделены ди- и трипептиды, имеющие в своем составе аминокислоты пролин и глицин, в том числе PGP, PG, GP и др. Они получили название глипролинов.

Наши эксперименты показали, что представитель глипролинов PGP (3,7 мкмоль/кг внутрибрюшинно) обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии, уменьшая площадь повреждений СОЖ примерно на 60% у опытных животных по сравнению с контрольными на этаноловой, индометациновой и стрессорной моделях язвообразования. Было показано также, что в этой дозе при ежедневном введении PGP ускоряет заживление язв желудка, вызванных аппликацией уксусной кислоты. Изучение дозозависимости гастропротективных эффектов трипептида в диапазоне концентраций 0,2-53 мкмоль/кг на этаноловой и стрессорной модели язвообразования показало, что противоязвенные эффекты PGP проявляются при дозе 0,5 мкмоль/кг и мало меняются при увеличении дозы в 10-100 раз.

Метаболиты PGP - PG и GP - обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP - центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипептидов до 53 мкмоль/кг.

Величина противоязвенного эффекта PGP и его метаболитов сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин. Несомненным преимуществом глипролинов перед атропином и амилином является то, что, являясь фрагментами соединительнотканных белков, они обладают низкой токсичностью и практически не имеют побочных эффектов. Амилин имеет ярковыраженную гормональную активность, что может стать основным препятствием при его использовании в качестве противоязвенного агента. Показаны многочисленные побочные эффекты и для атропина (нарушение аккомодации, тахикардия, атония кишечника, головокружение и др.).

Исследование гастропротективных свойств аминокислот глицина и пролина показало, что пролин малоэффективен как антиульцерогенный агент. Противоязвенные эффекты PGP, PG и GP могут быть частично связаны с высвобождением при их гидролизе глицина который, как показано в работе, обладает собственным противоязвенным действием на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования. PGP, PG и GP, по-видимому, могут являться соединениями, транспортирующими глицин к тканевым мишеням.

С другой стороны, показано, что PGP, PG, GP отличаются друг от друга и от исследованных аминокислот как по своим противоязвенным эффектам на разных моделях вызова язв, так и по механизмам действия. Исходя из этого, можно предположить, что глипролины могут иметь собственные специализированные рецепторы в системах защиты слизистой оболочки желудка.

В пользу этого свидетельствует и показанная нами относительно высокая стабильность глипролинов во внутренней среде организма. Исследования метаболизма PGP в экспериментах на кроликах показали, что при внутрибрюшинном введении время полужизни трипептида в плазме крови составляет более 2 ч, пик концентрации достигается через 30 мин после введения и его содержание в плазме составляет примерно 4,5% от общего количества введенного пептида. Часть пептида (примерно 2% от введенного) сохраняется в неизменном виде и через 5 ч после введения.

Полученные нами данные свидетельствовали о большем совпадении направленности и силы воздействия на гомеостаз СОЖ у PGP с PG, меньшем — с GP. Опыты с применением [3H]PGP подтвердили, что основным метаболитом PGP является дипептид PG, т.е. деградация пептида идет в основном за счет отщепления пролина с С-конца трипептида. GP образуется примерно в 3-4 раза меньше, чем PG.

Обобщая все сказанное, необходимо отметить, что защитное действие PGP в отношении СОЖ может быть связано как с действием самого трипептида в целом, так и с удачным сочетанием противоязвенных свойств всех возможных метаболитов, что и приводит к появлению у этого трипептида наиболее стабильных и хорошо выраженных противоязвенных свойств на всех изученных моделях язвообразования.

Одним из основных препятствий к применению регуляторных пептидов служит их быстрая деградация в желудочно-кишечном тракте. Проведенные нами исследования показали, что при внутрижелудочном и внутрикишечном введении (в капсулах, нерастворимых в желудке) меченого тритием PGP, в плазме крови обнаруживается интактный трипептид. Максимальное его количество, наблюдаемое на 30 мин после внутрижелудочного и на 60 мин после внутрикишечного введений, составляло примерно 1,5%-1,7% от введенного количества [3H]PGP. В крови в течение 5 ч эксперимента обнаруживались также дипептиды PG и GP.

Полученные нами данные о том, что PGP, PG и GP могут проникать в кровь из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде позволяют косвенно подтвердить возможность поступления глипролинов в организм из внешнего источника — поступающих с пищей белков соединительной ткани - коллагена и эластина. Показано, что гастропротективные свойства сохраняются у PGP при пероральном введении и присущи вероятному источнику глипролинов — коллагену в форме желатина, применяемому в качестве пищевой добавки.

Кроме соединительнотканных белков, источниками глипролинов могут быть, по-видимому, и другие белки, имеющие в своем составе последовательность PGP, такие как казоморфины, энтеростатины и синтетические производные АКТГ4-7 и тафцина - семакс и селанк.

Наличие в составе пептидов и белков последовательности PGP не только увеличивает их устойчивость к гидролизу, но и может наделять их биоактивностью глипролинов, что убедительно показано для семакса (MEHFPGP) при изучении его влияния на гемостаз. Что касается гомеостаза слизистой оболочки желудка, то внутрибрюшинное введение семакса, так же как и PGP, защищает слизистую оболочку желудка от повреждений, вызванных различными ульцерогенными агентами. При этом семакс действует в гораздо меньших концентрациях, чем PGP, что может свидетельствовать о том, что защитное действие семакса в отношении слизистой оболочки желудка связано не только с гидролизом семакса до PGP, но и определяется действием семакса в целом.

Гастропротективное действие глипролинов и семакса носит комплексный характер. Оно связано с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (базальной и стимулированной секреции кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как кровоток и бикарбонаты и ускорением скорости регенерации слизистой оболочки желудка (рис.52).

Рис. 52. Влияние глипролинов и семакса на гомеостаз слизистой оболочки желудка ("весы Шея" в модификации с использованием собственных данных и данных других авторов).

Обнаружение радиоактивной метки в мозге после системного введения меченого тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая их концентрацию в мозге и донной части желудка.

Показанное в экспериментах на животных гастропротективное действие может дать обоснование необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов - PG и GP - в качестве противоязвенных препаратов. Показанная высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочно-кишечного тракта в неизменном виде, сохранение противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение глипролинов в виде удобных для приема человеком таблетированных и капсулированных форм. Положительное влияние PGP и его метаболитов на широкий спектр механизмов, принимающих участие в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка (секрецию, кровоток, воспалительные процессы) делает их применение независимым от этиологии и типа патогенетических факторов, приведших к язвообразованию.

В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролинов -коллагена (в виде желатина) - открываются широкие перспективы профилактики и лечения нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем регулирования пищевого рациона человека и/или применения соединительнотканных белков в виде пищевых добавок.

Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До настоящего времени этот препарат применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического препарата. Наличие у него гастропротективных свойств делает возможным использование семакса в комплексной терапии язвенной болезни.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Жуйкова, Светлана Евгеньевна, Москва

1. Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. Пролин и простейшие пролинсодержащие фрагменты нейропептидов модулируют через центральные и периферические механизмы состояние слизистой оболочки желудка // Нейрохимия. 1996. Т. 13, Вып. 3. С. 209-214.

2. Абрамова МЛ., Самонина Г.Е., Мамедов Ч.В., Копылова Г.Н. Некоторые механизмы противоязвенного действия одного из простейших пролинсодержащих фрагментов регуляторных пептидов -Pro-Gly-Pro // Вестн. Моск. Ун-та. 1997. Сер. 16: «Биология», № 2. С. 7-10.

3. Ажгихин И.С. Простагландины новый класс биологически активных веществ // В кн.: Простагландины / Под ред. Ажгихина И.С. -М.: "Медицина". 1978. С. 6-83.

4. Алексеева Г.В., Боттаев Н.А., Горошкова В.В. Применение семакса в отдаленном периоде у больных с постгипоксической патологией мозга // Анестезиология и реаниматология. 1999. № 1. С. 40-43.

5. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека // Докл. АН. Сер. биол. 2000. Т. 374, № 3. С. 401-403.

6. Ашмарин И.П. Прогнозируемые и неожиданные эффекты олигопептидов (глипролинов, аналогов АКТГ4.ю, тафцина и тиролиберина) // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2001. Т. 87, №11. Р. 1471-1476.

7. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы истабилизаторы других пептидов // Вопр. биол. медиц. и фармацевт, химии. 2002. № 1. С. 24-27.

8. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Шелехов C.JI. Действие фрагмента адренокортикотропного гормона (AKTTVw) на обучение белых крыс при положительном подкреплении // Доклады АН СССР. 1978. Т. 240. № 5. С. 1245-1247.

9. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейропептиды // В кн.: Биохимия мозга / Под ред. Ашмарина И.П., Струкалова П.В., Ещенко Н.Д. -С-Пб.: Из-во С-Пб. Ун-та. 1999. С. 232-266.

10. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова Т.В. К вопросу о развитии проблемы эффективности сверхмалых доз биологически активных соединений // Рос. хим. журн. 1999. Т.53, № 5. С. 21-28.

11. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 2. С. 149-155.

12. Ашмарин И.П., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейств регуляторных пептидов // Вестн. РАМН. 1996. № 6. С. 50-57.

13. Ашмарин И.П., Пасторова В.Е., Ляпина Л.А. Влияние простейших пролинсодержащих пептидов на функциональную активность противосвертывающей системы и первичного гемостаза // Бюл. экспер. биол. и мед. 1998. Т. 125, № 5. С. 496-499.

14. Ашмарин И.П., Самонина Г.Е., Желязник Н.Я., Бакаева З.В. Протекторное действие пептида PGP на слизистую оболочку желудка //Докл. АН. 1999. Т. 368, № 5. С. 709-710.

15. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И.Ю., Самонина Г.Е. Влияние глипролинов на норадреналиновый тонус изолированного кольцевого сегмента аорты крысы // Бюл. экспер. биол. и мед. 2003. Т. 135, №4. С. 390-393.

16. Бродин С.В., Янович В.Х. Метаболизм 2-14С.глицина в тканях крыс in vivo // Укр. биохим. журнал. 1996. Т. 68, № 2. С. 34-37.

17. Булюсин В.Я., Нилова Т.Н., Шабанов П.Д. Лечение экспериментальных деструкций двенадцатиперстной кишки препаратами ноотропного действия // Бюл. экспер. биол. и мед. 1988. Т. 106, №11. С. 568-570.

18. Василенко В.Х., Гребен ев А.Л., Шептулин А. А. Язвенная болезнь//М.: «Медицина». 1987. 342 с.

19. Герман С.В., Жуйкова С.Е., Комаров Ф.И., Копылова Г.Н., Купер Г.Дж., Лукъянцева Г.В., Самопина Г.Е., Смирнова Е.А., Умарова Б.А. Панкреатический гормон амилин и целостность слизистой оболочки желудка // Вестник РАМН. 2001. Т. 12. С. 34-38.

20. Герман С.В., Купер Г.Дж., Самонина Г.Е., Серпа Р., Колокольникова О.А. Влияние панкреатического полипептида амилина на повреждения слизистой оболочки желудка // Рос. журн. гастроентерол. гепатол. проктол. 1997. Т.7, № 5. С. 93-97.

21. Глазова Н.Ю., Левицкая Н.Г., Андреева Л.А., Каменский А.А., Мясоедов Н. Ф. Ноотропные эффекты нового аналога фрагмента АКТГ(5-10) гексапептида AKTr(5-7)PGP // Докл. АН. 1999. Т. 367, № 1.С. 137-140.

22. Гривенников И.А., Долотов О.В., Голъдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих // Молек. Биол. Т. 33, № 1. С.120-126.

23. Гудашева Т.А., Бойко С.С., Акпаров В.Х., Островская Р.У.,

24. Розанцев Г.Г., Воронина Т. А., Жердев В.П., Середенин С.Б. Идентификация в мозге крыс цикло-пролилглицина, нового эндогенного пептида с ноотропной активностью // Докл. РАН. 1996. Т. 350, №6. С. 834-836.

25. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга// М.: «Медицина». 2001. 328 с.

26. ДельВалль Д. Язвенная болезнь // В кн.: Патофизиология органов пищеварения (пер. с англ.) / Под ред. Наточина Ю.В. М.: "Бином", С-Пб.: "Невский диалект". 1997. С. 43-63.

27. Демченко Н.Т. Методы исследования мозгового кровообращения // В кн.: Методы изучения кровообращения / JL: «Наука». 1976. С. 104-124.

28. Дубинин В.А., Асмакова Л.С., Сохраненкова Н.Ю., Беспалова Ж.Д., Незавибатъко В.Н., Каменский А.А. Сравнительный анализ нейротропной активности экзорфинов производных пищевых белков //Бюл. экспер. биол. и мед. 1998. Т. 125, № 2. С. 153-157.

29. Железная JI.A. Структура и функции гликопротеинов слизи (муцинов) // Рос. журн. гастроентер. гепатол. колопрокт. 1998. Т. 8, № 1.С. 30-37.

30. Жуйкова С.Е., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. Сравнение противоязвенных свойств ОФ-900, ОФ-743 и их комбинации на разных моделях индукции вызова язв желудка у крыс // Бюл. экспер. биол. и мед. 1997. Т. 124, № 7. С.13-15.

31. Золотарев В.А., Поленов С.А., Лепнев Г.П., Разумова Н.А. Метод непрерывной количественной оценки секреции кислоты и бикарбонатов в желудке наркотизированных крыс // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1996. Т. 82, № 7. С. 111-115.

32. Иванов Ю.В. Ультраструктурные изменения в поджелудочной железе крыс с острым панкреатитом после введения семакса // Экспер. клин, фармакол. 2000. Т. 63, № 6. С. 37-38.

33. Ивашкин В.Т. Helicobacter pilory: биологические характеристики, патогенез, перспективы эрадикации // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997. Т. 7, № 1. С. 21-23.

34. Каменская М.А. Синаптическая передача. Медиаторы // В кн.: Биохимия мозга / Под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В., Ещенко Н.Д. С-Пб.: Издательство С-Пб Ун-та. 1999. С. 179-204.

35. Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатъко В.Н., Ашмарин И.П. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейропептидного лекарственного препарата семакс // Физиология человека. 1992. Т. 18, № 5. С. 104-107.

36. Королева М.В., Мейзеров Е.Е., Незавибатъко В.Н., Каменский А. А., Дубинин В. А. Влияние гептапептида семакс на электроэнцефалограмму человека // Бюл. экспер. биол. и мед. 1996а. Т. 121, № 1.С. 116-117.

37. Королева М.В., Мейзеров Е.Е., Незавибатъко В.Н., Каменский А.А., Дубынин В.А., Яковлев Ю.Б. Изучение анальгетического действия препарата семакс// Бюл. экспер. биол. и мед. 19966. Т. 122, № 11. С. 527-529.

38. Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Зозуля А.А. Ингибирующее действие семакса и селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека // Биоорг. хим. 2001. Т.27, № 3. С. 180-183.

39. Курышева Н.И., Шпак А.А., Иойлева Е.Э., Галантер Л.И., Нагорнова Н.Д., Шубина Н.Ю., Слышалова Н.Н. «Семакс» в лечении глаукоматозной оптической нейропатии у больных с нормализованным офтальмотонусом // Вестн. офтальм. 2001. Т. 117, № 4,С. 5-8.

40. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю., Воскресенская О.Г, Андреева Л.А. Алфеева Л.Ю., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. Исследование нейротропной активности продуктов ферментативной деградации семакса//Докл. АН. 2000. Т. 372, № 2. С. 268-271.

41. Линднер Д.П., Поберий И.А., Розкин М.Я., Ефимов B.C. Морфометрический анализ популяции тучных клеток // Архив патологии. 1980. Т. 42, № 6. С. 60-62.

42. Лопина ОД. Физиология протонной помпы // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997. Т. 7, № 5. С. 91-96.

43. Лопина О.Д., Котлобай А.А., Рубцов A.M. Молекулярные механизмы регуляции секреции соляной кислоты // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997. Т. 7, № 6. С. 15-19.

44. Лукьянцева Г.В. Участие панкреатического гормона амилина в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка // Автор, дисс. канд. дис. 2002. 24 с.

45. Мазо В.К., Морозов И.А., Ширина Л.Н. Всасывание белковых макромолекул в желудочно-кишечном тракте взрослых млекопитающих // Успехи физиол. наук. 1989. Т. 20, № 3. С. 65-85.

46. Мазуров В.И. Биохимия коллагеновых белков // М.: «Медицина». 1974. 248 с.

47. Островская Р.У., Молодавкин Г.М., Трофимов С.С., Попова Р.Я., Гудашева ТА. Нейрофармакологические свойства производных пирацетама // Бюл. эксп. биол. и мед. 1982. Т. 94, № 12. С. 62-65.

48. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Смолина Т.Ю., Ашмарин И.П. Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты коротких пролинсодержащих пептидов // Изв. РАН. Сер. биол. 1998. № 3. С. 390-394.

49. Поленов С.А. Кровоснабжение органов желудочно-кишечного тракта //В кн.: Физиология кровообращения. Физиология сосудистой системы / Л.: "Наука". 1984. С. 470-472.

50. Полунин Г.С., Нуриева С.М., Баяндин Д.Л., Шеремет Н.Л., Андреева Л.А. Определение терапевтической эффективности новогоотечественного препарата «Семакс» при заболеваниях зрительного нерва//Веста, офтальм. 2000. Т. 116, № 1. С. 15-18.

51. Пономарева-Степная М.А., Незавибатъко В.Н., Антонова Л.В., Андреева JJ.A., Алфеева Л.Ю., Потаман В.Н., Каменский А.А., Ашмарин И.П. Аналог AKTTYio стимулятор обучения пролонгированного действия // Химико-фармацевтический журнал. 1984. №7. С. 790-795.

52. Рысс Е.С., Звартау Э.Э. Фармакотерапия язвенной болезни // М.: «Бином», С-Пб.: «Невский диалект». 1998. 253 с.

53. Самонина Г.Е., Нацвлишвили Н.А., Ашмарин И.П. Антиульцерогенное действие комбинации психостимулятора фенилалкилсиднониминового ряда и аргинина // Украинский физиолог, ж. 1991. Т. 37, № 6. С.43-47.

54. Самонина Г.Е., Сергеев В.И., Серпа Диас Р. Величина кровотока в желудке наркотизированных крыс в зависимости от степени пищевой депривации // Веста. Моск. Ун-та. 1999. Сер. 16, № 1. С. 912.

55. Самусев Р.П., Селин Ю.М. Анатомия человека // М.: «Медицина». 1990. 480 с.

56. Сафарова Э.Ф. Фармакологическое исследование цитопротекторного действия нейротропных пептидов // Автор, дисс. канд. биол. наук. М.: 2002. 21 с.

57. Сафарова Э.Ф., Шрам С.И., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Трофическое действие ноотропных пептидных препаратов церебролизина и семакса на культивируемые клетки феохромоцитомы крысы // Бюл. эксп. биол. и мед. 2002. Т. 133, № 4. С. 462-465.

58. Сафарова Э.Ф., Шрам С.И., Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф. Влияниепептида семакс на выживаемость культивируемых клеток феохромоцотомы крысы при окислительном стрессе // Бюл. эксп. биол. и мед. 2003. Т. 135, № 3. С. 309-313.

59. Северъянова Л.А. Влияние адаптивных гормонов на интегративную деятельность мозга // М.: «Наука». 1988. 124 с.

60. Соколова Н.А. Регуляторные пептиды и вегетативная регуляция сердца // Патол. физиол. и эксперим. терап. 1988. № 6. С. 74-84.

61. Татаркин В.М. Возможности применения простагландинов и их прекурсоров в терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта // В кн.: Простагландины / Под ред. Ажгихина И.С. М.: «Медицина». 1978. С. 183-209.

62. Тимофеева Н.М., Иезуитова Н.Н., Громова Л.В. Современные представления о всасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих // Успехи физиол. наук. 2000. Т. 31, № 4. С. 24-37.

63. Умарова Б.А. Гепарин тучных клеток в адаптивных реакциях организма//Автор, дисс. докт. биол. наук. М.: 2000. 46 с.

64. Умарова БА., Шапиро Ф.Б., Струкова С.М. Участие гепарина тучных клеток в физиологических реакциях организма // Вестн. МГУ. Сер. 16. «Биология». 1994. № 3. С. 18-24.

65. Хилькин A.M., Шехтер А.Б., Истранов Л.И., Леменев В.Л. Коллаген и его применение в медицине. М.: «Медгиз». 1976. 228 с.

66. Хитрое Н.К. Медиаторы воспаления // В кн.: Воспаление / Под ред. Серова В.В., Паукова B.C. М.: «Медицина». 1995. С. 81-99.

67. Хугаева В.К., Александрии В.В. Зависимость терапевтического эффекта пептидного препарата семакс от степени тяжести ишемии мозга // Бюл. эксп. биол. и мед. 1997. Т. 124, № 7. С. 39-42.

68. Циммерман Я.С., Зиннатуллин М.Р. Helicobacter pylori и их роль в развитии хронического гастрита и язвенной болезни // Клин. Медицина. 1997. № 4. С. 8-13.

69. Черкасова К.А., Ляпина Л.А., Ашмарин И.П. Сравнительное действие препарата семакс и простейших пролинсодержащих пептидов в модуляции гемостатических реакций // Бюл. эксп. биол. и мед. 2001. Т. 132, №7. С. 620-622.

70. Яснецов В.В., Крылова И.Н., Проворнова Н.А. Фармакологическая коррекция нарушений мнестических функций, вызванных гипоксией и ишемией головного мозга, у крыс //

71. Авиакосмическая и экологическая медицина. 1998. Т. 32, № 1. С. 5560.

72. Яснецов В.В., Попов В.М., Киселева Н.М., Каменский А.А., Незавибатько В.Н. Вестибулопротекторные и антиамнестические свойства фрагментов адренокортикотропного гормона и их аналогов // Бюл. эксп. биол. и мед. 1995. Т. 119, № 6. С. 634-636.

73. Яснецов В.В., Правдивцев В.А., Крылова И.Н., Козлов С.Б., Проворнова Н.А. Влияние семакса и АКТГ 5-10 на импульсную активность центральных нейронов // Бюл. эксп. биол. и мед. 1998. Т. 125, №3. С. 304-306.

74. Allen A., Flemstrom G.F., Garner A., Kivilaakso E. Gastroduodenal mucosal protection //Physiol. Reviews. 1993. V. 73, № 4. C. 823-857.

75. Anan K., Donahue P.E., Doyle M.D., Nyhus L.M. Effects of afferent and efferent celiac nerves on acute gastric lesions: due to changes in blood flow? // Am. Surg. 1993. V. 59, № 8. P. 500-504.

76. Arakawa Т., Watanabe Т., Fukuda Т., Higuchi K., Fujiwara Y., Kobayashi K., Tarnawski A. Ulcer recurrence: cytokines and inflammatory response-dependent process // Dig. Dis. Sci. 1998. V. 43, Suppl. 9. P. S61-S66.

77. Asselin J., Knight C.G., Farndale R.W., Barnes M.J., Watson S.P. Monomeric (glicine-proline-hydroxyproline)lO repeat sequence is a partial agonist of the platelet collagen receptor glycoprotein VI // Biochem. J. 1999. V. 339(Pt. 2). P. 413-418.

78. Backwell F.R., Wilson D., Schweizer A. Evidence for a glycyl-proline transport system in ovine enterocyte brush-border membrane vesicles // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V. 215, № 2. P. 561-565.

79. BaiJ.P., Amidon G.L. Structural specificity of mucosal-cell transport and metabolism of peptide drugs: implication for oral peptide drug delivery //Pharm. Res. 1992. V. 9, № 8. P. 969-978.

80. Balint G.A. On a possible interrelationship among smoking, gastric ulceration and endogenous prostacyclin // Exp. Toxicol. Pathol. 2002. V. 54, № 1. P. 39-41.

81. Ballinger A. Cytoprotection with misoprostol: use in the treatment and prevention of ulcers // Dig. Dis. 1994. V. 12, № 1. P. 37-45.

82. Battal M.N., Hata Y., Matsuka K. et al. Effect of prostaglandin I2 analogue, beraprost sodium, on bum-induced gastric mucosal injury in rats // Burns. 1997. V. 23, № 3. P. 232-237.

83. Bhaskar K.R., Gong D.H., Bansil R., Pajevic S., Hamilton J.A., Turner B.S., LaMont J. T. Profound increase in viscosity and aggregation of pig gastric mucin at low pH // Am. J. Physiol. 1991. V. 261, № 5. P. G827-G832.

84. Bickel M, Kauffman G.L. Gastric gel mucus thickness: effect of distention, 16,16-dimethyl prostaglandin E2, and carbenoxolone // Gastroenterology. 1981. V. 80. P. 770-775.

85. Bienkowski R.S., Cowan M.J., McDonald J.A., Crystal R.G. Degradation of newly synthesized collagen // J. Biol. Chem. 1978. V. 253, № 12. P. 4356-4363.

86. Blandizzi C., Colucci R., Carignani D., Lazzeri G., Del Tacca M. Positive modulation of pepsinogen secretion by gastric acidity after vagal cholinergic stimulation // J. Pharmacol. Exp. Therap. 1997. V. 283, № 3. P. 1043-1050.

87. Boron W.F., Waisbren S.J., Modlin I.M., Geibel J.P. Unique permeability barrier of the apical surface of parietal and chief cells in isolated perfused gastric glands // J. Exp. Biol. 1994. V. 196. P. 347-360.

88. Bowyer R.C., Jehanli A.M., Patel. G., Hermon-Taylor J. Development of enzyme-linked immunosorbent assay for free human pro-colipase activation peptide (APGPR) // Clin. Chim. Acta. 1991. V. 200, №2. P. 137-152.

89. Bregonzio C., Armando I., Ando H., Jezova M., Baiardi G., Saavedra J.M. Anti-inflammatory effects of angiotensin II ATi receptor antagonism prevent stress-induced gastric injury // Am. J. Physiol. 2003. V. 285, №2. P. G414-G423.

90. Brooks F.P. The pathophysiology of peptic ulcer: an overview // In book: Peptic ulcer disease. (Contemporaiy issues in Gastroenterology;

91. V.3) / Ed.: Brooks F.P., Cohen S., Soloway R.D. New York, Edinburgh, London, Melbourne: "Churchill Livingstone". 1985. P. 45-149.

92. Brown J.F., Keates A.C., Hanson P.J., Whittle B.J. Nitric oxide generators and cGMP stimulate mucus secretion by rat gastric mucosal cells //Am. J. Physiol. 1993. V. 265, № 3. P. G418-G422.

93. Bryan R.M.Jr. Cerebral blood floow and energy metabolism during stress //Am. J. Physiol. 1990. V. 259, № 2(Pt.2). P. H269-H280.

94. Brzozowski Т., Drozdowicz D., Majka J., Konturek S.J. Studies on gastroprotection induced by capsaicin and papaverine // J. Physiol. Pharmacol. 1992. V.43, № 4. P.309-322.

95. Brzozowski Т., Konturek S.J., Sliwowski Z. et al. Role of L-arginine, a substrate for nitric oxide-synthase, in gastroprotection and ulcer healing // J. Gastroenterol. 1997. V.32, № 4. P.442-452.

96. Bunce K.T., Grewal M., Parsons M.E. The effect of cimetidine on basal and stimulated pepsin secretion in the isolated whole stomach of the rat // British J. Pharmacol. 1981. V.73, № 1. P. 41-46.

97. Byun H.G., Kim S.K. Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from Alaskan pollack skin // J. Biochem. Mol. Biol. 2002. V. 35, № 2. P.239-243.

98. Caroppo R, Debellis L., Valenti G., Alper S., Fromter E., Curci S. Is resting state НСОз" secretion in frog gastric fundus mucosa mediated by apical СГ/НСОз' exchange? // J. Physiol. (Lond). 1997. V. 499 (Pt. 3). P. 763-771.

99. Chen R.Y., Ross G., Chyu K.Y., Guth P.H. Role of L-arginine-derived nitric oxide in cholinergic dilation of gastric arterioles// Am. J. Physiol. 1993. V.265, № 6(Pt 2). P. H2110-H2116.

100. Chen X.C., Hua Z.C., Zhu D.X. A low molecular weight urokinase derivative with enhanced fibrin affinity. Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. V. 39. P. 797-803.

101. Cho C.H., Chen B.W., Hui W.M., Lam S.K. The influence of acute or chronic nicotine treatment on ethanol-induced gastric mucosal damage in rats //Dig. Dis. Sci. 1990. V.35, N2 1. P.106-112.

102. Chuang C.N., Chen M.C.Y., Soil A.H. Gastrin-histamine interaction: direct and paracrine elements // Scand. J. Gastroenterol. 1991. V. 26, Suppl. 180. P. 95-103.

103. Clarke D.L., Thomson S.R. Attenuated gastric mucosal blood flow predicts non-healing of benign gastric ulcers // Eur. Surg. Res. 2002. V. 34, № 6. P. 432-436.

104. Cooper G.J. Amylin compared with calcitonin gene-related peptide: structure, biology, and relevance to metabolic disease // Endocr. Rev. 1994. V. 15, №2. P. 163-201.

105. Cooper G.J., Tse СЛ. Amylin, amyloid and age-related disease // Drags Aging. 1996. V. 9, № 3. P. 202-212.

106. Corbett M.E., Boyd E.J., Periston J.G., Wormsley K.G., Watt P. W., Rennie M. J. Pentagastrin increases pepsin secretion without increasing its fractional synthetic rate // Am. J. Physiol. 1995. V. 269, № 3. P. E418-E425.

107. Coskun Т., Chu S., Montrose H. Intragastric pH regulates conversion from net acid to net alkaline secretion by the rat stomach // Am. J. Physiol. 2001. V. 281. P. G870-G877.

108. Cucino C., Sonnenberg A. The long-term time trends of peptic ulcer and ulcerative colitis are interrelated // Am. J. Gastroenterol. 2002. V.97, № 10. P. 2657-2662.

109. Cunningham D.F., O'Connor B. Proline specific peptidases // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.1343, № 2. P. 160-186.

110. Curci S., Debellis L., Caroppo R., Fromter E. Model of bicarbonate secretion by resting frog stomach fundus mucosa. I. Transepithelial measurements//Pflugers Arch. 1994. V. 428. P. 648-654.

111. Curtis G.H., MacNaughton W.K., Gall D.G., Wallace J.L. Intraluminal pH modulates gastric prostaglandin synthesis // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1995. V.73,№ 1. P. 130-134.

112. Dabros W., Brzozowski Т., Konturek S.J., Stachura J. ECL cells involvement in the isoproterenol-induced gastroprotection. An ultrastructural study//Pol. J. Pathol. 1998. V.49, № 1. P. 3-13.

113. Debas H.T., Carvajal S.H. Vagal regulation of acid secretion and gastrin release // Yale J. Biol. Med. 1994. V. 67. P. 145-151.

114. Desai M.A., Mutlu M., Vadgama P. A study of macromolecular diflusion through native porcine mucus // Experientia. 1992. V. 48. P. 2226.

115. Descroix-Vagne M., Perret J.P., Daoud-El Baba M., Gros /., Rakotomalala H., Desvigne A., Jourdan G., Nicol P. Interaction between pepsin and acid secretion during fundic perfusion in cat and rabbit // Сотр. Biochem. Physiol. 1993. V.104A. P. 283-286.

116. Dimaline R., Evans D., Varro A., Dockray G. Reversal by omeprazole of the depression of gastrin cell function by fasting in the rat // J. Physiol. (Lond). 1991. V. 433. P. 483-493.

117. Ding M., Kinoshita Y., Kishi K., Nakata H., Hassan S., Kawanami

118. C., Sugimoto Y, Katsuyama M., Negishi M., Narumiya S., Ichikawa A., Chiba T. Distribution of prostaglandin E receptors in the rat gastrointestinal tract//Prostaglandins. 1997. V. 53, № 3. P. 199-216.

119. Eastwood G.L. Is smoking still important in the pathogenesis of peptic ulcer disease? // J. Clin. Gastroenterol. 1997. V. 25, Suppl. 1. P. Sl-S7.

120. Engel E., Guth P.H., Nishizaki Y, Kaunitz J.D. Barrier function of the gastric mucus gel // Am. J. Physiol. 1995. V. 269, № 6(Pt.l). P. G994-G999.

121. Fandriks L, Jonson C. Vagal and sympathetic control of gastric and duodenal bicarbonate secretion // J. Intern. Med. Suppl. 1990. V. 732. P. 103-107.

122. Ftindriks L, Stage L. Simultaneous measurements of gastric motility and acid-bicarbonate secretions in the anaesthetized cat // Acta. Physiol. Scand.1986. V.128. P. 563-573.

123. Farrell J .J., Taupin D., Koh T.J., Chen D., Zhao СМ., Podolsky

124. D.K., Wang T.C. TFF2/SP-deficient mice show decreased gastric proliferation, increased acid secretion, and increased susceptibility to NSAID injury // J. Clin. Invest. 2002. V. 109, № 2. P. 193-204.

125. Fault K.F., Schier G.M., Schlesinger P., Halpern B. The mass spectrometric identification of dipeptides in the urine of a patient suffering from chronic skin ulceration and oedema // Clin. Chim. Acta. 1976. V.15, №2. P. 313-321.

126. Feldman M. Comparison of the effects of over-the-counter famotidine and calcium carbonate antacid on postprandial gastric acid. A randomized controlled trial see comments. // JAMA. 1996. V. 275, № 18. P. 1428-1431.

127. Felley C.P., Qian J.M., Mantey S., Pradhan Т., Jensen R.T. Chief cell possess a receptor with high affinity for PACAP and VIP that stimulates pepsinogen release // Am. J. Physiol. 1992. V. 263, № 6. P. G901-G907.

128. Fiorucci S., McArthur K.E. Gastrin-releasing peptide directly releases pepsinogen from guinea pig chief cells // Am. J. Physiol. 1990. V. 259, № 5. P. G760-G766.

129. Flemstrom G. Effect of catecholamines, Ca+ and gastrin on gastric НСОз" secretion // Acta Physiol. Scand. 1978. Suppl.: Gastric ion transport. P. 81-90.

130. Flemstrom G., Isenberg J.I. Gastroduodenal mucosal alkaline secretion and mucosal protection // News Physiol. Sci. 2001. V.16. P. 2328.

131. Forssell H., Olbe L. Continuous computerized determination of gastric bicarbonate secretion in man // Scand. J. Gastroenterol. 1985. V.20. P. 767-774.

132. Frieri G., De Petris G., Aggio A., Santarelli D., Ligas E., Rosoni R., Caprilli R. Gastric and duodenal juxtamucosal pH and Helicobacter pylori // Digestion. 1995. V. 56, № 2. P. 107-110.

133. Friis-Hansen L. Gastric functions in gastrin gene knock-out mice // Pharmacol. Toxicol. 2002. V. 91, № 6, P. 363-367.

134. Friis-Hansen L., Sundler F., Li Y., Gillespie P.J., Saunders T.L., Greenson J.K., Owyang C., Rehfeld J.F., Samuelson L.C. Impaired gastric acid secretion in gastrin-deficient mice // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. G561-G568.

135. Galli S.J., Wershil B.K., Bose R., Walker P.A., Szabo S. Ethanol-induced acute gastric injury in mast cell-deficient and congenic normal mice. Evidence that mast cell can augment the area of damage // Am. J. Pathol. 1987. V.128,№ 1. P. 131-140.

136. Gardner M.L.G. Gastrointestinal absorption of intact proteins // Annu. Rev. Nutr. 1988. V. 8. P.329-350.

137. Garner A. Effects of acetylsalicylate on alkalinization, acid secretion and electrogenic properties in the isolated gastric mucosa // Acta Physiol. Scand. 1977. V.99. P.281-291.

138. Garner A., Flemstrom G. Gastric НСО'з secretion in the guinea pig //Am. J. Physiol. 1978. V.234, № 6. P. E535-E541.

139. Gislason H., Sorbye H., Abdi-Dezfuli F. et al. Role of prostaglandins and histamine in hyperemic response to superficial and deep gastric mucosal injury and H* back-diffusion in cats // Dig. Dis. Sci. 1995. V.40, № 8. P.1669-1678.

140. Goel R.K., Chakravarty M., Abbas W.R., Singh K.P., Bhattacharya S.K. Effect of piracetam, a nootropic agent, on experimental gastric ulcer in rat // Indian J. Exp. Biol. 1990. V. 28, № 4. P. 337-340.

141. Graham D.Y., Ginger M.L., Evans D.G., Evans D.J., Klein P.D. Effect of triple therapy (antibiotics plus bismuth) on duodenal ulcer healing: a randomized controlled trial // Ann. Intern. Med. 1991. V. 115. P. 266-269.

142. Greenberg G., Fung L., Pocol-Daniel S. Regulation of somatostatin-14 and -28 secretion by gastric acid in dogs: differential role of cholecystokinin// Gastroenterology. 1993. V. 105. P. 1387-1395.

143. Gritti /., Banfi G., Roi G.S. Pepsinogens: physiology, pharmacology, pathophysiology and exercise // Pharmacol. Res. 2000. V. 41, №3. P. 265-281.

144. Guidobono F. Amylin and gastrointestinal activity // Gen. Pharmacol. 1998. V. 31., № 12. P. 173-177.

145. Guidobono F., Coluzzi M., Pagani F., Pecile A., Netti C. Amylin given by central and peripheral routes inhibits acid gastric secretion // Peptides. 1994. V. 15, № 4. P. 699-702.

146. Guidobono F., Pagani F., Ticozzi C., Sibilia V., Pecile A., Netti C. Protection by amylin of gastric erosions induced by indomethacin or ethanol in rats // Br. J. Pharmacol. 1997. V. 120, № 4. P. 581-586.

147. Guslandi M, Sorghi M., Pontikaki I., Tittobello A. Gastric microcirculation and bicarbonate production in heavy smokers // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 1995. V. 7, № 10. P. 985-987.

148. Guslcmdi M., Tittobello A. Sustained enhancement of gastric НСОз secretion in humans by enprostil // Therapie. 1991. V. 46, № 1. P. 13-15.

149. Guttu K., Rosok В., Gislason H., Fandriks L., Svanes K., Gronbech J.E. Gastric bicarbonate secretion, acid secretion, and mucosal blood flow during influence of pentagastrin and omeprazole in the cat // Scand. J. Gastroenterol. 1991. V.26. P. 431-441.

150. Harada N., Okajima K., Murakami K., Uchiba M., Tanaka K., Okabe H., Takatsuki K. Novel role of prostacyclin in stress-induced gastric mucosal lesion formation in rats // J. Lab. Clin. Med. 1997. V.129, № 6. P.620-626.

151. Hawkey C.J., Rampton D.S. Prostaglandins and the gastrointestinal mucosa: are they important in its function, disease, or treatment? // Gastroenterol. 1985. V.89,№ 5. P.l 162-1188.

152. Heinemann A., Sattler V., Jocic M., Holzer P. Inhibition of acid-induced hyperaemia in the rat stomach by endogenous NK2 receptor ligands // Neurosci. Lett. 1997. V.237, № 2-3. P.133-135.

153. Helander H.F., Keeling D.J. Cell biology of gastric acid secretion // Baillieres Clin. Gastroenterol. 1993. V.7,№ 1. P. 1-21.

154. Hernandez D.E., Morin P., Salaiz А.В., Moreira M.A., Jennes L. Brain ACTH prevents stress gastric lesions in rats // Brain Res. Bull. 1990. V. 25, № 4. P. 605-607.

155. Hersey S.J., Sachs G. Gastric acid secretion // Physiol. Rev. 1995. V. 75. P. 155-189.

156. Heylings J.R., Garner A., Flemstrom G. Regulation of gastroduodenal НСО'з transport by luminal acid in the frog in vitro // Am. J. Physiol. 1984. V. 246. P. G235-G242.

157. Hill S.J., Ganellin C.R., Timmerman H., Schwartz J.C., Shankley N.P., Young J.M., Schunack W., Levi R., Haas H.L. International union of pharmacology. ХП1. Classification of histamine receptors // Pharmacol. Rev. 1997. V. 49, № 3. P. 253-278.

158. Hirose Я, Takeuchi K., Okabe S. Effect of indomethacin on gastric mucosal blood flow around acetic acid-induced gastric ulcers in rats // Gastroenterology. 1991. V.100,№ 5(Pt 1). P. 1259-1265.

159. Hirschowitz В.I., Helman С. A. Effects of fundic vagotomy and cholinergic replacement on pentagastrin dose responsive gastric acid and pepsin secretion in man // Gut. 1982. V. 23. P. 675-682.

160. Hisanaga Y., Goto H., Tachi K. et al. Implication of nitric oxide synthase activity in the genesis of water immersion stress-induced gastric lesions in rats: the protective effects of FK506 // Aliment. Pharmacol. Ther. 1996. V.10, № 6. P.933-940.

161. Ho S.B., Roberton A.M., Shekels L.L., Lyftogt C.T., Neihans G.A., Toribara N.W. Expression cloning of gastric mucin complementary DNA and localization of mucin gene expression I I Gastroenterology. 1995. V. 109. P. 735-747.

162. Hogan D.L., Ainsworth M.A., Isenberg J.I. Review article: gastroduodenal bicarbonate secretion // Aliment. Pharmacol. Ther. 1994. V.8, № 5. P. 475-488.

163. Holzer P. Role of sensory nerves in gastroprotection // Abstract of XXXIII Internat. Congr. Physiol. Sci. 1997. St. Peterburg. P.L009.03.

164. Holzer P., Pabst M.A. Visceral afferent neurons: role in gastric mucosal protection//News Physiol. Sci. 1999. V.14. P.201-206.

165. Holzer P., Guth P.H. Neuropeptide control of rat gastric mucosal blood flow. Increase by calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal polypeptide, but not substance P and neurokinin A // Circ. Res. 1991. V.68,№ 1. P.100-105.

166. Holzer P., Wachter C., Jocic M, Heinemann A. Vascular bed-dependent roles of the peptide CGRP and nitric oxide in acid-evoked hyperaemia of the rat stomach // J. Physiol. (Lond). 1994. V.480 (Pt 3). P.575-585.

167. Horie S., Yano S., Watanabe K. Effects of drugs acting on СГ /НСОз" and Na+/H+ exchangers on acid secretion in the rat gastric mucosa sheet preparation // Eur. J. Pharmacol. 1992. V. 229, № 1. P. 15-19.

168. Horie S., Yano S., Watanabe K. Inhibition of gastric acid secretion in vivo and in vitro by an inhibitor of СГ/НСО3" exchanger, 4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. V. 265, № 3. P. 1313-1318.

169. Howden C.W., Forrest J. A., ReidJ.L. Effects of single and repeated doses of omeprazole on gastric acid and pepsin secretion in man // Gut.1984. V. 25. P. 707-710.

170. Humphreys G.A., Davison J.S., Veale W.L. Hipothalamic neuropeptide Y inhibits gastric acid output in rat: role of the autonomic nervous system // Am. J. Physiol. 1992. V.263, № 5. P. G726-G732.

171. Jia L., Stamler J.S. Dual actions of S-nitrosylated derivative of vasoactive intestinal peptide as a vasoactive intestinal peptide-like mediator and a nitric oxide carrier // Eur. J. Pharmacol. 1999. V. 366, № 1. P.79-86.

172. Iiumoro Y., Bradford B.U., Forman D.T., Thurmcm R.G. Glycine prevents alcohol-induced liver injury by decreasing alcohol in the rat stomach//Gastroenterol. 1996. V.110. P. 1536-1542.

173. Isenberg J.I., Thompson J.C. Medical progress and ulcer disease: three key observations that changed the compass I I Gastroenterology. 1997. V. 113. P. 1031-1033.

174. Ito M., Shichijo K., Nakashima M, et al. Gastric mucosal blood flow in relation to stress-induced hypercontraction in spontaneously hypertensive rats //Jpn. J. Physiol. 1994. V.44, № 6. P.717-727.

175. Iwata F., Leung F.W. Misoprostol reverses the inhibition of gastric hyperemia and aggravation of gastric damage by tobacco cigarette smoke in the rat // Scand. J. Gastroenterol. 1995. V.30, № 4. P.315-321.

176. Janson J., Ashley R.H., Harrison D., Mclntyre S., Butler P.C. The mechanism of islet amyloid polypeptide toxicity is membrane disruption by intermediate-sized toxic amyloid particles // Diabetes. 1999. V.48. P. 491498.

177. Jin И.О., Lee K.Y., Chang T.-M., Chey W.Y., Dubois A. Secretin, a physiological regulator of gastric emptying and acid output in dogs // Am. J. Physiol. 1994. V. 267. P. G702-G708.

178. Jordan N., Newton J., Pearson J.P., Allen A. A new method for the visualization of in situ mucus layer in rat and man // Clin. Sci. (Colch). 1998. V. 95. P.97-106.

179. Kageyama T. Pepsinogens, progastricsins, and prochymosins: structure, function, evolution, and development // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V. 59, №> 2. P. 288-306.

180. Kajimura M., Reuben M.A., Sachs G. The muscarinic receptor gene expressed in rabbit parietal cell is the M3 subtype // Gastroenterology. 1992. V. 103. P. 870-875.

181. Kalia N., Brown N.J., Jacob S., ReedM.W., Bardhan K.D. Studies on gastric mucosal microcirculation. 1. The nature of regional variations induced by ethanol injury // Gut. 1997. V. 40, № 1. P 31-35.

182. Kamiya Т., Kobayashi Y., HirakoM., Misu N., Nagao Т., Нага M., Matsuhisa E., Ando Т., Adachi H., Sakuma N., Kimura G. Gastric motilityin patients with recurrent gastric ulcers // J. Smooth Muscle Res. 2002. V. 38, № l.P. 1-9.

183. Kato S., Hirata Т., Takeuchi K. Nitric oxide, prostaglandin, and sensory neurons in gastric mucosal blood flow response during acid secretion in rats // Gen. Pharmacol. 1997. V.28, № 4. P.513-519.

184. Kawano STsuji S., Sato N., Kamada T. NSAIDS and the microcirculation of the stomach // Gastroenterol. Clin. North. Am. 1996. V.25, № 2. P.299-315.

185. Kiraly A., Suto G., Guth P.H., Tache Y. Peripheral mediators involved in gastric hyperemia to vagal activation by central TRH analog in rats //Am. J. Physiol. 1998. V. 274, №l(Pt 1). P. G170-G177.

186. Kiraly A., Suto G., Vincze A., Mezsik G. Acute and chronic surgical vagotomy (SV) and gastric mucosal vascular permeability in ethanol treated rats // Acta Physiol. Hung. 1992. V.80, №1-4. P.219-224.

187. Kitagawa H., Takeda F., Kohei H. Effect of endothelium-derived relaxing factor on the gastric lesion induced by HC1 in rats // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990. V.253,№ 3. P.l 133-1137.

188. Kiviluoto Т., Ahonen M., Back N., Happola O., Mustonen H., Paimela #., Kivilaakso E. The pre-epithelial mucus-НСОЗ- layer protects against intracellular acidosis in acid-exposed gastric mucosa // Am. J. Physiol. 1993. V. 264, № 1. P. G57-G63.

189. Klamut M.J., Keshavarzian A. Stress ulcer // J. Assoc. Acad. Minor. Phys. 1992. V.3, № 3. P.89-94.

190. Kobayashi Т., Tonai S., Ishihara Y., Koga R., Okabe S., Watanabe T. Abnormal functional and morphological regulation of the gastric mucosa in histamine H2 receptor-deficient mice // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 1741-1749.

191. Konturek P.C., Brzozowski Т., Konturek S.J. et al. Activation of genes for growth factors and cyclooxygenases in rat gastric mucosa during recovery from stress damage // Eur. J. Pharmacol. 1998. V.342, № 1. P. 5565.

192. Konturek S.J., Brzozowski Т., Majka J., Szlachcic A., Pytko-Polonczyk J. Implications of nitric oxide in the action of cytoprotective drugs on gastric mucosa // J. Clin. Gastroenterol. 1993a. V.17. Suppl.l. P.S140-S145.

193. Konturek S.J., Brzozowski Т., Majka J., Dembinski A., Slomiany A., Slomiany B.L. Transforming growth factor alpha and epidermal growth factor in protection and healing of gastric mucosal injury // Scand. J. Gastroenterol. 1992. V.27, № 8. P.649-655.

194. Konturek S.J., Brzozowski Т., Pytko Polonczyk J., Drozdowicz D. Comparison of cholecystokinin, pentagastrin, and duodenal oleate in gastroprotection in rats // Scan. J. Gastroenterol. 1995. V.30, № 7. P.620-630.

195. Konturek S.J., Kwiecien N., Sito E., Obtulowicz W., Kaminski K., Oleksy J. Effects of ebrotidine on aspirin-induced gastric mucosal damage and blood flow in humans // Scan. J. Gastroenterol. 1993b. V.28, № 12. P. 1047-1050.

196. Kubes P., Wallace J.L. Nitric oxide as mediator of gastrointestinal mucosal injury? Say it ain't so // Mediators of Inflammation. 1995. V.4. P.397-405.

197. Kuratani K., Kodama H., Yamaduchi I. Enhancement of gastric mucosal blood flow by beta-3 adrenergic agonists prevents indomethacin-induced antral ulcer in the rat // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. V.270, № 2. P.559-565.

198. Kuwahira /., Gonzalez N.C., Heisler N., Piiper J. Regional blood flow in conscious resting rats determined by microsphere distribution // J. Appl. Physiol. 1993. V.74, № 1. P. 203-210.

199. Lacy E.R., Hund P., Tietge J. Effects of misoprostol, cimetidine, and ethanol on rat gastric plasma volume and morphology // J. Clin. Gastroenterol. 1990. V.12, Suppl.l. P. S158-S169.

200. Laine L.A. Helicobacter pylori and complicated ulcer disease // Am. J. Med. 1996. V. 100. P. 52S-57S.

201. Lanas A.I., Anderson J.W., Uemura N., Hirschowitz B.I. Effects of cholinergic, histaminergic, and peptidergic stimulation on pepsinogen secretion by isolated human peptic cells // Scand. J. Gastroenterol. 1994. V. 29, №8. P. 678-683.

202. Le J., Perier C., Peyroche S., Rascle F., Blanchon M.A., Gonthier R., FreyJ., Chamson A. Urine glycyl-L-proline increase and skin trophicity // Amino Acids. 1999. V. 17, № 3. P. 315-322.

203. Lee S.P. The mode of action of colloidal bismuth subcitrate // Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1991. V. 185. P. 1-6.

204. Lempinen M, Inkinen K., Wolff H., Ahonen J. Connective tissue growth factor in indomethacin-induced rat gastric ulcer // Eur. Surg. Res. 2002. V. 34, № 3. P. 232-238.

205. Leung F.W., Tallos E.G., Tache F.Y., Guth P.H. Calcitonin gene-related peptide inhibits acid secretion without modifying blood flow // Am. J. Physiol. 1987. V. 252. P. G215-G218.

206. Lewis S.D., Nag AS., Lyle E.A., Mellot E.A. Inhibition of thrombin by peptides containing lysil-alpha-keto carbonyl derivatives. 1995. Thromb. Haemost. V.74. P. 1107-1112.

207. Li D.S., Raybould H.E., Quintero E., Guth P.H. Calcitonin gene-related peptide mediates the gastric hyperemic response to acid back-diffusion // Gastroenterology. 1992. V.102, № 4(Pt 1). P.l 124-1128.

208. Li D.S., Raybould H.E., Quintero E., Guth P.H. Role of calcitonin gene-related peptide in gastric hyperemic response to intragastric capsaicin // Am. J. Physiol. 1991. V. 261, № 4(Pt.l). P. G657-G661.

209. Li P., Chang T.M., Chey W.Y. Secretin inhibits gastric acid secretion via a vagal afferent pathway in rats // Am. J. Physiol. 1998. V. 275, № 1. P. G22-G28.

210. Li Z.Q., Mardh S. Interactions between Ca2+ and cAMP-dependent stimulatory pathways in parietal cells // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1311. P. 133-142.

211. Li Z.S., Fox-Threlkeld J.E., Fumess J.B. Innervation of intestinal arteries by axons with immunoreactivity for the vesicular acetylcholine transporter (VAChT) 11 J. Anat. 1998. V.192(Pt 1). P.107-117.

212. Ligumsky M., Sestieri M., Окоп Е., Gins burg I. Antioxidants ingibit ethanol-induced gastric injury in rat. Role of manganese, glycine, carotene // Scand. J. Gastroenterol. 1995. V.30, № 9. P.854-860.

213. Lin C.W., Bianchi B.R., Miller T.R., Witte D.G., Wolfram C.A. Both CCK-A and CCK-B/gastrin receptors mediate pepsinogen release in guinea pig gastric glands // Am. J. Physiol. .1992. V. 262, № 6. P. G1113-G1120.

214. Lin L., Okada S., York D.A., Bray G.A. Structural requirements for the biologycal activity of enterostatin// Peptides/ 1994. V. 15. P. 849-854.

215. Lin L., York D.A. Comparison of the effects of enterostatin on food intake and gastric empting in rats // Brain Res. 1997. V. 745. P. 205-209.

216. Lin S.K., Lambert J.R. Helicobacter pylori in ulcerogenesis // Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1995. V. 210. P. 64-69.

217. Lippe I. Т., Holzer P. Participation of endothelium-derived nitric oxide but not prostacyclin in the gastric mucosal hyperaemia due to acid back-diffusion // Br. J. Pharmacol. 1992. V. 105, № 3. P.708-714.

218. Ma L., Chow J. Y, Cho C.H. Mechanistic study of adverse actions of cigarette smoke exposure on acetic acid-induced gastric ulceration in rats // Life Sci. 1998. V. 62, № 3. P. 257-266.

219. Mardh S., Song Y.H., Carisson C., Bjorkman T. Mechanisms of stimulation of acid production in parietal cells isolated from the pig gastric mucosa//Acta Physiol. Scand. 1987. V. 131. P. 589-598.

220. Maton P.N., Burton M.E. Antacids revisited: a review of their clinical pharmacology and recommended therapeutic use // Drugs. 1999. V.57, № 6. P. 855-870.

221. Matsueda K., Muraoka A., Umeda N., Misaki N., Uchida M., Kawano O. Effect of the luminal hydrogen ion on alkali and mucus secretion in the rat stomach // Scand. J. Gasrtoenterol. Suppl. 1989. V. 162. P. 35-38.

222. Matsuhisa T.M., Yamada N.Y., Kato S.K., Matsukura N.M.

223. Helicobacter pylori infection, mucosal atrophy and intestinal metaplasia in Asian populations: a comparative study in age-, gender- and endoscopic diagnosis-matched subjects // Helicobacter. 2003. V. 8, № 1. P. 29-35.

224. McDonald C., Trier J.S., Everett B. Cell proliferation and migration in the stomach, duodenum and rectum of man // Gastroenterology. 1964. V. 46. P. 405-417.

225. Mertz N.A., Hillings J., Eskerod O., Bukhave K., Rask M.J. Muscarinic Mi receptor inhibition reduces gastroduodenal bicarbonate secration and promotes gastric prostaglandin Ег synthesis in healthy volunteers // Gut. 1995b. V.36, № 4. P. 528-533.

226. Metcalfe D.D., Baram D., Mecori Y.A. Mast cell // Physiol. Rev. 1997. V. 77, № 4. P. 1033-1079.

227. Milani S., Calabro A. Role of growth factors and their receptors in gastric ulcer healing // Microsc. Res. Tech. 2001. V. 53, № 5. P. 360-371.

228. Morishita Т., Guth P.H. Escape of gastric submucosal arterioles from acetylcholine-induced dilatation // Microcirc. Endothelium Lymphatics. 1986a. V.3, № 1. P. 89-105.

229. Morishita Т., Guth P.H. Vagal nerve stimulation causes noncholinergic dilatation of gastric arterioles // Am. J. Physiol. 1986b. V. 250, № 5(Pt 1). P. G660-G664.

230. Mozsik G., Karadi O., Kiraly A., Debreceni A., FiglerM., NagyL., Par A., Par G., Suto G., Vincze A. The key-role of vagal nerve and adrenals in the cytoprotection and general gastric mucosal integrity // J. Physiol. Paris. 2001. V. 95. P. 229-237.

231. Noto Т., Nagasaki M, Endo T. Role of vagus nerves and gastrin in the gastric phase of acid secretion in male anesthetized rats // Am. J. Physiol. 1997. V. 272, № 2. P. G335-G339.

232. Odes H.S., Hogan D.L., Steinbach J.H., Ballesteros M.A., Koss M.A., Isenberg J.I. Measurement of gastric bicarbonate secretion in the human stomach: different methods produce discordant results // Scand. J. Gastroenterol. 1992. V. 27. P. 829-836.

233. Ohkura Y., Furihata Т., Kawamata H., Tabuchi M., Kubota K, Terano A., Sakai Т., Fujimori T. Evaluation of cell proliferation and apoptosis in Helicobacter pylori gastritis using an image analysis processor//Gastric Cancer. 2003. V. 6, № 1. P. 49-54.

234. Okabe S., Roth J.L.A., Pfeiffer C.J. A method for experimental, penetration gastric and duodenal ulcer in rat. Observation on normal healing//Am. J. Digestive Disease. 1971. V. 16, № 3. P. 277-284.

235. Overmier J.B., Murison R. Anxiety and helplessness in the face of stress predisposes, precipitates, and sustains gastric ulceration // Bihav. Brain Res. 2000. V. 110. P. 161-174.

236. Pfeiffer A., Rochlitz H., Noelke В., Таске R., Moser U., Mutschler E., Lambrecht G. Muscarinic receptors mediating acid secretion in isolated rat gastric parietal cells are of Мз type // Gastroenterology. 1990. V. 98, № 1. P. 218-222.

237. Pfeiffer C.J. Experimental analysis of hydrogen ion diffusion in gastrointestinal mucus glycoproteins // Am. J. Physiol. 1981. V. 240, № 1. P. G176-G182.

238. Potaman V.N. Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Levitskaya N.G., Nezavibatko V.N. N-terminal degradation of АСТЩ4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 176, № 2. P. 741-746.

239. Potaman V.N. Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study // Peptides. 1993. V.14, № 3. P. 491495.

240. Qian J.M., Rowley W.H., Jensen R.T. Gastrin and CCK activate phospholipase С and stimulate pepsinogen release by interacting with two distinct receptors // Am. J. Physiol. 1993. V. 264, № 4. P. G718-G727.

241. Qiu B.S., Pfeiffer C.J., Cho C.H. Effects of chronic nitric oxide synthase inhibition in cold-restraint and ethanol-induced gastric mucosal damage in rats // Digestion. 1996. V.57, №1. P. 60-66.

242. Raufman J.P. Gastric chief cell: receptors and signal transduction mechanisms//Gastroenterology. 1992. V. 102. P. 699-710.

243. Raufman J.P. Peptic activity and gastroduodenal mucosal damage // Yale J. Biol. Med. 1996. V. 69, № 1. P. 85-90.

244. Ray A.K., Dey P.K. Influence of glycyl-proline (a dipeptide sequence of P-LPH at 43-44 position) on central actions of morphine // In: Current status of centrally acting peptides / Adv. Biosci. 1982. V.38. P. 261-264.

245. Raybould H.E., Holzer P., Thiefin G., Holzer H.H., Yoneda M, Tache Y.F. Vagal afferent innervation and regulation of gastric function // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 298. P.109-127.

246. Richter С., Tanaka Т., Yada R.Y. Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases: pepsinogen, progastricsin and prochymosin // Biochem. J. 1998. V. 335(Pt. 3). P. 481-490.

247. Rioicc K.P., Wallace J.L. Mast cell activation augments gastric mucosal injury through a leukotriene-dependent mechanism // Am. J. Physiol. 1994. V. 266, № 5(Pt. 1). P. G863-G869.

248. Rosenstock S., Jorgensen Т., Bonnevie O., Andersen L. Risk factors for peptic ulcer disease: a population based prospective cohort study comprising 2416 Danish adults // Gut. 2003. V. 52, № 2. P. 186-193.

249. Rossmann H., Bachmann O., Vieillard-Baron D., Gregor M., Seidler U. Na+/HCCV cotransport and expression of NBC 1 and NBC2 in rabbit gastric parietal and mucous cells // Gastroenterology. 1999. V. 116. P. 1389-1398.

250. Rostom A, Dube C., Wells G., Tugwell P., Welch V., Jolicoeur E., McGowan J. Prevention of NSAtD-induced gastroduodenal ulcers // Cochrane. Database Syst. Rev. 2002. № 4. CD002296.

251. Samonina G., Ashmarin I., Lyapina L. Glyproline peptide family: review on bioactivity and possible origins // Pathophysiology. 2002. V. 8. P. 229-234.

252. Sanders M., Ayalon A., Roll M., Soli A. The apical surface of canine chief cell monolayers resists H* back-diffusion // Nature. V. 313. P. 52-54.

253. Sandin A., Andrews F.M., Nadeau J A., Nilsson G. Effect of nervous excitation on acid secretion in horses // Acta Physiol. Scand. 2000. V. 168, №3. P. 437-442.

254. Sato N., Kawano S., Tsuji S., Ogihara Т., Yamada S. Gastric blood flow in ulcer diseases // Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1995. V. 208. P. 14-20.

255. Scarpignato C. Nonsteroidal anti-inflammatory drags: how do they damage gastroduodenal mucosa? // Dig. Dis. 1995. V. 13, Suppl. 1. P. 9-39.

256. Schade C., Flemstrdm G., Holm L. Hydrogen ion concentration in the mucus layer on top of acid-stimulated and -inhibited rat gastric mucosa //Gastroenterology. 1994. V. 107. P. 180-188.1. Л I

257. Seidler U., Pfeiffer A. Inositol phospate formation and Ca .i in secretagogue-stimulated rabbit gastric mucous cells // Am. J. Physiol. 1991. V. 260, №1. P. G133-G141.i

258. Seidler U., Sewing K.F. Ca -dependent and -independent secretagogue action on gastric mucus secretion in rabbit mucosal explants // Am. J. Physiol. 1989. V. 256, № 4. P. G739-G746.

259. Sellers L.A., Allen A., Morris E.R., Ross-Murphy S.B. Mucus glycoprotein gels. Role of glycoprotein polymeric structure and carbohydrate side chains in gel-formation // Carbohydr. Res. 1988. V. 178. P. 93-110.

260. Sevak R., Paul A., Goswami S., Santani D. Gastroprotective effect of beta-3 adrenoreceptor agonists ZD 7114 and CGP 12177 A in rats I I Pharmacol. Res. 2002. V. 46, № 4. P. 351-356.

261. Sharma H.S., Dey P.K. Influence of long-term immobilization stress on regional blood-brain barrier permeability, cerebral blood flow and 5-HT level in conscious normotensive young rats // J. Neurol. Sci. 1986. V.72,№1.P. 61-76.

262. Singh G., Singh L., Raufman J.P. Y2 receptors for peptide YY and neuropeptide YY on dispersed chief cells from guanea pig stomach // Am. J. Physiol. 1992. V. 262. № 4. P. G756-G762.

263. Sizonenko S. V., Sirimanne E. S., Williams С. E., Gluckman P.D. Neuroprotective effects of the N-terminal tripeptide of IGF-1, glycine-proline-glutamate, in the immature rat brain after hypoxic-ischemic injury // Brain Res. 2001. Vol. 922. P. 42-50.

264. Sjdvall Н., Forssell H, Olbe L. Simultaneous measurement of gastric acid and bicarbonate secretion in man // Scand. J. Gastroenterol. 1989. V. 24. P. 1163-1171.

265. Smith J.L., Torres E.L. Effect of topical acid on pepsinogen secretion in man // Scand. J. Gastroenterol. 1990. V. 25. P. 372-378.

266. Solcia E., Rindi G., Bujfa R., Fiocca R., Capella C. Gastric endocrine cells: types, function and growth // Regulatory peptides. 2000. V. 93. P. 31-35.

267. Soil A.H., Amirian D.A., Thomas L.P., Reedy T.J., Elashoff J.D. Gastrin receptors on isolated canine parietal cells // J. Clin. Invest. 1984. V. 73. P. 1434-1447.

268. Sorbye H., Svanes K. The role of blood flow in gastric mucosal defence, damage and healing // Dig. Dis. 1994. V.12, № 5. P. 305-317.

269. Stuart T.A., Sardet C., Pouyssegur J., Schwartz M.A., Brown D., Alper S.L. Immunolocalization of anion exchanger AE2 Mid cation exchanger NHE-1 in distinct adjacent cells of gastric mucosa // Am. J. Physiol. 1994. V. 266, № 2(Pt.l). P. C559-C568.

270. Suzuki H., Masaoka Т., Miyazawa M, Suzuki M, Miura S., Ishii H. Gastric mucosal response to Helicobacter pylori // Keio. J. Med. 2002. V. 51, Suppl. 2. P. 40-44.

271. Synnerstad I, Ekblad E., Sundler F, Holm L. Gastric mucosal smooth muscles may explain oscillations in glandular pressure: role of vasoactive intestinal peptide // Gastroenterology. 1998. V. 114, №2. P. 284-294.

272. Synnerstad /., Johansson M., Nylander O., Holm L. Intraluminal acid and gastric mucosal integrity: the importance of blood-borne bicarbonate//Am. J.Physiol. 2001. V. 280,№ l.P. 121-129.

273. Szabo S. The mode of action of sucralfate: the lxlxl mechanism of action//Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1991. V. 185. P. 7-12.

274. Takeuchi K., Kato S., Takehara K., Asada Y, Yasuiro T. Role of nitric oxide in mucosal blood flow response and the healing of HC1-induced lesions in the rat stomach // Digestion. 1997. V. 58, № 1. P. 19-24.

275. Takeuchi K., Nishiwaki H., Okabe S. Cytoprotective action of mast cell stabilizers against ethanol-induced gastric lesions in rat // Jpn. J. Pharmacol. 1986. V. 42, № 2. P. 297- 307.

276. Takeuchi К., Ohuchi Т., Matsumoto J., Okabe S. Regulation of gastroduodenal bicarbonate secretion by capsaicin-sensitive sensory neurons in rats // J. Clin. Gastroenterol. 1993. V. 1. P. S33-S39.

277. Takeuchi K., Ueshima K., Matsumoto J., Okabe S. Role of capsaicin-sensitive sensory nerves in acide-induced bicarbonate secretion in rat stomach I I Dig. Dis. Sci. 1992. V. 37, № 5. P. 737-743.

278. Takeuchi K., Ueshima K., Okabe S. Stimulation of gastric bicarbonate secretion by an analog of thyrotropin-releasing hormone, YM-14673, in the rat // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991b. V. 256, № 3. P. 10571062.

279. Tanaka M. Effects of medical vagotomy and sympathectomy on gastric mucosal prostaglandins in water immersion restrain rats // Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi. 1995. V. 92, № 8. P.l 133-1142.

280. Tao C., Yamamoto M., Mieno H., InoueM., Masujima Т., Kajiyama G. Pepsinogen secretion: coupling of exocytosis visualized by video microscopy and Ca2+.i in single cells // Am. J. Physiol. 1998. V. 274, № 6. P. G1166-G1177.

281. Tariq M., Al Moutaery A.R. Studies on the antisecretory, gastric anti-ulcer and cytoprotective properties of glycine // Res. Com. Molecular Path. Pharmacol. 1997. V. 97, № 2. P. 185-198.

282. Tarnawski A., Halter F. Cellular mechanisms, interactions, and dynamics of gastric ulcer healing // J. Clin. Gastroenterol. 1995. V. 21, Suppl. 1. P. S93-S97.

283. Tarn ok F., Mozsik G., Javor T. Comparison of inhibitory effects of atropine, cimetidine, and atropine plus cimetidine on the indomethacin-provoked gastric mucosal erosions in rats // Int. J. Tissue React. 1986. V.8, № 1. P. 41-45.

284. Taylor S.D., Soudah H.C., Chey W.Y., Scheiman J.M. Duodenal acidification and secretin, but not intraduodenal fat, inhibit human gastric acid secretion via prostaglandins I I Gastroenterology. 1994. V. 107. P. 1680-1685.

285. Tazi-Saad K., Chariot J., Del Tacca M., Roze C. Effect of alpha 2-adrenoceptor agonists on gastric pepsin and acid secretion in the rat // British J. Pharmacol. 1992. V. 106. P. 790-796.

286. Tepperman B.L., Jacob son E.D. Circulatory factor in gastric ulcer // In book: Peptic ulcer disease. (Contemporary issues in Gastroenterology;

287. V.3) / Ed.: Brooks F.P., Cohen S., Soloway R.D. New York, Edinburgh, London, Melbourne: "Churchill Livingstone". 1985. P. 261-278.

288. Tepperman B.L., Whittle B.J. Comparison of the effects of neuropeptide Y and noradrenaline on rat gastric mucosal blood flow and integrity//Br. J. Pharmacol. 1991. V. 102, № 1. P. 95-100.

289. Thangarajah #., Wong A., Chow D.C., Crothers J.M., Forte J.G. Gastric H-K-ATPase and acide-resistant surface proteins // Am. J. Physiol. 2002. V. 282, № 6. P. G953-G961.

290. Thiefin G., Raybould H.E., Leung F.W. et al. Capsaicin-sensitive afferent fibers contribute to gastric mucosal blood flow response to electrical vagal stimulation // Am. J. Physiol. 1990. V. 259, № 6(Pt 1). P. G1037-G1043.

291. Thiefin G., Tache Y, Leung F.W, Guth P.H. Central nervous system action of thyrotropin-releasing hormone to increase gastric mucosal blood flow in the rat // Gastroenterology. 1989. V. 97, № 2. P. 405-411.

292. Wachter C., Heinemann A., Jocic M., Holzer P. Visceral vasodilatation and somatic vasoconstriction evoked by acid challenge of the rat gastric mucosa: diversity of mechanisms // J. Physiol. (Lond). 1995. V.486(Pt 2). P. 505-516.

293. Waisbren S.J., Geibel J.P., Modlin I.M., Boron WF. Unusual permeability properties of gastric gland cell // Nature. 1994. V. 368. P. 332335.

294. Walker D., Thwaites D.T., Simmons N.L., Gilbert H.J., Hirst B.H. Substrate upregulation of the human small intestinal peptide transporter, hPepTl //J. Physiol. (L.). 1998. V. 507. P. 697-706.

295. Wank S.A. Cholecystokinin receptors // Am. J. Physiol. 1995. V. 269. P. G628-G646.

296. Weigert N., Schepp W., Haller A., Schusdziarra V. Regulation of gastrin, somatostatin and bombesin release from the isolated rat stomach by exogenous and endogenous gamma-aminobutyric acid // Digestion. 1998. V. 59,№ l.P. 16-25.

297. Welsh N. J., Shankley N.P., Black J.M. Comparative analysis of the vagal stimulation of gastric acid secretion in rodent isolated stomach preparations // Br. J. Pharmacol. 1994. V. 112. P. 93-96.

298. Winne D., Verheyen W. Diffusion coefficient in native mucus gel of rat small intestine //J. Pharm. Pharmacol. 1990. V. 42. P. 517-519.

299. Wu S., Giraud A., Mogard M, Sumii K., Walsh J. Effects of inhibition of gastric secretion on antral gastrin and somatostatin gene expression in rats //Am. J. Physiol. 1990. V. 258. P. G788-G793.

300. Wu S., Sumii K., Tari A., Sumii M, Walsh J. Regulation of antral gastrin and somatostatin gene expression during starvation and after refeeding//Gastroenterology. 1991. V. 101. P. 1552-1558.

301. Yagi K., Kato S., Ukawa H. Roles of prostaglandin E-receptor subtypes in gastric and duodenal bicarbonate secretion in rats // Gastroenterology. 1997. V. 113, № 5. P. 1553-1559.

302. Yamamoto O., Matsunaga Y, Haga N., Itoh Z. Vagavagal inhibition of motilin-indused phase III contractions by antral acidification in dog stomach // Am. J. Physiol. 1994. V. 267, № 1. P. G129-G134.

303. Yong D.G., GengB.Q., Gu G.G., Zhong F.M., Yu W.H. Anti-ulcereffect of anisodamine in rats I I Chung. Kuo. Yao. Li. Hsuen. Pao. 1991. V. 12, №6. P. 522-525.

304. Zhang J.F., Zheng F. The role of paraventricular nucleus of hypothalamus in stress-ulcer formation in rats // Brain Res. 1997. V. 761. № 2. P. 203-209.