Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кардиопротекторное действие семакса при ишемии и ишемии-реперфузии миокарда у крыс

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Кардиопротекторное действие семакса при ишемии и ишемии-реперфузии миокарда у крыс"

На правах рукописи

БЕРДАЛИН Александр Берикович

КАРДИОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ СЕМАКСА ПРИ ИШЕМИИ И ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ МИОКАРДА У КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

^•пр ісї;

Москва - 2012

005019845

Работа выполнена на базе факультета фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова и ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Буравков Сергей Валентинович кандидат биологических наук, доцент Гаврилова Светлана Анатольевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России Яцковский Александр Никодимович

Доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной физиологии медицинского факультета ГФБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Северин Александр Евгеньевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации -Институт медико-биологических проблем РАН

Защита состоится 26 апреля 2012 года в 14 ч. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 001.004.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН. Автореферат разослан 23 марта 2012 года.

Ученый секретарь МИХАЙЛОВА

диссертационного совета Лилия Петровна

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

С инфарктом миокарда связана значительная доля смертности и инвалидности от заболеваний сердечно-сосудистой системы (Тепляков А.Т., 2003; Лазарева Е.А., 2006). Наиболее эффективным способом восстановления баланса между доставкой и потребностью миокарда в кислороде, с целью ограничения размера зоны некроза при инфаркте миокарда, является быстрая реканализация коронарной артерии и реперфузия миокарда при помощи тромболитической терапии или коронарной ангиопластики со стентированием (Basso С, 2006). Несмотря на очевидные положительные эффекты реперфузии, она сама может вызывать патологические изменения, которые объединяют в термине «реперфузионное повреждение» (Braunwald Е, 1985; KlonerR, 1993; Maxwell SRJ, 1997).

Это обуславливает актуальность поиска новых кардиопротекторных препаратов, эффективных и при ишемии с последующей реперфузией. В последнее время большое внимание уделяется производным естественных пептидных систем, в частности, меланокортинам, поскольку такие препараты имеют мало побочных эффектов и потенциально обладают нейро- и кардиопротективными свойствами.

Пептидный препарат Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) -искусственный меланокортин, аналог фрагмента 4-7 адренокортикотропного гормона (АКТГ) - Met-Glu-His-Phe, со стабилизирующим фрагментом Pro-Gly-Pro, не обладающий гормональной активностью. В исследованиях на животных показаны ноотропная (пептид улучшает обучаемость животных), антидепрессантная, анксиолитическая и анальгетическая активности Семакса (Пономарева-Степная М.А., 1984; Ашмарин И.П., 1997; Левицкая Н.Г., 2007), что послужило основанием для клинических исследований и последующей рекомендации применения 0,1 % раствора Семакса в клинике в качестве препарата, повышающего эффективность умственного труда в сложных условиях, а также при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза.

Известно нейропротекторное действие Семакса, он широко используется в клинической практике в терапии ишемического

инсульта (Гусев Е.И., 1999). Показано, что он снижает выброс про-(IL-lß, IL-8) и повышает, - противовоспалительных (IL-10 и TGF-ßl) цитокинов, ослабляя, тем самым, интенсивность воспалительной реакции (Скворцова В.И.,1999; Гусев Е.И., 2001). Пептид может снижать выраженность окислительного стресса: показано, что Семакс in vitro подавляет дыхательный взрыв нейтрофилов человека (Асташкин Е.И., 2001). Применение Семакса (в суммарной дозе 0,3 мг/кг внутрибрюшинно через 15 мин и 2 часа после начала эпизода ишемии) полностью предупреждало усиление генерации оксида азота в коре мозга крыс через 4 часа после двусторонней окклюзии общих сонных артерий, при этом наблюдалось значительное ослабление неврологической симптоматики (Фадюкова O.E., 2001). Описанные эффекты препарата дают основания предполагать его кардиопротекторное действие, учитывая общность патофизиологических механизмов гибели клеток при ишемическом повреждении мозга и сердца, однако влияние пептида на состояние миокарда после инфаркта изучено мало.

В предыдущих работах нашей лаборатории было показано наличие кардиопротекторного эффекта у пептида Семакс, примененного в острую стадию инфаркта миокарда (Гаврилова С.А., 2008). Данная работа посвящена исследованию механизмов кардиопротекторного действия пептидного препарата Семакс.

Цель исследования

Изучить кардиопротекторное действие пептида Семакс в экспериментальных моделях инфаркта миокарда у крыс и оценить возможность его влияния через симпатический отдел вегетативной нервной системы.

Задачи исследования

1. Оценить размер зоны поражения и рубца на 3-й и на 28-е сутки экспериментального инфаркта миокарда при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии, определить влияние Семакса на эти параметры

2. Определить влияние Семакса на светооптическом уровне на степень повреждения кардиомиоцитов, частоту контрактур, выраженность кровоизлияний и количество немиоцитарных

клеток, особенно в неишемизированном миокарде, через 3 суток после ишемии и ишемии-реперфузии

3. Изучить изменения ультраструктуры кардиомиоцитов под действием Семакса через 3 суток после моделирования инфаркта миокарда

4. Оценить влияние Семакса на уровень апоптоза кардиомиоцитов у крыс на 3 сутки инфаркта при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии миокарда

5. Изучить влияние Семакса на гемодинамику у крыс в покое и при фармакологической стимуляции сердца рг адреномиметиком добутамином на 3 сутки инфаркта миокарда при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии

6. Оценить динамику изменений концентрации катехоламинов плазмы крови под действием Семакса на 1-е и на 28-е сутки развития экспериментального инфаркта миокарда

7. Исследовать изменение плотности адренэргических сплетений в сердце крыс по флуоресценции комплекса катехоламинов с глиоксиловой кислотой в отставленный постинфарктный период (28 суток) и влияние Семакса на этот показатель.

Научная новизна исследования

На основании экспериментального морфологического, морфометрического, функционального исследования установлено, что при развитии инфаркта миокарда у крыс пептидный препарат Семакс оказывает кардиопротекторное действие. В работе показано уменьшение количества межмитохондриальных контактов межмиофибриллярного пула митохондрий кардиомиоцитов на 3 сутки инфаркта миокарда в результате введения Семакса в острую стадию заболевания. Установлено, что Семакс уменьшает уровень апоптоза кардиомиоцитов в постинфарктном периоде в моделях необратимой ишемии и ишемии-реперфузии.

На модели ишемии-реперфузии показано увеличение плотности симпатической иннервации миокарда после инфаркта в области межжелудочковой перегородки и уменьшение ее под действием препарата. На 1 сутки инфаркта миокарда в модели ишемии-реперфузии обнаружено снижение повышенной концентрации норадреналина в плазме крови крыс на фоне введения пептида Семакс.

На модели необратимой ишемии через 3 суток после окклюзии коронарной артерии показано усиление Pi-опосредованного ответа на инфузию добутамина, уменьшение ЧСС и конечнодиастолического давления в левом желудочке после введения Семакса.

Научно-практическая значимость

Полученные экспериментальные данные о кардиопротекторном эффекте Семакса открывают перспективу расширения области применения данного препарата в качестве кардиопротекторного средства в острую фазу инфаркта миокарда для улучшения функционального состояния сердечной мышцы и уменьшения апоптотической гибели кардиомиоцитов в постинфарктном периоде. Экспериментальные и методические подходы к оценке патофизиологических и морфологических особенностей влияния Семакса на динамику развития инфаркта миокарда могут применяться для оценки эффективности других кардиопротекторных средств.

Внедрение результатов исследования

Результаты данной работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на Кафедре физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты диссертационной работы были доложены на XV межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009); XVI межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010); научной конференции "Физиологическая активность регуляторных пептидов" (Москва, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); заседании кафедры физиологии и общей патологии факультета Фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова VII (Москва, 2010); съезде Казахского Физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной - основа здоровья и долголетия», посвященном 100-летию академиков АН КазССР Н.У.

Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева (Алматы, 2011); Российском Национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2011); на V Всероссийской школе с международным участием «Физиология кровообращения» (Москва, 2012).

Публикации по теме диссертации

Основные положения диссертации отражены в 10 публикациях, из них - 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 173 страницах. Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Список цитированной литературы включает 33 работы на русском языке и 193 на иностранных языках (всего 226 источников). Работа проиллюстрирована 40 рисунками и 7 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на 82 половозрелых самцах белых беспородных крыс массой 350 - 450 г.

Структура исследования. В исследовании использовали две экспериментальные модели инфаркта миокарда: модель необратимой ишемии и модель обратимой ишемии миокарда с последующей реперфузией. Были проведены 3 серии экспериментов: (1) с взятием материала миокарда через 3 суток от начала ишемии, для световой и электронной микроскопии, иммуногистохимического определения активной каспазы-3 и TUNEL-анализа (п=15); (2) эксперимент in vivo с оценкой функционального состояния сердечно-сосудистой системы путем измерения параметров системной гемодинамики и сократимости миокарда в покое и на фоне инфузии рг адреномиметика добутамина, а также с оценкой размера некротической зоны на 3 сутки инфаркта миокарда (п=40); (3) с определением уровня катехоламинов плазмы крови (взятие образцов - 24 часа и 28 суток после инфаркта), взятием материала для гистохимической оценки плотности симпатической иннервации в

отставленный постинфарктный период и определения массы рубца (через 28 суток после инфаркта; п=27).

Исследовали 5 экспериментальных групп: интактный контроль (К), необратимая ишемия (И), необратимая ишемия с введением Семакса (ИС), ишемия-реперфузия (ИР), ишемия-реперфузия с введением Семакса (ИРС).

Семакс вводили животным внутрибрюшинно в дозе 150 мкг/кг. В день операции Семакс вводили два раза - через 15 минут и 2 часа 15 минут от начала ишемии. В 3-й серии экспериментов Семакс вводили в день операции по вышеописанной схеме, и один раз в последующие 2, 3, 4, 5, 6 и 7-е сутки после операции. Схема и доза введения пептида были выбраны на основании экспериментальных и клинических исследований, показавших эффективность дробного и раннего применения данного препарата в условиях ишемии мозга (Яковлева Е.В., 1999; Гусев Е.И., 2001; Фадюкова O.E., 2001). Контрольным животным вводили стерильный физиологический раствор по той же схеме и в том же объеме, что и Семакс.

Экспериментальные модели. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977. На проведение экспериментов было получено разрешение комиссии МГУ имени М.В. Ломоносова по биоэтике. Инфаркт миокарда моделировали под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг, внутрибрюшинно) путем необратимой окклюзии левой коронарной артерии на 3-4 мм апикальнее ушка левого предсердия, или ишемией на 2,5 часа с последующей реперфузией. В конце эксперимента животным проводили эвтаназию передозировкой хлоралгидрата.

Микроскопические методы. Для световой, электронной микроскопии и определения уровня апоптоза материал забирали из 3 участков миокарда левого желудочка: ишемизированной области (передней стенки левого желудочка - ПС) и зон условно интактного миокарда: (верхней части боковой стенки левого желудочка - БС и межжелудочковой перегородки - МП). Плотность симпатической иннервации через 28 суток после инфаркта миокарда оценивали в межжелудочковой перегородке.

Для световой микроскопии фрагменты ткани миокарда фиксировали в течение 12 часов в 10%-ном нейтральном формалине, обезвоживали по стандартной методике и заключали в парафин.

Общую морфологию миокарда оценивали на срезах толщиной 5 мкм окрашенных гематоксилином-эозином. Подсчет площади поперечного сечения кардиомиоцитов проводили при помощи программы SigmaScan 5. Уровень апоптоза кардиомиоцитов оценивали иммуногистохимически на парафиновых срезах методом TUNEL анализа (набор ApopTag фирмы CHEMICON) и окрашивания активной каспазы-3 (первичные антикрысиные кроличьи моноклональные антитела фирмы Abeam; вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой). Результаты представлены в виде апоптотического индекса (АИ) - количества апоптотических ядер на 100 ядер кардиомиоцитов.

Для электронной микроскопии образцы ткани миокарда фиксировали в 4% глутаровом альдегиде на 0.1 М фосфатном буфере, дофиксировали в 1% растворе 0s04, контрастировали 2%-ным уранилацетатом на 70% этаноле, обезвоживали по общепринятой методике и заключали в эпон-аралдитную смолу. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу и исследовали на электронном микроскопе JEM 100СХ (Япония). Помимо описания ультраструктурных характеристик кардиомиоцитов проводили количественный анализ числа межмитохондриальных контактов (ММК) по пулам митохондрий (субсарколеммальные, межмиофибриллярные, околоядерные) и представляли как число ММК на 100 митохондрий. Также оценивали относительные площади, занимаемые на срезах миофибриллами и митохондриями при помощи точечной сетки по стандартной методике Г.Г.Автандилова (1973).

Для визуализации симпатических нервных волокон использовали метод, основанный на взаимодействии катехоламинов с глиоксиловой кислотой и последующей флуоресценцией этого комплекса (Axelsson S, 1972; Bjórklund А, 1972; Швалев В.Н., 2001). Образцы исследовали при помощи люминесцентного микроскопа Axiovert 200. Длина волны возбуждающего света - 380-440 нм, исследуемой люминесценции - 440-480 нм. Плотность симпатической иннервации оценивали по количеству пересечений симпатических нервов с узлами решетки, наложенной на изображение. Данные представляли в виде числа пересечений на 100 узлов решетки.

Оценка объема поражения. Через 3 суток после инфаркта объем поражения оценивали на срезах толщиной 1-1,5 мм, окрашенных 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТХ). Реакцию останавливали 10% формалином, срезы помещали между предметными стеклами и сканировали с двух сторон. Размер зоны некроза оценивали планиметрически с помощью программы AUC, как процент занятый зоной поражения от общей площади срезов левого желудочка. На 28 сутки инфаркта миокарда объем поражения оценивали по отношению массы рубцовой ткани к общей массе левого желудочка.

Проведение эксперимента in vivo по оценке функционального состояния сердечно-сосудистой системы. Эксперимент проводили на наркотизированных животных (тиопентал натрия, 75 мг/кг в/бр) с трахеотомией в остром эксперименте; в конце опыта животных подвергали эвтаназии и использовали для оценки размера зоны поражения на 3 сутки инфаркта. Системное артериальное давление регистрировали в брюшной аорте при помощи катетера имплантированного через левую бедренную артерию. Для измерения давления в левом желудочке сердца в полость желудочка вводили миниатюрный датчик давления Miliar. Обработку сигнала осуществляли с помощью многоканальной системы ТАМ-А и программного обеспечения Haemodyn (Hugo Sachs Elektronik). Рассчитывали: по кривой системного артериального давления -среднее артериальное давление (АДср.); по кривой давления в левом желудочке - величину среднего (АДЛЖср.), систолического (АДЛЖсист.), диастолического (АДЛЖдиас.) и конечно-диастолического давления (АДЛЖкдд.), а также индекс сократимости (+dP/dtmax) и индекс расслабления (-dP/dtmax) миокарда левого желудочка и частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Гемодинамические параметры оценивали в покое и при фармакологической нагрузке добутамином - агонистом ßr адренорецепторов, в дозе 1; 2; 3; 4,5 и 6 мкг/кг*мин. Проводилась инфузия в накопительном режиме в течение 3-х минут для каждой из пяти доз вводимого препарата.

Определение уровня катехоламинов в плазме крови. Образцы плазмы крови забирали из яремной вены через 24 часа и через 28 суток после окклюзии коронарной артерии. Уровень катехоламинов определяли при помощи высокоэффективной

жидкостной хроматографии в лаборатории нейрохимической фармакологии ФГБУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. Оценивали концентрацию ДОФА (3,4 - диоксифенилаланин), норадреналина, адреналина, дофамина, а также ДОФУК (3,4-диоксифенилуксусная кислота), - одного из основных метаболитов катехоламинов.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 6.0. Данные представлены на диаграммах как средняя ± доверительный интервал (ошибка средней *2), в таблицах как средняя ± ошибка средней. Значимость различий между независимыми выборками оценивали при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни, между зависимыми выборками при помощи непараметрического критерия Вилкоксона. Критический уровень значимости принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Размер зоны поражения на 3 сутки инфаркта миокарда и масса рубца на 28 сутки. На 3 сутки после операции зона инфаркта при необратимой ишемии составила 18% и была достоверно больше, чем при ишемии-реперфузии (12,7%). При этом Семакс не влиял на размер зоны некроза в обеих моделях (19,1 и 13,2% соответственно). Масса рубца на 28 сутки инфаркта миокарда, отнесенная к общей массе левого желудочка, статистически значимо не изменялась при введении Семакса как при необратимой ишемии, так и при ишемии-реперфузии, оставаясь на уровне 17-18%. Группы без введения препарата также не отличались между собой.

Уменьшение зоны некроза при реперфузии согласуется с ранними данными нашей лаборатории об обратимости повреждения миокарда через 2,5 часа после окклюзии коронарной артерии (Гаврилова С.А., 2008). Отсутствие влияния реперфузии на массу рубца на 28 сутки после инфаркта вероятно связано с большим содержанием мышечной ткани в рубце при реперфузии. Семакс на всех сроках не повлиял на размер зоны поражения. Известно, что воспалительная реакция - один из основных факторов, ответственных за расширение зоны некроза после инфаркта. Это подтверждается эффективностью противовоспалительной терапии, которая уменьшает размер зоны некроза миокарда при инфаркте (Hansen P.R.,

1995; Вогтт Я.Р., 2005). Поэтому отсутствие влияния пептида Семакс на размер зоны поражения может быть связано с малой противовоспалительной активностью данного препарата.

Морфология миокарда крысы на светооптическом уровне после экспериментального инфаркта. Ранжировка основных качественных признаков по выраженности с последующей полуколичественной оценкой учитывала: степень повреждения кардиомиоцитов, количество и размер кровоизлияний, количество немиоцитарных клеток на срезе (на 3 сутки в основном макрофаги и фибробласты) и частота контрактур (полос пересокращения) кардиомиоцитов. Выраженность признака оценивали от «-» (отсутствие признака) до «+++++» (максимальная выраженность признака) для каждой зоны миокарда у каждого животного, затем высчитывали среднюю по группе и округляли ее до целого значения. Результаты приведены в таблице 1. Степень повреждения клеток оценивали по наличию отека цитоплазмы кардиомиоцитов, кариопикноза, атрофии мышечных волокон, миоцитолиза, отсутствию поперечной исчерченности. Выраженность кровоизлияний отражает нарушение проницаемости сосудов в результате воспалительной реакции и ишемического повреждения клеток эндотелия. Степень инфильтрации ткани немиоцитарными клетками (в основном макрофагами, фибробластами, лимфоцитами) отражает выраженность воспалительной реакции. Количество кардиомиоцитов с контрактурным повреждением свидетельствует о наличии кальциевой перегрузки кардиомиоцитов, гиперактивации симпатической нервной системы (Кактурский Л.В., 1986). Характерные изменения морфологии миокарда на светооптическом уровне представлены на рисунке 1.

При необратимой ишемии весь срез передней стенки левого желудочка занимали некротические массы с единичными сохранными кардиомиоцитами. По периферии зоны некроза в грануляционной ткани наблюдали мелкие кровоизлияния. Однако и в условно интактном миокарде были кардиомиоциты с изменением структуры цитоплазмы (миолиз, вакуолизация, атрофия, полосы пересокращения), ядра клеток часто были конденсированы. В неишемизированном миокарде встречались скопления гистиоцитов, фибробластов и лимфоцитов (немиоцитарных клеток). Ишемия-

реперфузия увеличила в зоне риска количество сохранных кардиомиоцитов, но в некротизированной ткани образовались многочисленные лимфогистиоцитарные инфильтраты и обширные кровоизлияния. В условно интактном миокарде реперфузия усиливала выраженность морфологических изменений по сравнению с необратимой ишемией, вероятно, вследствие генерализации воспалительной реакции: кардиомиоциты с нарушенной структурой занимали площади больше поля зрения; наблюдали множество мелких лимфогистиоцитарных инфильтратов. Многие кардиомиоциты в этой зоне несли следы контрактурного повреждения. Введение Семакса при ишемии-реперфузии увеличило сохранность кардиомиоцитов и уменьшило воспалительную инфильтрацию ткани в области межжелудочковой перегородки (рис. 1). Выявленные морфологические изменения подтверждают противовоспалительное действие Семакса, однако ввиду отсутствия влияния на размер зоны некроза, следует сделать заключение о вторичной роли данного эффекта пептида в его кардиопротекторном действии.

Таблица 1. Данные полуколичественной оценки основных параметров морфологии миокарда левого желудочка в контрольной и опытных группах животных. Стрелками указано направление изменения признака при реперфузии. Отличия от групп без препарата указаны жирным шрифтом.

Группа Признак Интактный контроль Необратимая ишемия Ишемия-реперфузия

ПС БС МП ПС БС МП ПС БС МП

Степень повреждения кардиомиоцитов ++++ + ++ ++ ++++ і +++ +++І

Кровоизлияния - - - ++ - - +++1 г " -

Немиоцитарные клетки + + + +++ ++ ++ ++++ "ОТ +++■ "Ч

Контрактуры - - - + + + +++Ц ¡г ++ш +++ тш

Группы с введением Семакса

Степень повреждения кардиомиоцитов ++++ + ++ ++ ++++ +++ ++

Кровоизлияния - - - ++ - - +++ - -

Немиоцитарные клетки + + + +++ ++ ++ ++-н- +++ ++

Контрактуры - - - + + + +++ ++ +++

Рисунок 1. Микроскопическая картина миокарда на 3 сутки экспериментального инфаркта. А - межжелудочковая перегородка, группы интактного контроля, нормальный миокард; Б - передняя стенка левого желудочка при необратимой ишемии, демаркационная зона представлена грануляционной тканью, мелкие кровоизлияния; В - боковая стенка левого желудочка при ишемии-реперфузии, контрактуры кардиомиоцитов; Г -межжелудочковая перегородка при ишемии-реперфузии с введением Семакса, контрактуры. Окраска гематоксилином-эозином, х400.

Морфометрический анализ площадей поперечного сечения кардиомиоцитов не выявил отличий между контрольной и опытными группами. На 3 сутки инфаркта морфологические признаки ремоделирования миокарда не выявлялись, в то же время явления отека, наблюдаемые через 2,5 часа после развития инфаркта (Голубева A.B., 2006), исчезали или были незначительными.

Морфологический анализ ультраструктуры

кардиомиоцитов крыс после инфаркта. При электронной микроскопии в области передней стенки левого желудочка у крыс на 3 сутки инфаркта миокарда в обеих моделях формируется зона некроза кардиомиоцитов: детрит, состоящий из остатков миофибрилл, мембранных структур, полуразрушенных митохондрий

и гомогенных масс. Наблюдались макрофаги, фибробласты, при ишемии-реперфузии - эритроциты. В условно интактном миокарде в обеих моделях также выявлялся ряд ультраструктурных изменений: отек перинуклеарного и субсарколеммарного пространств, некоторое расширение саркоплазматического ретикулума и Т-системы кардиомиоцитов, изменение структуры саркомеров (непараллельный ход волокон, зоны саркомера определяются плохо). Отмечалось значительное число конденсированных или набухших митохондрий. Встречались кардиомиоциты с усиленной конденсацией хроматина и складчатым контуром ядра, - начальными признаками апоптоза. Эффект Семакса проявлялся большей сохранностью сократительного аппарата кардиомиоцитов условно интактного миокарда, меньшей выраженностью деформации Z-дисков (рис. 2).

На 3 сутки после операции не было выявлено изменений относительных площадей митохондрий и миофибрилл во всех экспериментальных группах; количество ММК у крыс с инфарктом также статистически значимо не изменялось, по сравнению с интактными животными. У животных, получавших Семакс, выявлена тенденция к снижению количества ММК в межмиофибриллярном пуле митохондрий. При сравнении количества ММК в группе необратимой ишемии и ишемии с Семаксом в области боковой стенки левого желудочка и группы ишемии-реперфузии с препаратом и без него в межжелудочковой перегородке изменения были статистически значимыми.

Межмитохондриальные контакты обеспечивают единство митохондриома, распределение электрической разности потенциалов между митохондриями, поставку энергии для синхронного сокращения всех саркомеров кардиомиоцита (Бакеева JI.E., 1982; Амченкова A.A., 1986). При увеличении нагрузки на миокард количество ММК увеличивается, а при уменьшении энергетической потребности кардиомиоцитов снижается (Проценко Д.Д., 1996). Наблюдаемое снижение количества ММК в межмиофибриллярном пуле митохондрий при введении Семакса, возможно, связано с уменьшением энергетической потребности миокарда вследствие ограничения активности симпатической нервной системы, что согласуется с другими нашими данными.

■■*? ' ТЯЯ ам

и» иоигу«с щщшлЧт * ш

' /

Яг

БМН

МФ

м

Щ Ш

жк

ш т

Рисунок 2. Ультраструктура миокарда крыс на 3 сутки экспериментального инфаркта. А - передняя стенка левого желудочка при необратимой ишемии, деструкция внутриклеточных структур; Б - боковая стенка левого желудочка при необратимой ишемии, повреждение митохондрий; В - межжелудочковая перегородка при необратимой ишемии с введением Семакса, поврежденные митохондрии околоядерного пула. Длина маркерной линии - 1 мкм. Я - ядро, М - митохондрия, МФ - миофибриллы, ММК - межмитохондральные контакты.

Влияние Семакса на уровень апоптоза кардиомиоцитов крыс при инфаркте в моделях ишемии и ишемии-реперфузии.

ТиЫЕЬ-анализ. У крыс контрольной группы по результатам Т1ЛЧЕЬ-анализа апоптотический индекс во всех областях миокарда составлял 0,15-0,20%, что соответствует литературным данным (Мегсагк^1и в., 2008). Необратимая ишемия и ишемия-реперфузия приводили к увеличению апоптотического индекса в зоне развития инфаркта в 37 и 42 раза соответственно (рис. 3). В условно интактном миокарде (БС и МП) количество ТТЖЕЬ-позитивных клеток также было больше такового в контрольной группе в 13 и 7 раз при необратимой ишемии и в 7 и 14 раз при ишемии-реперфузии соответственно (рис.3). Семакс, примененный в острую стадию развития инфаркта миокарда, достоверно снижал уровень апоптоза в

6,2 и 4 раза для ПС, БС и МП соответственно в условиях необратимой ишемии и в 6,2 и 8 раз в условиях ишемии-реперфузии.

При иммуногистохимическом выявлении активной каспазы-3 были получены сходные с Т1ЛЧЕЬ-анализом результаты. В интактном контроле апоптотический индекс составил 0,47-1,11%. При необратимой ишемии и ишемии-реперфузии в области передней стенки апоптотический индекс повысился в 2-3 раза; в области условно интактного миокарда в 1,5-2 раза. Семакс способствовал снижению апоптотического индекса примерно в 1,5 раза.

Рисунок 3. Уровень апоптотического индекса по результатам ТЦЫЕЬ-анализа. А - группы с необратимой ишемией; Б - группы с ишемией-реперфузией; данные представлены в виде средней ± доверительный интервал

(ошибка средней * 2). * -статистически значимые

отличия от группы интактного контроля; # - статистически значимые отличия от группы с препаратом (р<0,05).

пс 6с МП

К 3 суткам зона некроза уже сформирована и гибель кардиомиоцитов путем апоптоза, как в зоне риска, так и в условно интактном миокарде, связана с повышенной продукцией активных форм кислорода и провоспалительных факторов (Hori М., 2008). Повышенние активности симпатической нервной системы также может через ß]-опосредованную стимуляцию приводить к апоптозу кардиомиоцитов вследствие Са2+-перегрузки (Shizukuda Y., 1998; Osadchii O.E., 2007). Цитопротективный эффект Семакса можно объяснить как противовоспалительным действием препарата, так и снижением активности симпатической нервной системы.

?ю Г 9 i 8 [ 7

; e

\ 5 )

! 4

; з ! 2 \ 1 : о

¡10

ш Я х

5 S

S

*

0

01 т

S h о h С О

5 4 3 2

1 -I о 4

бс

Уменьшение апоптоза в условно интактном миокарде вносит существенный вклад в повышение функциональных возможностей миокарда в постинфарктном периоде (Гаврилова С.А., 2008).

Изменение гемодинамических параметров в покое и на фоне фармакологической Р1-стимуляции на 3 сутки инфаркта миокарда при введении Семакса в острую стадию. В покое у наркотизированных крыс в моделях необратимой ишемии и ишемии-реперфузии наблюдали статистически значимое уменьшение уровня среднего АД на 23 и 15% соответственно, систолического давления в левом желудочке на 23 и 13%, максимальной скорости увеличения (на 36 и 30%) и уменьшения давления в левом желудочке (на 58 и 56%); увеличение конечнодиастолического давления в левом желудочке в 3 и 2,5 раза соответственно, как следствие гибели части кардиомиоцитов и уменьшения сократительных возможностей постинфарктного сердца. Применение Семакса статистически значимо уменьшало уровень ЧСС на 26% при необратимой ишемии и на 21% при ишемии-реперфузии, конечнодиастолического давления в левом желудочке на 30 и 23% соответственно, по сравнению с группами без препарата. Кроме того, в группе ишемии-реперфузии происходило уменьшение максимальной скорости увеличения и уменьшения давления в левом желудочке на 11 и 17% соответственно (таблица 2).

Прямая стимуляция работы сердца агонистом рг адренорецепторов добутамином в возрастающих дозах приводила к сходной динамике изменений в группах с необратимой ишемией и ишемией-реперфузией. Небольшая амплитуда изменений АД позволяет говорить о преимущественном влиянии препарата на сердечную мышцу. При внутривенной инфузии добутамина наблюдали закономерное нарастание ЧСС с увеличением дозы препарата. Максимальный прирост ЧСС в группах с введением Семакса составил 23,3 и 25,4% (для необратимой ишемии и ишемии-реперфузии соответственно) по сравнению с фоновым уровнем при инфузии добутамина в дозе 6 мкг/кг*мин, что было статистически значимо выше, чем у интактных животных (13,7%) и животных из группы без введения Семакса (11,1 и 12,3% для необратимой ишемии и ишемии-реперфузии соответственно) (рис. 4).

Таблица 2. Значения регистрируемых фоновых параметров гемодинамики на 3 сутки развития инфаркта миокарда и у интактных животных; данные

представлены в виде средней ± ошибка средней; « - статистически значимое уменьшение/увеличение параметра по сравнению с группой

интактного контроля (р<0,05); 'О' - статистически значимое уменьшение параметра по сравнению с группой без препарата (р<0,05).

Параметр Иитактные Ишемия-реперфузия Ишемия-реперфузия + Семакс

АДср., мм рт.ст. 131,5±3,0 111,7±4,2 1 97,8±4,8 =

ЧСС, уд/мин 363,5±13,8 327,3±12,4 = 257,4±6,1 ii

АДЛЖср., мм рт.ст. 91,3+2,6 82,1 ±4,0 = 72,0±4,2 =

АДЛЖсист., мм рт.ст. 163,5±3,0 141,1±4,9 1 126,0±5,4 =

АДЛЖдиас., мм рт.ст. 3,7±0,4 11,3±1,5 t 6,1±1,0 U

АДЛЖкдд., мм рт.ст. 9,0±0,5 21,8±1,3 t 17,1±1,1 11

+dP/dt max, мм рт.ст./с 10660,9±422,2 7503,8±218,9 I 6658,1 ±242,1 11

-dP/dt max, мм рт.ст./с 12290,2±783,9 5446,2±159,1 1 4515,4±182,5 11

Парам Иитактные Необратимая ишемия Необратимая ишемия + Семакс

АДср., мм рт.ст. 131,5±3,0 102,3+4,6 I 107,6±1,6 =

ЧСС, уд/мин 363,5±13,8 352,3±19,8 = 260,2±5,1 i}

АДЛЖср., мм рт.ст. 91,3±2,6 79,4±4,7 = 77,0±2,8 =

АДЛЖсист., мм рт.ст. 163,5±3,0 126,8±5,7 1 130,0+3,9 =

АДЛЖдиас., мм рт.ст. 3,7±0,4 15,7±2,1 t 7,9±1,1 11

АДЛЖкдд., мм рт.ст. 9,0±0,5 26,7±0,9 t 18,9±0,9

+dP/dt max, мм рт.ст./с 10660,9±422,2 6814,8±178,1 1 6722,7±127,4 =

-dP/dt max, мм рт.ст./с 12290,2±783,9 5222,6±211,7 1 5414,4±188,7 =

Максимальная скорость увеличения давления в левом желудочке (+dP/dt шах) у здоровых животных (интактный контроль) на максимальной дозе добутамина (6 мкг/кг*мин) возросла практически в 2 раза по сравнению с фоновым значением. Инфарктные крысы без введения Семакса демонстрировали вдвое меньший прирост сократимости миокарда в ответ на стимуляцию ßr рецепторов. Применение Семакса в острую стадию инфаркта приводило к усилению прироста максимальной скорости увеличения давления по сравнению с группами без препарата (статистически значимо в группах необратимой ишемии), однако прирост не достигал уровня, наблюдаемого у интактных животных (рис. 4).

Уменьшение ЧСС и конечнодиастолического давления в левом желудочке в кардиологической практике считается важным признаком уменьшения нагрузки на миокард. По своему эффекту Семакс в этом плане напоминает блокаторы ß-адренорецепторов, что подтверждает вероятное влияние пептида на активность симпатической нервной системы (ESC expert consensus document, 2004; Osadchii O.E., 2007). Некоторое снижение скорости сокращения и расслабления миокарда, вероятно, вторично и может быть связано с уменьшением ЧСС под действием Семакса. Усиление реакции миокарда на добутамин, особенно заметное по изменению ЧСС и скорости сокращения миокарда, говорит о благоприятном влиянии пептида Семакс на течение постинфарктного периода. Скорее всего, данный эффект связан с повышением чувствительности бета-адренорецепторов под действием Семакса. Известно, что в постинфарктном периоде развивается десенситизация ßr адренорецепторов и снижается их количество из-за высокой активности симпатической нервной системы (Bristow MR, 1982; Gu Х.Н., 1998; Kompa A.R., 1999). При подавлении повышенной активности симпатической нервной системы чувствительность адренорецепторов восстанавливается. Наши экспериментальные данные соответствуют указанным выводам. Таким образом, гемодинамические данные подтверждают гипотезу о кардиопротекторном эффекте Семакса через ограничение влияния симпатической нервной системы на миокард.

Рисунок 4. Изменение гемодинамики по сравнению с фоновым уровнем на 3 сутки инфаркта миокарда в ответ на внутривенную инфузию

максимальной дозы

добутамина (6 мкг/кг*мин). А ЧСС; Б -максимальная скорость увеличения давления в левом желудочке; данные представлены в виде средней ± доверительный интервал (ошибка средней*2); * статистически значимые отличия от группы интактного контроля, # - статистически значимые отличия от группы без препарата.

Влияние пептидного препарата Семакс на динамику концентрации катехоламинов после инфаркта миокарда при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии. В крови крыс через 24 часа после начала необратимой ишемии наблюдали статистически значимое увеличение концентрации ДОФА в 1,5 раза, норадреналина и адреналина в 2 раза по сравнению с фоновым уровнем. На 28 сутки инфаркта миокарда концентрации вышеперечисленных катехоламинов не отличались от фоновых. Уровень дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) достоверно не изменялся, однако к 28 суткам наблюдалась тенденция к увеличению уровня ДОФУК (рис. 5А). Через 24 часа после ишемии-реперфузии наблюдали статистически значимое повышение уровня норадреналина в 2 раза, концентрация остальных катехоламинов не изменялась. К 28 суткам уровень норадреналина возвращался к фоновому, но наблюдалось достоверное увеличение концентрации ДОФА и ДОФУК в 1,5 раза. В модели ишемии-реперфузии Семакс приводил к достоверному снижению уровня норадреналина более чем в 2 раза по сравнению с группой без препарата. По другим

катехоламинам статистически значимых отличий обнаружено не было (рис. 5Б).

А

3000 -1 - -| нфон Рисунок 5. Уровни

2500 | й а 1-е сутки катехоламинов в плазме крови

2000 I---------028-е сутки _ _ ] ^ через сутки и 28 суток

после экспериментального инфаркта миокарда. А -динамика уровня

катехоламинов при

необратимой ишемии; Б -влияние Семакса на динамику катехоламинов при ишемии-реперфузии. Данные

представлены в виде средней ± доверительный интервал (ошибка средней*2),

пикограмм/мл. * статистически значимые отличия уровня

катехоламинов от фонового уровня катехоламинов у интактных крыс, # статистически значимые отличия уровня

катехоламинов от группы без введения семакса (р<0,05).

Наблюдаемое увеличение уровня ДОФА, норадреналина и адреналина в плазме крови крыс через 24 часа после развития инфаркта миокарда соответствует интенсивной стресс-реакции, в частности, на болевой синдром. Полученные результаты согласуются с данными литературы (Кауе D.M., 1994; Rundqvist В., 1997; Li W., 2004). На 28 сутки уровень катехоламинов снижался, хотя и оставался несколько выше (статистически незначимо) фонового уровня. Это можно объяснить активацией ферментных систем, участвующих в метаболизме катехоламинов, на что указывает повышение в этот срок уровня ДОФУК - одного из основных метаболитов катехоламинов. Через 24 часа после инфаркта миокарда Семакс приводил к уменьшению уровня норадреналина в плазме крови, статистически значимому в группе ишемии-реперфузии. Это согласуется с

полученными нами данными о влиянии препарата на активность симпатической нервной системы.

Плотность флуоресценции симпатических нервных окончаний миокарда в отставленные сроки после экспериментального инфаркта миокарда у крыс. В интактном контроле средняя относительная объемная плотность симпатических нервных волокон, измеренная по флуоресценции катехоламинов при конденсации с глиоксиловой кислотой, составила 1,94%. В модели необратимой ишемии инфаркт миокарда не приводил к увеличению относительной объемной плотности симпатических нервов. Семакс также не влиял на этот показатель. В группе ишемии-реперфузии относительная объемная плотность составила 3,34% и была достоверно выше контрольной (р=0,006). Введение Семакса приводило к статистически значимому (р=0,01) снижению плотности симпатической иннервации до 2,02 % (рисунок 6). Таким образом, в модели ишемии-реперфузии инфаркт приводит к увеличению плотности флуоресценции симпатических нервов в миокарде, а введение Семакса снижает этот показатель практически до интактного уровня. Мы предполагаем, что в данном случае имеет место именно изменение плотности иннервации миокарда, а не усиление/ослабление синтеза катехоламинов или включение «молчавших» симпатических нервов. Наличие в ткани миокарда функционально неактивных аксонов постганглионарных нейронов симпатической системы не показано, а чувствительность метода вполне достаточна для визуализации всех нервных терминалей.

4

к

I 3,5 I

а ,

<" Ч

(О П о ¿2,5

§ § 2 £ Ь

5 31.5

о

1

0,5 0 -

I

як

а ир

а и рс

Рисунок 6. Плотность

флуоресцирующих симпатических нервов миокарда при ишемии-реперфузии. Данные представлены в виде средней ± доверительный интервал (ошибка средней * 2). * -статистически значимые отличия (р<0.05).

Семакс приводил к достоверному уменьшению плотности симпатической иннервации в модели ишемии-реперфузии. То есть препарат каким-то образом уменьшал действие факторов

усиливающих рост нервов после инфаркта. С другой стороны, уменьшение плотности симпатической иннервации может само по себе быть причиной снижения активности этого отдела вегетативной нервной системы в постинфарктном периоде.

Заключение

Таким образом, гипотеза о кардиопротекторном влиянии Семакса посредством ограничения гиперактивации симпатической нервной системы находит подтверждение в результатах нашего эксперимента: уменьшение уровня апоптоза кардиомиоцитов; снижение ЧСС и конечнодиастолического давления в покое, усиление ответа миокарда на Р)-опосредованную нагрузку добутамином; снижение уровня норадреналина через 24 часа после перевязки коронарной артерии при отсутствии влияния препарата на размер зоны некроза говорит о преимущественном вкладе данного пути в кардиопротекторный эффект Семакса. Это подтверждает и уменьшение количества ММК межмиофибриллярного пула митохондрий, что указывает на уменьшение энергетических потребностей кардиомиоцитов. Полученные нами

экспериментальные данные, свидетельствующие о кардиопротекторном действии Семакса, интересны также тем, что введение препарата в первые сутки развития инфаркта оказывает длительный эффект на состояние сердца, проявляющийся на 3-й, и даже на 28-е сутки заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Семакс, примененный в острую стадию развития инфаркта миокарда, не влияет на размер зоны некроза, измеренный планиметрически по окрашиванию 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом, на 3 сутки и на массу рубца на 28 сутки заболевания как при необратимой ишемии, так и при ишемии-реперфузии.

2. Пептидный препарат Семакс, по данным полуколичественной оценки, уменьшает выраженность повреждения кардиомиоцитов и воспалительную инфильтрацию ткани в неишемизированном миокарде на светооптическом уровне на 3 сутки после инфаркта в модели ишемии-реперфузии.

. Влияние Семакса на 3 сутки после инфаркта в условно интактном миокарде характеризуется ультраструктурно большей сохранностью сократительного аппарата кардиомиоцитов и уменьшением количества межмитохондриальных контактов межмиофибриллярного пула митохондрий.

. По данным TUNEL-анализа и иммуногистохимического окрашивания активной каспазы-3, Семакс уменьшает повышенный после инфаркта апоптотический индекс, как в зоне риска, так и в условно интакном миокарде на 3 сутки развития заболевания.

. Семакс уменьшает ЧСС и конечнодиастолическое давление в левом желудочке, усиливает ßi-опосредованный ино- и хронотропный ответ миокарда на 3 сутки инфаркта при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии по сравнению с группами без введения препарата.

. Через 24 часа после экспериментального инфаркта миокарда в модели ишемии-реперфузии пептидный препарат Семакс снижает повышенную концентрацию норадреналина в плазме крови по сравнению с группой без введения препарата.

. В модели ишемии-реперфузии через 28 суток после экспериментального инфаркта миокарда Семакс уменьшает плотность флуоресценции симпатических нервов межжелудочковой перегородки, измеренную гистохимическим методом конденсации катехоламинов с глиоксиловой кислотой.

. Уменьшение количества межмитохондриальных контактов кардиомиоцитов, снижение уровня апоптоза, уменьшение плотности флуоресценции симпатических нервных волокон в миокарде после инфаркта, благоприятное влияние пептида на гемодинамические параметры, снижение уровня норадреналина в плазме крови при отсутствии влияния препарата на размер зоны поражения свидетельствуют о кардиопротекторном эффекте Семакса посредством ограничения гиперактивации симпатической нервной системы в постинфарктном периоде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бердалин А.Б., Курочкина E.H., Лин Е.Д. Морфологические особенности миокарда в зоне риска и областях, не задетых ишемией, в острую стадию инфаркта миокарда // XV межгородская конференция молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург, 2009. - С. 27.

2. Гаврилова С.А., Голубева A.B., Бердалин А.Б., Фоминых Е.С., Буравков C.B., Бычкова Е.Ю., Кошелев В.Б. Семакс снижает уровень апоптоза в сердце крыс в условиях ишемии-реперфузии // В сб.: Закономерности развития патологических состояний и их коррекция: материалы международной конференции. - Минск, Бизнесофсет, 2009. - С.47-50.

3. Бердалин А.Б., Голубева A.B. Семакс снижает уровень апоптоза кардиомиоцитов при развитии инфаркта миокарда у крыс. // XVI межгородская конференция молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». -Санкт-Петербург, 2010. - С.30-31.

4. Бердалин А.Б., Гаврилова С.А., Голубева A.B., Буравков C.B., Кошелев В.Б. Семакс оказывает кардиопротекторный эффект, уменьшая гибель кардиомиоцитов в условно интактном миокарде после инфаркта // Тезисы докладов научной конференции "Физиологическая активность регуляторных пептидов". - Москва, 2010. - С.24-25.

5. Гаврилова С.А., Голубева A.B., Бердалин А.Б., Фоминых Е.С., Буравков C.B., Кошелев В.Б. Защита сердца от ишемических и реперфузионных повреждений // Тезисы докладов XXI съезда физиологического общества им.И.П.Павлова. -М.-Калуга, 2010.-С.133.

6. Бердалин А.Б., Гаврилова С.А., Голубева A.B., Буравков C.B., Кошелев В.Б. Влияние семакса на морфологию миокарда и уровень апоптоза кардиомиоцитов при развитии инфаркта миокарда у крыс. // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. Сборник научных трудов. - М.,2010. - С. 33-35.

7. Бердалин А.Б., Голубева A.B., Гаврилова С.А., Буравков C.B., Кошелев В.Б. Кардиопротекторный эффект семакса при инфаркте миокарда связан с ограничением активности симпатической нервной системы. // Материалы VII Казахского Физиологического общества с международным участием: «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной -основа здоровья и долголетия», посвященная 100- летию академиков АН КазССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева. - Алматы, 2011. - С. 56-57.

8. Бердалин А.Б., Гаврилова С.А., Голубева A.B., Буравков C.B., Кошелев В.Б. Влияние семакса на апоптотическую гибель кардиомиоцитов крыс при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии. // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. - 2011. - №2. - С. 13-20.

9. Бердалин А.Б., Голубева A.B., Гаврилова С.А., Буравков C.B., Черников В.П., Кошелев В.Б. Влияние семакса на ультраструктуру миокарда крыс при необратимой ишемии и ишемии-реперфузии. // Технологии живых систем. -2011.-т.8,№6.-С. 51-58.

10. Гаврилова С.А., Голубева A.B., Бердалин А.Б., Буравков C.B., Кошелев В.Б. Семакс защищает сердце от реперфузионного повреждения. // Сб. тезисов V Всероссийской школы с международным участием «Физиология кровообращения». - М., 2012. - С. 40-41.

Заказ № 82-а /03/2012 Подписано в печать 22.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru