Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, тирозинкиназ, PI3-киназы и NO-синтаз в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, тирозинкиназ, PI3-киназы и NO-синтаз в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии"

На правах рукописи

Цибулышков Сергей Юрьевич

Роль опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, тирозинкиназ, Р13-киназы и РЮ-синтаз в реализации кардвопротекторного эффекта адаптации к непрерывной пормобарической гипоксии

03.03.01 - физиология 14.03.03 - патологическая физиология

3 О МАЙ 2013

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск -2013 005060046

005060046

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Томский государственный педагогический университет

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биофизики и функциональной диагностики ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава

России Ковалев Игорь Викторович

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры спортивно-оздоровительного туризма, спортивной физиологии и медицины ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский государственный

университет» Дьякова Елена Юрьевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» СО РАМН

Защита состоится «_» ___ 2013 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России по адресу 634050 г. Томск, Московский тракт, д. 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России

Автореферат разослан «_»_2013 г.

доктор биологических наук

Ласукова Татьяна Викторовна

доктор медицинских наук

Рыжкова Дарья Викторовна

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема повышения устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям все еще остается одной из наиболее актуальных проблем современной физиологии, патофизиологии и кардиологии. Это связано с тем, что ишемическая болезнь сердца и, прежде всего, острый инфаркт миокарда (ОИМ) представляют собой одну из основных причин инвалидизации и смертности среди взрослого населения России и экономически развитых стран [Марков В.А. и др., 2011; Чазов Е.И., 2008; Braunwald Е., 2011]. Единственным эффективным методом лечения ОИМ является реканализация инфаркт-связанной коронарной артерии [Марков В.А. и др., 2011; Чазов Е.И., 2008; Braunwald Е., 2011]. К сожалению, необратимые повреждения кардиомиоцитов при ишемии/реперфузии возникают слишком быстро. Так, по данным некоторых авторов [Neckar J. et al., 2003], обширный очаг некроза формируется при 20-минутной экспериментальной коронароокклюзии и последующей реперфузии (3 ч). Между тем, в России среднее время поступления больного с ОИМ в стационар составляет 2,5 - 2,8 ч [Марков В.А. и др., 2011]. В этой ситуации неоценимую помощь в спасении жизни пациентов с ОИМ на догоспитальном этапе могло бы оказать применение препаратов, заметно повышающих устойчивость сердца к действию ишемии/реперфузии. К сожалению, такие лекарственные средства пока не существуют. В создании подобных препаратов существенную помощь могло бы оказать изучение молекулярных механизмов адаптационных феноменов, повышающих устойчивость сердца к ишемии и реперфузии. К таким адаптивным феноменам следует отнести адаптацию к гипоксии.

В 1952 г Г. Селье [Selye Н., 1952] было показано, что адаптация к одному экстремальному воздействию может обеспечивать повышение толерантности организма и к другим экстремальным факторам, феномен получил название «перекрёстный эффект адаптации». Эти данные были подтверждены другими исследователями. Так, например, адаптация к иммобилизационному стрессу обеспечивает повышение устойчивости организма крыс к холоду [Kuroshima A. et al., 1984] и гипоксии [Меерсон Ф.З. и др. 1988]. Адаптация к иммобилизационному стрессу [Меерсон Ф.З. и др., 1988; Meerson F.Z. и Malyshev I.Yu., 1989] или холоду [Барбараш H.A., 1996] повышает толерантность сердца к аритмогенному действию ишемии и реперфузии. Установлено, что адаптация к периодической гипоксии обеспечивает повышение толерантности сердца к действию ишемии и реперфузии [Ding H.L. et al., 2004; Fitzpatrick C.M. et al., 2005; Kolar F. et al., 2005; Neckar J. et al., 2002; 2005]. Установлено, что адаптация крыс к хронической непрерывной нормобарической гипоксии (ХННГ) также оказывает инфаркт-лимитирующий эффект при коронароокклюзии и реперфузии in vivo [Neckar

J. et al., 2003] и повышает устойчивость изолированного сердца к действию глобальной ишемии/реперфузии [Tajima M. et al., 1994].

Адаптация к гипоксии представляет особый интерес для врачей и исследователей, поскольку кардиопротекторный эффект этого воздействия сохраняется несколько дней [Дудко В.А. и Соколов А.А., 2000; Меерсон Ф.З. и Малышев И.Ю., 1993; Меерсон Ф.З. и Пшенникова М.Г., 1988]. Согласно данным С.М. Fitzpatrick и соавторов [Fitzpatrick С.М. et al., 2005], кардиопротекторный эффект хронической гипоксии у новорожденных кроликов может сохраняться в течение 30 дней после последнего сеанса гипоксии, а по данным В. Ostadal и соавт. [Ostadal В. et al„ 1995] защитный эффект гипоксии может сохраняться в течение 4-х месяцев.

Существует определенное сходство между отсроченной фазой ишемического прекондиционирования и феноменом адаптационной устойчивости сердца к ишемии и реперфузии. Планируя это исследование, мы предположили, что молекулярный механизм протекторного эффекта адаптации и механизм положительного эффекта действия отсроченного ишемического прекондиционирования (second window) может быть сходен. Есть данные, которые подтверждают это предположение [Béguin P.C. et al., 2005; Xi L. et al., 2002].

Молекулярный механизм кардиопротекторного и антиаритмического действия ХННГ остается изученным недостаточно. Недавно российские физиологи установили, что антиаритмический эффект периодической гипоксии связан с активацией опиоидных рецепторов [Лишманов Ю.Б. и др., 2003]. Китайская группа исследователей получила данные о том, что активация NO-синтазы в кардиомиоцитах крыс, подвергнутых гипоксии, способствует улучшению сократимости сердца в реперфузионном периоде [Ding H.L. et al., 2004]. Сходные данные были получены другими исследователями [Fitzpatrick С.М. et al., 2005; Xi L. et al., 2002]. Таким образом, установлено, что опиоидные рецепторы, а так же протеинкиназа С и NO-синтаза играют важную роль в кардиопротекторном эффекте прерывистой гипоксии. По всей видимости, они же участвуют в адаптации к ХННГ.

Таким образом, анализ литературных данных позволяет нам предполагать, что механизмы формирования отсроченного ишемического прекондиционирования и механизмы защитного действия хронической непрерывной нормобарической гипоксии могут иметь сходную природу.

Цель исследования: Исследовать роль опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, тирозинкиназ, Р13-киназы и NO-синтаз в реализации кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние хронической непрерывной нормобарической гипоксии на уровень опиоидных пептидов в миокарде и плазме крови у крыс.

2. Исследовать роль ц-, 5- и к -опиоидных рецепторов в механизме формирования повышенной устойчивости миокарда к действию острой коронароокклюзии и реперфузии после воздействия хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

3. Выяснить значение протеинкиназы С в опосредовании кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

4. Изучить роль тирозинкиназ в механизме кардиопротекции при воздействии хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

5. Определить, участвует ли Р13-киназа в кардиопротекторном эффекте хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

6. Исследовать вклад NO-синтаз в кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Научная новизна

Впервые выявлено, что хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия вызывает увеличение содержания эндогенных опиоидных пептидов в миокарде и плазме крови у крыс.

В настоящем исследовании впервые выяснена роль опиоидных рецепторов в устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии у крыс, подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Впервые изучена роль протеинкиназы С, тирозинкиназ, Р13-киназы в кардиопротекторном эффекте хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Впервые исследован вклад индуцибельной NO-синтазы в кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Научно-практическая значимость

Результаты работы расширяют представления о роли опиоидных рецепторов и сопряженных с ними сигнальных путей в реализации повышения устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии.

Основные положения работы могут быть использованы в качестве теоретической основы для прикладных исследований в области создания принципиально новых фармакологических препаратов, обладающих кардиопротекторным действием.

По результатам работы была отправлена заявка на патент. Получена приоритетная справка.

Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В., Цибульников С. Ю., Горбунов A.C. «Средство, увеличивающее устойчивость сердца к ишемическим-реперфузионным повреждениям» от 27.03.2012 №2012111891

Основные положения, выносимые на защиту:

1.В условиях хронической непрерывной нормобарической гипоксии повышается концентрация эндогенных опиоидных пептидов в миокарде и плазме крови у крыс.

2.0пиоидная система является одним из звеньев повышенной устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии в условиях хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

З.Кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии реализуется при участии протеинкиназы С, тирозинкиназ, индуцибельной NO-синтазы.

Апробация работы: Материалы диссертации представлены на конференциях: XIV Всероссийская с международным участием конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» (Томск,

2010); Первая Международная Научно-Практическая конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); 6 Российская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011); Российский национальный конгресс кардиологов. (Москва,

2011); VII Сибирский физиологический съезд (Красноярск, 2012);

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ. Из

них 7 работ в журналах списка ВАКг& материалах международных и российских конференций.

Гранты. 10-04-00288-а РФФИ Сигнальный механизм адаптивного феномена индуцированного опиоидами; 11-04-16115-моб_з_рос Участие в работе VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция»; 11-04-98004-р_сибирь_а Адаптивный феномен, индуцированный опиоидами: рецегггорная природа и сигнальный механизм; 12-04-91152-ГФЕН_а Молекулярные механизмы адаптационного феномена, вызванного хронической гипоксией;

Личный вклад автора. Автором сформулированы цель, задачи исследования и основные положения, выносимые на защиту. Проведены в полном объеме экспериментальные исследования, изучены отечественные и зарубежные источники литературы, посвященные изучению гипоксии. Доля участия в сборе материала - 90%, в обработке материала - 100%, в обобщении и анализе материала 80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 249 источников (51 -отечественный и 198 - иностранных)

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на крысах самцах линии Вистар массой 250300 г.

При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Приказе МЗ СССР за № 755 от 12 августа 1977 г.

Крысы контрольной группы за 25 мин до перевязки коронарной артерии получали 0,2 мл физиологического раствора внутривенно.

Животные подвергались хронической гипоксии, постоянно находясь в гипоксической камере при 12% 02 и нормальном атмосферном давлении на протяжении 21 дня [Neckar J. et all, 2003]. Объем гипоксической камеры составил 1,5 м3, концентрацию 02 поддерживали на уровне 11,75—12,25%, концентрацию С02 поддерживали на уровне 0,03% системой «Био-нова-204G4R1» (НТО Био-нова, Россия, г. Москва). Давление 02 и С02 внутри камеры постоянно контролировали датчиками TCOD-IR и OLC 20 (Oldham, Франция), через блок управления МХ32 (Oldham, Франция).

Животным с ХННГ перед началом ишемии внутривенно вводили один из препаратов, представленных в таблице 1.

Таблица 1

Препараты, использованные в работе_

Налтрексон блокатор всех субтипов опиоидных рецепторов в дозе 5 мг/кг за 25 мин до ишемии [Takemori Е. et at., 1992];

ТГРР(у) блокатор 8-ОР в дозе 0,5 мг/кг за 25 мин до коронарооккпюзии [Лишманов Ю.Б. и др., 2003J;

BNTX блокатор 8,-ОР в дозе 0,7 мг/кг за 25 минут до коронарооккпюзии [Maslov L.N. et al., 2009];

Налтрибен блокатор (V ()!' в дозе 0,3 мг/кг за 25 минут до коронароокклюзии [Maslov L.N. et al., 2009J;

СТАР антагонист ц-ОР, в дозе 0,1 мг/кг за 25 мин до ишемии [Лишманов Ю.Б. и др., 2003];

Норбияалторфимин блокатор к-ОР в дозе 9 мг/кг за 90 мин до начала ишемии [Maslov L.N. et al„ 2009];

Хелеритрина хлорид блокатор протеинкиназы С в дозе 5 мг/кг за 25 мин до ишемии [Maslov L.N. et al., 2009];

L-NAME ингибитор NO-синтаз в дозе 10 мг/кг за 25 мин до ишемии [Fryer R.M. et а!., 2000],

S- метшгтомочевины сульфат Блокатор iNO-синтазы в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно, за 25 мин до начала ишемии [Jiang X. et al., 2004];

Гинестеин ингибитор тирозинкиназы использовали в дозе 5 мг/кг, за 25 мин до ишемии [Fryer R.M. et al., 1999, 2000];

Лавендустин блокатор Бгк/ЕОт-киназы применялся в дозе 1 иг/кг за 25 мин до ишемии [Натакачта Т. е! а1., 1999];

Вортманнин блокатор РВ киназы использовали в дозе 0,015 мг/кг за 45 мин до моделирования ишемии [Ро-мэ в. е! а1., 1994].

Подсчет эритроцитов производили по унифицированной методике в счетной камере Горяева [Меньшиков В.В. и др., 1987].

Ишемию миокарда (20 мин) моделировали путем перевязки левой коронарной артерии у животных, наркотизированных с помощью пентобарбитала натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно, Sanofi-Aventis, Франция) [Neckar J. et al, 2003] с последующей реперфузией, продолжительность которой составляла 180 мин. Во время выполнения процедуры крысы находились на искусственной вентиляции, которую осуществляли с помощью модифицированного аппарата "РО-6" (ОАО «Красногвардеец», Санкт-Петербург, Россия).

Измерение артериального давления осуществляли прямым методом путем канюлирования правой сонной артерии. Канюлю соединяли с датчиком давления SS13L (Biopac System Inc., Goleta, Калифорния, США) и перистальтическим насосом Minipuls Evolution (Gilson inc., Middleton, США) для постоянной подачи физиологического раствора и предотвращения тромбообразования в католе. Регистрацию данных осуществляли с помощью аппарата для электрофизиологических исследований МР35 (Biopac System Inc., Goleta, США). Запись и обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения INSTBSL-W компании Biopac System Inc., (Goleta, США).

Регистрацию ЭКГ in vivo осуществляли в первом (VI) и во втором грудном (V2) отведениях в течение всего периода ишемии и первого часа реперфузии с помощью аппарата для электрофизиологических исследований МР35 (Biopac System Inc., Goleta, США). Запись и обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения 1NSTBSL-W компании Biopac System Inc., (Goleta, США).

При оценке нарушений ритма сердца принимали во внимание только желудочковые формы аритмий: множественные желудочковые экстрасистолы; желудочковая тахикардия, желудочковая фибрилляция.

После 20-минутной ишемии и 180-минутной реперфузии сердце выделяли и промывали физиологическим раствором через канюлированную аорту. Для определения размера зоны риска (ЗР, зона гипоперфузии) осуществляли окраску сердца насыщенным раствором перманганата калия, перфузируя миокард через канюлированную аорту, правый желудочек удаляли. Срезы сердец толщиной в 1 мм производили перпендикулярно их продольной оси [Neckar J. et al, 2003]. Для определения зоны некроза (ЗН)

срезы окрашивали 1% раствором 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида (30 минут, 37°С) и помещали в 10% раствор формальдегида на 1 сутки. На следующий день после окрашивания срезы сканировали с обеих сторон (сканер HP Scanjet G2710), используя оригинальную прикладную программу. Зону риска и размер некроза определяли компьютеризированным планиметрическим методом. Величина очага инфаркта была выражена в процентах от зоны гипоперфузии.

Исследование содержания опиоидных пептидов: мет-энкефалина, ß-эндорфина, эндоморфина-1 и эндоморфина-2 проводили спектрофотометрическим методом EIA-наборами фирмы Бахем (Bachem, Peninsula Laboratories, LLC, San Carlos, CA, USA).

Экстракцию опиоидных пептидов из крови и ткани миокарда проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя к наборам на селективных колонках SEP-COLUMN, содержащих сорбент С18 фирмы Бахем (Bachem, Peninsula Laboratories, LLC, San Carlos, CA, USA).

Кровь и ткань миокарда забирали непосредственно после окончания ишемии-реперфузии.

Статистическую обработку результатов производили с помощью критериев yj и Манна-Уитни.

В таблице 2. представлено распределение животных по сериям экспериментов.

Таблица 2

Распределение животных по сериям экспериментов_

№ Серия Число

1 Интактные животные 10

2 Контрольные животные, острая коронароокклюзия-реперфузия 280

3 ХННГ 10

4 ХННГ, острая коронароокклюзия-реперфузия 210

5 Блокада опиоидных рецепторов налтрексоном, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

6 ХННГ, блокада опиоидных рецепторов налтрексоном, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

7 Блокада 6-опиоидных рецепторов Т1РР(у), острая коронароокклюзия-реперфузия 12

8 ХННГ, блокада 5-опиоидных рецепторов Т1РР(ч;), острая коронароокклюзия-реперфузия 12

9 Блокада 5|-опноидных рецепторов ВХТХ, острая коронароокклюзия-реперфузия 11

10 ХННГ, блокада 5гопиоидных рецепторов ВЫТХ, острая коронароокклюзия-реперфузия 11

И Блокада 62-опиоидных рецепторов налтрибеном, острая коронароокклюзия-реперфузия 11

12 ХННГ, блокада бг-опиоидных рецепторов налтрибеном, острая коронароокклюзия-реперфузия 11

13 Блокада ц-опиоидных рецепторов СТАР, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

14 ХННГ, блокада ц-опиоидных рецепторов СТАР, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

15 Блокада к-опиоидных рецепторов норбиналторфимином, острая коронароокклюзия-реперфузия 14

16 ХННГ, блокада к-опиоидных рецепторов норбиналторфимин, острая коронароокклюзия-реперфузия 14

17 Блокада йгк/ЕСте-киназы лавендустином, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

18 ХННГ, блокада ^гк/ЕОРЯ-киназы лавендустином, острая коронароокклюзия-реперфузия 12 (

19 Блокада Р13-киназы вортмашшном, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

20 ХННГ, блокада РБ киназы вортманнином, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

21 Блокада протеинкиназы С хелеритрином, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

22 ХННГ, блокада протеинкиназы С хелеритрином, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

23 Блокада тирозинкиназ генистеином, острая коронароокклюзия-реперфузия 11

24 ХННГ, блокада тирозинкиназ генистеином, острая коронароокклюзия-реперфузия 11

25 Блокада ЪЮ-синтаз Ь-КАМЕ, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

26 ХННГ, блокада ЫО-синтаз Ь-ИАМЕ, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

27 Блокада ¡N05 синтазы 5-метилтиомочевины сульфатом, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

28 ХННГ, блокада ¡N'05 синтазы З-метилтиомочевины сульфатом, острая коронароокклюзия-реперфузия 12

Примечание: ХННГ - хроническая непрерывная нормооарическая гипоксия.Всего было проведено 28 серий экспериментов и использовано 798 животных. Большие выборки наблюдений в 2 и 4 экспериментальных группах связаны с набором нормоксического контроля и групп крыс с гипоксией каждый сезон, что было предпринято для избегания ошибок, связанных с сезонными колебаниями параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования некоторых показателей периферической крови Проведенные исследования показали, что у животных, подвергшихся непрерывной нормобарической гипоксии, достоверно увеличивается количество эритроцитов с 4,87 млн/мл до 7,09 млн/мл и концентрация гемоглобина со 150 г/л до 229 г/л (Табл. 3).

Таким образом, полученные данные по показателям периферической крови подтверждают, что изменения гематокрита, повышение уровня гемоглобина и содержания эритроцитов так же характерно для животных в состоянии адаптации к гипоксии [Neckar J., et al., 2003].

Таблица 3

Показатели периферической крови у крыс, подвергнутых ХННГ _(М ± SEM)_

Гемоглобин, г/л Эритроциты (млн/мл) Гематокрит

Контроль, п= 17 150,22 ± 12,86 4,87 ±0,61 0,4 ±0,02

Адаптация к гипоксии, п-14 229,18 ±40,63 Р=0,0016 7,09 ±0,88 Р=0,000005 0,62 ± 0,03 Р=0,0005

Примечание: р - уровень достоверности относительно нормоксических крыс, ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия.

Исследование содержания уровня опиоидных пептидов в плазме крови и ткани миокарда

У крыс, подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии, наблюдалось достоверное увеличение уровня мет-энкефалина в плазме. При воздействии ишемии/реперфузии достоверно уменьшался уровень мет-энкефалина в плазме крови нормоксических крыс и в ткани миокарда. Во время ишемии/реперфузии сердца у животных с ХННГ уровень мет-энкефалина в плазме крови, напротив, достоверно повышался, а в ткани миокарда наблюдалось умеренное снижение по сравнению с исходными значениями у животных с ХННГ (табл. 4).

Уровень Р-эндорфина в плазме крови нормоксических животных во время ишемии/реперфузии сердца достоверно уменьшался в плазме крови и в ткани миокарда. Во время ишемии/реперфузии сердца у животных с ХННГ уровень р-эндорфина в плазме крови был достоверно выше, чем в аналогичной группе нормоксических животных, в ткани миокарда также наблюдалось достоверное увеличение уровня Р-эндорфина по сравнению с контролем ХННГ (табл. 4).

Уровень эндоморфина-1 в плазме крови и ткани миокарда нормоксических животных во время ишемии/реперфузии не изменялся. У крыс подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии наблюдался достоверный подъём уровня эндоморфина-1 в плазме крови по сравнению с нормоксическими животными, в ткани миокарда рост уровня эндоморфина-1 не наблюдался. Во время ишемии/реперфузии сердца у животных с ХННГ уровень эндоморфина-1 в плазме крови достоверно повышался, в ткани миокарда значительных изменений не наблюдалось (табл. 4).

Уровень эндоморфина-2 в плазме крови нормоксических животных во время ишемии/реперфузии сердца достоверно снижался, в то время как в ткани миокарда значительных изменений не наблюдалось. У крыс, подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии, наблюдался достоверный подъём уровня эндоморфина-2 в плазме крови. В ткани миокарда крыс с ХННГ уровень эндоморфина-2 достоверно повышался по сравнению с интактными животными. Во время ишемии/реперфузии

сердца у гипоксических животных уровень эндоморфина-2 в плазме крови достоверно повышался относительно аналогичной группы нормоксического контроля. В ткани миокарда наблюдался достоверный рост уровня эндоморфина-2 (табл. 4).

Таким образом, есть основания полагать, что опиоидные пептиды (мет-энкефалин, ß -эндорфин, эндоморфин-1, эндоморфин-2) могут принимать участие в реализации инфаркт-лимитирующего эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Таблица 4

Содержание опиоидных пептидов в плазме крови и ткани миокарда крыс, подвергнутых ХННГ при коронароокклюзии-реперфузии (М + SEM)

Показатель

Нормоксия

Нормоксия Ишемия-реперфузия

ХННГ

ХННГ + ишемия-реперфузия

Мет-энкефалин

Плазма крови, пг/мл

Миокард, пг/мг

527,08 ± 29,32

10,42 + 2,8

436,39 ±34,15 pl<0,02

1,59 + 0,14 р1<0,01

702,9 ±42,28 pl<0,01

19,99 ± 2,92 pl<0,01

898,79 ± 83,24 р2<0,01 рЗ<0,01

18,54 + 3,39 рЗ<0,01

ß-эндорфин

Плазма крови, пг/мл

Миокард, пг/мг

994,33 ± 39,7

0,58 ± 0,06

758,51 ±88,16 pl<0,05

0,18 ±0,02 pl<0,01

1044,39 ± 43,16

0,64 ± 0,065

1061,06 ±78,15 рЗ<0,02

1,05 ±0,082 р2<0,01 рЗ<0,01

Эндоморфин-1

Плазма крови, пг/мл

Миокард, пг/мг

4,87 ± 0,42

0,0048 ± 0,00034

4,53 ± 0,53

0,0041 ±0,00017

7,49 ± 0,24 pl<0,01

0,046 ± 0,0077

13,6 ±1,94 р2<0,01 рЗ<0,01

0,037 ±0,0061

Эндомор<Ьин-2

Плазма крови, пг/мл

Миокард, пг/мг

11,43 ±0,96

0,022 ±0,0015

6,87 ± 0,73 р1<0,01

0,015 + 0,0067

15,04 ± 1,14 р1<0,01

0,258 + 0,036 pl<0,001

20,6 ± 2,41 р2<0,01 рЗ<0,01

0,464 ±0,0439 р2<0,01 рЗ<0,01

Примечание: р1 - уровень достоверности по отношению к группе нормоксических крыс, р2 - уровень достоверности по отношению к группе крыс с ХННГ, рЗ - уровень достоверности по отношению к группе^ с ишемией-реперфузией у нормоксических особей. Количество наблюдений в каждой группе п=10.

Исследования показателей гемодинамики, таких как частота сердечных сокращений и артериальное давление не выявили достоверных различий между группами. Оказалось, что в условиях хронической непрерывной нормобарической гипоксии измеряемые параметры гемодинамики не изменяются.

Влияния хронической непрерывной нормобарической гипоксии на частоту и характер нарушений сердечного ритма при коронароокклюзии и реперфузии выявлено не было.

Кардиопротекторный эффект ХННГ

Острая коронароокклюзия и последующая реперфузия во всех сериях экспериментов вызывала образование зоны гипоперфузии размером 37,345,4% от массы левого желудочка без достоверных различий между группами. Сходная величина зоны риска указывает на воспроизводимость результатов и отсутствие изменения коллатерального кровотока под влиянием ХННГ и препаратов.

Исследования показали, что зона некроза у крыс, подвергнутых ХННГ, составляла от 16,6 до 20,4% от зоны риска, что достоверно (р<0,01) отличалось от показателей соответствующих контрольных групп. Следовательно, при воздействии ХННГ соотношение зоны некроза к зоне риска уменьшалось на 36% по отношению к контролю. Эти результаты свидетельствуют о том, что хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия оказывает выраженный кардиопротекторный эффект.

Рисунок 1. Влияние ХННГ на размер зоны некроза при 20-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии у крыс (М+БЕМ). Примечание: * р<0,01 - достоверность относительно группы нормоксических крыс.

ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия.

Изучение роли опиоидных рецепторов в реализации кардиопротекторного эффекта ХННГ Блокада опиоидных рецепторов (ОР) неселективным антагонистом налтрексом у гипоксических крыс приводила к увеличению индекса зона некроза/зона риска (ЗН/ЗР), что оказалось идентично показателю нормоксической контрольной группы (рис 2). Следовательно, блокада всех типов ОР устраняет кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии. Как видно из рисунка 2, блокада 8-ОР селективным антагонистом Т1РР(у) приводила к увеличению соотношения ЗН/ЗР более чем на 30% по отношению к таковым показателям группы контрольных животных с ХННГ. В результате, соотношение ЗН/ЗР оказалась равной таковой в контрольной нормоксической группе. Эти данные свидетельствуют о том, что 5-ОР принимают участие в формировании кардиопротекторного эффекта ХННГ.

И Контроль

□ ХННГ

□ ХННГ + Налтрексон ШХННГ + Т1РР(ч/)

□ ХННГ + Налтрибен

□ ХННГ + ВМТХ

0 ХННГ + СТАР

Е1ХННГ +

норбиналторфимин

Рисунок 2 Влияние блокады опиоидных рецепторов на размер зоны некроза при 20-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии у крыс после курса ХННГ.

Примечание: ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия. * р<0,01 - достоверность относительно группы нормоксических крыс, ** р<0,01 - достоверность относительно группы крыс после курса ХННГ

Дельта-ОР подразделяются на два субтипа: 5гОР и 52-ОР. Оказалось, что на фоне блокады З^ОР селективным антагонистом ВТчГТХ, размер зоны некроза относительно показаний контрольных животных с ХННГ не изменялся, то

есть защитный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии сохранялся. В то время как «выключение» 52-ОР селективным блокатором этого субтипа ОР налтрибеном приводило к увеличению соотношения ЗН/ЗР с 20,4% у животных с ХННГ до 54,9%, этот показатель не имел достоверных отличий от группы нормоксического контроля (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что в реализации кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии важную роль играют 52-, но не 5гОР. Предварительная блокада ц-ОР селективным блокатором СТАР приводила к увеличению соотношения ЗН/ЗР на 28%, что также указывало на устранение кардиопротекторного эффекта ХННГ (рис. 2). Этот факт говорит о том, что ц-ОР также участвуют в адаптационной устойчивости сердца к ишемии и реперфузии. Предварительное введение антагониста к -ОР норбиналторфимина не изменяло соотношения ЗН/ЗР у гипоксических особей. Следовательно^ -ОР не принимают участия в реализации кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии (рис. 2).

Выяснение роли опиоидной системы в реализации кардиопротекторного эффекта ХННГ показало, что блокада ОР полностью устраняла кардиопротекторный эффект. Этот факт доказывает наше предположение об участии эндогенной опиоидной системы в формировании повышенной устойчивости миокарда к ишемии/реперфузии у животных, прошедших курс предварительного воздействия хронической гипоксии. Опиоидная система была названа в числе стресс-лимитирующих систем, опосредующих адаптивные реакции, еще в 80-е годы профессором Ф.З. Меерсоном [Меерсон Ф.З., 1986]. С тех пор проведено множество работ, доказывающих участие тех или иных субтипов опиоидных рецепторов в формировании кардиотропных эффектов краткосрочной или долговременной адаптации. Так, например, обнаружено участие ОР в кардиопротекторном эффекте ишемического пре- и посткондиционирования [Schultz J.E.J. et al., 1998, Guo H.T. et al., 2011], антиаритмическом эффекте высокогорной гипоксии или стресса [Нарыжная Н.В. и др., 2011], защитном эффекте растительных адаптогенов [Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., 1994]. При этом показано, что при различных видах неспецифических адаптирующих воздействий защитный эффект опосредуется активацией различных типов ОР. При ишемическом прекондиционировании это 5rOP [Schultz J.E.J., 1998], антиаритмический эффект при воздействии периодической гипобарической гипоксии опосредуется через 5-ОР, а при стрессе - через ц-ОР [Нарыжная Н.В. и др, 2011]. Вместе с тем вопрос о рецепторной специфичности участия опиоидной системы в кардиопротекторном эффекте нормобарической гипоксии оставался открытым. В последующих экспериментах мы провели исследование роли различных субтипов ОР в реализации кардиопротекторного эффекта ХННГ путем поочередного ингибирования различных типов ОР селективными антагонистами. Данные о полном

устранении инфаркт-лимитирующего эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии при селективной блокаде 6-ОР свидетельствуют о ключевой роли этого рецепторного пула в реализации вышеуказанного эффекта. Однако дальнейшие эксперименты показали, что селективная блокада 52-ОР, но не 6,-ОР приводит к исчезновению кардиопротекторного эффекта.

Данные об устранении кардиопротекторного эффекта хронической нормобарической гипоксии при селективной блокаде ц-ОР являются аргументом в пользу значимой роли этого пула опиоидных рецепторов в реализации кардиопротекторного эффекта. Эти результаты выглядят логичными, если принять во внимание тот факт, что эндогенные энкефалины и р-эндорфин обладают высоким сродством как к ц-ОР, так и к 5-ОР [ЭЬатеап В.К е1а1., 1996].

Информация, полученная в ходе экспериментов с блокадой -ОР у гипоксических крыс, говорит о том, что в механизме развития кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии к: -ОР участия не принимают. Вместе с тем, в литературе есть данные об участии к-ОР в механизмах защитного эффекта ишемического пре- и посткондиционирования [УаксЬапоуа-МагсЬощапзка А. е1 а1., 2003;

вио Н.Т. е1 а1. 2011].

Резюмируя результаты исследования рецепторной специфичности участия опиоидной системы в защитном эффекте ХННГ от ишемического/реперфузионного повреждения, следует отметить, что и при пре- и посткондиционировании опиоидная система играет важную роль в адаптационной защите миокарда, но ее эффекты реализуются через иные субтипы ОР. Это представляется возможным, если принять во внимание тот факт, что к настоящему времени неизвестны селективные эндогенные агонисты 6,- или 52-ОР. Эндогенные опиоидные пептиды лей- и мет-энкефалины обладают сродством как к 5,- или 32-ОР, так и к Ц-ОР, поэтому защитные эффекты эндогенных опиоидов могут быть реализованы через любой из этих субтипов ОР. Мы можем предполагать, что наряду с неспецифическим увеличением уровня эндогенных опиоидов может происходить специфическое для каждого адаптирующего воздействия изменение рецепторного аппарата кардиомиоцитов, происходящее в различных ситуациях по отличающимся «сценариям».

Изучение внутриклеточных сигнальных механизмов кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической

гипоксии.

При исследовании роли ИО-синтазы в кардиопротекторном эффекте ХННГ было обнаружено, что введение ингибитора этого фермента, блокирующего все типы Ы0-синтазы Ь-ЫАМЕ, сопровождалось значительным увеличением размера зоны некроза по сравнению с

контрольными гипоксическими животными (рис. 3). При этом значение ЗН/ЗР оказалось на уровне крыс группы нормоксического контроля.

Таким образом, мы получили результаты, подтверждающие важную роль NO-синтазы в защитном действии хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Между тем, известно, что NO-синтаза представлена в сердце несколькими изоформами и их участие в адаптационных процессах остается предметом исследования [Зенков Н.К. и др., 2001]. Так, ранее было обнаружено, что при моделировании неспецифической устойчивости миокарда путем ишемического прекондиционирования возрастает экспрессия гена индуцибельной формы NO-синтазы [Bencsik Р. et al. 2010]. Другими авторами сообщается о важной роли эндотелиальной формы NO-синтазы в

прекондиционировании [Bell R.M. et al., 2001].

%

Н Контроль □ ХННГ

QXHHr + L-NAME

□ XHHT + S-метил-тиомочевина

Рисунок 3. Влияние блокады N0 синтазы на размер зоны некроза при 20-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии у крыс после курса ХННГ.

Примечание: ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия. * р<0,01 - достоверность относительно группы нормоксических крыс, ** р<0,01 - достоверность относительно группы крыс после курса ХННГ

Предварительное введение селективного ингибитора индуцибельной формы NO-cинтaзы ^О-синтаза) Э-метилмочевины сопровождалось значительным (в 3 раза) увеличением размера зоны некроза по сравнению с гипоксическим контролем (рис. 3). При этом значение ЗН/ЗР оказалось на уровне крыс группы нормоксического контроля.

Таким образом, наши исследования показали, что на фоне ингибирования iNO-синтазы кардиопротекторный эффект хронической нормобарической гипоксии не проявляется (рис. 3). Эти данные свидетельствуют о важной роли iNO-синтазы в защитном эффекте ХННГ. Роль эндотелиальной NO-синтазы остается неизученной. Группа аргентинских авторов под руководством проф. Т. Zaobornyj [Gonzales G.F. et al., 2005] не обнаружила в цитоплазме кардиомиоцитов, подвергнутых хронической гипоксии крыс, увеличения содержания эндотелиальной NO-синтазы, в то время как представительство индуцибельной NO-синтазы значительно возрастало по сравнению с нормоксическими животными. Влияние NO-синтазы на повреждение кардиомиоцитов при ишемии может опосредоваться через активацию оксидом азота митохондриальных АТФ-чувствительных К+-каналов, как это показано для гипобарической гипоксии [Fitzpatrick С.М. et al. 2005].

Ингибирование протеинкиназы С (ПКС) хелеритрином приводило в увеличению зоны некроза у крыс с ХННГ до уровня нормоксических животных (рис. 4).

На основании полученных данных мы можем сделать вывод о том, что кардиопротекторный эффект хронической нормобарической гипоксии не проявляется на фоне блокады протеинкиназы С. Эти данные согласуются с данными литературы об участии этого фермента в формировании кардиопротекции при других неспецифических адаптивных воздействиях: гипобарической гипоксии, ишемическом и фармакологическом прекондиционировании [Neckar J. et al., M 2005, Fryer R.M. et al., 1999, 2001]. На наш взгляд, протеинкиназа С играет роль ключевого фактора в формировании резистентности миокарда к ишемии-реперфузии, поскольку показана ее важная роль в кардиопротекции при большинстве видов адаптирующих воздействий [Kolar F., et al., 2004; Ping P. et al., 1999; Fryer R.M. et al. 1999]. Активация этого фермента приводит к фосфорилированию огромного количества внутриклеточных белков [Dempsey Е.С. et al., 2000]. Анализ данных литературы позволяет выделить несколько мишеней ПКС, которые участвуют в формировании адаптивной реакции сердца в ответ гипоксию. Это, прежде всего, АТФ-зависимые К^-каналы (КАТФ-каналы) [Fryer R.M. et al., 2001], а также тирозинкиназы [Baines С.Р. et al., 1998]. Одним из наиболее важных эффектов ПКС является ее способность транслоцироваться в митохондрии и запускать регуляторный каскад, приводящий к активации митохондриальных АТФ-чувствительных К -каналов (митоКАТФ-каналов) [Cohen M.V. et al., 2007; Costa A.D. et al., 2006; Penna C. et al., 2006; 2007; Uecker M. et al., 2003] и ингибированию открытия МРТ-пор (шРТР, МРТ-пора - mitochondrial permeability transition pore -митохондриальные поры переменной проницаемости) [Cohen M.V. et al., 2007; Costa A.D. et al., 2006; Penna C. et al., 2006; 2007].

И Контроль

ахннг

И ХННГ + хелеритрин

Рисунок 4. Влияние блокады протеинкиназы С на размер зоны некроза при 20-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии у крыс после курса ХННГ.

Примечание: ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия. * р<0,01 - достоверность относительно группы нормоксических крыс, ** р<0,01 - достоверность относительно группы крыс после курса ХННГ

О важной роли этого сигнального механизма в адаптационной кардиопротекции свидетельствуют публикации об устранении кардиопротекторного и антиаритмического эффектов гипоксии после блокады КАТФ-каналов [Нарыжная Н.В. и др., 2009, Baker J.E. et al., 1997] или при активации МРТ-пор у гипоксических крыс [Zhu W.-Zh et al., 2006].

Сходный эффект был обнаружен при ингибировании тирозинкиназ генистеином - размер зоны некроза в этой экспериментальной группе оказался на 70% больше, чем в группе гипоксических крыс с незаблокированными тирозинкиназами (рис. 5). Однако, при введении ингибитора тирозинкиназ лавендустина, блокирующего только Srk и EGFR (Srk - Srk-киназы, EGFR - epidermal growth factor receptor) [Williams-Pritchard G. et al., 2011, Ping P. et al., 1999], мы не обнаружили какого-либо влияния на размер зоны некроза у крыс с ХННГ. Аналогичные результаты мы получили при ингибировании Р13-киназы ее селективным блокатором вортманнином (рис. 5).

Если роль Кдхф-каналов в адаптации к нормобарической гипоксии известна [Baker J.E. et al., 1997], то роль тирозинкиназ оставалась не исследованной. Наши последующие эксперименты были направлены на выявление роли тирозинкиназ и их субтипов в формировании

кардиопротекции при хронической нормобарической гипоксии. Они показали, что при моделировании коронароокклюзии и реперфузии у гипоксических крыс на фоне ингибирования всех типов тирозинкиназ генистеином, кардиопротекторный эффект ХННГ не проявлялся (рис. 5). Это свидетельствует о важной роли этой группы киназ в защитном эффекте данного вида гипоксии. Вместе с тем известно, что семейство тирозинкиназ представлено в клетке более чем 1000 ферментами [Neet К. et al, 1996]. По результатам исследований [Ping Р, et al., 1999 и Williams-Pritchard G. et al. 2011], в опосредовании кардиопротекторного эффекта ишемического и фармакологического прекондиционирования играют важную роль Srk-киназы и EGFR-тирозинкиназы [Williams-Pritchard G., 2011, Ping Р, 1999]. Однако эксперименты, проведенные нами с антагонистом Srk/EGFR-субпопуляции тирозинкиназ лавендустином, не показали значимой роли этого фермента в опосредовании кардиопротекции при хронической нормобарической гипоксии. Эти результаты показывают, что в защитном действии как ХННГ, так и агонистов 5-ОР принимают участие другие субтипы тирозинкиназ. Возможно, что в качестве сигнальных киназ в этих случаях выступают Lsk - тирозин-киназы [Fryer R.M. et al., 2001].

■ Контроль

□ ХННГ

S ХННГ -1- генистеин

□ ХННГ +лавендустин В ХННГ +Вортманнин

Рисунок 5. Влияние блокады тирозинкиназ и Р13-киназы на размер зоны некроза при 20-минутной коронароокклюзии и 180-минутной реперфузии у крыс после курса ХННГ.

Примечание: ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия. * р<0,01 - достоверность относительно группы нормоксических крыс, ** р<0,01 - достоверность относительно группы крыс после курса ХННГ

Таким образом, на основании проведенных исследований мы можем говорить о важности опиоидной системы в защитном эффекте адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии. Поскольку у крыс, подвергнутых воздействию хронической непрерывной нормобарической гипоксии, содержание опиоидных пептидов в плазме крови и ткани миокарда значительно повышалось, а при ингибировании ОР кардиопротекторный эффект не развивался. В свою очередь, внутриклеточный механизм реализовывался через протеинкиназу С, индуцибельную форму ЫО-синтазы и тирозинкиназы (Рис. 6).

Рисунок 6. Гипотетическая схема участия опиоидных рецепторов и внутриклеточных сигнальных каскадов в механизме кардиопротекторного эффекта ХННГ.

Примечание: ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия. PL-C - фосфолипаза С; РК-С - протеинкиназа С; ТК - тирозинкиназа; К+АТР

- Кдтф-канал; МРТР - поры переменной проницаемости митохондрий; NOS

— NO-синтаза.

ВЫВОДЫ

1. Хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия приводит к увеличению концентрации опиоидных пептидов (мет-энкефалин, (3 -эндорфин, эндоморфин-1, эндоморфин-2) в плазме крови и в ткани миокарда.

2. Повышение толерантности сердца к действию ишемии и реперфузии у крыс, подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии, осуществляется через §2- и (х-опиоидные рецепторы.

3. Кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии реализуется через активацию протеинкиназы С.

4. Кардиопротекторный эффект к действию ишемии-реперфузии в условиях хронической непрерывной нормобарической гипоксии зависит от активности тирозинкиназ.

5. Киназа PI3 не участвует в кардиопротекторном эффекте хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

6. Кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии реализуется с участием индуцибельной формы NO-синтазы.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ласукова Т.В. Внутриклеточные механизмы опиоидергической регуляции функции миокарда в условиях нормоксии и посгашемической реперфузии./ Ласукова Т.В., Маслов Л.Н., Горбунов A.C., Цибульников С.Ю.// Росс, физиол. жур.- 2009,- Т. 95, № 4,- С. 376-386.

2. Маслов Л.Н. Значение опиоидных рецепторов в регуляции толерантности сердца к патогенному действию длительной ишемии-реперфузии in vivo. / Маслов Л.Н., Барзах Е.И., Крылатое A.B., Браун С.А., Олтджен П.Р., Говиндашвами М, Чернышева Г.А., Соленкова Н.В., Лишманов А.Ю., Цибульников С. Ю., Криг Т., Жанг Е. // Росс, физиол. жур.- 2009,- Т.95.- №.6, С.563-572.

3. Ласукова Т.В. Роль внутриклеточного кальция и циклических нуклеотидов в реализации кардиопротекторного действия агонистов 8¡- и кгопиоидных рецепторов. / Ласукова Т.В., Маслов Л.Н., Низкодубова С.В., Горбунов A.C., Цибульников С.Ю. // Бюлл. экспер. биол. мед.- 2009,- Т. 147.- №. 12.- С.636-639.

4. Маслов Л.Н. Опиоидный пептид дельторфин П имитирует кардиопротекторный эффект ишемического прекондиционирования: роль 8-опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, Клтф-каналов. / Маслов Л.Н., Барзах Е.И., Крылатов A.B., Чернышёва Г.А., Криг Т., Соленкова Н.В., Лишманов А.Ю.,Цибульников С.Ю.,ЖангЕ. //Бюлл. экспер. биол. мед.- 2010.- Т.149.-№ 5, С.524-527.

5. Цибульников С.Ю Антиаритмические эффекты адаптации к гипоксии и стрессу реализуются через различные типы опиоидных рецепторов. Тезисы докладов XIV Всероссийская с международным участием конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» 19-23 апреля Томск2010г.

6. Цибульников С.Ю Роль опиоидных рецепторов в формировании кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии. Тезисы докладов Первой Международной Накчно-Практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» 23-26. ноября 2010, Санкт-Петербург, с. 339-340.

7. Маслов Л.Н. Роль опиоидных рецепторов и связанных с ними внутриклеточных сигнальных каскадов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии. / Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В., Цибульников С.Ю., Горбунов A.C., Ласукова Т.В. // Российский национальный конгресс кардиологов 11 - 13 Октября 2011. Москва. Тезисы докл. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2011; 10 (6): Приложение 1:200-201.

8. Нарыжная Н.В., Цибульников С.Ю., Горбунов A.C. (г. Томск) Исследование функционального состояния МПТ-поры и трансмембранного потенциала митохондрий миокарда при ишемии и реперфузии у крыс, адаптированных к хронической нормобарической гипоксии. Тезисы докладов 6 Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» 11-13 октября 2011 года, г. Москва, Патогенез №3, 2011. с.50

9. Цибульников С.Ю. Исследование рецепторной природы опиоидного компонента кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии. Тезисы докладов 6 Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» 11-13 октября 2011 года, г. Москва, Патогенез №3, 2011. с.69.

10. Нарыжная Н.В., Цибульников С.Ю., Маслов Л.Н. Опиоидные рецепторы и сопряженные сигнальные механизмы кардиопротекции при хронической нормобарической

гипоксии. Сборник статей Физиомеди 3-1 «Высокие технологии, исследования, образование в физиологии, медицине и фармахологии». Том 1. Под редакцией А.П. Кудинова, Б.В. Крылова САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012. С. 207-210.

11. Маслов Л.Н. Взаимодействие опиоидных рецепторов и внутриклеточных сигнальных систем в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии. / Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В., Цибульников С.Ю., Горбунов A.C., Ласукова Т.В. // Физиологии кровообращения. V Всероссийская с международным участием школа-конференция. 31 января -3 февраля 2012. Сборник тезисов. Москва, 2012,102-103.

12. Маслов Л.Н. Вазопротекторный эффект классического ишемического прекондиционирования. / Маслов Л.Н., Крылатой A.B., Горбунов A.C., Цибульников С.Ю., Семенцов A.C. // Сиб. мед. жур. (Томск).- 2012,- Т. 27,- №1, С.9-17.2

13. Лишманов Ю.Б. Роль ц-, 8- и к -опиоцдных рецепторов в формировании кардиопротекторного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии. / Лишманов Ю.Б., Нарыжная Н.В., Цибульников С.Ю., Маслов Л.Н., Колар Ф., Жанг И. // Сиб. мед. жур. (Томск).- 2012.- Т. 27.- №1, С.111-114.1

14. Цибульников С.Ю. Сигнальные механизмы кардиопротекции при ¡фонической нормобарической гипоксии. Тезисы докл. VII Сибирского физиологического съезда, г. Краспоярск, 27-29 июня 2012 г.

15. Маслов Л.Н. Триггерный механизм адаптивного феномена ишемического посткондиционирования сердца. / Маслов Л.Н., Мрочек А.Г., Барзах Е.И., Лишманов А.Ю., Горбунов A.C., Цибульников С.Ю., Семенцов A.C., Прокудина Е.С. // Росс, физиол. жур,- 2012 -Т.98.-№.9, С.1053-1069.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

OHM - острый инфаркт миокарда

ХННГ - непрерывная нормобарическая гипоксия

ЗР - зона гипоперфузии (зона риска)

ОП - опиоидные пептиды

3II/OP - зона некроза/зона риска

ОР - опиоидные рецепторы

митоКлто-каналы - АТФ-чувствительные К*-каналы

КАтф-каналы - АТФ-зависимые К*-канальг

АТР - аденозинтрифосфат

mPTP, МРТ-пора - mitochondrial permeability transition pore - митохондриальные поры

переменной проницаемости

1'13-кииаза - phosphatidylinositol-3-киназа

ЧСС - частота сердечных сокращений

iNO-сиитаза - индуцибельная NO-синтаза

ПКС - протеинкиназа С

Подписано в печать: 10.04.2013 г. Бумага: офсетная Тираж: 100 экз. Печать: трафаретная

Формат: 60x84/16 Усл. печ. л.: 1,39

Заказ: 730/Н

Издательство

Томского государственного педагогического университета

г. Томск, ул. Герцена, 49. Тел. (3822) 52-12-93 e-mail: pub!ish@tspu.edu.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Цибульников, Сергей Юрьевич, Томск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ТОМСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

0420135^513

Цибульников

Сергей Юрьевич

Роль опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, тирозинкиназ, Р13-киназы и Ж)-синтаз в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии

03.03.01 - физиология

14.03.03 - патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук ЛасуковаТ.В.

доктор медицинских наук Рыжкова Д.В.

Томск - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

4 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы кардиопротекторного эффекта гипоксии 12

1.2. Патогенез ишемических и реперфузионных повреждений 23

миокарда

1.3. Опиоидная система и ее роль в регуляции функции миокарда в 33

норме и при патологии

1.4. Опиоидная система в процессах адаптации сердца 43

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования 51

2.2. Характеристика методов исследования 53

2.2.1. Моделирование хронической непрерывной нормобарической 53 гипоксии

2.2.2. Моделирование коронароокклюзии-реперфузии 53

2.2.3. Регистрация и оценка ишемических и реперфузионных 54 нарушений сердечного ритма

2.2.4. Оценка ишемических-реперфузионных повреждений 54 миокарда

2.2.5 Лабораторные методы исследования крови 55

2.2.6 Исследование гемодинамики 55

2.2.7 Определение содержания опиоидных пептидов в крови и 56 ткани миокарда

2.3. Характеристика используемых фармакологических агентов 57

2.3.1. Антагонисты опиоидных рецепторов 57

2.3.2. Фармакологические инструменты для оценки вклада N0- 60 синтазы, протеинкиназы С и тирозинкиназ в реализацию кардиотропного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии

2.4. Методы статистической обработки результатов 63

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Изменения показателей периферической крови у крыс, 64 подвергшихся хронической непрерывной нормобарической гипоксии

3.2 Изменение уровня опиоидных пептидов у крыс, подвергнутых 65 хронической непрерывной нормобарической гипоксии

3.3 Исследование гемодинамики 68

3.4 Влияние хронической непрерывной нормобарической гипоксии 73 на частоту и характер нарушений сердечного ритма при коронароокклюзии и реперфузии

3.5. Кардиопротекторный эффект хронической непрерывной 77 нормобарической гипоксии

3.5.1 Изучение роли опиоидных рецепторов в реализации кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной 80 нормобарической гипоксии

3.5.2 Изучение внутриклеточных регуляторных механизмов в 87 кардиопротекторном эффекте хронической непрерывной нормобарической гипоксии

3.5.2.1 Изучение участия МО-синтазы в реализации 87 кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии

3.5.2.2 Изучение участия протеинкиназы С в реализации 90 кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии

3.5.2.3 Изучение участия тирозинкиназ в реализации 93 кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97

ВЫВОДЫ 102

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЗИ/ЗР - соотношение зона инфаркта/ зона риска ЗН - зоны некроза

ЗР - зона риска (зона гипоперфузии) индуцибельная iNOS inducible NO-synthase

ИП - ишемическое прекондиционирование (ischemic preconditioning)

конститутивная eNOS endothelial NO-synthase

КФК - креатинфосфокиназа

ЛДГ - лактатдегидрогенеаза

МАПК - Митоген-активируемые протеинкиназы

МАПК - митоген-активируемые протеинкиназы

митоСОД - митохондриальная супероксиддисмутаза

НО-1 - индуцибельная гемоксигеназа

ОИМ - острый инфаркт миокарда

ОП - опиоидные пептиды

ОР - опиоидные рецепторы

ПКС - протеинкиназа С

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СПР - саркоплазматический ретикулум

ХННГ - хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия

цАМФ - циклический аденозин монофосфат

цГМФ - циклический гуанозин монофосфат

ЧСС - частота сердечных сокращений

ADP - аденозиндифосфат

AIF - апоптоз-индуцирующий фактор

AMP - аденозинмонофосфат

АТР - аденозинтрифосфат

ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase) - киназа

Fas - маркер апоптоза

HIF-1 - hypoxia inducible factor - фактор, индуцируемый при гипоксии

ISAM - The International Society of Adaptive Medicine - Международное общество

по адаптационной медицине

JNK - c-Jun N-terminal kinase - янус-киназа

Mcl-1 - Myeloid Cell Leukemia 1 - антиапоптотический белок

mPTP, МРТ-пора - mitochondrial permeability transition pore - митохондриальные

поры переменной проницаемости

NO" S-нитрозоглутатиона (GSNO)

Р13-киназа - инозитол-3-фосфат киназа

ROS - reactive oxygen species - активные формы кислорода

SERCA2a - Са2+-АТРаза

Smac/DIABLO - проапоптотический митохондриальный белок TNF-a - фактор некроза опухоли a TUNEL - маркер апоптоза

XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis - Х-связанный ингибитор апоптоза

Введение

Актуальность. Проблема повышения устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям все еще остается одной из наиболее актуальных проблем современной патофизиологии и кардиологии. Это связано с тем, что ишемическая болезнь сердца и, прежде всего, острый инфаркт миокарда (ОИМ) представляют собой одну из основных причин инвалидизации и смертности среди взрослого населения России и экономически развитых стран [Марков В.А. и др., 2011; Чазов Е.И., 2008; Braunwald Е., 2011]. Единственным эффективным методом лечения ОИМ является реканализация инфаркт-связанной коронарной артерии [Марков В.А. и др., 2011; Чазов Е.И., 2008; Braunwald Е., 2011]. К сожалению, необратимые повреждения кардиомиоцитов при ишемии-реперфузии возникают очень быстро. Между тем, в России среднее время поступления больного с ОИМ в стационар составляет 2,5 - 2,8 ч [Марков В.А. и др., 2011]. В этой ситуации неоценимую помощь в спасении жизни пациентов с ОИМ на догоспитальном этапе могло бы оказать применение препаратов, заметно повышающие устойчивость сердца к действию ишемии-реперфузии. К сожалению, такие лекарственные средства пока не существуют. В создании подобных препаратов существенная роль принадлежит изучению молекулярных механизмов адаптационных феноменов, повышающих устойчивость сердца к ишемии и реперфузии. К таким адаптивным феноменам следует отнести адаптацию к гипоксии

В 1952 г Г. Селье [Селье Г., 1960; Selye II., 1952] было показано, что адаптация к одному экстремальному воздействию может обеспечивать повышение толерантности организма и к другим экстремальным факторам, феномен получил название «перекрёстный эффект адаптации». Эти данные были подтверждены другими исследователями. Так, например, адаптация к иммобилизационному стрессу обеспечивает повышение устойчивости организма крыс к холоду [Kuroshima А. et al., 1984] и гипоксии [Меерсон Ф.З. и др. 1988]. Адаптация к иммобилизационному стрессу [Меерсон Ф.З. и др., 1988; Meerson F.Z. и Malyshev I.Yu., 1989] или холоду [Барбараш H.A., 1996] повышает толерантность сердца к аритмогенному действию ишемии и реперфузии. Установлено, что адаптация к периодической гипоксии обеспечивает повышение толерантности сердца к

действию ишемии и реперфузии [Ding I-I.L. et al., 2004; Fitzpatrick C.M. et al., 2005; Kolar F. et al., 2005; Neckar J. et al., 2002; 2005]. Установлено, что адаптация крыс к хронической непрерывной нормобарической гипоксии (ХННГ) также оказывает инфаркт-лимитирующий эффект при коронароокклюзии и реперфузии in vivo [Neckar J. et al., 2003] и повышает устойчивость изолированного сердца к действию глобальной ишемии-реперфузии [Tajima M. et al., 1994].

Адаптация к гипоксии представляет особый интерес для врачей и исследователей, поскольку кардиопротекторпый эффект этой адаптации сохраняется несколько дней [Дудко В.А. и Соколов A.A., 2000; Меерсон Ф.З. и Малышев И.Ю., 1993; Меерсон Ф.З. и Пшенникова М.Г., 1988]. Согласно данным C.M. Fitzpatrick и соавторов [Fitzpatrick C.M. et al., 2005], кардиопротекторпый эффект адаптации к хронической гипоксии у новорожденных' кроликов может сохраняться в течение 30 дней после последнего сеанса гипоксии, а по данным В. Ostadal и соавт. [Ostadal В. et al., 1995] защитный эффект адаптации к гипоксии может сохраняться в течение 4-х месяцев. Существует определенное сходство между отсроченной фазой ишемического прекондиционирования и феноменом адаптационной устойчивости сердца к ишемии и реперфузии. Исходя из литературных данных, мы предположили, что молекулярный механизм протекторного эффекта адаптации и механизм положительного эффекта действия отсроченного ишемического прекондиционирования (second window) может быть сходен [Béguin P.C. et al., 2005; Xi L. et al., 2002]. Так, например, P.C. Béguin и соавторы обнаружили, что сердца, изолированные у крыс, которых подвергли 4-х часовой непрерывной гипоксии и последующей нормальной оксигенации, через 24 ч после гипоксического воздействия становятся резистентными к ишемии-реперфузии in vitro. Этот эффект был устранен с помощью ингибирования NO-синтазы и блокады митохондриальных КдтФ-каналов [Béguin P.C. et al., 2005]. Сходные данные были получены L. Xi и соавторами [Xi L. et al., 2002]. Следует отметить, что NO-синтаза участвует в формировании отсроченной фазы ишемического прекондиционирования, а Кдю-каналы играют важную роль в обеих фазах прекондиционирования [Yellon D.M. and Downey J.M., 2003]. Как при адаптации к гипоксии, так и в случае «второго окна» прекондиционирования,

появление необратимых повреждений кардиомиоцитов задерживается, сократимость миокарда в реперфузионном периоде улучшается, а частота возникновения ишемических и реперфузионных аритмий снижается. Однако адаптационная толерантность сердца к ишемии развивается на уровне целого организма, а феномен ишемического прекондиционирования может быть вызван с помощью кратковременной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Следовательно, нельзя исключить возможность того, что рецепторный и сигнальный механизмы ишемического прекондиционирования и адаптации к гипоксии различны. Хорошо известно, что аденозин, опиоиды и брадикинин участвуют в механизме развития ишемического прекондиционирования [Маслов JI.II. и др., 2006; Yellon D.M. and Downey J.M., 2003]. Эти соединения могут имитировать ишемическое прекоидиционирование [Маслов J1.H. и др., 2006; Yellon D.M. and Downey J.M., 2003]. В развитии отсроченной фазы ишемического прекондиционирования важную роль играет NO-синтаза и циклооксигеназа-2 [Yellon D.M. and Downey J.M., 2003]. Существуют данные о том, что в прекондиционировании важную роль играют протеинкиназа С, тирозинкиназы, ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase) - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами, она же р42/44-киназа [Yellon D.M. and Downey J.M, 2003] и Р13-киназа (PI3, от phosphatidylinositol-3-kinase) [Ban К. et al., 2008; Yang X.M. et al., 2010].

Молекулярный механизм кардиопротекторного эффекта адаптации к ИНГ остается изученным недостаточно. Российские физиологи установили, что антиаритмический эффект адаптации к периодической гипоксии связан с активацией опиоидных рецепторов [Лишманов Ю.Б., и др., 20036]. Китайская группа получила данные о том, что активация NO-синтазы в кардиомиоцитах крыс, адаптированных к гипоксии, способствует улучшению сократимости сердца в реперфузионном периоде [Ding I-I.L. et al., 2004]. Сходные данные были получены другими исследователями [Fitzpatrick С.М. et al., 2005; Xi L. et al., 2002]. Установлено, что опиоидные рецепторы, протеинкиназа С, NO-синтаза играют важную роль в кардиопротекторном эффекте адаптации к периодической гипобарической гипоксии.

Таким образом, анализ литературных данных позволяет нам предполагать, что механизмы формирования отсроченного ишемического прекондиционирования и механизмы защитного действия адаптации к непрерывной нормобарической гипоксии могут иметь сходную природу.

Цель: Исследовать роль опиоидных рецепторов, протеинкиназы С, тирозинкиназ, Р13-киназы и >Ю-синтаз в реализации кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Задачи:

1. Изучить влияние хронической непрерывной нормобарической гипоксии на уровень опиоидных пептидов в миокарде и плазме крови у крыс.

2. Исследовать роль ц-, 6- и к- опиоидных рецепторов в механизме формирования повышенной устойчивости миокарда к действию острой коронароокюпозии и реперфузии после воздействия хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

3. Выяснить значение протеинкиназы С в опосредовании кардиопротекторного эффекта хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

4. Изучить роль тирозинкиназ в механизме кардиопротекции при воздействии хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

5. Определить, участвует ли Р13-киназа в кардиопротекторном эффекте хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

6. Исследовать вклад Ж)-синтаз в кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Научная новизна

Впервые выявлено, что хроническая непрерывная нормобарическая гипоксия вызывает увеличение содержания эндогенных опиоидных пептидов в миокарде и плазме крови у крыс.

В настоящем исследовании впервые выяснена роль опиоидных рецепторов в устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии у крыс, подвергнутых хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Впервые изучена роль протеинкиназы С, тирозинкиназ, Р13-киназы в кардиопротекторном эффекте хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Впервые исследован вклад индуцибельной NO-синтазы в кардиопротекторный эффею1 хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Научно-практическая значимость

Результаты работы расширяют представления о роли опиоидных рецепторов и сопряженных с ними сигнальных путей в реализации повышения устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии.

Основные положения работы могут быть использованы в качестве теоретической основы для прикладных исследований в области создания принципиально новых фармакологических препаратов, обладающих кардиопротекторным действием.

По результатам работы была отправлена заявка на патент. Получена приоритетная справка.

Маслов Л.Н., Нарыжная Н.В., Цибульников С. Ю., Горбунов A.C. «Средство, увеличивающее устойчивость сердца к ишемическим-реперфузионным повреждениям» от 27.03.2012 №2012111891

Основные положения, выносимые на защиту:

В условиях хронической непрерывной нормобарической гипоксии повышается концентрация эндогенных опиоидных пептидов в миокарде и плазме крови у крыс.

Опиоидная система является одним из звеньев повышенной устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии в условиях хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Кардиопротекторный эффект хронической непрерывной нормобарической гипоксии реализуется при участии протеинкиназы С, тирозинкиназ, индуцибельной NO-синтазы.

Апробация работы: Материалы диссертации представлены на конференциях: XIV Всероссийская с международным участием конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» (Томск, 2010); Первая

Международная Научно-Практическая конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); 6 Российская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011); Российский национальный конгресс кардиологов. (Москва, 2011); VII Сибирский физиологический съезд (Красноярск, 2012);

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ. Из них 7 работ в журналах списка ВАК, 8 — в материалах международных и российских конференций.

Гранты. 10-04-00288-а РФФИ Сигнальный механизм адаптивного феномена индуцированного опиоидами

11-04-16115-моб_з_рос Участие в работе VI Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция»

11-04-98004-р_сибирь_а Адаптивиый феномен, индуцированный опиоидами: рецепторная природа и сигнальный механизм

12-04-91152-ГФЕН_а Молекулярные механизмы адаптационного феномена, вызванного хронической гипоксией

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям д.б.н. Т.В. Ласуковой и д.м.н. Д.В. Рыжковой, а также профессору Л.Н. Маслову, с.н.с. Н.В. Нарыжной, член-корр. РАМН Лишманову Ю.Б. за неоценимую помощь при работе над диссертационной работой.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы кардиопротскторного эффекта гипоксии

Кардиопротекторный эффект адаптации к гипоксии был впервые открыт в 1958 году чешскими исследователями, которые показали, что сократительная активность правого желудочка изолированного миокарда крыс, пребывавших в условиях симулированной высокогорной гипоксии, соответствующей высоте 7000 м над уровнем моря, лучше восстанавливается после воздействия аноксии, чем у неадаптированных животных [Kopecky М., 1958]. Позднее этим же коллективом ученых был обнаружен факт повышения устойчивости миокарда адаптированных крыс к ишемическому повреждению [Роира, О. 1966]. Следом было установлено, что сходный защитный эффект может быть достигнут относительно более короткими эпизодами гипобарической гипоксии по 4 - 6 ч в день в течение 24 - 42 дней [Meerson F.Z. 1973]. Кроме того, был выявлен антиаритмический эффект курса прерывист�