Молекулярные механизмы регуляции синтеза белка при мышечной атрофии: моделируемая гравитационная разгрузка и хроническая алкогольная миопатия

Лысенко, Евгений Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции синтеза белка при мышечной атрофии: моделируемая гравитационная разгрузка и хроническая алкогольная миопатия
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции синтеза белка при мышечной атрофии: моделируемая гравитационная разгрузка и хроническая алкогольная миопатия"

На правах рукописи

ЛЫСЕНКО Евгений Алексеевич

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА БЕЛКА ПРИ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ: МОДЕЛИРУЕМАЯ ГРАВИТАЦИОННАЯ РАЗГРУЗКА И ХРОНИЧЕСКАЯ АЛКОГОЛЬНАЯ МИОПАТИЯ

03.03.01 - физиология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

' 1 СЕН 2011

Москва-2011

4852481

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации — Институте медико-биологических проблем РАН

на

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук Тарасова Ольга Сергеевна

Доктор медицинских наук, профессор Маевский Евгений Ильич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится /Уи^сЛ^Л^ 11 г. в £_ часов заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации — Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д.76-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации — Институте медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан «/•/» й^Ь^СУб-2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М^ М.А. Ленинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Атрофия мышц наблюдается при многочисленных заболеваниях, связанных с нарушением белкового метаболизма, при гипокинезии, вызванной необходимостью соблюдать длительный постельный режим, а также во время космического полета. Результатом атрофических изменений мышц является снижение их функциональных возможностей. Известно, что белок является не только строительным элементом клетки, он также обеспечивает основную функцшо мышцы - сокращение. Поддержание или изменение мышечной массы осуществляется за счет изменения соотношения скоростей синтеза и распада белка. Интенсивность „ специфичность этих процессов регулируется с помощью многочисленных сигнальных механизмов, результатом взаимодействия которых является формирование качественного и количественного белкового состава мышечного волокна.

Как правило, причиной развитая ¿трофических изменений в мышечной пани является уменьшение скоросш синтеза белка, и увеличение скорости его распада. Подобное представление основывается на многочисленных свидетельствах разнонаправленной регуляции этих процессов. И действительно, активация систем, положительно влияющих на скорость синтеза белка, как правило, приводит к подавлению акшвносга сигнальных каскадов, запускающих катаболические процессы, и наоборот. Однако, существуют примеры, нарушающие данную закономерность. Так, при моделировании гравитационной разгрузки и при хронической алкогольной миопатии наблюдается уменьшение скорости синтеза белка. И, если в первом случае уменьшение скорости синтеза белка играет ключевую роль в развитии атрофии при коротких сроках воздействия, то при хронической алкогольной миопатии оно практически полностью определяет течение заболевания. Исходя из вышесказанного, представляет интерес сравнение механизмов развития атрофии при моделирований гравитационной разгрузки и при хронической алкогольной миопатии.

Известным последствием гравитационной разгрузки (в частности, космического полета) как человека, так и животных является потеря массы мышц, особенно тех, которые участвуют в поддержании позы тела в условиях земной гравитации [Черепахин М.А. И др., 1973; Какурин Л.И., 1964; Португалов В.В. И др., 1976; Shenkman B.S. et al„ 1994]. Совокупность изменений в поперечнополосатой мышце, ксгорые вызывает гравитационная разгрузка, принято называть гипогравитационным мышечным синдромом [Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004]. Для детального исследования влияния гравитационной разгрузки на организм человека и животных используются наземные модели, повторяющие эффекты невесомости. Одной из таких моделей является антиортосташческое вывешивание грызунов [Kovikov V.E., Пут' Е.А., 1981; Morey-Holton

E.R., Globus R.K., 2002]. Антиортосгатическое вывешивание крыс приводит к развитию атрофии мышц задних конечностей, наиболее заметны эти изменения в волокнах камбаловидной мышцы [Ohira Y. et al., 1992]. Известно, что вывешивание приводит к снижению скорости синтеза белка уже после коротких сроков воздействия [Loughna P. et al., 1986; Thomason D.B., 1989]. Точный механизм, приводящий к уменьшению скорости синтеза белка во время гравитационной разгрузки, ни у человека, ни у животных в настоящий момент не установлен. Кроме того, данные о состоянии сигнальных систем не отражают динамику развития процесса, на их основе невозможно сформировать целостное представление о механизмах регуляции синтеза белка во время разгрузки.

Пассивное растяжение камбаловидной мышцы, применяемое на фоне антиорто статического вывешивания, предотвращает развитие в ней атрофических изменений [Goldspink D.F., 1977; Loughna P. et al., 1986]. Кроме того известно, что при применении пассивного растяжения на фоне трехсуточного вывешивания в мышце увеличивается скорость синтеза белка [Loughna P. et al., 1986]. Согласно данным Hornberger с соавторами [Homberger T.A., Chien S., 2006]одним из триггеров, воспринимающих механический сигнал является белковый комплекс mTORCl . Однако, до сих пор не была проведена оценка активности этой системы во время пассивного растяжения камбаловидной мышцы, применяемого на фоне ангиортостатического вывешивания задних конечностей.

Результатом длительного и чрезмерного потребления алкоголя является развитее атрофии мышц. В отличие от функциональной разгрузки при алкогольной миопатии нарушения развиваются в волокнах, экспрессирующих тяжелые цепи миозина II типа. Причем во время алкогольной интоксикации в первую очередь уменьшается скорость синтеза белка, тогда как скорость распада белка остается неизменной [Lang С.Н. et al., 2000]. Ряд работ по исследованию причин развития алкогольной миопатии был проведен с использованием модели хронического алкоголизирования животных. Было, в частности, показано, что причиной уменьшения скорости синтеза белка как при острой алкогольной интоксикации, так и при хроническом потреблении спирта является снижение эффективности инициации трансляции, тогда как скорость элонгации трансляции уменьшается только после сравнительно более длительного периода потребления этанола [Lang С.Н. et al., 2000; Lang С.Н. et al., 1999]. Тем не менее, не проводился анализ состояния систем регуляции синтеза белка при хронической алкогольной миопатии в мышцах человека. А учитывая тот факт, что у людей встречаются гораздо более экстремальные случаи развития алкогольной миопатии, исследование процессов регуляции синтеза белка у таких пациентов может позволить выявить ранее не известные проявления заболевания.

Восстановление нормальных функциональных возможностей скелетных мышц у

пациентов с проявлениями хронической алкогольной мииипи занимает от 3 месяцев до года [Martin F. et al., 1985; Preedy V.R. et al., 2001]. Понимание механизмов развития и течения заболевания могло бы способствовать разработке методов, ускоряющих восстановление функциональных возможностей организма.

Цель работы состояла в анализе молекулярных механизмов рефляции синтеза белка при мышечной атрофии, вызванной моделируемой гравитационной разгрузкой или длительным потреблением этанола.

Задачи работы:

1. Исследовать динамику изменения уровня экспресии инсулиноподобного ростового

фактора -1 (IGF-I) в печени и камбаловидной мышце крыс во время антиортостатического вывешивания.

2. Исследовать динамику изменения активности сигнальных каскадов, ответственных за регуляцию инициации (Akt/mTOR и MEK/Erk) и элонгации (eEF2) трансляции, в камбаловидной мышце крыс во время антиортостатического вывешивания.

3. Исследовать активность mTOR системы по уровню фосфорилирования ее субстрата p70S6k при пассивном растяжении камбаловидной мышцы крыс на фоне антиортостатического вывешивания.

4. Определить содержание инсулиноподобного ростового фактора -1 (IGF-I) в крови и активность IGF-I-зависимых сигнальных каскадов (Akt/mTOR и MEK/Erk) в латеральной головке четырехглавой мышце бедра пациентов с различной степенью выраженности симптомов хронической алкогольной миопатии.

5. Определить содержание инсулиноподобного ростового фактора -1 (IGF-I) в крови и активность IGF-I-зависимых сигнальных каскадов (Akt/mTOR и MEK/Erk) в медиальной головке икроножной мышцы крыс, длительное время потреблявших этанол.

6. Оценить возможное^ применения аминокислотных пищевых добавок или механозавиошого ростового фактора (MGF) для ускорения процесса восстановления мьплц животных, длительное время потреблявших этанол.

Научная новизна работы:

1. Впервые проанализирована динамика экспрессии IGF-I в печени крыс во время аншортостатаческого вывешивания, характеризующаяся прогрессивным снижением концентрации мРНК IGF-I.

2. Впервые проанализирована динамика изменения активности киназ S6 белка рибосом (p70S6k и р90 RSK) в волокнах камбаловидной мышцы крыс во время антиортостатического вывешивания. Показано, что снижение тотального содержания и акшвности P70S6k наблкдается лишь после 14 суток воздействия, а р90 RSK даже демонстрирует повышение

активности после 7 суток разгрузки.

3. Впервые обнаружено изменение активности киназ Б6 белка рибосом (рУОЭбк, Р90 МК) в латеральной головке четырехглавой мышце бедра пациентов с различной степенью выраженное™ симптомов хронической алкогольной миопатии.

4. Впервые показано, чга снижение активности киназ Б6 белка рибосом (рУОБбк, р90 К5К) в волокнах медиальной головки икроножной мышцы крыс, восстанавливавшихся в течение месяца после длительного периода алкоголизации, может быть предотвращено введением соответственно аминокислотных пищевых добавок либо механозавишмого

ростового фактора (МСР).

Научно-практическая значимость

Полученные результаты способствуют лучшему понимание механизмов регуляции синтеза белка в постуральной мышце млекопитающих в условиях травитационной разгрузки, разгрузки в сочетании с пассивным растяжением (моделью эксцентрической нагрузки) и разгрузки в сочетании с применением Ь-арпшив. Исследование ростовых процессов в постуральной мышце имеет большое практическое значение для оценки эффективности мероприятий, направленных на профилактику атрофии мышц, в том числе на предотвращение негативного влияния на них невесомости.

Проведенный анализ механизмов регуляции синтеза белка во время хронической алкогольной миопатии способпвует лучшему пониманию течения заболевания. Кроме того, применение аминокислотных пищевых добавок или механозавишмого ростового фактора (МОЕ) в период восстановления может стать эффективным методом, способствующими скорейшему восстановлению функциональных возможностей мышц пациентов с симптомами хронической алкогольной миопатии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Уменьшение скорости синтеза белка на ранних сроках функциональной разгрузки (3 и 7 суток) вызвано снижением эффективности элонгации трансляции, которое, в свою очередь, вызвано инактивацией фактора элонгации трансляции еЕР2.

2. Уменьшение активности систем регуляции синтеза белка (Ак1/тТОК и МЕК/Егк сигнальных каскадов) происходит до морфологических изменений волокон четырехглавой мышцы бедра пациентов с признаками хронической алкогольной миопатии.

3. Применение аминокислотных пищевых добавок способствует активации тТСЖ системы и восстановлению площади поперечного сечения быстрых волокон медиальной головки икроножной мышцы животных, восстанавливающихся после длительного периода алкоголизации.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 14 публикациях в научных журналах

и сборниках конференций, из них 4 в ведущих росшйских рецензируема журналах, входящих в Перечень ВАК.

Апробация работы. Основные результаты были доложены „а X «Конференции молодых ученых, специалистов и счетов», „освященной дню шсмонавтики (Москва, 19 апреля 20П года, С.44); на IV Всероссийской с международным участием школе-конференции по физшлопш мышц и мышечной деятельности (Москва, 1-4 февраля 2011 года, С.28); на XXXIX Европейской Мышечной конференции (Падуя, Италия 11-15 сеншбря 2010 года, С. 115).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ-ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол №2 от 27 мая 2011 г.).

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», грантов РФФИ№№ 07-04-00763-а, 08-04-01557-а и 10-04-00504-а.

Структура диссертации. Работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, а также выводы. Диссертационная работа изложена на 131 странице, содержит 33 рисунка] 3 таблицы и список цитированной литературы из 232 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Организация экспериментов

Антиортосгатическое вывешивание различной продолжительное™. Для

моделирования навигационной разгрузки применялся метод аншортосгатического вывешивания по Новикову - Ильину [Novikov V.E., Ilyin Е.А., 1981]. Самцы крыс породы Висгар весом 180-200 грамм были разделены на 4 группы (по 7 животных в каждой): интактный контроль (С), 3-суточное вывешивание (HS3), 7-сутовдое вывешивание (HS7) и 14-суточное вывешивание (HS14). После окончания эксперимента у животных под авертновым наркозом (в среднем 2 мл. 2.5% авертина внутрибрюшинно на животное весом 200 г.)(100% авертин: 10 г. 2,2,2-трибромоэтанол и 10 мл. Tert-амиловоп) спирта) отбиралась кровь из почечной вены, выделялась печень и камбаловидная мышца.

Пассивное растяжение камбаловидной мышцы на фоне атиортосгатического вывешивания. Применение специфического ингибигера серин'треошшовой протеишшназь, mTOR - рапамицина. Живошым под авертановьщ наркозом на голеностоп накладьвалась гипсовая повязка таким образом, чтобы между голенью и стопой был острый угол. Для определения вклада mTOR системы в поддержание мышечной массы во время разгрузки применялся специфический блокатор этой системы - рапамицин. За 6 дней до начала вывешивания животные получали рапамицин в виде внутрибрюшинных

инъекций в дозе 5 мг/кг массы тела. Затем крысы были вывешены с иммобилизацией задних конечностей. В течение всего периода вывешивания животным вводили внутрибрюшинно

рапамицин в дозе 1,5 мг на килограмм массы тела.

28 самцов крыс породы Висгар весом 200-220 грамм были разделены на 4 группы по 7 животных в каждой: интакшый контроль (С), вывешивание 14 суток (HS14), вывешивание 14 суток с пассивным растяжением камбаловидной мышцы (HSS14), вывешивание 14 суток с пассивным растяжением камбаловидной мышцы и введением рапамицша (HSR). После окончания эксперимента под авертиновым наркозом у крыс выделялась камбаловидная мышца, после чего им вводилась вызывающая гибель животного доза наркоза.

Хроническая алкогольная миопатия. Было обследовано 38 пациентов, находившихся на стационарном лечении в клинике нервных болезней Первого МГМУ им. И.М.Сеченова. У всех больных был длительный алкогольный анамнез (10-20 лет). Взятие проб мышечной ткани из латеральной головки четырехглавой мышцы бедра осуществляли методом шщизионной биопсии. Кроме того, были взяты пробы мышечной ткани у 3 здоровых

добровольцев с помощью игольчатой биопсии.

По результатам определения площади поперечного сечения медленных и быстрых волокон, сравнив эти показатели со средними значениями морфометрических показателей здоровых лиц, 15 пациентов были разделены на 3 группы: пациент без морфометрически выявленных атрофических изменений - «О», пациенты с строфическими изменениями волокон II типа - «И», пациенты с атрофическими изменениями волокон I и II типов - «I+II». Три добровольца составили группу контроль - «С».

Перед исследованиями пациенты и добровольцы подписывали информированное согласие на участие в клинико-лабораторных исследованиях. Проводимые исследования были одобрены Комиссией Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по биомедицинской эмке.

Хроническая алкоголизация животных. Методика алкоголизации животных была разработана на основе работ Ch. Lang [Lang С.Н. et al., 2004]. Животные были разделены на 6 групп: «С» - контроль, «А1о> -16 недель алкоголизации, «R» -16 недель алкоголизации и последующее восстановление в течение месяца, «R+AA» - 16 недель алкоголизации и последующее восстановление в течете месяца в сочетании с кормлением аминокислотными пищевыми добавками, «R+Sal» -16 недель алкоголизации и последующее восстановление в течение месяца в сочетании с инъекциями физиологического раствора, «R+MGF» - 16 недель алкоголизации и последующее восстановлен в течение месяца в сочетании с инъекциями механоэависимого ростового фактора (MGF).

Методики обработки биоматериала и анализа данных Определение концентрации инсулнноподобного фатора роста в сыворотке крови

проводили согласно стандартному протоколу непрямого иммуноферментшго анализа Использовались моноклональные первичные антитела против IGF-I (Abeam) и вторичные антитела, коньгогированные с пероксидазой хрена (Santa Cruz).

Определение общего белка в мышечной ткани. Камбаловидную мышцу гомогенизировали в лизирующем буфере (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA ph 7,6) и растворяли 1:1 в 2N NaOH при 37° С в течение 30 минут [Goto К. et а]., 2004]

Концентрации белка в гомогегаге определяли с помощью protein assay kit (Bio Rad Hercules CA) и спектрофотометра "SHIMADZU". По данным колориметрии рассчитываяи процент общего белка в мышце.

Определение сухоп, веса мышцы. Для определения сухого веса мышцы от нее отрезалась часть и взвешивалась. Затем ее помещали в термостат (90"С). Через двое суток ее доставали, взвешивали и снова помещали в термостат. Если еще через сутки meymema* часть мышцы не потеряла в весе, данные фиксировались.

Определение площади поперечного сечения волокон с преобладанием быстрых или медленных изоформ тяжелых цепей миозина. Поперечные срезы мышцы готовились на микротоме криосгаге фирмы Leica Microsystems при температуре -ЖС. Срезы последовательно инкубировались с первичными моноклошльными антителами против "быстрых» или "медленных" изоформ тяжелых цепей миозина NCL-MHCf и NCL-MHCs (Novocastra Laboratories, Великобритания) и вторичными антителами котированными с FITC (ИМТЕК, Россия). Срезы фотографировались с помощью флуоресцентного микроскопа Leica Q500MC (Германия) и фотокамеры Leica DC300, средняя площадь поперечного сечения волокон измерялась с помощью программного обеспечения Leica Qwïn.

PCR в реальном времени. Тотальная РНК выделялась ш m.soleus с помощью набора «RNeasy Micro kit» («Qiagen», Германия) согласно протоколу выделения для тканей, обогащенных соединительнотканными волокнами, с некоторыми модификациями. кДНК синтезировали набором с обратной транскрилтазой MMLV («Сингол», Россия). Полимерная цепная реакция (ПЦР) проводилась в амплификаторе iQ5 ("Bio-Rad", США) с набором, содержащим флуоресцентный краситель SYBR Green I и кшъюшрованную с антителами Taq-полимеразу для «горячего старта» («Сингол», Россия). Определение количества мРНК IGF-I относительно количества мРНК референснош гена ß-актина было выполнено методом 2—, Анализ продуктов амплификации проводился путем плавления в амплификаторе от 72°С до 95°С с шагом 0,5°С и последующим электрофорезом аликвоты образца в 2% агарозном геле.

Вестерн блох. Замороженная мышца измельчалась с помощью микротома-криостата фирмы Leica Microsystems (Германия) на срезы толщиной 20 микрометров, которые затем заливались холодным лизирующим буфером (TrisHCl (рН=8,0) 50 mM; NaCl 150 mM; SDS 0,1%; Triton Х-100 0,1%; EDTA 10 mM; ß-glycerophosphat 50 Mm; EGTA 5 mM; NaF 50 mM; Na3V04 lmM; Aprotinin 20pg/ml; Leupeptin 50pg/ml; Pepstatin 20pg/ml; PMSF lmM). Образцы гомогенизировались на холоде с помощью гомогенизатора «Хепох» и откручивались в центрифуге с охлаждением в течение 10 мин при 10000g <+4°С). Содержание белка в лизатах определялось с помощью бицинханинового метода. Предварительно готовилась смесь из 1 ml реагента А рН=11,25 (0,1% бицинхониновая кислота; 2% Na2CCh; 0,95% NaHC03; 0,16% калия-натрия тартрат тетрапздрат; 0,4% NaOH; Н20) и 80 ni реагента В (l%CuSO<). К 1 ml приготовленной смеси добавлялось по 50 ul предварительно разведенных проб, либо стандартов (бычий сывороточный альбумин). Пробирки тщательно перемешивались и инкубировались в термостате в течение 30 минут при 60°С. После инкубации пробирки охлаждались, оптическая плотность измерялась на спектрофотометре при длинне волны 562 ran. Конценрация белка в пробах рассчитывалась по калибровочной кривой. Перед использованием лизаш смешивали с буфером Laemly (Tris-HCl рН=6,8 50mM; SDS 2%; бромфеноловый синий 0,1%; глицерин 10%; Н20). Равное количество белка (10-20М) наносилось в лунки для последующего разделения с помощью SDS-PAAG электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле) [Brette W.N., 1981]. Белок переносился на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad). Мембрана последовательно инкубировалась в 5% растворе сухого обезжиренного молока, в первичных и вторичных, коньюгированных с пероксидазой хрена, антителах. Каждый этап сопровождался отмывкой в PBS-TWEEN. Интенсивность свечения метки фиксировали на Medical X-ray film. Полученные изображения сканировали, обработка изображений производилась с помощью программы ImageJ.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных производилась с помощью прграммы OpenOffice.org Cale, находящейся в свободном доступе. Достоверность отличий между группами определялась с помощью U-критерия Манна-Уитни. В эксперименте с пассивным растяжением камбаловидной мышцы и введением рапамицина применялся критерий Данна.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление механизмов снижения скорости синтеза белка во время антиортостатического вывешивания различной продолжительности.

Для того, чтобы продемонстрировать эффект вывешивания на камбаловидную мышцу крыс, измерялась ее масса и «сухой вес».

0,00045

g 0,00040

^ 0.00035 те

u 0,00030-« S 0,00025-' 3 0,00020 Э 0,00015 S 0,00010 2 0,00005 ; 2 0.00000

I * т

-т- * т

ifpj

HS3 HS7 HS14

Риса Отношение массы камбаловидной мышцы к массе тепа животного

; — _ вывешивание трое суток; Ш7 - вывешивание семь суток, Нс>14 вывешивание четырнадцать суток

Данные представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0 25-0 75) - оостоверные отличия от контроля (р<0,05)

В нашем эксперименте отношение массы камбаловидной мышцы к массе тела живогаого было достоверно снижено уже после 3 суток вывешивания. После 7 и 14 суток этот параметр был снижен вдвое по сравнению с контролем (Рисунок 1).

I I

£ о

120 100 80 60 40

20 О

с HS3 HS7 HS14

Рис.2. Содержание белка в камбаловидной мышце. С — интактный контроль; HS3 ~ вывешивание трое суток- HS7 — вывешивание семь суток; HS14 - вывешивание четырнадцать суток Данные представлены в виде медианы и интерквартильной широты (035-0 75) * - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Было обнаружено достоверное снижение содержание белка в мышце после 7 и 14 суток вывешивания, тогда как после 3 суток вывешивания наблюдалась тенденция к снижению этого параметра (Рисунок 2). Исходя из этих данных, можно заключить, что снижение массы камбаловидной мышцы во время вывешивания происходило из-за снижения содержания основного строительного и функционального элемента кле-жи - белка. И, если снижение мышечной массы на третьи сутки функциональной разгрузки еще можно объяснить потерей воды, то при более продолжительном воздействии изменение содержания белка в мышце

пропорционально изменению ее веса. Ранее также сообщалось, что после 7-ми и 14-ти дней вывешивания снижение содержания белка в камбаловидной мышце пропорционально снижению содержания воды [ОЫга, 2002], а при коротком воздействии, потеря воды вносит

больший вклад в снижение массы мышцы [Мотта, 2007].

Очевидно, чм снижение содержания белка в мышце являлось следствием снижения скорости его синтеза или увеличения скорости его распада. Известно, что снижение синтеза миофибриллярных белков в т. зо1еш наблюдается при ашиортостатпческом вывешивании крыс и одностороннем вывешивании конечное™ у людей [Иискщг Ш « а1„ 2004; «па Р. * а1., 1986; СшбЙат Т. <* а1., 2010]. В частности, Loughna с соавторами в 1986 г. показали, что рке на третьи сутки вывешивания происходит снижение скорости синтеза белка на 21% [Ьои§1та Р. й а1., 1986]. Это вполне согласуется с нашими данными, если считать, что

результат подобного снижения проявился к 7 суткам разгрузки.

Инсулиноподобный ростовой фактор 1 (КЙЧ) является важным системным регулятором процессов анаболизма и катаболизма в мышечном волокне. Анализ уровня его экспрессии в камбаловидной мышце и печени был важным этапом оценки вклада системных механизмов в регулщию процесса оттаза белка при функциональной разгрузке (Рисуиок 3).

120 100'

S 80

О а

60 40 ;

20 ;

Рис 3. Уровень экспрессии ICF-I в m.soleus (А) и печени (Б).

С - интактный контроль; HS3 - вывешивание трое суток; HS7 - вывешивание семь суток - HS14 — вывешивание четырнадцать суток.

Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. * - достоверные отличия от контроля (р<0,0ь)

В камбаловидной мышце уровень экспрессии ЮБ-1 резко снижался уже после 3 суток вывешивания, после 7 суток он оставался сниженным, а после 14 суток воздействия был снижен недостоверно. В печени крыс происходило прогрессивное снижение уровня экспрессии 1GF-I, однако после трех суток вывешивания эти изменения еще не отличались от

контроля.

Поскольку печень является основным источником IGF-I в системном кровотоке в покое

[LeRoith D. et al„ 1992], а его экспрессия б камбаловидной мышце может влиять на содержание ростового фактора в межклеточной жидкости можно было бы предположить, что подобные изменения приводили к снижению содержания IGF-I в крови и межклеточной жидкости камбаловидной мышцы.

И действительно, ранее было показано, что содержание IGF-I в плазме крови достоверно снижается после 14 дней космического полета [Adams, 2000]. Кроме того сотрудниками нашей лаборатории было показано, чш после 14 дней антиортостатического вывешивания крыс происходило достоверное снижение IGF-I в сыворотке крови [Литвинова КС. и др., 2007].

Киназа S6 белка рибосом p70S6k является одним из ключевых регуляторов процесса инициации И элонгации трансляции. Методом электрофореза с последующим вестерн блоттингом проводился анализ ее тотального содержания и уровня фосфоршшровакия по сайту Т389 (Рисунок 4). Анализировалось фосфорилирование именно этого сайта, так как этот показатель максимально коррелирует с активностью фермента [Karlsson Н.К. et al„ 2004; Blomstrand Е. et al„ 2006].

ЯЯШJiPlfl

I* AI

120 « 100

I 80

S i о

5 40 о

HS14

!тшт шт t mm r

■ВЕЯВ 4 V ZzSK. p

" I -f- rt- pf ★ В

4 ш ■ dpi

i i if Г- Щ

L -й: i Шя Ли

С HS3 HS7 HS14

' '--------- ^ V улл-улуушшуиаипим {£}у р/и^ок.

С ~ интактный контроль; Н53 - вывешивание трое суток; НБ7 ~ вывешивание семь суток; Н514 — вывешивание четырнадцать (уток.

Данные представлены в виде медианы и интерквартильнай широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

В наших исследованиях активность р7036к не менялась после 3 и 7, и снижалась только после 14 суток вывешивания. Кроме того, соотношение фосфорилированной и тотальной форм р70Э6к (степень фосфорилирования) не менялось при различных сроках воздействия, что может свидетельствовать о том, что снижение активности фермента произошло из-за снижения его тотального содержания, а не из-за снижения активности сигнального каскада. Эти данные согласуются с исследованиями, в которых было показано, что активность р7056к

не меняется после 7 и 10 суток вывешивания и достоверно снижается только после 14 суток воздействия [Chüds Т.Е. et al., 2003; Gwag T. et al., 2009; Sugiura T. et al., 2005]. Однако, в работах Homberger и DuPont с соавторами наблюдалась противоположная тенденция. Активность P70S6K снижалась после 12 часов, 7ми и 14™ суток вывешивания, а также снижался уровень фосфорилирования mTOR и Akt [Homberger Т.А. et al., 2001; Dupont E. et

al., 2011; Bajotto G. et al., 2011].

Существует альтернативный путь активации синтеза белка, эффектором которого

является киназа S6 белка рибосом Р90 RSK. Так как ее функции и функции p70S6k во многом перекрываются, было сделано предположение, что для поддержания нормальной эффективности трансляции необходимо нормальное функционирование обоих ферментов. В таком случае снижение акшвноста Р90 RSK после 3-суточного вывешивания объясняло бы снижение скорости синтеза белка.

—- ■j o' ; ■ : ^ ? > '■'.■-".f.-j:

"Î"

HS14

HS3 HS7

HS14

Рис 5 Общее содержание (А) и уровень фосфорилирования р90 Я5К.

С - штатный контроль; НХ - вывешивание трое суток; Ж7 - вывешивание семь

суток; №14 — вывешивание четырнадцать суток. ^

Данные представлены в виде медианы и интерквартилънои широты (и,2Ь-и,/Ь).

* - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Общее содержание и уровень фосфорилирования Р90 RSK не отличались от контроля после 3 и 14 суток вывешивания, а после 7 суток превышали его (Рисунок 5). Тенденции этих параметров были схожими, о чем свидетельствует тот факт, что отношение содержания фосфорилированной формы киефосфорилированнои не менялось во всех группах животных.

Субстратом рибосомальных киназ является зб белок рибосом. О том, к каким результатам привели изменения активности рибосомальных киназ, можно было судить по степени фосфорилирования четырех основных сайтов вб белка (Рисунок 6).

HS7 HS14

Рис.6. Уровен фосфорипирования s6 белка рибосом в положениях 240/244 (А) и 235/236 СВ)

Данные представлены в виде медианы и интерквартилъной широты (0,25-0 75) - оостоверные отличия от контроля (р<0,05)

Никаких изменений уровня фосформирования s6 белка рибосом не быяо выявлено.

Таким образом, исходя из наших данных, акшвность киназ S6 белка рибосом не снижалась на ранних сроках разгрузки. Тогда как после более длительного периода функциональной разгрузки (14 суток) снижение эффективности трансляции может быть вызвано снижением активности mTOR и ее эффектора p70S6k.

Фактором, который во многом определяет эффективность элонгации транслщии, является eEF2. В работе Rose с соавторами было показано, что увеличение [Си*]' происходящее в частности во время тренировки, приводит к инактивации eEF2 посредством активации специфической кальмодулинкиназы eEF2K [Rose AJ. et al„ 2009]. Исходя из этого, было сделано следующее предположение: повышение уровня [Са21 во время функциональной разгрузки, как и во время тренировки, приводит к инактивации элонгационного фактора eEF2 (фосфорилированию в положении Т56) и снижению эффективности элонгации трансляции. А поскольку увеличение концентрации [Са*] происходит уже на в-гсрые су™ вывешивания [Ingals С.Р. et al„ 2001], этот механизм может лежать в основе снижения скорости синтеза белка на 21% после трехсуточного вывешивания.

* N

s | ;

HS3 HS7

HS14

Рис.7, общее содержание eEF2K (А) и уровень Ф0С^и^а^/ЕР^вешивате С - интактный контроль; HS3 - вывешивание трое суток, HS7 - вывешивание семь суток; HS14 - вывешивание четырнадцать суток. ^ Данные представлены в виде лаканы и интерквартилънои широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Общее содержание eEF2K после 3 суток вывешивания еще не отличалось от контроля, а после 7 и 14 - существенно превышало его уровень. Фосфорилирование eEF2 по двум важнейшим сайтам, определяющим ен, активность, было существенно повышено после всех сроком воздействия (Рисунок 7). Несмотря на то, что после трех суток вывешивания данные по содержанию фермера и уровню фосфорштирования его субстрата отличаются, в целом

тенденции этих двух параметров схожи.

Таким образом, снижение скоросм синтеза белка на ранних срока* функционально« разгрузки вероятно связано со снижением эффективности трансляции, вызванным снижением активности элонгационного фактора eEF2. Инактивация которого, в свою очередь, происходила из-за повышения концентрации ионов [Са2+] в волокне.

Пассивное растяжение камбаловидной мышцы „а фоне антиортостахического вывешивания. Применение специфического ингибитора тТОВ системы рапамицина.

Ранее многами авторами, в том числе сотрудниками нашей лаборатории было показано, та пассивное растяжение на фоне функциональной разгрузки приводит к поддержанию массы камбаловидной мьтпщы и площади поперечного сечения волокон, увеличению скорое™ синтеза белка [Loughna P. et al, 1986; Baewer D.V. et al., 2004; Kandarian S.C., Stevenson EJ„ 2002; Miyazaki M. et al„ 2008; Таракина M.B. и др., 2008]. Одним из возможных механизмов действия пассивного растяжения может быть активация mTOR системы. Как известно одним из стимулов этой системы ™ся механическая нагрузка [Hornberger Т.А., Chien S., 2006].

(С

5 с

о «

6 о

ЧА

НЭ14 Нвэ НЭР?

120 100 80 60 40 20 1 0

С Н314 НЭЗ НвГ?

Рис.8. Общее содержание (А) и уровень фосфорилирования (В) р70Б6к С ~ штактный контроль; НБ14 - вывешивание четырнадцать суток ■ НБЭ -

4 суаГ~ " № ^ ~ —' ■

Данные представлены в виде медианы и интерквартильнои широты ГО 25-0 75)

оостоверные отличия от контроля (р<0,05)

# - достоверные отличия от НвБ (р<0,05)

При исследовании уровня фосфорилирования субстрата тТСЖ (р7056к) было показано, что при применении пассивного растяжения на фоне разгрузки данный параметр бьи достоверно снижен в сравнении с контрольной группой, несмотря на то, что общее содержание кишзы находилось на уровне контроля (Рисунок 8). Если предположить, что снижение уровня фосфорилироватя рТОвбк во время вывешивания было вызвано активацией протеолиза в волокне и снижением общего содержания фермента, то эффект поддержания его общего уровня при применении пассивного растяжения косвенно указывает на защитные механизмы данного воздействия. Поэтому возможным механизмом поддержания мышечной массы при применении пассивного растяжения на фоне разгрузки в течение 14 суток является подавление протеолиза в мышечном волокне.

Применение рапамицина не способствовало изменению уровня фосфорилирования р70Б6к относительно группы, в которой пассивное растяжение хамбаловидной мышцы применялось на фоне вывешивания. Уровень фосфорилирования фермента был достоверно снижен относительно контрольной группы. Таким образом тот факт, что введение рапамицина не предотвращало эффект пассивного растяжения является следствием подавленного состояние тТСЖ системы в отсутствие ингибитора.

Исследование механизмов развития атрофии мышц у людей, длительное время потреблявших алкоголь.

На основании полученных при морфометрии данных все пациенты были разделены на две группы. В первую группу с морфологически подтверщенной атрофией мышечных

волокон вошли 10 мужчин, средний возраст которых составил 45,6 лет, длительность приема алкоголя -17,1 лет, среднее количество потребляемого этанола в сутки -185,5 мл.

Вторую группу составили пациенты без морфологически подтвержденной атрофии мышечных волокон. В неё вошли 6 мужчин, средний возраст - 41,2 лет, длительность алкогольной интоксикации составила в среднем 9,6 лет, среднее количество употребляемого

этанола - 200,0 мл/сут.

На основании результатов морфометрии в группе пациентов с атрофией мышечньк

волокон выделены две подгруппы: с атрофией только волокон П типа (53%) и с атрофией

волокон как I, так и II типов (47%) (Рис. 10). Данные подгруппы были сопоставимы по

возрасту и количеству потребляемого этанола в сутки.

При оценке длительности алкогольного анамнеза выявились статистически достоверные различия между группами. Так, в группе пациент без атрофии мышечных волокон длительность алкогольной интоксикации составила 9,6 лет, с селективной атрофией

волокон II типа -15,1 лет, с атрофией обоих типов - 20,7 лет.

Оценка концентрации IGF-I в плазме крови выявила достоверные различия между пациентами с морфологически подтвержденной атрофией мышечных волокон (121,8 нг/мл) и группой контроля (216 нг/мл) (Рисунок 9).

1,300 S.

I 250 а.

« 200 § ISO

J 100 £

§. 50

Контоль Без атрофии С атрофией

Рис.9. Концентрация инсулинопоЗобного ростового фактора I (IGF-Цвмазме крови. Данные представлены в виде медианы и интерквартильнои широты (0,25-и, /Ь). * - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Наши данные, свидетельствующие о снижении уровня IGF-1 у пациентов, согласуются с результатами, полученными в экспериментальных исследованиях на животных [Kumat V. et al„ 2002; Lang C.H. et al., 20041. Не исключено, что снижение уровня IGF-I у пациентов с хронической алкогольной интоксикацией может быть связано с той или иной степенью поражения печеночных ианей. Ведь основным источником циркулирующего IGF-I являются

клетки печени.

Анализировались два iGF-I-зависимых сигнальных каскада, конечными эффекторами которых являются киназы S6 бели рибосом p70S6k (Рисунок 10) и р90 RSK (Рисунок 11).

120

I 100 Ч

о £

§ е

80 60 40 20 О

_£

120

§ 100 säa

о ««и

■ РР?

о.

Е о

г-

80 60;

40 |

20 | I 0'

БА

1+11

Рис.10. Оощее содержание (А) и уровень фосфорилирования (В)р7036к С - контроль (здоровые добровольцы); БА - Пациенты без выявленных

^■ТтГХитЧСГКи ПР>Ша№*МРОФЩ " ~пациенты с атрофией волокон II типа, 141 - пациенты с атрофией волокон I и II типов

Данные представлены в виде медианы и интерквартшъной широты (0 25-0 75) ' - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Общее содержание и уровень фосфорилирования р/ОЭбк были достоверно снижены во всех группах пациентов не зависимо от степени развития атрофических изменений.

8 с

S £

120 100 80 60 40 : 20 . 0

■■ I -

Iii

Ф Ш

- 1 $

| Ш

ба

Ml с БА I!

Puc.ll. Общее содержание (А) и уровень фосфорилирования (В) р90 RSK С-контроль (здоровые добровольцы); БА-Пациенты без выявленных имщногистохишчески признаков атрофии; II - пациенты с атрофией волокон II 1 +11 — пациенты с атрофией волокон lull типов.

Данные представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0 25-0 75) - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

120 100 -{ 80 !

60 i

40 -j 20; 0

типа;

Общее содержание и уровень фосформирования Р90 МК были также достоверно снижены во всех группах кроме группы с атрофией волокон второго типа. Тем не менее

общая тенденция к снижению очевидна.

Ранее в экспериментах на хронически алкоголизированных животных было показано, что КН-мвисимые. выше лежащие по отношению к тТОЯ компоненты этого сигнального каскада не затронуты влиянием алкогольной интоксикации. Соответственно предполагается, что изменения р7036к при хроническом алкоголизме обусловлены прямым действием этанола на шТОЯ. Естественно предположить, что в настоящем исследовании снижение общего содержания и фосфорилированной формы Р70Б6К у обследованных пациентов связано с действием аналогичного патогенетического механизма. Что же касается изменений рЭОНЭК, то эта киназа Б6 белка рибосом является компонентом другого сигнального каскада, запускаемого ЮЫ с помощью иных механизмов, до сих пор неисследованных применительно к алкогольной миопаши. Поэтому обнаруженные нами впервые изменения этой сигнальной молекулы у пациентов с хронической алкогольной интоксикацией могут быть обусловлены снижением концентрации 1СБ-1 в системном кровотоке.

Хроническая алкоголизация животных.

На модели хронической алкоголизации животных исследовалась возможность применения стимуляторов белкового анаболизма (аминокислоты с разветвленными боковыми цепями - ВСАА, механозависимьш ростовой фактор - МСБ) для устранения негативных эффектов хронической интоксикации в период восстановления животных после периода алкоголизации в условиях полного исключения этанола из рациона питания. Поскольку восстановительный период у пациентов клиники МГМУ ш. И.М. Сеченова составлял от 3 месяцев до года, учитывая межвидовые различия, было сделано предположение, что для возникновения положительных изменений в мышце животных, длительное время потреблявших алкоголь, достаточно будет одного месяца восстановительного периода. Также предполагалось, что при таком длительном восстановительном периоде негативные эффекты первоначального острого периода, так называемого абстинентного синдрома, не окажут существенного влияния на итоговые результаты.

После окончания периода алкоголизации производилась оценка потребления этанола

этот показатель составил в среднем 25 г*кг веса-депь". Причем в первые 6 недель

эксперимента потребление этанола в группах увеличивалось, после чеш этот показатель постепенно снижался (Рис. 12).

л АО

2 4 6 8 10 12 14 16 18 время (недели)

Рис.12. Потребление этанола животными в период алкоголизации

Данные представлены в виде медианы и штерквартилъной широты (0,25-0,75).

Проводилась оценка площади поперечного сечения волокон медиальной головки икроножной мышцы с «быстрым» И «медленным» миозиновым фенотипом (Рисунок 13).

5000-i 4500 4000 3500 < 3000 I 250020001 I ¿5 15оо ;

U 1000 500 j

о-!

ГХ1

□ Fast □ Slow

Ál * i

rfl

Ale

R R+AA R+Sal R+MGF

Рис.13. Площадь поперечного сечения волокон.

С - контроль; Ale - алкоголизация; R - восстановление; R+AA— восстановление с

раствора, R+MGF — восстановление с инъекциями MGF.

Данные представлены в виде медианы и интеркварттьной широты (0 25-0 75)

-достоверные отличия от контроля (р<0,05)

# - достоверные отличия от Ale (р<0,05) Хроническое потребление этанола не влияло на площадь поперечного сечения волокон с тяжелыми цепями миозина I типа, тогда как происходила атрофия волокон, содержащие тяжелые цепи миозина II тапа, после алкоголизации. Восстановление этого параметра наблюдалось в группе, получавшей в период восстановления амшокислошые пищевые добавки. Внутримышечное введение MGF не приводило к подобным изменениям. Это

согласуется с ранее опубликованными данными, свидетельствующими о том, что после алкоголизации происходит снижение площади поперечного сечения «быстрых» волокон, и двухнедельное восстановление в условиях исключения алкоголя из рациона животных не приводило к восстановлению этого параметра [Otis J.S., Guidot D.M., 2010].

0,8 i

0,7 i

в 0.6 J

§ t g.0.5

I 0A •

* 0,3'1 E i ° 0,2 ¡

tfv

0.1

ь т

i'i и

а ■ i ■ 1 !

* "I

□

^-.....r

R R+AA

С Ale

Рис 14 Содержание IGF-I в сыворотке крови.

С- король; Ale - алкоголизация; R - восстановление; R+AA - восстановление с

аминокислотами „ . п, „

Данные представлены в виде медианы и интерквартшънои широты (0,25-0,75).

* - достоверные отличия от Ale (р<0,05)

Для анализа системных механизмов регуляции белкового метаболизма оценивалось содержание IGF-I в сыворотке крови (Рисунок 14). После 16 недель алкоголизации содержание этого ростового фактора не снижалоо, относительно контрольной группы, тогда как после месяца восстановления в условиях исключения алкоголя из рациона происходило снижение этого параметра на 70%. Эти данные не согласуются с работой, в которой было показано снижение IGF-I в плазме крови уже после 6 недель алкоголизации [Lang С.Н. et al-, 2003], однако, потребление этанола в нашем эксперименте было не столь интенсивным.

для анализа клеточных механизмов регуляции синтеза белка оценивалась активность (фосфорилирование) ккназ S6 белка рибосом p70S6knp90 KSK (Рисунок 15).

140

« 120 С; о. ЮО , Е § 80 ¡t • --

Б бо; О |

гя 40 ;

20 -j

0 .

««Г

Ale Alc+R AA+R

120

в £ 100-

1 80 ;

i -

§ 60-,

40!

20 * |

i 0-.~

Ale

R R+AA

Puc.15. Уровень фосфорилирования p70S6k (A) u p90 RSK (B)

Данные представлены в виде медианы и интерквартилъной широты (0 25-0 75) *- достоверное отличие от С (р<0,05) '

# - достоверное отличие от Ale (р<0,05)

Не происходило ожидаемого снижения уровня фосфорилирования p70S6k после периода алкоголизации, тогда как в период восстановления этот параметр снижался, а при восстановлении в сочетании с кормлением аминокислотами наблюдалась тенденция к восстановлению активности фермента. Отсутствие изменения активности p70S6k после 16 недель алкоголизации не согласуется с данными Lang [Lang С.Н. et al.. 2003]. Однако можно предположил,, что на отсутствие изменения этого параметра могло повлиять либо недостаточное потребление этанола, либо снижение его потребления, которое наблюдалось в последние несколько недель эксперимента.

Впервые в случае с алкогольной миопатией анализировался уровень фосфорилирования

другой киназы S6 белка рибосом РЭ0 RSK. Активность этой киназы достоверно снижалась

после периода алкоголизации, а прекращение приема алкоголя приводило к еще большему

снижению параметра. Применение аминокислотных пищевых добавок не приводило к

восстановлению ее акптвности, тогда как внутримышечное введете MGF восстанавливало

уровень фосфорилирования р90 RSK до контрольных значений (Рисунок 16). Стимуляция

киназы S6 белка рибосом, относящейся к MEK/Erk сигнальному каскаду, согласуется с

представлениями о том, что анаболический эффект MGF опосредуется именно этим

сигнальным каскадом [Philippou A. Et al., 2009]. Тем не менее восстановление акшвности рЭО

RSK не привело к восстановлению площади поперечного сечения быстрых волокон m.gastrocnemius.

140 t Г

В! 120 4

g П. 100 -f

i о 80-f

* i

S 60 j

40 ; I

20 4 l

o 4

л ..l.mzjt #

rî"

rti

Ale R+Sal R+MGF

Pue 16 Уровень (расформирования рЭО RSK при введении MGF. С - контроль; Ale - алкоголизация; R+Sal- восстановление с инъекциями физиологического раствора; R+MGF - восстановление с инъекциями MGE Данные представлены в виде медианы и интерквартильнои широты (ü,2>u,/bj.

* - достоверные отличия от контроля (р<0,05)

# - достоверные отличия от R+Sal (р <0,05)

Таким образом, длительное потребление алкоголя оказывало негативное дейсшие на системы регуляции синтеза белка в мышце и развитее атрофии. Исключение зтанола из рациона питания животных приводило к еще более существенным изменениям, что свидетельствует о развитии абстинентного сивдрома на данном этапе эксперимента. Тем не менее, применение различных стимуляторов синтеза белка может ускорить восстановление анаболических процессов в мышце.

ВЫВОДЫ

1. Во время антиортостатического вывешивания различной продолжительности у крыс уменьшается уровень экспрессии системного регулятора синтеза белка инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) в печени (после 7 и 14 суток вывешивания) и камбаловидной мышце

(после 3 и 7 суток вывешивания).

2. Динамика изменения активности и общего содержания киназ S6 белка рибосом (P70S6K p90RSK) не совпадает с динамикой изменения содержания белка в камбаловидной мышце крыс во время аншоргосгатаческого вывешивания различной продолжительности. Причем снижение как уровня фосфорилирования, так и общего содержания p70S6k наблюдается лишь после 14 суток вывешивания, а уровень фосфорилирования и общее содержание P90RSK не снижаются после 3 и 14 и повышаются после 7 суток воздействия.

З.Во время агаиортостатического вывешивания различной продолжительности в камбаловидной мышце крыс происходит увеличение уровня фосфорилирования фактора элонгации трансляции eEF2.

4. При хроническом пассивном растяжении камбаловидной мышцы крыс во время 14-суточного вывешивания активность mTOR системы подавлена, а поддержание массы мышцы осуществляется за счет других механизмов.

5. У людей с морфологически выявленными атрофическими изменениями волокон латеральной головки четырехглавой мышцы бедра, вызванными длительным злоупотреблением алкоголя, происходит уменьшение уровня в крови системного регулятора синтеза белка IGF-I.

6. У людей и животных, длительное время потреблявших алкоголь, треду с уменьшением площади поперечного сечения быстрых волокон происходит уменьшение активности сигнальных систем, ответственных за регуляцию синтеза белка (mTOR, MEK/Erk), независимо от степени проявления агрофических изменений.

7. В течение 30 суток после окончания периода алкоголизации уровень IGF-I в крови и активность ситальных каскадов, активируемых им (mTOR, MEK/Erk) оказывается сниженной. При этом введение аминокислот с разветвленными боковыми цепями (ВСАА) и внутримышечное введение механозависимого ростового фактора (MGF) способствует восстановлению актвности mTOR системы и MEK/Erk сигнального каскада соответственно. Введение аминокислот также способствует восстановлению размеров быстрых волокон.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.А. Лысенко, О.В. Туртикова, Е.В. Качаева, член корреспондетгг РАН И Б Ушаков PA^rm™' • АКТИВНОСТЬ РИБОСОМАЛЬНЫХ КИНАЗ ПРИ ФУНВДИОНАлЗ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ // ДОКЛАДЬ1ФАУ^ТмШЛ™

а 1°;В' Казанцева' Г-А- Маслова, Е.А. Лысенко, O.E. Зиновьева Б С Шенкман Н Н

интоксикации // Ашалыклштическои и экспериментальной неврологии. 2010. T4MV15-19 3 Е.АЛысенко, Ю.В.Казанцева, O.E. Зиновьева, Н.Н.Яхно, Б.С.Шенкман Ютеточвь.е сигнальные механизмы в разв.тши атрофии скелешых мышц Человека пТи хршиесшй алкогольной миопатин // Технологии живых систем 2010 Т 7(8) 38-44 Чюничестй

ЕЛ Лыс111^>Ги°п^,Г'тЛГМКаР0В' АЕ БуГр°Ва- m "Л- Карташкина,

„ ШЕец- Т Л' Немировская. ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ L АРГИНИНА НА

™ 99-mS ФУ"ЩИ0НЛЛШ0Й РАЗГ™ МЫШЦЫ // биЖЖ^

5. Туртикова О.В., Лысенко Е.А. Ростовые процессы в попуралыюй мышце в условиях гравитационной разгрузки и мышечного напряжения „а ее фоне // ^ПкоХеГ^

^SZ^cT"и аудетош>'тосвященная дню KMteL~

6- Туртикова О.В., Лысенко Е.А., Скачков И.В. Эффекты внутримышечного введения рекомбшшггаого механозависимогс фактора роста у крыс // IX «Конф^ре ш к "

тГс72ПЕЦИаЛИСТОВ И С1УДеНТОВ>>' космонавтики. МосЦ lZPcZZ

L„KU„™.™!;;t' ТУР™К0Ва 0 В- Ка'шева Е В- Рибосомальных киназ при

функциональной разгрузке задних конечностей животных различной продолжительности //

IX «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная дню

кпгмпнавтики Москва, 14 апреля 2010 года, С.56.

W.A Туртикова О.В. Негативные эффекты хронической алкоголизации

животно й методы ni предотвращения // X «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная дню космонавтики. Москва, 19 апреля 2011 года, L.44. ^ Шсншап Б С Качаева ЕВ., Лысенко Е.А. Внутриклеточные сигнальные механизмы в процессахгтотравитационной ¿срофяи мышц// XXI Съезд физиологического общества им И П Павлова Калуга, 19-25 сентября 2010 года, С.692.

10' Лшеш'S, Туртикова О.В. Качаева Е.В., Шенкман Б.С. Механизмы рефляции

синтеза &пка при функциональной разгрузке различной продолжительное™ // IV В™ ийекая е меж^иародньш участием школа-конференция по физиологии мышц и

мышечной деятельности. Москва, 1-4 февраля 2011 года, С.28 .. с IGF, и ега

11 Качаева ЕВ., Лейнсоо Т.А., Лысенко Е.А., Туртикова О.В., Шенкмаи Б.С. I и его ооль в вменений мышечной массы, синтеза белка в скелетных мышцах при

&иоРн= разгрузке // .V Всероссийская с Межда„аР= ^ТевралГмП конференция по физиологии мышц и мышечной деятельности. Москва, 1-4 февраля 2011

T'TsShenkman E-A.Lysenko, E.V.Kaehaeva, T.A.Leinso. Muscle mass regulation during iavM untSg and reloading: facts and unsolved problems // Internahonal sympos.um

r'SSSSS« G.Maslova, O.Zinovyeva, B.^an^me parameters of the protein synthesis during chronic alcohol mtoxieat.on m human // XXXIX European Muscle Conference. Падуя, Италия, 11-15 сентября 2010 год^С.115. 14. B.Shenkman, T.Leinso, E.Kachaeva, EXysenko Lwer and ™SHC,C signalling molecules in soleus muscle in the course of hmdlimb unloading // XXXIX European Muscle Conference. Падуя, Италия, 11-15 сентября 2010 года, С.120.

Подписано в печать:

15.08.2011

Заказ № 5777 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лысенко, Евгений Алексеевич

Список сокращений

Введение •

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13 Ш Роль инсулиноподобного ростового фактора в поддержании мышечной массы

1.2 Сигнальный путь тТог

1.3 КаБ/ЕКК сигнальный путь в регуляции трансляции

1.4 Регуляция трансляции

1.5 Функциональная разгрузка скелетных мышц

1.5.1 Адаптация скелетных мышц к условиям микрогравитации во время космического полета

1.5.2 Моделирование эффектов микрогравитации "

1.6 Алкогольная миопатия

2. ОГАНИЗАЦИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 54 2; 1 Использованные в работе экспериментальные методы и подходы

2.1.1 Объект исследований

2.1.2 Антиортостатическое вывешивание различной продолжительности 54 2:1.3 Пассивное растяжение камбаловидной мышцы на фоне антиортостатического вывешивания; Применение специфического > ингибитора тТОЯ системы — рапамицииа 55 2.1.4 Потребление Е-аргинина на фоне антиортостатического вывешивания:

2.1.5. Хроническая алкогольная миопатия

2.1.6 Хроническая алкоголизация животных

2.2 Методики обработки биоматериала и анализа данных 59 2.2.1 Определение концентрации инсулиноподобного фатора роста в сьгооротке крови

2.2:2 Определение содержания белка в мышечной ткани

2.2.3 Определение сухого веса мышцы

2.2.4 Определение площади-поперечного сечения волокон . с преобладанием быстрых или медленных изоформ тяжелых цепей миозина

2.2.5 PCR в реальном времени

2.2.6 Вестерн блот

2.2.7 Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Выявление механизмов снижения скорости синтеза белка во время антиортостатического вывешивания различной продолжительности

3.2 Пассивное растяжение камбаловидной мышцы на фоне антиортостатического вывешивания. Применение специфического ингибитора mTOR системы — рапамицина

3.3 Потребление L-аргинина на фоне антиортостатического вывешивания

3.4 Исследование механизмов развития атрофии мышц у людей, длительное время потреблявших алкоголь

3.5 Хроническая алкоголизация животных

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Выявление механизмов снижения скорости синтеза белка во время антиортостатического вывешивания различной продолжительности

4.2 Пассивное растяжение камбаловидной мышцы на фоне антиортостатического вывешивания. Применение специфического ингибитора mTOR системы — рапамицина

4.3 Потребление Ь-аргинина на фоне антиортостатического вывешивания

4.4 Исследование механизмов развития атрофии мышц у людей, длительное время потреблявших алкоголь

4.5 Хроническая алкоголизация животных

4.6 Сравнение механизмов возникновения атрофических изменений в мышцах при функциональной разгрузке и хронической алкогольной миопатии 104 Выводы 106 Список литературы

Список сокращений

IGF-I - инсулиноподобный ростовой фактор

MGF - механозависимый ростовой фактор

IGF-IR — рецептор инсулиноподобного ростового фактора

IRS-I - субстрат инсулинового рецептора —

PI-3K — фосфоинозитол-3 киназа р85 - регуляторная субъединица PI-3K

Akt/PKB — протеинкиназа В mTOR — белок, активность которого блокируется рапамицином mammalian target of rapamicin)

Raptor — регуляторный белок, связанный с mTOR

GpL - mLST8/G-protein p-subunit-like protein mTORCl — белковый комплекс, в состав которого входят mTOR, raptor, G(3L rictor — белок в составе комплекса mTORC2 не восприимчивый к рапамицину mSinl - белок, ассоциированный с митогенактивируемой протеинкиназой mTORC2 - белковый комплекс, в состав которого входят mTOR, GpL, mSinl и rictor

Ras — связанный с мембраной белок, обладающий ГТФ-азной активностью

МАРК — митогенактивируемые протеинкиназы МЕК — киназа митогенактивируемой протеинкиназы (Киназа МАРК) Erk - регулируемая внеклеточными стимулами киназа (МАРК) Raf — киназа МАРКК

PD-098059 — ингибитор MEK/Erk сигнального каскада

IGFBPs - IGF связывающие белки

MuRF-1 — ЕЗ-убиквитинлигаза (muscle ring finger 1)

MAF box/atrogin-1 - ЕЗ-убиквитинлигаза (muscle atrophy F box)

FOXO — транскрипционный фактор

AMPK — цАМФ-зависимая киназа p70S6k — киназа S6 рибосомального белка р70 rpS6 — S6 белок рибосом

TSCl(hamartin)/TSC2(tuberin) - негативный регулятор mTOR (tuberous sclerosis complex 1 и tuberous sclerosis complex 2)

Rheb - относится к классу малых G-белков, обладающих ГТФ-азной активностью

ВСАА - аминокислоты с разветвленными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, валин)

Wartmannin - ингибитор PI-3K

PLD - фосфолипаза D

РА - фосфатидная кислота р90 RSK - киназа S6 белка рибосом р

4Е-ВР - белок, связывающий фактор инициации трансляции 4Е eIF4A - фактор инициации трансляции 4А (РНК хеликаза) eIF4E — фактор инициации трансляции 4Е ( 5'-сар-связывающий фактор) eIF4G - фактор инициации трансляции 4G eIF4F — комплекс, состоящий из eIF4A, eIF4E и eIF4G eIF4B - фактор инициации трансляции 4В eIF3 - фактор инициации трансляции eIF2 - фактор инициации трансляции eIF2B - фактор инициации трансляции 2В, способствующий замене ГДФ на ГТФ в нуклеотидсвязывающем сайте eIF eEF2 - фактор элонгации трансляции eEF2K - киназа фактора элонгации трансляции

Met-tRNA - комплекс транспортной РНК с метионином

GSK - киназа гликогенсинтазы (glucose sintase kinase)

5'-UTRs - 5'-нетранслируемые регионы

РАВР - белок, связывающий полиаденилатный хвост eEFIA - фактор элонгации трансляции 1А, обладающий ГТФ-азной активностью eEFIB - фактор элонгации трансляции 1В, способствующий замене ГДФ на ГТФ в нуклеотидсвязывающем сайте eEFIA

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

CDK1 - циклинзависимая киназа

BDNF - нейротрофический фактор мозга (brain-derived neurotrophic factor)

SOD - супероксиддисмутазой

GSH-px - глутатионпероксидазой

MDA - малеиновый диальдегид (maleic dialdehyde) iNOS - индуцибельная синтаза оксида озота nNOS - нейрональная синтаза оксида озота

GABA- у-аминомасляная кислота

NMDA - ТЧ-метил-О-аспартатный рецептор

TNF-a - фактор некроза опухоли a

HGF - фактор роста гепатоцитов

PDK - фосфатидилинозитол-3-зависимая киназа