Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Защитное и сигнальное действие оксида азота II на волокна скелетных мышц при различных уровнях сократительной активности
ВАК РФ 03.03.01, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Защитное и сигнальное действие оксида азота II на волокна скелетных мышц при различных уровнях сократительной активности"
005014819
ЛОМОНОСОВА ЮЛИЯ НИКОЛАЕВНА
ЗАЩИТНОЕ II СИГНАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ОКСИДА АЗОТА II НА ВОЛОКНА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УРОВНЯХ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
03.03.01 - физиология 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 2 ид? 2072
Москва -2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук и на кафедре био- и бионанотехнологии Московского государственного университета тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.
Научные руководители:
доктор биологических наук Немировская Татьяна Леонидовна
доктор химических наук, профессор, Швец Виталий Иванович
академик РАМН
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заведующий лабораторией физиологических проблем
невесомости ФГБУ «НИИОПП» РАМН Баранов Виктор Михайлович
доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории
адаптационной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.
Ломоносова Сазонтова Татьяна Геннадьевна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук
Защита диссертации состоится 22 марта 2012 г. в£0 часов, на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем Российской академии наук
Автореферат разослан ¿^февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета: доктор биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Начиная с исследований, проведенных в 1980-е года, было показано, что оксид азота II (N0) является важным регулятором в широкой области физиологических ответов [Furchgott et al., 1980]. NO образуется в результате окисления аминокислоты L-аргишша с одновременным образованием цнтруллина при действии фермента NO-синтазы. Скелетная мышца постоянно экспрессируст нсйрональную NO-синтазу (nNOS) и производит NO [Nakane et al., 1993; Kobzik et al., 1994]. Известно, что при уменьшении двигательной активности, а также при эксцентрической нагрузке (растяжение мышцы на фоне её сокращения) цитоскелетные и сократительные белки скелетных мышц подвергаются деструкции [Lieber et al,, 1994; Komulainen et al., 1999]. Клеточные факторы и механизмы действия, приводящие к разрушению белков, остаются неизвестными. Кроме того, роль NO в регуляции белкового метаболизма скелетных мышц остаётся неизученной. Ранее было показано, что при вывешивании крыс в m. soleus наряду с атрофией и разрушением цитоскелетных и сократительных белков происходит увеличение концентрации кальция [Ingalls et al., 1999; Mukhina et al., 2006] и соответственно активация ц-кальпаинов [Garcia et al., 2006]. Анализ путей, приводящих к разрушению белков в мышце, показал, что активация кальпаинов приводит к активации убиквитин-протеасомного протеолиза, ингибирование которого в свою очередь сводит к минимуму результат действия кальпаинов [Kramerova et al., 2005; Smith et al., 2007]. Было показано, что в скелетных мышцах при функциональной разгрузке особенно активно участвуют в процессах протеасомной деградации и отмечен существенный рост таких ЕЗ-лигаз, как атрогин-1/MAFbx и MuRF-1 [Jackman et al., 2004; Dupont-Versteegden et al., 2006]. Известно, что первые нарушения, происходящие в скелетных мышцах при функциональной разгрузке, связаны со снижением синтеза миофибриллярных и цитоскелетных белков, в котором задействован хорошо известный путь регуляции синтеза на уровне активации р7056-киназ, т.е. инициации трансляции [Bodine et al., 2001]. Кроме того, за снижением синтеза следует ускорение протеолиза [Jackman et al., 2004]. Имеются сообщения и о том, что при длительном уменьшении двигательной активности происходит также снижение продукции NO и nNOS [Tidball et al., 1999; Salanova et al., 2008]. При этом было показано, что NO способен активировать синтез цитоскелетных белков, а также ингибировать активность ц-кальпаинов мышц, что может предотвращать их атрофию [Tidball et al., 1999; Koh et al., 2000]. Все эти данные говорят о том, что в скелетной мышце существует связь между продукцией NO, активностью nNOS и синтезом цитоскелетных и сократительных белков. Было предположено, что введение L-аргинина (предшественника NO) при функциональной разгрузке увеличивает активность nNOS и соответственно продукцию N0, что может привести к блокированию работы упомянутых протеолитических ферментов (кальпаинов и ЕЗ-лигаз), и тем самым предотвратить разрушение белков и атрофию мышечных волокон (схема 1а). Взаимодействие nNOS с рядом белков играет важную роль в регуляции продукции NO [Копе et al., 2000; Gratton et al., 2000]. Среди них особенную значимость как для работы nNOS, так и для её стабильности имеет и HSP90 [Bender et al., 1999; Piech et al., 2003]. Его экспрессия была также исследована в данном эксперименте (схема 1а).
При растяжении мышц на фоне функциональной разгрузки происходит предотвращение атрофии мышечных волокон [Goldspink et al., 1977; Jaspers et al., 1988]. Также было показано, что при сокращении единичного волокна, статическом растяжении скелетно-мышечных клеток увеличивается количество N0 и активность nNOS [Руе et al., 2007; Tidball et al., 2000; Zhang et al., 2004], a также синтез цитоскелетных белков [Barton et al., 2005]. Эти эффекты усиливаются при введении предшественника NO L-аргинина или ингибировании кальпаина и блокируются введением ингибитора NO-синтазы L-NAME [Voisin et al., 2005]. Проведенные ранее исследования были выполнены с использованием культур ткани, однако их результаты позволяют провести аналогию с эффектами, которые
наблюдаются в мышце in vivo при её растяжении. Было выдвинуто предположение о том, что nNOS участвует в предотвращении атрофии разгруженной мышцы при её растяжении методом блокирования работы nNOS L-NAME. Если гипотеза верна, то будет обнаружена атрофия в растянутой m. soleus при блокировании активности nNOS (схема 16).
Функциональная Äiffi^^ Я разгрузка ^^^^ Функциональная ft разгрузка Растяжение Эксцентрическая álgMft ß нагрузка
Увеличивается,— концентрация ^ТТУкЬ У"пмчи.а«тся кальция \-ХУ активность ^ ' nN0S Активация кальпаинов 4*252) sJEÖ щ & Активация кальпаинов 0 * . _ Щ ^^^ nNOS 1 Активация кальпаинов
Схема 1. Методы проверки гипотез об участии пРЮБ в белковом метаболизме скелетной мышцы при а) функциональной разгрузке, б) растяжении на фоне разгрузки, в) эксцентрической нагрузке.
Было обнаружено, что эксцентрическая нагрузка (сокращение на фоне растяжения) вызывает ухудшение работоспособности мышцы уже через 24 часа [Hesselink et al., 1996] и появлению у человека отставленной мышечной боли [Allen et al., 2001 j. В частности, эксцентрическое сокращение повреждает в значительной степени цитоскелетные белки мышечного волокна, такие как десмин, дистрофии, спектрин, актинин [Friden et al, 2001]. Michetti et al. в 1995 году также опубликовали сообщение об ингибировании протеолитической активности ц-кальпаина из скелетной мышцы NO in vitro. Была выдвинута гипотеза о том, что активность кальпаинов при эксцентрической нагрузке можно блокировать введением предшественника NO L-аргинина и тем самым предотвратить протеолиз белков (схема 1в). Более того, была поставлена задача выявить путь поступления кальция в клетку при той же нагрузке, его роль в механизмах деструктивных изменений цитоскелетных белков. Для этого животным был введен блокатор кальциевых каналов L-типа нифедипин.
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования являлся анализ фундаментальной проблемы клеточной физиологии, связанной с исследованием механизмов защитного и сигнального действия N0 на скелетно-мышечные волокна при функциональной разгрузке, их растяжении на фоне разгрузки, а также при эксцентрическом сокращении.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить влияние введения предшественника N0 L-аргинина на степень атрофии m. soleus, содержание цитоскелетного белка десмина во время вывешивания крыс; выявить действие N0 на сигнальный путь убиквитин-протеасомной деградации, ЕЗ-лигазы, и синтеза белка, р7056-киназы, при функциональной разгрузке мышц.
2. Охарактеризовать вклад нейрональной NO-синтазы в предотвращение атрофии, разрушения цитоскелетного белка десмина и миофибриллярного а-актина, проанализировать работу сигнальных путей, участвующих в белковом обмене (Akt-mTOR-p70S6k, ЕЗ-лигазы) в m. soleus, во время растяжения m. soleus на фоне ее функциональной разгрузки.
3. Исследовать эффект введения предшественника N0 L-аргинина на трансформацию тяжёлых цепей миозина (ТЦМ) I типа в сторону ТЦМ II типа при снижении функциональной
активности m. soleus и оценить влияние нейроначьной NO-синтазы на экспрессию ТЦМ I типа при растяжении m. soleus на фоне разгрузки.
4. Оценить защитную функцию L-аргинина и N0 на содержание цитоскелетных белков m. soleus при однократной эксцентрической нагрузке, а также исследовать влияние применения L-аргишша на работоспособность крыс, подвергшихся однократной эксцентрической нагрузке.
5. Изучить роль кальциевых канатов L-типа в протеолизе цитоскелетных белков ш. soleus, а также в изменении работоспособности крыс после однократной эксцентрической нагрузки.
Научная новизна работы:
1. Впервые показано, что введение L-арпшина при функциональной разгрузке и перед однократной эксцентрической нагрузкой приводит к увеличению в m. soleus концентрации N0. Более того, обнаружено защитное действие L-аргинина на белковый метаболизм скелетных мышц при функциональной разгрузке, а также однократной эксцентрической нагрузке. Введение L-аргинина при функциональной разгрузке поддерживает экспрессию мРНК MAFbx, MuRF-1 и содержание р7056-киназ на контрольном уровне.
2. Впервые оценен вклад NO-зависимой сигнальной системы в поддержание белкового метаболизма скелетных мышц in vivo при их растяжении на фоне функциональной разгрузки. Обнаружено, что блокирование нейроналыюй NO-синтазы (nNOS) при растяжении m. soleus на фоне разгрузки не приводит к развитию атрофии и увеличению экспрессии мРНК MAFbx и MuRF-1.
3. Впервые обнаружено, что nNOS принимает участие в регуляции тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I типа. Введение предшественника NO L-аргинина при функциональной разгрузке m. soleus поддерживает содержание мРНК ТЦМ 1 типа па контрольном уровне, а блокирование nNOS при растяжении m. soleus на фоне разгрузки приводит к снижению содержания мРНК ТЦМ I типа.
4. Впервые показано, что одним из путей поступления кальция в мышечное волокно при однократной эксцентрической нагрузке являются катьциевые каналы L-типа, их блокирование существенно снижает степень разрушения цитоскелетных белков в скелетной мышце при однократной эксцентрической нагрузке и увеличивает работоспособность после нее.
Научно-практическая значимость
Значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о физиологических и клеточных механизмах, запускающих процесс адаптации скелетных мышц к разным режимам сократительной активности. Идентификация N0 как сигнального фактора, участвующего в регуляции белкового синтеза, является фундаментальным направлением, которое может найти приложение в нейрологии, экстремальной и реабилитационной медицине, в разработке новых программ тренировки спортсменов и геронтологии. Предшественник N0 L-аргинин может быть применен в качестве средства профилактики разрушения цитоскелетных белков скелетных мышц при эксцентрической нагрузке, а также при атрофии мышц, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой, с целью устранения их негативных последствий. Более того, введение L-аргинина может препятствовать возникновению отставленной мышечной боли, вызванной протеолизом, у спортсменов после интенсивных эксцентрических нагрузок, тем самым, повышая их работоспособность. Увеличение концентрации N0 может быть использовано для снижения экспрессии ЕЗ-убиквитин-лигаз, участвующих в протеасомной деградации белков и для предотвращения снижения экспрессии тяжелых цепей миозина I типа. Результаты работы позволяют сделать вывод о том, что NO-зависимая система способна обеспечить высокую степень профилактики, а применение L-аргинина практически исключает негативные побочные эффекты.
Положения, выносимые на защиту:
1. Введение предшественника N0 [„-аргинина позволяет предупредить разрушение цитоскелетных белков в скелетной мышце, как при интенсивной эксцентрической нагрузке, так и функциональной разгрузке; увеличивает работоспособность после однократной эксцентрической нагрузки. Более того, нейноральная ЖЗ-синтаза участвует в регуляции экспрессии мРНК тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I типа.
2. Растяжение скелетной мышцы приводит к предотвращению атрофии во время функциональной разгрузки, но роль нейрональной ЫО-снитазы в поддержании массы мышцы незначительна.
3. Предотвращение поступления кальция через кальциевые каналы Ь-типа в мышечное волокно препятствует повреждению цитоскелетных белков при однократной эксцентрической нагрузке и снижению работоспособности после ней.
Апробация работы
Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на: Российско-британской конференции молодых ученых (Екатеринбург, Россия, 2007); 59-й научно-технической конференции студентов МИТХТ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2007), 36-й, 37-й, 38-й, 39-й европейских мышечных конференциях (Стокгольм, Швеция, 2007; Оксфорд, Великобритания, 2008; Лилль, Франция, 2009; Падуя, Италия, 2010); 7-й, 8-й, 9-й конференциях молодых учёных, специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2008, 2009, 2010); 7-м и 8-м международных симпозиумах "Биологическая подвижность: достижения и перспективы" (Пущино, Россия, 2008, 2010); конференции «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); 14-й международной конференции по биохимии упражнений (Онтарио, Канада, 2009); 17-м международном симпозиуме «Человек в космосе» (Москва, 2009); 30-м и 31-м симпозиумах по гравитационной физиологии (Сиань, Китай, 2009; Триест, Италия, 2010); 29-м съезде физиологического общества имени И.П.Павлова. (Калуга, 2010); 6-й всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности «Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности» (Москва, 2011).
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ-ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 7 от 12 декабря 2011 г.). Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-01599-а.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 2 патента, 20 тезисов докладов конференций, в том числе международных.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания организации экспериментов и методик обработки биологического материала, изложения результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 122 страницах печатного текста, включает 48 рисунков, 4 таблицы и список литературы из 210 наименований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Организация экспериментов*.
14-суточное вывешивание крыс. Применение Ь-аргннина. Целью эксперимента было проверить гипотезу о том, что уровень N0 при функциональной разгрузке мышц может снижаться, а сам N0 является сигнальной молекулой, имеющей отношение к регуляции белкового метаболизма. Для проверки этой гипотезы животным был введен предшественник N0 Ь-аргинин при функциональной разгрузке. 42 самца 2,5-месячных крыс Вистар были разделены на 3 группы по 14 животных в каждой группе. Первая группа - интактный контроль (группа К), вторую группу крыс вывешивали согласно модели гравитационной разгрузки по Илышу-Новикову [Пут е1 а1., 1981] 14 дней таким образом, что передние конечности опирались на пол, а задние его не касались (группа В). Третью группу вывешивали с введением Ь-арпшина с питьевой водой (конце1гграция 1^-аргинина 500 мг/кг массы крысы, группа ВЛ). Крысы были забиты сверхдозой нембутала (75 мг/кг массы), выделенные т. $о1еш немедленно замораживали в жидком азоте. Из каждой группы 7 животных были использованы для определения относительного содержания N0 в т. 5о1еиз с помощью ЭПР-спектроскопии в содействии с Институтом биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, а ш. 5о1еиз других 7 животных хранили при -85°С для дальнейшего анализа содержания десмина, пЫОЗ, р7056к, Р-р70Б6к методом вестерн-блотгинга; содержание мРНК п1М08, МАРЬх, МиЯР-1, мРНК тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I, Па, ИЬ, Пс!/х типов, инсулиноподобного фактора роста (ЮР-1) и белков теплового шока 90 (Н5Р90) методом ПЦР в реальном времени.
Пассивное растяжение т. $о1еи$ на фоне вывешивания. Введение блокатора неГфоналыюй .ЧО-синтазм Ь^АМЕ. В данном эксперименте была проверена гипотеза об участии пЫ05 (которая ассоциирована с мембранным дистрофин-саркогликановым комплексом) в предотвращении атрофии разгруженной мышцы при её растяжении методом блокирования работы пЫ08 Ь-ЫАМЕ (гидрохлорид Ы-нитро-Ь-аргинин метилового эфира). Если гипотеза верна, то будет обнаружена атрофия в растянутой ш. зо1еиз при блокировании пК05. 56 самцов 2,5-месячных крыс Вистар были разделены на 4 группы по 14 животных в каждой группе: интактный контроль (группа К); вторую группу крыс вывешивали 14 дней согласно модели Ильина-Новикова (группа В) [Пут е! а1., 1981]. Еще 2 группы были также вывешены 14 дней: одну группу вывешивали с растяжением т. Бокиэ (группа Р), другую вывешивали с растяжением ш. эокиз и введением Ь-ЫАМЕ (Ь-ЫАМЕ ежедневно вводили с питьевой водой 90 мг/кг массы крысы, группа РН). Растяжение т. $о1еиз во время вывешивания проводилось по методике, описанной ранее [Таракина и др., 2008; Туртикова и др., 2008], т.е. обе задние конечности крыс были иммобилизованы в голеностопном суставе под углом 35° с помощью синтетического полимерного бинта (Эс^сИсаз!, «ЗМ», США). Крысы были забиты сверхдозой нембутала (75 мг/кг массы), т. 5о1еиз немедленно была заморожена в жидком азоте. Из каждой группы 7 животных были использованы для определения относительного содержания N0 в ш. зо1еи5, а т. зо1еиз других 7 животных были выделены для проведения всех остальных исследований. Было проанализировано содержание десмина, а-актина, пЫОБ, р7056к, Р-р7056к методом вестерн-блоттинга; содержание мРНК пЫОЗ, МАРЬх, \luRF-l, ТЦМ I, На, 11с1Ух типов, ШР90 методом ПЦР в реальном времени.
Эксцентрическая нагрузка крыс. Применение предшественника N0 Ь-аргишша и блокатора ненроналыюй МО-синтазы Ь-Р\'\МЕ. Для выявления сигнальной роли Ь-аргинина и N0 в регулировании белкового метаболизма при эксцентрической нагрузке был проведен следующий эксперимент. 28 2,5-месячных самцов крыс Вистар были разделены на 4 группы по 7 животных в каждой: одна группа животных служила контролем (группа К, масса тела 276,0 (246,5-301,0) г; масса ш. зо1еиз 139,2 (108,1-164,2) мг); крысы
* Все процедуры с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ-РФ ИМБП РАН.
второй группы (группа ЭБ, масса тела 275,5 (235,9-310,6) г; масса m. soleus 98,7 (94,1-101,6) мг) бегали вниз по беговой дорожке (тредбану) со скоростью 20 м/мин в течение 40 минут. Тредбан располагался под углом 16° к поверхности пола. Третьей группе за 2 дня до физической нагрузки давали L-аргинин с водой в дозе 500 мг на кг массы тела в день, а затем крысы подвергались бегу по тредбану согласно предыдущей программе (группа ЭА, масса тела 272,0 (265,6-280,7) г; масса m.soleus 114,1 (100,9-120,8) мг). Четвертой группе животных за 2 дня до бега вводился L-NAME с водой в дозе 90 мг на кг массы тела в день, а затем животные подвергались бегу по тредбану (группа ЭН, масса тела 254,3 (239,2-262,1) г; масса m. soleus 100,3 (95,1-107,3) мг). Через 24 часа после бега у животных под нембуталовым наркозом выделялась m. soleus, немедленно замораживалась в жидком азоте, после чего крысам вводилась сверхдоза нембутапа (75 мг/кг массы). Пробы хранили при -85°С. Было определено содержание десмина методом вестерн-блоттинга, дистрофина -иммуногистохимически на поперечных срезах мышцы, содержание мРНК nNOS, ц-кальпаина, MAFbx, MuRF-1 методом ПЦР в реальном времени. Для определения работоспособности животных после выполнения эксцентрической нагрузки проводили повторный эксперимент с 4 группами по 10 крыс в каждой группе. Для выяснения относительных изменений содержания N0 в мышцах после введения L-аргинина было взято дополнительно 6 контрольных крыс (К) и 6 крыс с введением L-аргинина по предыдущей схеме (КА). В группах с эксцентрической нагрузкой определение содержания N0 с помощью ЭПР-спектроскопии не проводилось, т.к. с диэтилдитиокарбаматом железа II (Ре(ДЭТК)2) крысы не могли выполнять физическую нагрузку.
Эксцентрическая нагрузка крыс. Эффект блокады кальциевых каналов L-типа. Для анализа путей поступления кальция в клетку при резистивной нагрузке, его роли в протеолизе цитоскелетных белков был проведен эксперимент с однократной резистивной нагрузкой крыс на тредбане и блокированием дигидропиридиновых кальциевых каналов. 18 самцов крыс Вистар были разделены на 3 группы по 6 животных в каждой: «Контроль» (группа К, масса тела 270,1 (239,8-290,1) г; масса m. soleus 137,1 (105,9-157,3) мг); вторая группа - «Эксцентрический бег» (группа ЭБ, масса тела 272,3 (239,7-302,3) г; масса m. soleus 100,7 (94,0-107,1) мг), где животные подвергались эксцентрической нагрузке; третья группа - «Эксцентрический бег с введением нифедипина» (специфического блокатора L-кальциевых каналов в дозе 6,25 мг/кг в течение 2 суток с питьевой водой, группа ЭФ, масса тела 294,5 (258,8-315,5) г; масса ш. soleus 132,8 (120,6-152,4) мг). По истечении 24 часов после бега у животных под нембуталовым наркозом выделялась rn. soleus, немедленно замораживалась в жидком азоте, после чего крысам вводилась сверхдоза нембутала (75 мг/кг массы). Пробы хранили при -85°С. Было определено содержание цитоскелетных белков десмина и дистрофина. Для анализа работоспособности после выполнения эксцентрической нагрузки проводили дополнительный эксперимент с теми же 3 группами крыс по 10 в каждой группе.
Методики обработки биоматериала и анализ данных.
Выявление nNOS, десмина, а-актина, p70S6k, P-p70S6k методом ДДС-электрофореза в ПААГ с последующим вестерн-блоттингом. Для выявления белков был использован ДДС-электрофорез по Лэмли [Laemmli et al., 1970]. С каждой пробы т. soleus с помощью криостата («Leica», Германия) были сделаны срезы толщиной 20 мкм, помещены в лизирующий буфер с использованием коктейля ингибитора протеаз («Roche», Германия). Электрофорез был проведен для десмина и а-актина в 12%-ном, для nNOS - в 8%-ном; для p70S6k и P-p70S6k - в 10%-ном полиакриламидных гелях. Электрофорез был проведен при 15 мА на гель в мини-системе («Bio-Rad Laboratories», США) при комнатной температуре в течение 1 часа. Белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану в системе mini Trans-Blot («Bio-Rad Laboratories»). Для выявления белковых полос были использованы первичные поликлональные антитела - анти-nNOS («BD Biosciences», США,
разведение 1:250), анти-десмин («Novocastra», США, NCL-L-DES-DER11, 1:200), анти-а-актин («SIGMA», США, 1:500), aHTii-p70S6k («Santa Cruz», США, 1:10000), aHTii-P-p70S6k («Abcam», США, участок фосфорилирования Т389, 1:10 000). Для nNOS были использованы вторичные антитела («ИМТЕК», Россия, GAR, 1:1000), конъюгированные с пероксидазой хрена; для десмна и a-актина («ИМТЕК», GAM, 1:500) - биотинилированные; для p70S6k и P-p70S6k («SIGMA», GAR, 1:200 000) - биотинилированные. Затем блоты с десмином и и-актином икубировались с авидин-пероксидазным конъюгатом («SIGMA», 1:1000) в течение 30 мин с последующей проявкой с помощью 3% раствора Н2О2 в TBST с диаминобензидином. nNOS, p70S6k, P-p70S6k были выявлены на пленке с помощью Immun-StarTM Substrate Kit («Bio-Rad Laboratories»). Все инкубации с антителами проводились 1 час при комнатной температуре. Блоты отмывались 6 раз по 10 мин в TBST. Вестерн-блотгинг был повторен не менее 3 раз. Анализ белковых полос производился с помощью денситометра GS-800 (Quantity-One™ software, «BioRad Laboratories»), Все измерения проводились в линейном диапазоне проявляющего реагента, сканера, и рентгеновской пленки. Оптическая плотность (ОП) полосы контрольной группы на анализируемой мембране была принята за 100%, а ОП полос других групп были сравнены с ОП полос контрольной группы, расположенными на одной и той же мембране.
Экспрессия генов nNOS, IISP90, ЕЗ-лигаз, IGF-1, ц-кальпаинов, ТЦМ I, II типов. Была выделена тотальная мРНК из 10 мг мышечной ткани, затем проведена обратная транскрипция с ферментом MMLV RT, ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green 1 в амплификаторе iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System («BioRad Laboratories»). Праймеры были сконструированы с помощью программ РптегЗ и mfold или взяты из литературы. Для проверки качества работы праймеров и полученных после ПЦР ампликонов был проведен горизонтальный элкгрофорез в агарозном геле, выделен нужный сегмент ДНК. Секвенирование ДНК проводилось в центре коллективного пользования «Геном», основанного на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Для анализа полученных данных использовалось относительное количественное определение целевого гена, нормализованное к референсному, метод 2"лдп (метод Ливака). GAPDH и ß-актин были выбраны в качестве референсных генов, экспрессия которых постоянна в камбаловидной мышце в условиях экспериментов [Stevens et al., 1999; Meissner et al., 2001].
Иммуногистохимическое выявление дистрофина в мышечных волокнах. Поперечные срезы мышечной ткани толщиной 10 мкм, приготовленные с использованием криостата («Leica»), инкубировались с первичными моноклонапьными антителами против дистрофина (1:20, NCL-DYSI «Novocastra») и вторичными поликлональными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой (GAM, «Molecular probes», США, А1еха546, 1:1000). Все инкубации были проведены в течение 1 ч при комнатной температуре. Для данной реакции делался негативный контроль (без первичных антител) для выявления неспецифической окраски.
Оценка работоспособности. Тестирование проводилось в течение 15 минут при скорости движения ленты беговой дорожки 27 м/мин, угол наклона ленты составлял 20°. Стимулом для бега являлась реакция избегания удара электрическим током (40 В) при замедлении бега или остановке животного. Животные, отказывающиеся бегать (проводившие на электродах более 1 мин), исключались из исследования. Для оценки работоспособности животного использовались такие показатели, как время контакта животного с электростимуляционной площадкой, выраженное в процентах по отношению к общему времени тестирования ФРаэм, сек; и изменение количества выполненной животными в процессе исследования работы А, кДж [Рылова и др., 1964].
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных производилась с помощью программы Origin Pro v.В.О SR5. Достоверность отличий между группами определялась с помощью непараметрического варианта критерия Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений.
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование действия L-аргинина на атрофию m. soleus при её функциональной разгрузке. Масса крыс во всех группах не отличалась от контрольного уровня (табл. 1), что свидетельствует об отсутствии стресса у животных во время экспериментальных воздействий. При измерении массы m. soleus было обнаружено её значительное снижение в группе вывешивания (В) на 46% (р<0,05) относительно таковой в группе контроля (К). В то же время в группе с введением L-аргинина (ВЛ) атрофия мышцы была частично предотвращена, и ее масса оказалась на 21% выше, чем в группе В (р<0,05) (табл. 1). Впервые было обнаружено существенное уменьшение содержания N0 в m. soleus после её двухнедельной функциональной разгрузки (рис. 1). Ранее сообщали об увеличении концентрации N0 в интактной мышце при ее сокращении [Balón et al., 1994], а другие авторы доказали в экспериментах на единичных мышечных волокнах, что N0 может продуцироваться внутри волокна (а не только в окружающих тканях) и регулироваться его сократительной активностью [Руе et al., 2007].
Табл. 1. Масса животных н lll.sokus._
Параметр/группа К В ВЛ
Масса крысы, г 253,3 (245,2-258,5) 246,2 (240,0-256,4) 249,4 (244,2-250,6)
Масса soleus, мг 101,0 (97.2-105,0) 55,2 (52,9-56,4)* 67,1 (65,3-73,4)* "
Результаты приведены в виде медианы и пнтерквартнльной широты (0,25-0,75), * достоверные отличия от группы К, р < 0,05,- # - достоверные отличия от группы В, р < 0,05.
Введение 1_-аргинина предотвратило снижение относительного содержания N0 в группе ВЛ (рис. 1). Одновременно со снижением относительного содержания N0 в т. зо1еиз крыс
Рис. 1. Относительное содержания N0 измерялось методом ЭПР-спектроскопии в т. в контроле (К), у вывешенных (В) и
вывешенных с введением Ь-аргинина (ВЛ) крыс. Результаты приведены в виде медианы и пнтерквартнльной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05;
# - достоверные отличия от В, р<0,05.
группы В было обнаружено уменьшение содержания п1М05 (как белка, так и мРНК) (рис. 2, 3), что было вполне ожидаемо. Некоторые авторы сообщали о снижении уровня пЬЮБ в т. 8о1еш при гипокинезии человека [Т1<1Ьа11 й а1., 1999; БаЬпоуа е! а1., 2008]. Неожиданным было то, что содержание пЬЮБ (как белка, так и мРНК) в группе ВЛ было уменьшено так же, как и в группе В. Можно предположить, что. во-первых, расхождение в содержании пЫОБ в группах В и ВЛ и количестве N0 в них может быть связано с возможными различиями между активностью фермента и его концентрацией в этих группах. Аналогичная ситуация
к в вл
Рис. 2. Содержание п!Ч08 в т. Ч'к'и^ у вывешенных (В) п вывешенных с введением Ь-аргнннна (ВЛ) крыс оценивали относительно уровня соответствующих белков в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05.
была отмечена при длительном увеличении сократительной активности мышцы: концентрация пЫОБ в ней не изменялась, в то время как активность фермента, измеренная по скорости превращения Ь-[14С]аргинина в
Ь-[14С]цитрулин. была увеличена в 1,5 раза по сравнению с таковой в
Рис. 3. Содержание мРНК nNOS в ш. 5о1еш у вывешенных (В) и вывешенных с введением Ь-аргиннна (ВЛ) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной шпроты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К", р<0,05.
контрольной группе [Harris et al., 2008]. Во-вторых, разница в содержании NO и nNOS в группах В и ВЛ может быть связана и с отличиями в концентрации у них HSP90. У животных группы ВЛ содержание мРНК HSP90 не отличалось от такового в группе контроля, в то время как в группе В оно было достоверно снижено (рис. 4). Аналогичное снижение как концентрации белка HSP90, так и концентрации его мРНК после двухнедельной функциональной разгрузки m. soleus было выявлено ранее [Sakurai et al., 2005; Ishihara et al., 2008]. Известно, что nNOS образует комплекс с шаперонами HSP90, и только в этом
Г в ВЛ
1 I #
*
Рис. 4. Содержание мРНК HSP90 в m. soleus у вывешенных (В) п вывешенных с введением L-аргиннна (ВЛ) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от К, р<0,05, - достоверные отличия от В, р<0,05.
состоянии сохранятся ее полная каталитическая активность и
стабильность [Song et al., 2001; Averna et al., 2008]. HSP90 увеличивает образование NO, усиливая
каталитическую функцию nNOS в интактных клетках in vivo в зависимости
от своей концентрации [Оарр е! а1., 20041. В состоянии комплекса с ШР90 пИСЙ также более устойчива к протеолитической деградации кальпаинами, концентрация которых существенно повышается в т. эокив животных при функциональной разгрузке [Уеппае1еп е( а1., 2007]. Эффективность защиты лЮБ пропорциональна уровню внутриклеточной экспрессии Н8Р90 [Song й а!., 2001]. В группе крыс, которым при вывешивании вводили Ь-аргинин (ВЛ), наблюдается снижение степени атрофии (табл. 1). Авторы [Ко11 е1 а1., 2000] при исследовании культуры мышечных клеток обнаружили, что N0 вовлечен в развитие гипертрофии скелетной мышцы снижением белковой деградации и увеличением белкового синтеза, и впервые показали, что N0 ингибирует протеолиз, вызванный ионофорами кальция в культуре мышечных клеток. Происходит это из-за ингибирования N0 активности ц-катьпаина в результате химической модификации остатка цистеина, расположенного в активном центре фермента. Известно, что при двухнедельной функциональной разгрузке мышц в цитоплазме происходит накопление ионов кальция [Шенкман и др., 2008]. В группе ВЛ снижение степени атрофии также могло наблюдаться из-за ингибирования N0 активности кальпаинов. Наибольший вклад в развитие атрофии вносит снижение содержания сократительных белков, но разрушение цитоскелетных белков существенно влияет на
Рис. 5. Содержание цнтоскелетного белка десмина в мышце $о!еи$ у вывешенных (В) и вывешенных с введением Ь-артинина (ВЛ) крыс оценивали относительно уровня соответствующих белков в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и мнтерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от В, р<0,05.
изменение
мышечного тонуса и сократительных свойств мышцы [ТЪотаэоп й а1., 1990; Оюрагс! е1 а1., 2001]. Влияние введения Ь-аргинина на предотвращение протеолиза цитоскелетных белков при к в вп разгрузке мышц совершенно не
исследовано. Уровень десмина в группе В после двух недель вывешивания животных был несущественно меньше, чем в группе К. В ряде работ сообщается о снижении концентрации (как белка, так и мРНК) десмина на ранних сроках вывешивания крыс (от 1 до В суток) [\Vagatsuma е( а1., 2002; Giger е1 а1., 2009]. В то же время уже после трех и шести недель вывешивания крыс (как и после продолжительной гипокинезии у человека) авторы работы [Епш е! а1., 2007] не нашли каких-либо изменений в его содержании. Можно предположить, что концентрация цитоскелетного белка десмина снижается в течение первых нескольких дней функциональной разгрузки мышц, а затем на более поздних этапах способна восстанавливаться. Поэтому можно и не обнаружить достоверного уменьшения его содержания после двухнедельного вывешивания крыс. В то же время у животных группы ВЛ содержание десмина было на 24% выше, чем в группе В (рис. 5). Имеются сообщения о том, что N0 способен активировать синтез некоторых цитоскелетных белков (талина и винкулина) в клетках С2С12 [КоЬ е!: а1., 2000]. Можно заключить, что введение Ь-аргинина (и, вероятно, поддержание уровня N0) при функциональной разгрузке предотвращает снижение в ш. вокш концентрации некоторых цитоскелетных белков и снижает степень её атрофии. Для выяснения механизма этих процессов в группе ВЛ была проанализирована работа системы протеасомной деградации (содержание ЕЗ-лигаз, МАИЬх и МиЯР-П и белкового синтеза (одного из звеньев Ак(-тТСЖ-р7086к сигнального пути), а также содержание инсулиноподобного фактора
роста IGF-1 в m. soleus. Известно, что первые нарушения, происходящие в скелетных мышцах при функциональной разгрузке, связаны со снижением белкового синтеза. За ним следует ускорение протеолиза [Forstennann et al., 1994], который играет важную роль в потере мышечной массы. Особенно интенсивно при функциональной разгрузке мышц начинают активироваться такие ЕЗ-лигазы, как MAFbx и MuRF-1, которые задействованы в процессах протеасомной деградации белков [Jackman et al., 2004; Reid et al., 2005; Dupont-Versteegden et al., 2006] Именно поэтому они были выбраны маркерами протеолиза в настоящей работе. Содержание их мРНК было повышено у вывешенных крыс (группа В| относительно группы контроля (рис. 6). В противоположность этому оно не отличалось от
Рнс. 6. Содержание мРНК MAFbx и MuRF-1 в т. soleus у вывешенных (В) н вывешенных с введением L-аргиннна (ВЛ) крыс оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и ннтеркваргильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от контроля, р<0,05;
* - достоверные отличия от В, р<0,05.
такового у животных, которым вводили L-аргинин. Недавно было показано, что MuRF-1 принимает участие в убиквитинировании компонентов толстых миофиламентов, участвуя в их деградации [Cohen et al.,
2009]. Снижение экспрессии MuRF-1 в группе ВЛ могло быть связано со снижением в ней степени атрофии мышцы. Известно, что HSP90 также участвуют в процессах протеасомной деградации. Образуя устойчивые
препятствуют дальнейшим процессам
Рис. 7. Содержание компонентов системы синтеза белков (нефосфосфорнлнрованных p70S6k н фосфорнлированных p70S6k) в m. soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением L-аргнннна (ВЛ) крыс оценивали относительно уровня соответствующих белков в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и ннтерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от контроля, р<0,05.
шаперон-зависимого убиквитинирования [Pratt et al., 2008].
В группе ВЛ, в которой наблюдалось
„ _,_,_, частичное предотвращение атрофии,
к в вл концентрация мРНК HSP90 была
существенно выше таковой в группе В (рис. 4). HSP90 могли также выполнять защитную функцию от протеасомной деградации белков в этой группе. Ранее было показано, что повышение концентрации NO при функциональной разгрузке скелетных мышц ведет к предотвращению деструкции некоторых цитоскелетных белков, в том числе и из-за снижения их протеасомной деградации [Timothy et al., 2000]. Несомненно, одной из причин предотвращения атрофии и снижения концентрации некоторых цитоскелетных белков в группе ВЛ является снижение их распада. Интенсивность сигнальных процессов анаболической направленности в этой группе была
- 2 ■
-Я
-Я
4-4-
I
I
MAFbx MuRF-1
11 х #
#
комплексы со многими белками, они
S к
£ о
К В ВЛ К В ВЛ
р70$6к P-P70S6K
4-1
ft
P-p70S6k
11
проверена путем определения содержания фосфорилированных и нефосфорилированных p70S6k. Akt-mTOR-p70S6k хорошо известен как главный путь регуляции синтеза белка на уровне инициации трансляции [Bodine et al., 2001]. Снижение уровня фосфорилирования p70S6k в m. soleus на 14-е сутки вывешивания уже было показано ранее [Gwag et al„ 2009], тогда как эффект поддержания его концентрации при введении L-аргинина был обнаружен впервые (рис. 7). Так как отношение p70S6k/P-p70S6k было одинаковым во всех группах, можно предположить, что снижение уровня фосфорилирования p70S6k при вывешивании произошло из-за уменьшения тотального содержания киназы в результате интенсификации протеолиза в мышечном волокне. Можно заключить, что при вывешивании происходит снижение интенсивности синтеза белка на уровне инициации трансляции, тогда как пероральное введение L-аргинина предотвращает этот процесс, сохраняя тотальное содержание и уровень фосфорилирования p70S6k на уровне контроля. Было также исследовано содержание мРНК 1GF-1 в мышце при разгрузке, анаболические свойства которого известны [Song et al., 2005]. Однако в большинстве работ речь идет об IGF-1 крови. Сигнальные пути, запускаемые IGF-1, экспрессируемого в мышце при разгрузке, не изучены. В текущем эксперименте концентрация его мРНК была одинаковой во всех группах. Ранее отмечалась неоднозначная динамика IGF-1. Так, после двух суток вывешивания мышей его концентрация в мышце снижалась, а к восьмым суткам не отличалась от уровня контроля [Awede et al., 1999]. Анаболическая роль IGF-1 при разгрузке требует дальнейшего изучения. Можно заключить, что различия в массе мышцы или содержании цитоскелетного белка десмина в группах В и BJT может происходить как за счет большей анаболической активности, так и за счет снижения экспрессии протеолитических маркеров (атрогин-I/MAFbx, MuRF-1) после введения L-аргинина при функциональной разгрузке мышцы. У животных группы В наблюдалось снижение экспрессии мРНК ТЦМ 1 типа (рис. 8) и повышение экспрессии ТЦМ lib и II d/x типов относительно таковых в группе контроля.
Рис. 8. Содержание мРНК ТЦМ I типа в m. soleus у вывешенных (В) и вывешенных с введением L-аргинина (BJ1) крыс оценивали относительно контрольного (К) урОВНЯ. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от контроля, р<0,05;
# - достоверные отличия от В, р<0,05.
Аналогичное перераспределение изоформ ТЦМ в сторону более высокого содержания миозинов II типа было описано ранее [Thomason et al., 1989]. В то же время введение L-аргинина (группа ВЛ) полностью предотвратило эти изменения (рис. 8), В работе [Smith et al., 2002] было отмечено, что введение блокатора NO-синтазы (L-NAME) при функциональной перегрузке мышцы предотвращает трансформацию мышечных волокон в сторону большего содержания волокон I типа. Фенотипическая пластичность мышц может регулироваться эндогенным NO через Са2+/кальмодулинзависимую NO-синтазу [Drenning et al., 2008]. Одним из возможных регуляторов синтеза ТЦМ I в скелетной мышце называют Са2+/кальмодулиновый путь [Chin et al.. 2005]. В то же время для продукции NO nNOS также необходим кальмодулин [Song et al., 2001. Peng et al., 2009]. Одним из стимулов, приводящих к изменениям экспрессии ТЦМ в проведенном эксперименте, может быть активация
Са2+/кальмодулинового пути при функциональной разгрузке мышц и его взаимодействие с nNOS.
Таким образом, введение предшественника N0 L-аргинина при функциональной разгрузке снижает степень атрофии m. soleus и предотвращает снижение содержания цитоскелетного белка десмина, а также препятствует снижению мРНК ТЦМ I. Снижению атрофии в какой-то степени могли способствовать отсутствие увеличения уровня компонентов системы протеосомальной деградации (атрогина-1/MAFbx, MuRF-1) при функциональной разгрузке и поддержание интенсивности синтеза белка рибосомальной р7056-киназой.
Оценка вклада нейрональной NO-синтазы в предотвращение атрофии в скелетной мышце при ее растяжении на фоне снижения двигательной активности. Снижение содержания N0 при введении L-NAME в группе РН на величину, сопоставимую с группой В (относительно группы К), свидетельствует об адекватном воздействии ингибитора на активность NO-синтазы (рис. 9). В группе Р существенных отличий от группы К по этому
Рис. 9. Относительное содержание N0 в m. soleus у контрольных (К), вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением m. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m. soleus и введением L-NAME (РН). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильнон широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05,
# - достоверные отличия от Р, р<0,05.
параметру не наблюдалось. Рядом авторов было также показано увеличение продукции N0 при растяжении мышцы, а также связь между активностью nNOS и экспрессией некоторых цитоскелетных белков [Koh et al., 1999]. Однако несмотря на существенное снижение концентрации N0 в ш. soleus крыс группы РН относительно группы К, его масса не отличалась от группы Р (табл.2). Табл. 2. Массы животных и m. soleus.
Параметр/группа К В Р РН
254,1 236,3 255,3 233,3
масса крысы, г (248,9-256,2) (230,6-239,3) (252,5-255,4) (225,7-240,3)
масса soleus, мг 100,2 54,0 93,2 101,2
(97,5-103,0) (50,9-56,9)* (87,1-102,1)" (97,8-100,4)"
Результаты приведены в виде медианы и интерквартильнон широты (0,25-0,75), * достоверные отличня от группы К, р < 0,05; # - достоверные отличия от группы В, р < 0,05.
Итак, у обеих групп экспериментальных крыс, вывешенных с иммобилизацией конечности и растяжением m. soleus развитие атрофии было предотвращено (табл. 2). Предотвращение атрофии при растяжении m. soleus во время вывешивания животных согласуется с результатами предыдущих исследований [Loughna et al., 1986; Jaspers et al., 1988], однако её связи с активностью nNOS выявлено не было. Различий в содержании десмина между группами К, Р и РН также не было обнаружено, но в группе В его содержание было существенно ниже такового в группе Р (рис. 10). Динамика содержания десмина в m. soleus
Рис. 10. Содержание десмина и a-актина в т. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением m. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m. soleus и введением L-NAME (РН) оценивали относительно уровня соответствующих белков в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от В, р<0,05; U - достоверные отличия от Р, р<0,05.
меняется в зависимости от срока вывешивания, и наиболее выраженное его снижение наблюдали после первой недели [Enns et al., 2007; Dapp et al., 2004]. К третьей неделе вывешивания происходит его полное восстановление [Chopard et al., 2005]. Содержание a-актина было снижено в одинаковой степени в обеих группах, РН и В, как по сравнению с группой К, так и по сравнению с группой Р (рис. 10).
Рис. 11. Содержание мРНК nNOS в m. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением ш. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m. soleus и введением L-NAME (РН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05; U - достоверные отличия от Р, р<0,05.
Ранее обнаружили снижение концентрации дистрофина и a-актина при вывешивании животных [Chockalingam et al., 2002], но возможное участие nNOS в поддержании белкового метаболизма мышцы при её растяжении не
Рис. 12. Содержание nNOS в m. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением m. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m. soleus и введением L-NAME (РН) оценивали относительно уровня соответствующих белков в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,01);
* - достоверные отличия от В, р<0,01.
обсуждалось. Можно заключить, что nNOS не вносит существенного вклада в предотвращение атрофии во время растяжения m. soleus при вывешивании, но участвует в поддержании экспрессии некоторых цитоскелетных мышечных белков. Каким образом может быть обеспечена эта защита? Было обнаружено, что при блокировании nNOS с помощью L-NAME во время
растяжения мышцы в ней снижается не только содержание N0 (рис. 9), но и содержание мРНК nNOS относительно групп К и Р (рис. 11). Величина этих изменений сопоставима с группой В. Однако было неожиданным получить падение уровня nNOS в группе РН (рис.12). В то же время содержание мРНК HSP90 в этой группе была самой высокой из всех групп (рис. 13).
Рис. 13. Содержание мРНК HSP90 в ш. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением in. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m. soleus и введением LAÑAME (РН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и ннтерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,01;
# - достоверные отличия от В, р<0,01.
Известно, что HSP90 в клетке, образуя комплекс с nNOS, защищает её от протеолиза и сохраняет её активность [Vermaelen et al., 2007; Averna et al., 2008]. Можно предположить, что, несмотря на снижение экспрессии мРНК nNOS, сам белок nNOS был защищен от распада HSP90. Это, впрочем, не может гарантировать сохранение активности самой nNOS на прежнем уровне. Ранее показано, что сохранение концентрации nNOS при длительном увеличении сократительной активности мышцы может сопровождаться увеличением активности фермента [Harris et al., 2008]. Кроме того, увеличение концентрации HSP90 могло иметь защитную функцию по отношению к некоторым цитоскелетным белкам в
Рис. 14. Содержание мРНК MAFbx и MuRF-1 в m. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением ш. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением ш. soleus и введением L-NAME (РН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и ннтерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05;
# - достоверные отличия от В, р<0,05.
группе с растяжением и блокированием nNOS (группа РН). Ранее было показано, что NO способен не только активировать синтез некоторых цитоскелетных белков [Koh et al., 2000; Zhang et al., 2004], но и ингибировать активность р-кальпаинов мышц [Koh et al., 2000]. Судя по полученным данным о том, что уровень a-актина в ш. soleus группы с растяжением (Р) существенно выше такового в группе с блокированием nNOS (рис. 10), можно предположить, что активность nNOS при растяжении имеет значение для защиты некоторых белков m. soleus от разрушения. Возникает вопрос, что предотвращает атрофию m. soleus при растяжении: снижение распада белка или увеличение анаболических процессов? Для ответа на поставленный вопрос была проанализирована работа звеньев системы протеасомной деградации, атрогин-1/MAFbx и MuRF-1, и белкового синтеза Akt-mTOR-p70S6k. В отличие от группы «Вывешивание», в группах с вывешиванием и растяжением m. soleus увеличения содержания атрогин-1/MAFbx и MuRF-1
1 -, т # I
I 1 ' I
-1 - #
и -а < -2 --3 ■ -4
к в р РН
Рис. 15. Содержание компонентов системы синтеза белков (нефосфосфорилированных p70S6k и фосфорилированных p70S6k) в m. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением m.soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m.soleus и введением L-NAME (РН) оценивали относительно уровня соответствующих белков в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и интерквартнльной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05;
# - достоверные отличия от В, р<0,05.
не наблюдалось (рис. 14), как и снижения мРНК HSP90, которые также участвуют в процессах протеасомной деградации. Увеличивается ли в группах Р и РН синтез белка было проверено путем анализа содержания фосфорилированных и нефосфорилированных p70S6k. Было обнаружено снижение уровня фосфорилирования p70S6k в m. soleus на 14 сутки вывешивания (рис. 15), что уже было показано ранее [Gwag et al., 2009]. Так как отношение P-p70S6k/p70S6k было одинаковым во всех группах, можно предположить, что снижение уровня фосфорилирования p70S6k при вывешивании произошло из-за уменьшения тотального содержания киназы в результате интенсификации протеолиза в мышечном волокне. Однако в обеих группах с растяжением m. soleus снижение уровня фосфорилирования p70S6k было таким же существенным (рис. 15), хотя атрофии m. soleus в этих группах отмечено не было. Можно заключить, что масса мышцы и содержание некоторых белков в группах с растяжением m.soleus поддерживается за счет предотвращения в ней процессов деградации белка. В то же время белковый синтез, регулируемый сигнальным путём Akt-mTOR-p70S6k, в этой группе был снижен. Стоит отметить, что кроме Akt-mTOR-p70S6k существуют другие факторы, участвующие в регуляции белкового синтеза, которые здесь не рассматриваются, например, на уровне трансляции или элонгации. Как у вывешенных животных (группа В), так и у группы с введением L-NAME (группа РН) наблюдалось снижение экспрессии мРНК ТЦМ 1 типа.
Рис. 16. Содержание мРНК ТЦМ 1 в m. soleus у вывешенных (В), вывешенных крыс с растяжением m. soleus (Р), вывешенных крыс с растяжением m. soleus и введением L-NAME (РН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартнльной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от К, р<0,05; " - достоверные отличия от Р, р<0,05.
При растяжении мышцы без ингибирования nNOS такого явления не отмечалось (рис. 16). Повышение экспрессии мРНК ТЦМ lib и II d/x типа относительно группы контроля наблюдалось во всех вывешенных группах. Итак, впервые было показано, что nNOS участвует в регуляции экспрессии мРНК медленных ТЦМ при растяжении мышцы. Smith et al. в 2002 году было отмечено, что
к Т в р т РН
1 I *# i I *#
введение блокатора NO-синтазы (L-NAME) при функциональной перегрузке мышцы предотвращает трансформацию мышечных волокон в сторону большего содержания волокон I типа. Фенотипическая пластичность мышц может регулироваться эндогенным N0 через кальций-кальмодуллин зависимую nNOS [Chin et al., 2005; Drenning et al, 2008].
Таким образом, можно сделать вывод, что нейронапьная NO-синтаза не вносит существенного вклада в предотвращение атрофии во время растяжения m. soleus при вывешивании, но участвует в поддержании экспрессии некоторых мышечных белков. Впервые была выявлена взаимосвязь между работой nNOS в мышце и концентрацией ТЦМ I типа.
Оценка действия L-аргинина и эффекта блокирования nNOS на цитоскелетные белки скелетной мышцы при ее эксцентрическом сокращении. Содержание в мышце N0 в контрольной группе с введением L-аргинина (группа КА) было на 64% (р<0,05) выше, чем у интактных контрольных животных. Ранее N0 был выявлен в интактной мышце, а также при ее сокращении [Balon et al., 1994]. На культуре клеток было показано, что N0 производится в скелетной мышце эндогенно, более того, при сокращении единичного волокна количество N0 в нем увеличивалось [Руе et al., 2007]. Введение ингибитора NOS предотвращало такое увеличение содержания NO. Через 24 часа после бега на тредбане у крыс были обнаружены
Рис. 17. Содержание десмина в m. soleus крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением L-аргинина (ЭА), эксцентрическому бегу с введением L-NAME (ЭН) оценивали относительно уровня данного белка в контроле (К*). Результаты приведены в виде медианы и интерквартнльной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05;
# - достоверные отличия от ЭА, р<0,05.
снижение уровня десмина относительно группы контроля (рис. 17) и разрушения в дистрофиновом слое (рис. 18, 19). Обычно деструкция достигает максимума через 12-24 часа после тренировки, но некоторые белки (титин, небулин) начинают разрушаться позже [Murphy et al., 2006]. В нашей лаборатории ранее также не было обнаружено разрушения титина и небулина через 24 ч после аналогичного бега крыс на тредбане [Немировская и др., 2008]. Ранее было показано, что эксцентрическая Рис. 18 Иммуногистохимическое выявление вызывает снижение
дистрофина. Поперечный срез Ш. soleus. * _ . .
Стрелками указаны разрывы в работоспособности уже через 24 часа после ее дистрофиновом слое мышечных волокон. окончания. Это выражается в снижении
эксцентрического максимального момента силы, максимальной изометрической силы и сопротивления к утомляемости как у крысы [Paddon-Jones et al,, 2001; Kyparos et al., 2011], так и у человека [Paddon-Jones et al.. 2001; Behm et al., 2001]. Полученные в настоящей работе результаты согласуются с предыдущими исследованиями, т.к. в группе ЭБ было также обнаружено снижение работоспособности через 24 часа после эксцентрического бега. Критерием служила работа, выполненная
к ЭБ ЭА ЭН
К о а н X О х 120 ■ 100 ■ 80 ■ I *# I I -# Jm,
(0 X s 60 ■ i
4 Ф s X re 5 а о о 40 ■ 20 ■
к ЭБ ЭА ЭН
■
Рис. 19. Отношение (в процентах) длины разрыва от периметра всего волокна у контрольных животных (К); крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением L-аргинина (ЭА), эксцентрическому бегу с введением L-NAME (ЭН). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05;
# - достоверные отличия от ЭА, р<0,05.
животным во
время теста на физическую работоспособность (рис. 20). Более того, в некоторых работах были получены данные, которые говорят о том, что наряду со снижением работоспособности после эксцентрической нагрузки происходит изменение параметров, характеризующих степень повреждения мышцы, а именно уменьшение диапазона движения [Behm et al., 2001], возникновение отека [Sorichter et al., 2001], мышечной боли [Jamurtas et al., 2000]. что, вероятно, является причинами снижения физической работоспособности.
Рис. 20. Работоспособность крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением L-аргннина (ЭА), эксцентрическому бегу с введением L-NAME (ЭН) оценивали относительно Контроля (К). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05,
# - достоверные отличия от ЭА, р<0,05.
Увеличивается через 24 часа после эксцентрической нагрузки и содержание креатин-киназы, что свидетельствует о повреждении мембраны [Paschalis et al., 2005; Takekura et al., 2001]. Стоит обратить внимание на то, что в группе бегавших крыс (ЭБ) был обнаружен протеолиз мембранного белка дистрофина и цитоскелетного десмина (рис. 17-19), что также может являться причиной снижения работоспособности названной группы. В группе ЭА, которой вводили L-аргинин, наряду с отсутствием деструкции упомянутых белков (рис. 17-19) было обнаружено, что ее работоспособность не была снижена относительно таковой у животных, не подвергавшихся эксцентрическому бегу (группа К, рис. 20). Имеются исследования, в которых была показана взаимосвязь между изменением кальция при эксцентрической тренировке и активацией кальпаинов, разрушающих цитоскелетные белки [Murphy et al., 2006]. При растяжении скелетно-мышечных клеток увеличивается количество N0, что предотвращает протеолиз кальпаинами цитоскелетных белков [Koh et al., 2000; Zhang et al., 2004]. При этом L-аргинин способствует усилению перечисленных эффектов, а блокатор NOS L-NAME препятствует их проявлению. Эти данные говорят о влиянии продукции N0 и активности nNOS на синтез цитоскелетных белков. В группе с блокированием nNOS (ЭН) разрушения цитоскелетных белков были значительны. Вероятно, их протеолиз при эксцентрической нагрузке, который происходит из-за увеличения концентрации кальция и активации им кальпаинов, может быть предотвращен не только снижением концентрации
Рнс. 21. Содержание мРНК ц-кальиаинов в т. soleus крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением L-аргинина (ЭА), эксцентрическому бегу с введением IGNAME (ЭН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и ннтерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05; ■■ - достоверные отличия от ЭА, р<0,05.
кальция (ом. следующий эксперимент), но и увеличением концентрации N0 в мышце, который ингибирует активность р-кальпаина и протеолиз. В группе бегавших крыс с введением L-аргинина (ЭА) было обнаружено, что концентрация мРНК р-кальпаина не отличалась от группы контроля (рис. 21), тогда как во всех остальных группах бегавших крыс (ЭБ и ЭН) она была высокой. Именно в этих группах и были обнаружены самые значительные разрушения цитоскелетных белков. Кальпаины начинают аутолизироваться вскоре после эксцентрической нагрузки [Murphy et al., 2007], кроме того, было найдено и дополнительное увеличение их мРНК в группах ЭБ и ЭН. В этих группах можно было бы ожидать и увеличения концентрации ЕЗ-лигаз (атрогин-1/MAFbx и MuRF-1). Ранее было показано, что атрогин-1 играет существенную роль в снижении мышечной массы через регулирование распада мышечных белков убиквитинированием [Bodine et al., 2001; Gomes et al., 2001]. Однако в группах ЭБ и ЭН концентрация мРНК атрогин-1 /MAFbx и MuRF-1 снижалась более выражено (рис. 22), чем в группе ЭА.
Рис. 22. Содержание мРНК MAFbx и MuRF-1 в ш. soleus крыс, подвергшихся
эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением L-аргинина (ЭА), эксцентрическому бегу с введением L-NAME (ЭН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и ннтернвартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05; - достоверные отличия от ЭА.
Такое же снижение атрогина-1/MAFbx было обнаружено ранее через 24 часа после эксцентрической однократной нагрузки у испытуемых [Kostek et al., 2007]. Концентрация ЕЗ-лигаз в мышце после нагрузки снижалась в 3,3 раза относительно базального уровня. Авторы отмечают, что длительная эксцентрическая тренировка у людей вызывает наибольшую гипертрофию. Однако они также не смогли объяснить феномен снижения концентрации ЕЗ-лигаз после однократной эксцентрической нагрузки, когда наблюдается разрушение некоторых цитоскелетных белков. В нашем случае разрушение цитоскелетных белков могло происходить из-за активации кальпаинов, в то время как анаболическая сигнальная система уже могла активироваться. Поэтому длительное применение L-аргинина может привести к отсутствию тренировочного эффекта. Интересно отметить, что в группе ЭБ экспрессия мРНК nNOS через 24 ч после бега была достоверно выше, чем в группе контроля (рис. 23). Ранее Roberts et al. в 1999 г.
MAFbx eMuRF-1
ЭБ ЭА ЭН
0,0 ■
и
< -0,4 ■
-0,8 -
IT
-1,2 -
показали увеличение активности гМОБ и еМОБ при остром сокращении скелетной мышцы. Было выдвинуто предположение, что увеличение экспрессии мРНК п1\105 в эксперименте могло произойти в ответ на истощение субстрата при беге и недостаток продукции N0 в волокне. Во всяком случае, именно этими причинами объясняется увеличение активности, например, окислительных ферментов скелетных мышц при аэробной тренировке выносливости у спортсменов. В группе ЭА содержание мРНК п^ЮБ не отличалось от уровня контроля (рис. 23), что может быть связано с достаточным количеством субстрата и N0 во
Рис. 23. Содержание мРНК п1ЧО§ в ш. крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением Ь-аргинина (ЭА), эксцентрическому бегу с введением Ь^АМЕ (ЭН) оценивали относительно контрольного (К) уровня. Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05;
* - достоверные отлнчия от ЭА, р<0,05.
время выполнения беговой нагрузки. Блокирование работы пМОЭ Ь-ЫАМЕ привело к повышению уровня мРНК пЫОБ после беговой нагрузки как относительно уровня контроля, так и группы ЭБ (рис. 23). Такие изменения в экспрессии мРНК выглядят как обратная регуляция синтеза белка. Итак, было найдено, что введение Ь-аргинина перед эксцентрической нагрузкой приводит к увеличению в т. вокив концентрации N0 по сравнению с группой контроля, отсутствию повреждений в дистрофиновом слое мышечных волокон, предотвращению снижения уровня десмина, увеличению работоспособности животных относительно группы, подвергавшейся эксцентрическому бегу и группы, в которой блокировали функцию иЫОЗ перед беговым тестом, а также к отсутствию увеличения в ней уровня мРНК пЫОБ через 24 часа после бега. Таким образом, профилактическое введение Ь-аргинина ведет к предотвращению повреждений цитоскелетных белков и увеличивает работоспособность после однократной эксцентрической нагрузки.
Эффект блокады Ь-кальциевых каналов при эксцентрической нагрузке. Ранее было показано, что эксцентрическая тренировка индуцирует повреждения сократительных и цитоскелетных компонентов мышечных волокон |ТгапсЬеп е! а1., 1996; Anrlstrong е1 а1., 1983].
Рис. 24. Отношение (в процентах) длины разрыва от периметра всего волокна у контрольных животных (К)", крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением нифеднпина (ЭФ). Результаты приведены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05; и - достоверные отличия от ЭФ, р<0,05.
Причем самые ранние события в мышечном повреждении ПО своей природе являются механическими, в то время как поздние события указывают.
Т * 4- *# I
I ' к ЭБ 1 ЭА ЭН
*#
I,
ЭБ ЭФ
что они могут быть результатом процессов ремоделирования мышцы. Причиной поздних изменений может быть накопление кальция. Кальций является сигнальной молекулой, которая способна инициировать протеолитические процессы в скелетных мышцах [Murphy et al., 2007]. Имеется ввиду базальный кальций, концентрация которого в мышечном волокне повышается во время и после эксцентрической нагрузки [Duan et al., 1990; Lowe et al., 1994]. Кальциевые каналы активируются очень медленно и концентрация Са2+ очень низка для активации сокращения. Повышение концентрации базального кальция может быть результатом нескольких событий: снижения интегративности мембраны саркоплазматического ретикулума; разрывов в сарколемме; открытия механо-чувствительных каналов, реагирующих на растяжение или изменения в триадах и ориентации т-трубочек, приводящие к входу кальция через потенциал-чувствительные каналы (такие как дигидропиридиновые рецепторы DHPR) [Duan et al., 1990; Belcastro et al., 1998]. В экспериментах in vitro было показано, что блокада DHPR нифедипином предотвращает накопление кальция, вызванное сокращением [Soza et al., 1986].
Рис. 25. Содержание десмина в ш. soleus крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением нифедипина (ЭФ) оценивали относительно уровня данного белка в контроле (К). Результаты приведены в виде медианы и иитерквартильной широты (0,25-0,75). * - достоверные отличия от ЭБ, р<0.05.
В работе было обнаружено увеличение длины разрывов в дистрофиновом слое у крыс через 24 часа после бега на тредбане (рис. 24). Дистрофиновый комплекс весьма чувствителен к уровню сократительной активности скелетной мышцы. Ранее также показывали разрывы в дистрофиновом слое при интенсивном повторном сокращении мышцы [Peters et al., 2003]. Beaton et al. в эксперименте с участием добровольцев обнаружили очень незначительные повреждения дистрофинового слоя после нагрузки, на которые введение амлодипина не оказало эффекта [Beaton et al., 2002]. Вероятно, выбранная нагрузка была недостаточна для повреждения дистрофинового комплекса. После эксцентрических сокращений мышцы обычно наблюдают разрушение (или повреждение) десмина [Komulainen et al., 1998; Peters et al., 2003]. Через 24 ч после бега крыс с введением нифедипина не было найдено отличий между ними и животными группы контроля в содержании десмина в m. soleus (рис. 25). В отличие от предыдущих экспериментов на животных в эксперименте на людях-добровольцах при введении амлодипина группа авторов не обнаружила снижения уровня десмина в мышце после тренировки [Beaton et al., 2002]. Не исключено, что этот эффект связан с недостаточной интенсивностью применяемой тренировки. Также известно, что десмин является субстратом для кальпаина, который активируется кальцием [Barash et al., 2002]. Введение блокатора кальциевых каналов L-типа предотвратило разрушение десмина в нашем эксперименте. Различия в результатах экспериментов разных авторов могут быть связаны с тем, что повреждения после эксцентрической нагрузки различаются в мышцах с разной архитектурой и различным типом волокон. Кроме того, различные мышцы не одинаково вовлечены в тот или иной вид нагрузки. Одной из целей проведенного эксперимента с эксцентрической нагрузкой было предотвратить падение работоспособности животных после однократной эксцентрической
к ЭБ ЭФ
К ц о ? 120 100 ■ * Т * Т
0 X
о5 80 ■ 1
X S 5 0 0) сг 0) S X 1 а 0) Ct о О 60 ■ 40 ■ 20 ■
к ЭБ ЭФ
Рис. 26. Работоспособность крыс, подвергшихся эксцентрическому бегу (ЭБ), эксцентрическому бегу с введением нифедипина (ЭФ) оценивали относительно Контроля (К). Результаты приведены в виде медианы II ннтерквартильной широты (0,25-0,75).
* - достоверные отличия от К, р<0,05,
# - достоверные отличия от ЭФ, р<0,05.
нагрузки с помощью профилактического введения нифедипина. В группе, которой вводили нифедипин, работоспособность не отличалась от таковой в контрольной группе, в отличие от группы ЭБ, где работоспособность снизилась
относительно группы К (рис. 26). Таким образом, можно заключить, что введение нифедипина при эксцентрической нагрузке предотвращает разрушение цитоекелетных белков в т. вокиэ и снижение работоспособности через 24 часа после однократной эксцентрической нагрузки.
ВЫВОДЫ
1. Поддержание концентрации N0 в ш. 8о1еиз на уровне группы контроля с помощью введения его предшественника Ь-аргинина при 14-дневном вывешивании крыс снижает степень атрофии мышцы и предотвращает уменьшение содержания десмина; чему способствует как отсутствие увеличения уровня компонентов системы протеасомной деградации (атрогин-1/МАБЬх, МиЫМ), так и поддержание интенсивности синтеза белка рибосомальной р7086-киназой.
2. Нейрональная ЫО-синтаза не вносит существенного вклада в предотвращение атрофии и не вызывает уменьшение содержания ЕЗ-убиквитин-лигаз (атрогин-1/МАРЬх, МиЯР-1) во время растяжения т. зокив при 14-дневном вывешивании крыс, но участвует в поддержании экспрессии миофибриллярного белка а-актина. Система синтеза АЙ-тТ011-р7086к не принимает участия в предотвращении атрофии во время растяжения.
3. Введение предшественника N0 Ь-аргинина при 14-дневном вывешивании крыс предотвращает снижение мРНК тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I типа; кроме того, блокирование нейрональной ЫО-синтазы во время растяжения на фоне разгрузки способствует снижению экспрессии мРНК ТЦМ 1 типа.
4. Введение предшественника N0 Ь-аргинина при однократном эксцентрическом беге крыс предотвращает уменьшение содержания цитоекелетных белков, дистрофина и десмина, увеличивает работоспособность крыс, а блокирование нейрональной ЫО-синтазы при той же нагрузке приводит к их разрушению и снижению работоспособности животных.
5. Блокирование кальциевых каналов Ь-типа при однократной эксцентрической нагрузке предотвращает или существенно снижает степень разрушения дистрофина и десмина, а также приводит к предотвращению снижения работоспособности крыс.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах:
1. Немировская Т.Л., Ломоносова (Китина) Ю.Н., Железнякова А.В., Вихляндцев И.М Цигоскелетные белки и белки теплового шока 27 при эксцентрической нагрузке: эффекты блокады L-кальциевых каналов // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2008, 94(3), С.293-300.
2. Ломоносова Ю.Н., Железнякова А.В., Бугрова А.Е., Жирякова А.В., Каламкаров Г.Р., Немировская Т.Л Защитное действие оксида азота на цитоскелетные белки скелетных мышц при эксцентрической нагрузке // Биофизика. 2009, 54(3), С.515-21.
3. Kartashkina N.L, Lomonosova Y.N., Shevchenko T.F., Bugrova A.E., Kalamkarov G.R, Nemirovskaya T.L. Prevention of muscle fibers atrophy during gravitational unloading: the effect of L-arginine administration // Acta Astronáutica. 2010, 68, P.1486-94.
4. Ломоносова Ю.Н., Каламкаров Г.Р., Бугрова A.E., Шевченко Т.Ф., Карташкина Н.Л., Лысенко Е.А., Швец В.И., Немировская Т.Л. Защитное действие L-аргинина на белки m.soleus при функциональной разгрузке мышцы // Биохимия. 2011, 76(5), С.699-710. Патенты:
5. Патент РФ 2389486 С1, МПК А61К 31/198. Ингибитор протеолиза цитоскелетных белков скелетных мышц при физической нагрузке / Немировская Т.Л., Китина (Ломоносова) Ю.Н., Железнякова А.В., Архипенко Ю.В. - Опубл. 20.05.2010. Бюл. №14.
6. Патент РФ 2391968 С1, МПК А61К 31/136. Способ профилактики разрушения цитоскелетных белков скелетных мышц при эксцентрической нагрузке / Немировская Т.Л., Китина (Ломоносова) Ю.Н., Железнякова А.В., Архипенко Ю.В. - Опубл. 20.06.2010. Бюл. №17.
Тезисы конференций:
7. Lomonosova (Kitina) Y., Zelesnjakova A., Nemirovskaya Т. Cytoskeletal structures of muscle fiber under eccentric exercise. Effects of calcium L-type channels blockade // Joint British-Russian Young Scientists Workshop: Muscles structure, function, regulation. Yekaterinburg, Russia, 2007, P.ll.
8. Ломоносова (Китина) Ю.Н. Протекторные действия нифедипина на цитоскелетные белки скелетной мышцы при эксцентрической нагрузке // 59-тая научно-техническая конференция студентов, МИТХТ им. М.В. Ломоносова. Москва, 2007, С. 15.
9. Nemirovskaya T.L., Zelesnjakova A.V., Kitina (Lomonosova) J.N., Vichlyandtsev I.M., Shenkman B.S. Muscle cytoskeletal and HSP27 under eccentric exercise and hindlimb suspension (HS) of rats: Effects of calcium L-type channels blockade // 36th European Muscle Conference of the European Society for Muscle Research. Stockholm, Sweden, 2007, P.30.
10. Ломоносова (Китина) Ю.Н. Что регулирует экспрессию тяжелых цепей миозина в m.soleus при снижении двигательной активности? // 7-я Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная дню космонавтики и приуроченная к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Москва, 2008, С.43.
11. Lomonosova (Kitina) Y., Zhelesnyakova A., Bugrova A., Zhiryakova A., Nemirovskaya T. Cytoskeletal proteins of muscle fibers under eccentric exercise: effects of L-arginine administration // 7th International Symposium "Biological Motility: Achievements and perspectives". Pushcino, Moscow, 2008, V.l, P.35.
12. Y. Lomonosova (Kitina), A. Zhelesnyakova, A. Bugrova, A. Zhiryakova, T. Nemirovskaya Cytoskeletal proteins of muscle fibers under eccentric exercise: effects of L-arginine administration // 37th European Muscle Conference of the European Society for Muscle Research, Oxford, UK, 2008, P.50.
13. Ломоносова Ю.Н., Карташкина Н.Л., Бугрова A.E., Аболтин П.В Уровень мРНК атрогина-1 при снижении функциональной активности скелетных мышц: эффекты введения
L-аргинина // Конференция "Ломоносов-2009", секция "Фундаментальная медицина". Москва, 2009, С.21.
14. Карташкина Н.Л., Ломоносова Ю.Н., Бугрова А.Е., Аболтин П.В. Предотвращение атрофии мышечных волокон при гравитационной разгрузке: эффекты введения L-аргинина // 8-я Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2009, С.22.
15. Lomonosova Y., Kartashkina N, Bugrova A, Kalamkarov G, Nemirobskaya T. Prevention of muscle fiber atrophy induced by gravitational unloading: effect of L-arginine administration // 14th International Conference Biochemistry of Exercise: Muscle as Molecular and Metabolic Machines. Ontario, Canada, 2009, P.74.
16. Lomonosova Y.N., Kartashkina N.L., Shevchenko T.F., Bugrova A.E., Kalamkarov G.R., Nemirobskaya T.L. Prevention of muscle fiber atrophy during gravitational unloading: effect of L-arginine administration // 17th IAA Humans in Space Symposium. Moscow, Russia, 2009, P.81.
17. Lomonosova Y., Kartashkina N, Bugrova A, Kalamkarov G, Nemirobskaya T. Prevention of muscle fiber atrophy induced by gravitational unloading: effect of L-arginine administration // 30th Annual International Gravitational Physiology Meeting. Xi'an, China, 2009, P. 112.
18. Lomonosova Y., Kartashkina N, Bugrova A, Kalamkarov G, Nemirobskaya T. Effect of NO on desmin degradation of unweighted m.soleus in rats // 38th European Muscle Conference of the European Society for Muscle Research. Lille, France, 2009, P.28.
19. Lomonosova Y., Kartashkina N, Bugrova A, Kalamkarov G, Nemirobskaya T. Role of NO in prevention of cytoskeletal proteins degradation under various level of muscle's contractile activity // 38th European Muscle Conference of the European Society for Muscle Research. Lille, France, 2009, P.29.
20. Ломоносова Ю.Н., Карташкина Н.Л. Участие nNOS в поддержании белкового метаболизма растянутой m.soleus крыс на фоне функциональной разгрузки // 9-я Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2010, С.55.
21. Nemirovskaya T.L., Lomonosova Y.N. Mechanisms of protective and signaling effects of nitric oxide on skeletal muscle fibers under various levels of contractile activities // 9th International Symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies". Pushchino, Russia, 2010, P.191.
22. Lomonosova Y., Nemirovskaya Т., Kartashkina N. Role of nNOS activity in stretch-induced m.soleus atrophy prevention in hindlimb suspended rats // 31st Annual ISGP Meeting: Life in Space for Life on Earth. Trieste, Italy, 2010, P.96.
23. Lomonosova Y.N., Kalamkarov G.R., Kartashkina N.L., Lisenko E.A, Nemirovskaya T.L. Influence of nNOS activity changes on signaling pathways of rat soleus under unloading and stretching // 39th European Muscle Conference. Padua, Italy, 2010, P.l 17.
24. Ломоносова Ю.Н., Немировская Т.Л. Механизм защитного и сигнального действия N0 на скелетные мышцы при гравитационной разгрузке // 29-й Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. Калуга, 2010, С.434.
25. Ломоносова Ю.Н., Швец В.И., Карташкина Н.Л., Лысенко Е.А., Немировская Т.Л. Роль nNOS в поддержании белкового синтеза при растяжении m.soleus крысы в условиях снижения функциональной активности // 6-я Всероссийская с международным участием Школа-конференция по физиологии мышц и мышечной деятельности: Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности. Москва, 2011. С.27.
26. Немировская Т.Л., Ломоносова Ю Н. Функция нейрональной NO-синтазы в скелетной мышце // 6-я Всероссийская с международным участием Школа-конференция по физиологии мышц и мышечной деятельности: Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности. Москва, 2011. С.32.
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ЭГТА - этиленгликоль-бис(2-аминоэтил-эфир)тетрауксусная кислота ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
атрогин-1/MAFbx - ЕЗ-убиквитинлигаза (атрогин-1/muscle atrophy F-box)
Akt/PKB — протеинкиназа В
DHPR - дигидропиридиновые рецепторы
IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста 1
L-NAME- N-(0Mera)-HHTp0-L-apriiHiiii метиловый эфир
MuRF-1 - ЕЗ-убиквитинлигаза (muscle ring finger 1)
m. soleus - musculus soleus;
mTOR - белок, активность которого блокируется раламицином (mammalian target of rapamicin)
nNOS - нейрональная синтаза оксида азота II p70S6k - киназа S6 рибосомального белка р70
Подписано в печать 13.02.12 Заказ № 46 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86 (495) 936-88-35 (494) 434-83-55
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ломоносова, Юлия Николаевна, Москва
61 12-3/773
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН, Московский государственный университет тонкой химической технологии
им. М.В. Ломоносова.
На ща^ах рукописи
Ломоносова Юлия Николаевна
ЗАЩИТНОЕ И СИГНАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ОКСИДА АЗОТА II НА ВОЛОКНА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УРОВНЯХ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
03.03.01 - физиология 03.01.04 - биохимия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научные руководители: доктор биологических наук Т.Л. Немировская доктор химических наук, профессор, академик РАМН В.И. Швец
Москва-2012
Список сокращений.................................................................................................4
ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................12
1.1. Ж)-синтаза: структура и функции...........................................................12
1.1.1. Оксид азота II.......................................................................................12
1.1.2. Функции Ь-аргинина...........................................................................12
1.1.3. Структура нейрональной Ж)-синтазы. Образование N0...............13
1.1.4. Изоформы Ж)-синтазы.......................................................................15
1.1.5. Механизмы действия N0....................................................................18
1.2. Функциональная разгрузка скелетной мышцы......................................19
1.2.1. Модель функциональной разгрузки. Вывешивание........................19
1.2.2. Вывешивание и мышечная масса.......................................................20
1.2.3. Механизмы ответственные за потерю белка в скелетной мышце..21
1.2.4. Участие N0 в регуляции метаболизма скелетной мышцы при функциональной разгрузке...........................................................................28
1.3. Функция N0 в сокращающейся мышце. Регуляция кальпаин-опосредованного цитоскелетного протеолиза...............................................31
1.4. Регуляция убиквитин-протеасомной системы после физической нагрузки.............................................................................................................35
1.5. Роль кальция в разрушении цитоскелетных белков при эксцентрической нагрузке...............................................................................35
2. ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................38
2.1. Экспериментальные методы и подходы.................................................38
2.1.1. Объект исследований..........................................................................38
2.1.2. Вывешивание крыс. Применение Ь-аргинина..................................38
2.1.3. Пассивное растяжение т. 8о1еш на фоне вывешивания. Введение б локатора нейрональной Ж)-синтазы Ь-ЫАМЕ........................................40
2.1.4. Эксцентрическая нагрузка крыс. Применение предшественника N0 Ь-аргинина и блокатора нейрональной ТчЮ-синтазы Ь^АМЕ.................41
2.1.5. Эксцентрическая нагрузка крыс. Эффект блокады кальциевых каналов Ь-типа................................................................................................43
2.2. Методики обработки биоматериала и анализ данных...........................44
2.2.1. ДДС-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом...............44
2.2.2. Исследование экспрессии генов.........................................................47
2
2.2.3. Иммуногистохимическое выявление дистрофина...........................52
2.2.4. Описание теста на работоспособность..............................................52
2.3. Анализ полученных данных.....................................................................53
2.3.1. Анализ блотов......................................................................................53
2.3.2. Анализ данных ПЦР-РВ......................................................................54
2.3.3. Анализ препаратов после иммуногистохимической реакции.........54
2.4. Статистическая обработка данных..........................................................55
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................56
3.1. Исследование действия Ь-аргинина на атрофию т. 8о1еи8 при вывешивании.....................................................................................................56
3.2. Оценка вклада нейрональной ]ЧО-синтазы в предотвращение атрофии в скелетной мышце при ее растяжении на фоне снижения двигательной активности.........................................................................................................63
3.3. Оценка действия Ь-аргинина и эффекта блокирования пЖ)8 на цитоскелетные белки скелетной мышцы при ее эксцентрическом сокращении.......................................................................................................69
3.4. Эффект блокады Ь-кальциевых каналов при эксцентрической нагрузке.............................................................................................................76
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................80
4.1. Защитное действие предшественника N0 Ь-аргинина на белки скелетной мышцы при функциональной разгрузке......................................80
4.2. Роль активности нейрональной ТЧО-синтазы в предотвращении атрофии растянутой т. 8о1еш крыс................................................................85
4.3. Действие предшественника N0 Ь-аргинина и б локатора >Ю-синтазы Ь-ЫАМЕ на цитоскелетные белки при эксцентрической нагрузке............88
4.4. Блокирование Ь-кальциевых каналов при эксцентрической нагрузке. ............................................................................................................................92
ВЫВОДЫ:.............................................................................................................95
Список литературы................................................................................................96
Список сокращений.
MB - мышечное волокно
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат ФАД - флавинадениндинуклеотида ФМН - флавинмононуклеотида
ЭГТА - этиленгликоль-бис(2-аминоэтил-эфир)тетрауксусная кислота ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
атрогин-1/MAFbx - ЕЗ-убиквитин-лигаза (атрогин-1 /muscle atrophy F-box)
Akt/PKB — протеинкиназа В
ВН4 - (6R)- 5,6,7,8 ,-тетрагидробиоптерина
СаМ - кальмодулин
DHPR - дигидропиридиновые рецепторы eNOS - эндотелиальная синатаза оксида азота II
eIF2B - фактор инициации трансляции 2В, способствующий замене ГДФ на ГТФ в нуклеотидсвязывающем сайте eIF2 eIF2 - фактор инициации трансляции 2
eIF4E - фактор инициации трансляции 4Е ( 5'-сар-связывающий фактор) Foxo - транскрипционный фактор
GSK3ß - киназа гликоген-синтазы 3ß (glycogen sintase kinase 3ß)
IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста 1
L-NAME - ]Ч-(омега)-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир
MuRF-1 - ЕЗ-убиквитин-лигаза (muscle ring finger 1)
m. soleus - musculus soleus;
mTOR - белок, активность которого блокируется рапамицином (mammalian target of rapamicin)
NF-kB - транскрипционный фактор (nuclear factor-кВ transcription factor)
nNOS - нейрональная синтаза оксида азота II
PHAS-1/4E-BP1 - связывающий фактор инициации трансляции 4Е
p70S6k - киназа S 6 рибосомального белка р70
P-p70S6k - фосфорилированная форма p70S6k
4
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность работы.
Известно, что при функциональной разгрузке мышц их цитоскелетные и сократительные белки подвергаются деструкции [1-3]. Было показано, что функциональная разгрузка уже через 14 дней приводит к тому, что атрофия т. 8о1еи8 достигает 40-45%. При этом наибольший вклад в снижение мышечной массы при разгрузке вносят сократительные белки [1,3]. В то же время в значительной степени страдают и многие белки цитоскелетного аппарата мышцы [1]. Клеточные факторы, запускающие процессы протеолиза белков при атрофии исследованы недостаточно. Известна роль кальция в процессе запуска протеолиза цитоскелетных белков [4, 5]. Было показано, что кальций активирует цистеиновые протеазы кальпаины [5]. Так же известно, что кальпаины в свою очередь активируют убиквитин-протеасомную систему протеолиза, которая представляет собой наиболее мощную протеолитическую систему в клетке [6, 7]. В то же время появляется все больше свидетельств того, что N0 также может участвовать в процессах регуляции белкового метаболизма скелетных мышц. Так наряду с увеличением концентрации кальция в ряде работ было показано снижение содержания нейрональной ЫО-синтазы (п1Ч08) при длительном уменьшении двигательной активности и разрушении мышечных белков [8, 9], а увеличение содержания N0 частично предотвращает распад цитоскелетных белков, вызванный введением кальциевых ионофоров в культуре мышечных клеток [10]. Более того, предшественник N0 Ь-аргинин повышает содержание утрофина в мышах шёх [11, 12]. Такие данные наводят на мысль о том, что эти процессы взаимосвязаны. Было предположено, что введение Ь-аргинина может поддержать вероятное снижение сигнальной молекулы N0, что приведет к снижению степени атрофии при функциональной разгрузке т. 8о1еш. При этом были оценены основные компоненты системы распада, а именно ЕЗ-убиквитин-лигазы, и синтеза белка, р7086-киназы и их фосфорилированная форма.
Одним из способов предотвращения атрофии m. soleus во время функциональной разгрузки является её пассивное растяжение [13, 14]. Механизмы, которые приводят к такому положительному действию при применении растяжения, изучены весьма слабо. Одним из претендентов, поддерживающим белковый гомеостаз мышцы и предотвращающим атрофию таким способом, с высокой вероятностью является nNOS т.к. она ассоциирована с мембранным дистрофин-саркогликановым комплексом. Таким образом, растяжение может активировать работу nNOS, тем самым, повышая продукцию N0. Так, к примеру, помимо упомянутого эффекта NO препятствовать распаду белков в культуре мышечной ткани [10-12], было показано, что количество данной молекулы увеличивается при сокращении волокна [15] и растяжении скелетно-мышечных клеток [16], при этом увеличивается активность nNOS и синтез некоторых цитоскелетных белков. Все эти работы свидетельствуют о том, что существует явная связь между метаболизмом цитоскелетных белков, продукцией N0 и активностью nNOS в мышечных волокнах. Проведенные ранее исследования были выполнены с использованием культур ткани, однако их результаты позволяют провести аналогию с эффектами, которые наблюдаются в мышце in vivo при её растяжении. Предположение об участии в поддержании белкового метаболизма проверялось блокированием nNOS с помощью L-NAME при растяжении на фоне функциональной разгрузки. Если данная гипотеза верна, то будет обнаружена атрофия в растянутой мышце при применении L-NAME.
В данной работе не осталось без внимания одна из самых повреждающих физических нагрузок, а именно эксцентрическая (сокращение мышцы на фоне её растяжения). При этом разрушаются многие цитоскелетные белки (десмин, дистрофии, спектрин, актинин) [17], как в мышцах человека, так и в мышцах животных, что приводит к значительному снижению их работоспособности. Десмин и дистрофии - цитосклетные белки, обеспечивающие интеграцию внутриклеточных структур мышечного
6
волокна и сократительную функцию мышц [1]. Поэтому исследование распада этих белков при эксцентрической нагрузке представляет существенный интерес. Ранее было показано, что эксцентрическая нагрузка приводит к увеличению концентрации кальция в мышечном волокне [18], а как было отмечено выше, кальций необходим для запуска работы протеаз кальпаинов [5], функция которых может блокироваться N0 [19]. В рамках данной работы была проверена гипотеза о защитной функции Ь-аргинина и N0 на содержание цитоскелетных белков и при однократной эксцентрической нагрузке, а также оценена работоспособность животных через 24 часа.
Дополнительный эксперимент с эксцентрической нагрузкой был проведен для решения задачи, касающейся путей поступления кальция в миоплазму мышечного волокна, т.к. данный вопрос достаточно не изучен. Кальций может проникать из внеклеточного пространства через различные типы наружных кальциевых каналов, а также просачиваться из структур саркоплазматического ретикулума. В настоящей работе был проанализирован один из путей поступления кальция в миоплазму, а именно через кальциевые каналы Ь-типа. Было предположено, что введение нифедипина, блокатора кальциевых каналов Ь-типа, предотвратит распад цитоскелетных белков при эксцентрической нагрузке и повысит работоспособность животных.
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования являлся анализ фундаментальной проблемы клеточной физиологии, связанной с исследованием механизмов защитного и сигнального действия N0 на скелетно-мышечные волокна при функциональной разгрузке, их растяжении на фоне разгрузки, а также при эксцентрическом сокращении.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить влияние введения предшественника N0 Ь-аргинина на степень атрофии т. 8о1еш, содержание цитоскелетного белка десмина во время вывешивания крыс; выявить действие N0 на сигнальный путь убиквитин-протеасомной деградации, ЕЗ-лигазы, и синтеза белка, р7086-киназы, при функциональной разгрузке крыс.
2. Охарактеризовать вклад нейрональной КО-синтазы в предотвращение атрофии, разрушения цитоскелетного белка десмина и миофибриллярного а-актина, проанализировать работу сигнальных путей, участвующих в белковом обмене (Ак1>тТОН-р7086к, ЕЗ-лигазы) в т. 8о1еш, во время растяжения т. 8о1еи8 на фоне ее функциональной разгрузки.
3. Исследовать эффект введения предшественника N0 Ь-аргинина на трансформацию тяжёлых цепей миозина (ТЦМ) I типа в сторону ТЦМ II типа при снижении функциональной активности т. 8о1еш и оценить влияние нейрональной 1\Ю-синтазы на экспрессию ТЦМ I типа при растяжении т. 8о1еш на фоне разгрузки.
4. Оценить защитную функцию Ь-аргинина и N0 на содержание цитоскелетных белков т. 8о1еш при однократной эксцентрической нагрузке, а также исследовать влияние применения Ь-аргинина на работоспособность крыс, подвергшихся однократной эксцентрической нагрузке.
5. Изучить роль кальциевых каналов Ь-типа в протеолизе цитоскелетных белков т. 8о1еш, а также в изменении работоспособности крыс после однократной эксцентрической нагрузки.
Положения, выносимые на защиту.
1. Введение предшественника N0 L-аргинина позволяет предупредить разрушение цитоскелетных белков в скелетной мышце, как при интенсивной эксцентрической нагрузке, так и функциональной разгрузке; увеличивает работоспособность после однократной эксцентрической нагрузки. Более того, нейрональная NO-синтаза участвует в регуляции экспрессии мРНК тяжёлых цепей миозина (ТЦМ) I типа.
2. Растяжение скелетной мышцы приводит к предотвращению атрофии во время функциональной разгрузки, но роль нейрональной NO-снитазы в поддержании массы мышцы незначительна.
3. Предотвращение поступления кальция через кальциевые каналы L-типа в мышечное волокно препятствует повреждению цитоскелетных белков при однократной эксцентрической нагрузке и снижению работоспособности после неё.
Научная новизна работы.
1. Впервые показано, что введение L-аргинина при функциональной разгрузке и перед однократной эксцентрической нагрузкой приводит к увеличению в m. soleus концентрации N0. Более того, обнаружено защитное действие L-аргинина на белковый метаболизм скелетных мышц при функциональной разгрузке, а также однократной эксцентрической нагрузке. Введение L-аргинина при функциональной разгрузке поддерживает экспрессию мРНК MAFbx, MuRF-1 и содержание р7086-киназ на контрольном уровне.
2. Впервые оценен вклад NO-зависимой сигнальной системы в поддержание белкового метаболизма скелетных мышц in vivo при их растяжении на фоне функциональной разгрузки. Обнаружено, что блокирование нейрональной NO-синтазы (nNOS) при растяжении т.
8о1еи8 на фоне разгрузки не приводит к развитию атрофии и увеличениею экспрессии мРНК МАЬЬх и МиШМ.
3. Впервые обнаружено, что п1Ч08 принимает участие в регуляции тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I типа. Введение предшественника N0 Ь-аргинина при функциональной разгрузке т. 8о1еш поддерживает содержание мРНК ТЦМ I типа на контрольном уровне, а блокирование п!ЧГ08 при растяжении т. 8о1еш на фоне разгрузки приводит к снижению содержания мРНК ТЦМ I типа.
4. Впервые показано, что одним из путей поступления кальция в мышечное волокно при однократной эксцентрической нагрузке являются кальциевые каналы Ь-типа, их блокирование существенно снижает степень разрушения цитоскелетных белков в скелетной мышце при однократной эксцентрической нагрузке и увеличивает работоспособность после неё.
Научно-практическая значимость.
Значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о физиологических и клеточных механизмах, запускающих процесс адаптации скелетных мышц к разным режимам сократительной активности. Идентификация N0 как сигнального фактора, участвующего в регуляции белкового синтеза, является фундаментальным направлением, которое может найти приложение в нейрологии, экстремальной и реабилитационной медицине, в разработке новых программ тренировки спортсменов. Предшественник N0 Ь-аргинин может быть применен в качестве средства профилактики разрушения цитоскелетных белков скелетных мышц при эксцентрической нагрузке, а также при атрофии мышц, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой, с целью устранения их негативных последствий. Более того, введение Ь-аргинина может препятствовать возникновению отставленной мышечной боли, вызванной протеолизом, у спортсменов после интенсивных эксцентрических нагрузок,
10
тем самым, повышая их работоспособность. Увеличение концентрации N0 может быть использовано для снижения экспрессии ЕЗ-убиквитин-лигаз, участвующих в протеасомной деградации белков и для предотвращения снижения экспрессии тяжелых цепей миозина I типа. Результат�
-
Ломоносова, Юлия Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.03.01
- Локальная и дистантная регуляция сократительной активности гладких мышц воздухоносных путей
- Синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс при физических нагрузках и введении 17а-метилтестостерона
- Цитоскелетные компоненты мышечных волокон и коллаген в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки.
- Сократительные свойства диафрагмальной мышцы морской свинки в норме и в условиях экспериментальной патологии
- Изменение содержания оксида азота в тканях крыс при гипокинезии различной длительности
