Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс при физических нагрузках и введении 17а-метилтестостерона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс при физических нагрузках и введении 17а-метилтестостерона"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Г 6 од

на правах рукописи

Турханова Людмила Владимировна

СИНТЕЗ ПОЛИАМИНОВ В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ КРЫС ПРИ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗКАХ И ВВЕДЕНИИ 17а-МЕТИЛТЕСТОСТЕРОНА

специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте физической культуры

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор В.А. Рогозкин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Михайлов С.С. кандидат биологических наук, доцент Шведова В.Н.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита состоится 30 июня 1998 года в 13 часов на заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской химико-фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат диссертации разослан "Л« 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. К настоящему времени известно, что физические нагрузки (ФН) сопровождаются многочисленными биохимическими изменениями в организме, которые зависят от интенсивности и длительности мышечной деятельности [Яковлев, 1974; Меньшиков, Волков, 1986]. Прежде всего эти изменения затрагивают скелетные мышцы - ткань, обеспечивающую двигательную активность организма.

Изучение процессов синтеза белка и путей его регуляции в скелетных мышцах занимает одно из центральных мест в функциональной биохимии. Исследования, проведённые в секторе биохимии СПб НИИ Физической культуры показали, что:

1) в восстановительный период после однократных и систематических ФН в скелетных мышцах происходят изменения, затрагивающие все основные процессы синтеза белка транскрипцию [Зильбер, Рогозкин, 1971; Плискин, 1973; Фельдкорен, 1979], ядерно-цитоплазматический транспорт [Плискин, 1973; Морозов, 1976], трансляцию [Литвинова, Рогозкин, 1970];

2) синтез белков в скелетных мышцах регулируется андрогенами и их синтетическими аналогами [Фельдкорен, 1979; Рогозкин, 1988]. В частности было установлено, что анаболические стероиды регулируют активность фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы I, что в конечном итоге приводит к усиленному синтезу как сократительных, так и энзиматических белков скелетных мышц. Анаболические стероиды привлекают особое внимание исследователей из за их широкого применения в медицинской практике, что связано с выраженным миотропным эффектом аналогов андрогенов [Пивницкий, 1974; Рогозкин, 1988].

В последнее время принимается, что андрогены реализуют свой метаболический эффект через индукцию синтеза некоторых андроген- зависимых ферментов, которые выполняют важные функции в клетках и обеспечивают дальнейшее метаболическое действие андрогенов при стимуляции анаболических процессов. Это предположение было сделано на основании фактов о том, что концентрация тестостерона увеличивается в крови животных практически сразу после выполнения физических нагрузок, то есть

во время выраженных катаболических процессов в скелетных мышцах.

К группе ферментов, активно отвечающих на действие андрогенов во многих органах животных относятся ключевые ферменты синтеза полиаминов - орнитиндекарбоксилаза (ОДК) и S-аденозилметиониндекарбоксилаза (S-АМДК) [Ярыгин, 1987; Seiler, 1996]. Эти ферменты катализируют синтез полиаминов (путресцина, спермидина, спермина), которые активируют РНК-полимеразы [Jacob, Rose, 1978; Abraham, Pihl, 1981], влияют на ацетилирование гистонов и негистоновых белков хроматина [Desiderio et al., 1992], стабилизируют рибосомы и тРНК [Pegg et al., 1982; Rudkin et al., 1984; Tabor, 1984], что в конечном итоге отражается на скорости синтеза белков клеток, их росте и развитии. Было показано, что концентрация полиаминов и активность ферментов ОДК и S-АМДК хорошо коррелирует с интенсивностью анаболических процессов в ткани [Rudkin, 1984; Holtta, 1985; Bolkenius, Seiler, 1987; Matthews, 1993].

В работах Яковлева H.H.[ 1979] было показано, что активность фермента ОДК и содержание полиаминов изменяются в скелетных мышцах в ответ на ФН. Однако, возможные механизмы активации системы синтеза полиаминов андрогенами, концентрация которых увеличивается в восстановительный период после ФН, не были исследованы. Кроме того, в литературе отсутствуют прямые указания на влияние анаболических стероидов на синтез полиаминов в скелетных мышцах.

Цель исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании эффекта физических нагрузок различной интенсивности и длительности и введения 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс.

Задачи исследования;

1. Развить метод определения содержания полиаминов в скелетных мышцах крыс с использованием ионообменной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2, Определить условия для измерения активности орнитиндекарбоксилазы и S-аденозилметиониндекарбоксилазы в скелетных мышцах различного функционального профиля.

3. Изучить изменение активностей этих ферментов и содержания полиаминов в скелетных мышцах крыс при выполнении однократных физических нагрузок различной интенсивности и длительности.

4. Исследовать влияние систематической мышечной деятельности различной направленности и состояния тренированности на синтез полиаминов в скелетных мышцах.

5. Изучить влияние однократного и систематического введения 17ос-метилтестостерона на активность ферментов и содержание полиаминов в скелетных мышцах различного функционального профиля.

Научная новизна н практическая значимость исследования.

Данные по исследованию содержания полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) и активности двух ферментов (ОДК и 8-АМДК), осуществляющих синтез полиаминов, в скелетных мышцах в период отдыха после различных ФН, представляют особый интерес, поскольку до настоящего времени практически отсутствуют работы по данной теме. Из отечественной литературы известна лишь одна публикация [Яковлев, 1979], посвященная исследованию активности фермента ОДК и содержания полиаминов в скелетных мышцах после ФН. Однако, представленные в ней результаты несколько отличаются от данных, полученных нами.

В результате экспериментов установлено, что активность ферментов ОДК и Б-АМДК и содержание полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) в скелетных мышцах зависят от типа волокон составляющих мышцу. Значения данных показателей в мышцах, содержащих преимущественно оксидативные волокна в два раза превышали таковые в волокнах гликолитического типа.

Впервые одновременно исследовали изменение активности ферментов ОДК, Б-АМДК, содержания полиаминов в скелетных мышцах и содержания тестостерона в крови животных в различные периоды отдыха после ФН. Повышение содержания в мышцах путресцина в срочный период восстановления (катаболическая фаза) было обусловлено увеличением активности ОДК в это же время. В отставленный период восстановления (анаболическая фаза) повышалось содержание в мышцах спермидина и спермина, вызванное возрастанием активности фермента Б-АМДК. При этом изменение концентрации тестостерона в крови носило фазный

характер и первый пик увеличения концентрации тестостерона совпадал по времени с возрастанием активности ОДК.

Установлено, что однократная анаэробная ФН приводит к большей активации системы синтеза полиаминов в гликолитических, а однократная аэробная ФН - в оксидативных мышечных волокнах, что соответствует представлению о специфичности биохимических процессов адаптации к ФН определенной направленности.

Выполнение систематических ФН преимущественно аэробной направленности сопровождалось снижением содержания полиаминов в смешанных мышечных волокнах. При выполнении систематических ФН анаэробной направленности и аэробной направленности с включением "ускорений" установлено увеличение их содержания в этих мышечных волокнах.

Опыты с введением анаболического стероида 17а-метилтестостерона показали, что синтез полиаминов увеличивается под воздействием этого гормона, но степень увеличения активности ферментов ОДК, Б-АМДК и содержания полиаминов зависела от типа мышечных волокон, составляющих скелетную мышцу.

Выполненная работа имеет преимущественно экспериментальный характер и позволяет судить об особенностях метаболизма индивидуальных ферментов и низкомолекулярных веществ при адаптации мышц к повышенной физической активности и об их гормональной регуляции. Материалы исследования могут быть использованы в курсах общей эндокринологии. Кроме того, показанная в работе взаимосвязь между уровнем андрогенов в крови и активностью системы синтеза полиаминов в скелетных мышцах позволяет использовать этот теоретический материал при оптимизации рационального питания спортсменов на разных уровнях их подготовки и соревнований, а также при оптимизации профилактического питания. Разработанный высокочувствительный метод определения содержания полиаминов и оптимизированные методы измерения активности ферментов ОДК и Б-АМДК могут быть использованы в клиниках для диагностики онкологических заболеваний.

Положения выносимые на защиту. 1. Активности ключевых ферментов синтеза полиаминов ОДК и БАМДК и содержание

полиаминов ( путресцина, спермидина, спермина) зависят от типа мышечных волокон.

2. Увеличение активностей ключевых ферментов в синтезе полиаминов ОДК и S-АМДК и содержания полиаминов после однократной аэробной ФН выражено больше в оксидативных мышечных волокнах, а после анаэробной ФН - в гликолитических мышечных волокнах.

3. Систематические ФН аэробной направленности сопровождаются снижением содержания полиаминов в скелетных мышцах белых крыс. Систематические анаэробные ФН или ФН аэробной направленности с включением "ускорений" приводят к увеличению содержания полиаминов в скелетных мышцах.

4. Однократное и систематическое введение Па-метил-тестостерона приводит к активации системы синтеза полиаминов в скелетных мышцах.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 132 страницах, содержит 13 таблиц и 20 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения. Список использованной литературы включает 175 наименования, в том числе 133 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования проводили на половозрелых беспородных белых крысах, полученных из питомника "Рапполово" и содержащихся в условиях вивария НИИФК на стандартной лабораторной диете [Неменова и соавт., 1968]. Все функциональные эксперименты проводились на крысах-самцах массой 200-260 г. Контрольные серии составляли животные находящиеся на обычном двигательном режиме, а экспериментальные группы животных подвергались воздействиям однократных или систематических нагрузок плаванием в воде оптимальной температуры 30-32°С или получали интраперитонеальные инъекции различных доз стероидов. Характер функциональных и фармакологических воздействий определялся поставленными задачами.

Систематическая мышечная деятельность животных состояла из плавания 5 раз в неделю в течение 4-х недель с дополнительным грузом. Нагрузка, имеющая аэробную направленность,

представляла собой плавание с грузом 4% от массы тела животного с постепенным увеличением длительности плавания от 10 мин в первый день до 40 мин в конце месячного тренировочного цикла (группа 1). Животные второй группы плавали по описанной выше схеме, но интенсификация нагрузки достигалась включением в аэробное плавание коротких (20сек) отрезков максимальной интенсивности с дополнительным грузом 12 % массы тела, сопровождающихся 40 сек интервалами отдыха на 5,15,25,35 минутах тренировочного плавания (группа 2). Этот способ аэробной тренировки условно назовем - ФН с включением "ускорений". Животные третьей группы выполняли ФН высокой интенсивности, заключающиеся в шестикратном повторении одноминутного плавания через полутороминутные интервалы отдыха. Для прогрессивного увеличения интенсивности нагрузки плавание проводили с грузом, возраставшим постепенно от 4 до 12% от массы тела в течение 1 месяца тренировки. Животных исследовали через 48 часов после заключительного тренировочного плавания. Однократная анаэробная ФН составляла 8 разовое плавании с 12%-ым грузом от массы тела в режиме: 1мин плавания, 1,5 мин отдыха. Животных исследовали сразу после ФН, через 2, 8 и 24 часа восстановительного периода. Однократная аэробная ФН представляла собой плавание с 5% грузом до первого пятнадцати секундного погружения в воду. Животных исследовали сразу после ФН и через 2, 8 и 48 часов восстановительного периода.

При изучении влияния андрогенов на синтез полиаминов, 17а-метилтестостерона вводили интраперитонеально в дозе 0,2 мг на 100 г массы тела при однократном введении гормона. Животных исследовали через 2, 8, 24 часа действия 17а-метилтестостерона . При изучении влияния систематического введения 17а-метилтестостерона животным ежедневно вводили интраперитонеально гормон в дозе 0,1 мг на 100 г массы тела в течение месяца. Животных исследовали через 24 часов после последней инъекции гормона.

Исследовали два типа скелетных мышц задней конечности крысы: пяточную, содержащую преимущественно оксидативные волокна, и белую часть четырехглавой мышцы бедра, содержащую в основном гликолитические волокна (Armstrong, Phelps, 1984). Для определения содержания полиаминов в скелетных мышцах ткань (100мг) гомогенизировали в 0,2 М НС104 в соотношении 1:3 (вес/объем). Экстракт центрифугировали (20 мин при 30000- 50000 g) и супернатант использовали для определения содержания

полиаминов. Супернатант сначала подвергали двухступенчатой ионообменной хроматографии по разработанной нами схеме (последовательное применение катионита КРС-8п и анионита ДАУЭКСхЮ). Содержание полиаминов определяли с помощью оптимизированного метода обращенно-фазной ВЭЖХ. За основу был взят метод Hyvonen [1992].

Активность фермента ОДК измеряли по оптимизированной нами методике, взяв за основу методику Persson [1983]. Навеску скелетных мышц гомогенизировали в 10-ти кратном объеме ЮОмМ Трис-HCl буфере, рН 7.0-7.2, содержащем 55мкМ ПФ, 2.5мМ ДТТ. 100 мкл гомогената инкубировали с 35 мкМ (уд.акт. 40-60 mCí/ммоль) 14С-орнитина в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 200мкл 0,6 н НС104. Выделяющийся в ходе реакции 14СОг улавливали с помощью фильтровальной бумаги, пропитанной 25 мкл 1М Hyamine (Serva, Германия). Фильтр переносили в сцинцилляционную жидкость и мерили радиоактивность на жидкостносцинцилляционном счетчике Mark -III (Delta Medical, Германия). Содержание белка рассчитывали по методу Bradford (1976). Активность ОДК выражали как пмоль '"СОг/ мг белка час'1.

Активность фермента S-АМДК измеряли по оптимизированной нами методике, взяв за основу методику Sauro V.S. [1990]. Навеску скелетных мышц гомогенизировали на льду в 10-ти кратном объеме ЮОмМ Трис-HCl буфере, рН 7.0-7.2, содержащем 1,5 мМ путресцина, 2.5мМ ДТТ. 200 мкл гомогената инкубировали с 14C-S-аденозилметионином в конечной концентрации 40 мкМ (уд.акт. 59 mCí/ммоль) в течение 60 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавляя в реакционную среду 200 мкл 0,6 н НСЮ4. Дальнейшая регистрация радиоактивности проводилась по схеме, идентичной для фермента ОДК. Активность S-АМДК выражали как пмоль 14СОг/ мг белка час'1.

Содержание тестостерона в крови определяли методом РИО (Чайковский и соавт., 1983).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне вероятности р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

1 Разработка метода определения содержания полиаминов в экстрактах скелетных мышц. При разработке метода определения содержания путресцина, спермидина, спермина в экстрактах скелетных мышц животных за основу был взят метод обращенно-фазной ВЭЖХ с постколоночной дериватизацией полиаминов о-фталевым альдегидом [Hyvonen, 1992]. Для отделения полиаминов от других флуорогенных соединений (в первую очередь от субстрата -орнитина) был разработан метод двухступенчатой ионообменной хроматографии с последовательным использованием катионита КРС - 8п, количественно сорбировавшего соединения, содержащие первичные аминогруппы и, затем, смолы ДАУЭКС 1x10, сорбировавшей количественно соединения, содержащие карбоксильные группы. В результате путресцин отделялся от субстрата (орнитина) и мог быть количественно измерен (рис.1). Разработанный метод достаточно прост, специфичен в отношении полиаминов и обладает высокой чувствительностью (нижний порог чувствительности 1-5 пмоль вещества в пробе). Для определения содержания полиаминов в скелетных мышцах с помощью данного метода было достаточно 100-200 мг ткани.

2 Определение активности ферментов ОДК и SzAMflK в скелетных мышцах. При оптимизации методов измерения активностей ферментов ОДК и S-АМДК в скелетных мышцах за основы были взяты методики Persson [1983] и Sauro V.S. [1990], соответственно. Скелетные мышцы являются тканью, для обработки которой требуется значительно большее время по сравнению с такими органами как печень, почки, мозг. В названных органах активность ферментов ОДК и S-АМДК измеряли в цитозолях. Учитывая короткое время полужизни обоих ферментов [Tabor and Tabor, 1984; Seiler, 1996] и длительность приготовления цитозоля из скелетных мышц, мы определили оптимальные условия для измерения активности ферментов ОДК и S-АМДК в гомогенатах скелетных мышц.

А.

В.

1

Put.

Sm

»4

Sd

JL

1

Put.

I I I I I I I....... I I I I I I I I I II I I I I I I I M I I I I I I I I M . I I I I I I I I I I M I

' s m ов tn s tr. n сч n ю ^^inmmk

Рис.1. Хроматограммы A. - экстракта скелетных мышц без ионообменной хроматографии, В. - экстракта скелетных мышц после двухступенчатой ионообменной хроматографии.

Учитывая, что ферменты ОДК и S-АМДК находятся в цитозольной фракции клеток, активность этих ферментов соотносили с количеством цитоплазматического белка, измеренного методом Bradford [1976].

Оптимизированные условия проведения реакций подробно описаны в "Материалах и методах исследования". Метод позволяет определить активность ферментов ОДК и S-АМДК в 100 мг скелетных мышц.

3 Значения активностей ферментов ОДК, 5-АМДК и содержания полиаминов в скелетных мышцах разного функционального профиля. Было установлено, что величины активностей ключевых ферментов синтеза полиаминов и содержания полиаминов зависят от типа волокон, составляющих мышцу. Величины данных показателей в скелетных мышцах белых беспородных крыс весом 200-260 г возраста 3-4 месяца представлены в табл.1.

Таблица 1.

Активность ферменов ОДК , Б- АМДК и содержание полиаминов в

скелетных мышцах ( Х±БО, п=5 )

Типы мышечных волокон Активность (пмоль'4С02/мг белка час'1) Содержание (нмоль/мг белка)

ОДК Б-АМДК путресцин спермидин спермин

Оксидативные (У кр«с) Контроль (собств. данные) 8.87+0.50 3.62+0.30 1.03+0.03 2.52+0.04 4.08+0.10

Гликолитические (У крыс) Контроль (собств. данные) 2.42+0.20 1.50+0.30 0.66+0.01 1.56+0.03 3.50+0.10

Скелетные мышцы хомячков (Заиго еЬа!, 1990) 2 недели 30 недель 50,10+3.20 5,50+0.10 20,11+0.90 3,00+0.20 40,25+1.50 2.30+0.80 60,00+11.00 7,50+1.30 50,00+10.00 6,00+0.80

Причина более высоких величин активностей ферментов ОДК, Б-АМДК и, как следствие, содержания полиаминов в икроножной мышце, состоящей преимущественно из оксидативных мышечных волокон, может быть объяснена наличием в этом типе мышечных волокон большего количества рецепторов андрогенов [Фельдкорен, 1996; 1поие, 1994], необходимых для реализации метаболического действия андрогенов. В экспериментах на почках мышей, дефектных по синтезу рецепторов андрогенов, было показано, что активность ОДК и содержание путресцина значительно понижены

по сравнению с интактными животными [Pajunen, 1982]. По-видимому, мышечные волокна оксидативного типа, обладая большим количеством рецепторов андрогенов, являются более чувствительными к метаболическому действию андрогенов, что выражается в большей экспресии генов ОДК и S-АМДК.

В целом, низкие значения как активностей ферментов, так и содержания полиаминов объясняются возрастом животных и уровнем их двигательной активности. Известно, что система синтеза полиаминов особенно активна в развивающемся организме, который характеризуется высокими скоростями анаболических процессов [Ярыгин, 1987; Holtta, 1985; Matthews, 1993]. Это было хорошо продемонстрировано Sauro [1990] в экспериментах на хомячках разного возраста (табл.1). Полученные нами данные в целом находятся в соответствии с данными Sauro [1990]. 4 Исследование влияния однократных анаэробных и аэробных ФН на активность ферментов ОДК. S-АМДК и содержание полиаминов в скелетных мышцах крыс. Результаты эксперимента представлены в таблицах 2,3 и на рисунках 2,3.

Результаты эксперимента показывают, что в восстановительный период после обоих видов ФН в скелетных мышцах происходит увеличение активностей ферментов ОДК и S-АМДК и, как следствие этого, повышение содержания полиаминов. При этом степень изменения метаболизма полиаминов в функционально различных мышечных волокнах зависела от характера ФН. Однократная анаэробная ФН приводила к большему увеличению активности ферментов ОДК, S-АМДК и содержания полиаминов в мышечных волокнах гликолитического типа: активность ОДК была повышенной на 170% и 250%, 93% и 180% через 2 и 8 часов отдыха в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно и достигала уровня покоя в обоих мышечных волокнах через 24 часа отдыха. Активность S-АМДК была повышена на 60% и 74%, 110% и 160% через 2 и 8 часов отдыха и оставалась повышенной через 24 часа отдыха на 10% и 14% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Содержание полиаминов увеличивалось в соответствии с повышением активностей ферментов. Так, содержание путресцина

Активность

ОДК

пмоль ИС02/ мг белка час'1.

.-1

Активность

в-АМДК пмоль 14С02/ мг белка час'1.

■1У

'I—

Концентрация тестостерона (нг /мл)

Рис.2 Влияние однократной анаэробной ФН на ферменты синтеза полиаминов в оксидативных(1) и гликолитических(2) мышечных волокнах и на концентрацию тестостерона в крови крыс(Х±80, п=8)

повышалось уже после 2 часов отдыха (на 130 % и 200 % в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно), что совпадает по времени с пиком активности ОДК. Содержание спермидина, спермина, образование которых катализирует Б-АМДК, увеличивалось к 8 часу отдыха (на 60% и 80% для спермидина, 40% и 52% для спермина в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно), что соответствовало пику активности Б-АМДК.

Следует отметить, что увеличению активности ОДК к 2 часу отдыха предшествовало повышение (на 100 %) концентрации тестостерона в крови животных. Повышение содержания в скелетных мышцах спермидина, спермина (полиамины, непосредственно участвующие во взаимодействиях с нуклеиновыми кислотами, стабилизирующие процессы транскрипции и трансляции белков) совпадало по времени также с повышенной концентрации тестостерона в крови. Данные результаты находятся в соответствии с положением об андрогенной регуляции ферментов синтеза полиаминов [Ярыгин, 1987; Сгоаг 1992; КоЛисЫ 1993]. Кроме того, повышенное содержание спермидина и спермина к 8 часу отдыха совпадает по времени с анаболическими процессами в скелетных мышцах после ФН, в частности с повышенной скоростью синтеза дРНК и рРНК

хромосомно-ядрышкового комплекса скелетных мышц [Ппискин, 1973]. По данным зарубежных авторов к этому времени увеличивается скорость процессов трансляции белков в скелетных мышцах [Саггаго, 1990; СЬеБку, 1992; Кгаетег, 1995].

Таблица 2.

Содержание полиаминов в скелетных мышцах после однократной анаэробной ФН (нмоль/мг белка, Х±БО, п=8).

Мышечные волокна путресцин спермидин спермин

Оксидативные До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых: 2 ч 8ч 24ч 1.03±0.03 1.14±0.05 2.34±0.0б * 1.86±0.04 * 1.21 ±0.02 2.52А0.04 2.49±0.03 2.85±0.06 * 4.04±0.10 * 2.75±0.07 * 4.08±0.10 4.16±0.0б 4.50±0.09 * 5.91±0.13 * 4.38±0.08 *

Гликолигические До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых.: 2 ч 8ч 24ч 0.66±0.01 0.72±0.03 1.98±0.08 * 1,42±0.02 * 0.87±0.03 1.56±0.03 1.59±0.05 2.10±0.08* 2.81 ±0.08 * 1.80±0.03 * 3.50±0.09 3.32±0.07 3.96±0.10 * 5.35±0.09 * 4.12±0.06 *

* - различия по отношению к контрольной группе достоверны (р < 0.05)

После выполнения однократной ФН аэробного характера в скелетных мышцах наблюдались схожие процессы в изменение метаболизма полиаминов, но более выраженные в оксидативных мышечных волокнах: активность ОДК повышалась на 300% и 135%, через 2 часа отдыха в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Это сопровождалось увеличением содержания путресцина в оксидативных волокнах на 220%, а в гликолитических мышечных волокнах на 125%. К 8 часу отдыха активность ОДК и содержание путресцина начинали возвращаться к своим исходным величинам. Активность Б-АМДК начинала увеличиваться через 2 часа отдыха и повышалась к 8 часу отдыха на 122% и 93% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно, что вызывало соответствующее повышение содержания спермидина и спермина в этих мышечных волокнах: к 8 часу отдыха содержание спермидина и спермина было

полиаминов в оксидативных(1) и гликолитических(2) мышечных волокнах и на концентрацию тестостерона в крови крыс(Х±80, п=8)

Таблица 3.

Содержание полиаминов в скелетных мышцах после однократной аэробной ФН (нмоль/мг белка, Х±БО, п=8).

Мышечные волокна путресцин спермидин спермин

Оксидативные До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых: 2 ч 8ч 48ч 1.03±0.03 1.20±0.02 3.30±0.05 * 2.63±0.07 * 1.35±0.07 2.52±0.04 2.61±0.06 3.37±0.10 * 4.27±0.10 * 2.95±0.07 * 4.08±0.10 4.10±0.08 4.28±0.10 * 5.43±0.10 * 4.50±0.10 *

Гликолитические До ФН (покой) Сразу по окончании Отдых: 2 ч 8ч 48ч 0.66±0.03 0.70±0.02 1.49±0.05 * 1.12±0.02 * 0.82±0.03 1.5б±0.03 1,63±0.03 2.05±0.07 * 2.44±0.08 * 1.80±0.03 3.50±0.09 3.40±0.10 3.78±0.10 * 4.35±0.09 * 3.87±0.06

* - различия по отношению к контрольной группе достоверны ( р < 0.05)

повышенным на 69 % и 33 % в оксидативных, и, на 50 % и 24 % в гликолитических мышечных волокнах. Увеличение активностей ферментов и содержания полиаминов в скелетных мышцах происходило на фоне повышенной концентрации тестостерона в крови.

Полученные данные позволяют заключить, что изменение метаболизма полиаминов после ФН происходит в соответствии со специфичностью биохимических изменений метаболизма в скелетных мышцах, протекающих интенсивнее в функционально более активных мышечных волокнах при выполнении ФН определенной направленности [Яковлев, 1976]. Из полученных результатов по однократным ФН можно заключить, что система синтеза полиаминов участвует в адаптационных процессах, идущих в скелетных мышцах преимущественно на ранних сроках восстановления и это обусловлено повышением в это время концентрации тестостерона в крови.

5 Влияние систематической мышечной деятельности на содержание полиаминов в скелетных мышцах крыс. Известно, что систематическое выполнение аэробных и анаэробных ФН приводит к разным изменениям концентрации тестостерона в крови [Рогозкин, 1988]. Изменение концентрации тестостерона при систематических аэробных ФН происходит в меньшей степени, чем после систематических анаэробных ФН [Рогозкин, 1988]. Это приводит к тому, что в состоянии покоя у животных, тренированных аэробными ФН, не наблюдается изменения в концентрации тестостерона в крови, в то время как у животных тренированных анаэробными ФН наблюдается его повышение на 50 %. Интересно отметить, что содержание полиаминов в смешанных мышечных волокнах у животных, тренированных анаэробными ФН, в состоянии покоя было значительно повышенным: на 130 %, 100 % и 160 % для путресцина, спермидина, спермина, соответственно. Содержание полиаминов у животных, тренированных аэробными ФН, было пониженным, а у животных, тренированных аэробными ФН с включением «ускорений», содержание путресцина и спермидина было достоверно повышенным на 70% по сравнению с уровнем покоя. При этом данное изменение в синтезе полиаминов у этой группы животных происходило на фоне неизмененной концентрации тестостерона в крови. Эти изменения в синтезе полиаминов, происходящие на фоне неизмененной концентрации тестостерона в крови животных, указывают на их сложную гуморальную регуляцию. Известно, что синтез полиаминов в органах и тканях

регулируется как анаболическими , так и катаболическими факторами, действие которых направлено на поддержание их оптимальной концентрации в клетках [Seiler, 1996].

Таблица 4.

Влияние систематических ФН на содержание полиаминов в смешанных мышечных волокнах (нмоль/мг белка, Х±80, п=8)

Условия опыта Путресцин Спермидин Спермин

Нетренированные 1.20±0.08 3.12±0.10 4.85±0.13

Аэробные ФН - 2.66±0.12 * 3.90±0.10 *

Аэробные с "ускорениями" l.mo.os * 2.75±0.10 * 5.30±0.20 *

Анаэробные ФН 2.35±0.10 * 3.95±0.10 8.43±0.9 *

* - различия по отношению к контрольной группе достоверны (р <0.05)

Таким образом, снижение содержания полиаминов после систематических аэробных ФН может быть обусловлено повышенной чувствительностью скелетных мышц к катаболическим гормонам (глюкокортикоидам), в то время как после систематических аэробных ФН с включением «ускорений», пониженной чувствительностью их к глюкокортикоидам, что приводит к повышению уровня полиаминов в скелетных мышцах. Но данное предположение требует дополнительного экспериментального подтверждения.

6 Влияние однократного и систематического введения Па-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах. Изучение однократного воздействия 17а-метилтестостерона на активность системы синтеза полиаминов было проведено в эксперименте на 4 группах животных, одна из которых служила контролем. Животных оставшихся групп исследовали через 2, 8 и 24 часа после введения. Было установлено, что под воздействием гормона синтез полиаминов в скелетных мышцах увеличивается (рис.4).

Рис.4. Влияние однократного введения 17си-метилтестостерона на ферменты синтеза полиаминов в оксидативных (1) и гликолитических (2) мышечных волокнах и на концентрацию тестостерона в крови крыс (X+SD, п=8)

Характер изменений в системе синтеза полиаминов под воздействием 17а-метилтестостерона сходен с таковыми при однократных ФН, то есть происходит на фоне повышенной концентрации тестотстерона в крови. Однако, увеличение активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и их содержания происходит в более отставленный период ( 8 часов). Отставленный во времени эффект 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов можно объяснить более медленным поступлением гормона в клетки, так как известно, что во время ФН проницаемость мембран миоцитов за счет усиления перекисного окисления липидов резко увеличивается [Зезеров и соавт., 1987; Меерсон и соавт., 1988].

Степень изменения метаболизма полиаминов под воздействием 17а-метилтестостерона зависела также от типа мышечных волокон, составляющих скелетную мышцу. Увеличение активности ферментов ОДК и S-АМДК и содержания полиаминов происходило в большей степени в оксидативных мышечных волокнах. Активность ОДК увеличивалась через 2 часа действия гормона на

77% и 53%, а через 8 часов действия гормона на 210% и 130% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Активность Б-АМДК достоверно повышалась на 55% и 40% через 8 часов действия гормона в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Концентрация тестостерона повышалась через 2 часа на 87% и в дальнейшем начинала снижаться к исходному уровню. Увеличение содержания путресцина соответствовало увеличению активности ОДК, а спермидина и спермина увеличению активности Б-АМДК. Содержание путресцина повышалось на 31% и 13% после 2 часа, на 130% и 80% после 8 часов введения гормона в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Содержание спермидина повышалось после 8 часов введения гормона на 36% и 28%, а спермина на 20% и 14% в оксидативных и гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Через 24 часа действия гормона содержание спермидина и спермина оставалось достоверно повышенным в оксидативных мышечных волокнах на 27% и 10%.

Таблица 5.

Изменение содержания полиаминов в скелетных мышцах при введении 17а-метилтестостерона (нмоль/мг белка, приведены Х±БО, п=5).

Мышечные путресцин спермидин спермин

волокна

Оксидативные

Контроль 1.03±0.03 2.52±0.04 4.08±0.10

После введения

17а-

метилтестостерона

2ч 1.35±0.13 2.77±0.03 4.24±0.13

8ч 2.37±0.17 * 3.45±0.09 * 4.90±0.18 *

24 ч 1.72±0.08 3.2Ш.04 * 4.50±0.10 *

Гликолитические

Контроль 0.66±0.01 1.56±0.03 3.50±0.09

После введения

17а-

метилтестостерона 2ч 0.75±0.09 1.72±0.04 3.75±0.0б

8ч 1.20±0.08 * 2.00±0.03 * 4.00±0.13 *

24 ч 1.07±0.н 1.65±0.03 3.70±0.10

* - различие по сравнению с контролем достоверны (р<0,01)

Изучение воздействия систематического введения 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах проводили на двух группах животных - контрольной и экспериментальной. Животным экспериментальной группы ежедневно вводили 17а-метилтестостерон в дозе 0.1мг/100 г веса в течение четырёх недель. Животные контрольной группы не подвергались воздействию гормона. Исследование животных проводили через 48 часов после последнего введения 17а-метилтестостерона. Результаты исследования показывают, что систематическое введение 17а-метилтестостерона

приводит к увеличению активностей ферментов синтеза полиаминов (табл. 6) и содержания полиаминов в скелетных мышцах (табл. 8). Данные изменения более выражены для оксидативных мышечных волокон.

Таблица 6.

Влияние систематического введения 17а-метилтестостерона на активности ферментов ОДК и Б-АМДК в скелетных мышцах (пмоль |4С02/ мг белка час'1, п=5)

мышечные волокна ОДК Б-АМДК

контроль гормон контроль гормон

оксидативные 7.95±1.12 10.50±1.22* 3.44±0.30 4.28±0.09*

гликолитические 2.66±0.45 3.14±1.12* 1.50±0.08 1.67±0.10

* - различия по отношению к контролю достоверны( р < 0.05)

Активность ОДК повышалась на 32% и 18%, а активность Б-АМДК на 24% и 11 % в оксидативных и в гликолитических мышечных волокнах, соответственно. Интересно отметить, что концентрация тестостерона в крови при систематическом введении 17а-метилтестостерона понижалась (табл.). Этот факт свидетельствует об усилении транслокации гормон-рецепторных комплексов в ядро клетки - мишени, где связываясь с промоторным участком ДНК, они вызывают синтез РНК-полимеразы И, а следовательно и синтез новых м РНК. Систематическое воздействие такого рода приводит к адаптивному синтезу структурных и энзиматических белков и именно этим может быть объяснено повышение активности андроген - чувствительных ферментов ОДК и Б-АМДК.

Таблица 7.

Влияние систематического введения 17а-метилтестостерона на концентрацию тестостерона в крови крыс.

условия опыта концентрация тестостерона (нг/мл)

контроль 1,3 ±0,20

введение 17а-метилтестостерона 0,90 ±0,30

Таблица 8.

Влиние систематического введения 17а-метилтестостерона на содержание полиаминов в скелетных мышцах крыс ( нмоль/мг белка, Х±8В,п=5)

Тип мышечных волокон Путресцин Спермидин Спермин

контроль гормон контроль гормон контроль гормон

Оксидативные 1.10±0.05 1.33±0.05 * 2.50±0.08 2.88±0.10 * 4.10±0.10 4.64±0.15 *

Гликолитические 0.59±0.03 0.65±0.07 1.44±0.05 1.50±0.08 3.44±0.09 3.40±0.!0

* - различия по отношению к контролю достоверны( р < 0.05)

Достоверные изменения в содержании полиаминов происходили в оксидативных мышечных волокнах. Так, содержание путресцина, спермидина, спермина было повышено на 20%, 15%, 13% соответственно. В гликолитических мышечных волокнах содержание полиаминов не отличалось от уровня контроля.

Таким образом, введение 17а-метилтестостерона в течение четырёх недель приводило к повышению активности ключевых ферментов синтеза полиаминов ОДК и Б-АМДК в скелетных мышцах крыс и повышению содержания полиаминов в большей степени для оксидативных мышечных волокнах и это, по-видимому, связано с их наибольшей андрогенной чувствительностью. Заключение. В ходе проведенных экспериментов было показано, что два различных функциональных воздействия, - ФН и введение 17а-метилтестостерона, приводят к однотипным изменениям в метаболизме полиаминов в скелетных мышцах крыс. Это позволяет предположить, что система синтеза полиаминов в скелетных

мышцах активируется под воздействием андрогенов и, таким образом, участвует в анаболических процессах, идущих в восстановительный период в скелетных мышцах после ФН.

ВЫВОДЫ

1. Разработан высокочувствительный метод определения полиаминов ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, позволяющий определить содержание полиаминов в 100 мг скелетных мышц. Метод включает предварительную очистку биологического материала с помощью ионообменной хроматографии с использованием сульфокатионита КРС-8п и анионита ДАУЭКС. 2.Оптимизирован метод измерения активностей орнитин-декарбоксилазы и Б- аденозилметиониндекарбоксилазы, основанный на применение радиактивномеченых субстратов ферментативных реакций. Метод имеет высокую специфичность и чувствительность.

3.Однократная аэробная ФН приводила к активации синтеза полиаминов в скелетных мышцах белых крыс, выраженное более в мышечных волокнах оксидативного типа, а однократная анаэробная ФН сопровождалась активацией синтеза полиаминов в большей степени в гликолитических мышечных волокнах. 4.Систематическая мышечная деятельность аэробной направленности сопровождается снижением содержания путресцина, спермидина и спермина в скелетных мышцах. Систематические анаэробные ФН и аэробные ФН с включением "ускорений" и приводили к увеличению содержания полиаминов в скелетных мышцах.

5.Однократное введение животным анаболического стероида 17а-метилтестостерона в дозе 0.2 мг/100 г веса вызывало активацию синтеза полиаминов с достижением пика активности к 8 часу действия гормона. Данное изменение было более выражено в оксидативных мышечных волокнах.

6. Ежедневное введение 17а-метилтестостерона в дозе 0.1мг/100 г веса в течение месяца вызывало достоверное увеличение активностей ОДК и Б-АМДК и содержания полиаминов в большей степени в оксидативных мышечных волокнах.

7. Полученные результаты свидетельствуют об участии полиаминов в процесах адаптации мышечной ткани к ФН и их взаимосвязи с динамикой изменения концентрации тестостерона при различных режимах двигательной активности.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Турханова Jl.В. Влияние разных вариантов систематических физических нагрузок на синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс. Тезисы научной конференции НИИФК, СПб, 1995, с.50.

2. Турханова Л.В., Фельдкорен Б.И., Штайн Ю., Рогозкин В.А. Влияние физической нагрузки и введения 17а-метилтестостерона на синтез полиаминов в скелетных мышцах крыс. Сб."Современные проблемы физической культуры и спорта", СПб, 1998, с. 175-180.

3. Turchanowa L. and Rogozkin V.A. The Effect of exercise training on polyamines synthesis in rat skeletal muscle. 10 th International Conferense "Biochemistry of Exercise", Sydney, 1997.

4. Turchanowa L, Rogozkin V.A., Feldkoren B.I., Stein J. Influence of physical exercise and testosterone on ornithine decarboxylase activity and polyamine concentration in the rat skeletal muscle. 32nd Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation, Cracow, Poland, 18 April 1998.

5. Turchanowa L, Feldkoren B.I., Rogozkin V.A., Stein J. Spermidine and spermine synthesis is up-regulated in slow-twitching oxidative fibers of the rat skeletal muscle after physical loading. Experimental Biology (FASEB Annual Meeting), San Francisco, USA, 1998, c.A.951.

6. Turchanowa L, Feldkoren B.I., Rogozkin V.A., Milovic V., Stein J. Polyamine synthesis is up-regulated by physical loading and testosterone in the rat skeletal muscle. COST 917 Symposium "Advances in Polyamine Research", Trento, Italy, 1998.

7. Turchanowa L, Feldkoren B.I., Rogozkin V.A., Milovic V., Stein J. Polyamines Specific metabolic regulators or multi-functional polycations - role of physical exercise and androgens on polyamine metabolism in the rat skeletal muscle. Biochemical Society (UK), Sheffield, UK, 1998.