Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние физических нагрузок на активность АТР-зависимого протеолиза в скелетных мышцах крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние физических нагрузок на активность АТР-зависимого протеолиза в скелетных мышцах крыс"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗОК НА АКТИВНОСТЬ АТР-ЗАВИШ0Г0 ПР0ТЕ0ЛИЗА В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ КРЫС

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

На правах рукописи

БАБОШИНА

Ольга Владиславовна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в отделе биохимии спорта Научно-исследовательского института физической культуры, Санкт-Петербург.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор З.А.Рогозкин.

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор /..Г.цербак; кандидат биологических наук, доцент Кулева Н.В.

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии им..;.''.Сеченова Российской АН.

Защита диссертации состоится в \С часов на заседании специализированного ученого совета I' 063.57.09 по присуздению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199 1с4, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им А .¡'..Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

А.Г.Марков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕР. iCT /2<А РАБОТЫ

Актуальность темы. Изменения интенсивности метаболических реакций э скелетных мьшцах, происходящие во время физической деятельности, отражают вачшые аспекты биохимической адаптации организма. Процессы восстановления после физической нагрузки iiii) включают не только восполнение затраченных энергетических ресурсов, но сопровождаются также изменениями в скорости синтеза и деградации ряда белков мышц. Таким образом, осуществляется обновление состава миофибрилл и образование пула свободных аминокислот, пригодных для синтеза как структурных и ферментных белков мьмд, так и энергетических субстратов. Кроме того, протеаэы участвуют в реакциях посттрансляциончой модификации, в процессах регуляции количества ключевых ферментов, необходимых для быстрого восстановления работоспособности организма. Следовательно, протеолитические ферменты играют важную роль в поддержании нормального функционирования мышц при изменениях метаболизма, вызванных £Н. Однако пока неизвестно, какие факторы определяю* скорость распада индивидуальных белков и какие ферменты участвуют в их деградации (РогоякинДЗЭО).

В клетках млекопитающих отмечается сосуществование лизосо-мального и цитоплазматическсго путей распада белка. В скелетных мышцах обнаружено около 20 цитоплазматических протеаэ, среди которых достаточно полно охарактеризованы сериновые протеазы, кал-паины и ферменты знергозависимого пути деградации белков ( Bird et. al., 19SU )• дальнейшие исследования показали, что АТР-зави-симая система реакций протеолиза состоит из нескольких компонентов, включая небольшой по молекулярной массе (8.5 к^а) глобулярный белок убиквитин I Ciecuanover, 19S4)- В ходе реакций зтого пути убиквитин сначала присоединяется к белку, предназначенному для деградации, с помощью мул ьт/ферментного АТР-зявисимого комплекса. Затем происходит энергозависимый распад белка-мипени и освобождение убиквитина. На разрыв одной пептидной связи этим способом требуется две молекулы АТР, столько же, сколько и для ее синтеза (¡lerahko, Cieciiai. war, 1986). Активность данного типа протеолиза была обнаружена во мн.тих тканях организма, в том числе в разных типах скелетных щнц к сердечной мыще (aer.;ri:e, Jen-ni3en, 193?; Pacun et. al.,19^2; Haaa, 1309). Предполагается, что такой высокоселективный онергозависимый протеолиз может учас-

твовать в регуляции скорости обмена белков, однако конкретные механизмы изменения активности протеаэ не изучены. Так, отмечается увеличение количества связанных с убиквитином белков клетки, а следовательно потенциальных ^убстратов для АТР-зависимого распада, при голодании, атрофии или деннервации мышечной ткани (Haas, 1990). Таким образом, является удобной моделью для определения степени участия данной энергозависимой системы в процессах биохимической адаптации организма к действию различных факторов среды.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния »H различной интенсивности и длительности на активность АТР-зависимого протеолиза, содержание свободного убиквитина и распределение его конъюгэтов с белками в различных типах скелетных мышц крыс.

Задачи исследования. I. Развить и охарактеризовать иммунологические методы определения свободного и связанного с белками убиквитина.

2. Определить условия для выявления активности АТР-зависимого протеолиза в скелетных мышцах крыс.

3. Изучить величины активности АТР-зависимого протеолиза г. содержания убиквитина в скелетных мышцах различного функционального профиля.

4. .1зучить влияние однократных ФН различной интенсивности и длительности на активность АТР-зависимого протеолиза, содержание свободного убиквитина и распределение конъюгатов его с белками в скелетных мышцах.

5. Лсследовать влияние систематической мышечной деятельности преимущественно аэробной или анаэробной направленности на активность АТР-зависимого протеолиза.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружена связь между величиной активности АТР-зависимого протеолиза, содержанием убиквитина и типом миофибрилл, составляющих мышцу. Значения данных показателей в мышцах, содержащих преимущественно оксидатизные волокна,в два раза превышали таковые в волокнах гяиколитического типа. Показано, что коньюгаты убиквитина с белками распределены по молекулярным массам сходным образом в исследуемых типах мышц.

Кроме того, было установлено, что активность определяемого типа распада белков в скелетных мышцах зависит от возраста крыс и имеет наибольшее значение на ранних стадиях формирования животных.

Установлено, что однократные ФН приводят к повышению активности АТР-зависимого протеолиза и изменению уровня конъюгатоз убиквитина с белками. Выявлен небольшой по молекулярной массе (30 кДа) конъюгат з'биквитина, содержание которого зависит от направленности физической работы мышцы. В период отдыха после длительной ФН увеличение общей активности АТР-зависимого протеолиза и плотности иммуноскрашивания белка-конъюгата с молекулярной массой 30 кДа происходит в мышцах, составленных в основном гликолитическими волокнами, а после интенсивной ФН - в мышцах с оксидативными волокнами. Концентрация свободного убиквитина под действием ФН достоверно не изменяется.

Выполнение систематических ФН преимущественно аэробной или анаэробной направленности сопровождается адаптацией ферментов АТР-зависимого протеолиза к изменениям метаболизма в скелетных мышцах. В состоянии покоя не выявлено различий в величине активности АТР-зависимого протеолиза в скелетных мыщах животных, подвергнутых систематической Ш с разной направленностью метаболических процессов.

Практическая значимость работы заключается в разработке Чувствительных флуорометрического и флуороиммунного методов для определения активности АТР-зависимого протеолиза и концентрации свободного убиквитина, а также метода "Западного" блотинга для определения спектра конъюгатов убиквитина с белками с последующим их иммуноокрашиванием, Применение данных методов позволит исследовать определяемые показатели не только в скелетных мышцах, но и в других тканях животных.

Положения выносимые на защиту. X. Концентрация свободного убиквитина и хонъюгатов убиквитина с белками зависит от типа составляющих мышцу волокон. Распределение коныогатов с белками но моле-куляным массам имеет сходный характер в пяточной мья!це и белой части четырехглавой мышцы бедра. Активность АТР-зависимого протеолиза также коррелирует с типом волокон.

2. Обнаруженное после однократной длительной ФИ повышение

активности АТР-завиеимого протеолиза наиболее выражено в глико-литических, а после интенсивной .Ш - в оксидативных волокнах.

3. Повышение скорости энергозависимого распада в скелетных мышцах после Ш сопровождается увеличением содержания коньюга-тов убиквитика с белками.

4. Выполнение в течение месяца Ш преимущественно с аэробной или анаэробной направленность» метаболических процессов не сопровождается изменениями активности АТР-эависимого протеолиза в скелетных мышцах животных в состоянии покоя.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на аспирантских конференциях Ленинградского научно-исследовательского института физической культуры в 1988, 1989 гг., Всесоюзной конференции "Биохимия питания спортсменов", Ленинград, 1938, междудном симпозиуме "Питание и физическая работоспособность", Ленинград, 1990, сателлитном симпозиуме 20. конференции ФЕБО, доборо-ко, Венгрия, 1990, 8 международной конференции "Биохимия физических упражнений", Нагойя, Япония, 1991, 15 международном конгрессе по биохимии, Иерусалим, Израиль, 1991.

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 3-х статьях и 5-ти тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 116 страниц машинописного текста, 10 таблиц и 26 рисунков. Список литературы включает 203 наименования, в том числе 198 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на белых-беспородных крысах-самцах массой 150-240 г.

В качестве ФН использовали плавание в ванне площадью 50x50 см, глубиной 70 см, при температуре воды 30-32°С. Для уменьшения стрессорного воздействия ситуации на животных проводили их предварительную адаптацию к воде. Систематическая мншеч-нэя деятельность животных состояла из плавания 5 раз в неделю в течение 4-х недель с дополнительным грузом. Учитывая развиваюау-юся адаптацию к ФН для животных первой группы время плавания по-

степенно увеличивали от 2 до 40 минут» при дополнительном грузе 3% от масбы тела (аэробный режим). Животные второй группы плавали по 5 минут в течение всей тренировочной программы, при этом дополнительный груз еженедельно возрастал до 3, 6, 8 и 10% от массы тела (анаэробный режим). Гомогенаты мышц получали через 24 часа после ФН.

Однократная длительная ФН достигалась плаванием в течение 5 часов (аэробный режим). Интенсивная однократная ФН составляла 8 разовое плавание с дополнительным грузом 10% от массы тела в режиме: I минута плавания, 1.5 минуты отдыха (аэробно-анаэробный режим). Препараты мышц получали сразу после $11, через 12 и 24 часа отдыха.

Исследовали два типа скелетных мышц задней конечности крысы: пяточную, содержащую преимущественно оксидативкые волокна, и белую часть четырехглавой мышцы бедра, составленную в основном гликолитическими волокнами (Armstrong» Phelps, 1934 ). Ткань гомогенизировали в 3-х кратном объеме 50 мМ Трис-HCI буфера, pH 8.0 (I мМ ЭдТА, 50 мУ> рХг.'Б, I и" 2 - меркалтоэтанол, 10% гли-церол). Гомогенат центрифугировали при 70 000g в течение 90мин.

Убиквитин из эритроцитов человека выделяли по схеме, основанной на ряде ранее опубликованных методов ( Wilkinson et« al., 1980; Haas, Wilkinson,1385 ^ •

Антисыворотки, специфичные к свободному и связанному с белками убикзитину, получали в результате 10 недельной иммунизации кроликов (Нааз, "1985; fíaaa,Bright, 195* }. 3 качестве антигена использовали меченый МГЦ-убиквитин (Twining, 1384 ). Распределение конъюгатов убиквитина с белками определяли методом "Западного" блотинга. Аффинно-очищенные антитела, связанные с конъюгз-тами убиквитина на нитроцеллюлозном фильтре, выявляли в два этапа при помощи коньюгатов вторых антител с биотином X и коньюгатов щелочной фосфатазы с азидиком.

Активность АТР-зависимых протеаз шределяли с помощью разработанного флуорометрического метода, используя в качестве субстрата Ф1!ГЦ-казеин.

Электрофорез проводили в 8-20% градиентном геле акриламида (King, baernly, 1971 ), используя прибор фирмы Sigma (США) и набор реактивов фирмы Reanal (Венгрия).

Концентрацию белка определяли широко используемыми методами

(Lowry et.al., 1951; Bradford, 1976; Whittaker, Granum, 1980).

Математическую и статистическую обработку результатов проводили на микрокалькуляторе НР-9? (Hewlett-Packard , QUA), Экспериментальные данные обрабатывали статистически для уровня достоверности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЙХВДВАШШ И ИХ ОЮВДЗНЖ

1. Развитие и характеристика методов иммунологического определения убиквитина. На начальном этапе был получен высокоочищенный препарат белка из эритроцитов человека с использованием методов термообработки, фракционирования сульфатом аммония, гель-хроматографии. Перед иммунизацией убиквитин для повышения его антигенных свойств кокьюгировали с у -глобулином быка в весовом соотношении 18:1 и 4:1 (убиквитин: -^-глобулин). В результате иммунизации кроликов этими хоныогатами получали антисыворотки специфичные к свободному и связанному с белками убиквитину соответственно. Разработанный флуороиммунный метод определения концентрации свободного убиквитина имел рабочий диапазон 10-200 нг, чувствительность - 10 нг, вариативность - 7%. Налаженный метод "Западного" блотинга позволил выявить конъюгаты убиквитина с белками скелетных, мышц в интервале молекулярных масс от 25 до 100 кДа, причем полученная антисыворотка го/ела наибольшее сродство к белку с молекулярной массой 30 к^а.

2. Определение активности АТР-зависимого протеолиза в скелетных мышцах крыс. При разработке флуорсметрического метода за основу было принято выявление каллаинов в гомогенатах скелетных мышц с помощью ФИТЦ-казеина (Назаров, 1990). Для определения активности АТР-зависимых протеаз флуоресцентно меченые белки-субстраты ранее не применялись. Поэтому в данной работе были подобраны оптимальные условия для этой реакции в скелетных мышцах крыс. В результате реакционная смесь объемом 0.1 мл содержала: 0.2 мг Ф/ГГЦ-казеина, 5 d'. АТР, 10 мГ, конов магния, при рН 8.0. Метод позволяет определить активность протеаз в 50 -SCO мг скелетных мышц.

3. Значения активности АТР-зависимого протеолиза и содержания убиквитина в скелетных мышцах разного функционального профиля. Величина активности АТР-зависимого протеолиза и концентрация убиквитина зависят от типа волокон, составляющих мышцу. У белых беспородных крыс весом 200-220 г возраста 3-4 месяца в гомогена-

тах пяточной мьащы активность АТР-зависимого протеолиза составляла 0.88+0.05 мкгФИГЦ/мг белка и содержание свободного убикви-тина было 45.1+5.4 рмоль/мг белка. В гомогенатах белой части четырехглавой мышцы бедра эти показатели имели следующие значения - 0.4б+р.04 мкгйГГЦ/мг и 24.1+3.2 рмоль/мг. При иммунобло-тинге коныогаты убиквитина с белками, содержащиеся в гомогенатах исследуемых типов мышц, распределялись по молекулярным массам сходным образом, однако имелись значительные количественные отличия между индивидуальными конъюгатами. Например, для оксидати-вных волокон отмечено 2.4-кратное преобладание белка-коныогата с молекулярной, массой 30 кДа по сравнению с содержанием его в четырехглавой мыще бедра.

Представленные результаты согласуются с данными о более высокой скорости распада эндогенных белков в оксидативных волокнах ( ы, Goldberg,1976 ). Однако наличие корреляции между скоростью распада эндогенных белков, содержанием убиквитина и активностью АТР-зависимого протеолиза пока не обнаружено.

Кроме того, было установлено, что величина энергоэависимо-го распада белков в скелетных мышцах соотносится с возрастом животных. Так, например, активность АТР-зависимого протеолиза в пяточной мыще у животных возрастом 2 месяца (весом 140-160 г ) составляла 1.32+0.18 мкгФИГЦ/мг белка, а у животных возрастал 6-8 месяцев (300-340 г) - 0.50+0.13 мкгЖГЦ/мг белка.

Таким образом,можно предположить, что уровень АТР-зависи-мой протеолитической активности связан не только с функциональ- . ной направленностью мышечных . волокон, но и с этапами развития мышц.

4. Исследование влияния однократных интенсивной и длительной на активность АТР-зависимого протеолиза и содержание убиквитина в скелетных мышцах крыс. Результаты эксперимента представлены в таблицах 1,2 к рисунках 1,2.

длительная ФН (аэробный режим) приводила к достоверному увеличению скорости АТР-зависимого гидролиза ФИТЦ-казеина на 44% в гомогенатах пяточной мышцы через 12 часов отдыха после Ш.

В гомогенатах белой части четырехглавой мышцн бедра активность АТР-зависимого протеолиза увеличивалась hp. 42$, 72%, 6'3% через 0, 12 и 24 часа отдыха соответственно.

Концентрация свободного убиквитина посче такой Ш достовер-

Таблица I

Влияние длительной на активность АТР-зависимого протеолиза и содержание свободного убиквитина в скелетных мышцах крыс

условия опыта

Активность протеолиза мкгФИГЦ мг белка

Свободный убиквитин рмоль мг белка

гчО ^¡1

С:!йзу после '3! Через 12 часов отдыха Через 24 часа отдыха

Няточная мышца 0.56+0.12 59.7+3.3

0.76+0.1С 52.7+4.4 0.31+0.10* 61.8+2.2 0.55+0.04 56.4+4.4

Белая часть четырех-

главой ; мышцы бедра

«О 31 0.33+0.07 28.3+4.1

Сразу после ФН 0.47+0.05* 20.8+3.9

Через 12 часов отдыха 0.57+0.12* 24.1+4.9

Чврез 24 часа отдыха 0.54+0.07* 20.8+1.8

р < 0.05

но не изменялась в обоих типах мышц, распределения коныога-тоэ убиквитина с белками было характерно усиление в 3.2 раза иммуноокрашиваник полосы белка с молекулярной массой 30 кда на блоте после окончания ^П, в. 1.8 раз через 12 часов и в 2.2 раза после 24 часов отдыха по сравнению с уровнем контроля. Таким образом, однократное длительное плавание приводило к значительным изменения!.' в процессах протеолиза белков белой части четырехглавой мьищы бедра имеющей волокна гликолитического типа.

В гомогенатах пяточной мышцы не было обнаружено связи между увеличением активности АТР-зависимого протеолиза и содержанием убиквитина.

Интенсивная $Н приводила к усилению процессов протеолиза в обоих типах мышц. Так, активность АТР-зависимого протеолиза в гомогенатах пяточной мышцы возрастала достоверно на 27$ и 18% после 12 и 24 часов отдыха. Содержание белка с молекулярной мае-

Таблица 2

Влияние интенсивной ФК на активность ЛТР-заяиеимого протеолиза и содержание свободного убиквитина в скелетных мьшщах крыс

Условия опыта

Активность протеолиза

мкгФ'ЛТЦ мг Оелка

свободный убиквитин рмоль мг оелка

до ФН

Сразу после ФН Через 12 часов отдыха Через 24 часа отдыха

Пяточная 0.88+0.05 0.91+0.15 1.12+0.10* I.04+0.03*

мышца 45.1+5.4 44.8+2.5 41.1+3.5 34.2+4.1*

до ФН 0.46+0.04

Сразу после ФН 0.45+0.03

Через 12 часов отдыха 0.44+0.08

Через 24 часа отдыха 0.42+0.03

Белая часть четырехглавой мышцы бедра

24.1+3.2

24.6+2.0

26.7+4.7

19.4+2.9

р < 0.05

ой около 30 кДа также увеличивалось по сравнению с уровнем окоя в 1.5 и 2.3 раза через 12 и 24 часа отдыха после ФН рис.2). Кроме того, отмечалось увеличение плотности иммуно-крашивания белков-конъюгатов в районе 40 кда через 12 и 24 аса от,дыха.

В гомогенатах белой части четырехглавой мышцы бедра ак-ивность АТР-зависимого протеолиза не изменялась, хотя уро-ень убиквитина, связанного с белками, увеличивался через 24 аса после ФН по сравнению с контроле1а.

Результаты эксперимента показывают, что интенсивная ФН эробно-анаэробного характера приводит к значительным измене-иям метаболизма е волокнах оксидативного типа, которые спе-иализированы для ресинтеза ЛТР преимущественно в аэробных словиях. Исследование аналогичных показателей в мыицах пос-е длительной ФН выявило обратную зависимость. Наибольшие из-енения наблюдаются в волокнах гликолктического типа, не при—

£

/о

300 200 100 0

т

12

24

время отдыха, ч

Рйс.1. Влияние однократной длительной ФН на уровень связанного с убиквитином белка с молекулярной массой ЗОвда ф - пяточная мышца

О - белая часть четырехглавой мышцы бедра *

300 200 100 0

ФН

о

12

24

время отдыха, ч

Рис.2. Влияние однократной интенсивной ФН на уровень связанного с убиквитином белка с молекулярной массой ЗОкДа ф - пяточная мышца

О - белая часть четырехглавой мышцы бедра

способленных к функционированию в аэробных условиях.

Концентрация свободного убиквитина достоверно не изменялась в гомогенатах скелетных мышц после однскратных ФН,за исключением 25% снижения его уровня через 24 ча!а после интенсивной Ш в волокнах оксидативного типа. Данная величина не была связана с увеличением количества выявляемых иммуноокрашиванием конъюгатов. Рядом авторов также было отмечено, что увеличение уровня конъюгатов убиквитина с белками, происходящее в ответ на стрессорнсе воздействие, не отражается на величине концентрации свободного убиквитина. Так, гистохимические

«¡следования при самопроизвольной мышечной атрофии выявили [нтенснвное образование коньюгатов в местах разрыва волокон, >днако общее количество убиквитина, измеряемое методом РИА, к изменялось (Haas, 1989 ). Скорость синтеза убиквитина в ;анных аномальных условиях может возрастать более чем в два )аза при постоянной скорости распада (Haas, 1989 ). Исходя из >ышеизлсисенного, отсутствие достоверного уменьшения уровня сводного убиквитина при увеличении количества -онъюгатов, отме-юемое после однократных ФН, можно объяснить следующим образом, быстрое снижение уровня свободного убиквитина во время его осиленной кокыогации с новыми субстратами мсжет активировать ;интез этого белка, за счет которого его содержание быстро юсстанавливается до исходной величины.

>. Влияние систематической мышечной деятельности на активность LTP-зависимого протеолиза в скелетных мышцах крыс. Системати-гаская ФН в анаэробном и аэробном режимах в течение 4-х недель ie приводила к достоверным изменениям активности АТР-зависимо-'о протеолиза в скелетных мышцах крыс (табл.3).

Таблица 3 Влияние систематических ФН на АТР-завнсимый распад белков в скелетных мышцах различного метаболического профиля

Условия опыта

Пяточная мышца мкгФИГЦ/мг белка

Белая часть четырехглавой мышцы бедра мкгФИЩ/мг белка

1етренмрованные пробный режим ФН ■наэробный режим ФН

1.03+0.10 0.9%0.07 1.07+0.07

0.55+0.04 0.46+0.06 0.44+0.04

Как видно из данных таблицы 3, в состоянии покоя актив-[ость ферментов, участвующих в АТР-з.тисимом распаде белков,в нелетных мышцах различного метаболич>ского профиля существен-ю не различалась.

Таким образом, можно сделать вывод, что АТР-,убиквитин-¡ависимый распад белка происходит при кратковременной пере-

стройке метаболизма мышц. Этот процесс не связан с более глубс кой и длительной адаптацией организма к ФН, характерной для . тренировки. Вероятно, в реакциях энергозависимого протеолиза дополнительный расход основного источника энергии (АТР) необхс дим для изменения направленности метаболических процессов, обеспечивающих работу мышц. Иначе нормальное функционирование миофибрилл невозможно. Это подтверждается в представленной работе данными об увеличении активности АТР-зависимого протеолиза при однократных ФН аэробной и аэробно-анаэробной направленности именно в тех мышечных волокнах, которые наименее приспособлены к функционированию в заданном режиме. В процессе трени ровки происходит адаптация ферментного аппарата, увеличение за паса эндогенных субстратов, обеспечивающих нормачьную работу мышц во время всей тренировочной программы (Хочачка, Сомеро, 1988). При этом необходимость в перестройке метаболических про цессов не возникает, а следовательно энергозависимый распад белка не активируется.

ВЫВОДЫ

1. Разработан флуороиммунный метод определения концентрации свободного убиквитина в экстрактах скелетных мышц крысы. Рабочий диапазон метода составил 10-200 нг, чувствительность 10 нг. Содержание убиквитина было равным 45.9+4.0 рмоль/мг бел. ка в волокнах оксидативного типа и 2S.2+3.1 рмопь/мг белка в волокнах гликолитического типа.

2. Методом "Западного" блотинга было показано, что распределение коныогатов убиквитина с белками по молекулярным массам было сходным в гшогенатах пягочной мышцы и белой части четыре: главой мышцы бедра. Обнаружен белок-коньюгат с молекулярной ма( сой 30 кДа, содержание которого в два раза превышало величины для других белков-коныогатов.

3. Активность АТР-зависимого протеолиза составила С.83+0.( мкгйИГЦ/иг белка в волокнах оксидативного типа и 0.46+0.04 мкг Ф<ГЩ/мг белка в волокнах гликолитического типа.

4. Установлено, что активность АТР-зависимого протеолиза, концентрация свободного убиквитина и содержание коныогатов убиквитина с белками зависят от типа волокон, составляющих мышцы. Значения данных показателей в оксидативных волокнах в два раза превышали величины в волокнах гликолитического типа.

5. Однократная длительная SI приводила к усилению АТР-шсимого протеолиза и увеличению содержания белка с молеку-иой массой 30 к^а з мышечных волокнах гликолитического ти-через 0, 12 и 24 часа отдыха после ФН. В гомогенатах пяточ-i мышцы наблюдается увеличение активности АТР-зависимого 1теолиза через 12 часов отдыха.

Ô. Однократная интенсивная ФН приводила к увеличению ивности АТР-зависимого протеолиза, и содержания конъюга-убиквитина с белками после 12 и 24 часов отдыха в окси-ивных волокнах. В гомогенатах волокон гликолитического а наблюдалось только увеличение содержания белка-коньюга-с молекулярной массой 30 кДа через 24 часа отдыха после ФН.

7. Систематические ФН»преимущественно аэробной или анаэ-ной направленности сопровождаются адаптацией ферментов АТР-исимого протеолиза к изменениям метаболизма в скелетных цах. В период отдыха после систематических И не выявлено яичий в величинах активности АТР-зависимых протеаз в раз-

типах скелетных мышц.

8. Изменение активности АТР-зависимого протеолиза в гомо-атах скелетных мышц указывает на особенности метаболизма экон при выполнении ФН различной интенсивности и длительное-достоверное увеличение активности протеаз наблюдается в зчных волокнах,наименее приспособленных к сокращению в за-ïom режиме ФН.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО'ТЫЖ ДйССЕЕГАЦйИ

1. Бабошина О.В. АТФ-зависимый протеолиз внутриклеточных сов // Системные механизмы адаптации организма спортсмена к [ческим нагрузкам. - Л: ЛНИИЗК, 1988, С.95-101.

2. Влияние физических нагрузок на протеолиз в скелетных ;ах крыс / Назаров Л.В., Бабошина О.В., Цыпленков П.В. и // Материалы всесоюзной конференции "Биохимия питания (тсмеов" Л: 1989. - C.I9I-I93.

3. Назаров 'Л Б. , Бабошина О.В., Рогозкик В.А. Активность айнов, калпаетлтина и АТФ-зависимого протеолиза в скелет-мышцах различного типа // Материалы УН всесоюзной кокфе-ии "Биохимия мынц", Тбилиси, 1989, - С.215-216.

4. Влияние физических нагрузок на активность калпаинов 1 содержание миелопероксидазы в скелетных мышцах крыс / Назаров И.Б., Бабсшина О.В., Рогозкин В.А. и др. // Укр. биох! мич.яурн. -1990, - Т.62, № 3, - C.I0I-I05.

б.Бабоиина О.В., Бабчина И.В., Рогозкин В.А. Влияние физической нагрузки на АТФ-зависимый протеолиз в скелетных мышцах и печени крыс // Координация функций при срочной и долговременной адаптации организма спортсмена к физическим нагрузкам. - JI: ЛШ1ЛЖ, 1990, С.101-105.

6. Rogozkin V.A., Nazarov I.В., Baboahina O.V. The actj vity of proteolytic enzymes of rat skeletal muscle after ply sical exercise.// 20th. Meeting FEBS, Budapest, - 1990, - At 3tractg Tu 430.

T.Rogozkin V.A., Baboahina O.V. 'Ubiquitin-mediated protein metabolism in rat skeletal muscle during muscle actxvj ty // Satellite Symposium to 20th Meeting of FEBS, Budapest/ Hottinham, 1990, -.P.28.

8. Rogozkin V.A., Baboshina O.V., Razarov I.B. Activation of the AIP-, utiquitin-dependent and calcium-dependent proteolytic system in skeletal muscle during exercise and recovery // Che 8th Int. Biochem.Exers.Conf., Nagoya, Japan* 1991, - P. 147.

9. Регуляция витаминным комплексом Аэровит метаболического ответа на физическую нагрузку / Пшецдин А.И., Шишина Н, Бабошина О.В. и др. // Материалы Всесоюзной конференции "Юл ническая витаминология", Москва, - 1991, - С.303-304.

Подл.» печать 9,07.92г Объем In.л. тире* 100 вкз. Зысаз 64. Бесплатно.

ПП ВСЕГЕИ г. Санкт-Петербург 1992г.