Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гистидинсодержащих дипептидов на функциональные свойства Сa-каналов саркоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гистидинсодержащих дипептидов на функциональные свойства Сa-каналов саркоплазматического ретикулума"

гх Г Л П,1

I I О V"

1 о ФЕВ 1997

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

БАТРУКОВА Марина Алексеевна

УДК 577.352.4

ВЛИЯНИЕ ГИСТИДИНСОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА Са-КАНАЛОВ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

03.00.04- Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

доцент А.М. Рубцов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ю.Н. Антоненко доктор биологических наук

Ю.В. Архипенко

Ведущее учреждение: Институт биофизики клетки РАН,

г. Пущино

Защита состоится " 24" февраля 1997 г. в "_" часов

на заседании Диссертационного Совета Д.053.05.32 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, 119899, Воробьевы Горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" января 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук М.В. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Саркоплазматический реттосулум (CP) скелетных мышц играет ключевую роль в регуляции мышечного сокращения. Он представляет собой замкнутую систему мембранных цистерн и трубочек, пронизывающих саркоплазму вблизи миофибрилл. CP скелетных мышц представлен двумя морфологически и функционально различающимися структурами - продолговатыми трубочками (легкая фракция CP), расположенными вблизи миофибрилл, и терминальными цистернами (тяжелая фракция CP), которые контактируют с трансверзальными трубочками сарколеммы и соединяются с ними посредством особых структур - так называемых «соединительных ножек». Основным белковым компонентом продолговатых трубочек является Са-АТФаза, осуществляющая АТФ-зависимую аккумуляцию Са2+ внутрь везикул СР. Терминальные цистерны содержат Са-каналы и обеспечивают быстрый выброс Са2+ из ретикулума (Martonosi, 1984; Inesi, 1985).

В 1987 г. из тяжелой фракции CP скелетных мышц и сердца был выделен белок, названный рианодиновым рецептором (RyR), так как он с высоким сродством и специфичностью связывается с алкалоидом рианодином (Imagawa et al., 1987; Inui et al., 1987). Было установлено, что RyR в морфологическом отношении представляет собой белок «соединительных ножек» (Lai et al., 1988; Wagenknecht et al., 1989), a функционально - Са-канал CP (Lai et al., 1988; Smith et al., 1988). Наиболее известными активаторами RyR являются адениловые нуклеотиды, кофеин и ионы Са2+ в микромолярных концентрациях, а ингибиторами - рутениевый красный и ионы Mg2+ (Smith et al., 1986; Coronado et al., 1994). При регистрации одиночных каналов проводимость Са-каналов для Са2+ составляет около 120 pS (Smith et al., 1988). У млекопитающих RyR представлен тремя изоформами, кодируемым!* разными генами и обладающими разной первичной структурой и свойствами. Первая изоформа (RyRl) присутствует в скелетных мышцах, вторая (RyR2) - в сердце, третья (RyR3) - в головном мозге и гладкой мускулатуре (Marks et al., 1989; Otsu et al., 1990; Hakamata et al., 1992).

После открытия Са-каналов и выяснения их роли в функционировании скелетной мускулатуры стал понятен механизм действия многих физиологически активных соединений. Так, было показано, что кофеин увеличивает чувствительность демембранированных мышечных волокон к Са2+ (Harrison et al., 1985), а при добавлении его к изолированным мышечным препаратам он сам вызывает мышечную контрактуру (Sandow and Brust, 1966). Кроме того, он увеличивает напряжение, развиваемое утомленными мышечными препаратами (Lannergren and Westerblad, 1989). Оказалось, что все эти эффекты связаны с активирующим

действием кофеина на Са-каналы СР. Сходным физиологическим действием на мышечные препараты обладает дипептид карнозин, который, в отличие от кофеина, является эндогенным соединением и присутствует в цитоплазме мышечных клеток в миллимолярных концентрациях (Crush, 1970; Abe, 1995). Карнозин, подобно кофеину, увеличивает чувствительность демембранированных мышечных волокон к Са2+ (Harrison et al., 1985), а также повышает работоспособность (особенно при утомлении) изолированных мышечных препаратов (Crush, 1970; Петухов и др., 1976). Карнозин в составе скелетной мускулатуры был открыт в 1900 г., (Gulevitsch and Amiradzibi, 1900), позднее в скелетной мускулатуре были найдены его метилированные производные анзерин (Ackermann et al., 1929) и офидин, также называемый баленином (Imamura, 1939), в головном мозге был обнаружен гомокарнозин (Pisano et al., 1961), а в сердце - ацетилкарнозин (Sobue et al., 1975). Карнозин и анзерин практически не участвуют в традиционных путях метаболизма мышечной ткани, и их роль в мышечной клетке окончательно не установлена. Однако в онтогенезе карнозин появляется в мышцах к моменту замыкания рефлекторных дуг и формирования координированной двигательной активности и исчезает при денервации мышцы, что позволяет говорить о том, что эти дипептиды, по-видимому, имеют большое значение для функционирования скелетной мускулатуры (Северин, 1954; Добрынина, 1967). К другим свойствам карнозина, определяющим его роль в клетке, относятся способность активировать некоторые ферменты гликолиза (Наградова, 1958; Jenks and Hyatt, 1959; Johnson and Aidstack, 1984) и связывать ионы металлов переменной валентности (Davey, I960; Ch.iki.ra and Mizukami, 1991), а также его антиоксидантное действие (Дупин, 1987; Boldyrev et al., 1988). Кроме того, карнозин представляет собой буфер, компенсирующий закисление, которое возникает в ходе мышечной работы (Bate-Smith, 1938; Skulachev, 1978).

Поскольку карнозин и кофеин обладают сходным действием на мышечные препараты и эффект кофеина определяется его способностью активировать Са-каналы CP, мы предположили, что действие карнозина на мышечные препараты также может быть связано с его влиянием на Са-каналы СР.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование влияния карнозина на функционирование Са-каналов CP, для чего были поставлены следующие задачи".

1. Выделить препараты тяжелого CP, содержащие функционально активные Са-каналы;

2. Оценить возможность прямого активирующего действия карнозина на Са-каналы CP;

3. Исследовать влияние карнозина на взаимодействие Са-каналов СР с другими модуляторами их активности;

4. Исследовать рН-зависимость действия карнозина на Са-каналы СР;

5. Проанализировать влияние карнозина на разные изоформы НуИ.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показано, что карнозин и родственные соединения активируют чувствительные к рутениевому красному Са-каналы СР скелетных мышц и сердца.

Исследование влияния карнозина на взаимодействие Са-каналов СР скелетных мышц с другими регуляторами их активности показало, что карнозин увеличивает активирующее действие адениловых нуклеотидов и кофеина и снижает ингибиругощее действие низких концентраций М£2+. Установлено, что карнозин расширяет диапазон активирующих концентраций ионов Са2+. Аналогичным действием на Са-каналы СР сердца обладает ацетилкарнозин.

Определена рН-зависимость активирующего действия карнозина на Са-каналы. Установлено, что активирующее действие карнозина возрастает при закислении среды. Это позволяет предположить, что активатором Са-каналов может быть протонированная форма карнозина. Таким образом, карнозин может защищать Са-каналы СР от инактивации при закислении, возникающем в ходе мышечной работы.

Установлена роль различных функциональных групп молекулы карнозина в обеспечении его активирующего действия на Са-каналы СР скелетных мышц кролика. Показано, что анзерин (1-метил-карнозин) и карцинин (декарбоксилированный карнозин) действуют на Са-каналы более эффективно, чем карнозин. Активирующая способность офидина (3-метил-карнозин) и ацетилкарнозина снижена по сравнению с карнозином. Гомокарнозин (у-аминобутхфил-Ь-гистидин) и карнозин действуют на Са-каналы практически одинаково.

Показано также, что карнозин и ацетилкарнозин более эффективно активируют Са-каналы СР тех тканей, в которых они присутствуют в качестве эндогенных соединений: карнозин более эффективен в случае СР скелетных мышц, а ацетилкарнозин - СР сердца.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования расширяют представления о способах регуляции активности Са-каналов СР и о роли гистидинсодержащих дипептидов в мышечной ткани. Подходы, использованные в данной работе, а также полученные результаты могут использоваться при изучении функциональных особенностей Са-каналов СР. В частности, способность карнозина изменять сродство Са-каналов СР к другим модуляторам их активности необходимо учитывать при определении

параметров транспорта Са2+ в мышечных клетках и проводить эксперименты in vitro в присутствии физиологических концентраций карнозина, т.е. в условиях, по возможности приближенных к естественным. Результаты данной работы используются при чтении курса лекций по биохимии мембран на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ, а также при организации практической экспериментальной работы студентов и аспирантов кафедры.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на научном семинаре кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на Первой Российско-Британской конференции по мембранной биоэнергетике (Southampton, 1992), на Международной конференции аспирантов и студентов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96" (Москва, 1996) и на Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит стр. машинописного текста, таблиц и рисунков. Список литературы включает источника.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

Препараты тяжелой фракции саркоплазматического ретикулума из белых скелетных мышц кролика, крысы и утки получали методом дифференциального центрифугирования (Moni et al,, 1985).

Препараты тяжелой фракции саркоплазматического ретикулума сердца утки и быка получали методом дифференциального центрифугирования (Imagawa et al., 1988).

Концентрацию белка в препаратах тяжелого CP определяли с Кумасси бриллиантовым голубым G-250 по методу Спектора (Spector, 1978).

Анализ белкового состава получаемых препаратов тяжелого CP проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli, 1970), используя 3% концентрирующий и 3-20% градиентный разделяющий гели.

Регистрацию АТФ-зависимой аккумуляции Са2+ и лиганд-индуцируемого выброса Са2+ из везикул CP осуществляли с помощью металлохромного Са-индикатора антипирилазо III (Morii et al., 1985; Rubtsov and Murphy, 1988). Измерения проводили на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) в двухволновом режиме, регистрируя разницу в оптической плотности раствора при 720 и 790

нм (максимум и минимум поглощения комплекса антипирилазо Ш с Са2+ соответственно). Аккумуляцию Са2+ суспензией CP (0,5-1 мг/мл) начинали добавлением нуклеозидтрифосфата (0,5 мМ) в реакционную среду, содержащую 100 мМ КС1, 0,5 мМ MgCl2, 50 мМ PIPES-Трис (рН 7,0) и 50 fiM антипирилазо Ш. При использовании в качестве субстрата АТФ реакционная среда содержала АТФ-регенерирующую систему (10 IU креатинкиназы и 5 мМ креатинфосфата). При ГТФ-зависимой аккумуляции Са2+~ система регенерации субстрата отсутствовала. Выброс Са2+ вызывали внесением 0,2-2 мМ кофеина или 10-50 мМ карнозина при АТФ-зависимой аккумуляции Са2+ и 0,125-1 мМ АМФ при использовании ГТФ в качестве субстрата. Опыты проводили при 25°С.

Измерение скорости выхода Са2+ из пассивно нагруженных Са2+ везикул СР. Везикулы CP скелетных мышц пассивно нагружали Са2+, инкубируя их в течение ночи при 0°С (или в течение 1 часа при комнатной температуре) в растворе, содержащем 100 мМ КС1, 30 мМ PIPES-Tris (рН 7,0), 5 мМ СаС12 с 45Са2+ (10000 срш/нмоль) и 1 мМ PMSF. Затем аликвоты суспензии везикул CP разбавляли в 50 раз средой, содержащей 100 мМ КС1, 30 мМ PIPES-Tris (рН 7,0, контроль) или 30 мМ карнозин (рН 7,0) и, в зависимости от цели конкретного эксперимента, различные концентрации Са2+, ЭГТА, рутениевого красного и Mg2+. Через определенные промежутки времени выход Са2+ останавливали добавлением равного объема раствора, содержащего 20 мМ LaCl3 и 40 мМ MgCl2 (Kim et al., 1983). Пробы фильтровали через фильтры "Synpor" (ЧССР) (диаметр пор 0,4 мкм), промывали, высушивали и измеряли их радиоактивность в сцинтилляционной жидкости ЖС-106 на жидкостном сцинтилляционном счетчике "1214 Rackbeta" (LKB, Швеция). Пассивную нагрузку Са2+ везикул CP сердца осуществляли, инкубируя их в течение 1 часа при комнатной температуре в растворе, содержащем 100 мМ КС1, 30.мМ PIPES-Tris (рН 7,0), 5 мМ СаС12 с 45Са2+ (10000 срш/нмоль) и 1 мМ PMSF (Meissner and Henderson, 1987). Выход Са2+' из везикул CP анализировали как эписано выше. В данном случае раствор, останавливающий выход ~а2+, помимо 20 мМ LaCl3 и 40 мМ MgCl2 содержал также 10 ¡лМ рутениевый красный.

Статистическая обработка. Все эксперименты проводились 3-6 раз с использованием не менее трех различных препаратов СР. Для количественного выражения данных рассчитывали среднее арифметическое значение определяемого параметра и стандартное этклонение от среднего арифметического. Для оценки достоверности оазличий между средними арифметическими значениями параметров применяли критерий Стьюдента. В тексте обсуждаются различия с достоверностью р < 0.05 по критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Получение фракции тяжелого СР. содержащей функционально активные Са-каналы. Известно, что на электрофореграммах Са-каналы определяются как высокомолекулярные белковые полосы с молекулярной массой 350 - 450 кДа (Inui and Fleischer, 1988). Мы обнаружили, что наличие в полученных препаратах CP отмеченного стрелкой белка с высокой молекулярной массой коррелирует с наличием в этих препаратах активных Са-каналов, что определялось по их способности к выбросу Са2+ при внесении известных активаторов Са-каналов (Рис. 1). Таким образом, данный белок представляет собой Са-канал СР. Известно, что Са-каналы CP очень чувствительны к протеолизу, в результате которого они теряют активность. Так, некоторые из полученных нами препаратов CP (CP скелетных мышц крысы (дорожка 6), CP скелетных мышц кролика (дорожка 8) и CP сердца утки (дорожки 2 и 3)), в которых присутствовал указанный высокомолекулярный белок, содержали активные Са-каналы. В других препаратах (CP скелетных мышц утки (дорожка 4) и крысы (дорожка 7), а также CP сердца быка (дорожка 5) этот белок отсутствовал. В этих препаратах не удалось зарегистрировать активных Са-каналов. Ряд препаратов содержал более низкомолекулярный белок (предположительно

протеолитический фрагмент Са-каналов), наличие которого не коррелировало с присутствием активных Са-каналов. Так, в препарате 7 (CP скелетных мышц крысы), содержащем только этот белок, Са-каналы были неактивны.

Анализ влияния карнозина на скорость аккумуляции Са2+ препаратами тяжелого CP скелетных мышц кролика. При добавлении 0.5 мМ.АТФ к инкубационной среде, содержащей везикулы тяжелого саркоплазматического ретикулума и все необходимые для работы Са-АТФазы компоненты, происходит резкое уменьшение количества свободного Са2+ в среде вследствие его связывания с АТФ (Morii et al, 1985). Последующая аккумуляция Са2+ Са-АТФазой происходит в две стадии (Рис. 2а). На первой стадии Са-каналы находятся в открытом состоянии, в результате чего аккумуляция Са2+ происходит сравнительно медленно. На второй стадии Са-каналы закрываются, и накопление Са2+ происходит гораздо быстрее. Затем наступает равновесное состояние, когда скорость аккумуляции Са2+ равна скорости его утечки (Morii et al, 1985; Rubtsov and Murphy, 1988). Оно длится до тех пор, пока не израсходуется весь креатинфосфат, обеспечивающий регенерацию АТФ, после чего Са2+ начинает вытекать из везикул СР. Если на стадии равновесия добавить в среду кофеин или Са2+, происходит быстрый выброс Са2+ из CP в среду, сменяющийся затем его реаккумуляцией, также двухфазной (Рис. 2а).

ИуН »

205.000 -------■■»

116.000 > 97.000 »

66.000 »

45.000 ......... »

29.000 »

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. Электрофореграмма препаратов тяжелого СР, выделенных из сердца утки (2,3), скелетных мышц утки (4), сердца быка (5), скелетных мышц крысы (6,7) и скелетных мышц кролика (8). (1) - белки-маркеры. ИуК -рианодиновый рецептор (Са-канал).

При исследовании влияния карнозина на АТФ-зависимую аккумуляцию Са2+ везикулами СР скелетных мышц было установлено, что в присутствии карнозина происходит значительное снижение начальной скорости аккумуляции Са2+ везикулами СР (Рис. 26). Более того, по мере увеличении концентрации карнозина в инкубационной среде начальная скорость аккумуляции Са2+ падает (Рис. 3). Поскольку карнозин не ингибирует Са-АТФазу СР скелетных мышц кролика (Лопина и Болдырев, 1975), отмеченное снижение скорости аккумуляции Са2+ может быть связано с тем, что карнозин активирует Са-каналы СР.

Анализ карнозин-индуцируемого выброса Са2+ из везикул тяжелого саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика. Мы обнаружили, что внесение карнозина в инкубационную среду на стадии равновесия индуцирует быстрый выброс Са2+ (Рис. 2а). Этот эффект является дозозависимым, причем зависимость количества высвобождающегося из СР Са2+ от концентрации карнозина имеет гиперболический характер, что свидетельствует о наличии насыщаемых центров связывания карнозина на молекуле Са-канала. При изображении полученных данных в системе обратных координат можно рассчитать концентрацию карнозина, вызывающую

А72(ГА790 1

цМ J

(-Н

1 мин

2 3 4

I I !

Рис. 2. АТФ-зависимая аккумуляция и выброс индуцируемый 10

ММ. (2), 2 мМ кофеином (3) и 30 мМ карнозином (^/в контроле (а) и

/.вI присутствии 30 мМ карнозина (б), рН 7.0. Концентрация АТФ (1) 0.5 мМ.

полумаксимальный выброс Са2+ (Кд.5, мМ), и величину максимального выброса, вызываемого карнозином (Атах, нмоль Са2+/мг белка СР). Расчеты показали, что для карнозина Ко.5 = 8.67 + 0.15 мМ и Атах = 27.53 + 2.74 нмоль Са2+ на 1 мг белка ретикулума (Табл. 1). Необходимо отметить, что карнозин-индуцируемый выброс Са2+ полностью блокируется микромолярными концентрациями рутениевого красного, что свидетельствует об активации карнозином именно рианодинового рецептора.

Таблица 1. Параметры лиганд-индуцируемого выброса Са2+ из везикул тяжелого СР скелетных мышц кролика (К05 -концентрация, вызывающая полумаксимальный выброс

максимальное

количество

Са2+, мМ;

освобождаемого Са2+, нмоль Са2+/ мг белка СР).

Лиганд Ко.5 •А-тах

карнозин 8.67 + 0.15 27.53 + 2.74

анзерин 2.68 ±0.11 37.17 + 4.01

р-аланин нет эффекта

Ь-гистидин нет эффекта

Р-аланин + Ь-гистидин нет эффекта

имидазол нет эффекта

Чтобы установить, чем именно определяется активирующее действие карнозина на Са-каналы, мы исследовали действие на Са-каналы аминокислот, входящих в состав молекулы карнозина, а также наиболее известного производного карнозина - анзерина,

Рис. 3. Зависимость начальной скорости аккумуляции везикулами тяжелого CP скелетных мышц кролика от концентрации карнозина в инкубационной среде (за 100% взята скорость аккумуляции

Са2+ в присутствии 40 мМ PIPES).

5 1 1 | Г

К 0 Ю 20 30 40

карнозин, мМ

который присутствует в мышцах наряду с карнозином. Как видно из Таблицы 1, анзерин также вызывает быстрый выброс Са2+ из ретикулума, причем сродство к нему Са-каналов приблизительно в 3 раза выше, чем к карнозину, а величина максимального выброса в случае анзерина существенно выше, чем для карнозина. При этом ни сам имидазол, ни аминокислоты, входящие в состав молекулы карнозина ((3-аланин и L-гистидин), взятые как по отдельности, так и в смеси, не вызывают выброса Са2+ из ретикулума. Таким образом, активирующее действие карнозина на Са-каналы CP определяется, по-видимому, взаимным пространственным расположением различных групп в составе молекулы карнозина.

Влияние карнозина на чувствительность Са-каналов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц к кофеину и адениловым нуклеотидам. Несмотря на то, что карнозин и анзерин могут активировать Са-каналы CP, представляется маловероятным, что карнозин - и анзерин-индуцируемый выброс Са2+ имеет место in vivo, поскольку концентрация этих дипептидов в мышечных клетках достаточно высока и поддерживается на относительно постоянном уровне. Известно, что в мышцах большинства животных содержатся и карнозин, и анзерин (суммарная концентрация карнозина и анзерина в скелетных мышцах кролика составляет около 20 ммоль/кг ткани, из них карнозина 2 и анзерина 14-19 ммоль/кг ткани) (Crush, 1970; Abe, 1995). Так как дипептиды присутствуют только в цитоплазме мышечных клеток и отсутствуют в межклеточном

а

А720'А790

1 мин

^ /

1

Рис. 4. Аккумуляция Са2+ везикулами тяжелого СР при использовании в качестве субстрата 0.5 мМ ГТФ (стрелка а) и его пассивный выход (1) или выброс, индуцированный 0.3 мЗМ АМФ (стрелка б) в контроле (2) и в присутствии 30 мМ карнозина (3).

пространстве, их реальная концентрация в мышечных клетках, вероятно, еще выше.

Поскольку карнозин и анзерин, являясь активаторами Са-каналов, постоянно находятся в мышечных клетках в столь высоких концентрациях, необходимо было выяснить, как эти соединения влияют на взаимодействие Са-каналов с другими модуляторами их активности.

Анализ кофеин-индуцируемого выброса Са2+ в присутствии 30 мм карнозина показал, что величина К0.5 для кофеина снижается почти в 1.5 раза по сравнению с контролем, в то время как величина максимального выброса Са2+ (Атах) практически не меняется (Таблица 2). Таким образом, карнозин не только не конкурирует с кофеином за участки связывания, а, наоборот, потенциирует его действие, увеличивая сродство к нему Са-каналов.

Возможность влияния карнозина на взаимодействие Са-каналов с адениловыми нуклеотидами была проанализирована в условиях, когда аккумуляцию Са2+ внутрь везикул ретикулума осуществляли за счет гидролиза неаденилового нуклеотида ГТФ. При добавлении неадениловых нуклеотидов в среду, содержащую все необходимые для транспорта Са2+ компоненты, наблюдается уменьшение уровня свободного Са2+ в среде инкубации вследствие его аккумуляции внутрь везикул ретикулума, после чего наступает стадия равновесия (Рис. 4). В последующий период, по мере расходования субстрата, начинается утечка Са2+ (ЛиЫзоу е1 а!., 1988). Добавление на стадии

равновесия кофеина, Са2+ или карнозина не вызывает выброса Са2+, так как в данных условиях Са-каналы заиншбированы ионами однако при внесении 0.05 - 1 мМ адениловых нуклеотидов происходит быстрый дозозависимый выброс Са2+ (ЕиЫвоу а1., 1988).

Таблица 2. Значения К0.5 (мМ) и А^х (нмоль Са2+/мг белка СР) для кофеин- (при использовании в качестве субстрата АТФ) и АМФ-индуцируемого выброса Са2+ (при использовании в качестве субстрата ГТФ) из тяжелой фракции СР ■_скелетных мышц кролика._

Индуктор выброса Са2+ из СР 30 мМ PIPES 30 мМ карнозин

Ко.5 Атах Ко.5 ^тах

кофеин 0.32 ±0.01 18.86 HL0.06 0.19 ± 0.01 20.41 ± 0.03

АМФ 0.10 ± 0.02 20.03 ± 0.04 0.04 ± 0.01 12.36 ± 0.02

Определение Kq.5 и Агпях для АМФ-индуцируемого выброса Са2+ при ГТФ-зависимой аккумуляции Са2+ показало, что в присутствии 30 мМ карнозина величина К05 для АМФ снижается примерно в 2.5 раза (Таблица 2). Таким образом, как и в случае с кофеином, карнозин увеличивает сродство Са-каналов к этому активатору (Рис. 4), однако в данном случае наблюдается значительное снижение количества Са2+, освобождаемого в присутствии карнозина, по сравнению с контролем. Поскольку количество освобождающегося из везикул ретикулума Са2+ зависит от степени их нагрузки Са2+" (Ikemoto et al., 1989) и контролируется взаимодействием Са-каналов с Са-связывающим белком кальсеквестрином, локализованным на внутренней поверхности мембран ретикулума (Ronjat and Ikemoto, 1989), можно предположить, что наблюдаемое различие в величине Атах в данной модели отражает изменение этих взаимодействий под влиянием карнозина.

Влияние карнозина на чувствительность Са-каналов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика к ингибиторам - ионам Mg2+ и рутениевому красному. Для оценки влияния карнозина па взаимодействие Са-каналов СР скелетных мышц с ингибиторами был использован метод пассивной нагрузки везикул ретикулума Са2+. В случае высоких концентраций Mg2+ (1 мМ) и рутениевого красного (1 цМ) каналы полностью блокируются, и содержание оставшегося в везикулах Са2+ в контроле и в присутствии карнозина практически одинаково (Рис. 5). Однако в присутствии 50 дМ Mg2+ (что близко к величине К; для Mg2+, которая составляет около 70 цМ (Meissner et al., 1986)), наблюдается лишь частичное ингибирование Са-каналов. В этом случае 30 мМ

время, с время, с

Рис. 5. Влияние ингибиторов активности Са-каналов на выход из везикул СР скелетных мышц кролика в контроле (а) и в присутствии 30 мМ

карнозина (б). Везикулы СР нагруясжали Са^+ пассивно. Измерения проводили при рН 7.0 и рСа 5.3.

Ф - 1 мМ М§2+; О' 1 рутениевый красный; Щ - 50 цМ | | - без добавок;

карнозина не только устраняет ингибирующее действие но и

активирует Са-каналы.

Влияние карнозина на взаимодействие Са-каналов СР скелетных мышц, кролика с ионами Са2+. Известно, что зависимость активности Са-каналов СР скелетных мышц от концентрации Са2+ имеет колоколообразный характер, т.е. низкие (микромолярные) концентрации Са2+ активируют, а высокие (миллимолярные) -ингибируют Са-каналы. Максимальная активность Са-каналов наблюдается при рСа = 5.3 (Ме1якпег е! а1., 1986). Мы обнаружили, что карнозин изменяет чувствительность Са-каналов к Са2+. При всех исследованных концентрациях Са2+ карнозин увеличивает скорость выхода Са2+ из везикул СР и расширяет диапазон активирующих концентраций Са2+, увеличивая активирующее действие низких и оптимальных и снижая ингибирующий эффект высоких концентраций Са2+ (Рис. 6).

Анализ рН-зависимости действия карнозина на Са-каналы СР скелетных мышц_кролика. Мы обнаружили, что активность Са-каналов СР скелетных мышц кролика снижается при закислении среды и возрастает при защелачивании (Рис. 7), что хорошо согласуется с литературными данными (Ра1ас1е е1 а1., 1988). При исследовании активирующего действия карнозина на Са-каналы в интервале рН 6.0 - 8.0 было установлено, что при рН 7.5 - 8.0

рСа

Рис. 6. Зависимость количества Са2+, освобождаемого за 15 с из везикул CP скелетных мышц кролика, от концентрации Са2+ в реакционной среде., рН 7.0. Белые прямоугольники - контроль, черные прямоугольники -30 мМ карнозина. Везикулы CP нагружали Са2+ пассивно.

арнозин практически не влияет на количество освобождаемого из езикул CP Са2+, так как Са-каналы находятся, по-видимому, в [аксимально активном состоянии. Активирующее действие арнозина возрастает при закислении, и при рН 6.0 карнозин величивает количество освобождаемого из везикул CP Са2+ более ем в 5 раз по сравнению с контролем. Таким образом, карнозин нижает ингибирующее действие низких рН. Данный защитный ¡еханизм может иметь место in vivo при закислении, возникающем в оде работе мышц. Можно также предположить, что активирующим ействием на Са-каналы CP скелетных мышц кролика обладает ротонированная форма карнозина (рК карнозина = 7.01), однако анный вопрос требует специального анализа.

Исследование выброса Са2 ь из везикул CP скелетных мышц ролика, индуцируемого производными карнозина и гистидина. [оскольку мы установили, что анзерин действует более эффективно,

0 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

рН

Рис. 7. Зависимость количества Са2+, освобождаемого за 15 с из везикул СР скелетных мышц кролика, от рН. Белые прямоугольники - контроль, черные прямоугольники - 30 мМ карнозина. Везикулы СР нагружали Са2+ пассивно. Измерения проводили при рСа 6.5.

чем карнозин, а ни 3-аланин, ни гистидин не вызывают выброса Са2+, необходимо было выяснить, какая именно часть молекул карнозина и анзерина наиболее важна для обеспечения их взаимодействия с Са-каналами, В связи с этим мы проанализировали влияние ряда производных карнозина и гистидина на Са-каналы скелетных мышц кролика. Опыты проводили в системе с использованием антипирилазо III при активной АТФ-зависимой аккумуляции Са2+ внутрь везикул СР. На рис. 8 представлены данные о количестве Са2+, освобождаемом из СР скелетных мышц кролика при индукции выброса Са2+ различными гистидинсодержащими соединениями в концентрации 25 мМ (величина карнозин-индуцируемого выброса принята за 100 % ). Мы обнаружили, что близким к карнозину действием на Са-каналы обладает гомокарнозин, т.е. замена (3-аланина на у-аминомасляную кислоту не оказывает существенного влияния на взаимодействие дипептида с Са-каналами.

Рис. 8. Количество Са2+, освобождаемое из везикул СР скелетных мышц кролика, под действием каркозина и родственных соединений в концентрации 25 мМ. За 100% взято количество освобождаемого Са2+ при индукции выброса карнозиком. Везикулы СР нагружали Са2+ активно в присутствии АТФ.

1 - карнозин; 2 - гомокарнозин; 3 -ацетилкарнозин; 4 - анзерин; 5 - офидин; 6 - карцинин; 7 - 1-метил-Ь-гистидин; 8 - З-метил-Ь-гистидин; 9 - ацетилгистидин; 10 - Р-аланин; 11 - Ь-гистидин.

Способность карнозина активировать Са-каналы СР скелетных мышц кролика значительно увеличивается при декарбоксилировании: карцинин вызывает наибольший выброс Са2+ из всех рассмотренных гистидинсодержащих соединений.

Метилирование по 1 атому азота в имидазольном кольце также значительно увеличивает величину лиганд-индуцируемого выброса Са2+ (анзерин вызывает примерно в 2 раза больший лиганд-индуцируемый выброс Са2+ по сравнению с карнозином). Более того, 1-метил-Ь-гистидин, в отличие от самого гистидина, также индуцирует выброс Са2+, причем количество Са2+, освобождаемое под действием 1-метил-Ь-гистидина, сопоставимо с таковым, освобождаемым под действием карнозина. Однако при перемещении метильной группы от первого атома азота к третьему способность дипептидов активировать Са-каналы снижается (количество Са2+,

освобождаемое под действием офидина, примерно в 2 раза меньше, чем в случае карнозина, и почти в 4 раза меньше, чем для анзерина). При этом 3-метил-L-гистидин, в отличие от 1-метил-Ь-гистидина, не способен активировать Са-каналы. Снижение количества Са2+, освобождаемого из CP скелетных мышц кролика, наблюдается также при ацегилировании концевой аминогруппы остатка ß-аланина в молекуле карнозина.

Исследование влияния карнозина на Са-каналы CP сердца утки. Как следует из приведенных выше результатов, карнозин и родственные ему соединения.-":; активируют Са-каналы скелетной изоформы рианодинового рецептора (RyRl), а также изменяют их сродство к другим модуляторам активности Са-каналов. Однако существуют еще две изоформы рианодинового рецептора: ByR2 (в сердце) и RyR3 (в головном мозге и гладкой мускулатуре). Эти изоформы представляют собой разные белки, кодируемые разными генами и обладающие разными свойствами. Мы исследовали влияние карнозина на RyR2, отличающийся от RyRl по аминокислотному составу, электрофоретической подвижности и чувствительности к регуляторам активности, Кроме того, сердце как объект исследования интересно тем, что в нем содержится не сам карнозин, а его ацетилированное производное.

Как видно из электрофореграммы (Рис. 1), препараты CP сердца характеризуются низким содержанием белка Са-АТФазы, вследствие чего скорость АТФ-зависимого поглощения Са2+ везикулами очень низка. Поэтому мы нагружали везикулы CP Са2+ пассивным путем.

Мы обнаружили, что Са-каналы CP сердца утки практически не чувствительны к тем концентрациям ингибиторов, которые полностью блокируют выброс Са2+ из везикул CP скелетных мышц (1 цМ рутениевый красный и 1мМ Mg2+). Более того, 10 рМ рутениевый красный и 10 мМ Mg2+, взятые по отдельности, также были неэффективны. И только комбинация этих ингибиторов в данных концентрациях полностью блокировала Са-каналы CP сердца утки (Рис. 9).

Исследование действия на Са-каналы CP сердца утки известных активаторов Са-каналов - кофеина и адениловых нуклеотидов (АТФ) - на фоне низкой концентрации ионов Са2+ (рСа 8.5) показало, что кофеин является их эффективным активатором, увеличивая количество освобождаемого из везикул CP Ca24" примерно в 5 раз по сравнению с контролем (Рис. 9). Однако АТФ оказался слабым активатором Са-каналов CP сердца утки: количество освобождаемого из везикул CP Са2+ в присутствии 5 мМ АТФ лишь незначительно превышало таковое в контроле. Полученные нами результаты хорошо согласуются с имеющимися в литературе данными для Са-каналов CP сердца собаки (Meissner and Henderson, 1987).

4 -I

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 9. Количество Са2+, освобождаемое за 15 сек из везикул СР сердца утки в присутствии различных соединений. Везикулы СР нагружали Са2+ пассивно. Измерения проводили при рСа 8.5. (1) 25 мМ Р1РЕЭ; (2) 10 мМ кофеин; (3) 5 мМ АТФ; (4) 10 цМ рутениевый красный + 10 мМ Мё2+"; (5) 25 мМ карнозин; (6) 25 мМ карцинин; (7) 25 мМ ацетилкарнозин.

При исследовании влияния на Са-каналы СР сердца утки карнозина, ацетилкарнозина, представляющего собой эндогенный компонент сердечной ткани, и карцинина мы обнаружили, что, как и в случае СР скелетных мыши, карнозин примерно в 2 раза увеличивает количество освобождаемого из везикул СР Са2+ по сравнению с контролем (Рис. 9). Карцинин действует несколько хуже карнозина, а ацетилкарнозин, напротив, является более эффективным активатором Са-каналов СР сердца утки (в его присутствии количество освобождаемого из везикул СР Са2+ увеличивается почти в 2 раза по сравнению с карнозином и становится приблизительно равным количеству Са2+, освобождаемому из везикул СР под действием кофеина).

Поскольку ацетилкарнозин, являясь эндогенным компонентом сердечной ткани, действует на Са-каналы СР сердца более эффективно, чем карнозин, мы сравнили влияние этих двух активаторов на СР скелетных мышц, используя пассивно нагруженные Са2+ везикулы СР. Мы установили, что карнозин, который присутствует в скелетной мускулатуре в качестве эндогенного соединения, более эффективно действует на Са-каналы СР скелетных мышц кролика (Рис. 10).

Влияние ацетилкарнозина на взаимодействие Са-каналов СР сердца утки с ионами Са2+. Поскольку ацетилкарнозин, являясь

а

б

время, с время, с

Рис, 10. Выход Са2+ из везикул СР сердца утки (а) и скелетных мышц кролика (б) в контроле и в присутствии 30 мМ карнозина и 30 мМ ацетилкарнозика. Везикулы СР нагружали Са2+ пассивно. Измерения проводили при pH 7.0 и рСа 7.3.

ф - контроль; Q - 25 мМ карнозин; Д - 25 мМ ацетилкарнозин;

активатором Са-каналов СР сердца, постоянно присутствует в сердце в концентрации до 10 мМ (O'Dowd, 1992), мы проанализировали его влияние на чувствительность Са-каналов к ионам Са2+. Известно, что, в отличие от Са-каналов СР скелетных мышц, Са-каналы СР сердца собаки лишь в незначительной степени ингибируются высокими (миллимолярными) концентрациями Са2+ (Meissner et al., 1987). Мы установили, что, в отличие от Са-каналов СР скелетных мышц кролика, Са-каналы СР сердца утки сохраняют значительную долю активности при рСа 3.0 (Рис. 11). Оказалось, что ацетилкарнозин, подобно карнозину в случае СР скелетных мышц кролика, увеличивает чувствительность Са-каналов СР сердца утки к Са2+, усиливая активирующее действие низких и снижая ингибирующее действие высоких концентраций Са2+. Однако при концентрациях Са2+ около 10~5 - 10~4 М активирующее действие ацетилкарнозина не проявляется. По-видимому, при данных концентрациях Са2+ Са-каналы СР сердца утки находятся в максимально активном состоянии.

рСа

Рис. 11. Зависимость количества Са2+, освобождаемого за 15 с из везикул СР сердца утки, от концентрации свободного Са2+. Везикулы СР нагружали Са2+ пассивно. Белые прямоугольники - контроль, черные прямоугольники - 30 мМ ацетилкарнозина.

ВЫВОДЫ:

1. Карнозин и ряд его производных индуцируют выброс Са2+ из тяжелой фракции саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и сердца, активируя чувствительные к рутениевому красному Са-каналы.

2. Карнозин повышает чувствительность Са-каналов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика к их активаторам - адениловым нуклеотидам и кофеину - и снижает ингибирующее действие низких концентраций М£2+.

3. Карнозин увеличивает скорость выхода Са2+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика в области низких (субактивирующих) концентраций наружного Са2+, а также снижает ингибирующее действие высоких концентраций наружного Са2+ на Са-каналы. Аналогичным действием на Са-каналы саркоплазматического ретикулума сердца утки обладает ацетилкарнозин.

4. Активирующее действие карнозина

на

Са-канал

саркоплазматического ретикулума скелетных мьшщ кроли! возрастает при снижении рН от 8.0 до 6.0.

5. Способность гистидинсодержащих соединений активировать С каналы саркоплазматического ретикулума скелетных мьшщ кролга падает в ряду: карцинин, анзерин, карнозин, гомокарнозин, 1-мети. L-шстидин, ацетилкарнозин, офмдин. Гистидин, З-метил-Ь-гистиди ацетилгистидин и р^аланин не вызывают выброса Са2+ из везию тяжелой фракции саркоплазматического ретикулума скелетнь мышц кролика.

6. Сравнение влияния карнозина и ацетилкарнозина на освобожден! Са2+ из везикул саркоплазматического ретикулума скелетных мып кролика и сердца утки показывает, что карнозин более эффектив) действует в случае саркоплазматического ретикулума скелетнь мышц кролика, а ацетилкарнозин - саркоплазматического ретикулуа сердца утки.

. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Батрукова, MJL, Рубцов, АЖ, Болдырев, А_А. Влияние карнозина i Са-каналы саркоплазматичесхсого ретикулума скелетных мыш Биохимия, 1992, т. 57, вып. 6, стр. 904 - 910.

2. Bairukova, MA. and Rubtsov, А.М. Histidine-Containing Dipeptides J Endogenous Regulators of Sarcoplasmic Reticulum Ca-Release Channe Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes), 1996, in press.

3. Батрукова, MJL, Рубцов, A.M. Регуляция активности Са-канал< саркоплазматического ретикулума скелетных мышц эндогенный соединениями. Тезисы доклада, Международная конференщ студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-96 Москва, 12 - 14 апреля 1996 г.

4. Батрукова, MA, Рубцов, AJVL Регуляция активности Са-канал1 саркоплазматического ретикулума скелетных мышц мышечныь дипептидами карнозином и анзерином. Тезисы доклад Всероссийская конференция "Прикладные аспекты исследоеанг скелетных, сердечных и гладких мышц", Пущино, 7-11 октяб} 1996 г., стр. 12 - 13.