Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние активных форм кислорода на структурно-функциональное состояние мембран мышечных клеток и их антиоксидантная защита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние активных форм кислорода на структурно-функциональное состояние мембран мышечных клеток и их антиоксидантная защита"

САН КГ- ПЕТЕРБУРГСКИ II ГОСУДАРСТВЕННЫ» УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РГб од

2 7 т №

дятлов

Роман Викторович

ШЯШ1Е АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА СТРУКТУРНО-ШКЦНОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН МЫШЕЧНЫХ 1ЕТОК И ИХ АНТИОКСИДАНТИАЯ ЗАЩИТА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в лаборатории внутриклеточной регуляции НИ физиологии им А.А.Ухтомского Санкт-Петербургского государственно! университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С.Н.Лызлова Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАМН, профессор И.П.Ашмарин кандидат биологических наук О.Ю.Янковскнй. Ведущее учреждение:

Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН

заседании диссертационного совета К 063.57.09 но защите диссертации I соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санк Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санк

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургско государственного университета

Защита состоится

часов 1

Петербург, Университетская набережная, 7/9, ауд. 30 ■

Автореферат разослан" ¡4 " 1997г.

"Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Р.И.Коваленк<

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Биологические системы находятся в состоянии постоянных перемен, за процессами роста и развития неизбежно следуют старение и отмирание. Здоровье и жизнеспособность отдельной такой системы зависит не только от поступления жизненно важных ресурсов и удаления отходов, но и от защиты от потенциальных повреждающих сил. К этим силам можно отнести свободные радикалы, построенные на основе кислорода (активные формы кислорода), которые способны к окислительным реакциям с клеточными макромолекулами. Окислительный статус внутри клетки - это тончайший баланс между про-и антиоксидантной системами. При оптимальных условиях в клетке они эффективно обеспечивают защиту макромолекул организма от окислительного повреждения. Однако длительный дисбаланс в работе данных систем может привести к потенциально опасным условиям кислородного стресса и последующей клеточной дисфункции.

В настоящее время большое внимание биологов и медиков привлекают именно эти экстремальные состояния, при которых в клетках значительно повышается содержание активных форм кислорода (АФК). К числу таких состояний можно отнести гипоксию, гипероксию, воспалительные процессы, травмы, атеросклероз, ишемию, повреждения после различного рода излучений и другие. При чрезмерной наработке активных форм кислорода (кислородном стрессе) повреждаются клетки сердца, печени, мозга и других органов. Свободные радикалы очень токсичны для клеток, так как они являются мощными окислителями, изменяют барьерные свойства мембран, разрушают ДНК, липиды, модифицируют белковые молекулы, повреждают энергию-трансдуцирующие системы и обладают митогенным действием.

Установлено, что одной из основных внутриклеточных мишеней действия активных форм кислорода являются мембраносвязанные белки и ферменты, в том числе участвующие в регуляции Са2+-гомеостаза. Как известно, Са2+-транспортирующие системы плазмалеммы, митохондрий и эндоплазматического ретикулума клеток различных тканей и, особенно мышечной, вносят существенный вклад в регуляцию их функциональной активности.

Саркоплазматический ретикулум (СР) играет центральную роль в функционировании мышц, контролируя уровень свободного кальция в цитозоле миоцитов. Нарушение активного и пассивного транспорта ионов Са2* через мембраны СР может приводить к возникновению ряда патологических состояний. Однако в настоящее время сведений о

влиянии активных форм кислорода на Са2+-транспорт в мышечных клетках сравнительно немного. О действии же активных форм кислорода на структурное и функциональное состояние СР мышц имеются лишь отдельные разрозненные данные. Вышесказанное определяет актуальность настоящего исследования, посвященного изучению влияния активных форм кислорода на структурно-функциональное состояние мембран мышечных клеток и поиску веществ естественного происхождения, осуществляющих антиоксидантное действие.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в определении влияния активных форм кислорода на ряд показателей, характеризующих состояние мышечных клеток, а также в поиске веществ, обеспечивающих антиоксидантную защиту этих клеток.

Были поставлены следующие задачи:

Изучить влияние активных форм кислорода (гипохлорита, гидролероксида, супероксидного радикала):

на спонтанное и оксмтоцин-индуцируемое сокращение миометрия крысы;

на активный транспорт ионов кальция в мембранах саркоплазматического ретикулума различных мышц (скелетных и гладких);

на активность Са2+-АТРазы мембран саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты;

на микровязкость мембран саркоплазматического ретикулума гладких мышц.

На различных моделях (как с использованием активированных нейтрофилов, так и отдельных активных форм кислорода - гипохлорита, гидропероксида и супероксидного радикала) изучить способность некоторых веществ (дитиотреитола, глутатиона, тиреоидных гормонов, мелатонина) проявлять антиоксидантное действие.

Научная новизна

В работе впервые на разных моделях проведен сравнительный анализ токсического действия различных активных форм кислорода, таких как гипохлорит, гидропероксид, супероксидный радикал на мембраны СР скелетных и гладких мышц кролика.

Впервые установлено, что гипохлорит угнетает спонтанную и окситоцин-индуцируемую сократительную активность миометрия крысы, увеличивает микровязкость мембран саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты кролика. Гипохлорит, супероксидный радикал и гидропероксид снижают интенсивность активного транспорта кальция через мембраны саркоплазматического ретикулума скелетных и гладких

мышц кролика, уменьшают Са2*-АТРазную активность. Наибольшие изменения происходят под влиянием гипохлорита. Дитиотреитол оказывает защитное действие на Са2+-АТРазу, активный транспорт Са2+ и микровязкость мембран.

Впервые выявлено, что тиреоидные гормоны (тироксин, трийодтиронин) и мелатонин обладают способностью подавлять люминолзависимую хемилюминесценцию, вызванную активированными нейтрофилами. Наиболее сильным эффектом обладает тироксин в концентрации 10"5М.

Антиоксидантное действие тироксина, трийодтиронина и мелатонина показано на мембранах саркоплазматического ретикулума, подвергшихся влиянию активных форм кислорода. Гормоны в концентрации 10"7М частично восстанавливают активный транспорт Са2+ в мембранах СР скелетных мышц и гладких мышц аорты.

Антиоксидантное действие тиреоидных гормонов и мелатонина показано также на модели тушения люминолзависимой хемилюминесценции, вызываемой отдельными активными формами кислорода.

Впервые установлено, что тироксин, трийодтиронин и мелатонин усиливают активный транспорт Са2+ в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и гладких мышц аорты кролика. Наиболее сильный эффект оказывает тироксин в концентрации 10'5М.

Теоретическое и практическое значение работы

Широкое распространение состояний, при которых происходит образование избыточных количеств активных форм кислорода, делает актуальным изучение клеток-мишеней свободных радикалов и поиск веществ, обладающих антиоксидантным действием.

В работе на мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных и гладких мышц показано, что их атака активными формами кислорода приводит к повреждению структуры и функции мышечных клеток.

Полученные данные имеют значение для фундаментальной проблемы изучения молекулярных механизмов резистентности клеток к повреждающим факторам. Они представляют ценность и в прикладном аспекте, так как дополняют список известных антиоксидантных препаратов. Следует подчеркнуть тот факт, что эти антиоксидантные препараты - тироксин, трийодтиронин и мелатонин- являются естественными компонентами животного организма.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (9 глав), материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Диссертация содержит 46 рисунков. Прилагаемый список литературы включает 121 наименование.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на VI симпозиуме по биохимии липидов (3-6 октября 1994 г. в Санкт-Петербурге), на международном симпозиуме Biological Motility (1994 г. в Пущино), на международной конференции Enviromental Pollution and Neuroimmuno Interactions and Enviroment (17-24 июля 1S95 г. в Санкт-Петербурге), на конференции молодых физиологов и биохимиков России (19-21 сентября 1995 г. в Санкт-Петербурге), а также на международном симпозиуме по геронтологическим аспектам пептидной регуляции функций организма. По теме диссертации имеется 9 публикаций. Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры биохимии СПбГУ 25 декабря 1996г.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполняли на гладкомышечных клетках миометрия крысы, везикулах CP, выделенных из бедренных скелетных мышц кролика методом дифференциального центрифугирования (Ритов, 1977), везикулах CP, полученных из аорт самцов кролика по модифицированному методу Ватраса (Watras et al., 1989). Препараты мембран CP" охарактеризованы по уровню активности маркерных ферментов (глюкозо-6-фосфатаза, NADH-дегидрогеназа и др.), методом электронной микроскопии, по Ca2t -транспортирующей способности. Содержание белка определяли по методу Лоури. Электрофоретическое фракционирование белков везикул аорты проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970).

Исследования на полоске миометрия крысы осуществляли на тензометрической лабораторной установке в изометрическом режиме регистрации в камере с проточной системой в растворе следующего состава: 135 mM NaCI; 4,6 тМ KCI; 1,2 тМ MgCI2; 1,5 тМ СаСЬ; 11 тМ глюкоза; 10 тМ HEPES; рН 7,4.

Активный транспорт ионов Са2+ везикулами CP регистрировали по флуоресценции зонда хлортетрациклина (XT), которая отражает содержание мембраносвязанного кальция. Измерения проводили на флуоресцентном спектрофотометре HITACHI MPF-3 в средах следующего состава: для мембран CP скелетных мышц - 20 мкМ XT, 100 mM NaCI, 2 тМ Mg(CH3COOH)2l 2,5 тМ имидазол, 5 тМ Na2C204, 2тМ

АТР, 0,1мг/мл белка, рН 7.0, при 25°С; для везикул СР гладких мышц - 20 мкМ ХТ, 120 тМ КС1, 100 ткМ Мд(СН3СООН)2, 20 тМ НЕРЕБ, 5 тМ ЫагСгОл, 2 тМ АТР, 0,1 мг/мл белка, рН 6,8, при 25°С.

Определение АТРазной активности мембран СР гладких мышц аорты кролика проводили потенциометрическим методом (Болдырев, 1977).

Изменение микровязкости мембран СР гладких мышц осуществляли с использованием флуоресцентного зонда пирена. Скорость его диффузии и соответственно вязкость липидного слоя характеризуется отношением 1э/!м, где 1м - интенсивность флуоресценции мономеров пирена при длине волны 380 нм, !э -интенсивность флуоресценции эксимеров пирена при длине волны 480 нм. Для флуоресцентных исследований был применен специализированный спектрофлуориметр (СФР-1), предназначенный для регистрации флуоресценции в оптически плотных рассеивающих средах. Эксимеризацию пирена в СР наблюдали в среде следующего состава: 120 тМ КС1, 5 тМ Мд(СН3СООН)2, 20 тМ НЕРЕБ, 5 тМ №N3, рН 6,8; 0,1 мг/мл белка, 5 мкМ пирен. Определение микровязкости проводили, возбуждая флуоресценцию пирена светом при длинах волн 280 нм ("связанные" липиды) и 334 нм ("свободные" липиды).

Хемилюминесцентные методы исследования были использованы для характеристики антиоксидантных свойств тиреоидных гормонов и мелатонмна: измеряли тушение ими уровня хемилюминесценции, вызванной как активированными нёйтрофилами, полученными в градиенте плотности фи кол а (Владимиров, Шёрстнев, 1989), так и отдельными 'формами свободных' радикалов. Измерение хемилюминесценции проводили на хемипюминометре 1251 фирмы 1_КВ. Для усиления эффекта хемилюминесценции в среду добавляли люминол (Р1ика) до конечной концентрации 2*10"5 М. Конечный объем реакционной смеси составлял 1 мл.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие гипохлорита на спонтанную и окситоцининдуцируемую сократительную активности миометрия крысы.

В первой части данной работы исследовали влияние АФК на структурно-функциональную активность мышечных клеток. В данном разделе представлены данные по изучению влияния гипохлорита в различных концентрациях на два вида сократительной активности мышц' матки (спонтанной и окситоцин - индуцируемой). Обнаружено, что' гипохлорит ингибировал частоту сокращений и их амплитуду (рис.1,2).

^ЯШШШи

гипохяориг: Ю M Ю М 10 М 4*10 м

Рнс. 1. Действие гилохлорита на спонтанную активность миометрия крысы. Стрелками обозначены добавляемые последовательно в среду инкубации растворы разной концентрации гипохлорита.

ОЕГСИГОЦИН 10 М

KlKllllllillnii I i

5mm t t t t

гипохяориг. Ii M 10 M 10 М 12*10" М

Прослеживается эффект последействия гипохлорита на спонтанную активность миометрия, который выражается в том, что сбой силы и частоты сокращений мышцы возникает тогда, когда сам гипохлорит уже успевает полностью уйти из камеры, благодаря промыванию проточным физиологическим раствором.

Поскольку, известно, что сократительные ответы миометрия на окситоцин и спонтанная активность обусловливаются поступлением наружного Са2+ по каналам плазматической мембраны в клетку, можно предполагать, что гипохлорит в первую очередь нарушает работу Са2+ каналов, действуя на липидные и белковые компоненты мембраны. В связи с этим было решено исследовать влияние АФК на следующие параметры, характеризующие функциональную активность мышечных клеток: микровязкость мембран, АТРазную активность и активный транспорт Са2+.

2. Действие гипохлорита на микровязкость мембран СР гладких мышц аорты кролика.

Было изучено влияние ОСГ на процесс эксимеризации пирена в СР гладких мышц аорты кролика в интервале температур от 20°С до 40°С. Обнаружено, что обработка мембран СР гладких мышц аорты гипохлоритом в концентрации Ю М приводит к изменению их микровязкости по сравнению с контролем как в области "свободных" липидов, так и в области "анулярных" липидов, причем . микровязкость мембран в наибольшей степени повышается в области "связанных" липидов (анулярный слой) по сравнению со свободными от встроенных белков участками мембран (рис.3,4).

Рис. 2. Действие гипохлорита при пульсовой подаче на окситоцин-индуцированные фазные сокращения полоски мномегрия крысы. Стрелками обозначены добавляемые последовательно в среду инкубации растворы разной концентрации гипохлорита.

1сЯт

30 35 тептгрнурд, С

' хоприь Д1Т4-

гмпсхлвртг

' ппвиврп

Рис. 3. Действие гипохлорита и ДТГ на микровязкость мембран саркоплазматнчсского ретикулума аорты кролика ("свободные" липиды).

Представлены средние данные 5 опытов. По оси ординат: отношение интенсивности

флуоресценции эксимеров

(регистрация при длине волны 480 им) к интенсивности флуоресценции мономеров

(регистрация при длине волны 380 нм).

КЪ»

8.22

8.10

д1г +

тлахлорягт

35 40 _ »,,

теипгрятура, и

Рис. 4. Действие гипохлорита и ДТТ на микровязкость мембран саркоплазматического ретикулума аорты кролика ("связанные" липиды).

Представлены средние данные 5 опытов. По оси ординат: отношение интенсивности

флуоресценции эксимеров

(регистрация при длине волны 480 нм) к интенсивности флуоресценции мономеров

(регистрация при длине волны 380 нм).

Для защиты мембран от окислительного действия АФК нами был использован дитиотреитол (ДТТ), который является не только перехватчиком свободных радикалов, но и обладает способностью восстанавливать окисленные ЗН-группы белков. Предварительная обработка мембран ДТТ оказывала защитное по отношению к гипохлориту действие. Наибольший протекторный эффект ДТТ наблюдали в области "связанных" липидов.

3. Действие гипохлорита на активность Саг* АТРазы СР гладких мышц аорты кролика

Установлено, что действие гипохлорита в концентрации 10"6М на мембраны СР гладких мышц аорты кролика в течение 10 минут вызывало ингибирование АТРазной активности примерно на 22% (рис.5).

Рис. 5. Действие 54О"3А ДТТ на АТРязну] активность СР гладки мышц аорть

обработанного гипохлормтом (10 мин., 25с1 в концентрации 10"*М» К 10ЦМ. По оси ординат Уд|Р - скорость гидролиз АТР (100% - в отсутетин гипохлорита)* по ос абсцисс - время в минутах.

от 10"6М до

ингибирование АТРазной активности усиливалось с 22% до 68%. ДТТ I концентрации 5*10'3М оказывал защитное действие по отношению ингибирующему Са2+ -АТРазную активность СР влиянию ОСГ. При этои наблюдали частичное, а в случае использования гипохлорита I концентрации 1СГ6М - практически полное восстановление АТРазно; активности (до 96%).

4. Действие различных активных форм кислорода на активный транспорт кальция в саркоплазматическом ретикулуме скелетных мышц и СР гладких мышц аорты кролика.

Показано, что гипохлоритв концентрации Ю^М после 10 минутноп воздействия на мембраны оказывает ингибирующий активный транспор Са2+ эффект примерно на 70%, что выражено сильнее, чем действу» гипохлорита на АТРазную активность при аналогичных условия: (ингибирование на 22%). При предварительной обработке препарат; мембран СР гладких мышц аорты ДТТ в концентрации 5*10"31\ интенсивность транспорта Са2+ практически восстанавливалась (рис.6).

Иктоигвггзе» (■/,) 1ва

В9 6« 4В

20

е

гипохлорит 10 М

гипохлорит 10'5 М

-4- гипохлорит Ю"4 м

При увеличении концентрации гипохлорита

Рис. 6. Действие гипохлорита на скорость активного транспорта кальция в саркоплазматическом ретикулуме гладких мышц аорты кролика. По оси ординат: интенсивность флуоресценции в процентах, по оси абсцисс - время в минутах.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что действие гипохлорита направлено не только на липидный, но и на белковый компонент мембран СР.

В связи с тем, что в литературе имеются лишь разрозненные данные об окислительном действии отдельных АФК на мышечные мембраны, нами исследовано влияние гипохлорита, гидропероксида и супероксидного радикала на активный транспорт кальция в СР скелетных мышц и СР гладких мышц аорты кролика. Полученные результаты показывают, что самый сильный окислительный эффект проявляет гипохлорит в концентрации 10'7М после воздействия (рис.7,8). Затем идут супероксидный радикал, образование помощи взаимодействия 0,25 мМ ксантиноксидазы. Установлено, что все

пятиминутного гидропероксид (5*10"5М) и которого индуцировали при ксантина и 0,125 ед/мл три АФК оказывали более

сильное повреждающее действие на мембраны СР скелетных мышц по сравнению с мембранами СР гладких мышц аорты.

1ва ЛСЛ

п

(ЕЛ

контроль гипохлорит

[¿7

ГИДрО- СупгроКСИДНЫИ

перокеид радикал

Рнс. 7. Действие активных форм кислорода (гипохлорита - Ш"ТМ ,гидропероксидя - 5*! 0 М н супероксидного радикала) на активный транспорт кальция в сяркоплазматнческом ретикулине скелетных мышц кролика. Данные выражены в процентах по отношению к контролю (транспорт кальция бе) воздействия АФК). Представлены средние данные 5 опытов.

контроль гипахлорш гидро- гуперожеидньй оерикснд радахал

Рис. 8. Действие активных форм кислорода (гипохлорита - 10ЛМ «гидропероксида - 5"10~М н супероксидного радикала ) на активный транспорт к ял I,пни в саркоплазматическом ретикулуме аорты кролика. Данные выражены в процентах по отношению к контролю (транспорт кальция без воздействия АФК). Представлены средние данные £ опытов.

В целом, полученные данные позволяют заключить, что мишеньк действия АФК могут быть как липидные, так и белковые компоненть мембран. На наш взгляд, наиболее важным при развитии клеточно1 дисфункции является окисление АФК транспортных белков мембран, та| как при этом возникает усиление повреждающего действш окислительной атаки на ионный гомеостаз, приводящее к критическом; переполнению цитозоля пораженной клетки ионами Са2+

5. Влияние тиреоидных гормонов и мелатонина на люминолзависимую хемилюминесценцию, возникающую при активации нейтрофилов.

Во второй части работы изучали антиоксидантные свойстве тиреоидных гормонов и мелатонина. Их действие сравнивали ( действием хорошо изученного антиоксиданта глутатиона.

Показано, что тиреоидные гормоны явились эффективным! тушителями люминолзависимой хемилюминесценции, вызванное активированными нейтрофилами. Наиболее сильным эффектол обладал тироксин в концентрации 10"5М (уровень ХЛ снижался примернс на 67%). Для трийодтиронмна снижение хемилюминесценци1 составляло примерно 44%, для мелатонина около 19%, для глутатиона около 18% (рис.9).

%

108 88 60 40

(Ж

1

1 1 7 к 1

/*у> & / г к ■ -кЦ-

контроль

¡222 грийодтиронин

СИ тироксин

щз шаюнин

ЕШ глутатион

Рис. 9. Влияние трийодгиронння, тироксина, мелатонина и глутатиона в концентрации 10"5М на уровень хемилюминесценцщ вызванной активированными нейтрофилами. Представлены средние данные пяти опытов. По ос и ординат - интенсивность хемилюминесценции в % по отношению к контролю.

При рассмотрении полученных результатов возникает вопрос: чег опосредован такой эффект тиреоидных гормонов и мелатонина? Либ1 это их прямое взаимодействие с активными формами кислорода, пр котором происходит дезактивация АФК, либо это более сложны! механизм влияния ТГ на процесс индукции активных форм кислорода нейтрофильных гранулоцитах.

Для проверки высказанного предположения в следующей сери экспериментов было решено использовать в модельной систем! отдельно взятые активные формы кислорода. Такая постановка опыт исключает влияние ТГ собственно на нейтрофильные гранулоциты

дает возможность сравнить эффект ТГ и мелатонина при действии различных активных форм кислорода.

6. Влияние тиреоидных гормонов и мелатонина на уровень хемилюминесценции, индуцированной отдельными формами свободных радикалов.

В данной части работы люминолзависимую хемилюминесценцию возбуждали отдельными формами свободных радикалов, привносимыми в систему извне: супероксидным радикалом (Ог" ), гидропероксидом (Н202) и гипохлоритом (ОС1-).

Свечение, %

Рис. 10. Действие тироксина, трнйодтнроннна, мелатонина и глутатнона на уровень лммннолза&иснмой хемилюминесценции, вызванной гияохлорнтом. Представлены средние значения 6 опытов. Контроль (100%)-свечение, вызванное взаимодействием гипоыорнта и люминола.

Тироксин Трийодтнроннн Мелатонин Глутатмон

Рис. 11. Действие тироксина, трииодтиронина, мелатонина и глутатнона на уровень люммнолзавненмой хемилюмннесиенцин, вызванной гидропероксидом. Представлены средние значения 6 опытов. Контроль (100%) -свечение, вызванное взаимодействием гндропероксида н люмннола.

Тироксин Трийсширонин Мелатоккм Глутатясн

Свечение. % 1В9У

т

1/7

Рис. 12. Действие тироксина, трнйодтнроннна, мелатонина и глутатнона на уровень люмннолзависимой хемилюминесценции, вызванной супероксидным радикалом. Представлены средние значения 6 опытов. Контроль (100%) - свечение, вызванное взаимодействием супероксидного радикала и люмннола. , - -

Тироксин Трлйодтнроиин Мсивтонмн Гдутатион

Показано, что самыми сильными тушителями свечения были тиреоидные гормоны. Глутатион проявлял самую низкую антиоксидантную активность в присутствии всех активных форм кислорода. У мелатонина наибольшая антиокислительная активность была выражена при взаимодействии с гидропероксидом.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о прямом взаимодействии гормонов с активными формами кислорода.

7. Действие тиреоидных гормонов и мелатонина на активный транспорт Са2* в сарколлазматическом ретикулуме скелетных мышц и гладких мышц аорты кролика.

Полученные данные о наличии антиоксидантных свойств у тиреоидных гормонов и мелатонина позволяют предположить, что эти вещества будут оказывать протекторный эффект на активный транспорт Са2+ в везикулы СР при действии АФК. Для проверки этого предположения необходимо выяснить, каково собственное влияние исследуемых гормонов на активный транспорт Са2+ .

Ахиомий т)жхек«рт

288

(61

ЕйЗЗ контроль УТЛ тироксин

Рис. 13. Действие тироксина, трийодтирокнна и мелатонина на процесс активного транспорта кальция в мембранах

р.;.1 '| Трлйсдтиронин саркоплаэматического

ретнкулума скелетных мышц.

£23 ыематонш Контроль (100%) - опыты 6« добавления тиреоидных

гормонов и мелатонина. По оси ординат - интенсивность активного транспорта кальция в процентах.

Агаохый

1)МСЮ|1 288

Рис. 14 Действие тироксина, трннодтиронина и мелатонина на процесс активного транспорта кальция в мембранах

саркоплазматического Г^п трийодтирошш ретнкулума гладких мышц аорты. Контроль (100%) опыты без добавления тиреоидных гормонов и мелатонина. По оси ординат -интенсивность активного

транспорта кальция в процентах.

КШ контроль У7Л тироксин

1ТТТЗ ыелатонии

Результаты слектрофлуориметрии показали, что тиреоидные

гормоны и мелатонин в концентрации 10' М усиливали вход Са в везикулы саркоплаэматического ретнкулума (рис.13,14).

Содержание этих гормонов в среде в концентрации 10'7М и ниже не оказывало влияния на процесс транспорта Са2+ в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты; при концентрации 10"6М эффект не был значительным.

8. Влияние тиреоидных гормонов и мелатонина на активный транспорт Саг* в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и гладких мышц аорты кролика, подвергающихся свободнорадикальному повреждению.

В данной серии опытов исследовали протекторные свойства ТГ и мелатонина в концентрации 10"7М на везикулах СР скелетных мышц и СР гладких мышц аорты по действию гипохлорита, гидропероксида или супероксидного радикала. При этом внесение гормонов в инкубационную среду осуществляли как за 5 минут до начала действия АФК, так и сразу же после их действия. Установлено, что порядок внесения гормонов и АФК не оказывал влияния на результаты экспериментов и что защитный эффект тиреоидных гормонов и мелатонина был различным для разных активных форм кислорода.

Самую высокую антиоксидантную активность при действии гипохлорита на мембраны СР скелетных мышц проявлял трийодтиронин: происходило восстановление Са2+-транспорта до 30% (рис.15). Более слабым действием обладал тироксин и на последнем месте был мелатонин. Если же в качестве АФК использовали гидропероксид, то наибольший антиоксидантный эффект наблюдали в присутствии мелатонина - восстановление до 10%. При действии супероксидного радикала на везикулы СР скелетных мышц кролика, мелатонин, трийодтиронин и тироксин протекторных свойств в отношении активного транспорта Са не проявляли.

Рис. 15. Защитный эффект тиреоидных гормонов и мелатонина от окислительного действия гипохлорнтя, гидропероксида н сунероксидного радикала на мембраны саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика. По оси ординат: восстановление интенсивности активного транспорта кальция в % при предварительной инкубации мембран СР с тироксином, трниодтнронином или мелатонином и последующим действием активных форм кислорода. Концентрация Т4 п мелатонина - ЮМ

При действии гипохлорита на мембраны СР гладких мышц аорты кролика, трийодтиронин, как и в предыдущем случае, проявлял самую высокую антиоксидантную активность, вызывая восстановление Са2+-транспорта на 20%. Обработка везикул СР гладких мышц аорты кролика тироксином, трийодтиронином или мелатонином практически не вызывала восстановления активного транспорта Са2+ после воздействия гидропероксидом или супероксидным радикалом (рис.16).

Протекторное действие мелатонина и тиреоидных гормонов на процесс активного транспорта Са2+ в СР можно, по-видимому, объяснить электрон-акцепторными свойствами их молекул, которые позволяют - обезвреживать наиболее долгоживущие АФК, такие как гипохлорит и гидропероксид.

Однако, по-видимому, содержание в среде инкубации тироксина, трийодтиронина и мелатонина в концентрации 10"7М оказалось в наших экспериментах недостаточным для проявления протекторных свойств на активный транспорт Са2* везикулами СР при воздействии супероксидного радикала и гидропероксида. Вероятно, окислительное действие этих АФК, в силу их физико-химических свойств, в данном случае направлено на деструкцию белков и липидов СР.

Таким образом, нами установлено, что действие активных форм кислорода изменяет такие параметры везикул саркоплазматического ретикулума, как микровязкость, активный транспорт Са2+, активность Са2+-АТРазы. Эти изменения носят однонаправленный характер, связанный с сильным окислительным эффектом активных форм кислорода на липиды и белки мембран саркоплазматического ретикулума. Тироксин, трийодтиронин и мелатонин in vitro оказывают больший защитный эффект от окислительного действия свободных радикалов, чем глутатион.

%

Гис. 16. Защитный эффект тиреоидных гормонов и мелатонина от окислительного действия гипохлорита, гидропероксида супероксидного радикала на мембраны саркоплатматнческого ретикулума гладких мышц аорты кролика. По оси ординат: восстановление интенсивности активного транспорта кальция в % при предварительной инкубации мембран СР с тироксином, трийодтиронином или мелатонином и последующим действием активных форм кислорода. Концентрация Тз, Т4 и мелатонина -

ю'м

6. выводы

1. Гипохлорит в концентрации 4 * 10"5М вызывает угнетение спонтанной и окситоцин-индуцируемой сократительной активности гладких мышц миометрия крысы.

2. Гипохпорит в концентрации 10'5М повышает микровязкость мембран саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты кролика преимущественно в области "связанных" липидов по сравнению со свободными от встроенных белков участками мембран.

3. Гипохлорит в концентрации Ю^М ингибирует Саг+-АТРазную активность саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты.

4. Гипохлорит в концентрации 10"7М, гидропероксид в концентрации 5*10"5М и супероксидный радикал, генерируемый в ходе ксантиноксидазной реакции (0,25 мМ ксантина и 0,125 ед/мл ксантиноксидазы) вызывают снижение уровня активного транспорта Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме скелетных мышц и в саркоплазматическом ретикулуме гладких мышц аорты.

5. Дитиотреитол в концентрации 5*10'3М оказывает защитный эффект от окислительного действия гипохлорита на Са2+ -АТРазную активность, активный транспорт Са2* и микровязкость мембран саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты.

6.Тиреоидные гормоны и мелатонин обладают более сильной электронакцепторной активностью по отношению к гипохпориту, супероксидному радикалу и гидропероксиду, чем глутатион.

7. Тироксин, трийодтиронин и мелатонин в концентрации 10"5М усиливают активный транспорт Са2+ в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и в мембранах саркоплазматического ретикулума аорты. Наибольший эффект имеет тироксин, наименьший - мелатонин. Гормоны в концентрации 10'7М на активный транспорт Са2+ влияния не оказывают.

8. Тироксин, трийодтиронин и мелатонин в концентрации 10'7М проявляют защитный эффект от окислительного действия гипохлорита и гидропероксид а на мембраны саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и от действия гипохлорита на мембраны саркоплазматического ретикулума гладких мышц аорты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Antipenko A.Ye., Krasovskaya I. Ye., Pechatnicova Ye.V., Dyatlov R.V. Phosphorylation protects aorta sarcoplasmic reticulum calcium transport against oxidative stress.// XV Annual Sceintific Sessions. International Society for Heart Research, American section. June 20 - 24,1993, p.264.

2. Багров Я.Ю., Манусова Н.Б., Можаева М.Г., Острецова И.Б. Антипенко А.Е., Дятлов Р.В. Механизмы эффектов фуросемида нг водную проницаемость мочевого пузыря лягушки и на окситоцин индуцируемые сокращения миометрия крысы.// Физиологически журнал им. Сеченова, 1993, Т.79, №10, р.46-54.

3. Krasovskaya I.Ye., Antipenko A. Ye., Dizhe G.P., Dyatlov R.V., Lislovi L.V., Pechatnicova Ye.V., Lyzlova S.N. Protein phosphorylation and some antioxidants protective action against oxidative damage of sarcoplasmic reticulum membranes of heart and smooth muscles of rabbit aorta./ International symposium September 25 - October 1. Biological Motility Abstracts. Pushino, 1994, p.179.

4. Красовская И.Е., Лызлова Jl. В., Дятлов Р.В., Лызлова С.Н Изменение состояния липидов мембран саркоплазматическогс ретикулума гладкомышечных клеток аорты под влиянием окислительного действия активных форм кислорода.// VI Симпозиум по биохимии липидов, Санкт-Петербург, 1994,стр.50-51.

5. Дятлов Р.В., Лызлова Л. В., Красовская И.Е. Влияние тиреоидны) гормонов на люминолзависимую хемилюминесценцию, вызываемук активными формами кислорода.// Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций. Конференция молоды) физиологов и биохимиков России. Санкт-Петербург, 1995, стр.67.

6. Lizlova L.V., Krasovskaya I. Ye., Dyatlov R.V., Dizhe G.P., Lyzlova S.N Antioxidant action of thyroid hormones.// The 1995 International Co Conference on Environmental Pollution (ICEP'95) and Neuroimmunc Interactions and Environment (ICONE'95). St.Petersburg, Russia, 199£ (17-24 July), p.148.

7. Krasovskaya I.Ye., Lyzlova L. V., Ekhvalova T.V., Antipenko A.Ye., Dizhe G.P., Dyatlov R.V., Lyzlova S.N. Muscle cells membrane proteins protection during free radical attack as a mechanism of adaptation tc hypoxia.// Hypoxia Medical Journal, Moscow, 1996 (april-june), №2, p.40.

8. Dyatlov R.V,, Krasovskaya I, E., Lyzlova L.V., Yekhvalova T.V., Lyzlovs S.N., Anisimov V.N. Antioxidative effect of pineal geroprotectors melatonir and epithalamin.// Gerontological aspects of peptide regulation о organism functions. International symposium november 25-27 1996, p.39 132.

9. Антипенко A.E., Красовская И.Е., Диже Г.П., Лызлова Л.В., Дятлое Р.В., Лызлова С.Н. Влияние окислительного стресса на мембрань саркоплазматического ретикулума гладкомышечных клеток и и> защита с помощью протеинфосфорилирования и антиоксидантов Вестник Санкт-Петербургского университета. 1996, серия 3, вып.4 (№24), стр. 66-73