Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свободнорадикальные процессы и их регуляция в тканях крыс при действии соединений ртути

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Куксенко, Марина Евгеньевна, Краснодар

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201354

7/. Л

і -г і

На правах рукописи

КУКСЕНКО Марина Евгеньевна

Свободнорадикальные процессы и их регуляция в тканях крыс при действии соединений ртути

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Внуков

Ростов-на-Дону 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение................................................................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы......................................................................................................11

1.1. Свободнорадикальные процессы и их регуляция в живых системах..........................................................................................................................................11

1.1.1. Характеристика и пути образования свободных радикалов в живых системах................................................................................................................11

1.1.2. Процессы перекисного окисления липидов и их основные звенья..........................................................................................................................................19

1.1.3. Регуляция свободнорадикальных процессов............................................22

1.2. Ртуть и её производные......................................................................................................30

1.2.1. Общие механизмы токсичности ртути и её производных............33

1.2.2. Современные представления о биохимических и молекулярно-генетических механизмах действия............................35

Глава 2. Материалы и методы исследования....................................................40

2.1. Постанова эксперимента на животных............................................................40

2.2. Получение биологического материала..........................................................43

2.3. Биохимические методы исследования............................................................44

2.3.1. Хемилюминесцентный анализ в системе Н202-люминол . 44

2.3.2. Определение содержания диеновых конъюгатов........................44

2.3.3. Определение малонового диальдегида................................................45

2.3.4. Определение шиффовых оснований......................................................46

2.3.5. Определение содержания пероксинитрита и продуктов

метаболизма оксида азота - нитроглутатиона и

нитротирозина........................................................................................................47

2.3.6. Определение активности супероксиддисмутазы........................48

2.3.7. Определение активности каталазы..........................................................49

2.3.8. Определение оксидазной активности церулоплазмина .... 50

2.3.9. Определение содержания внеэритроцитарного

гемоглобина..............................................................................................................51

2.3.10. Определение суммарной пероксидазной активности..........52

2.3.11. Определение концентрации мочевой кислоты..........................52

2.3.12. Определение содержания мочевины..................................................53

2.3.13. Определение содержания общих липидов в плазме крови, гемолизате эритроцитов и гомогенате тканей печени..............................................................................................................................53

2.3.14. Определение содержания общего белка в гомогенате тканей печени..........................................................................................................53

2.3.15. Определение концентрации общего гемоглобина в гемолизате эритроцитов................................................................................54

2.4.Статистическая обработка результатов исследования....................55

Глава 3. Результаты исследования....................................... 56

3.1. Влияние ацетата ртути на развитие окислительного стресса и

его регуляцию в тканях животных............................... 56

3.1.1. Интенсивность НгОг-люминол-индуцированной хемилюминесценции в тканях крыс при действии ацетата ртути...................................................................... 56

3.1.2. Интенсивность ПОЛ в тканях крыс при действии ацетата ртути.................................................................. 59

3.1.3. Показатели нитрозильного стресса в плазме крови крыс при действии ацетата ртути........................................ 63

3.1.4. Уровень СПА и ВЭГ в тканях животных при действии ацетата ртути........................................................ 65

3.1.5. Активность антиоксидантной системы в тканях животных при действии ацетата ртути........................ 68

3.2. Влияние нитрата метилртути на развитие окислительного

стресса и его регуляцию в тканях животных..................... 78

3.2.1. Интенсивность НгОг-люминол-индуцированной хемилюминесценции в тканях крыс при действии

нитрата метилртути............................................... 78

3.2.2. Интенсивность ПОЛ в тканях крыс при действии нитрата метилртути.......................................................... 81

3.2.3. Показатели нитрозильного стресса в плазме крови крыс при действии нитрата метилртути.............................. 84

3.2.4. Уровень СПА и ВЭГ в тканях животных при действии нитрата метилртути................................................ 86

3.2.5. Активность антиоксидантной системы в тканях животных при действии нитрата метилртути................ 88

Глава 4. Обсуждение результатов......................................... 98

Выводы................................................................................ 123

Предложения для внедрения в практику....................................... 124

Список литературы.................................................................. 125

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

АКМ - активные кислородные метаболиты;

АО - антиоксиданти;

АОЗ - антиоксидантная защита;

АОС - антиоксидантная система;

АФК - активные формы кислорода;

ВЭГ - внеэритроцитарный гемолобин;

ГПО - глутатионпероксидаза;

ГТ - глутатионтрансфераза;

ДК - диеновы конъюгаты;

МДА - малоновый диальдегид;

МК - мочевая кислота;

НЬ - гемоглобин;

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

СОД - супероксиддисмутаза;

СПА - суммарная пероксидазная активность:

СРО - свободнорадикальное окисление;

СРП - свободнорадикальные процессы;

ТБК - тиобарбитуровая кислота;

ХЛ - хемилюминесценция;

ЦП - церулоплазмин;

ШО - шиффовы основания;

ОІЧЮОН - пероксинитрит;

Гл8МЭ - нитроглутатион;

МЭТир - нитротирозин.

ВВЕДЕНИЕ

Применение ртути в различных отраслях деятельности человека является существенным фактором загрязнения экосистем, что оказывает выраженное воздействие на формирование популяционного здоровья населения [Онищенко Г.Г., 2003]. Использование ртутьорганических соединений ограничено или запрещено в ряде стран Европейского Союза [Осипова В.П., 2000; Давыдова С.Л., 2001; Davies В.Е., 1999].

Ртуть относится к первому классу опасности (чрезвычайно опасное химическое вещество), а её соединения обладают присущими только им токсическими свойствами. Основным проявлением токсического эффекта считают образование координационной связи иона ртути с атомами серы, азота, кислорода, входящими в состав молекул, т.е. с тиольными группами и гистидиновыми звеньями белка, гемоглобином, цитохромом Р45о, рецепторами и т.п. [Давыдова C.JL, 1999; Stepanov A.A., 2002; Taylor Т.J., 2007]. В результате происходит повреждение клеточных структур, агглютинация белка, ингибирование ферментов, угнетение метаболической активности [Пенькова Г.А., 2012; Hare M.F., 1992].

Органические соединения ртути обладают в целом большим токсическим действием, чем соответствующие неорганические соли [ВОЗ, 2012]. Причиной большей токсичности этих соединений по сравнению с неорганическими солями является наличие в молекуле липофильных органических групп. Этим обеспечивается их высокая степень всасывания в желудочно-кишечном тракте, распространение с током жидкости по всему организму и перенос через мембраны клеток за счет диффузии. Органические производные способны накапливаться в клетках, имеют больший период биологического полураспада. Наиболее токсичными производными ртути являются алкилпроизводные, имеющие короткую углеродную цепь, так как

медленно разлагаются и медленно выводятся из организма [Deacon G.B., 2002].

Последние десятилетия привели исследователей к осознанию необходимости выделения в самостоятельную группу экотоксикантов -металлоорганических соединений тяжелых металлов [Deacon G.B., 2002]. Ряд авторов показывают, что металлоорганические соединения обладают ещё большим повреждающим действием по сравнению с органическими производными [Кирилова Л.Б., 2001; ООН (ЮНЕП), 2011]. Их отличительной особенностью является то, что ионы металла ковалентно связаны непосредственно с атомами углерода, и их токсичность усугубляется протекающей реакцией дезалкилирования в организме, в результате чего происходит разрыв связи «металл-углерод», и это приводит к образованию свободных радикалов [Давыдова C.JL, 2001].

Несмотря на то, что известно большое количество эффектов, вызываемых ртутью и её соединениями, в доступной литературе нет достаточных сведений о действии органических солей и металлоорганических производных на процессы свободнорадикального окисления и его регуляцию в целом.

В связи с этим является актуальным исследование проявлений влияния органических и металлоорганических производных ртути в концентрациях, не вызывающих и вызывающих клинические признаки отравления ртутью.

Основная часть работ посвящена анализу дисбаланса функционирования ферментных систем и показателей метаболизма in vitro, реже - in vivo, причем основной путь введения исследуемых веществ -внутрибрюшинный. Практически отсутствуют экспериментальные работы, посвященные исследованию токсического действия соединений ртути при энтеральном пути поступления.

В соответствии с этим исследование действия соединений ртути на процессы свободнорадикального окисления и его регуляции является актуальным, а неизученные вопросы являются задачами, объединенными общей целью исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование влияние органического и металлоорганического производных ртути на свободнорадикальные процессы и их антиоксидантную регуляцию в эксперименте.

В соответствии с поставленной целью были определены и решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние соединений ртути на интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) по параметрам хемилюминесценции и содержанию молекулярных продуктов ПОЛ в тканях животных.

2. Выявить изменение показателей нитрозильного стресса в крови животных под влиянием органического и металлоорганического производных ртути.

3. Исследовать влияние соединений ртути на стабильность и структурное состояние мембран эритроцитов по уровню внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и других форменных элементов крови и клеток печени по уровню суммарной пероксидазной активности (СПА).

4. Определить состояние антиоксидантной системы по активности ферментативных и содержанию неферментативных антиоксидантов в тканях животных при действии производных ртути.

5. Сравнить действие органической соли и металлоорганического производного ртути на процессы свободнорадикального окисления и его регуляцию.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное систематическое исследование in vivo влияния органической соли и металлоорганического производного ртути на свободнорадикальные процессы и их регуляцию в крови и печени лабораторных животных (крыс).

Впервые обнаружено развитие нитрозильного стресса при действии соединений ртути, что подтверждается увеличением продукции пероксинитрита и его производных в плазме крови лабораторных животных.

Впервые показано нарушение стабильности мембран клеток исследованных тканей, что подтверждено возрастанием уровня суммарной пероксидазной активности и внеэритроцитарного гемоглобина.

При действии металлоорганического производного ртути впервые показаны более резкие изменения свободнорадикальных процессов и нарушение их антиоксидантной регуляции в крови и ткани печени по сравнению с действием органической соли ртути.

Впервые выявлено, что концентрация ртутьорганических производных, не вызывающая признаки ртутного отравления (атаксию, анорексию), достоверно приводит к выраженным изменениям свободнорадикальных процессов и их регуляции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования данные подтверждают имеющиеся сведения об общей направленности токсического действия органических производных ртути.

Показано участие всех исследованных звеньев свободнорадикальных процессов на действие ртутьорганических производных (ацетата ртути и нитрата метилртути).

Определены основные сходства и различия в действии органической соли и металлоорганического производного ртути на СРП и их антиоксидантную регуляцию.

Получено экспериментальное подтверждение влияния органических производных ртути в концентрациях, не вызывающих симптомы ртутного отравления, на свободнорадикальные процессы и их антиоксидантную регуляцию.

Проведённые исследования способствовали установлению степени воздействия производных ртути на процессы свободнорадикального окисления и его антиоксидантную регуляцию в исследованных тканях. Это может позволить экстраполировать полученные данные на организм человека.

Продемонстрировано участие органического и металлоорганического производных ртути в процессах свободнорадикального окисления и их регуляции. Следствием этого является развитие оксидативно-нитрозильного стресса, приводящее к нарушению структурно-функционального состояния мембран клеток исследованных тканей, ингибированию ферментов антиоксидантной защиты, что лежит в основе развития как обратимых, так и необратимых патобиохимических процессов в организме животных.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы для организации медико-биологического мониторинга контингента лиц, связанных с производством или использованием производных ртути, а также для ранней верификации, профилактики и лечения отравлений органическими производными ртути.

Основные положения, выносимые на защиту.

Действие как органического, так и металлоорганического производного ртути сопровождается усилением свободнорадикальных процессов и повышением образования продуктов перекисного окисления липидов в крови и ткани печени животных.

В крови крыс при действии как органического, так и металлоорганического производного ртути наблюдается индукция процессов нитрозильного стресса.

^ У животных при действии как органического, так и металлоорганического производного ртути выявлено нарушение стабильности и структурного состояния мембран эритроцитов и клеток печени.

^ В исследованных тканях животных действие как органического, так и металлоорганического производных ртути приводит к разнонаправленному изменению активности ферментов антиоксидантной защиты и снижению содержания низкомолекулярных антиоксидантов.

^ Металлоорганическое производное ртути, в сравнении с органическим, приводит к более выраженным изменениям СРП и нарушению их регуляции. Выявлено, что концентрация производных ртути, не вызывающая признаки ртутного отравления, достоверно приводит к выраженным изменениям свободнорадикальных процессов и нарушению их регуляции.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Свободнорадикальные процессы и их регуляция в живых системах

Известно, что свободнорадикальные процессы (СРП) являются универсальными и имеют место во всех биологических объектах от одноклеточных до высокоорганизованных многоклеточных организмов. Эти процессы протекают постоянно и поддерживаются на стационарном уровне благодаря наличию в организме антиоксидантных систем (АОС) [АшаБЙн У.С., 2004]. При нарушении в системе регуляции происходит активация свободнорадикального окисления (СРО), в результате которого развиваются различные патологические процессы. Исследование СРП и их регуляции является неотъемлемой частью изучения реакций организма на действие различных веществ, поступающих в живые организмы из окружающей среды. В связи с задачами настоящей работы, в первом разделе обзора литературы, освещается современный взгляд на СРП и их регуляцию.

1.1.1. Характеристика и пути образования свободных радикалов в живых системах

Значительный вклад в СРО вносят активированные кислородные метаболиты (АКМ) - свободнорадикальные формы соединений кислорода, образующиеся в результате одно-, двух-, трёх- электронного восстановления кислорода, которые обладают разнообразным спектром физиологических и патологических эффектов [Ланкин В.З., 2001].

Общие закономерности образования и характерные свойства АКМ вытекают из физико-химических особенностей кислорода. Так, если молекула присоединяет дополнительно поочерёдно по одному электрону, образуются высоко реакционноспособные активные формы кислорода: 1. образование супероксид анион-радикала 02+

2. образование пероксида водорода 02'~ + \е + 2Н+ Н202

3. образование свободного гидроксильного радикала 02'"+Н202^'0Н+0Н"

4. образование синглетного кислорода Н202 + ог !о2 + 'ОН + ОН"

Кислород в синглетном состоянии (*02) характеризуется тем, что спин одного электрона, находящегося на внешней орбитали одного из атомов, обращается, в результате чего разрывается одна из двух связей в м