Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы при оксидативном стрессе различной этиологии

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы при оксидативном стрессе различной этиологии"

На правах рукописи

Искусных Игорь Юрьевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ ОКСИДАТИВНОМ СТРЕССЕ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ

Специальность 03.01.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Воронеж - 2012

005044080

005044080

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии

Цветикова Любовь Николаевна

кандидат биологических наук, НИИ экспериментальной биологии и медицины "Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко", старший научный сотрудник

Ведущая организация Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии»

Защита состоится 28 мая 2012 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разослан 26 апреля 2012 года.

Ученый секретарь ,

диссертационного совета Грабович М.Ю.

доктор биологических наук u

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Окислительный стресс или некомпенсированное образование в клетке активных форм кислорода (АФК), является причиной систематического повреждения ДНК, белков и липидов, что может приводить к клеточной смерти и лежит в основе ряда патологических состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, токсическое поражение печени и сахарный диабет, относящихся к свободнорадикальным патологиям. В ответ на интенсификацию свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки. Глутатионредуктазная/ глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма (Владимиров Ю.А., 1972), поддерживающей на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикальных процессов (Владимиров Ю.А., 1972, Kowaltowski A.J., Шишкина Л.Н., 2000). Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детокснкация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Fe2+ (Осипов А.Н., 1990, Skulachev V.P., 1997). Учитывая то обстоятельство, что большинство известных патологических состояний сопровождаются усилением СО (Ланкин В.З., 2001, Bakker S.J., 2000, Kowaltowski A.J., 1999) биосубстратов и изменением активности АОС, весьма актуальной проблемой представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и выбора тактики лечения заболеваний.

Установлено, что при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, может изменяться гормональный статус организма, в связи с чем, индукция оксидативного стресса может иметь опосредованный нейрогуморальный характер. Клеточные культуры являются удобной модельной системой для исследования оксидативного стресса, поскольку их использование позволяет исключить многие неспецифические факторы, сопровождающие индукцию оксидативного стресса. В этой связи, изучение экспрессии ГП и ГР на клеточных культурах in vitro при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода, является также актуальной задачей.

В настоящее время в литературе имеются данные относительно изменения функционирования некоторых звеньев антиоксидантной системы в тканях животных и человека (Gutterer J.M., 1999, Madamanchi N.R., 1992, Krauth-Siegel R.L., 1982) в условиях патологии. Однако имеющиеся сведения носят часто разрозненный, противоречивый и несистематизированный характер. Вместе с тем, представляет интерес выявление общих закономерностей и особенностей функционирования ГП/ГР АОС при оксидативном стрессе различной этиологии, в частности, вызванным развитием патологических состояний - адреналинового миокардита, токсического гепатита, сахарного диабета 2 типа (СД 2), а также индуцируемым АФК в клеточных культурах. Использование различных модельных систем позволяет

выявить важнейшие молекулярные механизмы регуляции глутатионовой АОС с одной стороны, а также ее специфические особенности - с другой.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование экспрессии ГР и ГП в тканях крыс в условиях оксидативного стресса, вызванного индукцией свободнорадикальных патологий: адреналинового миокардита, токсического поражения печени, сахарного диабета 2 типа, а также воздействием пероксида водорода на клеточные культуры фибробластов. В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1 .Корреляционный анализ активностей ГР, ГП и интенсивности свободно-радикальных процессов в тканях крыс при адреналиновом миокардите, экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ) и СД2.

2,Оценка уровня экспрессии ГП, ГР и Г6ФДГ в тканях крыс при адреналиновом миокардите, ЭТГ и СД2.

3. Исследование влияния пероксида водорода на метаболическую активность, особенности пролиферации и клеточную гибель фибробластов мыши линии Ь929

4.Исследование уровня экспрессии ГП и ГР в фибробластах линии 1^929 при воздействии пероксида водорода.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование экспрессионной регуляции ГР, ГП и Г6ФДГ при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, а также индукции апоптотических процессов в клеточных культурах. Выявлены особенности экспрессии данных ферментов и проведен сравнительный анализ активности ГР/ГП-системы при оксидативном стрессе, вызванном адреналиновым миокардитом, ЭТГ, СД2. Осуществлен компьютерный дизайн олигонуклеотидов для определения уровня экспрессии генов ГП, ГР и Г6ФДГ. Установлено, что пероксид водорода подавляет метаболическую активность клеток и индуцирует апоптоз фибробластов линии Ь929, что сопровождается повышением степени экспрессии ГР и ГП.

Полученные данные представляют интерес с точки зрения регуляции образования АФК за счет изменений активностей ГР и ГП, взаимосвязанных с модификацией их экспрессии. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК с помощью ключевых ферментов глутатионовой антиоксидантной системы при развитии свободнорадикальных патологий.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Фармобразование-2010» (Воронеж, 2010), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» Томск, 2010), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (УФА, 2010), на международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на школе-конференции «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (Москва, 2010), на конференции

«Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных проблем и прикладных научных задач», (Москва, 2010).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 13 публикациях - в 3 статьях и 10 тезисах. На защиту выносятся следующие положения:

1. В условиях оксидативного стресса, вызванного развитием адреналинового миокардита, выявлена корреляционная зависимость уровня ДК, параметров БХЛ, отражающих скорость свободнорадикальных процессов, и активностей ГП и ГР в сердце крыс, возрастающих за счет индукции синтеза ферментов de novo.

2. При токсическом поражении печени крыс интенсификация свободнорадикального окисления биосубстратов коррелирует с возрастанием активностей ГП и ГР, что сопряжено с увеличением уровня их экспрессии.

3. Развитие СД2 сопровождается интенсификацией свободнорадикальных процессов, что коррелирует с активацией ГП/ГР- системы. Однако в условиях данной патологии происходит индукция синтеза ГР и снижение уровня экспрессии ГП.

4. Воздействие пероксида водорода на фибробласты линии L929 приводит к снижению их метаболической активности, пикнозу и кариорексису, являющимися признаками апоптоза, развивающегося в клеточной культуре, и возрастанию степени экспрессии ГП и ГР.

5. Предложена схема процессов регуляции экспрессии ГП и ГР и их участия в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе различной этиологии.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 180 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы. Иллюстративный материал включает 59 рисунков и 25 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали взрослых лабораторных белых крыс (Rattus norvégiens L.), самцов, массой 150 — 200 г, содержащихся на стандартном рационе питания в виварии. Исследования проводились также на линиях клеток из коллекции клеточных культур Института Биофизики Клетки РАН: NCTC clone L929 - фибробласты, полученные из клеток подкожной соединительной ткани мышей СЗН/An (Flow Laboratories, Великобритания, J.Nat. Cancer Inst. 1948,9, 229);

Адреналиновый миокардит у крыс моделировали введением 0,1% раствора адреналина в дозе 0,15 мл на 100 г массы тела (Непомнящих Л.М., 2002). Контрольным животным вводили соответствующую аликвоту физиологического раствора.

Моделирование экспериментального токсического гепатита

осуществляли пероральным введением 33% раствора СС14 в вазелиновом масле из расчета 64 мкл CCL, на 100 г веса животного (Федорова Н.Ю., 1999).

Сахарный диабет индуцировали внутримышечным введением протамин-сульфата в течение 3-х недель в дозе 10 мг/кг массы тела животного в объеме 0,5 мл 0,9% NaCl, 3 раза в сутки (Ульянов A.M., 2000).

Определение диеновых конъюгатов (ДК) осуществляли на спектрофотометре Hitachi U1900 при 233 нм (Стальная И.Д., 1997).

Интенсивность свободнорадикальных процессов определяли методом индуцированной пероксидом водорода с сульфатом железа биохемилюминесценции (БХЛ) на биохемшноминометре БХЛ-007 с программным обеспечением.

Определение активности ферментов ГР, ГП и ГбФДГ осуществляли на спектрофотометре Hitachi U1900 при 340 нм. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25°С.

Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry, 1951)

Экстракцию тотальной РНК осуществляли с использованием тризолового метода.

Электрофорез РНК и ДНК проводили в агарозном геле. Для окрашивания использовали бромистый этидий.

Обратную транскрипцию осуществляли на матрице выделенной РНК со случайными гексапраймерами.

ПЦР-амплификацию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проводили на приборе АНК-32. В ходе эксперимента использовали набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR Green I.

Определение относительного уровня экспрессии генов осуществляли с применением сравнительного метода пороговых циклов и программного обеспечения «REST 2008» (Pfaffl M.W., 2002).

Оценку метаболической активности клеток проводили на основании МТТ-теста, основанного на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриаль-ными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток.

Исследование жизнеспособности фибробластов L929, культивируемых в присутствии пероксида водорода, проводили на микроскопе Axiovert 200 (Цейсс, Германия). Для проведения анализа использовали набор L-7007 LIVE/DEAD Вас Light Bacterial Viability Kit (Invitrogen, США).

Для оценки интенсивности апоптоза и анализа изменения ядерной морфологии клетки окрашивали красителем Hoechst (1 мкМ). Препараты просматривали во флуоресцентном микроскопе Axiovert 200 Цейсс.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 7-8-х кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. Результаты опытов

сравнивали с контролем. В таблице и на рисунках приводятся средние арифметические значения активностей фермента и их стандартные ошибки. Полученные данные обрабатывали с использованием ^критерия Стьюдента, обсуждаются статистически достоверные результаты при р<0,05 (Ллойд, Ледерман, 1990).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность: научному руководителю диссертации д.б.н., проф. Т.Н. Поповой и коллективу лаборатории роста клеток и тканей Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН: д.м.н., проф. Б.К. Гаврилюку, асп. А.Л. Попову, к.ф-м.н. И.И. Селезневой, к.ф-м.н. Г.А. Давыдовой за предоставление возможности работы с культурами фибробластов.

ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И

ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В СЕРДЦЕ КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ АДРЕНАЛИНОВОГО МИОКАРДИТА

Интенсивность патологического процесса в сердце при введении адреналина оценивали с помощью активностей АсАТ и сердечной изоформы креатинкиназы (КК-МВ) в сыворотке крови. Активность КК-МВ и АсАТ, являющихся маркерными ферментами повреждения миокарда, возрастала при адреналиновом миокардите в 7,2 и 2,6 раза соответственно по сравнению с контролем. Наблюдающиеся изменения активностей ферментов, являющихся критериями выраженности процессов цитолиза в тканях сердца (АсАТ, КК-МВ), свидетельствуют о нарушении функционирования данных органов при патологии.

Динамика свободнорадикального окисления и состояние ГР/ГП антиоксидантной системы были исследованы в ткани сердца крыс в течение 36 часов после индукции адреналинового миокардита. В результате проведенных исследований нами было установлено, что при развитии патологии сердечной мышцы происходит увеличение содержания ДК уже через 12 часов после введения адреналина в 3,6 раза. Максимальный уровень ДК, превышающий контрольное значение в 3,7 раза, наблюдался спустя 24 часа после введения данного гормона. На 30-м и 36-м часу развития адреналинового миокардита уровень ДК был повышенным в 3,6 раза относительно контроля. Полученные данные свидетельствуют об активации процессов ПОЛ и накоплении продуктов липопероксидации в ткани сердца животных, подвергнутых экспериментальному адреналиновому миокардиту.

Показано также, что светосумма хемилюминесценции (8) и интенсивность максимальной вспышки (1тах), отражающие интенсивность СО, значительно возрастали, достигая максимума через 24 часа после индукции патологии. 8 увеличивалась в 1,7 раз, по сравнению с контролем. Значение 1шах возрастало в сердце в 3,9 раза относительно уровня контрольных значений. Через 24 часа после индукции патологии сердца наблюдалось

повышение величины тангенса угла наклона кинетической кривой (tgcb), характеризующего общую антиоксидантную активность, в 3,3 раза по сравнению с нормой. Это позволяет заключить, что в условиях патологии начинают действовать компенсаторные механизмы, направленные на снижение уровня СО в клетке.

Исследование изменения активности ГП в ходе развития адреналинового миокардита показало, что максимальная активность наблюдается через 24 часа после введения адреналина. При этом активность в расчете на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались соответственно в 1,5 и 1,4 раза.

Максимальный уровень ГР в сердце крыс при адреналиновом миокардите был зарегистрирован через 24ч после индукции патологии. Активность на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались в 1,9 и 1,8 раза соответственно. На 30-м и 36-м часу развития адреналинового миокардита удельная активность ГР была повышена в 1,5 и 1,4 раза соответственно. Полученные результаты отражают увеличение антиоксидантного потенциала в сердце крыс на данных этапах развития адреналинового миокардита. По-видимому, наблюдаемые изменения активностей ГП и ГР, являющиеся защитной реакцией организма на интенсификацию СО биосубстратов при развитии адреналинового миокардита, могут быть как результатом их активации, так и стимуляции синтеза. Таким образом, очевидно, существует взаимосвязь между интенсивностью свободнорадикальных процессов и активностями ГР и ГП в кардиомиоцитах крысы. Согласно полученным результатам, в сердце при индуцированном адреналином миокардите наблюдается также увеличение активности Г6ФДГ. Так, активность Г6ФДГ в сердце, выраженная в количестве Е на грамм сырой массы и в виде удельной активности, увеличивается в 2,2 и 2,8 раза соответственно. Очевидно, активация Г6ФДГ, наблюдаемая при патологии, может иметь значение для работы ГР/ГП АОС, использующей НАДФН для восстановления глутатиона.

Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Imax и S имеют значения 0,9, 0,8, 0,6. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, Imax, S и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно.

Было проведено исследование экспрессии ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите у крыс. Для определения уровня экспрессии гена ГР из сердца крыс на 24ч развития адреналинового миокардита была экстрагирована тотальная РНК. Электрофореграмма выделенной РНК свидетельствует, что количество 28S рРНК значительно преобладает над 18S рРНК. Это позволяет сделать заключение об отсутствии деградации полученной РНК под действием рибонуклеаз. После проведения реакции обратной транскрипции были оптимизированы временные и температурные характеристики ПЦР-РВ и подобрана концентрация праймеров для обеспечения высокой эффективности амплификации. Анализ экспрессии гена ГР с учетом эффективности ПЦР позволил установить, что через 24 часа после индукции

патологии уровень этих транскриптов увеличивается. Экспрессия ГР возрастала в 2,8 раза относительно нормы (рис. 1). s а б в

§ *S 1 : -

§ I i---------------------------------у-—— I _ _____

I:.......Т Й i '-"-g

..... 2 i............................................... SH . : $ S •

........ Л eaui;

>12 12 12

Рис. 1 Уровень транскриптов генов глутатионредуктазы (а), глутатионпероксидазы (б) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) в сердце крыс контрольной группы (1) и на 24 час развития адреналинового миокардита (2), рассчитанный с помощью программного обеспечения Rest 2008

Оценка уровня экспрессии с гена глутатионпероксидазы в норме и при патологии осуществлялась с помощью программы «REST 2008». Расчет разницы экспрессии с учетом пороговых циклов для генов "домашнего хозяйства" и значений эффективности амплификации показал, что при адреналиновом миокардите происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГП в сердце крыс в 7,3 раза относительно нормы (рис. I). Установлено, что экспрессия Г6ФДГ в сердце крыс при адреналиновом миокардите возрастала в 5,9 по сравнению с контролем (рис.1). Регенерация GSH в ходе ГР-реакции осуществляется при постоянном притоке в систему восстановительных эквивалентов, основными поставщиками которых в клетке являются дегидрогеназы пентозофосфатного пути. Поэтому, очевидно, развитие адреналинового миокардита сопровождалось индукцией Г6ФДГ, поставляющей НАДФН для функционирования глутатионовой АОС (Попова Т.Н., 2009).

ГЛАВА 4. ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ КРЫС

Для оценки состояния клеток печени при развитии экспериментального токсического гепатита было проведено измерение активности АлАТ и АсАТ в сыворотке крови животных. При токсическом поражении печени под действием CCl,t происходит увеличение активности АлАТ и АсАТ в сыворотке крови подопытных животных. Так, активность АлАТ на 4-е сутки развития ЭТГ увеличивалась в 7,7 раза, а активность АсАТ - в 4,9 раза по сравнению с группой контрольных животных. Это свидетельствует о развитии цитолитического синдрома, так как эти ферменты являются маркерами степени поражения ткани печени при токсическом гепатите.

Уровень евободнорадикального окисления и состояние ГР/ГП антиоксидантной системы были исследованы в ткани печени крыс в течение 125ч развития ЭТГ. Было установлено, что максимальный уровень ДК, превышающий контрольное значение в 1,8 раза, наблюдался спустя 96 часов после введения токсического агента. Полученные данные свидетельствуют об активации процессов ПОЛ и накоплении продуктов липопероксидации в ткани печени животных, подвергнутых ЭТГ.

Показано также, что светосумма хемилюминесценции (8) и интенсивность максимальной вспышки (1шах), отражающие интенсивность СО, значительно возрастали, достигая максимума через 96 часов после индукции патологии. Б увеличивалась в 2,7 раз, по сравнению с контролем. Значение 1шах возрастало в сердце в 2,0 раза относительно уровня контрольных значений. Через 96ч после индукции патологии печени наблюдалось повышение величины тангенса угла наклона кинетической кривой (^а2), характеризующего общую антиоксидантную активность, в 2,3 раза по сравнению с нормой. Это позволяет заключить, что в условиях патологии начинают действовать компенсаторные механизмы, направленные на снижение уровня СО в клетке.

Исследование изменения активности ГП в ходе развития ЭТГ показало, что максимальная активность наблюдается через 96 часов после введения тетрахлорметана. При этом активность в расчете на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались соответственно в 4,6 и 2,5 раза. Максимальный уровень ГР в сердце крыс при ЭТГ был зарегистрирован также через 96ч после индукции патологии. Активность на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались в 1,5 и 2,1 раза соответственно. Установлено, что на 96ч развития ЭТГ происходит увеличение удельной активности Г6ФДГ в печени крыс в 1,7 раза, относительно контроля. Индукция ЭТГ сопровождается также увеличением активности Г6ФДГ в печени, выраженной в количестве Е на грамм сырой массы, в 1,8 раза по сравнению с контролем.

Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, 1тах, Б имеют значения 0,5, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией диеновых конъюгатов, 1тах, Б и активностью ГП: 0,9, 0,9, 0,9 соответственно. Это свидетельствует, что интенсивность СО взаимосвязана с активностью ГР/ГП системы. Увеличение интенсивности процессов пероксидации липидов приводило, вероятно, к увеличению нагрузки на ГР/ГП-систему, основным субстратом которой являются липопероксиды. Однако механизм, благодаря которому происходит активация ГП и ГР при интенсификации СО остается не вполне ясным. В связи с этим, было проведено исследование экспрессии ГР/ГП системы при ЭТГ у крыс.

Расчет разницы экспрессии с учетом порогового цикла для референсных генов и значений эффективности амплификации показал, что при ЭТГ происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР в печени крыс в 3,0 раза

относительно нормы (рис.2). С применением ПЦР-РВ выявлено также увеличение степени экспрессии ГП при ЭТГ (рис.2).

в

Рис.2 Уровень транскриптов генов глутатионредуктазы (а), глутатионпероксидазы (б) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) в печени крыс в норме (1) на 96 час развития ЭТГ (2), рассчитанный с помощью программного

обеспечения Rest 2008

Относительная концентрация транскриптов ГП возрастала в 2,5 раза относительно контрольных значений (рис.2). Установлено, что экспрессия Г6ФДГ в печени крыс при ЭТГ увеличивается в 5,9 раз (рис.2). Увеличение экспрессии Г6ФДГ при ЭТГ, вероятно, связано с интенсивным потреблением глутатионовой АОС восстановительных эквивалентов в форме НАДФН и способствует регенерации восстановленного глутагиона (Попова Т.Н., 2008).

ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА

Для наших исследований была выбрана модель сахарного диабета, основанная на введении протамин-сульфата (Ульянов A.M., 2000). В данной модели при связывании протамин-сульфатом эндогенного гепарина у здоровых крыс развивается состояние резистентности по отношению к гипогликемическому действию как эндогенного, так и экзогенного инсулина. Развитие сахарного диабета контролировали с помощью определения концентрации глюкозы в крови и моче в течение 3-х недель развития СД2. Показано, что на 2-ю неделю развития СД2 концентрация глюкозы в крови превышала нормальные значения.

Активность пероксидного окисления липидов определяли по накоплению молекулярных продуктов ДК в печени крыс в течение 3-х недель развития СД2. Печень является интегральным органом, выполняющим регуляторно-гомеостатическую функцию в организме, регулирующим обмен углеводов, белков, липидов, пигментов, витаминов и минеральных веществ. При СД2 в печени происходят различные патогенетические процессы, приводящие к

изменению регуляторных и биосинтетичеких свойств гепатоцитов. В результате проведенных исследований нами было установлено, что на 7-е и 14-е сутки развития СД2 уровень ДК существенно не отличался от контроля. Полученные данные свидетельствуют, что к 3-й неделе развития СД2 происходит активация процессов ПОЛ и накопление продуктов липопероксидации в ткани печени животных, подвергнутых воздействию протамин-сульфата. В условиях гипергликемии свободные радикалы также образуются в процессе аутоокисления глюкозы в ходе формирования конечных продуктов гликознлирования, которые, в свою очередь, также участвуют в патогенезе ангиопатий, способствуют нарастанию ишемии и интенсификации свободнорадикальных процессов в тканях при СД.

Известно, что важным фактором в патогенезе осложнений сахарного диабета является окислительный стресс (Балаболкин М.И., 2002). В этой связи для определения интенсивности свободнорадикальных процессов и общей антиоксидантной активности при СД2 был применен метод биохемилюминесценции (БХЛ). Через 7 суток после индукции СД2 достоверных изменений параметров БХЛ не наблюдалось. Однако к 21 суткам происходило выраженное увеличение светосуммы хемилюминесценции (Б) и интенсивности максимальной вспышки (1тах), отражающих интенсивность СО. Б увеличивалась в 3 раза по сравнению с контролем. Значение 1шах возрастало в печени в 1,6 раза относительно уровня контрольных значений. Происходило повышение величины тангенса угла наклона кинетической кривой характеризующего общую антиоксидантную активность, в

2,1раза по сравнению с нормой. Это позволяет заключить, что в условиях патологии начинают действовать компенсаторные механизмы, направленные на снижение уровня СО биосубстратов в клетке.

Максимальный уровень ГР в печени крыс при СД2 был зарегистрирован на 21-е сутки после начала индукции патологии. Активность на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались в 1,7 и 2,2 раза соответственно. Исследование изменений активности ГП в ходе развития СД2 показало, что максимальная активность наблюдается также на 21 сутки после индукции патологии. При этом активность в расчете на грамм сырой массы и удельная активность увеличивались соответственно в 2,4 и 2,6 раза. По-видимому, наблюдаемые изменения активностей ГП и ГР, являются защитной реакцией организма на интенсификацию СО биосубстратов при развитии СД2.

Было проведено также изучение изменений каталитической активности Г6ФДГ в контрольных условиях и при СД2. Удельная активность Г6ФДГ в печени крыс с СД2 падала в 1,3 раза. Активность, выраженная в виде Е/г сырой массы, уменьшалась в 1,6 раза. Известно, что при СД снижена интенсивность функционирования пентозофосфатного пути. Причинами снижения, как предполагают, являются подавление синтеза глюкокиназы и индукция глюкозо-6-фосфатазы в печени, вследствие чего уменьшается доступность глюкозо-6-фосфата для Г6ФДГ. Кроме того, Г6ФДГ индуцируется инсулином и кортикостероидами (Попова Т.Н., 2009), таким образом, в условиях

инсулинорезистентности, характерной для СД2, экспрессия Г6ФДГ, по-видимому, должна быть снижена.

Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, Irnax, S имеют значения 0,9, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, lmax, S и активностью ГП: 0,9, 0,8, 0,9 соответственно. Рассчитанные коэффициенты корреляции показывают, что интенсивность СО биосубстратов и активность ГР/ГП системы взаимозависимы.

Установлено, что на 21 сутки развития патологии уровень транскриптов ГР увеличивается в 1,8 раза относительно нормы (рис.3). Выявлено, что при СД 2 типа наблюдается пониженный уровень мРНК ГП. Показано, что экспрессия гена ГП снижается в 1,9 раза на 21 сутки СД2 по сравнению с нормой (рис. 3). Можно предположить, что уменьшение экспрессии ГП сопряжено с уменьшением резистентности клеток к инсулину. Показано, что у мышей с гиперэкспрессией ГП наблюдалось развитие гипергликемии и увеличение резистентности к инсулину (McClung J.Р., 2004). Взаимосвязь изменения уровня селена и селенсодержащих белков с инсулиновой резистентностью описана в ряде работ (Lei X.G., 2005, Stapleton S.R., 2000). Уменьшение уровня экспрессии ГП, очевидно, связано с особенностями метаболизма при СД2. По-видимому, увеличение активности ГП может происходить не за счет синтеза de novo, а с помощью других механизмов. Возможно, это связано с конформационными перестройками в молекуле белка, вследствие фосфорилирования/дефосфорилирования. Это согласуется с данными, свидетельствующими об изменении кинетических параметров и регуляторных свойств фермента при оксидативном стрессе, развивающимся, в частности, при токсическом поражении печени (В.Г. Артюхов, 2008).

а б в

Рис. 3. Уровень транскриптов генов глутатионредуктазы (а), глутатионпероксидазы (б) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) в печени крыс контрольной группы (1) и на 21 день развития СД2 (2), рассчитанный с помощью программного обеспечения Rest 2008

Оценка экспрессии гена Г6ФДГ в образцах печени крыс при сахарном диабете показала, что содержание мРНК Г6ФДГ при патологии снижалось в 2,5 раза относительно нормы (рис.3).

ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ, МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ

ЛИНИИ Е929

Методом дифференцированного флуоресцентного окрашивания живых и мертвых клеток было подтверждено наличие токсического эффекта пероксида водорода на фибробласты Ь929. Микрофотографии клеток, подвергнутых воздействию пероксида водорода в 50мкМ концентрации, представлены на рис. 4. Установлено, что пероксид водорода воздействуя на клетки линии Ь929, приводит к пикнозу и кариорексису, являющимися признаками апоптоза.

Нельзя исключить, что пероксид водорода проникает в клетки и, вступая в реакцию Фентона, приводит к интенсификации свободнорадикальных процессов. Оксидативный стресс, в свою очередь, способствует выходу цитохрома С из кристы митохондрий, который индуцирует запуск каскада реакций, ведущих к аггоптозу, сопровождающегося фрагментацией и сморщиванием клеточных ядер.

ПГ -Л • : . . ■ : .

и

Рис.4 Клетки линии 1.929 при инкубации с пероксидом водорода в концентрации 50мкМ: флуоресцентное окрашивание 8УТО 9 (1- контроль,2 - клетки, обработанные пероксидом водорода) и иодидом пропидия (3- контроль,4 - клетки, обработанные пероксидом водорода)

Анализ результатов МТТ-теста позволил установить уменьшение активности фибробластов при оксидативном стрессе, индуцированном

пероксидом водорода. В положительном контроле МТТ - теста (среде, содержащей 10% ДМСО) наблюдалась практически 100% гибель клеток. При воздействии пероксида водорода происходило относительное уменьшение сигнала МТТ в 1,4 у фибробластов линии Ь929. Это может быть связано с уменьшением митохондриальной активности клеток. Нельзя исключить, что уменьшение митохондриальной активности клеток Ь929 происходит из-за интенсификации свободнорадикальных процессов. Под действием АФК в АТР/АХ)Р-антипортере, белке внутренней мембраны митохондрий, может происходить окисление БН-группы СуБ-56, что приводит к превращению этого переносчика адениннуклеотидов в неспецифический канал, проницаемый для любых низко молекулярных веществ. В результате в митохондриальный матрикс поступает вода и внешняя мембрана, площадь которой меньше площади внутренней мембраны, разрывается. При этом все белки, растворенные в межмембранном пространстве, включая ци гохром С, выходят в цитозоль и индуцируют гибель клеток по пути апоптоза (Самуилов В. Д., 2001, Скулачёв В.П., 2000). Таким образом, массовый цитолиз приводит к уменьшению показателей клеточной активности.

После инкубации клеточной культуры фибробластов Ь929 с 50мкМ пероксидом водорода в течение Зч из них была выделена РНК, которую использовали для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-РВ с геноспецифичными праймерами.

Проведенные исследования экспрессии гена ГР показывают, что при воздействии 50мкМ пероксида водорода уровень транскриптов (¡яг увеличивается в 1,7 раза относительно нормы (рис.5).

Было обнаружено увеличение экспрессии ГП в 6,1 раза относительно контроля (рис. 5).

г,в -

5 1.»

О

О 1.4

2. 1.2

с

ё

л 0.5-

1 0.«

о 0.4

а > о.г

■з

1»

1 ■¡ИГ"

ннц

—, ........................................................................

__г

—- г г -

Рис.5. Уровень транскриптов глутатионредуктазы (а) и глутатионпероксидазы (б) в клетках культуры фибробластов линии Ь929: 1-контроль, 2- после инкубации с пероксидом водорода

Возможно, что интенсификация транскрипции гена ГР и ГП вызвана активацией транскрипционного фактора №кВ свободными радикалами, образующимися в результате вовлечения пероксида водорода в реакцию

Фентона. Поскольку пероксид водорода способен легко проникать через мембраны клеток и генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа, вызывать окисление БН-групн белков, пероксидное окисление ненасыщенных жирных кислот, то, очевидно, он может выступать в качестве фактора, индуцирующего апоптоз. Образование ОН* может также осуществляться в реакции Хабера-Вайса, в которой также участвует Н202 и ионы металлов переменной валентности (например, Ре3+, Си2+), восстанавливающиеся в ходе этого процесса (Попова Т.Н., 2008), что также может вносить вклад в усиление СО биосубстратов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности координации функционирования ГР, ГП с интенсивностью протекания реакций Фентона и Хабера-Вайса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многое гупенчатая система антиоксидантной защиты выполняет в организме функцию контроля за уровнем клеточных АФК и является показателем резистентности клеток к окислительному стрессу. Специфичность в распределении отдельных компонентов системы антиоксидантной защиты в тканях и разных компартментах клеток указывает, что она выполняет роль не столько подавления, сколько регуляции образования и взаимопревращений АФК.

Согласно полученным результатам к 24ч развития адреналинового миокардита происходит увеличение удельной активности ГР и ГП в сердце крыс в 1,8 в 1,4 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Также показано, что происходит активация процессов СО биосубстратов в сердце в условиях данного патологического состояния. Параметры биохемилюминесценции - 1тах и Б, отражающие уровень АФК, наиболее значительно возрастают к 24 часу развития адреналинового миокардита. Коэффициенты корреляции, характеризующие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, 1тах и 8 имеют значения 0,9, 0,8, 0,6. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, 1шах, Б и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно. Таким образом, показано, что имеет место зависимость между содержанием ДК, 1шах, Б и активностью ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите. Необходимо отметить, что согласно результатам определения показателей биохемилюминесценции в сердце крыс при адреналиновом миокардите происходит мобилизация АОС. Об этом свидетельствует увеличение кривой биохемилюминесценции. При этом уровень компенсаторных механизмов, направленных на снижение интенсивности свободнорадикальных процессов, оказывается недостаточным и в клетках миокарда в условиях адреналинового миокардита происходит увеличение содержания продуктов ПОЛ. Исследование экспрессии ГР/ГП системы при адреналиновом миокардите у крыс показало, что активация ферментов происходит за счет гиперэкспрессии их генов в условиях патологии.

Установлено, что при адреналиновом миокардите происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГР и ГП в сердце крыс в 2,8 и 7,3 раза соответственно относительно нормы.

Результаты проведенных исследовании свидетельствуют об интенсификации процессов СО биосубстратов в печени в условиях ЭТГ, причем степень выраженности данных процессов коррелирует с активацией ферментов глутатионовой антиоксидантной системы. Установлено, что параметры биохемилюминесценции - светосумма и интенсивность максимальной вспышки, отражающие интенсивность СО, в наибольшей степени возрастают к 96 часу развития ЭТГ печени крысы по сравнению со значениями в норме. Рассчитаны коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, 1шах, Б в печени крыс при токсическом гепатите: 0,5, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между активностью ГП и концентрацией ДК, 1шах, Б: 0,9, 0,9, 0,9, соответственно. Исследование экспрессии генов ГП и ГР с учетом эффективности амплификации показало, что при интенсификации СО биосубстратов уровень экспрессии ГР возрастал в 3,0 раза, ГП в 2,5 раза по сравнению с контролем. Можно предположить, что интенсификация свободнорадикальных процессов способствует активизации ГР и ГП.

Рядом авторов выявлена интенсификация СО биомолекул при развитии СД2 (Смирнова О.М., 2003, Недосугова Л.В., 2006, Балаболкин М.И., 2002). Кроме того, при оксидативном стрессе происходит усиленный синтез белков шаперонов, которые способствуют повышению внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона, необходимого для функционирования ГР/ГП-системы. Проведенные исследования свидетельствуют об активации свободнорадикальных процессов к 21 дню развития СД2, причем степень выраженности данных процессов коррелирует с активацией ферментов глутатионовой антиоксидантной системы. Установлено, что параметры биохемилюминесценции, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов, возрастают к 21 дню развития СД2 по сравнению со значениями в норме. Нами было показано, что при СД2 происходит повышение активностей ГР и ГП в печени крыс в 1,7 и 2,2 раза соответственно по отношению к активности данного фермента в норме. В ходе исследований было установлено, что на 21сутки развития патологии уровень транскриптов ГР увеличивается. Однако уровень транскриптов ГП снижается. Экспрессия ГП снижалась в 1,9 раза, а ГР увеличивалась в 1,8 раза относительно нормы. Можно предположить, что уменьшение экспрессии ГП приводит к снижению инсулиновой резистентности клеток печени. Нельзя исключить, что увеличение активности ГП связано с информационными перестройками в молекуле белка, вследствие фосфорилирования/ дефосфорилирования при оксидативном стрессе (В.Г. Артюхов, 2008).

Установлено, что пероксид водорода в концентрации 50мкМ приводит к пикнозу и кариорексису клеток линии Ь929, являющимися признаками апоптоза. Нельзя исключить, что уменьшение митохондриальной активности

клеток L929 происходит из-за интенсификации свободнорадикальных процессов. Оксидативный стресс, в свою очередь, способствует выходу цитохрома С из кристы митохондрий, который индуцирует запуск каскада реакций, ведущих к апоптозу. Показано, что при воздействии пероксида водорода происходит уменьшение сигнала МТТ в 1,4 у фибробластов линии L929. Это может быть связано с уменьшением митохондриальной активности клеток и их гибелью вследствие интенсификации СО биосубстратов. При воздействии 50мкМ пероксида водорода уровень транскриптов ГР и ГП увеличивается. По-видимому, увеличение экспрессии ферментов направлено на коррекцию свободнорадикального гомеостаза.

Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что изменение функционирования ГР и ГП при патологии взаимосвязано со скоростью СО биосубстратов. На основании проведенных исследований была создана гипотетическая схема процессов регуляции экспрессии и участия ГР и ГП в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе различной этиологии. Можно предполагать, что во всех исследуемых патологических состояниях интенсификация свободнорадикальных процессов способствует индукции ГР и ГП посредством активации NF-kB свободными радикалами. Свободные радикалы способны активировать NF-kB путем инактивации фактора IkBa (Nam Н., 2004). NF-kB также регулирует гены, участвующие в воспалении, апоптозе, пролиферации и регенерации печени (Yamada Y., 1998). Можно предположить, что активация NF-kB индуцирует экспрессию ГП и ГР. Кроме того, высокая концентрация ГР и ГП при ЭТГ может быть связана с активацией белка Nrf. Согласно имеющимся данным, транскрипция антиоксидантных ферментов регулируется AREs - элементами. Nrf2 и Nrfl являются транскрипционными факторами, которые могут связываться с AREs и активировать гены ГП и ГР (Itoh К., 1999, Dhakshinamoorthy S., 2000, Nguen. Т., 2000, Yu R., 2000, Не С., 2001, Huang, Н., 2000, Kwak М., 2001). Однако, механизмы индукции оксидативного стресса при различных патологиях отличаются. При адреналиновом миокардите интенсификация СО происходит за счет аутоокислення адреналина, усиленной работы сердечной мышцы и гипоксии, которая, как известно, сопровождается активацией NO-синтазы и ксантинооксидазы, генерирующих АФК. В ходе развития ЭТГ происходит образование СС13*- продукта радикальной природы, обладающего высокой реакционной активностью и способностью эффективно взаимодействовать как с белками, так и с липидами, инициируя СО. В основе индукции оксидативного стресса при СД2 лежит образование продуктов неферментного гликозилирования и карбонильных интермедиатов на фоне гипергликемии, приводящих к генерации АФК. Воздействие пероксида водорода на клеточные культуры фибробластов линии L929 сопровождается интенсификацией СО биомолекул посредством вовлечения Н202 в реакцию Фентона. Однако, большинство исследованных путей индукции оксидативного стресса приводят к увеличению экспрессии ГР/ГП системы, направленной на коррекцию свободнорадикального гомеостаза. Исключением является

подавление транскрипции ГП при СД2, которое, по всей видимости, связано с гипергикемией и существенными нарушениями метаболических процессов при патологии. Таким образом, развитие оксидативного стресса, как правило, сопровождается гиперэкспрессией ГР и ГП, что взаимосвязано с усилением синтеза Г6ФДГ, поставляющей восстановительные эквиваленты для ГР/ГП системы. Тем не менее, при патологических состояниях, сопряженных с многосистемными сдвигами в обменных процессах, таких как СД2, по-видимому, происходит нарушение согласованности экспрессии ГР и ГП. Характерно, что экспрессия Г6ФДГ при этом оказывается подавленной. Выявленные изменения в экспрессионной регуляции данных ферментов могут являться дополнительным негативным фактором, усугубляющим течение патологического процесса.

Ре* ♦ СС1Д 1 (Ре^-ссу

мчня«>р| í

(Ре>-ссу+ а

!

-са30,1 + е

ре2' -•СС1,-0,1

мг-АИЕ

Гипергликемия 3

Продукты неферментитивного

гликозилирования Карбонильные интермедиа™

Л

Г6ФДГ

НАДФ

НАДФН АФК

II

№Ва тф МИ® ваф „5 ] <>

Швф1 Инсупинорезистентность

А-**

О*

л \\

АФК фаф ТИР

//

//

: г

Аутоокисление адреналина Работа сердечной мышцы ; ГИПОКСИЯ

\\

ч \

: АФК ф. 1КВа ф №кВ ф| 1кВаф [ АФК ф

Рис.6. Гипотетическая схема процессов регуляции экспрессии и участия глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксидативном стрессе, индуцированном развитием патологических состояний: токсического гепатита (1), адреналинового миокардита (2), сахарного диабета 2 типа (3) и воздействием пероксида водорода на клеточную культуру фибробластов (4)

Условные обозначения: IX - Ингибирующий эффект; "Ц*- Активирующий эффект; 1 - увеличение, : - уменьшение интенсивности процесса

ВЫВОДЫ

1. Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, 1пмх и 8 в сердце крыс при адреналиновом миокардите имеют значения 0,9, 0,8, 0,6. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, 1шах, 8 и активностью ГП: 0,7, 0,9, 0,8 соответственно.

2.При оксндативном стрессе, индуцированном развитием адреналинового миокардита, происходит увеличение уровня транскриптов с гена ГП в сердце крыс в 7,3 раза относительно нормы.

3.Прн адреналиновом миокардите в сердце крыс экспрессия ГР возрастает в 2 8 раза. Экспрессия Г6ФДГ, поставляющей НАДФН для ГР-реакции, увеличивается при патологии в 5,9 раз по сравнению с контролем.

4. Корреляционно-регрессивный анализ свидетельствует, что коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, 1тах, 8 в печени крыс при токсическом гепатите составляют: 0,5, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между активностью ГП и концентрацией ДК, 1тах, 8: 0,9, 0,9, 0,9, соответственно.

5.Содержание транскриптов ГП в печени крыс при токсическом гепатите возрастает в 2,5 раза относительно контрольных значений.

6.При экспериментальном токсическом гепатите происходит увеличение уровня транскриптов ГР в печени крыс в 3,0 раза относительно нормы. Экспрессия гена Г6ФДГ возрастает при патологии в 2,5 раза относительно контрольных значений.

7. Коэффициенты корреляции, отражающие зависимость между активностью ГР и содержанием ДК, 1тах, Б в печени крыс при СД2 типа, имеют значения: 0,9, 0,6, 0,9. Значения коэффициентов корреляции между концентрацией ДК, 1шах, Б и активностью ГП: 0,9,0,8, 0,9 соответственно.

8. Установлено, что экспрессия гена ГП в печени крыс при СД2 снижается в 1,9 раза по сравнению с нормой.

9. Экспрессия ГР в печени крыс при СД2 типа увеличивается в 1,8 раза относительно нормы. Однако, содержание мРНК Г6ФДГ при патологии снижалось в 2,5 раза относительно контроля, что очевидно, было взаимосвязано с торможением пентозофосфатного пути.

10. Воздействие пероксида водорода на клеточную культуру фибробластов линии Ь929 приводит к уменьшению митохондриалыюй активности, пикнозу и кариорексису, что, по-видимому, связано с индуцированием апоптотических процессов.

11. При воздействии пероксида водорода экспрессия ГП в клеточной культуре фибробластов линии 1.929 увеличивается в 6,1 раза по сравнению с нормой. Уровень экспрессии ГР в фибробластах Ь929 при воздействии пероксида водорода возрастает в 1,7 раза относительно контрольных значений.

12. Предложена гипотетическая схема процессов регуляции экспрессии ГП и ГР и их участия в контроле свободнорадикального гомеостаза при оксндативном стрессе различной этиологии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Искусных И.Ю. Изучение количественной экспрессии гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы печени крыс в норме, при индукции апоптоза и действии тиоктовой кислоты на фоне патологии! И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова// Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 2009.- стр.26.

2. Искусных И.Ю. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при адреналиновом миокардите/ И.Ю. Искусных// III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород, 2010,- С. 94-95.

3. Агарков A.A. Исследование уровня экспрессии гена глутатионредуктазы в печени крыс в норме и при токсическом гепатите/ A.A. Агарков, Т.Н. Попова, И.Ю. Искусных// Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ. Материалы 4-й всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010», Воронеж, 2010. - С.8-10.

4. Искусных И.Ю. Экспрессия селенсодержащей глутатионпероксидазы при канцерогенном действии тетрахлорметана/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, С.Г. Ржевский, О.С. Мушарова// Сибирский онкологический журнал, V региональная конференция молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2010. -стр.52.

5. Искусных И.Ю. Экспрессия глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы при токсическом гепатите/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, О.С. Мушарова, С.Г. Ржевский, И.А. Тюрин// Первые международные Беккеровские чтения, Волгоград, 2010, С. 105-106.

6. Искусных И.Ю. Оценка давления отбора на ген селенсодержащей глутатионпероксидазы/ И.Ю. Искусных И Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных проблем и прикладных научных задач, Москва, 2010,- стр.23.

7. Искусных И.Ю. Повышение уровня экспрессии глутатионредуктазы при адреналиновом миокардите у крыс/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, С.Г. Ржевский, О.С. Мушарова// Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования», Уфа, 2010.- 117-118.

8. Искусных И.Ю. Экспрессия глутатионредуктазы при действии тиоктовой кислоты на фоне токсического гепатита/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино, 2010. - С. 140-141.

9. Искусных И.Ю. Влияние мелатонина на экспрессию глутттюнредуктазы у крыс с сахарным диабетом1 И.Ю. Искусных, С.Г. Ржевский, О.С. Мушарова// Школа-конференция «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины», Москва, 2010.- С.43-45.

10. Искусных И.Ю. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при сахарном диабете/ И.Ю. Искусных, А.А. Агарков, Т.Н. Попова// Современные проблемы системной регуляции физиологических функций, Хургада, 2010,- С.89-90.

11.* Искусных И.Ю. Роль магнитосом в нарушении гомеостаза и развитии патологии/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова //Биомедицинская химия.-2010,- Т.56,-вып. 5,- С.

526-538.

12.* Iskusnykh I. Intensity of myocardial free-radical processes and expression of glutathione peroxidase and glutathione reductase genes in rats with adrenaline myocarditis/ I. Iskusnykh, T. Popova, O. Musharova// Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry.-2011,- v. 5.- no. 4.- p.357-362.

13.* Искусных И.Ю. Экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы it уровень свободнорадикальных процессов при сахарном диабете у крыс/ И.Ю. Искусных, Т.Н. Попова, А.А. Агарков, С.Г. Ржевский // Молекулярная медицина.- 2012.-№ 1.-С. 49 - 52.

♦Статьи № 11, 12, 13 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.

Подписано в печать 24.04.12. Формат 60*84 1/|в- Усл. псч. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ 429.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полнграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Искусных, Игорь Юрьевич, Воронеж

61 12-3/1130

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет»

На правах рукописи

Искусных Игорь Юрьевич

ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ ОКСИДАТИВНОМ СТРЕССЕ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биол. наук, профессор Т.Н. Попова

Воронеж 2012

Содержание

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................15

1 .Свободнорадикальное окисление биомолекул и система антиоксидантной защиты........................................................................................15

1.1. Свободные радикалы и оксидативный стресс..................................16

1.2. Антиоксидантная система защиты.............................................24

1.2.1.Ферментативные и неферментативные звенья антиоксидантной защиты.......................................................................................24

1.2.2.Роль глутатионредуктазы в механизмах защиты от клеточного стресса........................................................................................29

1.2.3.Структурная организация и биохимические свойства глутатион-

пероксидаз....................................................................................32

1.2.4. Физиолого-биохимическое значение глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы............................................................................................35

1.2.5. Кооперативность функционирования антиоксидантных ферментов....36

2. Патологии, сопряженные с оксидативным стрессом............................38

2.1. Миокардит и его патогенез.........................................................39

2.1.2.Механизмы влияния адреналина на уровень свободных радикалов в

клеточных системах................................................................40

2.2.Токсическое поражение печени....................................................44

2.2.1.Общая характеристика гепатитов................................................44

2.2.2.Метаболические нарушения при токсическом гепатите....................44

2.3.Сахарный диабет и его типы........................................................47

2.3.1.Свободнорадикальное окисление в патогенезе сахарного диабета.......47

2.4. Пероксид водорода как индуктор оксидативного стресса....................53

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ....................................................55

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................55

2.1. Объект исследования................................................................55

2.2. Методы исследования...............................................................55

2.3. Индукция экспериментального токсического гепатита......................55

2.4. Создание модели адреналинового миокардита.................................56

2.5. Моделирование сахарного диабета 2-го типа................................56

2.6. Получение тканевых гомогенатов.................................................56

2.7. Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления биосубстратов методом биохемилюминесценции...........................57

2.8. Определение содержания диеновых конъюгатов.............................59

2.9. Определение активности глутатионредуктазы.................................60

2.1.0 Определение активности глутатионпероксидазы............................61

2.1.1. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы..............61

2.1.2. Определение активности аланинаминотрансферазы и аспартат-

аминотрансферазы..................................................................61

2.1.3 .Определение активности креатинкиназы-МВ................................63

2.1.4. Определение количества белка..................................................64

2.1.5. Экстракция тотальной РНК тризоловым методом...........................64

2.1.6. Электрофорез РНК.................................................................65

2.1.7. Обратная транскрипция...........................................................66

2.1.8. ПЦР-амплификация в режиме реального времени..........................66

2.1.9. Определение уровня экспрессии генов глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы...................................67

2.2.0. Электрофорез ДНК................................................................69

2.2.1. Среды для работы с культурами клеток.......................................70

2.2.2. Оценка метаболической активности и жизнеспособности клеток.......71

2.2.3. Оценка степени развития апоптоза в клеточной культуре фибробластов

2.2.4. Корреляционно-регрессионный анализ.......................................72

2.2.5.Статистическая обработка экспериментальных данных....................72

ГЛАВА 3. ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОН-РЕДУКТАЗЫ В СЕРДЦЕ КРЫС В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ АДРЕНАЛИНОВОГО МИОКАРДИТА.............................................74

3.1. Активность ферментов-маркеров цитолиза кардиомиоцитов в сыворотке крови крыс при развитии адреналинового миокардита...........................74

3.2. Содержание диеновых конъюгатов в сердце крыс в динамике развития адреналинового миокардита............................................................75

3.3. Динамика параметров биохемилюминесценции в сердце крыс при адреналиновом миокардите.............................................................76

3.4. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в сердце крыс в динамике развития адреналинового миокардита.................................78

3.5. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сердце крыс при адреналиновом миокардите..............................................................81

3.6. Корреляционный анализ активностей глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и интенсивности свободнорадикальных процессов при адреналиновом миокардите........................................................83

3.7. Экспрессия глутатионредуктазы в сердце крыс при адреналиновом миокардите.................................................................................84

3.8. Экспрессия глутатионпероксидазы в сердце крыс в при адреналиновом миокардите.................................................................................104

3.9. Уровень экспрессии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сердце крыс при

адреналиновом миокардите............................................................109

ГЛАВА 4. ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ

ПЕЧЕНИ КРЫС........................................................................112

4.1. Активность ферментов-маркеров цитолиза гепатоцитов в сыворотке крови крыс при токсическом поражении печени, индуцированном тетрахлорметаном.......................................................................112

4.2. Содержание диеновых конъюгатов в печени крыс в динамике развития токсического гепатита..................................................................113

4.3. Параметры биохемилюминесценции в печени крыс в динамике развития токсического гепатита, индуцированного тетрахлорметаном..................114

4.4. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени......................................................116

4.5. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при токсическом гепатите....................................................................118

4.6. Корреляционный анализ активностей глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы и интенсивности свободнорадикальных процессов в печени крыс при экспериментальном токсическом гепатите...................120

4.7. Экспрессия глутатионредуктазы при токсическом поражении печени..121

4.8. Экспрессия глутатионпероксидазы при токсическом поражении печени.......................................................................................122

4.9. Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при экспериментальном

токсическом гепатите....................................................................124

ГЛАВА 5. ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА

5.1. Уровень глюкозы в сыворотке и моче крыс в динамике развития сахарного диабета 2 типа...............................................................126

5.2. Содержание диеновых конъюгатов в печени крыс в динамике развития экспериментального сахарного диабета 2 типа.....................................127

5.3. Параметры биохемилюминесценции в печени крыс в динамике развития сахарного диабета 2 типа...............................................................129

5.4. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в печени крыс при сахарном диабете 2 типа..........................................................132

5.5. Активность глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при сахарном диабете 2 типа...............................................................135

5.6.Корреляционный анализ активностей глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы и уровня свободнорадикальных процессов в печени крыс при сахарном диабете 2 типа................................................................136

5.7. Экспрессия глутатионредуктазы в печени крыс при развитии сахарного диабета 2 типа.............................................................................137

5.8. Экспрессия глутатионпероксидазы в печени крыс при сахарном диабете

2 типа.......................................................................................138

5.9.Экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс при сахарном

диабете 2 типа............................................................................140

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ, МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ ЛИНИИ L929.............................................................................141

6.1. Уровень клеточной гибели в культуре фибробластов линии L929 при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода...............141

6.2. Дыхательная активность фибробластов линии L929 при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода.................................143

6.3. Экспрессия гена глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы при интенсификации свободнорадикального окисления в культуре фибробластов

линии L929 пероксидом водорода...................................................144

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................147

ВЫВОДЫ.................................................................................154

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ....................................156

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АОС - антиоксидантная система

АсАТ- аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

БХЛ - биохемилюминесценция

Г6ФДГ- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГП-глутатионпероксидаза

ГПС-глутатионпероксидазная система

ГР- глутатионредуктаза

ГСД- гистидинсодержащие соединения

ДК- диеновые коньюгаты

ДМСО-диметилсульфоксид

ИБС - ишемическая болезнь сердца

КК- креатинкиназа

КПНГ-продукты неферментативного гликозилирования ЛПВП -липопротеины высокой плотности Л11Ш1 -липопротеины низкой плотности МДА- малоновый альдегид

мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота

НАДФ -никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

НАДФН-никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

рКПНГ- рецептор КПНГ

РКС - протеинкиназа С

САЗ - система антиоксидантной защиты

СД2 - сахарный диабет 2 типа

СО - свободнорадикальное окисление СОД- супероксиддисмутаза СР - свободные радикалы ФАД-флавинадениндинуклеотид ЦТК -цикл трикарбоновых кислот ЭТС- эмбриональная телячья сыворотка а-ТосН -токоферол в8Н - восстановленный глутатион в880- окисленный глутатион ЫБ-кВ- ядерный фактор транскрипции

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Окислительный стресс или некомпенсированное образование в клетке активных форм кислорода (АФК), является причиной систематического повреждения ДНК, белков и липидов, что может приводить к клеточной смерти и лежит в основе ряда патологических состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, токсическое поражение печени и сахарный диабет, относящихся к свободнорадикальным патологиям. В ответ на интенсификацию свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки. Глутатионредуктазная/глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма [18], поддерживающей на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикальных процессов [18, 21, 81]. Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Ре [63, 241].Учитывая то обстоятельство, что большинство известных патологических состояний сопровождаются усилением СО [45, 126, 177] биосубстратов и изменением активности АОС, весьма актуальной проблемой представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и выбора тактики лечения заболеваний.

Происходящее под влиянием негативных факторов повреждение мембраны кардиомиоцитов сопровождается выделением в межклеточное пространство биологически активных веществ, таких как гистамин, брадикинин, серотонин, лейкотриены. Под действием этих веществ увеличивается проницаемость сосудов микроциркуляторного русла, развивается отек ткани миокарда, наблюдаются точечные кровоизлияния, что приводит к развитию очагов ишемии, где развивается ацидоз, дегенерация и

некроз кардиомиоцитов. Существует мнение, что при адреналиновом миокардите в результате аутоокисления адреналина происходит интенсификация свободнорадикальных процессов. Усиление работы сердечной мышцы в результате введения адреналина приводит к гипоксии, что вызывает интенсификацию СО биосубстратов, благодаря активации N0-синтазы и ксантинооксидазы.

К числу ксенобиотиков с наиболее высокой степенью избирательной гепатотоксичности относятся хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (СС14). Имеющиеся данные свидетельствуют, что развитие СС14-гепатита сопряжено с интенсификацией СО биосубстратов [47, 3]. Организм человека и животных располагает целым рядом сложных биохимических систем (метаболизма ксенобиотиков, антирадикальной защиты и т.д.), во многом определяющих чувствительность к действию токсинов разного строения. К их числу относится и глутатионовая система.

Сахарный диабет второго типа (СД2) характеризуется хронической гипергликемией, которая приводит к нарушению обмена веществ, влияя на него непосредственно или через изменение экспрессии генов различных белков, участвующих в патогенезе и механизмах развития осложнений при данной патологии. Гипергликемия сопровождается повышением скорости аутоокисления глюкозы с последующим увеличением уровня свободных радикалов и развитием окислительного стресса. Кроме того, ишемия, гипоксия и псевдогипоксия тканей, которые имеют место при СД2, являются дополнительными факторами, способствующими повышенному образованию свободных радикалов в организме. При этом значимость гипергликемии в инициации СО биосубстратов показана как на экспериментальных моделях, так и в клинических исследованиях [73, 9, 57, 6].

Установлено, что при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом, может изменяться гормональный статус организма, в связи с чем индукция оксидативного стресса может иметь опосредованный

нейрогуморальный характер. Клеточные культуры являются удобной модельной системой для исследования оксидативного стресса, поскольку их использование позволяет исключить многие неспецифические факторы, сопровождающие индукцию оксидативного стресса. В этой связи, изучение экспрессии ГП и ГР на клеточных культурах in vitro при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода, является также актуальной задачей.

В настоящее время в литературе имеются данные относительно изменения функционирования некоторых звеньев антиоксидантной системы в тканях животных [220, 221, 222, 223] и человека [148, 147, 66] в условиях нормы и патологии. Однако имеющиеся сведения носят часто разрозненный, противоречивый и несистематизированный характер. Вместе с тем, представляет интерес выявление общих закономерностей и особенностей функционирования ГП/ГР АОС при оксидативном стрессе различной этиологии, в частности, вызванным развитием патологических состояний -адреналинового миокардита, токсического гепатита, СД 2 типа, а также индуцируемым АФК в клеточных культурах. Использование различных модельных систем позволяет выявлять важнейшие молекулярные механизмы регуляции глутатионовой АОС с одной стороны, а также ее специфические особенности - с другой.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование экспрессии ГР и ГП в тканях крыс в условиях оксидативного стресса, вызванного индукцией свободнорадикальных патологий: адреналинового миокардита, токсического поражения печени, сахарного диабета 2 типа, а также воздействием пероксида водорода на клеточные культуры фибробластов.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1.Корреляционный анализ активностей ГР, ГП и интенсивности свободно-радикальных процессов в тканях крыс при адреналиновом миокардите, ЭТГ и СД2.

2.0ценка уровня экспрессии ГП, ГР и Г6ФДГ в тканях крыс при адреналиновом миокардите, ЭТГ и СД2.

3. Исследование влияния пероксида водорода на метаболическую активность, особенности пролиферации и клеточную гибель фибробластов мыши линии Ь929

4.Исследование уровня экспрессии ГП и ГР в фибробластах линии Ь929 при воздействии пероксида водорода.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование экспрессионной регуляции ГР, ГП и Г6ФДГ при патологиях, �