Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние мелатонин-корригирующих препаратов-мелаксена и вальдоксана, на свободнорадикальный гомеостаз при синдроме тиреотоксикоза

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние мелатонин-корригирующих препаратов-мелаксена и вальдоксана, на свободнорадикальный гомеостаз при синдроме тиреотоксикоза"

На правах рукописи

Горбенко Марина Владимировна

ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОИИН - КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ - МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ ПРИ СИНДРОМЕ

ТИРЕОТОКСИКОЗА

Специальность 03.01.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 № 2013

Воронеж - 2013

005544364

005544364

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Воронежский

государственный университет», биолого-почвенный факультет, кафедра биофизики и биотехнологии, профессор

Земченкова Ольга Владимировна

кандидат биологических наук, ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко», кафедра биохимии, ассистент

Ведущая организация

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «22)» декабря 2013 года в \6 С0 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разослан «7Л » ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

/

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем современной медицины являются заболевания щитовидной железы. Синдром тиреотоксикоза, обусловленный гиперпродукцией гормонов щитовидной железы, относится к одной из часто встречаемых эндокринопатий. При данном заболевании из-за избытка тиреоидных гормонов (ТГ) происходят нарушения функционирования сердечно-сосудистой, пищеварительной, центральной нервной систем. Имеются данные, что ТГ в больших концентрациях индуцируют окислительный стресс в печени, сердце и скелетной мускулатуре крыс, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) и интенсификации пероксидного окисления липидов (ПОЛ) (Vinditti Р., 2006). Избыточная генерация свободных радикалов (CP) ведет к повреждению мембран, нарушению жизнедеятельности клеток и их апоптотической гибели (Чеснокова Н.П., 2007). При этом важную роль играет активация многоуровневой антиоксидантной системы (АОС) организма, включающей два звена: ферментативное и неферментативное. Очевидно, актуальной задачей является поиск лекарственных средств, способных влиять на процесс развития оксидативного стресса при тиреотоксикозе.

В настоящее время повышается интерес к исследованию биологически активных препаратов, способных активировать АОС и обладающих самих по себе антиоксидантными свойствами. В связи с этим приобретает значение исследование антиоксидантной активности мелаксена и вальдоксана. Мелаксен является препаратом, имеющим в своем составе мелатонин. Это адаптогенный препарат, синтезированный из аминокислот растительного происхождения. Известно, что мелатонин - нейрогормон, продуцируемый у человека и других позвоночных эпифизом, а также клетками диффузной эндокринной системы. Этот гормон играет роль регулятора многих физиологических функций: участвует в формировании суточных биоритмов, торможении некоторых функций гипофиза, регуляции иммунных реакций, оказывает анальгезирующий и седативный эффекты. Мелатонин можно рассматривать как наиболее универсальный из биологических антиоксидантов, реализующий свою активность путем различных механизмов: гормон обладает выраженной способностью связывать CP, а также стимулировать определенные компоненты АОС (Reiter R.J., 2007; Левин Я.И., 2012; Paulis L., 2007). Кроме того, существуют препараты с мелатонинергическим типом действия. К ним относится вальдоксан, действующим веществом которого является агомелатин. Он является мощным лигандом мелатониновых рецепторов, а также относится к антидепрессантам с инновационным механизмом действия (Kennedy S.H., 2007; Dubovsky S.L., 2009; Kasper S., 2009). Данные препараты применяются с профилактической и лечебной целью. Однако их влияние на свободнорадикальный гомеостаз при синдроме тиреотоксикоза остается невыясненным.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование воздействия мелатонин - корригирующих препаратов -мелаксена и вальдоксана, на свободнорадикальный гомеостаз при

тиреотоксикозе в эксперименте на животных, а также при применении мелаксена на фоне базисного лечения пациентов в клинических условиях.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния мелаксена и вальдоксана на показатели, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) в печени, сердце и сыворотке крови крыс с экспериментальным гипертиреозом (ЭГ).

2. Оценка активности глутатионового звена АОС (активности глутатионредуктазы (ГР), глутатионпероксидазы (ГП), глутатионтрансферазы (ГТ) и уровня восстановленного глутатиона (вБН)) и активности КАЭРН-генерирующих ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и ЫАОР-изоцитратдегидрогеназы (ЫАОР - ИДГ) при действии мелаксена и вальдоксана на фоне развития гипертиреоза;

3. Исследование действия мелаксена и вальдоксана на содержание цитрата и активность аконитатгидратазы (АГ), являющейся критической мишенью действия АФК.

4. Изучение влияния мелаксена и вальдоксана на активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) при ЭГ у крыс.

5. Определение параметров биохемилюминесценции (БХЛ) и исследование фрагментации ДНК в сыворотке крови пациентов с тиреотоксикозом при проведении базисной терапии и комбинированного лечения с мелаксеном.

6. Изучение функционирования глутатионовой АОС при комбинированной терапии с мелаксеном на фоне развития тиреотоксикоза.

7. Оценка воздействия мелаксена на активности ЫАОРН - генерирующих ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и ИАОР-изоцитратдегидрогеназы, при синдроме тиреотоксикоза.

8. Определение активности аконитазы и содержания цитрата в сыворотке крови больных с тиреотоксикозом после проведения традиционного лечения и комбинированной терапии, включающей мелаксен.

9. Создание гипотетической модели участия мелатонин - корригирующих препаратов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование воздействия мелатонин - корригирующих препаратов на интенсивность СО биомолекул, активности ферментативных и неферментативных компонентов АОС и ряда ферментов окислительного метаболизма, при гипертиреозе как в эксперименте на животных, так и у пациентов с синдромом тиреотоксикоза в клинических условиях. Установлено, что введение мелаксена и вальдоксана при ЭГ приводит к снижению интенсивности СРП и степени мобилизации ферментов АОС во все исследуемых тканях крыс. Показана эффективность применения для торможения развития окислительного стресса мелаксена на фоне базисной терапии больных с синдромом тиреотоксикоза. Исследовано воздействие мелатонин - корригирующих препаратов на функционирование ферментов, генерирующих ИАОРН, необходимого для работы глутатионовой АОС. Предложена гипотетическая схема участия мелатонин - корригирующих препаратов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению

фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом.

Практическая значимость. Результаты работы углубляют фундаментальные представления о путях реализации протекторного действия мелатонин - корригирующих веществ, обладающих антиоксидантным потенциалом. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в решение проблемы по выявлению нарушений метаболизма при тиреотоксикозе и способствуют поиску оптимальных путей их коррекции. Данные о позитивном воздействии мелатонин - корригирующих препаратов на свободнорадикальный гомеостаз в тканях млекопитающих свидетельствуют о возможности применения мелаксена и вальдоксана в антиоксидантной терапии, при лечении тиреотоксикоза. Результаты исследований с использованием мелаксена в ходе лечения пациентов с тиреотоксикозом указывают на целесообразность применения антиоксидантной терапии при данной патологии.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Интеграция процессов обмена веществ в организме», «Свободнорадикальные процессы в биосистемах», спецкурсов по аналитической и клинической биохимии, энзимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских диссертаций студентами Воронежского государственного университета.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз Россия 2011" (Воронеж, 2011), на IV международной научно - практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов - на -Дону, 2011), в материалах IV Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2011), в материалах XVIII, XIV межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт Петербург, 2011,2012,2013), на V Международной научно-практической конференции «Современное состояние естественных и технических наук» (Москва, 2011), на III Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2012), в материалах Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева (Чебоксары, 2012), на I и II Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием (Воронеж, 2012, 2013), в материалах V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых (Тверь, 2012), а также на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль, 2012)

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 16 публикациях - в 4 статьях и 12 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Мелагонин - корригирующие препараты - мелаксен и вальдоксан, могут выступать в качестве протектров при развитии оксидативного стресса при ЭГ.

2. Введение мелаксена и вальдоксаиа животным с ЭГ приводит к снижению степени мобилизации АОС и приближению ряда показателей антиоксидантной защиты к контрольным значениям.

3. Под воздействием мелатонин - корригирующих препаратов происходит изменение в сторону нормы активности ряда ферментов окислительного метаболизма, способных оказывать лимитирующие действие на интенсивность СО биосубстратов.

4. Включение мелаксена в базисное лечение приводит к существенному уменьшению параметров БХЛ, отражающих интенсивность СРП, и снижению степени мобилизации ряда ферментативных и неферментативных компонентов АОС в организме больных с тиреотоксикозом.

5. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема, отражающая воздействие мелатонин - корригирующих препаратов на свободнорадикальный гомеостаз организма при тиреотоксикозе. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов (4 главы), заключения, выводов, списка литературы (232 источника). Иллюстрационный материал включает 31 рисунок и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект и материалы исследования. В ходе экспериментальных исследований использовали сыворотку крови и гомогенаты печени и сердца белых лабораторных крыс-самцов массой 200-250 г. Материалом исследований служила также сыворотка крови здоровых доноров и крови больных с синдромом тиреотоксикоза. Животные были разделены на шесть экспериментальных групп: в 1-й группе (п=19) животных содержали на стандартном режиме вивария; во 2-й группе (п=9) у животных индуцировали гипертиреоз; в 3-й и 4-й группах (п=18) животным после индуцирования гипертиреоза вводили внутрибрюшинно мелаксен («Юнифарм», США) в дозе 5 и 10 мг/кг веса животного ежедневно в течение 3-х дней в утренние часы; в 5-й и 6-й группах (п=18) крысам с ЭГ вводили внутрибрюшинно вальдоксан («Лаборатория Сервье Индастри», Франция) в дозах 5 и 10 мг/кг веса животного.

Больные с гипертиреозом были разделены на две группы. Первая группа пациентов находилась на традиционном лечении. Вторая группа пациентов дополнительно к антитиреоидным препаратам и Р - адреноблокаторам получала мелаксен (Юнифарм, США) по 1 таблетке, содержащей 3 мг мелатонина, 1 раз в день за 30-40 минут перед сном в течение 10 дней. Контрольную группу составили 65 практически здоровых лиц с нормальными показателями общего, биохимического анализов крови и содержания ТТГ и Т4 свободного.

Создание экспериментальной модели гипертиреоза у крыс. Гипертиреоз вызывали внутрибрюшинным введением трийодтиронина. Гормон вводили здоровым животным в дозе 100 мкг на 100 г массы тела в виде

раствора в 0,9% NaCl. Инъекции осуществляли трижды через день в течение шести дней (Fernandez, 1991 ). В качестве протекторов использовали мелаксен и вальдоксан, введение которых осуществляли троекратно. Все процедуры эксперимента соответствовали требованиям международных правил гуманного отношения к животным, отраженных в санитарных правилах по отбору и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). (УК РФ ст. 245). Образцы для анализа забирали на 7-е сутки после начала эксперимента.

Клиническое исследование больных с синдромом тиреотоксикоза. В

клиническое исследование было включено 33 человека с синдромом тиреотоксикоза, в том числе 12 мужчин (43%) и 21 женщина (57%). Возраст пациентов составлял от 27 до 69 лет: средний возраст - 49,6±3,8 лет. Диагнозы были поставлены на основании клинических признаков заболевания, гормонального исследования крови, данных ультразвукового исследования щитовидной железы. Средняя продолжительность заболевания составляла 4,2±0,7 месяца.

Подготовка материала для исследования. Сердце и печень после многократного перфузирования ледяным изотоническим раствором измельчали, гомогенизировали в охлажденной среде выделения следующего состава: 0,1 М трис-НС1-буфер (рН 7,8), содержащий 1 мМ ЭДТА, 1% [3-меркаптоэтанол и центрифугировали при 10000 g в течение 12 мин. Полученный гомогенат использовали для дальнейших исследований. Забор крови осуществляли из сердца. Кровь помещали на 0,5 часа в термостат при температуре 37°С и центрифугировали при 3000g в течение 10 мин. Полученную сыворотку использовали для дальнейших исследований.

Определение интенсивности свободнорадикальных процессов. Для определения интенсивности СРП применяли метод индуцированной биохемилюминесценции. Использовали биохемилюминометр БХЛ-06М с программным обеспечением. Кинетическую кривую биохемилюминесценции регистрировали в течении 30 секунд и определяли следующие параметры БХЛ: светосумму (S), интенсивность вспышки (Imax) и величину тангенса угла наклона касательной к нисходящей ветви кривой (tga2) (Любитский О.Б., 1996). Содержание ДК определяли спектрофотометрически при 233 им. (Стальная И.Д., 1977). Степень спонтанной ОМБ крови и гомогената печени и сердца определяли при 370 нм (Дубинина Е.Е., 2000).

Определение интенсивности апоптоза осуществляли по степени фрагментации ДНК. ДНК выделяли фенольно-хлороформным методом (Маниатис, 1984). Степень фрагментации ДНК определяли методом электрофореза.

Определение активности ферментов. Активность ферментов определяли на спектрофотометре Hitachi U - 1900. Активность СОД определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия в неэнзиматической системе феназинметасульфата и NADH при 540 нм (Матюшин Б.Н., 1991). Определение активности каталазы проводили методом, основанным на способности пероксида водорода образовывать с

молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм. (Королюк М.А., 1988). Активность NADP-зависимых ферментов определяли при 340 нм. О скорости реакций, катализируемых Г6ФДГ и NADP-ИДГ, судили по возрастанию оптической плотности в результате восстановления NADPH. О скорости ГР-реакции судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления NADPH, протекающего за счет реакции восстановления глутатиона. О скорости ГП-реакции судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления NADPH, протекающего за счет осуществления сопряженных ферментативных реакций: образования окисленного глутатиона под действием ГП и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением NADPH, под действием ГР. Активность АГ определяли при 233 нм. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25°С. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка или Е в расчете на 1 г сырой массы материала (мл сыворотки). Общий белок определяли с помощью биуретовой реакции.

Определение содержания низкомолекулярных антиоксидантов. Концентрацию GSH определяли с помощью реакции с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой, в результате которой образуется тионитрофенильный анион, имеющий максимум поглощения при 412 нм (Бузлама B.C., 1997). Количество цитрата определяли по методу Нательсона (Афанасьев В.Г., 1973).

Экстракция тотальной РНК. Для оценки уровня экспрессии Gpxl и Gsr выделяли тотальную РНК с использованием набора Yellow Solve.

Электрофорез РНК и ДНК. Электрофорез РНК и ДНК проводили в агарозном геле. Для окрашивания использовали бромистый этидий.

Обратная транскрипция. На матрице выделенной РНК с помощью обратной транскрипции получали кДНК, используемую для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

ПЦР-амплификация в режиме реального времени. ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили на приборе АНК-32. В ходе работы использовали праймеры для определения уровня транскриптов исследуемого гена и референсного гена. В ходе эксперимента использовали набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR Greenl.

Определение уровня экспрессии генов осуществляли с применением сравнительного метода пороговых циклов и программного обеспечения «REST 2008» (Pfaffl M.W., 2002).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 8-9-ти кратных повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. Результаты опытов сравнивали с контролем. В таблицах и на рисунках приводятся средние арифметические значения активностей данного фермента и их стандартные ошибки. Полученные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента с вычислением

среднего значения, стандартного отклонения, различия считали достоверными при р<0,05 (Ллойд, Ледерман, 1990).

ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕЛАТОНИН - КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ У КРЫС С целью исследования влияния мелатонин - корригирующих препаратов на уровень СРП в тканях крыс с ЭГ был использован метод биохемилюминесценции, а также оценка содержания ДК и степени ОМБ. При введении мелаксена и вальдоксана животным с ЭГ происходило снижение параметров БХЛ в печени, сердце и сыворотке крови крыс, отражающих степень протекания СО и возрастающих при патологии (табл. 1).

Таблица 1.

Параметры биохемилюминесценции в печени, сердце и сыворотке крови крыс в

контроле, при ЭГ и введении мелаксена и вальдоксана.

Группы животных Светосумма вспышки хемилюминесценции (5), тУ х с Интенсивность максимальной вспышки (1тах), тУ Тангенс угла падения кинетической кривой

-а X <и У и Ё Си и « х н о о. _ 8 § & -а и Т и с о я ч о. а> о СЗ ы н о о. а О са ш о 3 & -о X о X и с о я ч а. и о га к н о о. " о па а о 3 О. о и:

1 23,7±1,1 05 14,54+ 0,637 31,71± 1,425 4,3+0,1 89 2,43±0, 115 5,99+0, 189 1,5±0,0 75 1,8±0,0 87 0,99±0,0 35

2 30,79±1, 445* 20,7±0, 973 47,34+ 1,978 6,13+0, 279 4,38+0, 206 7,37+0, 268 1,82±0, 085 1,96±0, 089 2,21+0,1 05

3 25,917±0 ,967* 15,85± 1,137* 35,11+ 1,654* 5,236± 0,262* 3,370± 0,157* 6,479± 0,312* 1,610+ 0,078* 1,83+0, 0406* 1,507±0, 065*

4 25,743±1 ,08** 15,847 ±0,97* 33,290 ±1,66* 4,817+ 0,210* 3,153+ 0,290* 6,123± 0,298* 1,621+ 0,02* 1,864± 0,05* 1,332±0, 054*

5 25,671±0 ,861** 15,34± 0,645* 33,757 ±1,56* 4,956± 0,231* 3,070± 0,135* 6,545± 0,301* 1,589± 0,064* 1,84±0, 0211* 1,423±0, 0653*

6 25+0,594 ** 15,62± 0,644* 33,31± 1,623* 4,685+ 0,341* 3,032+ 0,143* 6,239+ 0,254* 1,602± 0,078* 1,853+ 0,047* 1,342+0, 0623*

Примечания: 1 - группа контрольных животных, 2 - крысы с ЭГ, 3 -введение мелаксена в дозе 5 мг/кг после индукции экспериментального гипертиреоза; 4 - введение мелаксена в дозе 10 мг/кг после индукции ЭГ, 5 -введение вальдоксана в дозе 5 мг/кг после индукции ЭГ; 6 - введение вальдоксана в дозе 10 мг/кг при развитии патологии.

* - отличия от значений при ЭГ достоверны (уровень значимости р<0,05) Установлено, что светосумма БХЛ при воздействии мелаксена и вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг уменьшалась в сердце крыс в 1,3 раза, в печени в 1,2 раза, т.е. наблюдалось изменение в сторону контроля. Сходные изменения Б были отмечены и для сыворотки крови животных, которым вводили мелаксен и вальдоксан. При введении мелаксена в исследуемых дозах на фоне развития патологии, происходило снижение 1шах в печени на 1,2 и 1,3 раза, в сердце в 1,3 и 1,4 раза (р<0,05) по сравнению с животными с патологией. Величина 1тах в сыворотке крови крыс при воздействии мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг,

уменьшалась на 14% и 20 % соответственно. Введение вальлоксана на фоне развития ЭГ также приводило к снижению I™, в сторону нормы. Выявленное снижение значений S и Imax, по-видимому, может быть связано с проявлением мелассном и вальдоксаном антиокендантных свойств, направленных на подавление чрезмерного образования CP при гипертиреозе. Данное предположение подтверждается уменьшением степени мобилизации Л ОС организма, что проявляется в снижении ig а; при введении исследуемых препаратов.

Виутрибрюшиниое введение мелакссна и вальлоксана в лозах 5 и 10 мг/кг веса животного при гипертиреозе приводило к снижению уровня ДК но сравнению с их содержанием при патологии.

Содержание ДК в печени крыс, снижалось при введении мелакссна в дозах 5 и 10 мг/кг па 9% и 8%, а ири введении вхпьдоксана в 1,2 и 1,4 раза соответственно, по сравнению с патологией (рис. I). Воздействие исследуемых препаратов в дозах 5 и 10 мг/кг приводило к уменьшению содержания ДК в сыворотке крови крыс в 1.2 раза. Концентрация ДК в сердце животных при введении мелаксана и вальлоксана изменялась в сторону контрольных значений.

»

йдш

1 г . I ■» * в

Группы жиоснмык

Рис. I. Содержание ДК в печени в сердце И и сыворотке крови Ш крыс в норме (I). при экспериментальном гипертиреозе (2). при введении мелакссна в дозах 5 и 10 мг /кг (3,4), при введении вальлоксана в дозах 5 и 10 мг/кг (5.6).

Выявлено, что при развитии ЭГ наблюдалась увеличение степени ОМЬ. Установлено, что при ЭГ солержане карбонильных соединений в печени крыс увеличивается в 1.4 раза по сравнению с контрольной группой. Возрастание ОМБ было выявлено и в сердце, и в сыворотке крови крыс. Считается, что в состоянии окислительного стресса, атаке ЛФК подвергаются в первую очередь, белки плазматических мембран, а не лииилы (Dean R.T.. 1991). Известно, что в

качестве ochodiii-ix индукторов ОМБ. рассматриваются ЛФК. увеличение

свободного железа, продукты ПОД. Высокие концентрации ТГ могут приводить к возрастанию потребления кислорода и стимулируют выработку СР. При действии АФК происходит нарушение нативной конформанин белков с образованием крупных белковых агрегатов или фрагментация белковой молекулы (Davies K.J.. 1987).

Установлено, что содержание карбонильных групп при воздействии мелакссна в дозах 5 и 10 мг/кг уменьшалось в сердце крыс в 12 раза, в печени в 1,3 раза (рис.2). Аналогичные изменения в содержании карбонильных

СОСДИИСНИЙ были нымв.юпы в СЫВОрОТКе крони ПОДОПЫТНЫХ

животных, которым вводили мслаксен и вальдоксан. При действии вальдоксаш при ЭГ содержание карбонильных групп также изменялось в сторону нормы.

«lililí

i г i 4 s с

Группы ЖИ001НЫК

Рис. 2 Содержание карбонильных групп в печени >-, в сердце И и сыворотке крови В крыс в норме (I). при экспериментальном гипертнреозе (2), при введении мслакссна в дозах 5 и 10 мг/кг (3.4), при ввелении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг (5.6).

Выявленное »жжение значении S и Iniax. содержания ДК и карбонильных соединении, по-видимому, может быть связано со способностью данных препаратов оказывать влияние на содержание мелатонина и чувствительность его рецепторов, что приводит к проявлению гормоном антиоксидантных свойств, способствующих нормализации уровня СО биомолскул.

При введении мслатонин - корригирующих прспараюв активность акоиитазы - чувствительной мишени действия СР. снижающаяся в тканях крыс при ЭГ, изменялась i сторону контроля. Так. при действии мслакссна в дозах $ и 10 мг/кг на фоне 'Л" активноегь АГ в печени увеличивалась в 1,4 и 1,5 раза, в сердце - в 1,6 и 1.8 раза и в сыворотке крови - в 1,2 раза. Введение вальдоксана животным с гипертиреозом приводило к повышению данного параметра и ткани печени в 1,5 раза, сердца - в 1.8 и 1,9 раза, в сыворотке крови - в 1,2 puta no сравнению со значениями при патологии. Данная тенденция прослеживалась и при расчете удельной активности АГ в различных тканях крыс.

Вероятно, нормализация активности АГ при введении мслатонин -корригирующих препаратов на фоне развития патологических процессов происходила вследствие снижения уровня СО и реконструкции желсзо-ссриого кластера дайною фермента.

ВЛИЯНИЕ МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ

К важнейшим компонентам АОС организма относятся ферменты СОД. каталаза, ГН. ГР и ГТ, в связи с чем было проведено исследование влияние мслакссна и вальдсксана на изменение активности этих антноксидантных ферментов. В условиях разни i им ЭГ имело место увеличение их акт ивност и по сравнению с контролем, что, по-видимому, является признаком функциональных изменений, вызванных избыточной генерацией CP »

увеличением биосинтеза антиоксидантных ферментов в

процессе развития окислительного стресса.

Под воздействием мелакссна и вальдоксана на фоне развития патологии в исследуемых дозах наблюдаюсь снижение активности каталазы и СОД в печени, сердце и сыворотке крови крыс по сравнению с животными с ЭГ. Гак. при дейсгвии мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг на фоне развития гипсртирсоза происходило уменьшение удельной активности СОД в печени в 1.3. а в сердце

1.2 раза по сравнению со второй группой животных (рис.3). Наблюдалась также тенденция изменения активности фермента в сыворотке крови в сторону нормы. При введен и > вальдоксана в лозах 5 и 10 мг/кг крысам с ЭГ отмечалось снижение данного параметра в печени в 1.2 раза, в сердце - в 1.3 и 1.2 раза, в сыворотке крови - в 1.2 раза относительно значений при гипертнреозе (рис. 3).

При введении мслатонин - корригирующих препаратов животным с ЭГ было отмечено также снижение активности каталазы в тканях и сыворотке крови крыс по сравнению с животными с патологией. Вероятно, наблюдаемые изменения активности СОД и каталазы под влиянием мелаксена и вальдоксана могут быть объяснены их воздействием на уровень и эффективность действия мслатонина в организме, который благодаря антиоксилантным свойствам, способен уменьшать степень протекания СО. и как следствие снижать фу нкциональную нагрузку ,,а С°Д и катал азу.

И'кша

1 2 14 5 6

Группы животных р

ис.З. Активность супероксиддисмутазы в печени . сердце И и сыворотке крови ■ крыс в норме (I), при патологии (2). при введении мелакссна в дозах 5 и 10 мг/кг на фоне гипсртирсоза (3,4). при введении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг при развитии патологии (5,6).

К важнейним компонентам ЛОС организма относят глутатионпероксидазную/ I лутатионредуктазную (ГП/ГР) систему, использующую для детоксиканин псроксидов восстановленный глутатион. При введении мелаксена на фоне развития тиреотоксикоза активность ГП и I Р. возрастающая при патологии в печени крыс, снижалась в 1,4 раза. Действие мелакссна в дозах 5 и 10 мг/кг в условиях гипсртирсоза сопровождалось уменьшением активности ГП и ГР в сердце, выраженной в [•/ г сырой массы, в

1.3 и 1,2 раза соответственно. При введении мелаксена и вальдоксана активность данных ферментов в сыворотке крови также изменялась в сторону контрольных значений. Изменения удельной активности ферментов сохраняли ту же тенденцию.

Установлено, что развитие ЭГ" сопровождалось увеличением

активности ГТ в печени в 1.9 раза, в сердце в 13 раза и в сыворотке крови крыс в 1,7 раза по сравнению с контрольным уровнем (рис.4). Таким образом, наблюдаемое изменение активности ГТ может быть защитной реакцией организма на чрезмерное образован«? ЛФК при интенсификации СО в процессе развития I ипертиреоза. Мри введении мслакссиа в дозах 5 и 10 мг/кг крысам с ЭГ было выявлено снижение активности ГТ в сыворотке крови в 1.2 раза (рис. 4). Активность ГТ в печени крыс, выраженная в Е на грамм сырой массы, при введении мслакссиа крысам с патологией снижалась в 1,3 и 1.6 раза. Активность ГТ в сердце, при воздействии мслакссиа падала на 14% и 17% (р<0,05) соответственно. При введении вальдоксана наблюдазась сходная тенденция изменения активности фермента в тканях и сыворотке крови крыс.

Мац

> г з » «

Г|»упп»1 жиео-иых

Рис.4. Активность глутатионтрансферазы. выраженная в виде Е на 1рамм сырой массы печени ссрлиа И. и Е на мл сыворотки крови Н крыс в норме (I). при экспериментальном гипертиреозе (2). при введении мслакссиа в дозах 5 и 10 мг/кг (3.4). при введении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг (5,6)

По - видимому, снижение активности ГП, ГР и ГТ пол действием мслакссиа и вальдоксана. в сторону контрольных значений, свидетельствует о реализации мслатонином антноксидантных свойств, благодаря которым он »ффсктивио взанмодсйствовуст со СР с образованием малотоксичных или нетоксичных, мегаболизнрусмых в организме соединений. Такой механизм его действия, приводит к снижению интсновности процессов СО. и как следствие, уменьшению функциональной нагрузки на I 11/1 Р - систему.

Регенерация (¡ЯП в холе ГР-реашии осуществляется при постоянном притоке в систему восстановительных эквивалентов, основными поставщиками которых в клетке являются лсгидрогсна:ы пентоэофосфатпого пути. В качестве

альтернативного источника МАОРИ рассматривают МЛОРИЛ'рсакцию.

Ранее было установлено, что при гипертиреозе активность Г6ФДГ в тканях крыс возрастает в большей мере, чем активность МАОР-ИДГ, что свидетельствует о большей функционазьиой нафуэкс на фермент пентозо фосфатного пути как поставщика МОРН для работы ГИ/ГР-систсмы. Внутрибрюнншнос введение мслатонии - корригирующих препаратов при развитии ЭГ приводило, к снижение активности 16ФДГ и ЫАОР-ИДГ в исследуемых тканях, относительно второй фуппы животных. По-видимому, снижение степени мобилизации ГР/ГП АОС. к которому приводит введение

мелаггонин - корригирующих препаратов, способствует торможению процессов СО. что проявляется и и уменьшении активности NADPH -генерирующих ферментов.

ЭКСПРЕССИЯ I ЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ, П1УТАТИОН11ЕРОКСИДАЗЫ, СУГ1ЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ И ДЕЙСТВИИ МЕЛАТОНИН- КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ На нервом этапе нами была успешно проведена экстракция тотальной РНК и) печени и сердца крысы с последующей обратной транскрипцией мРНК. В результат« была получена одноценочечная кД1 IK. Д|я амплификации учаегка гена в работе использовались праймеры, подобранные с помощью программы Geiiamics Expression. ПЦР - РВ проводили на приборе АПК - 32. С применением ПНР в реальном времени выявлено изменение степени экспрессии СОД, катал азы, ГП и ГР при ЭГ.

Таблица 2

Изменение уровня транскриптов генов ПI, ГР, СОД и каталазы в тканях крыс при ЭГ и действии мелаксена и вальлоксана на фоне патологии

Группы живошых да = а<п1)-С1 (GAPDH) ДО-СИГР)-Ct(GAPDH) д C«=а (со;о • CKGAPOH) да« а (Kaiaiaibi) - Cl (GAPDH)

Koiiipo.il. печень 7.91 ±0.37 7,94x0,39 8.87x0.42 8.64x0.39

01 печень 6.20x0.30* 6.:ЗОхО,15* 6.8x0,32* 7.13x0.34*

ЭГ + мелаксеи (5 mi/ki ) мснснь 7.6x0,33* 7.24x0,34* 7.49x0.35* 8.31x0.39*

ЭГ + вальлоксан (5 мг/м) печень 7,56x0.36* 7^6x0.31* 7.51x0.36* 8,51x0.37*

Контроль сердце 8.1x0.41 Ц42хО,38 8.92x0.41* 7.92x0.38

ЭГ сердце 6.60x0.32' 0.') 1x0.32« 7.26x0.34* 6.21x0.30*

ЭГ + мелаксеи (5 мг/кг)ссрлнс 7.6x0,38* 7J85xO,36* 8,42x0.41* 7,62x0.35*

ЭГ ♦ вальлоксан (5 мг/кг) печень 7.56x0.37' 7j66x0,37* 8.66x0.42* 7,43x0.36*

Примечание: * - отличия от нормы лоеюнонм (Р<0,05)

При введении мелатонин - корригирующих препаратов в дозе 5 мг/кг животным с ЭГ ир1>исходило уменьшение экспрессии генов СОД. каталазы. ГР и ГП по сравнению с уровнем при патологии (табл. 2). Вероятно изменения активностей СОД. каталазы. ГР и ГП могут быть связаны с увеличением скорости синтеза данных ферментов при патологии и ее уменьшением при введении мелаксена и вальдоксана, благодаря антиоксидантному действию использованных препаратов, снижающих степень мобилизации фермснюв АОС.

ВЛИЯНИЕ МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА НА СОДЕРЖАНИЕ НЕФЬРМЕНТАТИВНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ При введении мелаксена и вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг на фоне развития гипертиреоза в тканях животных отмечается снижение содержания цитрата по сравнению с данными при патологии. Введение мелаксена

приводило к уменьшению уровеня нитрата в сыворотке крови в 1,6 раза (р<0,05). в печени в 1.3 и 1.4 и в сердце - в 1.4 и 1.5 раза (р<0.05). Уменьшение лонного параметра наблюдалось н в тканях крыс, которым вводили вальдоксан но сравнению с группой с ЭГ (рис. 5). Изменение содержания цитрата в сторону нормы при введении мслатоннн - корригирующих препаратов, по-видимому. было связано со снижением стспсин выраженности окислительного cipccca.

UÜUUJU

® i : J J 5 6

1руппы животных

Рнс.5. Содержание интрига в печени . сердце и сыворотке крови И крыс в норме (I). при экспериментальном гипертиреоэе (2). при введении мслаксена в дозах 5 и 10 мг/кг (3.4). при введении вальдоксана п дозах 5 и 10 mi/кг (5.6).

Выявлено также увеличение содержания восстановленного глутатиона при введении мелакссна и вальдоксана на фоне развития ЭГ. Так. было показано, что воздействие мелакссна в дозах 5 и 10 мг/кг приводит к возрастанию содержания GSH: в 1.2 и 1,3 pata в печени, в 1.5 и 1.2 рам в сердце и в 1.3 раза в сыворотке крови крыс по сравнению с животными с патологией. Подобная тенденция наблюдается и при введении вальдоксана.

ВЛИЯНИЕ МЕЛАКСЕНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДИОРАДИКАЛЫ ЮГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБС ТРАТОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ВОЛЬНЫХ С СИНДРОМ ТИРЕОТОКСИКОЗА Согласно полученным данным, параметры БХЛ: S и характеризующие интенсивность СРП. возрастали при синдроме тиреотоксикоза в сыворотке крови по сравнению со значением нормы. Причем после проведения традиционного лечения происходило еще большее увеличение S и I™, (в 1.3 и 1.2 раза соответственно) и снижение величины tga; (в 1.2 раза) но сравнению со значениями при юреотоксикозс. что. очевидно, было связано с усилением генерации АФК при приеме анипиреоидных лекарственных препаратов. После проведения комбинированной терапии с мслакссном на фоне базисной терапии у 65 % больных наблюдалось увеличение S. но в меньшей степени, чем в группе, не получавшей мслаксен (на 8%). а у 35% больных даже наблюдалось снижение данного параметра на 25% по сравнению с результатами, полученными до лечения. Величина Imax у больных принимающих мслаксен также возрастала в меньшей степени - на 15%. по сравнению с данными до лечения. Показатель tget; в сыворотке крови увеличилась в 1.3 раза. Исходя из полученных данных, можно предположить.

что. нол действием мслакссна происходило снижение интенсивности генерации АФК, что сопровождалось снижением степени выраженности окислительного стресса

Данные об изменениях параметров ЬХЛ у больных, принимающих мслаксен, соотносятся с результатами оценки степени фрагментации ДИК лейкоцитов крови. Выявлено, что при развитии тиреотоксикоза наблюдалась фрагментация ДНК лейкоцитов крови больных. Причем полученные фрагменты ДНК образовывали характерную «апоптозную лестницу». После проведения стандартного лечения наблюдаюсь снижение степени фраг ментации ДНК. При исследовании образцов крови больных, принимавших мслаксен на фоне базисной терапии, апоитозная лестница в большинстве проб практически не визуализировалась, что может быть свидетельством антиаионтотнческога действия исследуемого препарата (рис.6).

Рис.6. Электрофора рамма прспарагов ДНК из лейкоцитов крови: I -маркеры молекулярной массы; 2 -контроль. 3 -больные с синдромом тиреотоксикоза до лечения; 4 - после стандартного лечения; 5.6 - при комбинированной терапии с мслакссном.

Установлено, что у больных, находящихся на традиционном лечении, активность АГ, снижающаяся при патологии в 1.2 раза, еще болынс умсньшатась. По - видимому, по было связано с тем. что в процессе биотрансформации ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ, при функционировании цитохрома Р - 450. часть активированных молекул не реагирует с субстратом, а освобождается из комплекса с ферментом с образованием CP (Буторова Л.И.. 2010). Это сопровождается инактивацией железо-серного кластера АГ. сопряженной с разборкой |4Fe-4S] кластера, карбонилироваиием и деградацией фермента. После приема пациентами мслакссна на фоне базисной терапии, активность АГ. выраженная в Г/мл сыворотки, увеличиваюсь в среднем на 19,4%. Удельная активность Al' повышалась на 23.7% по сравнению с соответствующими показателями до лечения. По-видимому, применение мелаксена обеспечиваю коррекцию уровня мслатонина в организме больных с синдромом тиреотоксикоза Известно, что гормон, проявляя своё антиоксидантное действие, приводит к детоксикации СР. что способствует уменьшению степени повреждения молекулы фермента и изменению активности АГ в сторону контроля.

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В СЫВОРТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ТИРЕОТОКСИКОЗА ПРИ ПРИЕМЕ МЕЛАКСЕНА После проведения стандартной терапии содержание глутатиона снижающееся при синдроме тиреотоксикоза, сиге больше натаю. Показано, что

после про веления терапии с чслаксеном наблюдалось повышение концентрации GSH в сыворотке крови по сравнению с его уровнем ло лечения на 15%.

Было установлено, что развитие тиреотоксикоза сопровождается увеличением активности ферментов П1/ГР системы. Пекле проведения стандартной терапии наблюдалось возрастание активностей ГП/ГР-систсмы по сравнению с данными до лечения. Яо второй группе пациентов после проведения базисной терапии, включающей мелаксеи. активности I II и ГР. выраженные в Е на мл. снижались на 34.9% и 43.4 % соответственно (рис.8). Удельные активности 1 11 и ГР уменьшались в 1.4 и 1.5 раза но сравнению с данными до лечения.

О.Э

V14

щ ■■Пи II

12 3 4 i

Группы год и е мт о О

I ill

I 3

Группы пациеиюп

Рис. 8. Активность глутатиоинероксилазы (А) и глутатионредукгаэы (Б), выраженная в Е/мл. в сыворотке крови в норме (I): у больных с тиреотоксикозом (2); при традиционном лечении (3): применении мелаксена на фоне стандартного лечения (4).

Установлено, что в 1-ой группе пациентов с тиреотоксикозом при поступлении в стационар наблюдается уменьшение активности Г6ФДГ, выраженной в Е на мл сыворотки, в го время как активность ЫАОР-ИДГ увеличивается по сравнению с контролем. После проведения базисной терапии, активности МОР-ИД! и I 6ФДГ, выраженные в Е на мл. увеличивались, по сравнению с результатами до лечения.

Но второй группе пациентов после проведения стандартной терапии включающей мелаксеи. активность Г6ФДГ, выраженная в Е на мл сыворотки, увеличивалась в 1.6 раза. Удельная активность Г6ФДГ увеличивалась на 52.9%. При проведении базисной терапии, включающей мелаксеи, происходило снижение активности МИР-ИД Г. выраженной в Е на мл сыворотки, в среднем на 15%, удельная активность уменьшалась на 23.4 % по сравнению с данными, полученными до лечения.

Следует подчеркнуть, что выявленные изменения активности ИАБР-НДГ имели такую же тенденцию, как и изменения активности ГП/Г'Р системы. Можно предполагать, что при данной патологии роль ЫЛПР-ИД! как поставщика МЛЭРН для глутатионовой АОС возрастает в связи с определенным торможением ГбФДГ-актявности.

Содержание цитрата в сыворотке крови у больных с синдромом тиреотоксикоза снижалась в 1.7 раза по сравнению с контролем. После проведения, традиционного лечения и комбинированной герапии с мелакссном

существенных изменений содержания цитрата выявлено не было. В данном случае не наблюдалось взаимосвязи между содержанием цитрата и активностью АГ, катализирующей его превращение до изоцитрата. Возможно, это связано с тем, что цитрат помимо превращений аконитазой, мог утилизироваться в других процессах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ряд данных имеющихся в литературе, свидетельствуют о том, что развитие тиреотоксикоза характеризуется усилением генерации АФК, интенсификацией ПОЛ (гагкоую М„ 2012). При этом наблюдаются структурно-функциональные повреждения биомембран, нуклеиновых кислот и белков, то есть важнейших компонентов клетки.

Согласно полученным нами результатам у крыс с ЭГ активированы процессы СО биосубстратов, что подтверждается возрастанием параметров биохемилюминесценции, повышением содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК, и увеличением уровня карбонильных групп модифицированных белков. Наряду с этим происходит мобилизация компонентов АОС.

При введении мелатонин - корригирующих препаратов происходило снижение параметров, отражающих интенсивность СРП. Так, при действии исследуемых препаратов на фоне развития ЭГ имело место снижение параметров БХЛ - Б, 1тах и в печени, сердце и сыворотке крови крыс. Антиоксидантный эффект мелаксена и вальдоксана подтверждается и изменением в сторону контроля уровня ДК при их введении животным с патологией. Следует отметить, что при воздействии исследуемых препаратов на фоне развития патологического состояния снижается также уровень окислительной модификации белков.

Установлено, что под воздействием мелатонин - корригирующих препаратов происходило снижение степени мобилизации компонентов АОС по сравнению с патологией, что может объясняться проявлением ими антиоксидантных свойств. Об этом свидетельствует уменьшение общего антиоксидантного потенциала, оцениваемого по значениям такого параметра БХЛ, как тангенс угла падения кинетической кривой Полученные данные подтверждаются и измерением активности отдельных компонентов АОС. При введении мелаксена и вальдоксана крысам с ЭГ наблюдалось снижение удельной активности СОД и каталазы в печени, сердце и сыворотке крови крыс. Воздействие мелатонин - корригирующих препаратов сопровождалось и сдвигом активности ГП, ГР и ГТ в сторону контрольных значений. Можно предположить, что мелаксен и вальдоксан, приводили к увеличению эффективности действия мелатонина, который способен эффективно обезвреживать СР, приводя к уменьшению степени протекания СО, и, тем самым снижая нагрузку на основные антиоксидантные звенья организма. В тканях экспериментальных животных с патологией, которым вводили мелаксен и вальдоксан, в большинстве случаев происходило возрастание концентрации восстановленного глутатиона по сравнению с группой с ЭГ. Полученные результаты согласуются с имеющимися литературными данными, что мелатонин увеличивает митохондриальной пул вБН и стимулирует активность

фермента, участвующего в синтезе глутатиона - гамма

глутамилцистеинсинтетазы, за счет которого может увеличиваться его содержание (Acuna - Castroviejo D., 2001).

В этих условиях отмечено также возрастание активности АГ, существенно снижающейся при патологии. При введении мелаксена и вальдоксана на фоне развития гипертиреоза было выявлено изменение концентрации цитрата в сторону контроля.

Положительное влияние мелаксена и вальдоксана на уровень СО в тканях крыс с ЭГ, послужило основой для продолжения исследования действия данных препаратов в условиях клиники. В этой связи, была осуществлена сравнительная характеристика ряда показателей состояния свободнорадикального гомеостаза у пациентов с тиреотоксикозом, находящихся на базовой терапии и комбинированном лечении с применением мелаксена.

Согласно результатам проведенного исследования, выявлено, что при комбинированной терапии с мелаксеном у больных с синдромом тиреотоксикоза происходит снижение интенсивности СО биомолекул, чего не наблюдается у пациентов получавших только антитиреоидные препараты. Об этом свидетельствовали показатели: параметры БХЛ, фрагментация ДНК, а также более высокая активность АГ в сыворотке крови больных.

При применении мелаксена на фоне базисной терапии больными с синдромом тиреотоксикоза происходило снижение активности ферментов глутатионового звена АОС, возрастающих при патологии. По-видимому, при терапии с мелаксеном имело место торможение СРП и снижение нагрузки на АОС, что и приводило к меньшей степени активации ее глутатионового звена.

Резюмируя данные, полученные в настоящей работе, можно сделать заключение о воздействии мелаксена и вальдоксана на содержание мелатонина и чувствительность его рецепторов, что приводило к проявлению гормоном антиоксидантных свойств,сопряженных непосредственно со способностью связывать СР. Это обеспечивало уменьшениеинтенсивности СО биосубстратов и, как следствие, снижение функциональной нагрузки на антиоксидантные звенья организма.Результаты исследования свидетельствуют о положительном воздействии мелатонин - корригирующих препаратов на состояние свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе и возможности их применения для коррекции патологического состояния.

ВЫВОДЫ

1. Введение мелаксена и вальдоксана на фоне ЭГ сопровождается снижением уровня СРП, что подтверждается уменьшением концентрации ДК, содержания карбонильных групп и параметров БХЛ - 8 и 1тах, в тканях экспериментальных животных.

2. Выявлено изменение активности СОД и каталазы при введении мелатонин - корригирующих препаратов экспериментальным животным в направлении контрольных значений, что может свидетельствовать о реализации антиоксидантного эффекта исследуемых препаратов, снижающего нагрузку на ферменты АОС.

3. При введении мелаксена и вальдоксана на фоне развития патологии в тканях печени, сердца и крови крыс отмечено изменение активности ферментов глутатионового звена АОС, а также ферментов, генерирующих КАЭРН, в сторону контрольных значений. Введение мелатонин -корригирующих препаратов на фоне развития гипертиреоза, по всей видимости, приводит к снижению интенсивности СО биосубстратов и, как следствие, снижению функциональной нагрузки на глутатионовое звено АОС и ферменты, поставляющие КАБРН, необходимый для ее работы.

4. При введении мелатонин - корригирующих препаратов экспериментальным животным на фоне развития патологии происходило увеличение содержание восстановленного глутатиона по сравнению с соответствующим показателем в группе крыс с ЭГ.

5. Установлено, что введение мелаксена и вальдоксана экспериментальным животным приводило к увеличению активности АГ, существенно снижающейся при развитии ЭГ, и изменению концентрации цитрата в сторону нормы. По-видимому, данные препараты оказывали влияние на эффективность действия мелатонина, как антиоксиданта, что приводило к уменьшению степени развития процессов СО биосубстратов, и к защите молекулы фермента от повреждения СР.

6. Комбинированная терапия с включением мелаксена приводила к существенному снижению параметров БХЛ, отражающих уровень СРП, в сыворотке крови пациентов с синдромом тиреотоксикоза, что свидетельствует о способности мелатонина проявлять антиоксидантное действие, обеспечивая снижение уровня генерации АФК.

7. Результаты исследования степени фрагментации ДНК свидетельствуют, что патологические изменения при синдроме тиреотоксикоза сопровождаются апоптотическими процессами. Коррекция содержания мелатонина в организме пациентов под действием мелаксена способствует снижению степени выраженности оксидативного стресса и уменьшению фрагментации ДНК.

8. При включении мелаксена в базисную терапию больных с синдромом тиреотоксикоза происходило снижение степени мобилизации АОС организма по сравнению с патологией. Так, активность ГП и ГР уменьшалась на 34,9% и 43,4% соответственно.

9. Выявлено возрастание активности АГ в сыворотке крови пациентов с синдромом тиреотоксикоза на 19,4% после проведения комбинированной терапии с мелаксеном, что, вероятно, связано с реконструкцией Fe-S кластера молекулы фермента, обеспечивающей изменение активности АГ в сторону контрольных значений.

10. На основании результатов исследования предложена гипотетическая схема регуляции свободнорадикального гомеостаза под воздействием мелаксена и вальдоксана.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Горбенко М.В. Активность аконитатгидратазы и содержание цитрата в крови больных с синдромом тиреотоксикоза при комбинированной терапии с мелаксеном / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, H.A. Текунова // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз Россия 2011". В двух томах. Том 2. - Воронеж, 2011. - С. 18-21.

2. Горбенко М.В. Активность глутатионпероксидазы и концентрации глутатиона в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза при комбинированной терапии с мелаксеном / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова // Материалы IV Международной научно -практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». - Ростов - на- Дону, 2011. - С. 86.

3. Душечкина О.Ю. Влияние мелаксена на параметры биохемилюминесценщш в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза / О.Ю. Душечкина, С.С. Попов, М.В. Горбенко, A.B. Великий, Н.В. Наумова, В.Н. Свариенко, Е.П. Чернышова, Г.Н. Купцова // Материалов IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология». - Курск, 2011. - С. 117-120.

4. Горбенко М.В., Активность глутатионовой антиоксидантной системы в сердце крыс при гипертиреозе и действии вальдоксана / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов, Е.В. Ситникова, A.C. Хамлова // Материалы V Международной научно-практической конференции «Современное состояние естественных и технических наук». - Москва, 2011. -С. 49-51

5. Горбенко М.В. Воздействие мелаксена на параметры биохемилюминесценции в тканях крыс при развитии экспериментального гипертиреоза / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов, Е.В. Ситникова, О.Ю. Утицких // Материалы III Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии». - Москва, 2012. - С.13-15.

6. Горбенко М.В. Влияние вачьдоксана на активность супероксиддисмутазы и катачазы в сыворотке крови крыс при развитии гипертиреоза / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Я.Г. Воронкова, A.C. Хамлова // Сборник материалов Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы химической науки и

образования», посвящённой 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева, В двух томах. Том 2. - Чебоксары, 2012. - С. 126-128.

7. Горбенко М.В. Влияние мелаксена на активность глутатионовой антноксидантной системы в сердце крыс при гипертиреозе / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова // Материалы XVIII Межгородской конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт - Петербург, 2012. - С.40-41.

8. Горбенко М.В. Активность аконитатгидратазы и содержание цитрата в тканях крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии мелаксена / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов, Е.В. Ситникова, A.C. Хамлова, Я.Г. Воронкова // Сборник научных статей Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Медико - биологические и педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и здорового образа жизни». - Воронеж, 2012. - С. 244-247.

9. Горбенко М.В. Влияние валъдоксана на параметры биохемилюминесценции в тканях крыс при развитии экспериментального гипертиреоза / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых «Симбиоз - Россия 2012». - Тверь, 2012.-С. 148-149.

10. Горбенко М.В., Активность аконитатгидратазы и содержание цитрата в сыворотке крови крыс с экспериментальным гипертиреозом при введении мелаксена / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова // Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященная 70-летию профессора A.A. Чумакова. - Ярославль, 2012. - С. 56.

И. Горбенко М.В. Активность супероксиддисмутазы и каталазы в тканях крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии вальдоксана / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова, A.C. Хамлова, О.Ю. Утицких // Сборник научных статей II Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Медико -биологические и педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и здорового образа жизни». - Воронеж, 2013. - С. 161-164.

12. Горбенко М.В. Влияние мелаксена на активность супероксиддисмутазы и каталазы в тканях крыс при развитии гипертиреозава / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова, A.C. Хамлова, // XIX межгородская конференция молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии -2013». - Санкт-Петербург, 2013. С 24-26.

13. Горбенко М.В. Активность глутатионовой антиоксидантной системы при действии мелаксена и вальдоксана на фоне гипертиреоза у крыс / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов // Биомедицинская химия. - 2013. - Т.59. - №5. - С. 541-548. (Gorbenko М. V. The Effect ofmelaxen and valdoxan on the activity of the glutathione antioxidant system in rats with experimental hyperthyroidism / M.V. Gorbenko, T.N. Popova, K.K. Shulgin, S.S.

Popov // Biochemistry ( Moscow) Supplement Series В : Biomedical Chemistry. - 2013. - Vol. 7, №1. - P. 27-31.

14. Горбенко M.B. Особенности функционирования глутатионовой антиоксидантной системы крови больных с синдромом тиреотоксикоза при комбинированной терапии с мелаксеном / М.В. Горбенко, С.С. Попов, К.К. Шульгин, Т.Н. Попова, О.Ю. Душечкина // Вестник Воронежского государственного университета Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2013. -№2. -С. 83-88.

15. Горбенко М.В. Влияние мелаксена и вальдоксана на активность глутатионовой антиоксидантной системы и НАДФН - генерирующих ферментов в сердце крыс при экспериментальном гипертиреозе / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. - № 10. - С. 12-15.

16. Горбенко М.В. Влияние мелаксена и вальдоксана на активность супероксиддисмутазы и катализы при экспериментшьном гипертиреозе / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - № 12. - С.5-7.

Статьи № 13, 14, 15,16 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Отпечатано в ООО «Копи-цснтр «Исток» Печать цифровая, с готового оригинал- макета. Заказ № 17464 от 20Л1.2013 г. Тираж 100 экз. Пр-т Революции, 58 Тел. 473 261-49-90 Н-таН: s_omk@iiiail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горбенко, Марина Владимировна, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «Воронежский государственный университет»

Па правах рукописи

04201454622

к/

Горбенко Марина Владимировна

ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИН - КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ -МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА, НА СВОБОДНОРАДИКАЛЫ1ЫЙ ГОМЕОСТАЗ ПРИ СИНДРОМЕ ТИРЕОТОКСИКОЗА

Специальноегь 03.01.04. - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Попова Т.Н.

Воронеж 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1.1. Щитовидная железа и тиреоидные гормоны 14

1.1.1. Физиологическая роль гормонов 15

1.1.2. Синтез, секреция и метаболизм тиреоидных гормонов 17

1.1.3. Транспорт тиреоидных гормонов 21

1.1.4. Синдром тиреоитоксикоза 23

1.1.5. Генерация активных форм кислорода

при тиреотоксикозе 26

1.2. Механизм образования и роль свободных радикалов 29

1.3. Система защиты организма от действия

активных форм кислорода 32

1.3.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы 33

1.3.1.1. Суиероксиддисмутаза и каталаза 34

1.3.1.2. Роль системы глутатиона в процессах

антиоксидантной защиты 37

1.3.1.3. Характеристика NADPH - генерирующих ферментов 42

1.3.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы 44

1.4. Мелатонин - корригирующие препараты 46

1.4.1. Мелатонин и эпифиз 49

1.4.2. Физиологические функции мелатонина 53

1.4.3. Антиоксидантная активность мелатонина 55

1.4.4. Применение мелатонина в качестве лечебного препарата

при различных заболеваниях 60

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 65

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 65

2.1. Объект исследования 65

2.2. Характеристика выборки больных с гипертиреозом 65

2.3. Методы исследования 66

2.3.1. Создание модели гипертиреоза у крыс 66

2.3.2. Подготовка материала для исследования 67

2.3.3. Измерение активности ферментов 68

2.3.3.1. Определение активности ферментов сопряженных с окислительно - восстановительными превращениями

ЫАО КАЭР 68

2.3.3.1.1. Определение активности глутатионпероксидазы 69

2.3.3.1.2. Определение активности глутатионредуктазы 69

2.3.3.1.3. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 69

2.3.3.1.4. Определение активности ИАОР - зависимой Изоцитратдегидрогеназы 70

2.3.3.2. Определение активности глутатионтрансферазы 70

2.3.3.3. Определение активности аконитатгидратазы 71

2.3.3.4. определение активности супсроксиддисмутазы 71

2.3.3.5. Определение активности каталазы 72

2.3.4. Определение содержания компонентов неферментативной антиоксидантной системы 73

2.3.4.1. Определение концентрации восстановленного глутатиона 73

2.3.4.2. Определение содержания цитрата 74

2.3.5. Оценка оксидативного статуса 75

2.3.5.1. Определение интенсивности биохсмилюмииесцепции 75

2.3.5.2. Определение содержания диеновых коныогатов 76

2.3.5.3. Оценка окислительной модификации белков 77

2.3.6. Унифицированный метод определения содержания

общего белка по биуретовой реакции 78

2.3.7. Определение степени фрагментации ДНК 80

2.3.8. Электрофорез ДНК 81

2.3.9. Определение уровня экспрессии генов 82 2.3.9.1. Выделение тотальной РНК 82

_

2.3.9.2. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция 83

2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных 84

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА НА ФОНЕ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ГИПЕРТИРЕОЗА 85

3.1. Интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях крыс

в условиях нормы, при гипертиреозе и действии мелакссна и вальдоксана 85

3.2. Влияние мелаксена и вальдоксана на активность супероксиддисмутазы и каталазы в различных тканях крыс при гипертиреозе 93

3.3. Влияние протекторов на активность глутатионового звена антиоксидантной системы в тканях крыс при гипертиреозе 98

3.4. Экспрессия глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы в тканях крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонин -корригирующих препаратов 106

3.5. Влияние мелаксена и вальдоксана на активность некоторых НАДФН-продуцирующих ферментов в тканях крыс при гипертиреозе 108

3.6. Влияние протекторов на активность аконитазы и содержание

цитрата в тканях крыс при гипертиреозе 112

ГЛАВА 4 ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕЛАКСЕНА НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ И

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ

СИСТЕМЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ТИРЕОТОКСИКОЗА 118

4.1. Влияние мелаксена на параметры биохемилюминесценции в

сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза 118

4.2. Оценка степени фрагментации ДНК в лейкоцитах крови больных с синдромом тиреотоксикоза при проведении стандартного лечения и комбинированной терапии с мелаксеном 120

4.3. Функционирование глутатионовой антиоксидантной системы в сыворотке крови больных с синдромом тирстоксикоза при проведении базисной терапии и приеме мелаксена 122

4.4. Влияние мелаксена на активность NADPH-генериругощих ферментов в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза 126

4.5. Активность аконитатгидратазы и уровень цитрата в сыворотке крови больных с синдромом тиретоксикоза при проведении базисной терапии и приеме мелаксена 129 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 132 ВЫВОДЫ 136 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 138 ПРИЛОЖЕНИЕ 163

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - аконитатгтдратаза

АО - антиоксидант

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

БХЛ - биохемилюминисценция

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГП - глутатиоппероксидаза

ГР - глутатиопредуктаза

ДК - диеновые коныогаты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖК - жирные кислоты

ИДГ - изоцитротдегидрогсназа

ОС - окислительный стресс

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

ПФП - пентозофосфатный путь

РНК - рибонуклеиновая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

СР - свободные радикалы

СО - свободнорадикалыюе окисление

Т3 - 3,5,3 -трийод-Ь-тиронин

Т4 - Ь-тироксин

ТГ - тиреоидные гормоны

ТРГ - тиреотропин-рилизииг гормон

ТСГ - тиронин-связывающий глобулин

ТСПА - Ь-тироксин -связывающий прсальбумин

ТТГ - тирсотрогшый гормон

ФАД - флавинадениндинуклеотид

цАМФ - циклический 3,5-аденозинмонофосфат

ЭДТА -этилендиамидтетраацетат

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Cys - цистеии

Glu - глутаминовая кислота

GSH - глутатион восстановленный

GSSH - глутатион окисленный

NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем современной медицины являются заболевания щитовидной железы. Синдром тиреотоксикоза, обусловленный гииерпродукцией гормонов щитовидной железы, относится к одной из часто встречаемых эндокринопатий. При данном заболевании из-за избытка тиреоидных гормонов (ТГ) происходят нарушения функционирования сердечно-сосудистой, пищеварительной, центральной нервной систем. Имеются данные, что ТГ в больших концентрациях индуцируют окислительный стресс в печени, сердце и скелетной мускулатуре крыс, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) и интенсификации пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [223]. Избыточная генерация свободных радикалов (СР) ведет к повреждению мембран, нарушению жизнедеятельности клеток и их апоптотической гибели [55]. При этом важную роль играет активация многоуровневой антиоксидантной системы (АОС) организма, включающей два звена: ферментативное и неферментативное. Очевидно, актуальной задачей является поиск лекарственных средств, способных влиять на процесс развития оксидативного стресса при тиреотоксикозе.

В настоящее время повышается интерес к исследованию биологически активных препаратов, способных активировать АОС и обладающих самих но себе антиоксидантными свойствами. В связи с этим приобретает значение исследование антиоксидантной активности мелаксена и вальдоксана. Мелаксен является препаратом, имеющим в своем составе мелатонин. Это адаптогенный препарат, синтезированный из аминокислот растительного происхождения. Известно, что мелатонин - нейрогормон, продуцируемый у человека и других позвоночных эпифизом, а также клетками диффузной эндокринной системы. Этот гормон играет роль регулятора многих физиологических функций: участвует в формировании суточных биоритмов,

торможении некоторых функций гипофиза, регуляции иммунных реакций, оказывает анальгезирующий и седативный эффекты. Мелатонин можно рассматривать как наиболее универсальный из биологических антиоксидантов, реализующий свою активность путем различных механизмов: гормон обладает выраженной способностью связывать СР, а также стимулировать определенные компоненты АОС [179,147]. Кроме того, существуют препараты с мелатонинергическим типом действия. К ним относится вальдоксан, действующим веществом которого является агомелатин. Он является мощным лигандом мелатониновых рецепторов, а также относится к антидепрессантам с инновационным механизмом действия [167]. Данные препараты применяются с профилактической и лечебной целью. Однако их влияние на свободнорадикальный гомеостаз при синдроме тиреотоксикоза остается невыясненным.

Цели и задачи исследования. Целыо настоящей работы было исследование воздействия мелатонин - корригирующих препаратов -мелаксена и вальдоксана, на свободнорадикальный гомеостаз при тиреотоксикозе в эксперименте на животных, а также при применении мелаксена на фойе базисного лечения пациентов в клинических условиях.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния мелаксена и вальдоксана на показатели, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) в печени, сердце и сыворотке крови крыс с экспериментальным гипертиреозом (ЭГ).

2. Оценка активности глутатионового звена АОС (активности глутатионредуктазы (ГР), глутатиониероксидазы (ГЦ), глутатионтрансферазы (ГТ) и уровня восстановленного глутатиона (ОБН)) и активности КАОРН-гснерирующих ферментов - глюкозо-6-фосфагдегидрогеназы (Г6ФДГ) и КАБР-изоцитратдегидрогеназы (КАЭР -ИДГ), при действии мелаксена и вальдоксана на фоне развития гипертиреоза;

3. Исследование действия мелаксена и вальдоксана на содержание цитрата и активность аконитатгидрагазы (АГ), являющейся критической мишенью действия АФК.

4. Изучение влияния мелаксена и вальдоксана на активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) при ЭГ у крыс.

5. Определение параметров биохемилюминесценции (БХЛ) и исследование фрагментации ДНК в сыворотке крови пациентов с тиреотоксикозом при проведении базисной терапии и комбинированного лечения с мелаксеном.

6. Изучение функционирования глутатионовой АОС при комбинированной терапии с мелаксеном на фоне развития тиреотоксикоза.

7. Оценка воздействия мелаксена на активности КАБРН - генерирующих ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и КАПР-изоцитратдегидрогеназы, при синдроме тиреотоксикоза.

8. Определение активности аконитазы и содержания цитрата в сыворотке крови больных с тиреотоксикозом после проведения традиционного лечения и комбинированной терапии, включающей мелаксен.

9. Создание гипотетической модели участия мелатонии - корригирующих препаратов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование воздействия мелатонин - корригирующих препаратов на интенсивность свободнорадикального окисления (СО) биомолекул, активности ферментативных и неферментативных компонентов АОС и ряда ферментов окислительного метаболизма, при гипертиреозе как в эксперименте на животных, так и у пациентов с синдромом тиреотоксикоза в клинических условиях. Установлено, что введение мелаксена и вальдоксана при ЭГ приводит к снижению интенсивности СРП и степени мобилизации ферментов АОС во все исследуемых тканях крыс. Показана эффективность применения для торможения развития окислительного стресса мелаксена на

фоне базисной терапии больных с синдромом тиреотоксикоза. Исследовано воздействие мелатонин - корригирующих препаратов на функционирование ферментов, генерирующих КАВРН, необходимого для работы глутатионовой АОС. Предложена гипотетическая схема участия мелатонин -корригирующих препаратов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом.

Практическая значимость. Результаты работы углубляют фундаментальные представления о путях реализации протекторного действия мелатонин - корригирующих веществ, обладающих антиоксидантным потенциалом. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в решение проблемы по выявлению нарушений метаболизма при тиреотоксикозе и способствуют поиску оптимальных путей их коррекции. Данные о позитивном воздействии мелатонин - корригирующих препаратов на свободнорадикальный гомеостаз в тканях млекопитающих свидетельствуют о возможности применения мелаксена и вальдоксана в антиоксидантной терапии при лечении тиреотоксикоза. Результаты исследований с использованием мелаксена в ходе лечения пациентов с тиреотоксикозом указывают на целесообразность применения антиоксидантной терапии при данной патологии.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Интеграция процессов обмена веществ в организме», «Свободнорадикальные процессы в биосистемах», спецкурсов но аналитической и клинической биохимии, этимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских диссертаций студентами Воронежского государственного университета.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз Россия 2011" (Воронеж, 2011), на IV международной научно -практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов - на - Дону, 2011), в материалах IV Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2011), в материалах XVIII, XIV межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт Петербург, 2011,2012,2013), на V Международной научно-практической конференции «Современное состояние естественных и технических наук» (Москва, 2011), на III Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2012), в материалах Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева (Чебоксары, 2012), на I и II Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием (Воронеж, 2012, 2013), в материалах V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых (Тверь, 2012), а также на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль, 2012)

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 16 публикациях, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Мслатонин - корригирующие препараты - мелаксен и вальдоксан, могут выступать в качестве протекторов при развитии оксидативного стресса при ЭГ.

2. Введение мелаксена и вальдоксана животным с ЭГ приводит к снижению степени мобилизации АОС и приближению ряда показателей антиоксидантной защиты к контрольным значениям.

3. Под воздействием мелатонин - корригирующих препаратов происходит изменение в сторону нормы активности ряда ферментов окислительного метаболизма, способных оказывать лимитирующие действие на интенсивность СО биосубстратов.

4. Включение мелаксена в базисное лечение приводит к существенному уменьшению параметров БХЛ, отражающих интенсивность СРП, и снижению степени мобилизации ряда ферментативных и неферментативных компонентов АОС в организме больных с тиреотоксикозом.

5. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема, отражающая воздействие мелатонин - корригирующих препаратов на свободнорадикальиый гомеостаз организма при тиреотоксикозе.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов (4 главы), заключения, выводов, списка литературы (232 источника). Иллюстративный материал включает 7 таблиц и 22 рисунка, а также 7 рисунков в приложении.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Щитовидная железа и тиреоидные гормоны

Щитовидная железа у взрослого чел�