цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов

Савина, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов"

На правах рукописи

САВИНА Татьяна Александровна

цАМФ- И Са2+/КАЛЬМОДУЛИН - ЗАВИСИМЫЕ СИСТЕМЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ НЕЙРОНАЛЬНЫХ БЕЖОВ КАК МИШЕНЬ ДЛЯ ДЕЙСТВИЯ АНТИКОНВУЛЬСАНТОВ 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине - 2005

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Научные руководители: кандидат биологических наук

Татьяна Георгиевна Щипакина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Александр Владимирович Куликов доктор медицинских наук, профессор Георгий Иванович Ковалев

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН,

г. Пущино

Защита диссертации состоится «19» октября 2005г. в _13_ часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН. По адресу 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН. Автореферат разослан « 19 » сентября 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, к.

кандидат физико-математических наук ф. Панина

ты

tmm

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Эпилепсия представляет собой большую группу клинических синдромов, в которой только 40% случаев заболевания поддается медикаментозному лечению (Карлов, 1990; Davies et al., 1996). Все применяемые в настоящее время противоэпилептические препараты по своему механизму действия являются скорее антисудорожными, чем антиэпилептическими, т.к. они не устраняют причин возникновения эпилептических синдромов, а направлены лишь на поддержание нейрохимического статуса, на фоне которого развитие судорог затруднено (Lfisher, 1998; Post, 2004). В отличие от ряда используемых антиконвульсантов, вальпроат натрия и эпифизарный гормон мелатонин являются антиконвульсаятами широкого спектра действия, нейрохимическими субстратами которых служат как ключевые звенья рецепторных комплексов (бензодиазепиновые, ГАМК- и глутаматергнческие рецепторы), так и рсгуляторных систем, патофизиология которых вовлечена в развитие i-и i гервозбудимости. Антиэпилептическое действие данных препаратов объясняется, главным образом, их влиянием на ГАМК-ергическую систему мозга (Смирнов, 2001; Wu et al., 1999; Johannessen, 2000), однако представляется вероятным, что их высокая эффективность при лечении различных типов эпилептических синдромов может также опосредоваться влиянием на универсальную систему внутриклеточной регуляции - систему вторичных посредников. Конечными эффекторами системы вторичных посредников являются протеинкиназы - ферменты, осуществляющие регуляцию большинства рецепторных и канальных белков, а так же белков цитоскелета посредством одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций - фосфорилированием. Са2+/кальмодулин- (CaMKII) и цАМФ- (РКА) зависимые протеинкиназы, а также Са2+/кальмодулин-активируемая протеипфосфатаза 2В (кальцинейрин), локализованные как пре-, так и постсинаптически, являются ключевыми ферментами взаимомодулирующих путей реализации действия двух важных внутриклеточных вторичных посредников - Са2+ и цАМФ. Общими субстратами указанных ферментов являются такие ключевые для функционирования нейронов белки, как синапсины, ассоциированный с микротрубочками белок 2 (МАР2, регулирует полимеризацию тубулиновых микротрубочек), субъединицы AMP А- и NMDA-рецепторов и др. (Sanchez et al., 2000; Валке et al., 2000). Однако, данные об участии систем фосфоршгировани я/дефосфоршшрования в механизмах инициации и поддержания гипервозбудимости нейронов, а также степень вовлечения этих систем в механизмы действия различных антиконвульсантов, в частности, мелатонина и вальпроата натрия, крайне немногочислены. Начиная с открытия Э.Сазерлендом регуляторного действия цАМФ (Sutherland, 1972), последующие исследования функционирования белков-эффекторов систем цАМФ- и Са2+/зависимого проведения сигнала показали, что различные пути вторичных посредников взаимомодулируют друг друга, образуя разветвленную регуляторную сеть, специфичность ответа которой определяется рецепторными комплексами, запускающими внутриклеточные каскады фосфорилирования /дефосфорилирования, набором и компартментализацией белков-эффекторов. Комплексный анализ изменений в системах цАМФ- и Са^/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков в мозге животных с наследственной предрасположенностью к судорогам, вызываемым звуком, несомненно позволит выявить механизмы, ответственные за генерацию и поддержание судорожной активности и р^ щщ^^ЖПГ^шосвязи между

библиотека 1

" ull' J*

антисудорожным действием мелатопина и вальпроата натрия и изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования иейрональных белков.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является изучение участия систем пАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования иейрональных белков в механизмах развития и поддержания судорожной активности, а также в реализации действия антиконвульсантов широкого спектра действия мелатонина и вальпроата натрия.

Конкретные задачи исследования:

1. Выявление особенностей функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования белков в мозге крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенпым судорогам по сравнению с нечувствительными к звуковому воздействию крысами Вистар;

2. Сравнительный анализ изменений систем фосфорилирования иейрональных белков в мозге крыс линии КМ после однократных аудиогенных судорог и после хронического звукового воздействия (аудиогенного киндлинга);

3. Исследование влияния мелатонина и вальпроата натрия на активности протеинкиназ СаМКИ и РКА in vitro-,

4. Анализ влияния однократного введения мелатонина и вальпроата натрия на исследуемые системы фосфорилирования и аудиогенные судороги крыс линии КМ;

5. Изучение действия хронического потребления мелатонина и вальпроата натрия крысами КМ на параметры судорог и динамику развития миоклонуса при аудиогенпом киндпинге;

6. Исследование отставленного действия введения мелатонина (50 мг/кг) крысятам КМ в критические для развития мозга периоды постнатального развития (1-7Р, 7-14Р и 14-21Р дни) на реализацию чувствительности к звуку в половозрелом возрасте, а также на системы цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования иейрональных белков и состояние синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.

Научная новизна.

В представленной работе впервые показано, что у животных с наследственной предрасположенностью к судорогам в различных структурах мозга, вовлеченных в реализацию судорожной активности, существует генетически детерминированное изменение содержания Са2+/кальмодулин-регулируемых ферментов - протеинкиназы СаМКП и протеинфосфатазы калыщнейрина, что может являться одним из механизмов, участвующих в формировании нейрональной гипервозбудимости. Показано, что даже однократное судорожное воздействие вызывает долговременные изменения содержания а-субъединицы CaMKII и калыщнейрина в отдельных структурах мозга крыс КМ. Выявлено антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия на различные типы аудиогенных припадков, а также потенпиирующее действие мелатонина на антисудорожную активность вальпроата натрия при совместном применении антиконвульсантов. Впервые продемонстрировано, что антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия при однократном введении сопровождается изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования иейрональных белков. Показано, что применение мелатощша на ранних стадиях постнатального развития может оказывать как

анти-, так и просудорожное отставленное действие в зависимости 01 постнатальных сроков введения препарата, сопровождающееся изменениями исследуемых систем фосфорилирования и морфологическими модификациями синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гилпокампа, что предполагает более осторожный выбор антисудорожной терапии при лечении ювснильных эпилептических синдромов.

Научно-практическое значение.

Результаты, полученные в данной работе указывают на вовлечение систем фосфорилирования/дефосфорилирования нейрональных белков и белков цитоскелета в механизмы предрасположенности и реализации судорожпых состояний и намечают подходы к разработке нового класса антиэпилептических препаратов, мишенью которых является система вторичных посредников.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на заседании секции "Межклеточные взаимодействия. Нейронаука" ученого совета ИТЭБ РАН (Пущино, 2005), на конференции "Цитоскелет и клеточная регуляция" (Пущино, 2000), на И конференции украинского общества нейронаук (Донецк, 2001), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 8-й конференции "Стресс и поведение" (Санкт-Петербург, 2004), на конференции Российского нейрохимического общества (Москва, 2005), а также в материалах других конференций.

Публикации.

По материалам работы опубликовано 6 статей в рецензируемых отечественных и иностранных журналах, а также 15 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты и обсуждение", "Заключение", "Выводы",

"Список цитируемой литературы". Диссертация изложена на_страницах машинописного

текста, содержит_рисунков,_таблиц и списка литературы из_ссылок.

Материалы и методы исследования

Экспериментальные животные. Работа выполнена на крысах самцах стока Вистар (п=7, возраст 3 месяца)(ИТЭБ РАН, г.Пущино) и крысах самцах линии Крушинского-Молодкиной различных возрастов (КМ, п=263), полученных из Лаборатории физиологии и генетики поведения биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова (г.Москва). Все серии экспериментов, кроме исследований с введением мелатонина в различные сроки посгнатального развития, выполнены на крысах линии КМ 3-х месячного возраста. Животных содержали в стандартных условиях с 12ч: 12ч световым режимом и свободным доступом к пище и воде.

Оценка аудиогенной судорожной активности крыс линии КМ. Аудиогенный киндлинг (АК). Крыс линии КМ 3-х месячного возраста подвергали однократному звуковому воздействию интенсивностью 100дБ и частотой 12-15кГц (аудиогенные судороги - АС) или аудиогенному киндлингу (20 экспозиций звуком, 1 раз в день, 6 дней в неделю) до появления миоклонуса (синхронные тикоподобные подергивания лицевой мускулатуры и конечностей). Животных брали в эксперимент через 2 суток после окончания АК. Известно, что развитие миоклонуса при аудиогенном киндлинге сопровождается появлением

спонтанной энилептиформной активности в коре и структурах лимбической системы (Семиохина и др. 1992). Оценивали тяжесть судорог (в баллах), латентность возникновения двигательного возбуждения от начала действия звуком (с), а также динамику формирования устойчивых миоклонических судорог при аудиогенном клндлинге. Тяжесть судорожного припадка оценивали в баллах по условной шкале: О-отсутствие реакции на звук в течение 90 с; 1-двигательное возбуждение, характеризующееся бегом и прыжками без судорог; 2-падение животного на брюшко и начало клонических судорог; 3-клонический судороги передних и задних конечностей на боку; 4-тонус передних конечностей с клопическими судорогами задних конечностей; 5-тонус передних н задних конечностей с жесткой ригидностью тела животного.

Введение вальпроата натрия и мелатонина крысам линии КМ различных экспериментальных групп. Мелатонин растворяли в этиловом спирте-ректификате, доводили до концентрации 10 мг/мл физраствором (конечное соотношение этанол: физраствор составляло 1:9), вальпроат натрия - в физрастворе до концентрации 50 мг/мл. Свежеприготовленный раствор мелатонина или вальпроата натрия 3-х месячным крысам линии КМ вводили внугрибрюшинно. Контрольным группам животных вводился соответственно или физраствор с 10% спиртом или физраствор. Введение мелатонина крысятам линии КМ в различные сроки постнатального развития осуществляли подкожно в область холки в дозе 50 мг/кг между 10-11ч, 1 раз в день.

In vitro фосфорилирование белков мозга. Реакцию фосфорилирования проводили в объеме 50 мкл, содержащем 50 мкг белка как описано (Yechikhov et al., 2000; Безгина и др., 2003) в присутствие ингибиторов протеаз (0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида, ЮмкМ бензамидииа, 1 ООнг/мл апротинина и 100нг/мл леупептина), 10мМ MgCb, 20мкМ АТФ (ЗмкКи у[32Р]АТФ /пробу) и ЮОмкМ цАМФ в случае цАМФ-зависимого фосфорилирования или 1 ОмМ MgClz, 0,ЗмкМ кальмодулина, 50мкМ АТФ и 2,5мМ СаСЬ для Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования. Фосфопротеины образцов разделяли в градиенте 6-12% ДДС-ПААГ с последующей авторадиографией гелей на пленке Kodak X-OMAT/AR5. Включение 32Р в белковую полосу, соответствующую белку МАР2 оценивали с помощью денситометрии радиоавтографов. Рис.1

а б в Типичное разделение

МАР2 МАР2 белков гомогенатов

270 Kfla | м» —^ — — — — - мозга в градиенте

6-12% ДДС-ПААГ после in vitro

КДЗ ^ фосфорилирования в

** присутствии

. СсР+/калъмодулина:

В В В а- окраска Кумасси R-

116 tffr t 250,6 -радиоавтограф

■ i с геля, в -

97 Ща * II иммунноблот белков

84 Тп» ' "' после разделения

— • ШШш Ка/,ЬЦИНВЙРИНА Слева от геля

66 цДа _ —* показаны белки-

55 кДа

45 кДа

J 5 ' * В маркеры, к которым 55кца леев —--- добавлен МАР2.

* _

ZI2I ' ^WW CaMKl!

Измерение активностей протеинкиназ РКА и CaMKII проводили с использованием специфических пептидных субстратов кемптида и синтида-2 соответственно (Fukunaga et al., 1993) в общем объеме 25 мкл (2 мкг белка) в присутствии вышеперечисленных ингибиторов протеаз, а также ЮмМ MgCl2, 120мкМ АТФ (1,4мкКи у[32Р]АТФ /пробу), ЮОмкМ цАМФ и ЮОмкМ кемптида для определения активности РКА или 10мМ MgCl, ЮОмкМ АТФ (1,4мкКи у[32Р]АТФ /пробу), 2,5мМ СаС12 и 0,ЗмкМ кальмодулина для определения общей активности СаМКП Определение Са27кальмодулин-независимой (функциональной) активности CaMKII проводили в присутствии 1мМ ЭГТА. Активности РКА и СаМКП полностью подавлялись 5мкМ амида фрагмента 6-22 белкового ингибитора РКА и IOmkM KN-62 (специфического ингибитора СаМКП) соответственно. Включение 32Р в кемптид определяли по методу Черепкова, используя жидкостной сцинциляционный счетчик "Beckman LS-650" (Beckman Instruments, Fillerton, CA). Активность РКА и СаМКП выражалась как количество пкмоль 32Р, включенных в кемптид или синтид-2 за мин на 1 мкг белка (Zheng et al., 2003).

Оценка содержания а-СаМКП, кальцинейрина и МАР2 с помощью иммунноблотинга. Аликвоты гомогената, разделяли в градиенте 6-12% ДЦС-ПААГ. Перенос белков из геля на нитроцеллтолозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм осуществляли на аппарате для полусухого переноса производства фирмы "Sigma-Aldrich" (США), используя буфер, содержащий 47,9мМ Tris рН 9,2; 38,6мМ глицина; 20% метанола, 0,0375% ДДС (Bjerrum and Schafer-Nelsen, 1986). Содержание белков в образцах оценивали по интенсивности цветной реакции на пероксидазу. В работе использовались следующие первичные моноклональные антитела: против МАР2 (IgG мыши, клон НМ2, разведение 1:500), против каталитической субъединицы кальцинейрина A (IgG мыши, клон С1956, разведение 1:5000) или против а-СаМКП (IgG мыши, клон С265, разведение 1:3000).

Электронно-микроскопические исследования выполнены с использованием методики прицельного совмещенного гистологического и электронно-микроскопического исследования (Мошков, 1985). Морфометрию проводили на электронно-микроскопических фотографиях (увеличение 91000), сделанных с ультратонких продольных срезов поля САЗ гиштокампа после контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца на электронном микроскопе "Tesla BS-500", используя для этого проекционный увеличитель "Microphoto". На продольных срезах оценивали количество тубулиновых микротрубочек на отрезке длиной 1,1 мкм, проведенном перпендикулярно к продольной оси дендрита (на 1,1 мкм при увеличении 91000 соответствует 10 см), общую длину синаптических контактов, число и длину активных зон, а также число и длину десмосомо-подобных контактов.

Статистическая обработка результатов исследований. Статистическая обработка данных проводилась с помощью статистического пакета Microsoft Exel и программы "Statistica". Достоверность полученных результатов оценивали методом однофакгорного дисперсионного анализа и по t-критерию Стьюдента. Для анализа достоверности различий между несколькими группами был использован дисперсионный анализ с методом множественных сравнений Шеффе (post hoc) или критерий Ньюмана- Кейлса. Для оценки достоверности различий между группами при электронно-микроскопических исследованиях использовали критерий Различия между группами считали достоверными при р<0,05. Все данные в работе представлены как среднее + стандартная ошибка среднего.

Результаты работы и обсуждение

1. Исследование систем Са2*/кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ и крыс Вистар. Полученные нами результаты свидетельствуют о модификациях исследуемых систем фосфорилирования в различных структурах мозга крыс линии КМ по сравнению с Вистар. Так, активность РКА в неокортексе (Нк) и гишюкампе (Гк) крыс КМ не отличалась от Вистар, но была повышена в нижних буграх четверохолмия (н.б.ч.), что может свидетельствовать об увеличении содержания РКА в этой структуре мозга крыс КМ (Табл.1). В настоящее время доказано участие РКА как в пре-, так и постсинапти ческих механизмах долговременной потенциации и депрессии (Kameyama et al., 1998; Yan-You and Kandel., 1998), однако роль РКА в механизмах эпилептогенеза остается не яспой. Общая активность СаМКП (может служить показателем уровня фермента) в исследуемых структурах мозга КМ и Вистар не различалась, однако функциональная активность протеинкиназы в Нк и н.б.ч. крыс линии КМ была достоверно выше, чем в соответствующих структурах мозга крыс Вистар (Табл.1).

Таблица 1. Активности протеинкиназ СаМКП и РКА, а также цАМФ- и Ca2*/каяьмодулин-зависимое фосфорилирование белка МАР2 в различных структурах мозга крыс Вистар(п=7) и крыс линии КМ (п-7). Различия между группами Вистар и КМ достоверны при *р<0,05 и **р<0,01.

В зависимости от частоты и амплитуды Са2+ сигнала, поступающего в нейроны, СаМКП активируется комплексом Са2+/кальмодулин, который, связываясь с протеинкиназой, устраняет действие автоингибиторного домена фермента, вызывает автофосфорилирование протеинкиназы по Thta6nx> (для a/ß-субъединиц) и переводит фермент в Саг+/кальмодулин-независимую активную форму (Bayer and Shulman, 2001; Hudmon and Shulman, 2002). По данным литературы, увеличение доли функционально активной протеинкиназы от общего пула фермента характерно для структур мозга, предрасположенных к эпилептогенезу (Churn et al., 1991; Blair et al., 1999). Критической структурой для инициации АС считается центральное ядро н.б.ч. среднего мозга (Chakravarty and Faingold, 1997; Ross and Coleman, 2000). Т.о., повышенная функциональная активность CaMKII в Нк и н.б.ч. крыс линии КМ может свидетельствовать, о высокой степени предрасположенности к развитию нейрональной гипервозбудимости в этих структурах мозга.

Стр-ра мозга_|_Вистар_|_КМ_

Активность протеинкиназ, включение пкмоль 32Р/мин-мкг белка

Функциональная активность СаМКП

н.б.ч. 2,93±0,15 3,56±0,16 **

гиппокамп 3,71±0,15 4,02±0,38

неокортекс 3,85±0,11 4,90±0JS *

Активность цАМФ-зависимой протеинкиназы

н.б.ч. 8,32±0,76 11,1 Ш,79 **

гиппокамп 10,78±0,45 10,14±0,66

неокортекс 16,07±1,46 15,27±0,37

In vitro фосфорилирование МАР2 (значения Аля Вистар взяты за 100%)

Саг*/калъмодулин-зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,00*9,95 92,89±12,44

неокортекс 100,00± 10,57 106,75±15,97

цАМФ-зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,(ХШ5,89 127,48±15,12

неокортекс 100,00±8,48 74,02±4,62 *

Методом иммунноблота показано, что в Нк, но не в Гк, крыс линии КМ содержание субъединиц а-СаМКП достоверно ниже, чем у Вистар (в н.б.ч. анализ содержания белков не проводился) (Рис.2,а). Установлено, что в различных структурах мозга состав холоэнзимов СаМКП различен, например, в лобных долях коры мозга крыс соотношение a/ß-субъединиц составляет 3:1 (Hunson and Shulman, 1992). Вероятно, в Нк крыс линии КМ может быть изменено соотношение нейроспецифических а- и ß-субъединиц СаМКП в сторону преобладания последних, отличающихся по кинетике активации и взаимодействию с некоторыми белками цитоскеяета и поетеияаптических уплотнений (F-акгином, PSD-95) (De Köninck and Shulman, 1998; Bayer and Schulman, 2001). При экспериментальной эпилепсии также описано увеличение экспрессии ß-СаМКП в гиппокампе (Morimoto et al., 1997).

Известно, что соматодендритный, нейроспецифический фосфопротеин МАР2 является in vivo субстратом как РКА, так и СаМКП (всего до 46 моль фосфата/моль белка), однако

^ 1601 а !□ Виспр| б «-160, e

1 но" пщ s я 15я" т м40 •

5 120. * ЯКМ I | 20 • <120 ■

1 S8: 1 ! »KS: f 1 IS: 1 | I »8- ^ . Ш \ Ш , \ Ш 11,11 ,

I Нк Гк Нк Гк » Нк Гк

Рис.2.

Содержание a-CaMKJl (а), кальцинейрина А (б) и МАР2 (в) в неокортексе и гиппокампе крыс Вистар (п=7) и крыс линии КМ (п=7). Значения для Вистар взяты за 100%. Различия между группами достоверны при *р<0,05 и **р<0,01.

его фосфорилирование СаМКП ингибирует полимеризацию тубулиновых микротрубочек цитоскелета и их взаимодействие с нейрофиламептами, в то время как цАМФ-зависимое фосфорилировапие приводит к снижению связывания МАР2 с актином и тубулином, ингибированию нуклеации мономеров тубулина (Yamauchi and Fujisawa, 1988; Sanchez et al., 2000), а также защищает MAP2 от протеолиза кальпаином (Johnson and Foley, 1993; Alexa et al., 1996). Как видно из Рис.2, содержание МАР2 в Нк крыс линии КМ снижено по сравнению с Вистар, при этом цАМФ-зависимое фосфорилирование МАР2 также снижено, изменений в Са^/кальмодулин-зависимом фосфорилировании МАР2 в Нк крыс КМ не обнаружено (Табл.1). Последнее наблюдение можно объяснить перераспределением СаМКП между цитозолем и компартментом микротрубочек в сторону увеличения пула СаМКП, заякоренных на МАР2. Калышнейрин дефосфорилирует МАР2 по сайтам, специфическим как для РКА, так и СаМКП (Goto et al., 1985; Sanchez et al., 2000). Содержание кальцинейрина в Нк КМ и Вистар не различалось, но в Гк крыс КМ было снижено (Рис.2,б). Т.о., полученные результаты свидетельствуют о количественных (содержание белков) и качественных (фосфосостояние) изменениях функционирования системы протеинкияазы-МАР2-протеинфосфатазы в Нк крыс линии КМ.

Суммируя полученные результаты относительно особенностей функционирования Са2+/кальмодулин- и цАМФ-зависимых систем фосфорилирования в отдельных структурах мозга крыс лилии КМ, можно предположить, что выявленные модификации (изменение содержания и фосфосостояния МАР2 в Нк, увеличение функциональной активности СаМКП в н б.ч. и Нк и активности РКА в н б ч , снижение содержания кальцинейрина в Гк) являются

составляющими особого нейрохимического статуса, ответственного за инициацию и распрос гранение судорожной активности в мозге животных. генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам. Подтверждением этого предположения могут служить приведенные ниже данные о дополнительной модификации указанных систем фосфорилирования при однократных судорогах и при аудиогенном киндлинге.

2. Исследование С^/кальмодулин — и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ через 2 суток после однократного звукового воздействия и после АК. Крыс линии КМ подвергали однократному звуковому воздействию (КМ после АС) или АК. При однократных АС тяжесть припадков крыс КМ составляла 4,80±0,13 балла, латентный период стадии "1" - 1,80±0,07с. Устойчивый миоклонус при АК (группа АКМ) развивался, в среднем, на 15 день звукового воздействия. В то время как общая активность СаМКП и активность РКА в исследуемых структурах мозга крыс КМ не изменялись ни после однократных АС, ни после АК, функциональная активность СаМКП увеличивалась в Нк и снижалась в н.б.ч. крыс группы АКМ (Табл.2.) Однако, более значительные изменения наблюдались в содержании а-СаМКИ и кальцинейрина (Рис.3).

Таблица 2.

Активности протеткиназ СаМКП и РКА в различных структурах мозга крыс линии КМ (п-7), КМ через 2 суток после АС (п~7) и после АК-группа АКМ (п~ 10)

| Стр-ра мозга | КМ | КМ после АС | АКМ

Активность протеинкиназ, включение пкмоль 32Р/мин-мкг белка

Функциональная активность СаМКП

н.б.ч. 3,56±0,16 3,16±0Д6 2,73±0,18 **

гиппокамп 4,02±0,38 4,21 ±0,36 3,75±0,08

неокортекс _ 4,90±0,35 4,70±0,26 6.14Щ36 *

Активность цАМФ-зависимой протеинкиназы

н.б.ч. 11,10±0,79 11,77*0,43 11,66±1,74

гиппокамп 10,14±0,66 9,23±0,50 10,59±0,71

пеокортекс 15,27±0,37 15,35±1,06 15,48±1,36

Различия между группами по сравнению с КМ достоверны при *p<0,0S и **р<0,01

Уровень a-CaMKII в Нк крыс КМ через 2 суток после АС достоверно увеличивался по сравнению с интактными КМ и оставался повышенным и после АК. После АС содержание а-CAMKII в Гк крыс КМ также достоверно выше, чем у ингактной группы, не подвергавшейся звуковому воздействию, но после АК снижалось до исходного уровня у КМ. Показано, что увеличение нейрональной возбудимости, наблюдаемое после амигдалярного киндлинга, приводит к снижению активности и содержания СаМКП в гшшокампе (Perlin et al., 1992; Post, 2004). Интересным представляется отсутствие различий общей активности тротеинкиназы на фоне изменения се содержания в Нк и Гк после АС. Объяснением может ;лужигь или различная чувствительность применяемых методов или дальнейшее изменение »отношения различных субъединиц фермента на фоне судорожной активности, триводящее, в итоге, к отсутствию различий общей активности СаМКП. Значительно ювышенное после АС содержание кальцинейрина в Гк КМ после АК также снижалось.

Различий в содержании кальцинейрина в Нк между всеми 3-я экспериментальными

группами крыс не выявлено. &

§ 160

Рис. 3.

Содержание а-САМКПи кальцинейрина А в неокортексе и гиппокампе крыс КМ (п=7), КМ через 2 суток после АС (п=7) (а, б) и после АК (п=10) (в,г). Значениядля КМ взяты за 100%. Различия между группами достоверны при *р<0,05 и**р<0,01.

Достоверных изменений в цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимом фосфорилировании белка МАР2 in vitro в Нк и Гк крыс КМ после однократных АС не наблюдалось (ТаблД), однако после АК цАМФ-зависимое фосфорилирование МАР2 in vitro сильно увеличивалось в Нк и Гк крыс ipyimu АКМ, Са2+/кальмодулин-зависимое фосфорилирование МАР2 в Нк также значительно увеличивалось по сравнению с исходным у КМ. Т.к. различий в содержании МАР2 в Нк и Гк крыс всех экспериментальных груш не обнаружено (данные не приведены), полученные результаты свидетельствуют об увеличении числа доступных для протеинкиназ сайтов на молекуле МАР2 in vitro (т.е. снижении фосфосостояния МАР2 in vivo) в Нк и Гк крыс КМ после АК, что, несомненно, может привести к значительному сдвигу равновесия процессов сборки/разборки тубулиновых микротрубочек в сторону их повышенной полимеризации и значительной реорганизации всего цитоскелета дендритов и сомы нейронов. Такое выраженное дефосфорилирование МАР2 in vivo по сайтам, фосфоршшрусмым СаМКП и РКА в Нк и Гк после аудиогенного киндлинга можно объяснить изменением компартментализации ферменюв, например, снижением содержания заякоренной на микротрубочках СаМКП (в Нк) или РКА (в Гк) при неизменном уровне связанного с микротрубочками кальцинейрина.

Таблица 3.

цАМФ- и Са2~/кальмодулип-зависимое фосфорилирование МАР2 в Нк и Гк крыс линии КМ (п~7), КМ через 2 суток после АС (п=7) и после АК (п=10).

Стр-ра мозга КМ КМ после АС КМ АКМ

Са2+/капшодулин- зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,00±12,11 82,38±5,00 100,00±11,30 97,37±10,96

неокортекс 100,00±13,79 78,81±12,56 100,00±16,16 200,16±21,58 **

цАМФ-зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,00±11,33 126,85±27,79 100,00±5,19 271¿3±22,97 **

неокортекс 100,00±5,51 96,98±13,79 100,00±6,28 Ш,73±14,74 **

Значения для группы КМ взяты за 100 %. Различия между группами по сравнению с КМ

достоверны при *р<0,05 и **р<0,01

Известно, что даже однократные, не приводящие в дальнейшем к стойкой патологии судороги, в том числе и АС, вызывают индукцию синтеза продуктов генов раннего ответа (Pozas et al., 1997; Eclls et al., 2004; Post, 2004). Мы предполагаем, что выявленное нами увеличение содержание a-CaMKII и кальцинейрина через 2 суток после однократной АС является именно следствием судорожной активности, в то время как изменения после АК, вероятно, отражают сложное взаимодействие прогрессии эпилепгогенеза и антагонистичных ему эндогенных адаптивных перестроек, направленных на снижение возбудимости нейронов в мозге КМ. Изменение степени фосфорилирования МАР2 в Гк и Нк крыс линии КМ после АК, вероятно, может также выступать как эндогенная «противосудорожная» адартация, направленная на снижение возбудимости нейронов. Полученные нами результаты показывают, что и однократные АС, и АК вызывают долговременные изменения в исследуемых нами системах фосфорилирования нейрональных белков, а также подтвержают существующее в настоящее время мнение о том, что пластические изменения, наблюдающиеся в различных структурах мозга животных с установившейся эпилептиформной активностью и изменения, происходящие в нервной ткани после однократной судороги имеют различные механизмы.

3. Исследование действия мелатонина и вальпроата натрия на активность САМКИ и РКА. Реакция начиналась добавлением антиконвульсанта, активаторов CaMKII и РКА (Са2+/кальмодулина или цАМФ, соответственно), пептидного субстрата и комплекса Mg^/АТФ в указанной последовательности. Контрольное значение активности протеинкиназ для различных концентраций мелатонина измерялось в присутствии 2% этанола в пробе. Т.к. оба антиконвульсанта переносятся транспортными белками крови, в частности, альбумином, все исследования их действия на активность протеинкиназ проводились в отсутствие БСА в реакционной среде, а также без Тритона Х-100 и фенилметилсульфонилфторида, растворителем которого служит изопропиловый спирт для предотвращения неспецифического взаимодействия. И мелатонин, и вальпроат натрия ингибировали общую, но не Са2+'кальмодулин-нсзависимую активность CaMKII Так, общая активность CaMKII в присутствии 10"5М мелатонина составляла 67% oí исходного уровня, при 10"3М - 44%, вальпроат натрия уже в концентрации 10"9М снижал общую активность CaMKII до 70% от контроля, а в концентрации 10_3M до 41% (Рис.4,а).

120

2о . —О— вальлроат _натрия

— --§

-S

О I I-1-г

К 10"9 10* 10"7 J о"6 10'S 1<И 10"

.-7

,-5

к ю"7 ю"6 ю"5 ю"4 ю"3

концентрация вещества, М

Рис.4.

Влияние мелатонта и вальпроата натрия на общую активность СаМКП (а) и РКА (б) in vitro Контрольное значение активностей протеинкиназ (К) без мелатонина и вальпроата натрия взято за 100%. Различия между группами по сравнению с контролем достоверны при *р<0,05 и **р<0,01.

Известно, что мелатонин является антагонистом кальмодулина и связывается с гидрофобным участком его молекулы через 5-метокси группу, препятствуя взаимодействию кальмодулина с его белками-акцепторами, в частности, с СаМКП (Benitez-King et al., 1993; Benitez-King et al., 1996). Более сложно объяснить ингибирование мелатонином в высоких концентрациях №5М-10'3М активности РКА (Рис.4,б). Вероятно в данном случае имеет место так называемое непродуктивное связывание вещества с протеинкиназой, "характерное для ферментов, субстратами которых являются биополимеры и являющееся частным случаем конкурентного ингибирования с образованием непродуктивных комплексов, не способных к каталитическому распаду (Корниш-Боуден, 1979).

Анализ кинетических параметров реакции ингибирования активности СаМКП вальпроатом натрия в присутствии различных концентраций кальмодулина и АТФ показал конкурентный характер ингибирования активности протеинкиназы по связыванию с кальмодулином. Все значения кажущихся Km и Vmax были рассчитаны из экспериментальных данных по уравнениям, предложенным Йоханссном и Ламри (Корниш-Боуден, 1979). Установлено, что полумаксимальное включение 32Р в синтид-2 наблюдалась в присутствии 0,037 мкМ кальмодулина в реакционной среде, Ушах реакции составляла 0,972 нмоль32Р/мин, константа ингибирования Ki для вальпроата натрия составляла 35 мкМ. Для нахождения Ki были независимо использованы метод наименьших квадратов и графический метод определения Ki из прямого линейного графика зависимости отношения Km/Vmax от концентрации ингибитора, предложенный Эйзенталем и Корниш-Боуденом. В присутствии различных концентраций АТФ и вальпроата натрия в реакционной среде скорость включения 32Р в синтид-2 не изменялась, Vmax реакции составляла 1,795 нмоль32Р/мин, Km (0,148мкМ) также не изменялась, что свидетельствует об отсутствии действия вещества на САМКП но сайту взаимодействия протеинкиназы с АТФ.

4. Влияние вальнроата натрия и мелатонина на аудиогенную судорожную активность крыс линии КМ и системы фосфорилирования. Взрослым крысам линии КМ внутрибрюшинно вводили мелатонин (75 мг/кг) и вальпроат натрия (200 мг/кг), тестирование на АС крыс опытных и соответствующих контрольных групп проводили через 30 мин после введения мелатонина или через 1 ч после введения вальпроата натрия.

Показано, что и мелатонин, и вальпроат натрия значительно облегчали аудиогенные припадки крыс КМ (Рис.5). В случае введения вальпроата натрия 60% (3/5) крыс опытной группы дополнительно проявляли 2-х фазное двигательное возбуждение в составе судорожного припадка, что, по данным литературы, свидетельствует о развитии сильных тормозных процессов (Семиохина и др, 1993; Ross and Coleman, 2000). Для выявления возможных нейрохимических изменепий, вызванных введением антиконвульсантов и сопровождающих ослабление АС, крысам линии КМ вводили мелатонин и вальпроат натрия в тех же дозах, по декапитировали через соответствующее время, не подвергая воздействию звуком (Рис.6, Табл.4).

Показано, что общая активность СаМКП в мозге крыс всех экспериментальных групп не различалась, что свидетельствует об отсутствии различий в содержании фермента Одпако, в Гк и н.б.ч. крыс опытной группы введения мелатонина выявлено достоверное увеличение функциональной активности СаМКП по сравнению с контролем, в то время как в Нк она была снижена. Схожая картина наблюдалась и после введения вальпроата натрия.

контроль млятонин 75 Mrfttr

контроль мльпроет 200 мг/кг

контроль вальпроат 200 мг/кг

Рис.5.

Параметры АС крыс линии КМ через 30 мин после введения мелатонина в дозе 75 мг/кг и через 1 ч после введения вальпроата натрия в дозе 200мг/кг. Число животных в каждой группе п=5.

а, г-латентность стадии "1",

б, д - латентность стадии "2",

в, е- тяжесть судорог.

Различия между соответствующими опытной и контрольной группами достоверны при *р<0,05 и **р<0,01, между группами интактных КМ и опытной группой

Нк Гк нЛ.ч. Нк Гк н.6.4.

Рис.6.

Функциональная активность СаМКП (а, в) и активность РКА (б, г) в мозге крыс КМ через 30 мин после внутрибрюшинного введения свежеприготовленного раствора мелатонина (75 мг/кг) и через 1ч после введения вапьпроата натрия (200 мг/кг). Различия между опытной и контрольной группами достоверны при *р<0,05 и **р<0,01.

Известно, что характер АС, развивающихся у крыс при звуковом воздействии, определяется соотношением процессов возбуждения/торможения в структурах ЦНС, вовлеченных в процесс генерализации и поддержания эпилептиформной активности от ствола на оба полушария переднего мозга, при этом активность отделов ЦНС модулируется многочисленными проекциями из различных структур мозга. Наблюдаемые нами изменения функциональной активности СаМКП, вероятно, могут быть как следствием такой модуляции, так и непосредственно являться результатом действия самих антиконвульсантов. Учитывая высокую липофильность мелатонина и вальпроатов и их способность проникать через ГЭБ и мембраны клеток, можно предположить, что антисудорожное действие этих веществ может опосредоваться как потенциированием ГАМКд-рецепторов, так и действием непосредственно на уровне клетки. Антисудорожное действие мелатонина также может определяться действием гормона через собственные метаботропные мембранные (mtj и МТ?) рецепторы, сопряженные с аденилатциклазой и ядерные рецепторы семейства ROR/RTZ (Смирнов, 2001; Barrett et al., 1994; Nonno et al., 2000). Вероятно, именно геномным действием, характерным для липофильных гормонов (десятки минут) и их рецепторов, приводящем к активизации биосинтеза белка (Кулинский и Колесниченко, 2005), можно объяснить повышение активности РКА в н.б.ч. крыс КМ после введения мелатонина (Рис.6,б). Также выявлено, что введение вапьпроата натрия вызывает in vitro снижение цАМФ-зависимого и увеличение Саг+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования МАР2 в Гк крыс КМ, коррелирующее с увеличением функциональной активности СаМКП (Табл.4).

Таким образом, особенностью действия вальпроата натрия является появление 2-х фазного двигательного возбуждения в составе судорожного припадка, сопровождающееся изменением фосфосостояния МАР2 в Гк крыс КМ. Полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что результирующий вектор взаимодействия

Таблица 4.

цАМФ- и Со2*/кальмодулин-зависимое фосфорилирование МАР2 в мозге крыс линии КМ через через 30 мин после введения мелатонина) и через 1 ч после введения валъпроата натрия.

Стр-ра мозга контроль вальпроат натрия (200 мг/кг) контроль мелатонин (50 мг/кг)

Са^/кальмодулин-зависимое фосфорилирование МАР2, %

гшшокамп 100,00±13,85 161,63*21,34 * 100,00±112,35 88,87± 15,21

неокортекс 100,00±10,58 111,65±20,61 100,00±17,32 120,59±17,06

цАМФ-зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,00±8,92 67,93±8,40 * 100,00± 10,56 95,95±13,29

неокортекс 100,00±13,14 97,71±5,67 100,00±9,14 115,77± 12,42

Число животных в каждой группе л=5. Значения для соответствующих контрольных групп взяты за 100 %. Различия между группами по сравнению с контролем достоверны при *р<0,05 и **р<0,01.

валъпроата натрия и мелатонина с их многочисленными биохимическими мишенями модифицирует характерную для эпилептического мозга систему вторичных посредников, что может, хотя бы частично, объяснять широкий спектр антисудорожного действия этих препаратов.

5. Влияние еальпроата натрия и мелатонина на аудиогенную судорожную активность крыс линии КМ во время АК Хроническое потребление животными мелатонина и валъпроата натрия с водой обеспечивает относительно постоянный их уровень в крови.

Аптиконвульсанты применяли, начиная с 1-го дня АК после первого звукового воздействия.

Рис.7.

Изменение латентности развития "стадии 1" припадка (а) и тяжести судорог (б) при АК крыс КМ, хронически получавших с водой вальпроат натрия (50 мг/л), мелатонин (50 мг/л), мелатонин (50 мг/л) -вальпроат (50 мг/ч) и у контрольной группы (вода). Число крыс в каждой группе п=10 Различия между группами "вальпроат"-"контроль"достоверны при *р<0,05 и **р<0,01; различия между группами "мелатонин+вальпроат "-"контролъ"достоверны при +р<0,05и ++р<0,01. Между группами "мелатонин"-"контроль"различий не выявлено.

—О— мльпроэт ! —■—контроль ! --Д--мсляговив

- меляонин+млыцхигг | +

** + *

дни воздействия

Сравнительный анализ аудиогенных судорог у крыс линии КМ при хроническом потреблении мелатонина (50мг/л) и вальпроата натрия (50мг/л) показал, что оба препарата не оказывали влияния на тяжесть припадков крыс КМ во время АК, но животные экспериментальной группы с введением вальпроата натрия показали небольшое, но достоверное увеличение латентного периода развития судорог в течение АК. Применение мелатонина совместно с вальпроатом натрия (группа "мелатонин + вальпроат") значительно усиливало антисудорожное действие вальпроата, что проявлялось в ослаблении тяжести судорог и увеличении латентности их развития у крыс этой экспериментальной группы в течение АК (Рис.7). Устойчивый миоклонус к окончанию АК у групп "вальпроат" и "мелатонин + вальпроат" развивался у 90% животных, в контрольной группе и группе с потреблением мелатонина - у 100% крыс.

6. Отставленное действие раннего постнатального введения мелатонина крысятам линии КМ. Крысятам вводили подкожно мелатонин (50 мг/кг) в разные сроки постнатального развития (1-7Р, 7-14Р и 14-21Р). День рождения помета считался нулевым. В опытную и контрольную группы брали самцов из одного и того же помета (7-14Р и 14-21Р), либо из разных пометов (группа 1-7Р). В возрасте 3-х месяцев крыс подвергали АК.

Введение мелатонина в возрасте с 1-го по 7-й дни. Развише судорог при АК у крыс опытной и контрольной групп показано на РисДа,г. В темпах развития миоклонуса различий не выявлено. У крыс опытной 1руш1Ы также обнаружено достоверное увеличение в Нк общей (127,18±8,64 по сравнению с 86,43±6,91 пкмоль32Р/мин-мш белка, р<0,01) и функциональной активности СаМКП (6,07±0,31 и 5,04±0,24 нкмоль32Р/мин-мкг белка в опыте и контроле соответственно, р<0,05), а также увеличение функциональной активности СаМКП в Гк (5,20±0,45 нкмоль32Р/минмкг белка и 3,22±0,18 соответственно, р<0,01). Активность РКА в Нк крыс опытной группы также была повышена (12,41±0,49 пкмоль32Р/минмкг белка и 10,41±0,77 пкмоль32Р/мин-мкг белка, соответственно, р<0,05).

Введение мелатонина в период с 7-го по 14-й дни. Латентный период развития судорог при первой экспозиции звука у животных опытной группы был достоверно короче, чем в контроле, латентный период развития судорог у крыс опытной группы практически в течение всего периода АК оставался достоверно более коротким, чем в контроле (Рис.8,бд). Более того, у 100% крыс опытной группы уже на 18 лень АК наблюдался устойчивый миоклонус. Анализ активностей протеинкиназ показал, что в Нк и Гк, но не в н.б.ч., крыс КМ опытной группы наблюдается снижение как общей, так и функциональной активности СаМКП. Так, общая активность протеинкиназы в Нк составляла 95,81±5,63 пкмоль32Р/мин-мкг белка по сравнению с 142,55±6,56 в контроле (р<0,01), в Гк - 86,41±5,92 пкм0ль32р/мин'мкг белка в опыте против 130,58±5,87 в контроле (р<0,01); функциональная активность СаМКП в Нк крыс опытной группы - 5,06±0,37 пкмоль^Р/мин-мкг белка по сравнению с 6,07±0,31 в контроле (р<0,05), в Гк - 4,47±0ДЗ пкмоль32Р/мин мкг белка по сравнению с 5,46±0,24 в контроле (р<0,05). Активность РКА в исследуемых структурах мозга крыс КМ экспериментальных групп не различалась

дни во действия ж» воздействия

Рис.8. Тяжесть судорог и латентный период их развития при АК крыс линии КМ,

получавших мелатонин в разные сроки раннего постнаталъного развития:

а, г- введение мелатонина с 1-7дни (п-10 крыс в опыте и п^9 в контрольной группе);

б,д- введение мелатонина с 7-14 дни (п-10 крыс в опыте и п=9 в контрольной группе);

в, е введение мелатонина с 14-21 дни (п=7 крыс в опыте и п=8 в контрольной группе).

Различия между группами достоверны при *р<0,05, **р<0,01.

Введение мелатонина в период с 14-го по 21-й дни. При первом звуковом воздействии тяжесть припадков у крыс опытной группы была достоверно ниже (3,57±0,22 балла, у большей части крыс наблюдались только клонические судороги), чем в контроле (4,63±0,20 балла, р<0,01), но латентность их развития не различалась. Устойчивый миоклонус у 100% крыс опытной группы наблюдался на 20-й день звукового воздействия, в контрольной группе - на 19-ый день. Анализ активности СаМКЛ в мозге животных этой экспериментальной группы выявил достоверное повышение функциональной активности фермента только в Нк крыс опытной группы по сравнению с контролем (21,89±1,91 и 33,08±3,70 пкмоль32Р/мин-мкг белка соответственно, р<0,05), различий в общей активности СаМКП и активности РКА между опытной и контрольной группами не обнаружено.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что введение мелатонина крысятам линии КМ в различные сроки постнаталъного развития либо усилило, либо ослабило судорожную готовность у взрослых животных. Результаты многочисленных исследований указывают на существование "гормонального имлринтинга" при введении некоторых гормональных препаратов в раннем постнатальном возрасте. Так, даже однократное введение инсулина и гонадотропина новорожденным крысятам приводит к

значительной модификации рецепторов, сохраняющейся у взрослых животных в течение всей жизни (Угрюмов, 1999). Механизм таких изменений неизвестен и, возможно, связан с изменением числа рецепторов, сродства рецепторов к гормону или эффективности медиации. Хотя созревание эпифиза происходит у млекопитающих пренатально, у крысят мелатонин обнаруживается в плазме крови с 5-6Р дня, а появление устойчивого ритма биосинтеза нейрогормона происходит только на третьей неделе постнатального развития. Небольшие количества мелатонина также могут поступать с молоком матери (Sashihara et al., 1996; Rowe and Kennaway, 2002). Т.о., использованная в работе доза мелатопина могла видоизменить как нормальный для каждого конкретного периода развития фоновый уровень мелатонина, так и механизм становления гормон-рецепторных отношений, а также функционирование системы вторичных посредников. Так, при введении мелатонина с 7-14P в Нк и Гк крыс опытной группы наблюдается снижение как общей, так и функциональной активности СаМЮТ. Известно, что долговременное снижение активности СаМКП ассоциируется со стойкой эпилегггиформной активностью (Liang and Jones, 1997; Blair et al., 1999). Наблюдаемый нами характер проявления судорог и активности СаМКП указывает на то, что введение мелатонина с 7-14P крысятам линии КМ создает предпосылки для формирования сниженного порога к развитию аудиогенных судорог в половозрелом возрасте, т.е. оказывает проэпилептогенное действие.

Напротив, в экспериментальных группах с введением мелатонина в 1-7Р и 14-21Р нами выявлено увеличение функциональной активности СаМКП. В случае введения гормона в период 1-7Р, увеличение функциональной активности протеинкиназы в Нк крыс опытной группы определяется, вероятно, увеличением содержания киназы, в то время как в Гк (как и в случае увеличения функциональной активности киназы в Нк при введении мелатонина с 14-21Р) можно предположить увеличение содержания ее автофосфорилированной формы.

Особенности проявления судорожной активности у животных этих 2-х экспериментальных групп позволяют предположить, что введение мелатонина крысятам с 1-7Р и 14-21Р оказало слабое антисудорожное влияние. Вероятно, особенности отдаленных эффектов мелатонина, прежде всего зависят от биохимического статуса структур мозга, вовлеченных в генерацию АС, то есть наличием "мишеней", определяющих морфогенетическое действие препарата в тот или иной период постнатального развития.

Т.к. обнаруженное нами проэпилептогенное действие мелатонина при его введении крысятам КМ в период с 7 по 14 постнатальные дни представляет собой интересный, но неожиданный результат, нами было проведено дальнейшее исследование систем фосфорилирования при введении мелатонина в этот критический период. Крысятам КМ вводили мелатонин с 7-14Р, но в возрасте 3-х месяцев их декапитировалв, не подвергая звуковому воздействию. Исследование активностей протеинкиназ в мозге животных этой группы показало, что единственными различиями между опытной и контрольной группами являлось только незначительное увеличение активности РКА в Гк крыс опытной группы (9,60±0,37 пкмоль32Р/мин-мкг белка по сравнению с 8,42±0,43 в контроле, р<0,05). Однако, обнаружено увеличение содержания МАР2 в Нк и Гк крыс опытной группы, что, в совокупности с выявленным снижением в Нк как цАМФ-, так и Са2+/кальмодулин-зависимого in vitro фосфорилирования МАР2 свидетельствует о значительных модификациях цитоскелета в этих структурах мозга (Рис.9, Табл.5).

Рис.9.

Содержание a-CAMKII (а), кальцинейрина А (б) и МАР2 (в) в неокортексе и гиппокампе крыс КМ, получавших неонаталъно мелатонин с 7-14Р (п~8') и КМ контрольной группы (п=8). Значения для контроля взяты ча 100%. Различия между группами достоверны при *р<0,0$ и**р<0,01.

Таблица 5.

In vitro фосфорилирование белка МАР2 в различных структурах мозга крыс линии КМ, получавших мелатонин в период 7-14 Р (п=8) и контрольной группой (п=8) Значения для контроля взяты за 100%.

Стр-ра мозга контроль мелатонин 50 мг/кг

С^/кальмодулин-зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,00±14,19 80,08± 12,09

неокортекс 100,00±8,32 69,54±4,23 **

цАМФ-зависимое фосфорилирование МАР2

гиппокамп 100,00±15,02 109,97±9,99

неокортекс 100,00±6,98 74,17±7,86 *

Различия между группами достоверны при *р<0,05 и **р<0,01.

Содержание а-субъединицы СаМКП в исследуемых структурах мозга крыс опытной и контрольной группы не различалось, но содержание кальцинейрина увеличивалось в Гк и сильно снижалось в Нк крыс опытной группы. Полученные данные свидетельствуют о том, что системы цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования белков в мозге крыс, получавших мелатонин с 7-14Р значительно изменены, что могло служить одним из факторов, вызвавшим снижение порога к развитию нейрональной гипервозбулимости и, как следствие, наблюдаемое нами облегчение развития судорог при хроническом звуковом воздействии.

Дополнительно было проведено электронно-микроскопическое исследование синаптических контактов, образованных гигантскими мшистыми волокнами зубчатой фасции и апикальными дендритами пирамидных нейронов поля СЛЗ Гк крыс следующих экспериментальных групп: КМ с неонатальным введением мелатонина 50 мг/кг в период 7-14Р, крыс соответствующей контрольной группы и крыс КМ без введения веществ (интактная группа), взятых из тех же пометов, что и крысы опытной и контрольной группы. Крысы всех экспериментальных трупп звуковым воздействиям не подвергались. Морфометрический анализ показал увеличение плотности тубулиновьгх микротрубочек апикальных дендритов пирамид поля САЗ гиппокампа крыс контрольной группы по сравнению с нативными КМ и крысами опытной группы (Табл.6). Средняя длина синаптических контактов между мшистыми волокнами и апикальными дендритами (аксо-дендритные синапсы) пирамидных нейронов поля САЗ Гк крыс контрольной и интактной

групп не различалась, однако у крыс опытной группы она была несколько снижена. Нами также показано, что средняя длина активных зон (АЗ) и десмосомо-подобных контактов (ДПК) синапсов пирамид поля САЗ Гк крыс контрольной группы была выше, чем у обычных КМ и крыс опытной группы. ДПК представляют собой особый вид синаптического щелевого контакта, в котором со стороны пре- н постсинапса наблюдаются нити, образованные V-актином, который может пронизывать ДПК и, как предполагается выполняют метаболическую или регуляторную функцию, модулируя функционирование АЗ. Как видно из Табл.6, по ряду оцениваемых показателей все три группы животных различаются между собой, при этом группа интактных КМ занимает «промежуточное» положение.

Таблица 6

Характеристика синоптических контактов смешанного типа, образованных мшистыми волокнами зубчатой фасции на апикальных дендритах пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа крыс КМ различных экспериментальных групп:___

параметр исследования КМ контроль мелатонин 50 мг/кг

Число микротрубочек на 1 кв.мкм. 7,79±2,00 8,73±2,03++ 7,57±1,91**4-

Средняя длина синаптического контакта, мкм 3,04±0,13 3,04±0,09 2,72±0,08*Ч

Число АЗ 1,41±0,09 1,56±0,12 1,61±0,10

Средняя длина АЗ 0,23±0,01 0Д6±0,01+ 0,20±0,01**

Число ДПК 2,40±0,18 2,59±0Д2 2,57±0,22

Средняя длина ДПК 0,23±0,02 0Д8±0,02+ 0^0±0,01**

Отношение общей длины АЗ к длине синаптического контакта, % 12,69±1,32 14,38±1,06 13,11±0,93

Отношение общей длины ДПК к длине синаптического контакта, % 17,15±1Д6 19,07±1,11 20,72±1,07

Морфометрия исследуемых параметров проводилась при увеличении 91000, число животных в каждой группе п~3, общее число исследованных ультратонких срезов поля САЗ гиппокампа 3-х крыс в каждой группе п^79 (КМ), п=109 (контроль) и п=118 (мелатонип) Различия между группами интактных КМ и контрольной достоверны при *р<0,05 и **р<0,01; различия между контрольной группой и группой с введением мелатонина достоверны при*р<0,05 и **р<0,01; между интактными КМ и опытной группой при Jp<0,05 и 44р<0,01.

Полученные нами результаты при электронно-микроскопических исследованиях в совокупности с данными по проявлению судорог при АК и изменений в системах фосфорилирования белков свидетельствуют о том, что именно введение этанола с 7-14Р (в контроле), но не мелатонина, оказывает антисудорожное действие, в то время как мелатонин действует антш онистически, создавая нейрохимическую базу для облегчения формирования и распространения судорожной активности. Известно, что на 7-ой постнатальный день в гиппокампе мышей наблюдается максимум экспрессии ядерных рецепторов мелатонина подтипа ROR/RTZ, которые, согласно литературным данным, играют важную роль в дифференцировке нейронов (Смирнов, 1999; Sashihaiaet al., 1996). Т.о., наблюдаемый нами проэпилептогенный эффект введения мелатонина в 7-14Р можно объяснить модификацией экспрессии генов при участии ядерных рецепторов мелатонина и/или известным нейропротекторным действием гормона в этот период постнатального развития крыс

(усиленный синаптогенез и становление тормозной ГАМК-ергической системы), приводящим к образованию "избыточных" счнаптических связей и нарушению формирования нейронных сетей в мозге крыс линии КМ.

Заключение

Выявленные нами особенности функционирования цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилировапия нейрональных белков в мозге крыс линии КМ (изменение содержания и фосфосостояния МАР2 в Нк, увеличение функциональной активности СаМКН в н.б.ч. и Нк и активности РКА в н.б.ч., снижение содержания кальцинейрина в Гк), свидетельствуют о существовании особого нейрохимического статуса ЦНС животных, обладающих генетической предрасположенностью к аудиогенным судорогам. Долговременные модификации этих систем при индукции однократных судорожных припадков и аудиогенном киндлинге, в первую очередь, значительное увеличение содержания нейроспецифической а-субъединицы СаМКТТ и кальцинейрина в Гк крыс КМ после однократных АС, служат подтверждением вовлечения цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости. Можно предположить, что наблюдаемые нами изменения содержания а-САМКП и кальцинейрина после однократных аудиогенных припадков крыс КМ являются следствием судорожной активности, в то время как дальнейшие изменения содержания этих ферментов после АК могут отражать сложное взаимодействие процессов эпилептогенеза и антагонистичных ему эндогенных перестроек, направленных на снижение возбудимости нейронов Нк и Гк крыс КМ.

Следует отметить, что между исследуемыми системами фосфорилирования существует сложная взаиморегуляция, коюрая осуществляется через систему низкомолекулярных фосфопротеинов - ингибиторов протеинфосфатазы I (РР1) (Рис.10). Впервые такое взаимодействие путей было предложено П.Грингардом для белка DARP32 дофаминергических синапсов, являющегося изоформой ингибитора I, широко распространенною в различных отделах ЦНС (Greengard et al., 1998; Rakhilin et al., 2004). PP1 дефосфорилируег как CaMKII, так и регуляторную субъединицу РКА, изменяя кинетику активации последней. В результате цАМФ-зависимого фосфорилирования ингибитор I подавляет активность РР1, что, в свою очередь, приводит к снижению дефосфорилирования активной автофосфорилированной формы CaMKII, продлевая время ее существования. В свою очередь, дефосфорилирование ингибитора I кальцинейрином устраняет его действие на РР1. Кальцинейрин также дефосфорилирует РКА (Rusnak and Mertz, 2000). цАМФ-зависимое фосфорилирование Са2+-активируемой цистеиновой протеазы кальпаина, значительная часть которого в клетках заякорена на микротрубочках около МАР2, приводит к увеличению активности кальпаина, вызывая частичный протеолиз кальцинейрина и его активацию (Krebs and Graves, 2000; Wu et al., 2003). цАМФ-зависимая протеннкиназа и CAMKII имеют частично перекрывающуюся субстратную специфичность, но фосфорилируют различные остатки Ser или Thr субстрата, что также приводит к различной модуляции активности белка-эффектора.

мелатонин

—»--

рецепторы mtl, МТ2

увеличение внутриклеточного Се

.2+

АС

Са2+/кальмодулин

ингибиторI

—Э

О \ ингибитор I

РР2В

ингибитор I фосфосостояние

i © РР1

протевнфосфатаза

СаМКП

регуляция Q активности генов

Р-МАР2

РКА микротрубочки

ядро

Рис.10. Предполагаемая схема действия мелатонина и вальпроата натрия на уровне взаимодействия между системами цАМФ- и Ca2*/кальмодулин-зависимого фосфорияирования нейроналъных белков

К числу таких субстратов относятся синапсин I, МАР2, субъединицы потенциал-зависимых Са2+ и Na+ капалов, а также АМРА-рецепторов и др. Изменение фосфорилирования ядерных субстратов СаМКП и РКА также регулирует активность генома. Так, субстратом РКА в ядре является, в частности, CRE-связывающий белок CREB. Недавно выявлено, что сплайсинговая варианта ав-СаМКП имеет ядерную локализацию, xoir ее ядерные субстраты пе установлены (Bayer and Schulman, 2001). Дополнительным регулирующим фактором, вероятно, может выступать уровень свободного кальмодулина, «доступного» для Са2+/кальмодулнн-регулируемых ферментов (СаМКП, кальцинейрина), содержание которого в нейронах различных отделов мозга обычно меньше уровня кальмодулин-регулируемых ферментов, что предполагает наличие в клетках сложной регуляции его распределения. Т.о., нарушение того или иного звена этой взаиморегуляции может не только вызывать нарушение фосфосостояния определенных белков в различных клеточных компартментах, но и напрямую влиять на геном.

антисудорожное, но и проэпилептогенное действие. В настоящее время модуляторное действие мелатонина и вальпроата натрия на возбудимость нервной системы связывают, в основном, с их действием на ГАМК-рецепторы (Смирнов, 2001; Johannessen, 2000; Nonno et al., 2000). Учитывая высокую липофильность мелатонина и вальпроата натрия, выявлеппый нами линейный характер ингибирования ими активности СаМКП свидетельствует о возможном действии этих веществ непосредственно на уровне клеточных мишеней, например, через кальмодулин. Наиболее вероятным представляется, что наблюдаемые нами при введении антиконвульсантов изменения активностей протеинкиназ и фосфорилирования МАР2 (при введении вальпроата натрия) являются следствием сложной совокупности процессов взаимомодуляции различных структур мозга, действием мелатонина и вальпроата натрия на ГАМК-ергическую передачу и непосредственного влияния антиконвульсантов на уровне их клеточных мишеней, результатом которой является общее ослабление судорожного припадка Учитывая универсальность цАМФ- и Са2+Укальмодулин-зависимых систем фосфорилирования, а также полифункциональность СаМКП, РКА и кальцинейрина, введение животным мелатонина и вальпроата натрия в значительной степени меняет биохимический статус нервных клеток и может частично объяснять широкий спектр антисудорожного действия этих препаратов.

Выводы:

1. Выявленные особенности содержания а-изоформы CaMKII, кальдинейрина и МАР2, а также активностей протеинкиназ СаМКИ и РКА в отдельных структурах мозга крыс линии КМ по сравнению с Вистар, а также модификации функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования после однократных аудиогенных судорог и аудиогенного киндпинга указывают на вовлечение этих систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости.

2. Установлено, что in vitro мелатонин и вальпроат натрия ингибируют общую активность СаМКП, константа ингибирования для вальпроага натрия по сайту связывания фермента с комплексом Са2+/кальмодулин составляет 35 мкМ.

3. Ослабление аудиогенных припадков при однократном введении мелатонина и вальпроата натрия сопровождается увеличением функциональной активности СаМКП в ряде структур мозга крыс КМ и, в меньшей степени, изменением активности РКА. Кроме того, введение вальпроата натрия вызывает увеличение Са2+/кальмодулин-зависимого и снижение цАМФ-зависимого фосфорилирования МАР2 в гиппокампе крыс линии КМ.

4. Хроническое потребление мелатонина не оказывает влияния на характер аудиогенных припадков крыс КМ при аудиогенном киндяинге, в то время как вальпроат натрия приводит к ослаблению судорожной реакции. Применение мелатонина совместно с вальпроатом натрия потенциирует антисудорожное действие последнего.

5. Выявлено отставленное действие введения экзогенного мелатонина крысятам КМ в ранний постнатальный период развития на реализацию судорожной готовности крыс в половозрелом возрасте: введение мелатонина с 1-7Р и 14-21Р оказывает слабое антисудорожное действие, в то время как применение препарата в период с 7-14Р имеет выраженный проэшшептогенный эффект.

6. На примере изучения антиконвульсантов двух различных фармакологических классов (мелатонин и вальпроат натрия) показано, что их действие реализуется с участием цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков.

Работа выполнена при поддержке Российско! о фонда фундаментальных исследований (гранты №03-04-48787 и региональный №01-04-09739).

Список основных публикаций по теме диссертации:

1. Ечиков С.Н., Щипакина Т.Г., Чуланова (Савина) Т.А., Годухин О.В. Эндогенное цАМФ-и Са(2+)/кальмодулин-зависимое фосфорилирование белков гиппокампа и неокортекса крыс линии Крупшнского-Молодкиной и Вистар//Нейрохимия, 1998, т. 15 (4), с. 389-394.

2. Ечиков С.Н., Чуланова (Савина) Т.А., Моренков Э.Д., Щипакина Т.Г. Участие Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования МАР2 в механизмах наследственной эпилёпсии//Тезисы докладов конференции "Цитоскелет и клеточная регуляция", Пущине, 2000, с. 20.

3. Yechikhov S.N., Morenkov E.D., Chulanova (Savina) T.A., Godukhin O.V. and Shchipakina T.G. Involvement of cAMP-and Ca2+/calmodulin-dependent neuronal protein phosphorylation in mechanisms underlying genetic predisposition to audiogenic seizures in rats.// Epilepsy Research, 2001, Vol.46. P. 15-25.

4. Ечиков C.H., Чуланова (Савина) T.A., Безгина Е.Н., Мошков Д.А., Щипакина Т.Г. Динамика биохимических и структурных показателей микротрубочек и наследственная эпилепсия. // Архив клинической и экспериментальной медицины. Материалы II конференции украинского общества нейронаук, 2001, т. 10 (2), стр.156.

5. Sergey Yechikhov, Tatyana Shchipakina, Tatyana Savina, Sergey Kalemcncv, Sergey Levin and Oleg Godukhin. The role of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase П in mechanisms underlying neuronal hyperexcitability induced by repeated, brief exposure to hypoxia or high K+ in rat hippocampal slices//Neuroscience Letters, 2002, Vol. 335, Issue 1, P. 21-24.

6. Савина Т. А., Ечиков C.H., Садовников В.Б., Щипакина Т.Г. Аномалии фосфорилирования нейроспецифичного белка МАР2 как особенность эпилептического фенотипа/ГГезисы научных докладов Ш съезда биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, стр.381.

7. Безгина Е.Н., Мошков Д.А., Ечиков С.Н., Савина Т.А., Калеменев С.В., Моренков Э.Д., Щипакина Т.Г. Морфофункциональные особенности ультраструктуры микротрубочек и фосфорилирования белка МАР2 в нейронах гиппокампа крыс, предрасположенных к аудиогенной эпилепсии. // Цитология, 2003, Т. 45, № 10, стр. 1005 - 1012.

8. Savina Т. A., Shchipakina T.G. Effects of early postnatal administration of the pineal hormone melatonin to audiogenic seizures of Krushinsky-Molodkina rats induced by acute acoustic stress. // Psychopharmacology and biological narcology. 8-th "Stress and Behavior" Conference, Saint-Petersburg, 2004, Vol. 4, № 2-3, pp.719-720.

9. Савина T.A., Балашова O.A., Щипакина Т.Г. САМК П - нейрохимический "субстрат" вальпроата натрия?// Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2004. Т.90. № 8. стр. 289.

10. Савина Т.А., Федотова И.Б., Полетаева И.И. Влияние раннего постнатального введения мелатонина на поведение крыс липии КМ. // Рос. физиол. журн. им. И. М, Сеченова. 2004. Т 90. № 8 стр.221

Н.Савина Т.А., Федотова И.Б., Полетаева И.И., Семиохина А.Ф., Щипакина Т.Г.. Отставленные эффекта раннего постнатального введения эпифизарного гормона мелатонина на аудиогенные судороги крыс линии Крупшнского-Молодкиной // ЖВНД, 2005, Т.55, №1, стр.107-115.

12. Савипа Т.А., Балашова О.А., Щипакина Т.Г. Фосфорилирование нейропальных белков как вероятная мишень антиэпилептического действия мелатонина // Сборник материалов конференции РНО «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», 14-16 марта 2005 г., стр. 40.

Используемые сокращения: ДЦС - додецштсульфат натрия, АС - аудиогенные судороги, АК-аудиогенный киндлинг, СаМКП-Са2+/кальмодулин-зависимая протеинукиназа II, РКА -цАМФ-зависимая протеинкиназа, Гк - гиппокамп, Нк - неокортекс. н.б.ч. - нижние бугры четверохолмия, АЗ - активные зоны, ДПК - десмосомо-подобные контакты.

Принято к исполнению 15/09/2005 Исполнено 15/09/2005

Заказ № 1043 Тираж 80 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 16438

»18 26 Î

т-

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савина, Татьяна Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Модели эпилепсии на животных.

1.1.1. Модели судорожной активности in vivo. Киндлинг.

1.1.2. Этиология аудиогепных судорог.

1.1.3. Аудиогенная эпилепсия человека.

1.1.4. Модели приобретенной аудиогенной эпилесии на животных.

1.1.5. Наследственные аудиогенные судороги грызунов.

1.1.6. Аудиогенный киндлинг.

1.1.7. Биохимические изменения мозга при аудиогенной эпилепсии.

1.2. Нейробиологические основы эпилептогенеза развивающегося мозга.

1.3. Участие систем вторичных посредников в механизмах эпилептогенеза.

1.3.1. С а2 +/кал ьмодул ин -зав исимое фосфорилирование белков.

1.3.2. Внутриклеточные пути реализации сигнала, опосредуемого цАМФ. цАМФ-зависимое фосфорилирование белков.

1.3.3. Серин/треониновые протеинфосфатазы. Кальцинейрин.

1.3.4. Участие систем вторичных посредников в регуляции пластичности мозга и эпилептогенезе.

1.3.5. Взаимосвязь - и цАМФ-зависимых систем вторичных посредников.

1.4. Современные стретегии применения антиконвульсантов. Мелатонин и вальпроат натрия.

Глава II. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.

2.2. Лабораторные животные.

2.3. Исследование поведения крыс КМ в тесте «Открытое поле».

2.4. Оценка аудиогенной судорожной активности крыс линии КМ. Аудиогенный киндлинг.

2.5. Аудиогенный киндлинг крыс КМ на фоне хронического употребления мелатонина и вальпроата натрия.

2.6. Однократное введение мелатонина половозрелым крысам линии КМ и КМ после аудиогенного киндлинга.

2.7. Однократное введение вальпроата натрия половозрелым крысам линии КМ и КМ после аудиогенного киндлинга.

2.8. Введение мелатонина крысам линии КМ в течение 7 дней с последующим тестированием на аудиогенные судороги.

2.9. Введение мелатонина крысятам линии КМ в различные сроки раннего постнатального развития (1-7,7-14 и 14-21 постнатальные дни).

2.10. Выделение структур мозга.

2.11. Приготовление гомогенатов.

2.12. Определение концентрации белка.

2.13. In vitro фосфорилирование белков мозга.

2.13.1. сАМФ- зависимое фосфорилирование.

2.13.2. Саг+/кальмодулин-зависимое фосфорилирование.

2.13.3. Электрофорез и идентификация белков.

2.14. Измерение активностей протеинкиназ.

2.14.1. Измерение активности сАМФ-зависимой протеинкиназы.

2.14.2. Измерение активности Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы 7/.

2.14.3. Оценка включения фосфата в пептидные субстраты протеинкиназ.

2.15. Иммунохимические методы оценки содержания а-CaMKII, кальцинейрина и МАР с помощью иммунноблотинга.

2.16. Электронно-микроскопические исследования.

2.17. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава III. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Исследование систем Са /кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ и крыс Вистар.

3.2. Исследование Са2+/кальмодулин - и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ через 2 суток после однократного звукового воздействия и после АК.

3.3. Исследование действия мелатонина и вальпроата натрия на активность

САМКИ и РКА.

3.4. Влияние вальпроата натрия и мелатонина на аудиогенную судорожную активность крыс линии КМ и системы фосфорилирования.

3.4.1. Исследование действия мелатонина (50 и 75 мг/кг) и вальпроата натрия

200 мг/кг) на аудиогенные судороги крыс линии КМ.

3.4.2. Исследование действия мелатонина (50 и 75 мг/кг) и вальпроата натрия (200 мг/кг) на миоклонические судороги крыс линии КМ после аудиогенного киндлинга.

3.4.3 Хроническое введение мелатонина крысам КМ в течение 7 дней с последующим тестированием на аудиогенные судороги.

3.5. Влияние хронического потребления вальпроата натрия и мелатонина крысами

КМ на аудиогенную судорожную активность во время аудиогенного киндлинга.

3.6. Исследование отставленного действия раннего постнатального введения мелатонина на аудиогенные судороги половозрелых крыс линии КМ.

3. б. 1. Введение мелатонина в возрасте с 1-го по 7-й Р дни.

3.6.2. Введение мелатонина в возрасте с 14-го по 21-й Р дни.

3.6.3. Введение мелатонина в возрасте с 7-го по 14-й Р дни.

Введение Диссертация по биологии, на тему "цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов"

Актуальность проблемы:

Эпилепсия представляет собой большую группу клинических заболеваний, которым подвержено около 1% взрослого населения, при этом только 40% случаев заболевания эпилепсией поддается медикаментозному лечению, в то время как нейрохирургическое вмешательство (резекция ткани мозга у больных или нейротрансплантации) не всегда дает положительный эффект (Карлов, 1990). В настоящее время считается, что наследственные формы эпилепсий являются заболеванием мозга в целом (Богданов, 1997; Акимова и др., 2000). С этой точки зрения правомерен вопрос о том, в какой степени изменения функциональных или морфологических свойств индивидуальных нейронов, а также нейронов определенных структур головного мозга могут быть ответственны за эпилептогенез. Широкое разнообразие клинических форм эпилепсии свидетельствует о необходимости анализа клеточных и молекулярных механизмов инициации и развития заболевания.

На различных моделях эпилепсии на животных показано, что эпилептогенез сопровождаться многочисленными метаболическими нарушениями в нейронах, включающими в себя изменения экспрессии генов, внутриклеточного гомеостаза Са2+ и энергетики нейронов, изменением кластеризации и свойств различных рецепторных комплексов, в частности, ГАМК- и глутаматных, изменением проводимости ионных каналов, а так же морфологическими перестройками, приводящими к созданию гипервозбудимости нейрональных сетей. Нарушение функционирования нейронов в значительной степени определяется изменениями внутриклеточной системы регуляции различных клеточных процессов - системы вторичных посредников. Конечными эффекторами системы вторичных посредников являются протеинкиназы (протеинфосфотрансферазы) — ферменты, осуществляющие регуляцию большинства рецепторных и канальных белков, а так же белков цитоскелета посредством одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций — фосфорилированием. Са2+/кальмодулин- (СаМКП) и цАМФ- (РКА) зависимые протеинкиназы, а также Са2+/кальмодулин-активируемая протеинфосфатаза 2В (кальцинейрин), локализованные как пре-, так и постсинаптически, являются ключевыми ферментами взаимомодулирующих путей реализации действия двух важных внутриклеточных вторичных посредников - Са2+ и цАМФ. Начиная с открытия Э.Сазерлендом регуляторного действия цАМФ (Sutherland, 1972), последующие исследования л , функционирования белков-эффекторов систем цАМФ- и Са /зависимого проведения сигнала показали, что различные пути вторичных посредников взаимомодулируют друг друга, образуя разветвленную регуляторную сеть, специфичность ответа которой определяется рецепторными комплексами, запускающими внутриклеточные каскады фосфорилирования/дефосфорилирования, набором и компартментализацией белков-эффекторов. Большой интерес представляет изучение фосфорилирования ассоциированного с микротрубочками белка 2 (МАР2), который является одним из связующих звеньев между данными регуляторными внутриклеточными системами, а также морфологией и функциональной активностью нейрона. Фосфорилирование этого белка CaMKII и РКА регулирует динамику сборки/разборки тубулинового цитоскелета и взаимодействие микротрубочек с другими элементами цитоскелета, что, в свою очередь оказывает влияние на внутриклеточный транспорт, кластеризацию рецепторов, синаптическую передачу и поддержание формы дендритов. Изменения фосфорилирования белков, а также активности или содержания CaMKII, PICA и кальцинейрина показаны при долговременной потенциации синаптической передачи, процессах, связанных с обучением и некоторыми патологическими состояниями мозга. Кратковременное увеличение уровня внутриклеточного Са2+ и цАМФ вследствие судорожной активности запускает каскад как морфологических (изменением состояния цитоскелета посредством изменения фосфорилирования цитоскелетных белков), так и биохимических изменений, приводящих к долговременной активации генома и образованию так называемых "эндогенных антиконвульсантов" - адаптационных перестроек, препятствующих развитию гипервозбудимости и являющихся мишенями действия некоторых антиконвульсантов (Post, 2004). Известно, что такие антиконвульсанты, как вальпроат натрия и мелатонин являются "универсальными" антисудорожными агентами при различных формах эпилепсии. Антиэпилептическое действие данных препаратов в основном объясняется их влиянием на ГАМК-ергическую систему мозга, однако представляется вероятным, что их эффективность может опосредоваться влиянием на систему внутриклеточной регуляции, опосредованную Са2+ и цАМФ. Комплексный анализ изменений в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков в мозге животных с наследственной предрасположенностью к судорогам, вызываемым звуком, несомненно, позволит выявить механизмы, ответственные за генерацию и поддержание судорожной активности и дать заключение о взаимосвязи между антисудорожным действием мелатонина и вальпроата натрия и изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков, что позволит обогатить существующие на сегодняшний день знания о механизмах действия антиконвульсантов широкого спектра действия и, возможно, дать дополнительное направление для разработки новых актиконвульсантов.

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы является изучение участия систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нсйрональных белков в механизмах развития и поддержания судорожной активности, а также в реализации действия антиконвульсантов широкого спектра действия мелатонина и вальпроата натрия.

Конкретные задачи исследования:

1. Выявление особенностей функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования белков в мозге крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорогам по сравнению с нечувствительными к звуковому воздействию крысами В и стар;

2. Сравнительный анализ изменений систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ после однократных аудиогенных судорог и после хронического звукового воздействия (аудиогенного киндлинга);

3. Исследование влияния мелатонина и вальпроата натрия на активности протеинкиназ CaMKII и РКА in vitro;

5. Изучение действия хронического потребления мелатонина и вальпроата натрия крысами КМ на параметры судорог и динамику развития миоклонуса при аудиогенном киндлинге;

6. Исследование отставленного действия введения мелатонина (50 мг/кг) крысятам КМ в критические для развития мозга периоды постнатального развития (1-7Р, 7-14Р и 14-21Р дни) на реализацию чувствительности к звуку в половозрелом возрасте, а также на системы цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков и состояние синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.

Научная новизна.

В представленной работе впервые показано, что у животных с наследственной предрасположенностью к судорогам в различных структурах мозга, вовлеченных в реализацию судорожной активности, существует генетически детерминированное изменение содержания Са2+/кальмодулин-ре1улируемых ферментов - протеинкиназы CaMKII и протеинфосфатазы кальцинейрина, что может являться одним из механизмов, участвующих в формировании нейрональной гипервозбудимости. Показано, что даже однократное судорожное воздействие вызывает долговременные изменения содержания 8 а-субъединицы CaMKII и кальцинейрина в отдельных структурах мозга крыс КМ. Выявлено антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия на различные типы аудиогенных припадков, а также потенциирующее действие мелатонина на антисудорожную активность вальпроата натрия при совместном применении антиконвульсантов. Впервые продемонстрировано, что антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия при однократном введении сопровождается изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков. Показано, что применение мелатонина на ранних стадиях постнатального развития может оказывать как анти-, так и просудорожное отставленное действие в зависимости от постнатальных сроков введения, сопровождающееся изменениями исследуемых систем фосфорилирования и морфологическими модификациями синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа, что предполагает более осторожный выбор антисудорожной терапии при лечении ювенильных эпилептических синдромов.

Научно-практическое значение.

Результаты, полученные в данной работе указывают на вовлечение систем фосфорилирования/дефосфорилирования нейрональных белков и белков цитоскелета в механизмы предрасположенности и реализации судорожных состояний и намечают подходы к разработке нового класса антиэпилептических препаратов, мишенью которых является система вторичных посредников.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Савина, Татьяна Александровна

Выводы:

1. Выявленные особенности содержания а-изоформы CaMKII, кальцинейрина и МАР2, а также активностей протеинкиназ CaMKII и РКА в отдельных структурах мозга крыс линии КМ по сравнению с Вистар, а также модификации функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования после однократных аудиогенных судорог и аудиогенного киндлинга указывают на вовлечение этих систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости.

2. Установлено, что in vitro мелатонин и вальпроат натрия ингибируют общую активность CaMKII, константа ингибирования для вальпроата натрия по сайту связывания фермента с комплексом Са /кальмодулин составляет 35 мкМ.

3. Ослабление аудиогенных припадков при однократном введении мелатонина и вальпроата натрия сопровождается увеличением функциональной активности CaMKII в ряде структур мозга крыс КМ и, в меньшей степени, изменением активности РКА. Кроме того, введение вальпроата натрия вызывает увеличение Са2+/кальмодулин-зависимого и снижение цАМФ-зависимого фосфорилирования МАР2 в гиппокампе крыс линии КМ.

4. Хроническое потребление мелатонина не оказывает влияния на характер аудиогенных припадков крыс КМ при аудиогенном киндлинге, в то время как вальпроат натрия приводит к ослаблению судорожной реакции. Применение мелатонина совместно с вальпроатом натрия потенциирует антисудорожное действие последнего.

6. На примере изучения антиконвульсантов двух различных фармакологических классов (мелатонин и вальпроат натрия) показано, что их действие реализуется с участием цАМФ- и Са /кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков. 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Заключение.

Выявленные нами особенности функционирования цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ (изменение содержания и фосфосостояния МАР2 в неокортексе, увеличение функциональной активности CaMKII в н.б.ч. и неокортексе и активности РКА в н.б.ч., снижение содержания кальцинейрина в гиппокампе), свидетельствуют о существовании особого нейрохимического статуса ЦНС животных, обладающих генетической предрасположенностью к аудиогенным судорогам. Долговременные модификации этих систем при индукции однократных судорожных припадков и аудиогенном киндлинге, в первую очередь, значительное увеличение содержания нейроспецифической а-субъединицы CaMKII и кальцинейрина в гиппокампе крыс КМ после однократных аудиогенных судорог, служат подтверждением вовлечения цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости. Можно предположить, что наблюдаемые нами изменения содержания а-САМКН и кальцинейрина после однократных аудиогенных припадков крыс КМ являются следствием судорожной активности, в то время как дальнейшие изменения содержания этих ферментов после аудиогенного киндлинга могут отражать сложное взаимодействие процессов эпилептогенеза и антогонистичных ему эндогенных перестроек, направленных на снижение возбудимости нейронов неокортексе и гиппокампе крыс КМ.

Следует отметить, что между исследуемыми системами фосфорилирования существует сложная взаиморегуляция, которая осуществляется через систему низкомолекулярных фосфопротеинов - ингибиторов протеинфосфатазы I (РР1) (Рис.3.32). Впервые такое взаимодействие путей было предложено П.Грингардом для белка DARP32 дофаминергических синапсов, являющегося изоформой ингибитора I, широко распространенного в различных отделах ЦНС (Greengard et al., 1998; Rakhilin et al., 2004). PP1 дефосфорилирует как CaMKII, так и регуляторную субъединицу РКА, изменяя кинетику активации последней. В результате цАМФ-зависимого фосфорилирования ингибитор I подавляет активность РР1, что, в свою очередь, приводит к снижению дефосфорилирования активной автофосфорилированной формы CaMKII, продлевая время

113 ее существования. В свою очередь, дефосфорилирование ингибитора I кальцинейрином устраняет его действие на РР1. Кальцинейрин также дефосфорилирует РКА (Rusnak and Mertz, 2000). цАМФ-зависимое фосфорилирование Са31-активируемой цистеиновой протеазы кальпаина, значительная часть которого в клетках заякорена на микротрубочках около МАР2, приводит к увеличению активности кальпаина, вызывая частичный протеолиз кальцинейрина и его активацию (Krebs and Graves, 2000; Wu et al., 2003). цАМФ-зависимая протеинкиназа и CAMKII имеют частично перекрывающуюся субстратную специфичность, но фосфорилируют различные остатки Ser или Thr субстрата, что также приводит к различной модуляции активности белка-эффектора.

Предполагаемая схема действия мелатонина и вальпроата натрия на уровне взаимодействия между системами цАМФ- и Са2Укачьмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков.

К числу таких субстратов относятся синапсин I, МАР2, субъединицы потенциал-зависимых Са2+ и Na+ каналов, а также АМРА-рецепторов и др. Изменение фосфорилирования ядерных субстратов CaMKII и РКА также регулирует активность генома. Так, субстратом РКА в ядре является, в частности, CRE-связывающий белок CREB. Недавно выявлено, что сплайсинговая варианта а»-СаМК11 имеет ядерную локализацию, хотя ее ядерные субстраты не установлены (Bayer and Schulman, 2001). Дополнительным регулирующим фактором, вероятно, может выступать уровень свободного кальмодулина, «доступного» для Са2+/кальмодулин-регулируемых ферментов (CaMKII, кальцинейрина), содержание которого в нейронах различных отделов мозга обычно меньше уровня кальмодулин-регулируемых ферментов, что предполагает наличие в клетках сложной регуляции его распределения. Таким образом, нарушение того или иного звена этой взаиморегуляции может не только вызывать нарушение фосфосостояния определенных белков в различных клеточных компартментах, но и напрямую влиять на геном.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что антисудорожное действие вальпроата натрия и мелатонина опосредуется влиянием этих антиконвульсантов на системы вторичных посредников. В отличие от вальпроата натрия, влияние мелатонина на судорожную активность определяется также его ядерными ROR/RTZ-рецепторами, регулирующими активность хроматина, поэтому применение мелатонина в критические для становления нервной системы периоды развития может оказывать не только антисудорожное, но и проэпилептогенное действие. В настоящее время модуляторное действие мелатонина и вальпроата натрия на возбудимость нервной системы связывают, в основном, с их действием на ГАМК-рецепторы (Смирнов, 2003; Johannessen, 2000). Учитывая высокую липофильность мелатонина и вальпроата натрия, выявленный нами линейный характер ингибирования ими активности CaMKII свидетельствует о возможном действии этих веществ непосредственно на уровне клеточных мишеней, например, через кальмодулин. Наиболее вероятным представляется, что наблюдаемые нами при введении антиконвульсантов изменения активностей протеинкиназ и фосфорилирования МАР2 (при введении вальпроата натрия) являются следствием сложной совокупности процессов взаимомодуляции различных структур мозга, действием мелатонина и вальпроата натрия на ГАМК-ергическую передачу и непосредственного влияния антиконвульсантов на уровне их клеточных мишеней, результатом которой является общее ослабление судорожного припадка. Учитывая универсальность цАМФ- и Са /кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования, а также полифункциональность СаМКИ, РКА и кальцинейрина, введение животным мелатонина и вальпроата натрия в значительной степени меняет биохимический статус нервных клеток и может частично объяснять широкий спектр антисудорожного действия этих препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савина, Татьяна Александровна, Пущино

1. Акимова И.М., Гурчии Ф.А., Королева Н.Ю., Л. А. Мелючева, Е.А.Тайц. Клиническое проявление трансплантации эмбриональных зачатков мозга при заболевании эпилепсией // Физиология человека, 2000, Т.26, № 3, стр. 67-78.

2. Батуев А.С., Братина Т.А., Александров А.С., Рябинская Е.А. Аудиогенная эпилепсия: морфофункциональный анализ // Журнал высшей нервной деятельности, 1997, Т.47,Вып.2., стр. 431-438.

3. Богданов Н.Н. Значение интегральных подходов в поиске предикторов и изучении механизмов возникновения и развития эпилепсии // Успехи физиол. наук, 1997, Т.28, №2, стр. 21-39.

4. Веретенников Н.А., Куликова Д.А., Панин В.М., Корочкин Л.И. Биологические аспекты эпилепсии: морфологические и молекулярные исследования аудиогенной эпилепсии //Успехи соврем, биологии., 1996, Т.116, Вып.4., стр.407-417.

5. Годухин О.В. Клеточно-молекулярные механизмы киндлинга. // Успехи физиологических наук, 2005, Т.36, №2, стр. 41-54.

6. Зенков Л. Р. , Притыко А. Г. Фармакорезистентные эпилепсии: Руководство для врачей. М: МЕДпресс-информ, 2003 208 с.

7. Зенков Л.Р. Клиническое значение изменений электроэнцефалограммы при лечении эпилепсии вальпроатом (Депакин хроно). // Журн. невропатол. и психиатр. 2002, № 102,стр. 20-26.

8. Карлов В. А. Эпилепсия. М.: Медицина, 1990. 336 с.

9. Кветная Т.В. Мелатонин: роль и значение в возрастной патологии. // Т. В. Кветная, И.В.Князькин; Под ред. В.Х.Хавинсона. С-Пб;ВМедА, 2003. 93с.

10. Ковальзон В.М. Мелатонин, эпифиз и сон млекопитающих. //Нейрохимия, 2003, Т.20, №2, стр.93-100.

11. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики . М.: Мир, 1979 282 с.

12. Крушинский Л. В. Формирование поведения животных в норме и патологии. М.; Из-во МГУ, I960-264с.

13. Кулинский В.И.,.Колесниченко Л.С. Молекулярные механизмы действия гормонов I. Рецепторы. Нейромедиаторы. Системы со вторыми посредниками. // Биохимия, 2005, Вып.70, №1, стр. 33-51.

14. Семиохина А.Ф., Федотова И.Б., Кузнецова Л.М. Крысы линии Крушинского-Молодкиной как модель для изучения патологических состояний и методов их16

Информация о работе

Савина, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

цАМФ- и Ca2+/кальмодулин - зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы