Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые аспекты регуляции цАМФ-зависимой протеинкиназной активности у растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Некоторые аспекты регуляции цАМФ-зависимой протеинкиназной активности у растений"

9 з 0\'Л ^

° РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи УДК 577.! 75.13:577.152.27

ЗАКИРОВА Лилия Азатовна

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ цАМФ-ЗАВИСИМОЙ ПРОТЕИНКИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У РАСТЕНИЙ

03.00.12. - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

ч) .'.."..

КАЗАНЬ 1995

Работа выполнена* Б институте биологии Казанского Научного

Центра РАН

Научные руководители - академик РАН Тарчевский И.А.;

- доктор биологических наук Каримова Ф.Г. _ -

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Хохлова Л. П. - кандидат биологических наук Минибаева Ф.В.

Ведущая организация - институт биохимии им. Баха РАН

заседании Специализированного совета К 002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН по адресу: 4205<?3, Казань-$£3, а/я 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН

(г. Москва)

Защита состоится

года в часов на

Автореферат

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Н.Л. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы. После длительной дискуссии в литературе о ^акционировании системы цАМФ в растениях (Amrhein, 1974; Коро-1ев, Выскребенцева, 1978) были получены новые данные о компоненте этой системы (Franko, 1983; Newton, Brown, 1986; Яворская, .990; Каримова, 1994), подтверждающее наличие ее активности в >астениях. Одним из ключевых звеньев цАМФ-мессенджерной системы [вляются цАМФ-зависимые протеинкиназы. Существуют единичные ра-юты по определению их активности в растениях (Kato et al., .983; Newton, Brown, 1987; Каримова и др., 1991). В то же время i литературе есть ряд работ, где авторы не могли* обнаружить 1АШ-зависимую протеинкиназную активность в растениях (Carraty >t al., 1984; Reddy et al., 1987); были и случаи, когда экзоген-[ый цАМФ подавлял протеинкиназную активность" (Kato et al., 1983; larkwell et al., 1983; Романко и др., 1991). Определению ^МФ-зависимой протеинкиназной активности в грубых экстрактах )астений могут мешать АТФазы, протеазы, другие протеинкиназы Sorbin, 1983) и в особенности фосфопротеккфосфатазы (ФПФ) -юрменты, катализирующие процесс дефосфорилирования белков, ко-юрый идет одновременно с процессом фосфорилирования. Высокую активность ФПФ в растениях и регуляцию их активности специфически ингибиторами продемонстрировали в своих работах Mackintosh 1990), Kauss et al., (1991), Cohen et al., (1992), Каримова .1994) и другие исследователи.

Регуляция фосфоршшрования белков растений цАК№-зависимыми [ротеинкиназами и роль протеинфосфатаз при этом является в нас-■оящее время актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы Сило изу-:ение цАМФ-зависимой протеинкиназной активности и роли ферментов ;ефосфорилирования - фосфопротеикфосфатаз в регуляции уровня осфорилированности белков в клетках высиих .растений.

В задачи исследования входило:

- выявить цАМФ-зависимую протеинкиназную активность в экс-рактах из растений с помощью их высокоспецифичного белкового нгибитора и влияние на нее условий проведения опытов;

- выявить роль фосфопрот°инфосфатаз в регуляции уровня фосфо-илированности белков растений, в том числе цАКФ-зависимого;

Научная новизна работы. С помощью высокоспецифичного белково-

го ингибитора цАШ>-зависимых протеинкиназ ("Алга", С.-Петербург и "Sigma" USA) впервые показано, что цАМФ-зависимые протеинкина-зы могут быть активированы в разной степени уже в процессе приготовления гомогената и выделения белков, что может быть одной из причин трудностей в определении активности ферментов в тканях растений. Впервые в тканях растений выявлено влияние детергентов (додецилсульфата натрия и тритона Х-100) на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность.

Показано, что ингибиторы фосфатаз в разной степени увеличивали содержание фосфорилированяых белков растений в зависимости от вида ингибитора. Впервые показано изменение спектра фосфорилиро-ванных белков при действии ингибитора фосфатаз вольфрамата в высокой концентрации: увеличение фосфорилированности большого числа полипептидов, в том числе гиперфосфорилирование отдельных по-лилептидов, и одновременное изменение степени их цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования. Специфический ингибитор тиро-зинпротеинфосфатаз, ванадат натрия (ЮмМ), вызывал усиление степени фосфорилированности белков, фосфорилируемкх Са2+-зависимым способом.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физиолого-биохимических механизмов, лежащих в основе регуляции клеточной активности растений. Выявленная роль ингибиторов фосфатаз: вольфрамата, молибдата и ванадата натрия, активируемого ими фосфорилирования белков к связанное с ним изменение степени цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования объясняет механизм высокой токсичности этих солей - антропогенных стрессоров и является базой для создания более эффективных биотехнологических приемов Еыращивания растений.

Полученные результаты можно использовать в учебном процессе при чтении лекций.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 3-м съезде ВОФР (С.-Петербург, 1993); I1-м съезде Украинского общества физиологов растений (Киев, 1993); 9-м конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Чехия, Брно, 1994); научных конференциях КНЦ РАН (Казань, 1993-1995), XI конференции физиологов растений Югославии (Нови Сад, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ и подана в печать 1.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит ЗФ рисунков, /О таблиц. Слисок использованной литературы состоит \\ъЛу/ наименований, из них /<Я£на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные исследования выполнены на корнях зеленых растений и этиолированных проростках гороха Pisum sativum L. 2-12 дневного возраста, выращенных в лабораторных условиях на 1/4 среды Хог-ланда-Арнона под люминостатом (или в темноте).

Гомогенизацию проводили при 4°С в среде, состоящей из 50 мМ трис-буфера (рН 7,5); 1 мМ дитиотреитола (ДТТ); 1 мм фенилметил-сульфонилфторида (PMSF); 250 мМ сахарозы; 0,1 мМ теофилина; ЮмМ ЭДТА; 3% поливинилпирролидона (ПВП) и ингибиторов фосфатаз (где указано;. Гомогенат центрифугировали 3 минуты при 20000 g. Анализу подвергали супернатант и осадок, гомогенизированный в 500 мкл среды гомогенизации.

Грубую фракцию ядер получали по методу Дроевского и др. (1986) из корней 19-дневных зеленых растений гороха, выращенных под люминостатом (освещенность 10 кЛюкс) при 25° С.

Протеинкиназная активность определялась по методу Kikkawa et al. (1983) с модификациями (Каримова и др., 1991) во фракциях гомогената. Реакционная среда объемом 100 мкл содержала: 50 мМ PiPES-буфер рН 6,5; 5 мМ MgCl2; 1 мМ ДТТ; 0,5 мМ АТФ; [Г-ЗКР]-АТФ (500-800 тыс.имп-мин-1); 15-30 мкг белка; ЮмкМ цАМФ и различные ингибиторы фосфатаз (где указано). Радиоактивность просчитывали в толуольном сцинцилляторе (ЖС-1) на "Дельта-300 (США). Удельную активность фермента выражали в пмоль 32Р/мг белка в минуту. Проводился контроль на неспецифическое связывание 32Р на фильтрах. Содержание белка определяли по Лоури в осадках ТХУ. Параллельно пробы использовались для электрофореза белков по Laemmli (1970) в полиакриламидном геле с 0,1%-ным додецил-сульфатом натрия (SDS) с линейным градиентом 6-16% акриламида. Электрофореграммы фиксировали 50% этанолом и окрашивали 0,1% раствором Кумасси R-250. Радиоавтографию получали при экспозиции геля 14 дней при -20°С. Электрофореграммы и радиоэвтограммы сканировали на денситометра LKS 2202 ("LKB" Швеция) и ИФО-450 (Казань ) -

Фосфорилирование белков in vivo проводилось за 2 часа инкубации на слабом рассеянном свету отделенных от корней стеблей с листьями или целых проростков в растворах с Э2Р-ортофосфорной кислоты, цАМФ и АБК. Затем готовился гомогенат, учитывалось поглощение 32Рн проростками и фосфоридирование белков.

Опыты проводились в 3 биологических повторностях от 2 до S раз. В таблицах и рисунках приведены средние арифметические значения и средние квадратичные ошибки. Обсуждаются различия медду вариантами, достоверные при Po.oí-

В работе использовали [г~32РЬАТФ ( удельная активность 100С Кюри-ммоль-1) ПО "Изотоп"' (Ташкент); 32Р-ортофосфорную кислоту (удельная активность 5000 Кюри*ммоль"1) ПО "Изотоп"; MgCls "ВДН", PIPES, ДТТ, ЭГТА, цАШ, SDS, акрилачид и бисачриламид, KyMaccH-R-250, PMSF фирмы "Serva"; белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ (БИ) фирм "Sigma" (USA) и "Алга" (С.-Петербург), тритон Х-100 "Ferak"; соли вольфрамата, молибдата, вака-дата отечественные хч.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ цАМФ-ЗАВИСИМОЙ ПР0ТЕИНКИНАЗН0Й АКТИВНОСТИ ГОМОГЕНА-ТОВ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ С ПОМОЩЬ» ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНОГО БЕЛКОВОГО ИНГИБИТОРА ЦАМФ-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ.

Трудности в определении цАМ£-зависимой протеинкиназной активности в грубых экстрактах (Corbin, 1983), видимо, обусловил: немногочисленность публикаций по исследованию роли цАМБ-зависимых протеинкиназ в растениях. Высокая специфичность белкового ингибитора по отношению к каталитической субъединице цАМФ-зависимых протеинкиназ позволила нам использовать его для идентифи кации цАШ-зависимой протеинкиназной активности в грубых ткане вых экстрактах. Подавление фосфорилирования белков этим ингиби тором свидетельствует о наличии цАМФ-зависимых протеинкиназ, ве личина активности которых может быть выражена величиной подавле ния фосфорилирования ингибитором. В опытах мы использсвали бел ковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ фирм "Signa" (USA) "Алга" (С.-Петербург), выделенный из скелетных Мышц кролика cor ласно Walsh et al. (1971).

Таблица 1

Влияние белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ (БИ, 5мкг) на цАЩ>-зависимую протеинкиназную активность фракций гомо-гената этиолированных листьев гороха.

1 ■ |Возраст (растений 1 (дни) i Фракцгм | 32р i пмоль/мг белка-мин-1 | i

1 ■ Базальная i i |цАМФ, 10"8 М| i i ЦАШН-ЕИ |

1 5 | 10 1 супернатант) — г» — 1 1 102 ± 2 161 + 14 1 1 | 204 ± 6 | | 242 + 9 | i i 85 ± 1 I 132+6 |

1 5 | 10 1 1 осадок | - i» - i i 88 + 4 118 ± 12 1 1 | 127 ± 3 | | 197 ± 9 | ■ i 67 + 6 | *125 ± 14 |

* - разница с контролем недостоверна

В наших опытах в случае, когда наблюдалась стимуляция экзогенным цАМФ протешкияазноа активности, эта стимуляция снималась белковым ингибиторе» до уровня контрольного варианта и далее ниже, что однозначно свидетельствует о наличии цАМФ-зависимой про-теинкиназной активности в тканях растений (табл. 1).

Данные таблицы 2 спзаетельствуют о том, что в контроле, "ба-

Таблица 2

Влияние белкового ингибитора цАК®-зависимых протеинкиназ (БИ) на фосфорилирование белков гомогената этиолированных листьев гороха.

i i i-:-1

|Возраст | Фракция | 32Р, пмоль/мг белка • мин-1 |

| растений | гсмогената|-;-i-1-;—|

I (дни) | ] базадьное j БИ, 5 дат |% от базал. |

I-1--1-1-- I -1

I 2 |супернатант| 438 ± 11 | 314 ± 9 | 72 | I 10 | - » - 1 118 ± 2 |. 78 ± 5 | 66 |

I-к-1—-Н---Ч-1

I 2 | осадок | 436 ± 13 | 125 ±3 | 28 |

I 10 I - » - ! 108 ± 3 | 77 ± 2 | 71 | i__i_:_i_i_i_j

зальной" протеинкиназной активности, наблюдалась и цАМ2>-зависимая протеинкиназная активность. Величину цАМФ-зависимой протеин-киназной активности выражали в % от "бЗзальной" протеинкиназной активности (разность оставшейся активности от базальной).

Данные табл. 2 показывают, что цАМФ-зависимые протеинкиказы были активны in vivo или активировались в процессе приготовления гомогената. Для приготовления гомогеката листья отсекаются от целого растения, что уже является стрессовым фактором (Гордон, 1992; Пахомова, 1992), который, активируя аденилатциклазу, может повысить содержание эндогенного цАМФ в клетках растений (Каримова и др., 1993). Данные табл. 2 свидетельствуют о разном вкладе цАМФ-зависимой протеинкиназной активности в контрольную - от 28 до 72 % в разных опытах. Такая картина наблюдалась в проведенных нами десятках опытов.

Результаты наших исследований доказывают функционирование цАШ>-зависимых протеинкиназ в растениях и возможность определения их активности с помощью высокоспецифичного белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ; можно полагать, что одной из причин неудач в определении цАМФ-зависимой протеинкиназной ак-тиь юсти в тканях растений может быть активация ферментов эндогенным цАМФ еще до опыта, что маскирует их активацию экзогенным цАМФ в опыте. Такое предположение было сделано Ньютоном и Брауном в 1986 году (Newton, Brown, 1986).

ВЛИЯНИЕ ДЕТЕРГЕНТОВ НА УРОВЕНЬ цАМФ-ЗАВИСИМОГО ФООФОРИЖРОВАНИЯ БЕЛКОВ.

Данные литературы свидетельствуют о том, что различные детергенты изменяют конформацию биополимеров, в том числе и белков. Действие детергентов на исследуемую протеинкиназную активность было интересно с позиций имеющихся данных литературы о зависимости ее активности от доступности мест фосфорилирования в белках-субстратах для ферментов - протеинкиназ (кроме того, что активность цАМ$-зависимой протеинкиназы II регулируется автофос-форилированием), что определяется конформацией белков-субстратов и самого фермента. В качестве модификаторов конформации белков мы применили тритон Х-1Э0 и додецилсульфат натрия (0,01%), обработав ими грубую фракцию ядер, изолированных из корней 19-дневных растений гороха. Результаты одного из опытов с тритоном

Х-100 приведены на рисунке 1.

Данные рисунка 1 свидетельствуют о том, что детергент снизил базальный уровень фосфорилированности белков на'40% (рис. 1, варианты 1 и 3). Очевидно, это объясняется активацией протеин-фосфатаз детергентами (Kranics, Blornt, 1985). Использование белкового ингибитора цАШ-зависимых протеинкиназ показало, что доля цАМФ-зависимого фосфорилирования в необработанной детергентом грубой фракции ядер в контрольном варианте была равна 33% (рис.1, варианты 1 и 2); тритон Х-100 увеличил уровень за-

висимого фосфорилирования белков на 6% (рис. 1, варианты 3 и 4). Полученные результаты были характерны и для других опытов, однако, в отдельных случаях мы наблюдали уменьшение доли цАКФ-зави-симого фосфорилирования белков при обработке ядер детергентами. Для объяснения этого могут быть полезны данные литературы (Clarke Steven 1977), о том, что вызываемое детергентами изменение конформации белковых молекул зависит от упаковки их гидрофобных и гидрофильных остатков, что определяется' в живых клетках условиями окружающей среды.

На основании опытов, проведенных нами с детергентами можно сделать вывод о значении конформации белков растений для проявления активности цАМ£-зависимых протеинкиназ. Изменение конформации белков, вызванное детергентами, макет влиять как на активность самих ферментов, так и на доступность мест фосфорилирования в субстратах для протеинкиназ.

РОЛЬ ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ В РЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ИХ цАМФ-ЗАВИСИМОГО ШЯОРИЖРОВАНИЯ.

Одновременно с процессом фосфорилирования белков в клетках идет обратный процесс дефосфорилкрования, катализируемый фос-фопротеинфосфатазами. В литературе есть работы, касающиеся свойств кислых и щелочных фосфатгз в растениях (Kloeher, Lin-kins, 1988; Harsguchi Hircko et al., 1990; Хоритонов, Климаяевс-кая, 1990; Tadano eh al., 1991 и др.). В последнее время появились работы по протеинфосфатазач, активность которых подавлялась специфическими ингибиторами протеикоосфагаз (Polya, Haritou, 1S88; Mackintosh et al.,1989, 1990; Cohen, 1992). Чтобы показать потенциальную возможность протеинкиназ и вютад дефосфорклирова-иия в обский баланс фосфорилированных белков мы использовали не-

12г

10

в

Рис. 1. Влияние тритона Х-100 (0,01%) на фосфорилирование белков грубой фракции ядер, "изолированных из корней 19-дневных зеленых растений гороха. /

1. контроль; 2. БИ, 5мкг; 3. 30-'минутная обработка тритоном

Х-100; 4. обработка тритоном Х-100 + БИ.

БИ - белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ.

органические ингибиторы фосфатаз, механизмы действия которых хс-гошо изучены на щелочной фосфатазе E.coli. Важным является то, что фосфатазы обладают протеинфосфатазной активностью (Шуоич, Нагоев, 1980; Gellatly et al., 1993), и их ингибиторы проявляют свое икгибирующее действие и по отношению к фосфопротеинфосфата-зам (Chou et al., 1979).

Нами исследовалось влияние 6 различных ингибиторов фосфатаз (NaF, Na2W04, Ма2Мо04, Na3V04, КН2РО4, NagPgO?)- Максимальным действием на содержание 32Р в белках в наших опытах обладали мо-либдат и вольфрамат натрия.

Данные по концентрационной зависимости действия одного из ингибиторов фосфатаз - вольфрамата натрия (рис. 2) показали резкое увеличение включения 32Р б белки гороха при концентрации ингибитора 10 мМ; следует отметить, что стимуляция процесса наблюдалась и при концентрации 10_б-10~4 M (с небольшим пиком 5'10~5М), при которой (как показано в клетках животных и прокариот) ингибитор проявляет свое специфическое действие (Спиро, 1978).

Ингибиторы фосфатаз (молибдат и вольфрамат натрия) в концентрации 10 мМ повышали содержание 32Р в белках гороха в разных опытах от 3 до 80 раз; при этом изменялся уровень цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования белков, которые мы определяли с помощью белкового ингибитора цАШ-зависимых протеинкиназ и специфического хелатора Са2+ - ЭГТА.

Рисунок 3 представляет данные по влиянию ингибитора фосфатаз Na2W04 на степень базального и цАШ-зависимого фосфорилирования белков гороха. Ингибитор фосфатаз увеличил содержание 32Р в белках гороха в 14 и 40 раз в первом и втором опыте, соответственно (рис.3, А,Б). Действие белкового ингибитора показывает, что вольфрамат увеличил содержание 32Р в белках, фосфорилированных цАМБ-зависимым способом, с 24Z до 48% в первом опыте и уменьшил - с 45Z до 14% во втором опыте.

Данные рисунка 4 иллюстрируют действие двух ингибиторов про-теинфосфатаз - молибдата и вольфрамата натрия на степень Са2+ -зависимого фосфорилирования белков, которое определялось с помощью хелатора Са2+ - ЭГТА. Снижение включения 32Р в белки в вариантах с ЭГТА свидетельствует о том, что связывание Са2+ хе-латором, уменьшая концентрацию Са2+ в среде, вызывало падение активности Са2+-зависимых протеинкиназ.

£ гё

3

УА

1В

-й

нг иг лг* Ю- ю ¿тцм

Рис.2 Зависимость содержания ^Р з белках 3-.дневных этиолированных проростков гороха(осадок 20 000^) от концентрации воль-

фрамата в реакционной среде: ___ -контроль,

_._ -вольфраиат натрия

»-«г

, -г

»2-,

> I

130 120 т 100 90

во

70 60 50

м

5 Ч 3 2 1

12 3 4

1 2. 3 Ч

Рис. 3 . Влияние вольфрамата на степень цАШ-зависимого фос-форилиронания белков 11-дневных этиолированных листьев гороха (осадок 20000^) - А; изолированных ядер из корней 19-дневных зеленых ратений гороха' - Б.

1 - контроль; 2 - белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеин-киназ (БИ) 5 мкг; 3 - 10 мМ ТО42"; 4-10 ?лМ №042~+БИ.

Рис. 4. Влияние ингибиторов фосфатаз (10 мМ) и ЭГТА (5 мМ) на степень Са2+-зависимого фосфорилирования белков этиолированных 11-дневных листьев гороха (сулернатант 20000 е).

1. контроль; 2. ЭГТА, 5Ш; 3. М0О42", 10 мМ; 4. Мс042"+ЭГТА; 5. \(Ю4г~,10 мМ; 6. «042~+ЭГТА.

Приведенные данные по включению 32Р в белки гороха при действии ингибиторов фосфатаз - молибдата и вольфрамата натрия (ЮмМ) - подтверждаются данными электрофореза и радиоавтографии (рис.5 и 6), которые показывают, что в присутствии вольфрамата наблюдалось усиление фосфорилированности полипеп^идов низкой и средней мол. масс (в 2.5-6 раз); и особенно сильно (в десятки раз) - полипептидов высоких мол. масс 120, 138, 215, 245 кДа (рис. 6 А). Если в контрольном варианте экзогенный цАШ повышал в 4-5 раз уровень фосфорилированости полипептидов средней мол. массы от 25 до 67 кДа и снижал - у полипептидов низкой и высокой мол. масс (рис. 5 А), то совместное внесение цАМФ и ЭГТА в присутствии 10 мМ вольфрамата индуцировало резкое усиление фосфорилированности полипептидов средних мол. масс от 10 до 53 кДа (10, 12, 17, 20, 25, 36, 41, 50, 53) и усиливало наблюдавшееся в присутствии одного вольфрамата гиперфосфорилирование полипептидов 120, 138, 215, 245 кДа (рис. 6 Б). Фосфорилирование полипептидов снижалось хелатором Caz+ - ЭГТА отдельно (кроме одного полипептида 24 кДа) (рис. 5 Б) и в присутствии вольфрамата (рис. 6 Б). Очевидно, причина этого - элиминация Са2+-зависимого фосфорили-рования или активирование цАМФ-зависимого фосфорилирования, согласно каскадной регуляции фосфорилирования-дефосфорилирования белков (Ingebritsen, Cohen, 1983).

Повышение уровня фосфорилированности белков гороха в 14-80 раз (рис. 3, 4 и 6) в присутствии высоких концентраций (10 мМ) вольфрамата можно объяснить его действием в качестве ингибитора фосфатаз, которую он выполняет в тканях животных и прокариот в концентрации 10-6-10~4 М (Спиро, 1978). Сведения о чрезвычайно высоком уровне активности протеинфосфатаз типа 1 и 2А в растениях и возможности ингибирования их активности специфическими ингибиторами в 66 раз (Mackintosh et al., 1989) могут объяснить такое повышение уровня фосфорилированности белков, которое наблюдалось в наших опытах. Полученные нами данные подтверждают большую мощность протеинфосфатаз в растениях, что вполне объяснимо в свете необходимости выключения внешнего сигнала после реализации клеточного ответа. Нельзя исключить,"что взятые ингибиторы протеинфосфатаз - двухвалентные анионы могут -индуцировать структурный переход в белках клубок-спираль (Lee et al., 1976), что может резко увеличить доступность мест фосфорилировайия для различных протеинкиназ (Kennelly, Krebs, 1991) и объяснить наб-

V» V» »а.

«Ч Ч»

нол.кассо^йс}

«ч

Рис. 5. Денситограмш радиоавтографов фосфоршшрованньк полипептидов 6-дневных этиолированных листьев гороха, разделенных с помощью электрофореза по-Лзшлш'в градиенте ПААГ 6-16%:

А......-контроль;

Б......-контроль;

_- цАМ2>, 10~8 М; ЗГГА, 5иМ..

Л

«п 1 & N 5 «» ^

•л Ч\ Ц

*плнскса, «&}

Рис. 6. Денситограмкы радиоавтографов фосфорилированньи полипептидов 6-дневных этиолированных листьев гороха, разделенных с помощью электрофореза по Лэмихи в градиенте ПААГ 6-16Х: А......-контроль; _- ТО42", Ю мМ;---- И042~+ЦАМФ,10_8М;

Б......-контроль;

_- И042~+ЭГТА,5

- -- М342~+ЦАШН-ЭГТА.

людавшееся в наших опытах гиперфосфорилирование белков в присутствии двухвалентных анионов вольфрамата и молибдата. В пользу этого свидетельствуют и наши данные, которые показали, что только двухвалентные аниог I МоО2- и вызывали гиперфосфорилирование белков гороха.

Данные рисунков 3-6 свидетельствуют о том, что в вольфра-мат-индуцированном гиперфосфорилировании белков значительная доля принадлежала цАМФ- зависимым протеинкиназам (об этом свидетельствуют данные о действии их белкового ингибитора и экзогенного цАШ), в- то время как в контрольном варианте цАМФ-зависимая протеинкиназная активность была меньше. Эти результаты могут быть объяснены увеличением активности ферментов в варианте с М042~ из-за фосфорилирования регуляторной субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы типа II (Северин, 1991), что приводит к увеличению скорости диссоциации ее субъединиц и ингибированию их реассоциации (СогЫп, 1983). Кроме того, возможно появление в белках-субстратах дополнительных доступных для цАМФ-зависимых протеинкиназ мест фосфорилирования, что могло быть следствием структурного перехода клубок-спираль, индуцированного вольфрама-том.

Исходя из представленных нами экспериментальных данных и данных литературы, можно думать, что действие высоких концентраций вольфрамата на содержание 32Р в белках растений может быть связано: 1) с ингибированием протеинфосфатаз; 2) с повышением активности протеинкиназ; 3) с увеличением мест фосфорилирования з белках-субстратах для протеинкиназ.

Явление гиперфосфорилирования белков в присутствии высоких концентраций вольфраматов и молибдатов (вследствие чего выходит из строя система регуляции обмена веществ с помощью вторичных посредников) может объяснить токсическое действие этих тяжелых металлов при аккумуляции в организме. Б этом свете можно рассматривать данные Калакуцкого с сотр. (1991) о связывании полипептидами семян люпина вольфрамата, молибдата и других тяжелых металлов.

ВЛИЯНИЕ ВАНАДАТА НАТРИЯ НА УРОВЕНЬ ФОСФОгаМРОВАННОСТИ БЕЛКОВ ГОРОХА. "

Ванадат является специфическим ингибитором тирозинпротеин-

фосфатаз (Ramachandran, 1992), ферментов, дефосфорилируищих белки, фосфорилированные тирозинпротеинкиназами, которые в тканях животных участвуют в процессах неконтролируемого опухолевого роста. На тканях растений показана активность тирозинпротеинки-наз и их зависимость от Са2+ (Guo Yan-Lin, 1992), а также активность тирозинпротеинфосфатаз, чувствительная к ванадату (Gellat-ly et al., 1993). Наши опыты показали, чтс ванадат вызывал увеличение содержания фосфата в белках, фосфорилированных Са2+-зависимым способом (рис. 7). Об этом свидетельствуют результаты опытов с хелатором Са2+ - ЭГТА, который снизил ванадат-индуцированное повышение включения 3ZP в белки в 2,5 раза, что свидетельствует о Са2+-зависимости процесса. Дополнительным свидетельством этого являются данные по действию хлорпромазина (ХП) -специфичного ингибитора комплекса Са2+-кальмодулин. В то г.е время белковый ингибитор цАМ5-зависимых протеинкиназ; который в контроле уменьшил содержание 32Р в белках на 55%, в варианте с ванадатом не оказывал своего действия.

Обнаруженное нами увеличение содержания фосфорилированных белков при действии ванадата натрия позволяет косвенно судить о наличии1тирозинпротеинфосфатаз в растениях.

ВЛИЯНИЕ АБК НА 'ХОСЖОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ.

Одним из доказательств участия сигнальной системы цА),Э в клетках растений является изменение фосфорилированности белков при действии экзогенных фитогормонов.

Известно, что в процессах адаптации растений к стрессовым условиям важная роль прянадяеялт АБК. С другой стороны показано, что сигнальnai система цАМЭ принимает активное участие в т»санях животных при различных стрессах (Дсрсфвев и др., 1978). Данные об участии цАМЭ в ответных реакциях растений на. стресс-факторы получены в работах Мгксятовон с сотр. (1989) и Кариновой с сотр. (Каримова, Жуков, 1991). Olaf и Martin (1993) показали изменение спектра фосфорилированных белков Funaria hydrcmetrica под действием АБК (Ю-5 М).

Нами изучено действие экзогенной АБК (Ю-6 М) на спектр фос-форилироваиаи белков и протеиякиназную активность листьев гороха. Денситограздш радиоавтографов электрофсреграим фосфорилированных белков при 2х-ч2Совом действии АБК in vivo показали, что

Рис. 7. Влияние ванадата натрия (У043_) на включение Э2Р в белки 7-дневных этиолированных проростков гороха (осадок 20000г).

1. контроль; 2. цАЩ., ЮмкМ; 3. цАМЗН-БИ, 5мкг; 4.У043~,10 мМ; 5. У043"+ЦАШ; 6. У043~+цАШ*БИ; 7. У043~+цАШн-ЭГТА, 5 мМ; 5. У043"+ЦАКИНЗГТА+ХП, ЮмкМ.

БИ - белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ, ХП - хлорпромазин.

АЕК неоднозначно изменяла фосфорилированность отдельны:', полипептидов, повышая фосфорилированность фракций полипептидов мол. массы от 20 до 30 кДа; 43 кДа; 50 кДа и выше, в то же время снижая фосфорилированность полипептидов низких мол. масс, до 15 кДа и не изменяя - от 15 до 20 кДа и 32, 40 кДа.

Результаты опйтов, представленные в таблице 3, свидетельствуют о тем, что за 2 часа инкубации АБК повышала протеинкиназную активность обеих фракций гомогепатз. За 2 ^.часа инкубации цАМФ СЮ"6 М) также стимулировал протеинкиназную активность в супернатанте и осадке. Однонаправленное действие АЕК и экзогенного цАМФ предполагает, что в механизмы действия АБК включена цАШИлессенджерная система. Считается, что воспроизведение вторичным мессендкером эффекта гормона, является доказательством участия мессенджера в механизме действия гормона (Ивашкин,1987).

Однако в 2-х случаях действие АБК на протеинкиназную активность было выше, чем цАМФ (табл.3, оп.1 и 3). Возможно, это объясняется стимуляцией АБК не только цАМФ, но и Са2+-полифосфоино-зитольной системы. Данные о действии гормонов через две системы

Таблица 3

Влияние АБК и цАМ5 in vivo на удельную протеинкиназную активность этиолированных листьев гороха при 2х-часовой инкубации отсеченных от корней стеблей с листьями.

1 7 1 1 I N I |п/п| I I возраст растений (ДНИ) фракции гомоге-ната 32Р, пмоль/мг белка1мин J -1 1

i i контроль|цАМФ,10_бМ| i i i i АБК, 10_6М|цАШ+АБК |

1 1 1 1 1 1 1 1 2 | i i 5 6 суперна тан? — 1» — 139 + 9 | 1 87 ± 15| i *1б5 ± 10 | 189+4 | i 397 ± 17 | 1 159 ± 16 | i i "174 + 12| 1 210 ± 12| i

1 1 1 з | 5 осадок I 271 + 16| 1 406 ± 12 | 1 541 + 21 | i 1 576 ± 18| i

1 i 1 4 | i i 6 — »1 — 1 266 ± 11| i 368 + 6 | i 1 376+27 | 1 I 589 + 14| i

* - разница с контролем недостоверна

вторичных мессенджеров получены на тканях животных (Segaloff,

Askoli, 1988).

При совместном действии цАМБ и абсцизовой кислоты на протеин-киназную активность наблюдалась неоднозначная картина. Б 2 случаях совместный эффект АБК и цАШ> был равен эффекту одного из них (табл. 3, опыт 2 и 3), в одном случае меньше эффекта АБК, в другом больше. Возможно, это объясняется взаимоотношениями Са2+-и цАМФ-зависимых протеинкиназ при действии АБК (Owen, 1988). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в механизмы действия фитогормона АБК включена система вторичных посредников: что подтверждается влиянием АБК на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность и спектр фосфорилированных белков.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые установлено, что специфический белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ подавлял стимуляцию протеинкиназ-ной активности экстрактов из тканей растений, вызванную экзогенным цАМБ, что свидетельствует о наличии цАМФ-зависимой протеинкиназной активности в растениях.

2. Впервые показано влияние на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность тканей растений детергентов додецилсульфата натрия и тритона Х-100.

3. Обнаружено более десяти фосфорилированных полипептидов в листьях гороха; соотношение о2Р е них изменялось в зависимости от условий проведения опытов: действия экзогенного цАМФ, ингибиторов протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз.

4. Впервые показано, что ингибиторы фосфатаз вольфрамат и молиб-де.т натрия в высокой концентрации многократно повышали степень фосфорилированности большого числа полипептидов, вызывая даже "гиперфосфорилирование" полипептидов фракций 120, 138, 215, 245 кДа.

5. Ванадат натрия вызывал увеличение содержания 32Р в белках, которое снималось при внесении в реакционную среду хелатора Са2+ - ЭГТА.

6. Фитогормон АБК изменял спектр фосфорилированных белков листьев гороха. Экзогенный цАМФ действовал на протеинкиназную активность в том же направлении, что и АБК.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Каримова Ф.Г., Бунтукоза E.K., Тарчевская O.II., Алимова JI.А. Роль фэсфатаз в, регуляции фосфорилйрования-дефосфоршшрования белков растений // Деп. в ВИНИТИ. N 43-В93. 1993.

2. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Алимова Л. А., Мурсалимова Н.У. цАМФ-зависимые протеинкиназы растений // Деп. в ВИНИТИ. N 46-В93. 1993.

3. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Алимова Л.А., Мурсалимова Н.У. цАМФ-зависимое фссфорилирование белков растений // Тез. докл. II съезда Украинского общества физиологов растений. Киев, 1993. Т.1.. С.88 "

4. Каримова Ф.Г.Бунтукова Е.К., Алимова Л.А. Влияние тяжелых металлов (вольфрамат, молибдат натрия) на активность протеинки-наз и протеинфосфатаэ в растениях // Тез. докл. II съезда Украинского общества физиологов растении. Киев, 1993. т.1. С.88.

5. Закирова Л.А., Каримова Ф.Г., Мурсалимоза Н.У. Влияние тяжелых металлов (вольфрамат, ванадат и молнбдат натрия) на активность протеинкияаз и протеинфосфатаэ в растениях // Тез. докл. III съезда ВСЙР. С.-Петербург. 1993. С. 567. •

6. Karirova F.G., Zakirova L.А., MursaJirova N.U., Tarchevsky ■I.A. с АШ3-dependent protein kinass activity detertmination in etiolated pea seedlings // Abstracts 9th congress of FESPP. Brno. 1994. Y.38.

7. Каримова Ф.Г., Тарчевский И.А., Закироза Л.А. Влияние тяжелых металлов на фосфорилнрованность белков гороха // Биохимия. 1995. - В печати.