Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзогенных ретиноидов на ростовые процессы растений, синтез белков и их фосфорилирование

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных ретиноидов на ростовые процессы растений, синтез белков и их фосфорилирование"

pvb ОД

о ч 0\П ® L VJl к/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи УДК 581.121:631.589

БАКУРИДЗЕ ЦИАЛА ЛЕВАНОВНА

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РЕТИНОИДОВ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗ БЕЛКОВ И ИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань -

1 995

Работа выполнена в Казанском научного центра РАН.

Научные руководители

институте биологии Казанского

- кандидат биологических наук, АНДРИАНОВА Ю.Е.

- доктор биологических наук, КАРИМОВА Ф.Г.

Официальные оппоненты

- доктор биологических наук, профессор ЧИКОВ В.И.

- кандидат биологических наук, СИДОРОВ В.П.

Ведущая организация - Казанский государственный

университет, кафедра физиологии растений

/'/ I * - АнОО

Защита состоится " 7 " 1 99 5 г. в "/ , часов

на заседании специализированного Совета К.002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503, г.Казань, а/я 30).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского физико-технического института КНЦ РАН.

Автореферат разослан " 3 " 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Ос

Н.Л.Лосева

- з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: В клетках растений одновременно идут реакции синтеза (анаболические) и деградации (катаболические) биополимеров и липидов. В стрессовых условиях реакции катаболизма усиливаются. Продукты катаболических реакций выполняют разнообразные функции, одна из которых - сигнальная (Тарчевс-кий, 1991; Гречкин, 1992). Некоторые продукты деградации липидов являются гормонами (жасмонат, метилжасмонат, абсцизовая кислота и др.); они регулируют в клетках важнейшие процессы транскрипции и трансляции (Neumann et al., 1989; Parthier, 1990 и др. ).

Особой группой мембранных липидов являются олигопреноиды, функционирующие 8 хлоропластах и митохондриях самостоятельно или в составе более сложных соединений. Работ об их катаболизме относительно немного. Наибольший интерес представляют данные о деградации В-каротина в модельной системе с липоксигеназой, выделенной из сои (Simpson et al., 1976). При этом идентифицированы: моноэпоксиды В-каротина, конъюгаты полиеновых кетонов, апокаротинали (Сзо и С27) и, что представляет для нас наибольший интерес, B-Ciз -кетон, имеющий структурное сходство с 20-углеродными ретиноидами. Последующие исследования показали возможность деградации В-каротина до ретиноидов в высших растениях (Karnaukhov, 1990) и водорослях (Saranak, 1989; Saranak, Foster, 1994). В клетках животных В-каротин подвергается энзи-матическому превращению в ретиналь при участии фермента 15,15'-диоксигеназы (ЕС 1.13.11.21), которому также, как и ли-поксигеназе, необходим 0г для окисления. Продукты деградации В-каротина - ретиноиды - помимо своего основного назначения (зрительные пигменты), выполняют в клетках животных роль регуляторов разнообразных процессов: синтеза белка, нуклеиновых кислот, транспортных процессов и т.д. (Афанасьев, 1983). Показано, что они обладают антиканцерогенным действием (Peto et al., 1981).

Нужно заметить, что время жизни фотосинтетических пигментов

относительно невелико, особенно при стрессах, и выяснение возможной роли регуляторной (сигнальной) роли интермедиатов катаболизма каротина является чрезвычайно актуальной задачей для понимания особенностей формирования стресс-реакции и регуляции процессов жизнедеятельности растений.

Цель и задачи исследования: Целью нашей работы было изучение особенностей действия 0-каротина и продуктов его деградации: ретинола, ретиналя и ретиноевой кислоты (ретиноидов) на рост растений и отдельные стороны метаболизма клеток растений. В задачи исследования входило изучение влияния 0-каротина и ретиноидов на:

1) прорастание семян различных растений, рост отдельных органов и накопление биомассы в культуре клеток;

2) синтез белков;

3) протеинкиназную активность и фосфорилирование белков растений.

Научная новизна: Впервые исследовано действие ретиноидов на ростовую функцию растений, синтез белков и их фосфорилирование. Показано, что продукты деградации 0-каротина обладали активирующим прорастание семян действием. Наблюдался синергизм действия ИУК и ретинола в стимуляции роста колеоптилей пшеницы. Ретинол, изменяя соотношение 14С в образующихся из меченых аминокислот полипептидов, усиливал радиоактивность фракции полипептидов

17 и 47 кД колеоптилей пшеницы и уменьшал 19, 25, 28, 30, 38, и 55 кД. При совместном действии ретинола и ИУК значительно увеличивалась удельная активность фракций полипептидов 17 и 38 кД по сравнению с контролем. Ретиналь стимулировал цАМФ-зависи-мую протеинкиназную активность, одновременно подавляя активность Са2*-зависимых протеинкиназ в листьях гороха. 2 мМ раствор этанола стимулировал Са2 ♦ -зависимую протеинкиназную активность и рост колеоптилей пшеницы.

Практическая значимость: Полученные результаты вносят определенный вклад в понимание взаимоотношений анаболических реакций с реакциями катаболизма. Полученные результаты могут быть

использованы в биотехнологии как основа для поиска новых способов регуляции роста культур клеток и тканей и в практике сельского хозяйства для повышения интенсивности ростовых процессов растений.

Апробация работы: Результаты работы доложены на Отчетном Совещании Центрального совета Всесоюзного биохимического общества и национального комитета советских биохимиков (Казань, 1988); на II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 1989); на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990); на III съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); на III Международной конференции по регуляторам роста и развития растений (Москва, 1995); на итоговых научных конференциях КГУ (Казань, 1990, 1995); на отчетных конференциях Казанского института биологии КНЦ РАН (Казань, 1989 - 1995).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, одна работа находится в печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на ib3 страницах и содержит 12 таблиц и 35 рисунков. Список литературы состоит из 182 наименований, в том числе 107 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Основные исследования выполнены на семенах, корнях, листьях и колеоптилях различных культур (кукуруза, горох, огурцы, пшеница), выращенных в лабораторных условиях. Кроме того, объектом исследования являлась каллусная культура сои сорта Мелкосеменная. Ретиноиды растворялись в этиловом спирте, затем путем ступенчатого разведения дистиллированной водой раствор доводился до концентрации ретиноидов (10"3-10"9М). Контролем служили растворы этанола соответствующей концентрации.

Определение прорастания семян. Семена проращивали в раст-

ворах ретиноидов (в контроле - в растворах этанола) при температуре 22° С в чашках Петри. В каждом варианте бралось по 100 семян (10 чашек по 10 семян в каждой). Ежедневно фиксировался процент прорастания семян.

Способ получения каллуса. Каллус из эпикотилей сои был получен в нашей лаборатории с использованием методов, разработанных в лаборатории Р.Г.Бутенко (Бутенко, 1964). Каллус выращивали на модифицированной среде Филлипса (Калинин и др., 1980). Скорость нарастания каллусной массы определяли путем взвешивания на аналитических весах в стерильных условиях 10-12 кусочков каллуса в начале пассажа и через 21 день. Рассчитывали их среднее значение и относительную скорость нарастания к концу эксперимента по формуле Бутенко (1964). Ретиноиды в концентрации 10-э-10"®М вносили при посеве, в контрольном варианте вносили растворы этанола.

Метод определения ИУК-зависимого роста колеоптилей. В опытах использовали отрезки колеоптилей 2-х дневных этиолированных проростков пшеницы (Московская 35). Колеоптили по 40 штук помещали в чашки Петри с растворами фосфатного буфера и эффекторов и выращивали в термостате (25-28°С). Наблюдали динамику роста колеоптилей в следующие отрезки времени: 0, 1, 3, 5, 7 и 22 часа. Длину колеоптилей измеряли при помощи микроскопа (с использованием окуляра 8* и диоптрийной насадки). Влияние ИУК и ретиноидов на рост колеоптилей пшеницы определяли по модифицированному методу Бояркина (1966).

Определение интенсивности синтеза белка. В опытах использовали 10-миллиметровые отрезки колеоптилей 2-х дневных этиолированных проростков пшеницы (Московская 35), выращенных в темноте при 25°С. Отрезки вырезали на специальном станке на 4 мм ниже верхушки колеоптиля, выталкивали из них первичные листья и промывали дистиллированной водой. Интенсивность синтеза белка определяли с помощью меченых С14-аминокислот. Использовали смесь аминокислот (Чехословакия). Радиоактивный препарат в конечной концентрации 2 мВд в 10 мл воды инкубировали с отрезками коле-

оптилей (по 40 шт.) в термостате при 27°С (1 час). После одночасовой прединкубации в среду с отрезками опытного варианта добавляли 1мл раствора ИУК (конечная концентрация 10"7М) и ретинола (конечная концентрация 10"5М), а в среду с отрезками контрольного варианта - такое же количество воды. Экспозиция с ретинолом и ИУК составляла 1.5 часа. Колеолтили гомогенизировали в трис-глициновом буфере (0.01 М, рН 8.3). Растворимую фракцию белков отделяли центрифугированием (20000 д). Полученный экстракт разделяли в 9% полиакриламидном геле в 0.001М трис-глици-новом буферном растворе (рН 8.9). Электрофорез проводили в 3-5 повторностях (Остерман, 1988). Белковые фракции после многократного отмывания от краски нарезали на 8 зон. Во всех экстрактах измеряли плотность окраски на фотометре КФК-3 с красным светофильтром и определяли количество белка по методу Бредфорда (Bradford, 1976) по калибровочной кривой, построенной с использованием бычьего сывороточного альбумина. В этих же экстрактах измерялась, радиоактивность на жидкостно-сцинтилляционном счетчике Дельта-300 (США), далее рассчитывали удельную радиоактивность каждой белковой зоны.

Определение протеинкиназной активности и фосфорилирования белков растений. Объектами исследования служили семена гороха, отрезки 2-дневных колеоптилей пшеницы и отделенные стебли с листьями 10-дневных зеленых растений гороха, которые инкубировались в растворе 1 мкМ ретиналя на свету 2-3 часа. Протеинки-назная активность и фосфорилировние белков определялись в реакции переноса 32Р-ортофосфата из Т-положения молекулы АТФ на белок во фракциях гомогената - в супернатанте и осадке после 3-х минутного центрифугирования при 20000 д. Протеинкиназную активность фракций гомогената определяли по Kikkawa et al.,(1983) с модификациями); цАМФ-зависимое фосфорилирование белков определяли с помощью стандартного специфического белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ из скелетных мышц (Sigma, USA и Ал-га, С-Петербург). Са2+-зависимое фосфорилирование белков исследовали с помощью ЭГТА - хелатора Ca2t и антагониста кальмодули-

на - хлорпромазина. Удельную активность протеинкиназ выражали в пикомолях згР/мг белка в минуту. Проводился контроль на неспецифическое связывание 32Р на фильтрах. Фосфорилированные белки разделяли методом электрофореза по 1.аетт11 (1970) с последующей радиоавтографией. Электрофореграммы и радиоавтограммы сканировали на денситометре ИФО-450 (Казань). Содержание белка определяли по 1оучгу (1951).

Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики (Зайцев, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние каротина и продуктов его деградации на прорастание семян, рост корней и накопление биомассы каллусной культурой сои. Растворы каротина в концентрации от 10"10 до 10~4М за 48 часов увеличивали прорастание семян кукурузы по отношению к контролю - дистиллированной воде - на 13-20%, за 72-96 часов -на 44-46% (рис.1). Следует отметить, что раствор каротина высокой концентрации (10_гМ) сильно подавлял прорастание семян, особенно в начальный период прорастания. Максимум стимуляции прорастания семян наблюдался при концентрации каротина 10~5М. Это согласуется с данными Кирявцевой (1966), показавшей стимуляцию роста биомассы каллусной культуры малины в 2-3 раза при

: Юг

внесении каротина в среду для выращивания. Далее исследовали действие экзогенно вносимых продуктов деградации каротина: ретинола, ретиналя и ретиноевой кислоты на скорость роста растений.

п 100(-

Ю-го 10-' 10-' 10"' 10"' 10-' !0-< 10"3 10"»

каротин,м

Рис.1. Влияние каротина на прорастание семян кукурузы:

1 - за 48 часов, 2 - за 72 часа, 3 - за 96 часов. Прерывистой линией показан соответствующий контроль

На рис.2 представлены данные по влиянию водно-спиртовых растворов ретинола на процент прорастания семян гороха за 24 часа. Наибольший процент стимуляции за 24 часа (по сравнению с контролями: растворами этанола - на 38-55% и с дистиллированной водой на 100%) наблюдался при концентрации ретинола 10-в-10-6М. Как видно из приведенных данных, два контроля были необходимы, т.к. спиртовый раствор даже без ретинола вызывал стимуляцию роста. Высокие концентрации растворов ретинола в спирте (10"4-10"3М), а также самого этилового спирта (2х10"2-2х10"1М) подавляли прорастание семян. Наши опыты показали, что наибольшая стимуляция прорастания семян растворами ретинола отмечалась за 24 часа, со временем его эффект уменьшался. Сопоставление временного действия каротина и ретинола на прорастание семян указывает на специфичность их действия: если стимулирующий эффект растворов каротина увеличивался со временем до 96 часов (рис.1), то эффект растворов ретинола со временем, наоборот, уменьшался (данные приведены в диссертации). Возможно, это обусловлено более быстрой метаболизацией ретинола, по сравнению

с каротином.

: 2')

10-" Ю-3 10-* Ю-3

,___.__ 1___(___ ь ^Ре^ино^. м

2x10""1 >х10-~* 2х10-> 2х10-"< 2x10"3 2x10-! 2хГо-'

этанол,м

Рис.2. Концентрационная зависимость действия растворов ретинола и этанола на прорастание семян гороха за 24 часа: 1 - ретинол+этанол, 2 - этанол, 3 - вода

Данные по действию ретиное-вой кислоты разной концентрации на прорастание семян огурцов за 24 часа приведены на рис.3. Как и остальные ретино-иды, ретиноевая кислота в концентрации от 10-9 до 10"5М

стимулировала начальные этапы прорастания семян. Особенно наглядно это проявилось через 15 часов после замачивания, когда в

контрольном варианте прорастание полностью отсутствовало. Через 24 часа после замачивания разница между контролем и опытом была ниже (44%). Высокая концентрация ретиноевой кислоты (10"3М)

практически полностью подавляла прорастание семян.

. 20 I-:

5 ! 00!

2x10"' 2x10"'2x10-' 2х10-< 2х10"3 2х10"! 2x10"'

этанол,М

Рис.3. Действие ретиноевой кислоты и этанола на прорастание семян огурцов за разные промежутки времени:

15 часов после замачивания: 1 - ретиноевая кислота+этанол, - этанол (прорастания нет), - вода (прорастания нет);

24 часа после замачивания: 2 - ретиноевая кислота+этанол, 3 - этанол, 4 - вода

наблюдался при концентрации ретинола 10"5М.

Техника получения и поддержания культуры клеток и тканей открыла исследователям возможность углубленного изучения механизма действия различных физиологически активных соединений на метаболизм и рост клеток растений.

Ретиноиды оказывали влияние не только на скорость прорастания семян, но и на рост корней. На рис.4 представлены данные по действию ретинола на рост корней

огурцов, которые показывают, что наибольший эффект

ю-3 ю-'

ю-з

ретинол,М

~2х 10-'> 2x10*' 2x1 О" ' ~2х 10" 3~ 2х 1 0" г 2x10- 1

этанол

Рис.4. Влияние ретинола и этанола на рост корней огурцов после 48 часов воздействия: 1 - ретинол+этанол, 2 - этанол, 3 - вода

Это обусловлено высокой чувствительностью каллусных культур к условиям культивирования (Бутенко, 1984). Мы провели опыты по действию каротина и продуктов его деградации на каллусную культуру сои. Полученные данные показали, что биомасса каллуса в

контрольном варианте при выращивании на свету была на 36% меньше, чем в темноте при прочих равных условиях. Масса каллуса на свету была равна 2.5+0.2, в темноте - 3.9+0.1 г/г сырого веса. Ингибирование светом роста каллусной культуры известно (Бутен-ко, 1977). Шахов и Станкова (1978) показали торможение процессов клеточного деления и растяжения, роста каллуса и образования из него растений при длительном освещении каллусов. По нашим данным на свету наблюдалось более сильное рост-стимулирую-щее действие ретиналя (увеличение биомассы на 116%) (табл.1, гр.З), чем в темноте. При выращивании каллуса сои в темноте небольшой стимулирующий рост эффект ретиналя проявлялся лишь в концентрации 10"8 -10"9 М (табл 1, гр.2,3).

Таким Об— ТА.БПИЦА \ . Действие ретинапя на прирост биомассы каппуснои культуры сои на свету и в темноте (30 пассаж)

разом, наши результаты показали, что каротин и ре-тиноиды стимулировали прорастание семян, рост корней и колеоптилей, прирост биомассы каллусной культуры. Оптимальная концентрация, при которой наблюдался наибольший рост-стимулирующий эффект, в большинстве случаев была равна 10"5М, в случае культуры клеток - 10"в-10-5М. Высокие концентрации каротина и ретиноидов (10-3-10"гМ) тормозили рост. Наибольшая стимуляция ретиноидами наблюдалась на начальных этапах процесса прорастания, что свидетельствует о влиянии ретиноидов на пусковые механизмы прорастания семян. На каллусной культуре сои мы показали, что ретиналь максимально стимулировал прирост биомассы каллуса на свету (на 116%). Ретиналь не только снимал световое блокирование роста каллуса, но и вызывал превышение темно-вого уровня ростовых процессов, это чрезвычайно интересный эффект, объяснение которого представляет самостоятельную задачу.

Условия опыта Прирост каппуса, за 21 день (X от контроля)

Контроль Ретиналь, М

3.5ЧО-' 3.5*10"» 3,5*10-' 3.5*10-8

1 2 3 4 5

Свет Темнота 100 100 132 1 1 7 216 1 13 196 95 1 64 89

Влияние ретиноидов и ИУК на удлинение колеоптилей пшеницы. Показано, что начальные этапы прорастания семени связаны с инициацией роста растяжением клеток зародыша корня (Обручева, 1985). Полученные нами результаты по влиянию ретиноидов на начальные этапы прорастания позволяют предположить, что ретиноиды модифицируют процессы ауксин-зависимого роста. Известно, что физиологическое действие ауксина на растения - это усиление роста, обусловленное стимуляцией растяжения клеток. Стимуляция роста зависит от концентрации ауксина. Наши исследования проводились на копеоптилях пшеницы, как наиболее специфическом тест-объекте на действие ИУК. ИУК стимулировала рост колеоптилей пшеницы на всем протяжении опыта в концентрации 10~7 10"5 М, концентрация ИУК в 10"3М оказывала стимулирующий эффект только в начальном периоде (через 1 час после обработки отрезков колеоптилей) (рис.5). Высокая концентрация ИУК (10"3М) на протяжении всего периода наблюдения ингибировала рост колеоптилей. Наибольшая стимуляция роста (в 4-6 раз) под действием ИУК наблюдалась за 1-5 часов после обработки. Начальные этапы действия ИУК связывают с активацией протонной помпы и подкислением среды выращивания, дальнейшая стимуляция роста объясняется синтезом специфических белков, участвующих в ростовых процессах

(Гэлстон и др., 1983).

о. 7 I-

Время инкубации (часы) Рис.5. Влияние ИУК на прирост 2-х дневных отрезков колеоптилей пшеницы во времени: I - контроль (фосфатный буфер), II - контроль (этаноп 2 тм), III - ИУК (10"'М), IV - ИУК (Ю-'М). V - ИУК (Ю-'М), VI - ИУК ( 10"3 м)

На рис.6

представлены данные опыта по воздействию растворов ретинола в разной концентрации (от 10-3 до 10"3 М) на рост отрезков 2-х

дневных колеоптилей пшеницы. Из испытанных кон-

центраций стимулирующим рост отрезков действием за 1-3 часа обладали 10"9 -10"5М растворы ретинола, а за 5-22 часа лишь 10"7 -10"5М. Высокая концентрация ретинола (10"3 М) подавляла рост отрезков колеоптилей. На этом объекте наибольшим стимулирующим рост эффектом за 1-5 часов обладал 10"5М раствор ретинола. Это согласуется с данными по росту корней огурцов (рис.4), где максимум стимуляции роста корней (в 2 раза) наблюдался при концентрации ретинола 10"!М. Данные по приросту отрезков колеоптилей за единицу времени (мм/час) показали максимум стимуляции роста растворами ретинола за первые 3-5 часов. Затем эффект ослабевал, что характерно для действия физиологически активных соединений через мессенджерные системы. Стимуляция ретинолом роста колеоптилей резко уменьшалась после 5 часов инкубации (рис.6). Следует отметить различие в величине стимуляции роста колеоптилей в вариантах с ретинолом и ИУК за 1 час действия, что может объясняться отличием их механизмов действия.

Оптимальной для роста колеоптилей пшеницы с 3 часов действия и далее оказалась концентрация ИУК - 10"7М, которая в дальнейшем использовалась при комбинированном действии ИУК и ретинола (рис.7). Совместное действие ретинола и

7 22

Время инкубации (часы) Рис.б. Временная зависимость действия ретинола на прирост 2-х дневных отрезков колеоптилей пшеницы:

I - контроль (Фосфатный буфер), II - контроль (этанол, 2mM), III - ретинол (10'ЭМ), IV - ретинол (Ю-'м), V - ретинол (ю-»М), VI - ретинол (10* 3M)

ИУК приводило к активации ростовой функции по сравнению с одной ИУК: через 1 час экспозиции - на 20%, через 3 часа - на 116% и через 5 часов - на 40%. Заметим, что через 3 часа наблюдалось сложение эффектов ИУК и ретиналя, что свидетельствует о различии рецепторов этих физиологически активных

соединений. Семичасовая экспозиция отличалась понижением уровня стимуляции как под действием ретинола, так и в варианте с комбинированным действием ИУК и ретинола по

сравнению с

действием одной ИУК.

1 г 5 7 22

Время инкубации (часы) Рис.7. Влияние ретинола (10"*М) в комбинации с ИУК (10-'М) на прирост 2-х дневных отрезков колеоптилей пшеницы за различное время инкубации :

I - контроль (фосфатный буфер), II - контроль (этанол, 2 шН), III - ИУК (10-'м), IV - ретинол (10">М), V - ретинол (10"!М) + ИУК (10"'М)

Влияиие ретиноидов на синтез белков копеоптипей пшеницы.

Как уже отмечалось, стимуляция роста под влиянием ИУК, связанная на начальных этапах с активацией протонной помпы, продолжается недолго, дальнейший процесс ускорения роста требует усиления синтеза белков. По данным Полевого (1986) обработка отрезков колеоптилей ИУК (10 мг/л) в течение 10 минут в 3-4 раза увеличивала включение 1<С-лейцина в относительно малоподвижную фракцию белков (ОЭП составляла 0-0.66).

В нашу задачу входило изучение в сопоставительном плане влияния ретинола и ауксина in vivo на включение радиоактивных предшественников в растворимые белки колеоптилей пшеницы. Опыты с включением 14С-аминокислот в белки растворимой фракции гомо-гената отрезков 2-х дневных колеоптилей пшеницы показали, что удельная активность белков супернатанта в расчете на мг белка увеличивалась во всех вариантах с обработкой: контроль - 25 тыс. имп/мин на мг белка, ретинол 10"5М - 30 тыс. имп/мин, ИУК 10"7М - 32 тыс. имп/мин, ретинол 10"5 + ИУК 10"7М - 33 тыс. имп/мин. Данные свидетельствуют о том, что биосинтез белков при действии ретинола и ИУК активировался.

Данные электрофоретического разделения белков водораствори-

мой фракции показали увеличение под действием ретинола включения 14С-аминокислот в полипептиды массой 17 и 47 кД и уменьшение - в полипептиды 19, 25, 28, 30, 38 и 55 кД (рис.8). Можно полагать, что среди белков, синтез которых усиливался ретинолом, присутствуют ретинол-связывающие белки. Данные об удельной радиоактивности отдельных полипептидов, вычисленные по суммарной радиоактивности полос и содержанию в них белка свидетельствуют о том, что на роль ретинол-связывающего белка в клетках растений может претендовать полипептид массой 47 кД, удельная радиоактивность которого в варианте с ретинолом увеличивалась почти в 1.5 раза (рис.8). В полосе этого полипептида, активно включающего метку и в контроле, наблюдалось увеличение как радиоактивности, так и содержания белка.

При 1.5 часовом действии ИУК заметно увеличивалось содержание полипептида 28 кД. Интересно, что на фоне увеличения содержания белка в этой

электрофорети-ческой зоне снижалось включение в нее радиоак-

■100 fI

i j

ÖCOt-: I

200 !-

I

I

! 00

I

□ I ЕЗ Ш щ

1

IM

Г-ГЦ

p

I J

47

за

30

jB

25

19 17 Мол.масса,кД Рис.8. Влияние ретинола и ИУК на удельную радиоактивность полипептидов фракции легкорастворимых белков за 1.5 часа инкубации 2-х дневных отрезков копеоптипен пшеницы в растворах 14С-аминокиспот.

I - ретинол (Ю-'М), II - ИУК ОО-'М), III -ретинол (10-'М)+ИУК (10-'М)

тивной метки. При совместном действии ретинола и ИУК, согласно полученным нами результатам, наблюдалось усиление включения радиоактивной метки из смеси аминокислот в два полипептида с молекулярной массой 17 и 38 кД. Эти полипептиды, по-видимому, можно отнести к разряду регуляторных, имеющих высокую скорость оборота; они обладали высокой удельной радиоактивностью (рис.8). При совместном действии ретинола и ИУК очевидно усили-

вался и синтез и распад этих полипептидов; на основании этих данных следует полагать, что полипептиды с молекулярной массой 17 и 38 кД участвуют в активации ростовых процессов, имеющих место при совместном действии ретинола и ИУК.

Протсинкиназная активность и фосфорилирование белков растений в присутствии ретиналя. В литературе нет единого мнения о конкретном механизме действия ретиноидов на клетки животного происхождения. Полагают, что изменениям в системе ДНК-РНК-белок под действием ретиноидов предшествуют более ранние события на уровне плазматической и ядерной мембран, а также мембран аппарата Гольджи, которые ведут к изменению дифференциации клетки. Исходя из этих сведений мы предположили, что этими ранними событиями могли быть изменения в системах вторичных мессенджеров -цАМФ и Саг♦-фосфоинозитопьной. Это представляет интерес и в связи с тем, что фосфорилирование белков, активируемое вторичными мессенджерами, связано с резким изменением рн среды (ЯеНх е1 а!., 1994). В связи с этим нами изучено влияние ретиналя на цАМФ- и Саг♦-зависимую протеинкиназную активность растворимой фракции гомогената зеленых листьев, колеоптилей пшеницы и семян гороха. Оказалось, что в контрольном варианте, которым служил О.2шМ раствор этанола, через 3 часа инкубации цАМФ-зависимая протеинкиназная активность фракции осадка составляла 25% ба-зальной протеинкиназной активности. Об этом свидетельствует подавление ферментативной активности высокоспецифичным белковым ингибитором цАМФ-зависимых протеинкиназ на 25% по сравнению с базальной. На долю Саг♦-зависимых протеинкиназ в базальной активности приходилось 69%. Об этом свидетельствует подавление активности специфичным хелатором Са2+ - ЭГТА, и антогонистом кальмодулина - хлорпромазином (рис.Э-а).

Ретиналь за 3 часа инкубации на свету отделенных от корней стеблей с листьями в 2 раза усилил базальную протеинкиназную активность по сравнению с контролем (рис.9-6, I). Больше половины стимулированной ретиналем базальной протеинкиназной активности составила цАМФ-зависимая активность: об этом свидетельст-

вует факт подавления белковым ингибитором стимуляции, вызванной ретиналем in vivo.

Данные рис.9-6

свидетельствуют о том, что при действии рети-наля in vivo на фоне большой стимуляции цАМФ-зависимой проте-инкиназной активности была полностью подавлена Саг*-зависимая активность. Об этом мы судили по результатам опытов с ЭГТА, который , связывая Са2♦,

а -Ц2 гпм этанола 6 - ретиналь (1 мкМ)

Рис.9. Влияние 3-х часовой инкубации в растворе ретиналя и этанола отделенных от корней стеблей с листьями 10-диевиых растений гороха на протеинкиназную активность гомогената (фракция осадка 20000 д). I - базальная, II -белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинки-наз (5 мкг), III - цАМФ (1ткМ), IV - ЭГТА (5тМ), V - Са1 * (0.1 тМ), VI - хлорпромазин (ХЛ, 10 ткМ)

обычно подавляет Са2+-зависимые протеинкиназы: действительно, если в контроле ЭГТА подавил базальную активность на 69% (рис.9-а, IV), то в варианте с ретиналем ЭГТА даже несколько повысил протеинкиназную активность по сравнению с базальной (рис.9-6, IV) Дополнительным свидетельством того, что ретиналь подавил Са2*-зависимую активность, служат данные по действию хлорпромазина, который не снимал эффекта ретиналя (рис.9-6, VI, сравнить рис.9-а, VI).

Таким образом, по результатам наших опытов, ретиналь за 3 часа действия вызывал увеличение базальной протеинкиназной активности за счет сильного увеличения активности цАМФ-зависимых и подавления Са2♦-зависимых протеинкиназ. Эти результаты были подтверждены в опытах с отрезками 2-х дневных колеоптилей пшеницы и семенами гороха.

Наиболее интересную информацию об изменениях в фосфорилиро-ванности белков под действием ретиналя можно получить методом электрофореза фосфорилированных белков с последующей их радиоавтографией. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ретиналь усиливал фосфорилированность достаточно большого

числа полипептидов гороха. Использование белкового ингибитора цЛМФ-зависимых протеинкиназ показало, что ретиналь повысил фосфорилирование белков in vivo цАМФ-зависимым способом.

Важными являются результаты, показывающие, что в присутствии в реакционной среде 5тМ ЭГТА усиливалось базальное фосфорилирование белков, стимулированное ретиналем in vivo (рис.9-6). Связывая Ca2*, ЭГТА обычно вызывает ингибирование активности Саг*-зависимых протеинкиназ: в нашем опыте ЭГТА, наоборот, стимулировал фосфорилирование. По-видимому, ЭГТА стимулировал цАМФ-зависимое фосфорилирование, индуцированное ретиналем in vivo (т.к. оно снималось белковым ингибитором цАМФ-зави-симых протеинкиназ). Усиление цАМФ-зависимого фосфорилирования белков гороха с помощью 5тМ ЭГТА впервые наблюдали в работе Ка-римовой и Тарчевской (1988). Этот факт авторы объяснили в соответствии с гипотезой каскадной регуляции фосфорилирования-де-фосфорилирования белков, предложенной Jngebritsen и Cohen (1983) .

Таким образом, наблюдавшиеся нами изменения в системе вторичных мессенджеров при действии ретиналя in vivo на растения подтверждают наше предположение о включении их в механизмы действия ретиноидов. Усиление цАМФ-зависимого фосфорилирования отдельных белков под влиянием ретиналя, видимо, необходимо для стимуляции процессов транскрипции и трансляции. Из литературы известно о необходимости цАМФ-зависимого фосфорилирования белков при прохождении отдельных фаз клеточного цикла (Нестерова, 1987) и в активности полисом (Диденко и др., 1993).

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано стимулирующее действие продуктов деградации 0-каротина: ретиналя, ретинола и ретиноевой кислоты на прорастание семян различных растений, рост корней огурцов, отрезков колеоптилей пшеницы и биомассы каллусной культуры сои. Максимальный эффект ретиноидов на рост колеоптилей пшеницы наб-

людался в течение 3-5 часов.

2. Впервые показан синергизм действия фитогормона ИУК и ретинола в концентрации, соответственно, Ю-7 и 10"5М на прирост отрезков колеоптилей пшеницы (за 3 часа инкубации).

3. Ретинол (10"5М) усиливал синтез фракций полипептидов колеоптилей пшеницы 17 и 47 кД и уменьшал - 19, 25, 28, 30, 38 и 55 кД. ИУК несколько повышал уровень включения 14С-аминокислот в полипептид 17 кД. При совместном действии ИУК и ретинола в 2-3 раза увеличилась удельная активность фракции полипептидов 17 и 38 кД по сравнению с контролем.

4. Ретиналь (10"вМ) увеличивал фосфорилирование белков листьев гороха, которое снималось белковым ингибитором цАМФ-за-висимых протеинкинаэ.

5. Одновременно ретиналь индуцировал подавление Са2+-зави-симого фосфорилирования белков, что было выяснено использованием ЭГТА - хелатора Са2 + и хлорпромазина - антагониста комплекса Саг 4-кальмодулин.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Бакуридзе Ц.Л., Андрианова Ю.Е. Влияние гормонов на накопление биомассы в каллусной культуре сои. II Всесоюзная конференция по регуляторам роста и развития растений. Киев, 25-27 мая, 1988: Тез.докл. Киев, Наукова думка, 1989. С.191 .

2. Андрианова Ю.Е., Бакуридзе Ц.Л. Действие ретиналя на ростовые процессы растений. II Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. Минск, 24-29 сент.,1990: Тез.докл. 4.2. М., 1992. С.13.

3. Андрианова Ю.Е., Бакуридзе Ц.Л., Абдрахимов Ф.А., Сафина Н.И., Бабужина Д.И., Тарчевский И.А. Регуляция фотосинтеза в условиях стресса, роль метаболитов каротина. III Съезд Всероссийского общества физиологов растений.

- 20 -

С-Петербург, 24-29 июня, 1993: Тез.докл. С-Петербург, 1993. Т.З. С.251.

4. Бакуридзе Ц.Л., Андрианова Ю.Е., Зиновьева О.А., Лезина Л.Е. Физиологически активные метаболиты каротина. III Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. С-Петербург, 24-29 июня, 1993: Тез.докл. С-Петербург, 1993. Т.З. С.256.

5. Andrianova Ju.E., Bacuridze Ts.L., Safina N.I. Photosynthetiс pigment degradation. Carotin catabolites participation in. regulation growth. XV International Botanical Congress., Japan. 1 993, august 28 to serr.pter 3. Abstracts, N 6160. P.453.

6. Андрианова Ю.Е., Бакуридзе Ц.Л. Влияние ретиноидов и этилового спирта на прорастание семян (сдана в печать в Доклады Академии наук)

Формат 60х 84 1/16. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 70 экз. Заказ № 105 ТОП КЦН РАН