Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РЕТИНОИДОВ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗ БЕЛКОВ И ИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ РЕТИНОИДОВ НА РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗ БЕЛКОВ И ИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ"

российская академия наук казанский институт биологии кнц ран

На правах рукописи УДК 531.121:631.589

БАКУРИДЗЕ ЦИАЛА ЛЕВАНОВНА

влияние экзогенных ретиноидов на ростовые процессы

РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗ БЕЛКОВ И ИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 03,00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

К

Казань - 1995

yboatö;:/^/.

- 2

Работе выполнена в Казанском научного центра РАН,

Научные руководители

институте биологии Казанского

- кандидат биологических наук, АНДРИАНОВА Ю.Е.

- доктор биологических наук, КАРИМОВА Ф.Г.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор чиков в.и. кандидат биологически* наук, СИДОРОВ В.П.

Ведущая организация

Казанский государственный университет, кафедра физиологии растений

Защита состоится - Ль. kabfyü. 1ЭЭ5 г. в "/V " часов на заседании специализированного Совета К.002,16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологически* наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503, г.Казань, а/я 30). '

С-

С диссертацией можно ознакомиться е библиотеке физико-технического института КН(Д РАН.

Автореферат разослан

.1995 Г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы; в клетках растений одновременно идут реакции синтеза (анаболические) и деградации (катаболические) биополимеров и липидоа. Б стрессовых условиях реакции катаболизма усиливаются. Продукты катаболических реакций выполняют разнообразные функции, одна из которых - сигнальная (Тарчевс-кий, 1991; Гречкин, 1992). Некоторые продукты деградации липидов являются гормонами (жасмонат, метилжасмонат, абсциэовая кислота и др.); они регулируют в клетках важнейшие процессы транскрипции и трансляции (Neumann et al., 1969; Parthi ег, 1Э90 и др.).

Особой группой мембранных липидоа являются олигопреноиды, функционирующие в хлоропласта* и митохондриях самостоятельно или в составе более сложных соединений. Работ об их катаболизме относительно немного. Наибольший интерес представляют данные о деградации В-каротина а модельной системе с липоксигеназой, выделенной из сои (Simpson et al., 1376). При этом идентифицированы; моноэпоксиды 0-каротина, конъюгаты полненовых кетонов, апокаротинали (Cjo и Сгт) и, что представляет для нас наибольший интерес, B-Ct» -кетон, имеющий структурное сходство с 20-углсродными ретиноидами. Последующие исследования показали возможность деградации В-каротина до ретиноидов е высших растениях (Karnaukhov, 1990) и водорослях (Saranak, 1989; Saranak, rf^^V: Foster, 1994). в клетках животных В-каротин подвергается энзи-магическому превращению в ретиналь при участии фермента ' ,15,15*-диоксигеназы (ЕС 1.13.11,21), которому также, как и ли-

. 'поксигеназе, необходим Oi для окисления. Продукты деградации Q-каротина - ретиноиды - помимо своего основного назначения (зрительные пигменты), выполняют в клетках животных роль регуляторов разнообразных процессов: синтеза белка, нуклеиновых

ч*

кислот, транспортных процессов и т,д. .(Афанасьев, 1983). Показано, что они обладают антиканцерогенным действием (Peto et al., 1981).

Нужно замети>йу1()ривпвр;ем.яп:)*у|?15КД)оГосинтетических пигментов

ЦЕНТРАЛЬНАЯ И1Н?ЧУЦР!в Лв Р® "Л1 3 S КЛ>о Моск. тчии

Mun

относительно невелико, особенно при стрессах, и выяснение возможной роли регуляторной (сигнальной) роли интермедиатов катаболизма каротина является чрезвычайно актуальной задачей для понимания особенностей формирования стресс-реакции и регуляции процессов жизнедеятельности растений.

Цель и задачи исследования'. Цепь» нашей работы было изучение особенностей действия В-каротина и продуктов его деградации: ретинола, ретиналя и ретиноевой кислоты (ретиноидов) на рост растений и отдельные стороны метаболизма клеток растений. В задачи исследования входило изучение влияния О-каротина и ретиноидов на;

1) прорастание семян различных растений, рост отдельных органов и накопление биомассы в культуре клеток;

2) синтез белков;

3) лротеинкиназную активность и фосфорилирование белков растений.

Научная новизна: Впервые исследовано действие ретиноидов на ростовую функцию растений, синтез белков и их фосфорилирование. Показано, что продукты деградации (¡-каротина обладали активирующим прорастание семян действием. Наблюдался синергизм действия ИУК и ретинола в стимуляции роста колеоптилей пшеницы. Ретинол, изменяя соотношение 1*С в образующихся из меченых аминокислот полипептидов, усиливал радиоактивность фракции полипептидов

17 и 47 кД колеоптилей пшеницы-и уменьшал 13, 25, 28, 30, 35, и 55 кД. При совместном действии ретинола и ИУК значительно увеличивалась удельная активность фракций полипептидов 17 и 38 кД по сравнению с контролем. Ретииаль стимулировал цАМО-зависи-мую протеинкиназну» активность, одновременно подавляя активность Саг+-аависимых протеинкиназ в листьях гороха. 2 мМ раствор этанола стимулировал Са!*-зависимую протеинкиназную активность и рост колеоптилей пшеницы.

Практическая значимость-. Полученные результаты вносят определенный вклад в понимание взаимоотношений анаболических реакций с реакциями катаболизма. Полученные результаты могут быть

использованы в биотехнологии как основа для поиска новых способов регуляции роста культур клеток и тканей и в практике сельского хозяйства для повышения интенсивности ростовых процессов растений.

Апробация работы; Результаты работы доложены на Отчетном Совещании Центрального совета Всесоюзного биохимического общества и национального комитета советских биохимиков (Казань, 1988); на II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 1989); на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990); на III съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); на III Международной конференции по регуляторам роста и развития растений (Москва, 1995); на итоговых научных конференциях КГУ (Казань, 1990, 1995); на отчетных конференциях Казанского института биологии КНЦ РАН (Казань, 19S9 - 1995),

Публи^адиц; По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, одна работа находится в печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на страницах и содержит 12 таблиц и 35 рисунков. Список литературы состоит из 182 наименований, в том числе 107 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЕ!

Основные исследования выполнены на семенах, корнях, листьях и колеоптилях различных культур (кукуруза, горох, огурцы, пшеница), выращенных в лабораторных условиях. Кроме того, объектом исследования являлась каллусная культура сои сорта Мелкосеменная. Ретиноиды растворялись в этиловом спирте, затем путем ступенчатого разведения дистиллированной водой раствор доводился до концентрации ретиноидое (10~3-10~*М), Контролем служили растворы этанола соответствующей концентрации.

Определение прорастания семян. Семена проращивали в раст-

ворах ретиноидов (в контроле - в растворах этанола) при температуре 22°С в чашках Петри. В каждом варианте бралось по 100 семян (10 чашек по 10 семян в каждой). Ежедневно фиксировался процент прорастания семян.

Способ получения каллуса. Каллус иэ эпикотилей сои был получен в нашей лаборатории с использованием методов, разработанных в лаборатории Р.Г.Бутенко (Бутенко, 1964), Каллус выращивали на модифицированной среде Филлипса (Калинин и др., 1980). скорость нарастания каллусной массы определяли путем взвешивания на аналитических весах е стерильных-условиях 10-12 кусочков каллуса в начале пассажа и через 2! день. Рассчитывали их среднее значение и относительную скорость нарастания к концу эксперимента по формуле Бутенко (1964). ретиноиды в концентрации 10"*-10-«М вносили при посеве, в контрольном варианте вносили растворы этанола.

Метод определения ИУК-зависимого поста колеоптилей. а опытах использовали отрезки колеоптилей 2-х дневных этиолированных проростков пшеницы (московская 35). Колеоптили по 40 штук.помещали е чашки Петри с растворами фосфатного буфера и эффекторов и выращивали е термостате (25-2в°С). Наблюдали динамику роста колеоптилей в следующие отрезки времени: О, 1, 3, 5, 7 и 22 часа. Длину колеоптилей измеряли при помощи микроскола (с использованием окуляра Й* и диоптрийной насадки). Влияние ИУК и рети-ноидов на рост колеоптилей пшеницы определяли по модифицированному методу Бояркина (1966).

Определение интенсивности синтеза белка. В опытах использовали 10-миллиметровые отрезки колеоптилей 2-х дневных этиолированных проростков пшеницы (Московская 35), выращенных в темноте при 25»С. Отрезки вырезали на специальном станке на 4 мм ниже верхушки колеоптиля, выталкивали из них первичные листья и промывали дистиллированной водой. Интенсивность синтеза белка определяли с помощью меченых С1*-аминокислот. Использовали смесь аминокислот (Чехословакия). Радиоактивный препарат в конечной концентрации 2 мВд в 10 мл воды инкубировали с отрезками коле-

оптилей (по 40 iut* ) а термостате при 27eC (1 час). После одночасовой прединкубации в среду с отрезками опытного варианта добавляли 1мл раствора иук (конечная концентрация 10~ТМ) и ретинола (конечная концентрация 10->М), а в сред/ с отрезками контрольного варианта - такое же количество воды. Экспозиция с ретинолом и ИУК составляла 1.5 часа, Колеолтилн гомогенизировали в трис-глициновом буфере (0.01 М, рН 8.3). Растворимую фракцию белков отделяли центрифугированием (20000 9). Полученный экстракт разделяли в ЭХ полиакриламидном геле в 0.00Ш трис-глициновом буферном растворе (рН 8.9). Электрофорез проводили в 3-5 повторноетях (Остерман, 1Эвв). Белковые фракции после многократного отмывания от краски нарезали на в зон. 8о всех экстрактах измеряли плотность окраски на фотометре Кфк-3 с красным светофильтром и определяли количество белка по методу Бредфорда (Bradford, 1976) по калибровочной кривой,.построенной с использованием бычьего сывороточного альбумина, 8 этих же экстрактах измерялась, радиоактивность на.жидкостно-сцинтилляционном счетчике Дельта-300 (США), далее рассчитывали удельную радиоактивность каждой белковой зоны.

Определение протеинкинааной активности и ФосФорилирования бепкоа растений. Объектами исследования служили семема гороха, отрезки 2-дневных колеоптилей пшеницы и отделенные стебли с листьями 1.0-дневных зеленых растений гороха, которые инкубировались в растворе 1 мкМ ретинеля на свету 2-3 часа. Протеинки-назная активность и фосфорилировние белков определялись в реакции переноса 1 *р-ортофосфата из Tf-положения молекулы АТФ на белок во фракциях гомогената - в супернатанте и осадке после 3-х минутного центрифугирования при 20000 д. Протеинкииазную активность фракций гомогената определяли no Ktkkawa et al.,{1363) с модификациями); ЦАМФ-зависиное фосфорилирование белков определяли с помощью стандартного специфического белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ из скелетных мышц (Sigma, USA и Дл-га, С-Петербург). Са*♦-зависимое фосфорилирование белков исследовали с помощью ЭГТА - хелатора Саг* и антагониста кальмодули-

на - хпорпромаэина. Удельную активность протеинкинаэ выражали в пикомолях »*р/мг белка в минуту. Проводился контроль на неспе-цифическов связывание "Р на фильтрах. Фосфорилированные белки разделяли методом электрофореза по [.аеттН (1970) с последующей радиоавтографией. Электрофореграммы и радиоавтограммы сканировали на денситометре И<»0-45а (Казань). Содержание белка определяли по иоигу (1951).

Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики (Зайцев, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние каротина и продукта его деградации на прорастание

ремян. рост ^орней_и_накопление биомассы каллусной культурой

сои. Растворы каротина в концентрации от 10-'о до ю-«М за 48 часов увеличивали прорастание семян кукурузы по отношения» к контролю - дистиллированной воде - на 13-20*, за 72-96 часов -на 44-46Х (рис.1). Следует отметить, что раствор каротина высокой концентрации (10*гМ) сильно подавлял прорастание семян, особенно в начальный период прорастания. Максимум стимуляции прорастания семян наблюдался при концентрации каротина 10*!М. Это согласуется с данными Кирявцееой (1966), показавшей стимуляцию роста биомассы каллусной культуры малины в 2-3 раза при

внесении каротина в среду для выращивания. Далее исследовали действие зкаогенно вносимых продуктов деградации каротина: ретинола, ретиналя и

10-" 10-> Ю-« 10*' 10** <0*> 10"* 10-" 10'1

трети,н ретиноевой кисло-

Впийнн! К4ЭОТМН1 на ГР£Р4СТ**М« с*нпк

„««,. г - п 3 - »« ты на скорость

0а«м*иетоА по«а»«и сготмтс*

тауюммА контроль РОСТ Л растений.

На рис.2 представлены данные по влияний водно-спиртовых растворов ретинола на процент прорастания семян гороха эа 24 часа. Наибольший процент стимуляции за 24 часа (по сравнению с контропями: растворами этанола - на 38-55Х и с дистиллированной водой на 10056) наблюдался при концентрации ретинола 10-в-10-*М, Как видно из приведенных данных, два контроля были необходимы, т.к. спиртовый раствор даже без ретинола вызывал стимуляции» роста. Высокие концентрации растворов ретинола в спирте (10-<-10*ЭМ), а также самого этилового спирта (2x10-1 -2x10* ' М) подавляли прорастание семян. Наши опыты показали, что наибольшая стимуляция прорастания семян растворами ретинола отмечалась за 24 часа, со временем его эффект уменьшался. Сопоставление временного действия каротина и ретинола на прорастание семян указывает на специфичность их действия: если стимулирующий эффект растворов каротина увеличивался со временем до 96 часов (рис.1), то эффект растворов ретинола со временем, наоборот, уменьшался (данные приведены в диссертации). Возможно, это обусловлено более быстрой метаболиэацией ретинола, по сравнению с каротином.

Данные по действию ретимое-вой кислоты разной концентрации на прорастание семян огурцов за 24 часа приведены на рис.3. Как и остальные ретино-иды, ретиноееая кислота в концентрации от 10-' до 10"1М стимулировала начальные этапы прорастания семян, особенно наглядно это проявилось через 15 часов после замачивания, когда в

ЭТАНОЛ.И

Рме.2. КОНЦ*НТр«ЦИОНН4И ЭНИСНМОСТЬ действие раетэорОФ ретинола и 1Т1НОЛ1 и* прорвст»ни«

горох« а* 24 ч&м: 1 - р*ткнол+>т1ноп, 2 - этанол. 3 - аода

- 10 - -

контрольном варианте прорастание полностью отсутствовало. Через 24 часа после замачивания разница между контролем и опытом была ниже (44%). Высокая концентрация ретиноевой кислоты (10-'М)

практически полностью подавляла прорастание семян ---:

ратинОваеп

_____________I...__1__....... _!._. . >_имеют* * М

гто-1 глю-'гш»'1 гно" г*ю-1 4«ю-1 гно*1 '

этанол

Рие.з, ДаАстеиа с«тнно«во,и киспотм и »таноп» Н4 Лрорастанма С4МПН огурцов Э4.разные промежутки ареягеки;

15 часоа после ааыачиаения: т - ветииоааая кксЛ0Т4+атан0Л, - »таноп {прор«сТенид ни), - еода (лрооастаиип нет);

чеса поел* замачивания: 2 - ретиноааая кислота+атаиол, 3 ~ атанол, * - вода

Ретиноиды оказывали влияние не только на скорость прорастания семян, но и на рост корней. На рис.4 представлены данные по действии ретинола на рост корней

огурцов, которые показывают, что наибольший эффект

!.)г

I

5 [

наблюдался при концентрации ретинола 10-*М.

Техника получения и поддержания культуры клеток и тканей открыла исследователям возможность углубленного изучения механизма действия различных физиологически активных соединений на метаболизм и рост клеток растений. Это обусловлено высокой чувствительность» каллусных культур к условиям культивирования (Бутенко, 1984), Мы провели опыты по действии каротина и продуктов его деградации на каллусную культуру сои. Полученные данные показали, что биомасса каллуса в

ю-» ~г*Уо*-''

ю-' ю-*

10-»

10-'

10->

ретинол,м

г*Т ог» "

ЭТВН«Л,М

Рис,алияиие ретинола и >тенола на рост корнай огурцо* посла 4а часоа воза»Дет вил: 1 - ретиноя+»танол, г - »т»иоп, Э - аод»

контрольном варианте при выращивании на свету была на 36% меньше, чем в темноте при прочих равных условиях. Масса каллуса на свету была равна 2.5+0.2, в темноте - 3.9+0.1 г/г сырого веса. Ингибирование светом роста каллусной культуры известно (Бутен-ко, 1977). Шахоа и Станкоеа (1978) показали торможение процессов клеточного деления и растяжения, роста каллуса и образования из него растений при длительном освещении каллусов. По нашим данным на свету наблюдалось более сильное роет-стимулирум-щее действие ретиналя (увеличение биомассы на Ибх) (табл.1, гр.З), чем в темноте. При выращивании каллуса сои в темноте небольшой стимулирующий рост эффект ретиналя проявлялся лишь в концентрации 10-в-10"»М (табл 1, гр.2,3).

Таким Об— ТАБЛИЦА I. Д»Астаи* ратмналп М« Прирост биомассы каллусной

культур* сои на св»ту и а тамнот* л*ссв*>

разом, наши

результаты по- П0Н0ОСТ КАЛЛУСЙ ЗА Дань (Ж ОТ КОНТРОЛЯ)

казали, что У«Л0«ия ОПИТ» КОНТРОЛЬ Р * т и * а л к. М

каротин и ре- 3 5*10-' а.Зию-1 3.5*10-«

тиноиды стиму- 1 г Э 4

лировали растение просе- Сват Т«чног« 100 100 иг 11Т т 19В »1 1*4

мян, рост кор-

ней и колеоптилей, прирост биомассы каллусной культуры. Оптимальная концентрация, при которой наблюдался наибольший рост-стимулирующий эффект, в большинстве случаев была равна 10*'М, в случае культуры клеток - 10-е-10-*М. Высокие концентрации каротина и ретиноидов (10-1-10"гМ) тормозили рост. Наибольшая стимуляция ретиноидами наблюдалась на начальных этапах процесса прорастания, что свидетельствует о влиянии ретиноидов на пусковые механизмы прорастания семян. На каллусной культуре сои мы показали, что ретиналь максимально стимулировал прирост биомассы каллуса на свету (на 116Х). Ретиналь не только снимал световое блокирование роста каллуса, но и вызывал превышение темно-вого уровня ростовых процессов. Это чрезвычайно интересный аффект, объяснение которого представляет самостоятельную задачу.

- 12 - '

Слияние оетиноилое и ИУК на удлинение•колеоптилей пшеницы. Показано, что начальные этапы прорастания семени связаны с инициацией роста растяжением клеток зародыша корня (Обручева, 1985), Полученные .нами результаты по влиянию ретиноидов на начальные этапы прорастания позволяют предположить, что ретиноиды модифицируют процессы ауксин-зааисимого роста. Известно, что физиологическое действие ауксина на растения - это усиление роста, обусловленное стимуляцией растяжения клеток. Стимуляция роста зависит от концентрации ауксина. Наши исследования проводились на колеоптилях пшеницы, как наиболее специфическом тест-объекте на действие ИУК. ИУК стимулировала рост колеопти-лей пшеницы на всем протяжении опыта в концентрации 10~т -10"'М, концентрация ИУК в 10-»М оказывала стимулирующий эффект только в начальном периоде (через 1 час после обработки, отрезт ков колеоптилей) (рис.5). Высокая концентрация ИУК (10~*М) на протяжении всего периода наблюдения ингибировапа рост колеопти-лей. Наибольшая стимуляция роста (в 4-6 раз) под действием ИУК наблюдалась за 1-5 часов после обработки. Начальные этапы действия ИУК связывают с активацией протонной помпы и подкислением среды выращивания, дальнейшая стимуляция роста объясняется синтезом специфических белков, участвующих в ростовых процессах (Гэлстон и др., 1983).

На рис,6 представлены, данные опыта по воздействию растворов ретинола в разной концентрации (от 10-* до 10*3 М) на рост отрезков 2-х

дневных колеоптилей пшеницы. Из испытанных кон-

Рмс.9, влияние ИУК ив прирост г-ж дн*»кы* от* рокоя хол*оптип*й пш*нччы то »р*м«нн: I - кои1рель ■ <ояеФ1ТныА вубао), II1- "онтродь (»т«»вл г тМ), II! - ИУК МО-'М», IV - ИУК ПО-'М), V - ИУК (10-41), VI - ИУК,(10-*М}

центраций стимулирующим-рост отрезков действием за.1-3 часа обладали Ю"*-10-*М растворы ретинола, а за 5-22 часа лишь 10'Т-10-(Н. Высокая концентрация ретинола (10*,М) подавляла рост отрезков колеоптилей. На этом объекте наибольшим стимулирующим рост эффектом за 1-5 часов обладал 10"'М раствор ретинола. Это согласуется с данными по росту корней огурцов (рис.4), где максимум стимуляции роста корней (в 2 раза) наблюдался при концентрации ретинола 10*'М. Данные по приросту отрезков колеоптилей за единицу времени (мм/час) показали максимум стимуляции роста растворами ретинола.за первые 3-5 часов. Затем эффект ослабевал, что характерно для действия Физиологически активных соединений через мессенджерные системы. Стимуляция ретинолом роста колеоптилей резко уменьшалась после 5 часов инкубации (рис,б). Следует отметить различие в величине стимуляции роста колеоптилей в вариантах с ретинолом и МУК за 1 час действия, что может объясняться отличием их механизмов действия,

оптимальной для роста колеоптилей пшеницы с 3 часов действия и далее оказалась концентрация ИУК - 10*'М, которая в дальнейшем использовалась при ком б и ни ро ванном действии ИУК и ретинола (рис.7).

Совместное дейс- VI - р*гнноп мо-'м)* ""

теие ретинола и ИУК приводило к активации ростовой функции по сравнении с одной ИУК: через 1 час экспозиции — на 20Х, через 3 часа - на 1163£ и через'5 часов - на 40Х. Заметим, что через 3 часа наблюдалось сложение эффектов ИУК и ретиналя, что свидетельствует о различии рецепторов этих физиологически активных

рие.е. вр*н*нн»д а*шейноетк д*дст»ия р«тв-иояа на покроет !-* дн*»ных отроко* иомоп-тиа*4 пи«мним:

i - коитреп» (фосфатный 6уФ*р), 'ii - контроль (лчнол, гпм), III - р«тиноя по-»«),

соединений. Семичасовая экспозиция отличалась понижением уровня стимуляции как под действием ретинола, так и в варианте с комбинированным 'действием МУК и ретинола по

сравнению с

действием одной ИУК.

рлирние ретиноидов на синтез белков колеоптилей пшеницы.

Как уже отмечалось, стимуляция роста под влиянием ИУК, связанная на начальных этапах с активацией протонной помпы, продолжается недолго, дальнейший процесс ускорения роста требует усиления синтеза белков. По данным Полевого (1986) обработка отрезков колеоптилей ИУК (10 мг/л) в течение 10 минут в 3-4 раза увеличивала включение 14С-лейцина в относительно малоподвижную фракцию белков (ОЭП составляла 0-0.66).

В нашу задачу входило изучение в сопоставительном плане влияния ретинола и ауксина 1n vivo на включение радиоактивных предшественников в растворимые белки колеоптилей пшеницы. Опыты с включением '4С-аминокислот е белки растворимой фракции гомо-гената отрезков 2-х дневных колеоптилей пшеницы показали, что удельная активность белков супернатанта в расчете на мг белка увеличивалась во всех вариантах с обработкой: контроль - 25 тыс, имп/ыин на мг белка, ретинол 10*SM - 30 тыс. имп/мин, ИУК - 32 тыс. имп/мин, ретинол 10"1 + ИУК А0"тМ - 33 тыс. имл/мин. Данные свидетельствуют о том, что биосинтез белков при действии ретинола и ИУК активировался.

Данные электрофоретического разделения белков водораствори-

Рне.Т, Влиныма [ИТиноп« <!0-«м) « комбинации с ИУК (KWM1 н» При пост 2-* днааных отрезке» крлаоптклай пиемииы 2ш различно* арамд инкубации :

I » контроль (фосфатный Суса р), Ц - контроль (атанол. г тм), III - иук (10->М), IV - ратм-иол (10-»М), V - риинол («-•«(♦иук tto-'u)

мой фракции показали увеличение под действием ретинола включения '«С-аминокислот в полипептиды массой 17 и 47 кД и уменьшение - в полипептиды 19, 25, 2в, 30, 38 и 55 кД (рис.8). Можно полагать, что среди белков, синтез которых усиливался ретинолом, присутствуют ретинол-связывающие белки. Данные об удельной радиоактивности отдельных полипептидов, вычисленные по суммарной радиоактивности полос и содержанию в них белка свидетельствуют о том, что на роль ретиноп-свяэывающего белка в клетках растений может претендовать полипептид массой 47 кД, удельная радиоактивность которого в варианте с ретинолом увеличивалась почти в 1.5 раза (рис.а). В полосе этого полипептида, активно включающего метку и в контроле, наблюдалось увеличение как радиоактивности, так и содержания белка.

I

- СС01-° I и <

а

<7

1в

50

1 И 14 17

Мол.масса,кД Рис.6. Влкяки* ретинола и мук на уд*льнув ра~ диоактианоеть полипаптидоа фракции л«г*ор»ст-юрммыя £«якоа за т. 3 часа инкубации 2-я дн*аныя отр*э ков колаоптилай лшаницы а раст-аорах 11с-лминокислот. г

I - ратмиол (Ю-*м), II - ИУК (10-*м), III -ратине л (Ю-*и)*ИУК (ю-'м)

При 1.5 часовом действии ИУК заметно увеличивалось содержание полипептида 26 кД. Интересно, что на фоне увеличения содержания белка в этой электрофорети-ческой зоне снижалось включение в нее радиоак-

тивной метки. При совместном действии ретинола и ПУК, согласно полученным нами результатам, наблюдалось усиление включения радиоактивной метки из смеси аминокислот в два полипептида с молекулярной массой 17 и ЗВ кД. Эти полипептиды, по-видимому, можно отнести к разряду регуляторных, имеющих высокую скорость оборота; они обладали высокой удельной радиоактивностью (рис.8). При совместном действии ретинола и ИУК очевидно усили-

вапся и синтез и распад этик полипептидов; на основании этих данных следует полагать, что полилептиды с молекулярной массой 17 и 38 кД участвуют в активации ростовых процессов, имеющих место при совместном действии ретинола и ПУК.

Протеу1нкинааная активность и фрсффрилирование барков растений в присутствии оетинапя. В литературе нет единого мнения о конкретном механизме действия ретиноидов на клетки животного происхождения. Полагают, что изменениям в системе ДНК-РНК-белок под действием ретиноидов предшествуют более ранние события на уровне плазматической и ядерной мембран, а также мембран аппарата Гольджи, которые ведут к изменению дифференциации клетки. Исходя из этих сведений мы предположили, что этими ранними событиями могли быть изменения в системах вторичных мессенджеров -цАМФ и Ca1** -фосфоинозитольной. Это представляет интерес и в связи с тем, что фосфорилирование белков, активируемое вторичными мессенджерами, связано с резким изменением pH среды (Felix et al., 19Э4). В связи с этим нами изучено влияние ретинапя на цамф- и Ca1*-зависимую протеинкиназную активность растворимой фракции гомогената зеленых листьев, колеолтилей пшеницы и семян гороха. Оказалось, что в контрольном варианте, которым служил 0.2тМ раствор этанола, через 3 часа инкубации цАМФ-зависимая лротеинкиназная активность фракции осадка составляла 25% базальной протеинкиназной активности. Об этом свидетельствует подавление ферментативной активности высокоспецифичным белковым ингибитором цАМФ-зависимых протеиикиназ на 25Х по сравнению с базальной. На долю Са**-эависимых протеинкиназ в базальной активности приходилось 6ЭХ. Об этом свидетельствует подавление активности специфичным хелатором Ca** - ЭГТА, и антогонистом кальмодулина - хлорпромазином (рис.Э-а).

Ретиналь за 3 часа инкубации на свету отделенных от корней стеблей с листьями в 2 раза усилил баэальную протеинкиназную активность по сравнению с контролем (рис.9-6, I). Больше половины стимулированной ретиналем базальной протеинкинаэной активности составила цАМФ-заеисимая активность: об этом.свидетельст-

вувт факт подавления белковым ингибитором стимуляции, вызванной ретиналем in vivo.

Данные рис.9-6 свидетельствуют о том, что при действии ретиналя 1п vivo на фоне большой стимуляции

ЦАМФ-зависимой проте-инкинаэной активности была полиостью подавлена Саг*-зависимая активность. Об этом мы судили по результатам опытов с ЭГТА, который, связывая Са1*, обычно подавляет Саг*-зависимые протеинкиназы: действительно, если в контроле ЭГТА подавил базальную активность на 69% (рис.Э-а, IV), то в варианте с ретиналем ЭГТА даже несколько повысил протеиккиназную активность по сравнению с баэальной (рис.9-6, IV) Дополнительным свидетельством того, что ретиналь подавил Саг*-эаеисимую активность, служат данные по действию хлорпромазина, который не снимал эффекта ретиналя (рис,9-6, VI, сравнить рис.9-а, VI).

Таким образом, по результатам наших опытов, ретиналь за 3 часа действия вызывал увеличение баэальной лротеинкиназной активности эа счет сильного увеличения активности цАМФ-эависимых и подавления Са*+-эаеиеимых протеинкиназ, Эти результаты были подтверждены в опытах с отрезками 2-х дневных колеоптилей пшеницы и семенами гороха.

Наиболее интересную информацию об изменениях в фосфорилиро-ванности белков под действием ретиналя можно получить методом электрофореза фосфорилироеанных белков с последующей их радиоавтографией. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ретиналь усиливал фосфорилированность достаточно большого

ЮС* раТИНаЛА М >Т»"ОЛ1 отдаланнмх от корнай стаблаЯ с листьями 10-диаанн* растаний гороха на протаннхцнаэну« актиакостъ гомоганата {Фракция осадка £0000 о), 1 - ваэ*п»нал, п -балкоаый ингибитор цАМ*-эааиеимь»* протаиикн-* на» (S миг). ИГ - ЦАМФ (1ПКМ1, IV - ЭГТА (9лМ), V - С*" (0.1 пи), VI - хлорлроиааин (ХЛ, 10 вин)

числа полипептидов гороха. Использование Белкового ингибитора цШФ-зависимых протеиикиназ показало, что ретикаль повысил фос-форилирооание белков in vivo цАМФ-зависимым способом.

Важными являются результаты, показывающие, что в присутствии в реакционной среде 5тМ ЭГТА усиливалось базальное фосфо-рилирование белков, стимулированное ретиналем in vivo (рис.Э-б). Связывая Ca14, ЭГТА обычно вызывает ингибирование активности са**-эависимых протеиикиназ: в нашем опыте ЭГТА, наоборот, стимулировал фосфорилирование. По-видимому, ЭГТА стимулировал цАМФ-эависимое фосфорилирование, индуцированное ретиналем In vivo (т.к. оно снималось белковым ингибитором цАМФ-зави-симых протеиикиназ). Усиление цАМФ-зависимого фосфорилирования белков гороха с помощью 5тМ ЭГТА впервые наблюдали в работе Ка-римовой и Тарчевской (1988). Этот факт авторы объяснили в соответствии с гипотезой каскадной регуляции фосфорилирования-де-фосфорилирования белков, предложенной Jngebritsen и Cohen (1983),

Таким образом, наблюдавшиеся нами изменения в системе вторичных мессенджеров при действии ретиналя In vivo на растения подтверждают наше предположение о включении их е механизмы действия ретиноидов. Усиление цАМФ-зависимого фосфорилирования отдельных белков под влиянием ретиналя, видимо, необходимо для стимуляции процессов транскрипции и трансляции. Из литературы известно о необходимости цАМФ-зависимого фосфорилирования белков при прохождении отдельных Фаз клеточного цикла (Нестерова, 1087) и в активности полисом (диденко и др., 1993).

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано стимулирующее действие продуктов деградации 0-каротина: ретиналя, ретинола и ретиноевой кислоты на прорастание семян различных растений, рост корней огурцов, отрезков колеолтилей пшеницы и биомассы каллусной культуры сои. Максимальный эффект ретиноидов на рост колеоптияей пшеницы наб-

людался в течение 3-5 часов.

2. Впервые показан синергизм действия фитогормона ПУК и ретинола в концентрации, соответственно, 10"т и 10*'М на прирост отрезков колеоптилей пшеницы (за 3 часа инкубации).

3. Ретинол (10"*М) усиливая синтез фракций полипептидов колеоптилей пшеницы 17 и 47 кД и уменьшал - 19, 25, 28, 30, 38 и 55 кД, ПУК несколько повышал уровень включения 1 *С-аминокислот а полилептид 17 кД. При совместном действии ПУК и ретинола е 2-3 раза увеличилась удельная активность фракции полипептидов 17 и 33 кД по сравнению с контролем.

4. Ретиналь (10"*М) увеличивал фосфорилирование белков листьев гороха, которое снималось белковым ингибитором цАМФ-за-висимых протеинкинаэ.

5. Одновременно ретиналь индуцировал подавление Са11-зави-симого фосфорилирования белков, что было выяснено использованием ЭГТА - хелатора Саг* и хлорпромазина - антагониста комплекса Са1*-кальмодулин.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Бакуридзе Ц.Л., Андрианова Ю.Е.. Влияние гормонов на накопление биомассы в каллусной культуре сои, II Всесоюзная конференция по регуляторам роста и развития растений. Киев, 25-27 мая, 1988: Тез.докл. Киев, Наукова думка, 1939. С.131.

2. Андрианова Ю.Е., Бакуридзе Ц.Л. Действие ретиналя на ростовые процессы растений. [I Съезд Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 24-29 сент.,1Э90: Тез.докл. 4.2. М., 1992. С.13.

3. Андрианова Ю.Е., Бакуридзе Ц.Л., Абдрахимов Ф.А., Сафина Н.И., Бабужина Д.И., Тарчевский И.А. Регуляция фотосинтеза в условиях стресса, роль метаболитов каротина, III Съезд Всероссийского общества физиологов растений.

- 20 г

С-Петербург, 24-29 июня, 1993: Теэ.докл. С-Петербург, 1Э93. Т.З. С.251.

Бакуридэе Ц.Л., Андрианова Ю.Е., Зиновьева О.А., Лезина Л.Е. Физиологически активные метаболиты каротина. III Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. С-Петербург, 24-29 июня, 1993: Тез.докл. С-Петербург, 1993. Т.З. С.256.

Andrianova Ju.E,, Bacuridze Ts.L., Safina N. I. Photosynthetiс pigment degradation. Carotin catabolites part ici pat ion in regulat ion growth. XV Internet ional Botanical Congress., Japan. 1993, august 28 to sercpter 3. Abstracts, N 6160. P.4S3.

Андрианова Ю.Е., Бакуридэе Ц.Л. Влияние ретиноидов и этилового спирта на прорастание семян (сдана в печать в Доклады Академии наук)

Формат 60 x 64 1/16. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 70 экз. Заказ N0 105 ТОП КЦН РАН