Свободнорадикальный гомеостаз в условиях ишемии-реперфузии головного мозга крыс при воздействии гуанидиновых производных

Суховеева, Ольга Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свободнорадикальный гомеостаз в условиях ишемии-реперфузии головного мозга крыс при воздействии гуанидиновых производных
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свободнорадикальный гомеостаз в условиях ишемии-реперфузии головного мозга крыс при воздействии гуанидиновых производных"

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Суховеева Ольга Вадимовна

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.01.04.- Биохимия

4858489

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 НОЯ 2011

Научный руководитель: Доктор биологических наук, Профессор Т.Н. Попова

Воронеж 2011

4858489

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежском государственном университете» (ВГУ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Попова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Наквасина Марина Александровна

кандидат биологических наук, Лущик Марина Валерьевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «15» ноября 2011 г. в/3 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл.1

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета

Автореферат разослан «/#> октября 2011 г.

Ученый секретарь ^у/

диссертационного совета Грабович М.Ю

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Процессы свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов протекают в условиях физиологической нормы на стационарном уровне. В то же время чрезмерному образованию свободных радикалов (СР) способствуют многие патологические процессы (Болдырев А.А., 2001). В настоящее время существует концепция о существенной патогенетической роли СР в повреждении клеток головного мозга, обусловленном ишемией. Именно ишемия является наиболее распространенной причиной нарушений функций мозга (8а\у1теу 1991), что взаимосвязано с нарушением работы антиоксидантной защиты (АОЗ) организма. Нарушение функционирования системы АОЗ, контролирующей каскад свободнорадикальных реакций, неизбежно отражается на эффективности процессов детоксикации активных форм кислорода (АФК) в клетке и может привести к возникновению окислительного стресса и связанных с ним необратимых изменений в тканях. Если нарушение кровообращения было длительным - больше нескольких минут или часов, то вслед за восстановлением кровотока возникает каскад патологических изменений, лежащих в основе негативных явлений, связанных с реперфузией, которые включают, в частности, постишемическую гиперперфузию, а далее постишемическую гипоперфузию.

Актуальной проблемой является поиск средств, способных повышать резистентность организма к повреждающему действию СР при данной патологии. В медицинской практике при лечении заболеваний различной этиологии, в том числе и патологий головного мозга, когда атиоксидантная система (АОС) организма не справляется с усиленной продукцией АФК, широко используют антиоксиданты природного и синтетического происхождения. Гетероциклические производные гуанидина обладают широким спектром биологической активности (8. ЬоргаБей, 2005). Они проявляют антигипертензивные и кардиопротекторные свойства, являются супрессорами пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и ингибиторами адренорецепторов и натриевых каналов (Беленичев И.Ф., 2010), обладают бактерицидной и фунгицидной активностью, способствуют всасыванию глюкозы в желудочно-кишечном тракте, уменьшают глюконеогенез, снижают уровень холестерина, триглицеридов и инсулина у больных страдающих ожирением (Владимиров Ю.В., 1972). Однако вопрос о возможности применения бигуанидов в области нейропротекции до сих пор остается открытым. Исходя из этого, был проведен поиск бигуанидиновых

производных с целевой биологической активностью с помощью программы прогноза «структура-свойство» PASS (Prediction of Activity Spectrafor Substances), доступной в режиме on-line по адресу http://www.ibmli.msk.su/pass (A.B. Садым, 2002; V.V.Poroikov, 2002; С. Szabo, 1997). Компьютерному анализу было подвергнуто несколько сотен веществ с наиболее высокой вероятностью (>0,7-0,9) проявления той или иной активности. В результате нами были отобраны бигуаниды: N-[hmhho(4-морфолинил)метил]гуанидина (ИММГ) и И-[имино(1-

пиперидинил)метил]гуанидина (ИПМГ) с предполагаемым спектром интересующей нас биологической активности: данные вещества обладают противоишемическим, кардио-, церебропротекторным эффектами.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование воздействия ИММГ и ИПМГ на свободнорадикальный гомеостаз при ишемии-реперфузии головного мозга (ИРГМ) у крыс. В связи с поставленной целью решались следущие задачи:

1. Оценка влияния гуанидиновых производных на параметры биохемилюминесценции при ИРГМ у крыс, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов и общий антиоксидантный потенциал.

2. Исследование действия бигуанидов на содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов (ДК) при ИРГМ у крыс.

3. Исследование фрагментации ДНК в мозге крыс в норме, при ишемии-реперфузии и при введении ИММГ и ИПМГ.

4. Изучение влияния производных гуанидина на активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) при ИРГМ у крыс.

5. Исследование действия гуанидиновых производных на функционирование глутатионовой антиоксидантной системы при ИРГМ у крыс.

6. Определение кинетических параметров каталитического действия и оценка уровня экспрессии генов глутатионредуктазы (ГР) и глутатионпероксидазы (ГП) в мозге крысы при ИРГМ и действии ИММГ и ИПМГ.

7. Оценка воздействия бигуанидов на активности НАДФН-генерирующих ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ), при ИРГМ у крыс.

8. Исследование действия ИММГ и ИПМГ на метаболизм цитрата и активности ферментов, катализирующих его превращения.

9. Создание гипотетической модели участия гуанидиновых производных в регуляции свободнорадикального гомеостаза при ИРГМ у крыс.

Научная новизна. Проведены комплексные исследования воздействия бигуанидиновых производных на интенсивность СО и активность ферментативных и неферментативных компонентов АОС при ИРГМ у крыс. Установлено, что гуанидиновые производные могут проявлять нейропротекторные свойства, они способствуют торможению свободнорадикальных процессов и могут выступать в качестве антиоксидантов, уменьшая нагрузку на АОС организма. Выявлены особенности экспрессии некоторых ферментов АОС при патологии и действии ИММГ и ИПМГ. Впервые установлено, что модификации активностей ГР и ГП при ИРГМ и введении бигуанидов связаны с изменением уровня их экспрессии, а также ряда кинетических параметров каталитического действия. Выявлены оптимальные дозы для действия данных производных гуанидина, обеспечивающие наиболее выраженное изменение параметров, отражающих состояние свободнорадикального гомеостаза, в сторону нормальных значений. Предложена гипотетическая схема влияния производных гуанидина на свободнорадикальный гомеостаз организма на фоне развития ИРГМ.

Практическая значимость. Полученные данные имеют значение с точки зрения выявления молекулярных механизмов патологических нарушений при ИРГМ, а также поиска оптимальных путей их коррекции в медицинской практике. Данные о позитивном воздействии ИММГ и ИПМГ на свободнорадикальный гомеостаз представляют собой основу для практических рекомендаций при проведении клинических испытаний при лечении больных с ишемическими повреждениями головного мозга. Результаты работы углубляют фундаментальные представления о путях реализации протекторного действия веществ, обладающих антирадикальным потенциалом, что создает основы для развития антиоксидантной терапии.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы в биологических системах», а также спецкурсов по клинической биохимиии и энзимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских диссертаций студентами Воронежского госуниверситета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: 1-ой Общероссийской электронной научной конференции «Актуальные вопросы современной науки и образования» (Красноярск, 2010); 2-ой Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2010); 4-ой Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Конференция «Первые международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010); На 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнологии» (Курск, 2011); 4-ом Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия» (Воронеж, 2011); Ежегодной научно- отчетной конференции Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2011).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 13 публикациях, в том числе - 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Выявлено протекторное действие гуанидиновых производных (ИММГ и ИПМГ) при ИРГМ. Введение бигуанидов приводит к улучшению маркерных показателей при данной патологии и способствует торможению свободнорадикальных процессов, значительно интенсифицирующихся в патологическом состоянии.

2. Введение бигуанидов животным с ИРГМ приводит к снижению степени мобилизации АОС и приближению ряда показателей антиоксидантной защиты к контрольным значениям.

3. Под воздействием гуанидиновых производных происходит изменение в сторону нормы активности ряда ферментов окислительного метаболизма, способных оказывать лимитирующие действие на интенсивность СО.

4. В условиях интенсификации СО при ИРГМ происходит возрастание уровня транскриптов генов ГР и ГП в мозге животных. Снижение активности данных ферментов при введении бигуанидиновых производных при патологии сопряжено с уменьшением степени их экспрессии.

5. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема, отражающая участие бигуанидов в регуляции свободнорадикального гомеостза организма при развитии ИРГМ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 глав), списка литературы (228 источников) и приложения. Иллюстрационный материал включает 20 рисунков и 7 таблиц. В приложении содержится 6 рисунков и 2 таблица.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект и материалы исследования. В ходе экспериментальных исследований использовали сыворотку крови и гомогенат мозга белых крыс-самцов массой 150-200 г.

Создание экспериментальной моделей ишемии-ренерфузии головного мозга у крыс. Индуцирование ИРГМ у животных опытной группы осуществляли путем 30-минутной окклюзии обеих общих сонных артерий (Сапронов Н.С., 2000). Реперфузия достигалась снятием окклюзоров, восстановление кровотока контролировали визуально. Спустя трое суток животные были умерщвлены и головной мозг извлечен из полости черепа по стандартной методике. Все процедуры эксперимента соответствовали требованиям международных правил гуманного отношения к животным, отраженных в санитарных правилах по отбору и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). (УК РФ ст. 245). Крысы были разделены на 10 экспериментальных групп: 1 группа (контроль) - ложнооперированные животные; 2 группа - животные с постишемической реперфузией головного мозга; в 3, 4, 5 и 6 группах животным после индуцирования ишемии-реперфузии головного мозга интраперитонеально вводили ИММГ в дозах 12,5; 25; 50 и 75 мг/кг веса животного соответственно, один раз в сутки в течение 3-х дней эксперимента; в 7, 8, 9 и 10 группах крысам с постишемической реперфузией головного мозга вводили ИПМГ в дозах 12,5; 25; 50 и 75 мг/кг, также внутрибрюшинно, один раз в сутки в течение 3-х дней эксперимента.

Подготовка материала для исследования. Мозг крысы промывали в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем гомогенизировали в фарфоровой ступке в 3-кратном объеме охлажденной среды выделения. Гомогенат процеживали через капрон и центрифугировали при 7000 g в течение 15 мин. Супернатант использовали для дальнейшего исследования.

Забор крови осуществляли из сердца. Кровь помещали на 0,5 ч в термостат, затем центрифугировали при 3000g в течение 10 мин. Сыворотку крови использовали для дальнейших исследований.

Оценка интенсивности свобнорадикального окисления биосубстратов. Для оценки оксидативного статуса определяли содержание диеновых коньюгатов (ДК) спектрофотометрическим методом при 233 нм (Стальная И.Д., 1977). Для определения интенсивности СО применяли также метод биохемилюминесценции (БХЛ) с использованием биохемилюминометра БХЛ-06М с программным обеспечением (Любицкий О.Б., 1996). О степени развития апоптотических процессов судили по наличию фрагментации ДНК. ДНК выделяли фенольно-хлороформным методом, фрагментацию выявляли методом электрофореза в агарозном геле. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор «MassRuler» производства «Fermentas».

Оценка активности ферментов. Активность ферментов определяли на спектрофотометре СФ-56 с программным обеспечением. О скорости ферментативных реакций судили по изменению оптической плотности при 340 нм (ГР, ГП, НАДФ-ИДГ, Г6ФДГ). Активность АГ определяли при 233 нм, активность ЦС - 412 нм, каталазы - при 410 нм, СОД - при 540 нм. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах в расчете на грамм сырой массы (для тканевых гомогенатов) или на мл сыворотки, а также в виде удельной активности. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта реакции за 1 мин при температуре 25°С. Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Lowry О.Н., 1951).

Определение содержания компонентов неферментативной антиоксидантной системы. Содержание восстановленного глутатиона (GSH) определяли с помощью реакции, в результате которой образуется тионитрофенильный анион, имеющий максимум поглощения при 412 нм. Количество цитрата определяли по методу Нательсона (Медведева Л.В. и др., 2002).

Экстракция тотальной РНК. Для выделения тотальной РНК использовали тризоловый метод.

Электрофорез РНК и ДНК. Электрофорез РНК и ДНК проводили в агарозном геле. Для окрашивания использовали бромистый этидий.

Обратная транскрипция. На матрице выделенной РНК с помощью обратной транскрипции получали кДНК, используемую для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

ПЦР-амплификация в режиме реального времени. ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили на приборе АНК-32. В ходе работы использовали праймеры для определения уровня транскриптов исследуемого гена и референсного гена. В ходе эксперимента использовали набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR Greenl.

Определение уровня экспрессии генов. Определение относительного уровня экспрессии генов ГР и ГП осуществлялось с помощью программы «qgene» (Muller P.Y., 2002).

Выделение и очистка исследуемого фермента. Для получения ферментных препаратов ГР использовали схему очистки, включающую несколько стадий. В ходе выделения ГР и ГП после гомогенизации материала и фракционирования белков с помощью сульфата аммония фермент отделяли от низкомолекулярных соединений с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Все операции проводились в холодной камере при 0...4°С.

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические и регуляторные свойства ГР и ГП в норме, при ИРГМ и при введении гуанидиновых производных на фоне патологии исследовали на очищенных препаратах фермента. Определение кинетических параметров осуществляли в соответствии с рекомендациями Диксона и Уэбба ( Диксон, 1982).

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 6-8 кратных повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. Результаты опытов сравнивали с контролем. В таблице и на рисунках приводятся средние арифметические значения и их стандартные ошибки. Полученные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, различия сравниваемых показателей считали достоверными при р < 0,05.

ВОЗДЕЙСТВИЕ ГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС Важным фактором в патогенезе заболеваний головного мозга, сопряженных с развитием окислительного стресса, является в той или иной степени выраженная гипоксия, при которой нарушается генерация и

утилизация СР. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что развитие патологических изменений в мозге, связанных с ишемией-реперфузией, было сопряжено с увеличением параметров БХЛ в ткани мозга и сыворотке крови животных. Введение ИММГ и ИПМГ в исследуемых дозах животным с патологией приводило к снижению 8,1тах и tg а2 в ткани головного мозга и в сыворотке крови животных. Причем наибольшее уменьшение наблюдалось при введении ИММГ в дозах 25 и 50 мг/кг (табл 1).

Выявленное снижение значений 8 и 1шах, по-видимому, может быть связано с проявлением бигуанидиновыми производными антиоксидантных свойств, способствующих нормализации уровня СО биомолекул. Данное предположение подтверждается уменьшением степени мобилизации АОС организма, что проявляется в снижении tg а2 при введении исследуемых веществ.

Таблица 1.

Воздействие производных гуанидина на параметры биохемилюминесценции

при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

Группа животных I тах, мВ Б, мВ*сек tga

мозг сыворотка Мозг сыворотка мозг сыворотка

1 11,6±0,58 33,11±1,66 1,72±0,08 6,12±0,3 1,93± 1,09±0,1

2 26,85±1,34 58,99±2,95 3,68±0,18 13,61±0,68 4,75±0,24 2,63±0,13

3 21,2±1,06 38,52±1,93 2,4±0,12 8,7±0,44 3,7±0,19 2,4±0,12

4 10,88±0,54 27,12±1,36 1,83±0,09 5,38±0,27 1,98±0,1 0,91±0,05

5 12,11±0,6 30,19±1,51 2,09±0,11 5,91±0,3 2,95±0,15 0,98±0,05

6 21,5±1,08 36,77±1,84 2,4±0,12 7,4±0,37 3,2±0,16 2,0±0,1

7 25,3±1,27 36.97±1,85 2,68±0,14 10,14±0,51 3,5±0,18 2,29±0,12

8 11,9±0,6 30.16±1,51 2,41±0,12 6,14±0,31 3,18±0,16 1,42±0,07

9 12,74±0,64 31,48±1,57 2,66±0,13 6,33±0,32 3,51±0,18 1,61 ±0,08

10 15,27±0,76 34,48±1,72 3,28±0,16 12,45±0,62 4,77±0,24 2,48±0,12

Примечание: * - отличия от контроля достоверны (уровень значимости р<0,05).

В результате проведенных исследований нами было установлено, что введение бигуанидов животным с ишемией-реперфузией в дозе 25 мг/кг приводило к наиболее выраженному снижению уровня ДК в мозге и сыворотке крови животных, возрастающего при патологии. Использование ИММГ и ИПМГ в дозах 12,5 и 75 мг/кг не приводило к существенным изменениям.

Выявлено, что при развитии ишемии-реперфузии головного мозга наблюдалась фрагментация ДНК. Причем полученные фрагменты ДНК образовывали характерную «апоптозную лестницу». По мнению ряда исследователей, подобные фрагменты возникают при действии апоптоз-специфических нуклеаз, активация которых происходит при оксидативном стрессе (Muller К., 1992). Введение ИММГ и ИПМГ в дозах 25 и 50 мг/кг крысам с ИРГМ приводило к снижению степени фрагментации ДНК, что может быть свидетельством антиапоптотического действия исследуемых бигуанидов.

Важность исследования ферментов, участвующих в регуляции уровня цитрата состоит в том, что данное соединение, осуществляя хелатирование ионов Fe2+, способствует снижению его внутриклеточного уровня, а следовательно, скорости образованию гидроксильного радикала в реакции Фентона (Матасова JI.B., 2008). Согласно полученным данным введение ИММГ и ИПМГ животным с ИРГМ сопровождалось дозозависимым воздействием на содержание цитрата. Показано, что у крыс с постишемической реперфузией головного мозга наблюдалось значительное увеличение содержания цитрата как в ткани мозга, так и в сыворотке крови по сравнению с контрольными значениями. Введение ИММГ и ИПМГ в используемых дозах животным с ИРГМ приводило к уменьшению уровня цитрата в исследуемых тканях животных. Наряду с этим, под воздействием данных веществ было выявлено увеличение активности АГ, значительно снижающейся при патологии. Введение ИММГ в дозах 25 и 50 мг/кг животным на фоне развития постишемической реперфузии головного мозга приводило к более выраженному действию на активность данного фермента по сравнению с дозами, равными 12,5 и 75 мг/кг. Вероятно подобный эффект связан с проявлением антиоксидантных свойств используемых бигуанидов. Снижение интенсивности свободнорадикальных процессов сопровождается уменьшением повреждающего действия АФК на Fe-S-кластеры АГ, что приводит к нормализации её активности. Изменение содержания цитрата, по-видимому, связано с увеличением активности АГ при введении

используемых протекторов. При развитии постишемической реперфузии головного мозга происходило снижение активности ЦС как в ткани мозга, так в сыворотке крови крыс относительно контрольных значений. При введении ИММГ и ИПМГ животным с ИРГМ наблюдалось увеличение активности ЦС в исследуемых тканях. Причем наиболее выраженный эффект данных веществ выявлен также при введении их в дозах 25 и 50 мг/кг. При введении ИММГ и ИПМГ в дозах 12,5 и 75 мг/кг не было обнаружено выраженного протекторного эффекта по отношению к активности ЦС как в ткани мозга, так и в сыворотке крови экспериментальных групп животных.

ВОЗДЕЙСТВИЕ ГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС Исследование активности каталазы и СОД на фоне развития патологии головного мозга выявило значительное увеличение активности ферментов в мозге и в сыворотке крови крыс по сравнению с группой контрольных животных. Очевидно, увеличение активности данных ферментов при развитии постишемической реперфузии головного мозга носит адаптивно -компенсаторный характер в ответ на образование АФК (Владимиров Ю.А., 1991). Под воздействием ИММГ и ИПМГ на фоне развития патологии в исследуемых дозах наблюдалось снижение активности каталазы и СОД в мозге и сыворотке крови по сравнению с животными с ишемией-реперфузией. Причем наибольшее снижение наблюдалось при использовании бигуанидов в дозе 25 мг/кг.

Вероятно, уменьшение активности СОД и каталазы при введении синтетических производных гуанидина животным с постишемической реперфузией головного мозга может быть связано с антиоксидантным действием исследуемых веществ, приводящим к снижению степени мобилизации АОС.

Одним из основных компонентов ферментативного звена антиоксидантной защиты является ГР/ГП система. ГР является НАДФН-зависимым ферментом. В этой связи функционирование глутатионового звена АОЗ тесно сопряжено с ферментами, осуществляющими поставку восстановительных эквивалентов в виде НАДФН. К таким ферментам относится Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ.

л н и

я =

И я к

и X л

ч ф

ее

а ч

о О

0,02

0,015

0,01

0,005

1 23 45678 910 Группы животных

а мозг ■ сыворотка

Рис. 1. Удельная активность глутатионредуктазы в мозге и сыворотке крови крыс, в условиях нормы (1); при иргм (2); при введении иммг в дозах 12,5, 25, 50 и 75 мг/кг (3,4,5,6 соответственно); при введении ипмг в дозах 12,5, 25, 50 и 75 мг/кг (7,8,9,10 соответственно)

Развитие ишемии-реперфузии головного мозга сопровождалось значительным увеличением активностей ГР и ГП как в мозге, так и в сыворотке крови по сравнению с показателями в условиях нормы, что указывало на интенсификацию функционирования ферментов глутатионовой АОС в ответ на развитие окислительного стресса, вызванного патологическим состоянием (Кулинский В.И., 1990). Кроме того, был выявлен рост активности Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ в исследуемых тканях по сравнению с крысами 1-й экспериментальной группы, что видимо, было связано с необходимостью поставки восстановительных эквивалентов для работы глутатионового редокс-цикла в условиях оксидативного стресса при ишемическом повреждении головного мозга.

Внутрибрюшинное введение ИММГ и ИПМГ в дозе 25 мг/кг на фоне развития патологии приводило к наиболее выраженному снижению активностей ГР и ГП в мозге и сыворотке крови животных с постишемической реперфузией (рис. 1,2.). Введение данных бигуанидов животным с патологией в остальных дозах приводило к менее существенным изменениям значений исследуемых параметров, как в мозге, так и в сыворотке крови.

Наряду с этим, при внутрибрюшинном введении ИММГ и ИПМГ при развитии ИРГМ выявлено снижение активности Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ в исследуемых тканях относительно второй группы животных. Причем

наиболее выраженное уменьшение значений активности исследуемых ферментов показано при введении бигуанидов в дозе 25 мг/кг крысам с патологией. Использование ИММГ и ИПМГ в остальных дозах не сопровождалось значительными изменениями активностей этих ферментов. По-видимому, снижение степени мобилизации ГР/ГП АОС, к которому приводит введение ИММГ и ИПМГ, способствующее торможению процессов свободнорадикального окисления, проявляется и в уменьшении активности НАДФН-генерирующих ферментов.

0,02

Группы животных

В МОЗГ ■ СЫВОРОТКА

Рис.2. Удельная активность глутатионпероксидазы в мозге и сыворотке крови крыс, в условиях нормы (1); при ИРГМ (2); при введении ИММГ в дозах 12,5, 25, 50 и 75 мг/кг (3,4,5,6 соответственно); при введении ИПМГ в дозах 12,5, 25, 50 и 75 мг/кг (7,8,9,10 соответственно)

Выявлено также снижение содержания восстановленного глутатиона при введении исследуемых бигуанидов на фоне развития ИРГМ в сторону контрольных значений. Так, уровень глутатиона в мозге, возрастающий в патологическом состоянии в 2,0 раза, при введении ИММГ в дозах 25 и 50 мг/кг снижается в 1,6 и 1,2 раза, в концентрации 12,5 и 75 мг/кг - на 10% Подобная тенденция наблюдается и при введении ИПМГ.

ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ И ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В МОЗГЕ КРЫСЫ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ДЕЙСТВИИ БИГУАНИДОВ С применением ПЦР в реальном времени выявлено увеличение степени экспрессии ГР и ГП при ИРГМ. Очевидно, возрастание уровня экспрессии ГР связано с её участием в поддержании определенного пула 08Н, необходимого как для непосредственного лимитирования образования СР, так и для более интенсивного функционирования ГП-реакции в условиях

окислительного стресса. ГП катализирует реакцию детоксикации органических и неорганических пероксидов без образования свободных радикалов, используя в качестве донора водорода вБН (Ко\уаио\¥51и АЛ., 1999).

Таблица 2

Изменение уровня транскриптов гена глутатионредуктазы в мозге крыс в контроле, при ишемии мозга и действии бигуанидов на фоне патологии

Группы животных д а = а (ГР) - а (альбумин) Отношение экспрессии альбумин к ГР(2ДС')

Контроль 5,90±0,80 59,70

Ишемия мозга 3,90±0,15* 14,90

Ишемия мозга + ИММГ (25мг/кг) 4,8±0,98* 27,85

Ишемия мозга + ИММГ (50мг/кг) 4,5±0,23* 22,63

Ишемия мозга + ИПМГ (25мг/кг) 4,7±0,24* 25,99

Ишемия мозга + ИПМГ (50мг/кг) 4,3±0,22* 19,70

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (Р<0,05) Таблица 3

Изменение уровня транскриптов гена глугатионпероксидазы в мозге крыс в контроле, при ишемии мозга и действии бигуанидов на фоне патологии

Группы животных да=С( (гп)-а (альбумин) Отношение экспрессии альбумин к ГП (2Л с')

Контроль 3,87±0,30 14,60

Ишемия мозга 2,4±0,50* 5,27

Ишемия мозга + ИММГ (25мг/кг) 3,8±0,Ю* 13,90

Ишемия мозга + ИММГ (50мг/кг) 3,1±0,16* 8,57

Ишемия мозга + ИПМГ (25мг/кг) 3,6±0,18* 12,13

Ишемия мозга + ИПМГ (50мг/кг) 2,9±0,15* 7,46

Примечание: * - отличия от нормы достоверны (Р<0,05)

При введении ИММГ в дозах 25 и 50 мг/кг животным с ИРГМ происходило уменьшение экспрессии генов ГР и ГП по сравнению с уровнем при патологии (табл. 2,3). Также наблюдалось уменьшение экспрессии генов ГР и ГП по отношению к показателям во второй группе животных при введении ИПМГ. Вероятно изменения активностей ГР и ГП могут быть связаны с увеличением скорости синтеза данных ферментов при патологии и её уменьшением при введении производных гуанидина, благодаря антиоксидантному действию использованных протекторов, снижающих функциональную нагрузку на ГР/ГП систему.

С использованием ферментных препаратов ГР и ГП, некоторые кинетические параметры каталитического действия данных ферментов при патологии и действии бигуанидов. Так, значение Км для ГП по отношению к GSH в норме составляет 3,32 мМ. Выявлено, что в условиях постишемической реперфузии происходит снижение Км фермента к GSH в 1,6 раза. Подобные изменения были характерны и для сродства фермента по отношению к Н202. Величина Км для ГР по отношению к окисленному глутатиону уменьшается в 2,6 раза, к НАДФН - в 1,8 раза по сравнению с ферментом, выделенным из ткани мозга контрольных животных. Также при патологии наблюдается смещение рН оптимума ГП в более кислую сторону. По-видимому, это имеет значение для функционирования фермента в условиях ацидоза, сопровождающего развитие окислительного стресса при ишемии. Однако значительных изменений зависимости скорости ферментативной реакции ГР от концентрации ионов водорода в норме и при патологии не выявлено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ишемическое повреждение ткани головного мозга характеризуется усилением генерации АФК, интенсификацией свободнорадикальных процессов, деструкцией клеточных структур. В зависимости от силы и длительности воздействия окислительный стресс может вызывать гибель клеток, либо возможно включение адаптивных защитных механизмов (Lane N., 2002).

Согласно полученным результатам, бигуанидиновые производные, проявляя свои антиоксидантные свойства, способствуют ослаблению нагрузки на основное ферментативное звено АОЗ организма - СОД и каталазу (Максименко А.В., 1993). Кроме этого, бигуаниды способствуют снижению интенсивности протекания реакции Фентона и процессов ПОЛ в клеточных компарментах (рис 3). Также ИММГ и ИПМГ участвуют в

регуляции функционирования ГР/ГП системы, оказывая влияние на молекулярные механизмы, действующие на уровне экспрессии данных ферментов. Данные об изменении кинетических параметров ГР и ГП при патологии указывают, что модификации ферментативных активностей могут быть также связаны с изменением комформации белковых молекул.

Полученные данные свидетельствуют, что воздействие исследуемых бигуанидов на свободнорадикальный гомеостаз в организме животных с постишемической реперфузией головного мозга носило дозозависимый характер. Наиболее выраженный протекторный эффект выявлен для доз бигуанидиновых производных 25 и 50 мг/кг. Введение данных веществ в указанных дозах сопровождалось наибольшим изменением исследуемых параметров в сторону контрольных значений. По-видимому, это может быть связано со способностью используемых соединений выступать в качестве антиоксидантов и принимать участие в регуляции свободнорадикального гомеостаза в условиях развития окислительного стресса, обусловленного ишемией-реперфузией ткани головного мозга. Однако введение бигуанидов в дозе 12,5 мг/кг, очевидно не обеспечивает достаточного проявления протекторных свойств. Меньшая выраженность антиоксидантного эффекта с увеличением дозы исследуемых веществ может объясняться с точки зрения известного по литературным данным факта о двойственной роли антиоксидантов и возможном прооксидантном действии препаратов этого ряда. Имеется ряд данных, что эффективность действия антиоксидантов определяется дозой, сроками и способами их введения (Макеева A.B. 2010).

Таким образом, действие ИММГ и ИПМГ может рассматриваться как фактор, регулирующий свободнорадикальный гомеостаз на различных уровнях. Очевидно производные гуанидина могут выступать в качестве нейропротекторов при патологических состояниях, сопряженных с ишемическими повреждениями головного мозга.

Рис. 3. Гипотетическая схема участия бигуанидов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при шиемии-реперфузии головного мозга

Обознчения:

Снижение значений при патологии

Увеличение значений при патологии

■ Снижение значений при введении бигуанидов

Увеличение значений при введении буганидов

выводы

1. Установлено, что введение ИММГ и ИПМГ животным с ишемией-реперфузией головного мозга приводит в зависимости от дозы к выраженной в определенной степени нормализации интенсивности СО биомолекул, что проявляется в снижении параметров биохемилюминесценции, уровня диеновых коньюгатов и фрагментации ДНК.

2. Выявлено снижение активности СОД и каталазы при введении производных гуанидина на фоне развития ИРГМ, что может свидетельствовать о реализации антиоксидантного эффекта исследуемых веществ, уменьшающего нагрузку на ферменты АОС.

3. Показано изменение активностей ферментов ГР/ГП АОС и НАДФН - генерирующих ферментов - Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ, поставляющих НАДФН для глутатионового редокс цикла, при введении бигуанидиновых производных на фоне развития патологии.

4. Выявлено, что возрастание активностей ГР и ГП связано с увеличением количества транскриптов их генов. Введение ИММГ и ИПМГ на фоне ИРГМ приводило к уменьшению экспресии данных ферментов.

5. При введении ИММГ и ИПМГ на фоне развития патологии содержание восстановленного глутатиона, возрастающее при ИРГМ, изменялось в сторону контрольных значений. Так, уровень глутатиона, увеличивающийся в патологическом состоянии в ткани мозга в 2,0 раза, снижается при введении ИММГ и ИПМГ в дозе 25 мг/кг в 1,6 и 1,5 раза.

6. Нормализация активностей ферментов метаболизма цитрата и, как следствие, уменьшение его содержания при введении ИММГ и ИПМГ на фоне развития ишемии-реперфузии, также свидетельствует о снижении степени генерации свободных радикалов, критической мишенью которых может служить АГ.

7. Установлено, что оптимальные дозы введения бигуанидов, при которых проявляется их максимальный антиоксидантный потенциал - 25 и 50 мг/кг. Введение данных веществ в меньшей дозе приводит к снижению степени выраженности эффекта. При использовании бигуанидов в большей концентрации, по-видимому, начинает проявляться их прооксидантное действие, что сопровождается уменьшением изменений исследуемых параметров в сторону нормы.

8. На основании проведенных исследований предложена гипотетическая схема участия бигуанидов в регуляции

свободнорадикального гомеостаза организма при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Суховеева О.В. Воздействие бигуанидов на оксидативный статус ткани мозга и сыворотки крови крыс при постишемической реперфузии головного мозга/10.В. Суховеева., H.A. Дедикова, A.B. Макеева// Материалы 1-ой Общероссийской электронной научной конференции «Актуальные вопросы современной науки и образования», Красноярск,- 2009.- С. 1046-1047.

2. Макеева A.B. Влияние гуанидиновых производных на активность супероксиддисмутазы и каталазы при постишемической реперфузии головного мозга у крыс! A.B. Макеева, Т.Н. Попова, О.В. Суховеева, Л.Ф. Панченко// Нейрохимия, 2010,- Т.27,- №3,- С. 245-250.

3. Суховеева О.В. Воздействие №[штно(1-пиперидинил)метил]гуанидина активность аконитатгидратазы, цитратсинтазы и содержание цитрата в сыворотке крови крыс с постишемической реперфузией головного мозга/ О.В.Суховеева, А.В.Макеева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актальные проблемы современной науки и образования», Уфа.- 2010.- Т.2.- С. 671-675.

4. СуховееваО.В. Функционирование глутатионпероксидазной-глутатионредуктазной антиоксидантной системы в сыворотке крови крыс с постишемической реперфузией головного мозга и действии [имино(4-люрфолинил)метш]гуанидина/ О.В. Суховеева, A.B. Макеева, Т.Н. Попова // Первые международные Беккеровские чтения. Волгоград, 27-29 мая 2010. -Часть II. - С. 170-171.

5. Суховеева О.В. Активность аконитазы, цитратсинтазы и содержание г\итрата в ткани мозга при ишемии-реперфузии и действии N-[umuho(1-пиперидинил)метил] гуанидина на фоне развития патологии/ О.В. Суховеева, A.B. Макеева, Т.Н. Попова // Материалы 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование - 2010 » г. Воронеж, 20-21 апреля 2010, « Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ Часть II «Научные основы создания новых лекарственных средств », Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, с. 246-248.

6. Суховеева О.В. Сравнительная оценка действия разных доз N-[umuho(4-морфолинил)метил]гуанидина на уровень свободнорадикального окисления при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс/ О.В. Суховеева, А. И.

Клокова, A.B. Макеева, Т.Н. Попова // Сборник научных работ с материалами трудов 2-ой международной телеконференции «Фундаментальные науки и практитка», г.Томск 2010. - Т.1. -№ 3. - С. 76-77.

7. СуховееваО.В. Влияние Ы-[имино(4-морфолинил)метг<л]гуанидина в зависимости от дозы введения на активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в мозге и сыворотке крови крыс с постишемической реперфузией/ О.В. Суховеева, Т.Н Попова., A.B. Макеева, A.A. Агарков, Л.Н. Цветикова // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса «Симбиоз Россия 2011», Воронеж, 23-27 мая, 2011 - Т.1.- С. 41-44.

8. Суховеева О.В. Сравнительная оценка дозозависшюго воздействия бигуанидов на активность некоторых антиоксидантных ферментов при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс/ О.В. Суховеева, A.B. Макеева, A.A. Агарков H.A. Дедикова // Труды молодых ученых,- 2010.- Вып.1-2.-С.74-76.

9. Суховеева О.В. Применение ионообменной хроматографии для очистки глутатионредуктазы и глутатиоппероксидазы из мозга крысы в норме и при церебральной ш«елш«-реперфузии/ О.В. Суховеева, A.A. Агарков, Т.Н. Попова, H.A. Дедикова // Сорбционные и хроматографические процессы.-2011.- Т. 11.- Вып. 6,- С. 856-867.

10. Суховеева О.В. Влияние Ы-[имино(1-ттеридинил)метил]гуанидина и N-[имино(4-морфолинил)метил]гуанидина на содержание цитрата, активность аконитатгидратазы и цитратсинтазы при шиемии-реперфузии головного мозга у крыс/ О.В. Суховеева, Т.Н. Попова, A.B. Макеева, И.Ю Искусных // Биомедицинская химия.- 2011.- Т.57.- №5.- С.519-525. П.Попова Т.Н. Влияние И-[имино(1-пиперидинил)метил]гуанидина и N-[имино(4-морфолинил)метил]гуанидина на параметры биохемилюминесценции и уровень восстановленного глутатиона в мозге и сыворотке крови крыс при ишемии-реперфузии головного мозга/ Т.Н. Попова, О.В. Суховеева, A.B. Макеева, A.A. Агарков, Е.Д. Крыльский, С.М.С. Мухаммад Амин // Химико-фармацевтический журнал,- 2011,- Т.45,- № 6.- С. 42-46.

12. Суховеева О.В. Дозозависимое воздействие бигуанидов на активность глутатионпероксидазной-глутатионредуктазной системы и НАДФН-генерирующих ферментов при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс/ О.В.Суховеева, Т.Н. Попова, A.B. Макеева, A.A. Агарков, Л.Ф. Панченко // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2011,- Т 8,-С. 33-38.

13. Суховеева O.B. Влияние Ы-[шшно(4-морфолинш)метил]гуанидина на уровень диеновых коньюгатов и активность каталазы при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс/ О.В. Суховеева, Т.Н. Попова, A.A. Агарков, A.C. Хамлова // Материалы 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнологии».-Курск,- 2011.- С. 142-144. Статьи № 2,9,10,11,12 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК

Подписано в печать 07.10.11. Формат 60x84 Усл. печ. л. 1.2. Тираж 100 экз. Заказ 1230.

Отпечатано с готового ори га нал-макета в типографии Издательско-пол и графического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суховеева, Ольга Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метаболизм головного мозга 15 1.1.1 .* Этиология и патогенез ишемии мозга 16 1.1.2. Реперфузия — восстановление или повреждение церебральной ткани ^ *

1.2. Роль свободнорадикального окисления в организме

1.2.1. Антиоксидантная система и её роль в гомеостазе организма /

1.2.1.1. Ферментативное звено антиоксидантной защиты организма от окислительного стресса ^

1.2.1.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы 3О

1.2.2. Особенности окислительного стресса в мозге

1.3. Нейропротективная терапия 34 1.3.1. Испольвозание антиоксидантов при ишемии головного мозга

1.4. Гуанидиновые производные

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42 2.1. Объект и методы исследования

2.1.1. Объект исследования

2.1.2. Методы исследования

2.1.2.1. Создание модели ишемии-реперфузии головного мозга у экспериментальных животных и введение веществ -протекторов

2.1.2.2. Исследование фрагментации ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле ^

2.1.2.3. Подготовка материала для исследования

2.1.2.4. Определение концентрации лактата в ткани головного мозга крыс

2.1.2.5. Определение количества пирувата в ткани головного мозга экспериментальных групп животных

2.1.2.6. Оценка оксидативного статуса

2.1.2.6.1. Определение содержания диеновых коньюгатов

2.1.2.6.2. Определение интенсивности процессов свободнорадикального окисления биосубстратов методом биохемилюминесценции ^

2.1.2.7. Определение концентрации восстановленного глутатиона

2.1.2.8. Определение концентрации цитрата

2.1.2.9. Определение активности ферментов

2.1.2.9.1. Определение активности супероксиддисмутазы

2.1.2.9.2. Определение активности каталазы

2.1.2.9.3. Определение активности НАДФ-зависимых ферментов

2.1.2.9.4. Определение активности аконитатгидратазы

2.1.2.9.5. Определение активности цитратсинтазы

2.1.2.10. Определение концентрации белка

2.1.2.11. Выделение и очистка глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы из мозга крыс

2.1.2.11.1. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония

2.1.2.11.2. Гель-фильтрация на сефадексе 0

2.1.2.11.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

2.1.2.12. Экстракция тотальной РНК тризольным методом

2.1.2.13. Электрофорез РНК

2. Г.2.14. Обратная транскрипция

2.1.2.15. ПЦР-амплификация в режиме реального времени

2.1.2.16. Определение уровня экспрессии генов

2.1.2.17. Электрофорез ДНК

2.1.2.18. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. ВОЗДЕЙСТВИЕ

ГУАНИДИНОВЫХПРОИЗВОДНЫХ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС 3.1 Оценка уровня энергетического обмена при действии, гуанидиновых производных в ткани головного.мозга крыс при развитии ишемии-реперфузии.

3.2. Влияние бигуанидов на содержание диеновых коньюгатов в мозге и сыворотке крови крыс при ишемии-реперфузии головного мозга

3.3. Воздействие производных гуанидина на параметры биохемилюминесценции пи развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

3.4. Исследование фрагментации ДНК в мозге крыс в норме, при ишемии-реперфузии и при введении гуанидиновых производных

3.5. Изменение активности аконитатгидратазы под влиянием производных гуанидина при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

3.6. Воздействие производных гуанидина на содержание цитрата при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

3.7. Изменение активности цитратсинтазы под влиянием производных гуанидина при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

ГЛАВА 4. ВОЗДЕЙСТВИЕ ГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС

4.1. Изменение активностей супероксиддисмутазы и каталазы при действии бигуанидиновых производных на фоне развития ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

4.2. Влияние производных гуанидина на функционирование глутатионовой антиоксидантной системы и активность некоторых НАДФН-генерирующих ферментов при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

4.2.1. Влияние производных гуанидина на содержания восстановленного глутатиона при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

4.2.2. Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы при действии производных гуанидина при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

4.2.3. Воздействие производных гуанидина на активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс

ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ И ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ И ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ

В МОЗГЕ КРЫСЫ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ДЕЙСТВИИ БИГУАНИДОВ

5.1. Выделение тотальной РНК из мозга крыс

5.2. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

5.3. Оценка уровня экспрессии с генов глутатионредуктазы и 110 глутатионпероксидазы в норме, при ишемии-реперфузии и при введении бигуанидов при патологии

5.4. Очистка глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы из мозга крысы в норме и при церебральной ишемии-реперфузии

ЗКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свободнорадикальный гомеостаз в условиях ишемии-реперфузии головного мозга крыс при воздействии гуанидиновых производных"

Актуальность проблемы. Процессы свободнорадикального окисления (СО) биосубстратов протекают в условиях физиологической нормы на стационарном уровне. В то же время чрезмерному образованию свободных радикалов (CP) способствуют многие патологические процессы [160,161]. В настоящее время существует концепция о существенной патогенетической роли CP в повреждении клеток головного мозга, обусловленном! ишемией. Именно ишемия является наиболее распространенной причиной нарушений функций мозга [17,18], что взаимосвязано с нарушением работы антиоксидантной защиты (АОЗ) организма. Нарушение функционирования системы АОЗ; контролирующей каскад свободнорадикальных реакций, неизбежно отражается на эффективности процессов-детоксикации активных форм кислорода (АФК)-в клетке и может привести к возникновению окислительного4 стресса и связанных с ним необратимых изменений'в тканях [3j85]. Если нарушение кровообращения было длительным - больше нескольких минут или! часов, то вслед за восстановлением кровотока возникает каскад патологических изменений, лежащих в основе негативных явлений, связанных с реперфузией, которые включают, в частности, постишемическую гиперперфузию , а далее постишемическую гипоперфузию.

Актуальной проблемой является поиск средств, способных повышать резистентность организма к повреждающему действию CP при данной патологии. В медицинской практике при лечении заболеваний различной» этиологии, в том числе и патологий головного мозга, когда атиоксидантная система (АОС) организма не справляется с усиленной продукцией АФК, широко используют антиоксиданты природного и синтетического происхождения. Гетероциклические производные гуанидина обладают широким спектром биологической активности [130].

Они проявляют антигипертензивные и кардиопротекторные свойства, являются супрессорами пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и ингибиторами адренорецепторов и натриевых каналов [209], обладают бактерицидной и фунгицидной активностью, способствуют всасыванию глюкозы в- желудочно-кишечном тракте, уменьшают глюконеогенез, снижают уровень холестерина, триглицеридов и инсулина у больных, страдающих ожирением [80]. Однако вопрос о возможности применения бигуанидов в- области нейропротекции до- сих пор- остается- открытым. Исходя из этого, был проведен поиск, бигуанидиновых производных с целевой, биологической- активностью с помощью программы- прогноза «структура-свойство» PASS (Prediction* of Activity Spectrafor Substances), доступной в режиме on-line по адресу http://wwav.ibmh.msk.su/pass [138]. Компьютерному анализу было подвергнуто несколько, сотен веществ с наиболее высокой вероятностью (>0,7-0^9) проявления* той' или иной активности. В результате нами были отобраны бигуаниды: N-[hmhho(4-морфолинил)метил]гуанидина (ИММГ) и N-[hmhho(1пиперидинил)метил]гуанидина (ИПМГ) с предполагаемым спектром интересующей нас биологической, активности. Данные вещества обладают противоишемическим, кардио-, церебропротекторным эффектами.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей, работы было исследование воздействия ИММГ и ИПМГ на свободнорадикальный гомеостаз при ишемии-реперфузии головного мозга (ИРГМ) у крыс. В' связи с поставленной целью решались следущие задачи:

1. Оценка влияния- гуанидиновых производных на параметры биохемилюминесценции при ИРГМ у крыс, отражающие интенсивность, свободнорадикальных процессов и общий антиоксидантный потенциал.

2. Исследование действия бигуанидов на содержание первичных продуктов.ПОЛ - диеновых коньюгатов (ДК) при ИРГМ у крыс.

3. Исследование фрагментации ДНК в мозге крыс в норме, при ишемии-реперфузии и при введении ИММГ и ИПМГ.

4. Изучение влияния производных гуанидина на активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) при ИРГМ у крыс.

6. Определение кинетических параметров каталитического действия и оценка уровня экспрессии, генов глутатионредуктазы (ГР) и глутатионпероксидазы (ГП) в мозге крысы при ИРГМ и действии» ИММГ и ИПМГ.

7. Оценка воздействия бигуанидов на активности НАДФН-генерирующих1, ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, (Г6ФДГ) и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ), при ИРГМ у крыс.

8. Исследование действия ИММГ и ИПМГ на метаболизм цитрата и активности ферментов, катализирующих его превращения. ч 9. Создание гипотетической модели участия гуанидиновых производных в регуляции свободиорадикального гомеостаза при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс.

Научная новизна. Проведены комплексные- исследования воздействия бигуанидиновых производных на интенсивность СО и активность ферментативных и неферментативных компонентов АОС при ИРГМ у крыс. Установлено, что гуанидиновые производные могут проявлять нейропротекторные свойства, они способствуют торможению ч свободнорадикальных процессов и могут выступать в качестве антиоксидантов, уменьшая нагрузку на АОС организма. Выявлены особенности экспрессии некоторых ферментов АОС при патологии и действии ИММГ и ИПМГ. Впервые установлено, что модификации

11 активностей ГР и ГП при ИРГМ и введении бигуанидов связаны с изменением- уровня их экспрессии, а также ряда кинетических параметров; каталитического действия. Выявлены оптимальные дозы для действия данных производных гуанидина, обеспечивающие наиболее выраженное изменение параметров; отражающих состояние свободнорадикального гомеостаза, в сторону нормальных значений; Предложена гипотетическая'» схема.влияния.производных гуанидина на свободнорадикальный гомеостаз организма па фоне развития ИРГМ. Практическая значимость. Полученные данные имеют значение с точки» зрения1 выявления; молекулярных, механизмов патологических нарушений: при ИРГМ, а также поиска оптимальных путей их коррекции в медицинской«; практикеVДанные о позитивном« воздействию ИММГ и ИПМГ на свободнорадикальный гомеостаз представляют собой основу для практических рекомендаций- при проведении; клинических испытаний при лечении больных с ишемическими повреждениям и головного мозга. Результаты работы углубляют фундаментальные представления- о путях реализации протекторного действия- веществ, обладающих антирадикальным потенциалом; что; создает основы для развития антиоксид антной терапии.

Материалы* работы, используются в учебном, процессе на, биолого-почвенном факультете Воронежского- государственного университета при чтении курсов: «Биохимия: человека», «Свободнорадикальные процессы в биологических системах», а также спецкурсов по клинической биохимиии и энзимологии. Кроме того, они используются при проведении практикумов; выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских: диссертацийгстудентами Воронежского госуниверситета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: 1-ой Общероссийской электронной научной конференции «Актуальные вопросы современной науки и образования» (Красноярск, 2010); 2-ой Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2010); 4-ой' Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически, активных веществ» (Воронеж, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы-современной науки и образования» (Уфа,- 2010); Конференция^ «Первые международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010); На 4-ой Всероссийской научно-практической конференции» с международнымч участием «Биомедицинская инженерия юбиотехнологии» (Курск, 2011); 4-ом Всероссийском с международным участием Конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия» (Воронеж, 2011); Ежегодной научно- отчетной конференции Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2011).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной! работы изложены в 13 публикациях, в том« числе - 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

На защиту выносятся следующие положения:

5. На основе полученных' данных предложена гипотетическая схема, отражающая участие бигуанидов в регуляции свободнорадикального гомеостза организма при развитии ИРГМ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Суховеева, Ольга Вадимовна

выводы

1. Установлено, что введение; ИММГ и ИПМГ животным с ишемией-реперфузией головного мозга приводит в зависимости: от дозы к выраженной- в, определенной степени нормализации интенсивности СО биомолекул, что проявляется в снижении параметров биохемилюминесценции, уровня' диеновых коньюгатов и фрагментации ДНК.

2. Выявлено снижение активности СОД и катал азы при введении производных гуанидина на фоне развития ИРГМ, что: может свидетельствовать о реализации антиоксидантного эффекта исследуемых веществ, уменьшающего »нагрузку на ферменты АОС.

3. Показано изменение активностей ферментов ГР/ГП АОС и НАДФН -генерирующих ферментов^ - Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ, поставляющих НАДФН для. глутатионового редокс цикла,,при введении бигуанидиновых производных на фоне развития патологии.

41 Вшвлено^чтогвозрастание активностей; Щ'и^ГП? связано сгувеличением-количествам транскриптов их- генов. Введение ИММГ и ИПМГ. на! фоне ИРГМ( приводило к уменьшению экспресии данных ферментов. 5. При введении ИММГ и ИПМГ на фоне развития патологии содержания восстановленного: глутатиона возрастающее при ИРГМ, изменялось в сторону контрольных значений. Так, уровень глутатиона, увеличивающийся в патологическом состоянии в; ткани мозга, в . 2,0 раза, снижаетсяшри:введении ИММГ^ и^ИИМГ в дозе 25 мг/кг в 1^6 ш 1,5 раза.

6: Нормализация^ активности ферментов метаболизма цитрата и, как следствие, уменьшение его содержания при введении ИММГ и ИПМГ на фоне: развития ишемии-реперфузии, также свидетельствует о снижении; степени генерации свободных радикалов, критической мишенью которых может служить АГ.

7. Установлено, что оптимальные дозы введения бигуанидов, при которых проявляется их максимальный антиоксидантный потенциал - 25 и 50 мг/кг. Введение данных веществ в меньшей дозе приводит к снижению степени выраженности эффекта. При использовании бигуанидов в большей концентрации, по-видимому начинает проявляться их прооксидантное действие, что сопровождается уменьшением изменений исследуемых параметров в сторону нормы.

8. На основании проведенных исследований предложена гипотетическая схема участия бигуанидов в регуляции свободнорадикального гомеостаза организма при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важным фактором в патогенезе1 заболеваний; головного мозга, сопряженных с развитием окислительного стресса, является в той или иной степени? выраженная гипоксия; при которой? нарушается генерация« и утилизация; СР [60]. Результаты» проведенных исследований • свидетельствуют, что.' развитие: патологических изменений; в / мозге, связанных с ишемией-реперфузией, сопряжено с увеличением параметров БХЛ в ткани мозга ш сыворотке: крови животных. Значительное увеличение: светосуммы (Б) и интенсивности максимальной! вспышки (1шах) при ИРГМ' указывает на^ возрастание интенсивности СО- биомолекул. Рост, значений tga2, характеризующего общую антиоксидантную активность, свидетельствует о том, что в1условиях патологии ¡происходит мобилизация компенсаторных механизмов, направленных на снижение уровня СРП.

Введение: ИММГ в исследуемых-.: дозах животным; с патологией приводило? к; снижению? Б; 1шах и а2 в; тканш головного мозга и в;, сыворотке крови животных. Причем наибольшее уменьшение наблюдалось при; введении ИММ Г в дозах 2 5 и 5 0 мг/кг.

Воздействие ИПМГ также приводило к. дозозависимому снижению параметров?; БХЛ в мозге и* крови животных с постишемической реперфузией головного мозга. Введение данного вещества в дозах 25 и 50 мг/кг сопровождалось также наиболее выраженным изменением исследуемых показателей в сторону нормы.

Выявленное снижение значений и 1шах, по-видимому, может быть связано с проявлением бигуанидиновыми производными антиоксидантных свойств; способствующих нормализации; уровня СО биомолекул. Данное предположение: подтверждается уменьшением^ степени мобилизации АОС организма; что, проявляется в снижении tg а2 при введении; исследуемых веществ. .

В результате проведенных исследований нами было установлено, что введение бигуанидов животным с ишемией-реперфузией в дозе 25 мг/кг приводило к наиболее выраженному снижению уровня ДК в мозге и сыворотке крови животных, возрастающих при патологии. Использование ИММГ и ИПМГ в дозах 12,5 и 75 мг/кг не приводило к существенным изменениям.

Показано, что при развитии ишемии-реперфузии головного мозга наблюдалась фрагментация ДНК. Причем полученные фрагменты ДНК образовывали характерную «апоптозную лестницу». По мнению ряда исследователей, подобные фрагменты возникают при действии апоптоз-специфических нуклеаз, активация которых происходит при оксидативном стрессе [197]; Введение ИММГ и ИПМГ в дозах 25 и-50 мг/кг крысам с" ИРГМ приводило к снижению степени фрагментации ДНК, что может быть свидетельством антиапоптотического действия^ исследуемых бигуанидов.

Исследование активности каталазы и СОД на фоне развития патологии головного мозга выявило значительное увеличение активности ферментов в мозге и в сыворотке крови крыс по сравнению* с группой* контрольных животных. Очевидно, увеличение активности данных ферментов при развитии постишемической реперфузии головного мозга носит адаптивно - компенсаторный характер в ответ на образование АФК [97]. Под воздействием ИММГ и ИПМГ на фоне развития' патологии в исследуемых дозах наблюдалось снижение активности^ каталазы и СОД в мозге и сыворотке крови по сравнению с животными, с ишемией-реперфузией. Причем наибольшее снижение наблюдалось при использовании бигуанидов в дозе 25 мг/кг.

Вероятно, уменьшение каталитической активности СОД и каталазы при введении синтетических производных гуанидина животным с постишемической реперфузией головного мозга может быть связано с

118 антиоксидантным действием исследуемых веществ, приводящим к снижению степени мобилизации АОС [178].

Установлено, что развитие ишемии-реперфузии головного мозга сопровождается значительным увеличением активности ГР и ГП как в мозге, так и в сыворотке крови по сравнению с показателями в условиях нормы, что указывало на интенсификацию функционирования! ферментов глутатионовой АОС в ответ на развитие окислительного стресса, вызванного патологическим состоянием [188].

Кроме того, был выявлен рост активности Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ в исследуемых тканях по сравнению с крысами 1-й экспериментальной группы, что видимо,- было связано^ с необходимостью поставки восстановительных эквивалентов для работы глутатионового редокс-цикла в условиях оксидативного1 стресса при ишемическом повреждении головного мозга.

Внутрибрюшинное введение ИММГ и ИПМГ в дозе 25 мг/кг на фоне развития патологии приводило к наиболее выраженному снижению активностей ГР и ГП в мозге и сыворотке крови животных с постишемической реперфузией. Введение данных бигуанидов животным с патологией в остальных дозах не приводило к существенным изменениям значений исследуемых параметров, как в мозге, так и в сыворотке крови.

119 наиболее выраженное уменьшение значений активности исследуемых ферментов показано при введении бигуанидов в дозе 25 мг/кг крысам с патологией. Использование ИММГ и ИШМГ в остальных дозах не сопровождалось значительными изменениями активности этих ферментов.

По-видимому, снижение степени мобилизации ГР/ГП АОС, к которому приводит введение ИММГ и ИПМГ, способствующее торможению процессов свободнорадикального окисления, проявляется и в уменьшении активности НАДФН-генерируюгцих ферментов.

С применением ПЦР в реальном времени выявлено, изменение экспрессии ГР и ГП. Очевидно, возрастание экспрессии ГР связано с её участием в поддержании определенного пула ОЭН; необходимого как для непосредственного лимитирования образования СР, так и для более интенсивного функционирования ГП-реакции в условиях- окислительного стресса. ГП катализирует реакцию детоксикации органических и неорганических пер оксидов без, образования* свободных радикалов, используя в качестве донора водорода ОБН [102, 187].

При введении ИММГ в дозах 25 и 50" мг/кг животным с ИРГМ происходило уменьшение экспрессии генов * ГР и ГП по сравнению с уровнем при патологии. Также наблюдалось уменьшение экспрессии генов ГР'и ГП по отношению к показателям во второй группе животных при введении ИПМГ. Вероятно изменения, активностей ГР и ГП могут быть связаны с увеличением скорости синтеза данных ферментов при патологии и её уменьшением при введении производных гуанидина, благодаря антиоксидантному действию использованных протекторов, снижающих функциональную нагрузку на ГР/ГП систему.

С использованием очищенных ферментных препаратов ГР и ГП исследованы кинетические параметры каталитического действия ферментов. Результаты определенмя кинетических параметров ГР и ГП свидетельствуют, что модификации ферментативных активностей могут

120 быть связаны с изменением: комформации белковых молекул. Выявлены изменения сродства, ферментов к субстратам,, а также смещение РН оптимума ГП в более кислую сторону при патологии.

По-видимому, выявленные модификации; кинетических параметров. ГП и ГР при патологии; имеют значения? для более эффективной-элиминации; АФК, чрезмерное генерирование- которых происходит в. данных условиях.

Выявлено также снижение содержанияшосстановленного глутатиона при введении:исследуемых бигуанидов на фоне развития ИРГМ в сторону контрольных значений. Так, уровень, глутатиона,,в мозге; возрастающий- в патологическом состоянии в 2,0 раза; при введение ИММГ в дозах 25 и 50 мг/кг снижается в 1,6 и 1,2 раза; в. концентрации 12,5 и 75 мг/кг - на; 10% раза. Подобная тенденция наблюлается и при введении ИПМГ.

Важность исследования ферментов; участвующих в регуляции уровня цитрата- состоит в том, что- данное, соединение,, осуществляя хелатирование ионов\Ре2+, способствует снижению; его: внутриклеточного уровня;. а> следовательно; скорости; образованию? гидроксильного радикала в реакции Фентона.

Согласно полученным данным введение ИММГ и ИПМГ животным с ИРГМ сопровождалось дозозависимым воздействием на содержание цитрата; Показано, что у крыс с постишемичсской реперфузией головного мозга- наблюдалось значительное увеличение содержания- цитрата; как в ткани мозга, так. и в сыворотке крови: по сравнению с контрольными значениями. Введение'ИММГ и ИПМГ в используемых дозах животным с

ИРГМ« приводило к уменьшению» уровня: цитрата в исследуемых тканях животных. Наряду с этим; под. воздействием данных веществ было выявлено увеличение активности АГ, значительно снижающейся при патологии. Введение ИММГ в дозах 25 и 50 мг/кг животным на фоне развития постишемической реперфузии головного мозга приводило к

121 наиболее выраженному действию на активность данного фермента по сравнению с дозами, равными 12,5 и 75 мг/кг. Вероятно подобный эффект связан с проявлением антиоксидантных свойств используемых бигуанидов. Снижение интенсивности свободнорадикальных процессов сопровождается уменьшением повреждающего действия АФК на Ре-Б-кластеры АГ, что приводит к нормализации её активности. Изменение содержания цитрата, по-видимому, связано с увеличением активности АГ при введении используемых протекторов.

При развитии постишемической репер фузии головного мозга происходило снижение активности ЦС как в ткани мозга, так в сыворотке крови- крыс относительно контрольных значений. При введении ИММГ и ИПМГ животным с ИРГМ наблюдалось увеличение активности ЦС в исследуемых тканях. Причем наиболее выраженный эффект данных веществ выявлен при их введении в дозах 25 и 50 мг/кг ткани мозга. При введении ИММГ и ИПМГ в дозах 12,5 и 75 мг/кг не' было обнаружено выраженного протекторного эффекта по отношению к активности ЦС как в, ткани мозга, так и в сыворотке крови экспериментальных групп животных.

Таким образом, воздействие исследуемых бигуанидов на свободнорадикальный гомеостаз, животных с постишемической реперфузией носило дозозависимый характер. Наиболее выраженный протекторный эффект выявлен для доз бигуанидиновых производных 25 и

50 мг/кг. Введение данных веществ в указанных дозах сопровождалось наибольшим изменением исследуемых параметров в сторону контрольных значений. По-видимому, это может быть связано со способностью используемых соединений выступать в качестве АО и принимать.участие в регуляции свободнорадикального гомеостаза в .условиях развития* окислительного стресса, обусловленного ишемией и реперфузией ткани головного мозга. Меньшая выраженность антиоксидантного эффекта с

122 увеличением дозы исследуемых веществ может объясняться с точки зрения известного по литературным данным факта о двойственной роли антиоксидантов и возможном прооксидантном действии препаратов этого ряда [93]. Имеется ряд данных, что эффективность действия антиоксидантов определяется дозой, сроками и способами их введения [67].

Ишемическе повреждение ткани головного мозга характеризуется усилением генерации АФК, ростом свободнорадикальных и перекисных процессов, деструкцией клеточных структур. В зависимости от силы и длительности воздействия окислительный стресс может вызывать гибель клеток, либо возможно включение адаптивных защитных механизмов.

Согласно полученным результатам бигуанидиновые производные, проявляя свои антиоксидантные свойства, способствуют ослаблению нагрузки на основное ферментативное звено АОЗ организма — СОД и каталазу. Кроме этого, бигуаниды способствуют снижению интенсивности протекания реакции Фентона и процессов ПОЛ в клеточных компарментах. Также ИММГ и ИПМГ участвуют в регуляции функционирования ГР/ГП системы, оказывая влияние на* молекулярные механизмы, действующие на уровне экспрессии данных ферментов.

Таким образом действие ИММГ и ИПМГ может рассматриваться как фактор, регулирующий свободнорадикальный гомеостаз на различных уровнях. Очевидно производные гуанидина могут выступать в качестве нейропротекторов при лечении патологий, сопряженных с ишемическими повреждениями головного мозга. ацетил СоА + О А ♦♦ цитрат хелат°Р и V изоцитрат

НО

Активация НАДФН-оксидазы

Интенсификация СО биомолекул

1" Г6ФДГ ▼

•ТНАДФ-ИДГ оксидативная модификация белков катадазз*Т н2о+ ог

СБНа ■

Фрагментация нуклеиновых кислот

Нарушение барьерных и транспортных свойств мембраны

Патологические изменения метаболам еских процессов в клетке, активация апоптоза

Рис. 20. Гипотетическая схема участия бигуанидов в регуляции свободнорадикалъного гомеостаза при ишемии-реперфузии головного мозга

Обознчения: I

Снижение значений при патологии

Увеличение значений при патологии

Снижение значений при введении бигуанидов 1

Увеличение значений при введении буганидов

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суховеева, Ольга Вадимовна, Воронеж

1. Активность маркерных ферментов клеточных мембран крыс при адаптации к гипоксической гипоксии / И.Н. Маньковская, Г.Л. Вавилова, О.Н. Харламова // Укр биохим.журн.- 1997.-Т.69, №2.-С:79-87.

2. Аналитическая биохимия: учеб. пособие / Т.И. Рахманова, Л.В. Матасова, Т.Н. Попова. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2006. - 62 с.

3. Анатомия нервной системы: метод, материал / В.Ю. Сулин, Н.Д. Полякова Семенова. - Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2000. - 33 с.

4. Андреев А.Ю. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях / А.Ю. Андреев, Ю.Е. Кушнарева, A.A. Старков // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 2. - С. 246-264.

5. Ашмарин И.П. Биохимия мозга / И.П. Ашмарин, П.В. Стукалов, Н.Д. Ещенко. Спб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 1999. - 328 с.

6. Бел ушки на Н;Н. Гуанидин — тиолы / H.H. Белушкина, И.С. Северина // Биохимия; 1996. - Т. 61, № 12. - С. 2140-2146.

7. Ю.Беркович Е.М. Энергетический обмен в норме и при патологии / Е.М; Беркович. —М;: Медицина; 1964.—334 с.

8. И .Бернхард С. Структура и функция ферментов / С. Бернхард; перевод с англ. Л;М. Гинодмана, И.И: Рапановича; под ред. А.Е. Броунштейна. -М.: Мир, 1971.-334 с.

9. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения: органов. М: Медицина; 1989;-368?с:

10. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот; под ред. А.И. Арчакова; М;П; Кирпичникова, А.Е. Медведева и др.: М.: Изд-во НИИ Биомедицинская химия РАН, 1999. - 327 с.

11. Биохимия человека / Под ред. проф. Марри К. (пер. с англ.). В 2 т.-М.: Мир, 1993.- 760 с. .

12. Богач П.Г., Курский М.Д:, Кучеренко Н.Е., Рыбальченко В.К. Структура и функции биологических мембран. — К., Вища школа, 1981.—336 с.

13. Боголепов Н.К. Церебральные кризисы и инсульт. М. : Медицина, 1971.392с.

14. Боголепов H.H. Ультраструктура головного мозга / H.H. Боголепов. М.: Медицина, 1979. - 167 с.

15. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг. // Соросовский образовательный журнал.- 2001.- Т.7, № 4.-С 21-28.

16. Бузлама B.C. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и систем антиоксидантной защиты у животных /B.C. Бузлама. Воронеж, 1997. - 41с.

17. Бульон В.В. Коррекция последствий постишемического реперфузионного повреждения головного мозга цитофлавином/ В.В. Бульон, JI.C. Хныченко, Н. С. Сапронов // Бюлл. экспер. биол. и мед.-2000.- Т 129, № 2.- С 149-151.

18. Буравкова Л.Б. Роль циклических нуклеотидов в. патогенезе острой гипоксии// Л.Б. Буравкова, Э.С. Маилян, Е.А. Коваленко / Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 1983.-'№5.- С.40-43.

19. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон. М.: Медицина, 1991.- 167 с.

20. Ваизова O.E. Влияние этомерзола на локальный мозговой кровоток и отек мозговой ткани в условиях хронической ишемии/ O.E. Ваизова, Т.М. Плотникова, М.Б. Плотников // Эксперим. и клиническая фармакология.-1994.- Т.57, №7.- С.25-27.

21. Верещагин Н.В. Патология вертебробазилярной системы и нарушения мозгового кровообращения. М.: Медицина, 1980.- 310 с.;

22. Верещагин Н.В., Патология головного мозга при атеросклерозе и артериальной гипертонии./ Н.В. Верещагин, В.А. Моргунов, Т.С. Гулевская//М.: Медицина, 1997.-288 с.

23. Верещагин H.B. Инсульт в зеркале медицины и общества/ Н.В. Верещагин, З.А. Суслина // Вестник РАМН.- 2003.- № 11.- С. 48-55.

24. Виленский Б.С. Инсульт: профилактика, диагностика и лечение / Б.С Виленский. СПб.: Изд-во.С.-Петерб. ун-та, 1999: - 330 с.

25. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972.- 252 с.

26. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров и др. // Итоги науки и техники. Серия Биофизика. ВИНИТИ. 1991.-Т. 29.-С. 1-252.

27. Владимиров Ю.А. Физико — химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А .Я. Потапенко — М.: Высш.шк, 1989.- 199 с.

28. Ворлоу Г.П. Инсульт. Практическое руководство для ведения больных/ Г.П. Ворлоу, М.С. Деннис, ван Гейн Ж. //. СПб.: Политехника, 1998.- 374 е.;

29. Галкин В.А. Поликлиническая терапия« / Б.Я. Барт, H.A. Мухин; под ред. В.А. Галкина. М.: Медицина, 2000. - 255 с.

30. Гехт А.Б. Ишемический инсульт: вторичная профилактика иосновные направления фармакотерапии в восстановительном периоде / А.Б. Гехт // Медицинские новости. 2004. - №1. - С. 25-30.

31. Гомазков О. А. Ангиотензинпревращающий фермент в кардиологии: молекулярные и функциональные аспекты // Кардиология.- 1997.- № 11.-С. 58.

32. Григорова И. А. Патогенетические механизмы ишемического церебрального инсульта// Лпс.справа.- 1998.-№1.-С.58-65.

33. Гродзинский A.M. Краткий справочник по физиологии растений / A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский. Киев: Наукова думка, 1973. -273 с.

34. Гусев Е.И. Ишемия головного мозга / Е.И. Гусев, В.И. Скворцова. — М.: Медицина, 2001. 328 с.

35. Гусев Е.И. Проблема инсульта в России // Ж-л неврол. и психиатр.-2003.- №9.- С. 3-5.

36. Гусев Е.И. Сосудистые заболевания головного мозга/ Е.И. Гусев, Г.С. Бурд, Н.Н. Боголепов. М.: Медицина, 1979.- 142 с.

37. Данилов С.Н. Биологически активные соединения / С.Н. Данилов. -СПб.: Наука, 1965.-306 с.

38. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 3. 605 с.

39. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. -Т. 2.-515 с.

40. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, К. Джонс; под ред. Р. Досона. М.: Мир, 1991. - 434 с.

41. Досон Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот. М: Мир, 1991.-462 с.

42. Друзья или враги Активные формы кислорода и азота / Д.Б. Зоров и др. // Биохимия. 2005. - Т. 70, №. 2. - G. 265-272.

43. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е.Е. Дубинина // Успехи современной биологии. 19891 —Т.108, №1. — С.3-12;;:

44. Жеребцов Н:А. Биохимия / II.A. Жеребцов; Т.Н. Попова, В!1Г. Артюхов; -Воронеж:: Изд-во Воронеж, ун-та, 2002.— 696 с.

45. Зозуля Ю.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю.А. Зозуля, В*А^ Боровой^

46. Д;А. Сутковой // М.: Знание-М, 2000. G. 344.5 8.Иванов К.П. Энергетические потребности и кислородное обеспечение головного мозга / К.П:,Иванов; Ю.Я; Кисляков. СПб.: Наука, 1979.-214 с.

47. Киреев М.М. Нуклеотидный фонд головного, мозга крыс в восстановительном периоде после реанимации/ М.М. Киреев, В.Д. Конвой, В.Г. Корпачев //Вопр. мед. химии.- 1990.- №2.- С.158-162.

48. Кнорре Д.Г. Биологическая химия / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. М.: Высш. шк., 1998. - 478 с.

49. Коган А.Х. Свободнорадикальные перекисные механизмы патогенеза ишемии и их фармакологическая регуляция / А.Х. Коган, А.Н. Кудрин// Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1992. - № 2. - С. 5-15.

50. Козлов Ю.Г1. Свободные радикалы и их роль в нормальных и патологических процессах / Ю.П. Козлов// М.: Наука, 1973. С. 174.

51. Коррекция последствий постишемического реперфузного повреждения головного мозга / Н.С. Сапронов и др.. Бюл. Эксперим. Биол. И мед. 2000. - Т. 129, №18. - С. 17-19

52. Косицкий Г.И. Физиология человека / Г.И. Косицкий и> др.: — М:: Медицина, 1985. 544 с.

53. Костюк П.Г. Частная физиология нервной системы / Ф.Н. Серков,

54. Ю.П. Лиманский; под ред. П.К. Костюка. СПб.: Наука, 1983.-733 с.134

55. Коттрелл Б. Дж. Защита мозга // Анестезиол. и реаниматология.-1996,-№2.- С.81-85.

56. Кретович B.JI. Биологическая химия / B.JI. Кретович. М.: Серия Биологическая химия, 1971. — 235 с.

57. Крыжановский Г.Н. Общая патофизиология нервной системы. Руководство / Г.Н. Крыжановский. М.: Медицина, 1997. - 256 с.

58. Крыльский Д.В. Новые гетероциклические системы на основе производных гуанидина и его структурных аналогов: автореф. дис. . д-ра хим. наук / Д.В. Крыльскиш — Воронеж, 2006. — 40 с.

59. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи современной биологии*. -1990. № 114. - С.20-33.;

60. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. М.: Наука, 1978.-248 с.

61. Кухтевич И.И. Ишемический инсульт// М.: Медицина, 2006,- 170 с.

62. Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н. Липиды. // К., Высшая школа.- Киев, 1985. —247 с.

63. Лазебник-Л.Б., Дроздова* С.Л. Коррекция магниевого дефицита при сердечно-сосудистой патологии //Кардиология.- 1997.- №5.- С.103-104.

64. Ланкин В.З. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra / В.З. Ланкин // Кардиология. 2004. - №2. - С. 72-81.

65. Левитан Б.Н. Способ лечения острых отравлений / Б.Н. Левитан, H.H. Евлашева, А.Э. Васильев: Пат. РФ 2144817. 2000, Кл. А61К9/107, А61К31/02, А61Р7/00.

66. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер; перевод с англ. A.A. Баева; под ред. Я.М. Варшавского. М.: Мир, 1976. - 957 с.

67. Ленйнджер'А. Основы биохимии: В 3-х т. Т.2. — М., Мир, 1985. -368 с.

68. Лифшиц В.М. Биохимические анализы в клинике / В.М. Лифшиц, В.И; Сидельникова. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, >1995. - 221 с.91 .Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд,, У. Ледерман;.-Mi:.Финансы и статистика; 19901-С. 493-513:

69. Лукьянова Л:Д. Кислород зависимые процессы в клетках и: их функциональное состояние / Л. Д. Лукьянова,Б.С. Балмуханов, А.Т. Уголев. М;: Наука,. 1982. - 301 с.

70. Лукьянчук В.Д. Фармакология средств; . регулирующих прооксидантно-антиоксидантное состояние организма/ В. Д. Лукьянчук, E.À: Лысенко;; Л:В'1 Савченкова, Е.Ю: Бибик // Под ред. проф: В'Д.Лукьянчука.- Луганск, 1999:- 40-с.

71. Лурия А.Р: Мозг человека и психические процессы /А. Р; Лурия. -. М;: Педагогика,. 1970. -495 с. .

72. Львова Л.В. Преемственность // Журнал Провизор.- 2005.- № 4.- С. 33-41. '' ■ / ■ ,

73. Максименко А.В. Модифицированные препараты супероксид-дисмутазы- и каталазы для защиты сердечно-сосудистой системы и легких / А.В. Максименко // Успехи современной биологии. 1993. — Т.113,№3.-С. 251-363.

74. Матасова Л.В. Аконитаза млекопитающих при окислительном стрессе / Л.В. Матасова, Т.Н. Попова // Биохимия. 2008. - Т. 73,-вып. 9. - С. 1189-1198.

75. Матюшин Б.Н. Определение супероксиддисмутазной активности в материале пункционной биопсии печени при ее хроническом поражении / Б.Н. Матюшин, A.C. Логинов, В.Д. Ткачев // Лабораторное дело. 199 Г. - № 7. - С. 16-19.

76. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский // Новосибирск: Наука, 1981. С. 168.

77. Мелик-Адамян В.Р. Пространственная структура белков / В.Р. Мелик-Адамян// Природа. 1997. №7. - С. 61-69.

78. Меныцикова, Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты./ Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков М.: Фирма «Слово», 2006.- 556 с.

79. Метелица Д. Н. Активация кислорода ферментными системами / Д: И. Метелица. М.: Наука, 1982. - 255 с.

80. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): учеб. пособие / под ред. М.И. Прохоровой. -Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. 272 с.

81. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова, С.Е. Северин. М.: Мир, 1979. - 430 с.

82. Мосс Д. Ферменты / Д. Мосс: перевод с англ. H.A. Райской. -М.: Мир, 1970.-128 с.

83. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов, / Я. Мусил. -М.: Медицина, 1985. 314 с.

84. Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, A.A. Кишкун. — М.: Медицина, 2000 540 с.

85. Нейланд О.Я. Органическая химия / О.Я. Нейланд. М.: Высшая школа, 1990. — 751 с.

86. Нечипуренко Н.И. Роль оксида азота, при ишемии: головного мозга / Н.И. Нечипуренко // Медицинские новости. 2004. - № 1. -С. 7-10. ; '

87. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме/ А.Н. Осипов, IO.A. Азизова, Ю:А. Владимиров //Успехи биол. хим. — 1990. — Т. 31, №2.-С. 180-208.

88. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л;А. Остерман. М: Наука, 1985. - 536 с.

89. Пентюк A.A. Активности глутатионзависимых ферментов, каталазы и СОД в печени и сердце крыс с дефицитом витамина //Биохимия.- 1987.- №6.- С. 1009.

90. Петров A.A. Органическая химия / A.A. Петров, А.Т. Трощенко; под ред. Стадничука М.Д. СПб.: Иван Федоров, 2002. -624 с

91. Петрович Ю.А. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса./ Ю.А Петрович, Д.В. Гуткин // Пат. физиол. и эксп. терапия. 1986. - №5 - С 85-92.

92. Петрусевич Ю.М. Свободнорадикальное окисление липидов в норме и при патологии / Ю.М. Петрусевич. М.: Наука, 1976. - 200 с.

93. Пидэмский E.JI. Биологическое действие продуктов органического синтеза и природных соединений / E.JI. Пидэмский.- Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 1978. 149 с.

94. Плотников М.Б. Антиокислительные эффекты антигипоксантов- при ишемии мозга./ М.Б. Плотников, Е.А Кобзева, Т М Плотникова / Бюл эксперим. биол. и мед. 1992. - Т. 113.- №5. -С 504-506.

95. Покровский В.И. Популярная медицинская энциклопедия / В.И. Покровский. М.: Советская энциклопедия, 1992. - 688 с.

96. Попов В.Н. Ферменты: общая характеристика и роль в метаболических процессах: учеб. пособие / В.Н. Попов, М.И.ч

97. Фалалеева, А.Т. Епринцев. — Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2006. -39 с.

98. Прайер У. Свободные радикалы в биологии: в 2-х т. / У. Прайер. М.: Мир, 1979.-Т. 1.-311 165 с.

99. Проблемы анализа эндогенных продуктов ПОЛ / Под ред. A.A. Болдырева // Итоги науки и техники.- Серия Биофизика.-Т.18. М.: ВИНИТИ, 1986.-134 с.

100. Процессы перекисного окисления липидов в плазме крови и , эритроцитах больных с острыми нарушениями мозговогокровообращения / A.M. Белоус, А.И. Мохамед, В.А. Яворская// Журн. АМН УкраТни.- 1997.- №3,- С.448-457.

101. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии / Л.М. Пустовалова- Ростов-на Дону: Феникс, 1999. 540 с.

102. Р. Эльдерфилд Гетероциклические соединения (пер. с англ.), М., 1953

103. Рапопорт С. Медицинская биохимия / С. Рапопорт; перевод с нем. Н.К. Свиридова и др.; под ред. И.Б. Фридлянда.- М.: Медицина, 1966. 892 с.

104. Регуляция NAD-зависимой изоцитратдегидрогеназы у цитрат— продуцирующих дрожжей / И.Г. Моргунов, Н.Ю. Солодовников, A.A. Шарышев и др. // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 12. - С. 17061714.

105. Роль фактора некроза опухоли альфа и активация сфингомиелинового цикла в индукции апоптоза в условиях ишемии-реперфузии печени / A.B. Алесенко и др. // Биохимия. 2002. - Т. 67,№12.-С. 1632-1642.

106. Румянцева С.А. Комплексная антиоксидантная терапия реамбирином у больных с критическими состоянияминеврологического генеза / С.А. Румянцева // Международный медицинский журнал. 2002. - № 2. - С. 129-137.

107. Рябов Г.А. Гипоксия, критических состояний / Г. А. Рябов. -М.: Медицина, 1988. 275 с

108. Садым A.B. Интернет-система прогноза спектра биологической активности химических соединений/А.В. Садым, А. А.Лагунин, Д. А. Филимонов и др. //Химико-фармацевтический журнал.- 2002.- Т. 36.- № 10.- С. 21-26.

109. Сайке П. Механизмы реакций в органической химии / под ред. H.H. Суворова. М.: Химия, 1977. - 319 с.

110. Самойлов М.О. Реакция нейронов мозга на гипоксию / М.О. Самойлов //Л.: Наука, 1985. С. 185.

111. Северин С.Е. Молекулярные основы действия ферментов / С.Е. Северин, Г.А. Кочетов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. - 188 с.

112. Северин С.Е. Биохимия липидов и их роль в обмене веществ / С.Е. Северин. -М.: Наука, 1981. 168 с.

113. Северин С.Е. Функциональная активность ферментов и пути её регуляции / С.Е. Северин, Г.А. Кочетов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1981 - 208 с.

114. Скворцова В.И. Механизмы повреждающего действия церебральной ишемии и новые терапевтические стратеги / В.И.

115. Скворцова // Журнал неврологи и психиатрии.- 2003.- №9.- С.20-22.141

116. Скулачев В. П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения «мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы / В.П. Скулачев // Биохимия. — 2007. — Т. 72, №. 12. — С. 1700-1714.

117. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот. Современные методы в биохимии под ред. ОреховичаВ.Н. MI: Медицина, 1977.- 164 с.

118. Струков А.И. Патологическая анатомия: учеб. пособие / А.И. Струков. -М.: Медицина, 197L. 599 с.

119. Стуке И:Ю. Магний и кардиоваскулярная- патология '// Кардиология.-1996.- №4.- С.74-76.

120. Терапия некоторых старческих патологий, опосредованных АФК (сердечной аритмии, инфаркта миокарда, ишемии почки и инсульта головного мозга) / JI.E. Бакеева // Биохимия. 2008. - Т. 73,№12.-С. 1607-1621.

121. Тимочко М.Ф. Свободнорадикальные реакции и их метаболическая роль / М.Ф. Тимочко, Л.И. Кобильська // Мед. химия. 1999. - Т. 1, № 1. - С. 19-23.

122. Третьяков Ю.Д. Химия: справочные материалы / Ю.Д. Третьяков, В.И. Дайнеко; под ред. Ю.Д. Третьякова. М.: Просвещение, 1984. — 239 с.

123. Уайт А. Основы биохимии: в 3 томах./ А. Уайт, Ф. Хендлер, Э. Смит, Р. Хилл, И Леман //Т.2. — М., Мир, 1981. — 617 с.

124. Уголовный кодекс. Статья 245 УК РФ. Жестокое обращение с животными

125. Федин А.И. Современная концепция патогенеза и лечения острой ишемии мозга // Consilium-medicum.- 2000.- Т. 2, № 12.- С. 612.

126. Федин А.И. Современная концепция патогенеза и лечения острой ишемии мозга / А.И. Федин // Материалы науч-практ конф «Лечение ишемии мозга». 2001.- С. 5-23.

127. Федорова Н.Ю. Состояние системы глутатионпероксидазы-глутатионредуктазы в стимулированном к регенерации органе и ее роль в клеточной пролиферации : дисс. канд. биол. наук.- Воронеж, 1999,- С. 44-45.

128. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фёршт; перевод с англ. Ю.Б. Гребенщикова; под ред. Б.И. Курганова. М.: Мир, 1980.-433 с.

129. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович. М.: Высш. шк, 1993. - 350 с.

130. Халганг Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш; перевод с словацк. С.С. Элотского. — М.: Мир, 1991. — 204 с.

131. Хлуновский А.Н. Концепция болезни поврежденного мозга / А.Н. Хлуновский, A.A. Старченко; под ред. В.А. Хилько. СПб.: Изд-во Лань, 1999. - 256 с.

132. Хрипкова А.Г. Анатомия, физиология и гигиена человека / А.Г. Хрипкова. М.: Просвещение, 1975. - 400 с.

133. Ченас Н.К. Соотношение между глутатионредуктазной и диафоразной активностью глутатионредуктазы из Sarchamyces cerevisiae / H.K. Ченас, P.K. Ракаускенс, Ю.Ю. Кулис // Биохимия. — 1989.-Т. 54, №7.- С. 1090-1097

134. Чернов H.H. Латентная форма глутатионредуктазы в печени крыс / H.H. Чернов // Биохимия. 1986. - Т. 51, № 5. - С. 762-769.

135. Чеснокова Н.П. Общая характеристика источников образования свободных радикалов и антиоксидантных систем / Н.П. Чеснокова, Е.В'. Понукалина, М.Н. Бизенкова //Успехи современного естествознания.- 2006. № 7 - С. 37-41.

136. Шамрай Е.Ф. Клиническая биохимия / Е.Ф. Шамрай, А.Е. Пащенко. М.: Медицина, 1970. - 336 с.

137. Шмидт Е.В. Сосудистые заболевания головного и спинного мозга/ Е. В. Шмидт, Д.К. Лунев, Н.В. Верещагин //. М.-: Медицина, 1976.-283 с.

138. Щербань А.И. Органическая химия / А.И. Щербань. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та.,1998. 360 с.

139. Элконин Б.Л. Неотложная диагностика и терапия / Б.Л. Элконин, В.И.' Бородулин, А.Г. Киссин. СПб.: Медицина, 1987. -318 с.

140. Akaike N. Distribution of different types of calcium channels in the brain structures //Neurophysiology.- 1997.- V.29, №4-5.- P.297-306.

141. Behmanesh S. Mechanisme of endothelial cell swelling from lactacidosis studied in vitro/ S. Behmanesh, O. Kempski // Amer. J. Physiol.- 2000. V. 279, № 4.- P. 1512-1517.

142. Benzopyranyl guanidine derivatives, process for preparation thereof, and pharmaceutical compositions containing them: pat. 6,323,238 US; № 09/693,082; filed 20.10.00; published 27.11.01. USPTO Patent Full-Text and Image Database.

143. Chang L.Y. Molecular, immunocytochemistry of the CuZn superoxide dismutase in rat hepatocytes / L.Y. Chang et al. // J. Cell Biol. 1988. - V. 107. - P. 2169-2179.

144. Comparative spectral analysis of mammalian, fungal; and Bacterial-catalases: Resonance Ramam evidence for iron-tyrosinate coordination / D. S. Kamala et al. // J. Biol. chem. 1989. - V.26, №22. - P. 1277212779.

145. Davidoff. F. The effects of guanidine derivatives on mitochondrial function. II. Reversal of guanidine-derivative inhibition by long chain free fatty acids / F. Davidoff// Clin. Invest. 1968. - № 47. - P. 234.

146. Diagnostic evaluation of carbon tetrachloride-induced rat hepatic cirrhosis model / G.P. Lee et al. // Anticancer Res.- 2005. V. 25, №2A. -P. 1029-1038.

147. Didion S.P. Increased superoxide and vascular dysfunction in CuZnSOD-deficient mice / S.P. Didion // Circ Res. 2002. - V. 91. - P. 938-944.

148. Effect of oral dosing vehicles on the subchronic hepatotoxity of carbon*tetrachloride in the rat / K.P. Koporec et al. // J. Toxicol. Environ. Health.- 1995. V. 44, №. 1. P. 13-27.

149. Fridovichi I- Superoxide anion radical (02*); superoxide: dismutases, and related-matters / I. Fridovich // The Journal of Biological Chemistry. 2001".- V. 272, №30. - P. 18515-1851.7.

150. Hammerman G. Ischemia and reperfusion injury. The ultimate pathophysiologic paradox / C. Hammerman, M: Kaplan // Clin; Perinatol. 1998: - V. 25, №,3: - P. 757-777.

151. Ikeda T. New polymeric biocodes: synthesis and antimicrobial activities ofi polycations with; pendant biguanide groups. / T. Ikeda; H-Yamaguchi; S. Tazuke // Antimicrob; Agents Chemother. 1984. - № 8;-P. 139-144.

152. Increased superoxide and vascular dysfunction in CuZnSOD-deficient mice / S.P. Didion et al. // Circ Res. 2002. - V. 91. - P. 938944.;

153. Induction of antioxidant gene expression in, a mouse model of ischemic cardiomyopathy is dependent on reactive oxygen species / S. Sharma et al. // Free Radic. Biol. Med.- 2006.- V. 40.- P. 2223-2231'.

154. Intraluminal increase of superoxide anion follow transient focal cerebral ischemia in rats / T. Mori, T. Asano,' T. Matsui, H. Muramatsu // Brain Res.- 1999.- V.8, №2.- P. 350-357.

155. Intracellular ATF, a switch in the decision between apoptosis and necrosis / P. Nicotera, M. Liest, E. Ferrando-May // Toxicol. Lett.- 1998.-V.103, № 12.-P.139-142.

156. Ischemia induces metallothion III expression neurons of rat brain / S. Yanagitani, H. Miyazaki, Y. Nakahashi // J.Life Sci. Article.- 1999.-V.64, №8.- P.707-715.

157. Kamala D. S. Comparative spectral analysis of mammalian, fungal, and Bacterial catalases: Resonance Raman, evidence for iron-tyrosinate coordination / D. S. Kamala et al. // J: Biol. chem. 1989. - V.264, №22.-P. 12772-12779.

158. Kondo T. Reduction of CuZn-superoxide dismutase activity exacerbates neuronal cell injury and edema formation after transient focal cerebral ischemia / T. Kondo et. al. // J. Neurosci. 1997. - V. 17. - P. 4180—4189.

159. Kowaltowski A.J. Mitochondrial damage induced1 by conditions of oxidative stress / A,J. Kowaltowski, A.E. Vercesi // Free Radical Biology & Medicine. 1999. - V. 26. - P. 463-471.

160. Krinsky N.L. Membrane antioxidants // Ann; NY. Acad. Sci., 1988. — 551. —P. 17-33.

161. Lactat and pyruvate changes in the cerebral gray and white mather during posthypoic seizures in new born pigs / M. Thoresen, A. Hallstrom, A. Whitelow //Pediatr. Res.- 1998.-V.44, №5.-P.746-754.

162. Lascola C, Primer of Cerebrovascular. Diseases/ C Lascola, K.Welch, D Caplan // San-Diego: Academic Press. -1997.- P. 114-117.

163. Marklund S.L. Extracellular superoxide dismutase and other superoxide dismutase isoenzymes in tissues from nine mammalian species / S.L. Marklund*// Biochem. J. 1984. - V. 222. - P. 649-655.

164. Membrane and' receptor modifications of oxidative stress vulnerbility in aging / J.A. Joseph; N: Denisova, D. Fisher // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1998.- V.858; №20.- P.268-276.

165. Mercaptoethylguanidine and guanidine inhibitors of nitric-oxide synthase react with peroxynitrite and protect against peroxynitrite-induced oxidative damage / C. Szabo et al. // J. Biol. Chem.- 1997.- V. 272, №14.- P. 9030-9036

166. Mice overexpressing extracellular superoxide dismutase have increased resistance to focal- cerebral* ischemia / Sheng H., Bart R.D., Oury T.D., Pearlstein R.D.//Neuroscience.- 1999.- V.88, №1.- P.185-191.

167. Micromethods in single muscle fibus. Determinatione of grand glutathione reductase / R. Aushin et al. // Anal. Biochem. 1988. - V. 174, №2.-P. 575-579:

168. Molecular immunocytochemistry of the CuZn superoxide dismutase in rat hepatocytes / L.Y. Chang et al. // J. Cell Biol. 1988. - V. 107. -P. 2169-2179.

169. Molis T.M. Modulation of estrogen receptor mRNA expression» bymelatonin in MCF-7 human breast cancer cells/ T.M. Molis, L.L Spriggs.

170. S.M. Hill // Mol. Endocrinol.- 1994.- V. 8.- P. 1681-1690.148

171. Parker L. Free radicals in the brain. Springer. / L. Parker //Berlin, 1992. —P.380.

172. Pearce W.J. Mechanisms of hypoxic cerebral vasodilatation // Pharmacol. Ther.- 1995:- V.65, № 1.- P.9-12.

173. Plastidial glutathione reductase from Haynaldia villosa is an enhancer of powdery mildew resistance in wheat (Triticum aestivum) / Ya-Ping Chen et al. // Plant Cell Physiol. V. 48, № 12. - 2007. - P. 1702-1712.

174. Processing of Gene Expression Data Generated by Quantitative Real-Time RT-PCR / P. Y. Muller at al. // BioTechniques. 2002. - V. 32, №6. - P.354-360.

175. Processing of Gene Expression Data Generated by Quantitative RealTime RT-PCR / P. Y. Muller at al. // BioTechniques. 2002. V. 32, №6. —P.354-360.

176. Rafalowska U. The effect of aspartate on citrate metabolism in the cytosolic fraction of brain under conditions of normoxia, hypoxia and anesthesia / U. Rafalowska, M. Erecinska, B. Chance // J. Neurochem. -1975. V.25, №4. -P.497-501.

177. Reduction of CuZn-superoxide dismutase activity exacerbates neuronal cell injury and edema formation after transient' focal cerebral ischemia / T. Kondo et. al. / J. Neurosci. 1997. - V. 17. - P. 41804189.

178. Robin J. Mockett overexpression of glutathione reductase extends survival in transgenic Drosophila melanogaster under hyperoxia but notnormoxia / J.R. Mockett,S.S. Rajindar, C.O. William // The FASEB J. -1999.-V. 13. P. 1733-1742.

179. Sameshima H., Ota A., Kenous T. Pretreatment with-magnesium sulfate protects against hypoxic ischemia brain injury but postatreatment worsens brain damage-in seven-day-old, rat // Am. J. Obstet. Gynecol.-1999.- V.180, №3.- P.725-730.

180. Seymen O: The effect of iron supplementation on GSH levels, GSH-Px, and SOD1 activities of erythrocytes in L-thyroxine.administration / O. Seymen, A. Seven, G. Candan // Acta Med Okayama. -1997. -V. 51, №3; P. 129-133:

181. Sheng'H., Mice overexpressing extracellular superoxide-dismutase have increased resistance to focal, cerebral' ischemia Pearlstein R:D. / H. Sheng, R.D. Bart, T.D. Oury // Neuroscience. 1999: - V.88; № 1>. - P: 185-191.

182. Skulachev V.P. Mitochondrial physiology and pathology; concept of;programmed" death of organelles, cells and organisms / V.P. Skulachev II Mol. Aspects.of Medicine. 1999: - № 20: - P: 139-184

183. Stelmaszynska T. Possible involvement of, mieloperoxidese in lipid peroxidation' / T. Stelmaszynska, . E. Kukovetz, G. Egger // Int. J. Biochem. 1992. - V.24, №K -P.121-128.

184. Stocker R. Endogenous antioxidant defences- in" human blood plasma:. In: Sies H". ed. Oxidative stress:* oxidants and. antioxidants./ R.Stocker, B. Frei // London: Academic Press. — 19911- V.7 — P.213-243.

Информация о работе

Суховеева, Ольга Вадимовна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Свободнорадикальный гомеостаз в условиях ишемии-реперфузии головного мозга крыс при воздействии гуанидиновых производных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Свободнорадикальный гомеостаз в условиях ишемии-реперфузии головного мозга крыс при воздействии гуанидиновых производных - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы