Влияние гипотермии и даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при ишемии

Мохаммед Мустафа Таха

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние гипотермии и даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при ишемии
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипотермии и даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при ишемии"

005001728

МОХАММЕД МУСТАФА ТАХА

ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ И ДАЛАРГИНА НА АКТИВНОСТЬ N8, К-АТФазы И АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ СИНАПТИЧЕСКИХ МЕМБРАН МОЗГА КРЫС ПРИ ИШЕМИИ

03.01.04 - биохимия

1 О НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2011

005001728

Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет»

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Кличханов Нисред Кадирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Конторщикова Клавдия Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Перетягин Сергей Петрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»

Защита диссертации состоится «J2^/» HdSfflPsffl 2011г. в /£ ч. на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. E-mail: kfs@bio.unn.ru. факс: (831) 4652303

Автореферат разослан « #» //) 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

С. В. Копылова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема ишемических поражений головного мозга является одной из наиболее актуальных в современной неврологии. Ее медико-социальная значимость определяется большим весом сосудистых заболеваний головного мозга в структуре заболеваемости и смертности населения, а также высокими показателями временной нетрудоспособности и первичной инвалидности (Верещагин, Суслина, 2003, Гусев и др., 2007). В связи с этим изучение патогенеза и способов коррекции ишемического поражения головного мозга представляется важным как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Нарушения кровоснабжения головного мозга инициируют каскад биохимических реакций, лежащих в основе тканевого повреждения. Основные механизмы нейрональных повреждений включают истощение энергетических ресурсов в условиях ацидоза ткани мозга, нарушение ионного гомеостаза, избыточное накопление возбуждающих аминокислот, обладающих нейротоксиче-ским действием, и возрастание активных форм кислорода (АФК), индуцирующих развитие окислительного стресса (Гусев, Скворцова, 2002; Fiskum et al., 2004; Szydlowska, Tymianski, 2010). Образующиеся при этом АФК способствуют окислительной модификации не только мембранных липидов, но и цито-зольных и мембранных белков нервных клеток. Высокой чувствительностью к АФК обладают такие важнейшие ферменты синаптических мембран как Na, К-АТФаза и ацетилхолинэстераза (АХЭ). Ишемия мозга приводит к снижению активности Na, К-АТФазы (Dobrota et al., 1999), в результате чего нарушается транспорт ионов, развивается деполяризация мембраны, нейроны утрачивают свою важнейшую функцию - электрическую проводимость. Вместе с тем не совсем ясно как изменяется активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом в динамике неполной глобальной ишемии и в ближайшем постишемическом периоде.

АХЭ является одним из основных компонентов холинергической системы мозга. Фермент в нейронах головного мозга расположена на внешней поверхности постсинаптической мембраны холинергических синапсов, где регулирует временной профиль концентрации медиатора ацетилхолина в синаптической щели (Zimmerman, Soreq, 2006). Установлено, что повреждение нейронов, связанное с ишемией, сопровождается изменениями в холинергической системе (Kataoka et al., 1991). Однако нет единого мнения относительно того, как влияет ишемия на активность АХЭ в мозге (Saez-Valero et al., 2003; Hu et al., 2009).

рецепторы и проникает через гематоэнцефалический барьер только при его использовании в дозах не менее 0,5 мг/кг (Полонский и др., 1987; Лишманов, Маслов, 1994). В экспериментах на животных (Маслов и др., 2002) и в клинических условиях (Казанцев и др., 2000) даларгин оказывал противоишемическое действие, но механизмы такого действия пептида не изучены.

Известно, что устойчивость мозга к дефициту кровоснабжения может повышаться при снижении температуры тела (Liu, Yenari, 2007; Yenari et al., 2008; van der Worp et al., 2010). Особенно эффективным является мягкая гипотермия. Механизмы протекторного действия гипотермии весьма разнообразны. Они сопряжены с уменьшением эксайтотоксичности глутамата, ограничением кальциевой перегрузки клеток в очаге ишемии. В связи с этим представляет интерес исследование влияния мягкой гипотермии на активность мембранных ферментов и интенсивность свободнорадикальных процессов в синаптосомах.

Цель работы. Целью данной диссертационной работы является изучение активности мембранных ферментов и свободнорадикальных процессов в синаптосомах при ишемии/реперфузии головного мозга крыс до и после коррекции нарушений даларгином и гипотермией.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить активность Na, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при окклюзии сонных артерий разной длительности и реперфузии.

2. Изучить влияние даларгина и гипотермии на активность Na, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии.

3. Исследовать интенсивность окислительной модификации липидов и белков мембран синаптосом при ишемическом поражении головного мозга.

4. Исследовать защитный эффект даларгина и гипотермии в отношении свободнорадикального окисления липидов и белков мембран синаптосом при ишемии.

5. Изучить влияние ишемии головного мозга на состояние антиоксидант-ной системы защиты синаптосом (восстановленного глутатиона, активности СОД и каталазы).

6. Исследовать защитное действие даларгина и гипотермии в отношении антиоксидантной системы (восстановленного глутатиона, активности СОД и каталазы) синаптосом мозга при ишемии у крыс.

Положения, выносимые на защиту

1. Двусторонняя окклюзия сонных артерий приводит к повреждению мембран синаптосом из коры головного мозга крыс, ингибируя важнейшие ферменты мембран синаптосом - Na, К-АТФазу и АХЭ, увеличивая окислительную модификацию мембранных липидов и белков, подавляя активность антиоксидантной защиты синаптосом.

кации мембранных липидов и белков синаптосом, повышением активности ан-тиоксидантной защиты, но и защитой мембранных ферментов N3, К-АТФазы и АХЭ от ингибирования.

3. Мягкая гипотермия уменьшает выраженность повреждения мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии/реперфузии, но существенно подавляет антиоксидантную защиту.

Научная новизна исследования. Установлено, что активность Ка, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом из коры головного мозга при неполной глобальной ишемии снижается, а в период реперфузии возрастает. Впервые показано, что снижение активности N8, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом усиливается при увеличении длительности нарушения мозгового кровообращения. Впервые установлено, что даларгин снижает повреждающее влияние двусторонней окклюзии сонных артерий на синаптические окончания нейронов мозга путем активации антиоксидантной системы защиты, в результате чего происходит уменьшение накопления продуктов переокисления липидов и белков, т.е. нарушение клеточных мембран, что, в свою очередь положительно отражается на активность N3, К-АТФазы и АХЭ мембран. Получены конкретные значения доз даларгина, проявляющих и не проявляющих выявленные эффекты.

Впервые установлено, что мягкая гипотермия защищает Ж, К-АТФазу и АХЭ мембран синаптосом от ингибирования при ишемии и одновременно подавляет активность антиоксидантной защиты синаптосом.

В результате экспериментальных исследований сформулированы представления о патогенетической значимости окислительного стресса в повреждении синаптических мембран и обосновано применение даларгина и гипотермии в качестве нейропротекторов при ишемическом повреждении мозга.

Теоретическая значимость работы. Полученные в работе результаты доказывают участие окислительного стресса в развитии ответа ткани мозга на нарушения мозгового кровообращения, что является существенным вкладом в понимании патогенеза ишемических повреждений головного мозга. Проведенные исследования указывают на то, что окислительные повреждения мембран синаптосом начинаются уже на ранних этапах окклюзии сонных артерий и постепенно усиливаются по мере развития тяжести ишемии.

Полученные данные расширяют представления о роли энкефалинов в регуляции устойчивости мозга к ишемии. Результаты проведенного исследования доказывают эффективность использования даларгина в комплексной терапии острых нарушений мозгового кровообращения.

Практическая значимость работы. Ишемия мозга и ее последствие -ишемический инсульт являются тяжелейшими формами сосудистых поражений мозга, занимающая одно из первых мест в структуре общей смертности населения и являющаяся лидирующей причиной инвалидизации. В связи с этим поиск способов коррекции ишемии представляется важным для фундаментальной и практической медицины. Гипотермия является одним из потенциальных терапевтических подходов к защите мозга в клинической неврологии у больных с инсультом и травмами мозга. Понимание механизмов этого феномена может

дать основу для создания фармакологических препаратов, предназначенных для предупреждения последствий ишемического поражения мозга.

Внедрение результатов работы в практику. Основные результаты работы внедрены в учебный процесс в виде методических разработок для проведения практических и семинарских занятий на кафедре биохимии и биофизики Дагестанского государственного университета и включены в спецкурс «Сво-боднорадикальные процессы в биологических системах».

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на Международной научной конференции «Молекулярные механизмы адаптации» (г. Махачкала, 2008), II Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2008), 12-й, 13-й, 14-й Международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2008, 2009, 2010), II, III и IV Всероссийских научно-практических конференциях «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов» (г. Томск, 2009, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптаций растений и животных» (г. Махачкала, 2010). 7 Междунар. междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Работа содержит 6 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 248 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 126 белых крысах-самцах Вистар, массой 200-230 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. В эксперименте воспроизводились неполная ишемия головного мозга и механизм его реперфузионного повреждения. Ишемия головного мозга осуществлялась полной перевязкой обеих сонных артерий в течение 30, 60, 90 мин. Для создания реперфузионной модели ишемического повреждения у части животных после 60 минутной окклюзии двух сонных артерий моделировали реперфузию путем снятия лигатуры. Продолжительность реперфузии составила 60 и 90 мин. В качестве контроля использовали ложнооперированые животные. Все хирургические процедуры проводили под наркозом (внутрибрюшное введение тиопентала натрия в дозе 40-50 мг/кг). В период ишемии и реперфузии температура тела животного поддерживали на нормальном уровне (37°С). За 30 мин до декапитации (контроль) или за 30 мин до начала ишемии крысам внутрибрюшинно вводили 0,5 мл фармакопейного препарата даларгина (НПО «Микроген») в дозе 0,1 или 0,5 мг/кг массы. Интактным животным вводили такой же объём физиологического раствора. Дозы и сроки инъекции даларгина выбраны на основе анализа данных литературы по проявлению целого ряда биохимических и физиологиче-

скнх эффектов пептида (Лишманов, Маслов, 1994). В части опытов непосредственно перед окклюзией сонных артерий температура тела животного снижали до 33-34°С. Гипотермию вызывали, обкладывая тело животного целлофановым пакетом с мелкоколотым льдом. Температуру тела измеряли ректальным цифровым термометром MS6501.

Из коры головного мозга синаптосомы выделяли методом низкоскоростного центрифугирования (Hajos, 1975), с использованием центрифуги MR23i (Германия), а мембраны синаптосом - после гипоосмотического шока (Захарова, Аврова, 1998). Все процедуры проводили при 2-4°С.

Активность Na, К-АТФазы в мембранах синаптосом определили по скорости накопления в среде инкубации неорганического фосфора (Рожанец и д^, 1978) в ходе гидролиза АТФ и рассчитывали как разность между общей и Mg зависимой АТФазной активностью. Среда для определения общей АТФазы содержала следующие компоненты (в ммоль/л): NaCl - 130, KCl - 20, MgCb - 3, АТФ - 3, трис-HCl буфер (pH 7,4) - 30 и 50 мкг белка. При определении активности Mg2+-AT®a3u в среду инкубации кроме указанных компонентов вносили еще ингибитор Na, К-АТФазы уабаин в конечной концентрации 1-мМ. Активность АХЭ мембран синаптосом определяли по методу Элмана (Ellman et al., 1961), используя в качестве субстрата ацетилтиохолин (0,5 ммоль).

О свободнорадикапьных процессах (СРП) в синаптосомах мозга судили по интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), окислительной модификации белков, содержании восстановленного глутатиона, активности ключевых антиокислительных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. При этом в суспензии синаптосом определяли содержание малонового диальде-гида (МДА) (Лысакова и др., 1997), карбонильных групп мембранных белков (Venditti et al., 2004), глутатиона (Арутюнян и др., 2000), активность СОД (Fried, 1975) и каталазы (Королюк и др., 1988). Содержание белка определяли по Лоури (Lowry et al., 1951).

Статистическую обработку результатов исследования проводили по t-критерию Стьюдента, используя пакет прикладных программ «Excel» и «Statis-tica» для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние даларгина и гипотермии на активность Na, К-АТФазы синаптосом мозга при ишемии и реперфузии

Проведенные нами исследования показали, что при ишемии активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом снижается (табл. 1). К 30 мин ишемии активность фермента снизилась на 32,1%, к 60 мин - на 45,8%, а к 90 мин - на 53,7% относительно контроля. Таким образом, степень ингибирования фермента зависит от длительности ишемии.

Таблица 1

Активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом коры головного мозга крыс при ишемии и последующей реперфузии (M±m; п = 4-6)

Условия эксперимента Продолжительность ишемии и реперфузии, мин Активность Na, К-АТФазы, мкмоль Рн/мг/ч

Контроль - 35,23±1,28

Ишемия 30 23,93±0,46 Р<0,001

60 19,09±0,73 Р<0,001

90 16,31±1,12 Р<0,001

Реперфузия после 60 мин ишемии 60 27,86±0,62 Р<0,001 Pi<0,001

90 30,53±1,04 Р<0,002 Pi<0,001

Р - достоверное различие относительно контроля; Р, - относительно ишемии 60 мин.

Исследование фермента в постишемическом периоде показало, что снятие лигатуры и восстановление кровоснабжения мозга после 60 мин ишемии приводит к повышению активности К-АТФазы (табл. 1). Через 60 мин реперфузии активность фермента возрастает на 45,9%, а после 90 мин - на 59,9% относительно ишемии. Таким образом, при ишемии/реперфузии происходит обратимое ингибирование N3, К- АТФазы.

Для установления участия опиоидной системы в регуляции активности Ка, К-АТФазы мембран синаптосом при ишемии, животным перед окклюзией сонных артерий вводили даларгин. Выяснилось, что пептид в дозе 0, 1 мг/кг не оказывает влияние на активность Иа, К-АТФазы после 60 мин ишемии (рис. 1). Это означает, что стимуляция только периферических опиоидных рецепторов не влияет на активность К-АТФазы мембран синаптосом при ишемии мозга. Увеличение введенной дозы даларгина до 0, 5 мг/кг способствовало повышению активности фермента при ишемии. При этом активность N8, К-АТФазы после 60 мин ишемии на 25% выше, чем при ишемии без введения пептида. Через 60 и 90 мин реперфузии активность N8, К-АТФазы мембран синаптосом на фоне введения даларгина в дозе 0, 5 мг/кг выше на 8,7% и 11,2% соответственно, чем без введения пептида.

Таким образом, даларгин, в дозе, проникающей в головной мозг, защищает Ыа, К-АТФазу синаптических мембран от повреждения как в период ишемии, так и реперфузии. Следует отметить, что защитный эффект даларгина в отношении К-АТФазы в период ишемии выше, чем в постишемический период.

ж Р-,

А О И

сз'

ГО

га

30 25

< г

И60

Р60

Р90

I контроль Ш ишемия и реперфузия □ даларгин 100 мкг/кг Ш даларгин 500 мкг/кг

Рис. I. Влияние даларгина на активность К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии/реперфузии. К - контроль; И60 -ишемия 60 мин; Р60 и Р90 - реперфузия 60 или 90 мин после ишемии 60 мин. * - р<0,05 относительно К; # - р<0,05 относительно И60; + - р<0,05 относительно Р90.

В последнее время увеличиваются свидетельства того, что использование искусственной гипотермии оказывает нейропротекторный эффект при неврологических повреждениях. В связи с нейропротекторный эффектом легкой и умеренной гипотермии мы в дальнейшем исследовали активность Иа, К-АТФазы мембран синаптосом при ишемии, воспроизведенной на фоне легкой гипотермии. Выяснилось, что снижение температуры тела контрольных (ложноопери-рованных) крыс до 33-34°С приводит к падению активности К-АТФазы на 13,1% относительно контроля (рис. 2). В отличие от контроля гипотермия во время ишемии защищает N8, К-АТФазу от ишемического повреждения. Об этом свидетельствует тот факт, что при ишемии на фоне гипотермии активность фермента существенно выше, чем при ишемии без гипотермии. Так, активность Ка, К-АТФазы относительно контроля при ишемии снижается на 45,8%, а при ишемии на фоне гипотермии - только на 22,4%.

Рис. 2. Влияние гипотермии 33-34°С на активность Ма, К-АТФазы мембран си-наптосом коры головного мозга крыс при ишемии/реперфузии. К - контроль; Г — гипотермия; И - ишемия 60 мин; И+Г — ишемия 60 мин на фоне гипотермии; Р - реперфузия 60 мин после ишемии 60 мин; Р+Г - реперфузия 60 мин после ишемии 60 мин на фоне гипотермии. * - р<0,05 относительно К; # - р<0,05 относительно И.

Следует отметить, что в отличие от периода ишемии, снижение температуры тела только в период реперфузии не приводит к защите N8, К-АТФазы нейронов от ингибирования (рис. 2).

Влияние даларгина и гипотермии на активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом мозга крыс при шемии и реперфузии

Проведенные нами исследования показали, что при ишемии активность АХЭ снижается (табл. 2). Причем степень торможения активности АХЭ зависит от длительности окклюзии сонных артерий. Через 30 мин ишемии активность АХЭ снижается на 20,5%, через 60 мин - на 28,3%, через 90 мин - на 39,7% относительно контроля.

Реперфузия мозга после 60 мин его ишемии сопровождается достоверным повышением активности АХЭ относительно значений в ишемизированном мозге без реперфузии (табл. 2). Активность фермента через 60 мин реперфузии возрастает на 14%, а через 90 мин - на 22,4% по сравнению с его активностью при ишемии. Однако активность АХЭ через 90 мин реперфузии не достигает контрольного уровня.

Таблица 2

Активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом мозга крыс при ишемии и реперфузии (М±т, п=6)

Условия эксперимента Продолжительность ишемии и реперфузии, мин Активность АХЭ, мкмоль/мг/ч

Контроль - 46,68±0,67

Ишемия 30 37,10±0,59 Р< 0,00!

60 33,45±1,20 Р< 0,001

90 28,14±0,86 Р< 0,001

Реперфузия после 60 мин ишемии 60 38,14±0,53 Р< 0,001 Pi<0,05

90 40,95±0,47 Р< 0,001 Р,<0,001

Примечание: Р - достоверные различия относительно контроля, Р! - относительно ишемии 60 мин.

Данные по изучению защитного действия даларгина при ишемии приведены на рис. 3.

Ш контроль Ш ишемия и реперфузия О даларгин \ 00 мкг/кг £3 даларгин 500 мкг/ktj

Рис. 3. Влияние даларгина на активность АХЭ мембран синаптосом головного мозга при ишемии и реперфузии. К - контроль; И60 - ишемия 60 мин; Р60 и Р90 - реперфузия мозга в течение 60 и 90 мин после ишемии 60 мин. * - р<0,05 относительно К; # - р<0,05 относительно И60; + - р<0,05 относительно реперфузии без введения пептида.

Введение даларгина в дозе 0, 1 мг/кг за 30 мин до ишемии не оказало влияние на активность АХЭ мембран синаптосом после 60 мин ишемии как и в случае К-АТФазы (рис. 1). В дозе 0, 5 мг/кг активность фермента после 60 мин ишемии на 9,6% выше, чем при ишемии без введения пептида. В период реперфузии активность АХЭ на фоне даларгина выше по сравнению с реперфу-зией без введения пептида. Рост активности АХЭ при этом составляет через 60 мин реперфузии 8,5%, а через 90 мин реперфузии - 7,8% (р<0.01).

Таким образом, даларгин, в дозе, проникающей в головной мозг, частично защищает АХЭ синаптических мембран от ишемического повреждения.

В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние гипотермии на активность АХЭ синаптических мембран мозга крыс при ишемии и реперфузии (рис. 4). Как видно, мягкая гипотермия существенно не влияет на активность АХЭ у контрольных животных.

Рис. 4. Влияние гипотермии 33-34°С на активность АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при ишемии/реперфузии. К - контроль; И - ишемия 60 мин; Р - реперфузия 60 мин после ишемии 60 мин; * - р<0,05 относительно нормотермического контроля; # - р<0,05 относительно ишемии и реперфузии без гипотермии.

При ишемии на фоне гипотермии активность фермента существенно выше, чем при ишемии без гипотермии (рис. 4). Так, активность АХЭ относительно контроля при ишемии снижается на 28,3%, а при ишемии на фоне гипотермии - только на 18,5%. Таким образом, гипотермия во время ишемии защищает АХЭ от ишемического повреждения. Снижение температуры тела только в период реперфузии также оказывает защитный эффект на фермент. Так, актив-

ность АХЭ после реперфузии снижена на 18,3%, а после реперфузии на фоне гипотермии - на 8% относительно контроля (рис. 4).

Таким образом, снижение температуры тела до 33-34°С в период ишемии или после восстановления кровоснабжения мозга частично предотвращает ин-гибирование АХЭ мембран синаптосом.

Корреляционный анализ показал, что между изменением активности Na, К-АТФазы и АХЭ синаптических мембран при ишемии/реперфузии имеется достоверная в высокой степени положительная связь (г = 1,00; р<0,05). Это означает, что ингибирование исследуемых ферментов при ишемии происходит вследствие воздействия на них одних и тех же факторов. Возможно, что это является следствием их окислительной модификации под действием АФК. В связи с этим в дальнейшем мы исследовали интенсивность СРП в синаптосомах при ишемии/реперфузии.

Влияние даларгина и гипотермии на свободнорадикальные процессы в синаптосомах мозга при ишемии и реперфузии

Интенсивность ПОЛ в суспензии синаптосом оценивали по содержанию МДА. При этом измерено исходное содержание МДА и его накопление в суспензии синаптосом за 15 минут в присутствие системы Ре2+-аскорбат. Первый показатель характеризует стационарное содержание МДА in vivo, а второй показатель зависит как от содержания гидроперекисей липидов (предшественника МДА), так и от доступности двойных связей жирнокислотных остатков липидов свободным радикалам, генерируемым системой Ре2+-аскорбат.

Таблица 3

Содержание МДА и скорость его накопления в присутствии прооксидантов в синаптосомах из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии (М±т; п=4-6)

Состояние животного МДА (нмоль/мг белка)

исходный уровень прирост за 15 мин в присутствии Ре2+-аскорбат

Контроль 3,04 ± 0,09 8,47 ±0,24

Ишемия 60 мин 3,66 ± 0,23 Р< 0,05 10,46 ±0,65 Р< 0,05

Ишемия 60 мин+ реперфузия 60 мин 2,96 ±0,18 Pi<0,05 15,11 ±0,58 Р<0,01 Р[<0,001

Примечание: Р - достоверные различия относительно контроля, Р1 - относительно ишемии 60 мин.

Окклюзия сонных артерий в течение 60 мин приводит к повышению исходного содержания МДА в суспензии синаптосом на 20% относительно контроля (табл. 3). Аскорбат-индуцированный уровень МДА при ишемии также

возрастает на 20% . В период реперфузии исходное содержание МДА в суспензии синаптосом снижается до контрольного уровня. Однако аскорбат-индуцированный уровень МДА при реперфузии возрастает на 78% относительно контроля. Это означает, что в период реперфузии мембранные липиды синаптосом становятся более доступными для радикалов кислорода, генерируемых in vitro. Независимо от интерпретации полученных результатов твёрдо установлено, что при ишемических состояниях в синаптических мембранах происходит существенное изменение содержания интермедиатов СРП в липид-ной матрице.

Помимо липидов АФК участвуют в окислительной модификации белков нейрональных мембран. Белки в силу особенностей своего строения являются одними из основных мишеней АФК (Дубинина, Пустыгина, 2008; Муравлева и др., 2010). Поскольку окислительная модификация белков носит избирательный и специфический характер, а ее продукты являются маркерами раннего оксида-тивного стресса, то исследование этого процесса при ишемии/реперфузии представляет определенный интерес.

Как видно из табл. 4, ишемия приводит к резкому увеличению (на 100%) исходного уровня карбонилов в мембранных белках. В период реперфузии исходное содержание карбонильных групп в белках мембран синаптосом снижается относительно состояния ишемии, но остается выше контрольного уровня на 49%.

Таблица 4

Содержание карбонильных групп (нмоль/мг белка) и скорость их накопления в присутствии прооксидантов в белках мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии (М± т; п=4-6)

Состояние животного Карбонильные группы

исходный уровень прирост за 15 мин в присутствии Fe2+-H,02

Контроль 2,57 ±0,12 13,27 ±0,35

Ишемия 60 мин 5,14 ±0,35 Р<0,05 16,32 ± 1,23 Р< 0,05

Ишемия 60 мин+реперфузия 60 мин 3,83 ± 0,01 Р<0,01 Pi<0,01 13,75 ±0,73

Примечание: Р - достоверные различия относительно контроля, Р] - относительно ишемии 60 мин.

Ишемия приводит также к накоплению карбонилов (на 23%) в присутствие системы Фентона, генерирующей ОН-радикалы. Реперфузия приводит к уменьшению накопления карбонилов в белках мембран, что, возможно, обу-

словлено тем, что число мишеней для ОН-радикалов снижено вследствие их окисления in vivo.

Интенсивность окислительной модификации мембранных липидов и белков при ишемии/реперфузии может быть связана не только от скорости генерации АФК, но и от активности антиоксидантной защиты синаптических окончаний нейронов. В связи с этим было изучено изменение активности антиоксидантной защиты синаптосом при ишемии мозга и в ближайшем постишемиче-ском периоде.

Анализ содержания основного клеточного антиоксиданта - восстановленного глутатиона показал, что ишемия существенно снижает (на 50%) его уровень в синаптосомах (табл. 5). Реперфузия приводит к дальнейшему снижению содержания глутатиона в синаптосомах. Снижение уровня глутатиона коррелирует (г = 0,88) со снижением активности мембранных ферментов (Na, К-АТФазы и АХЭ) и степенью окислительной модификации мембранных липидов и белков синаптосом при ишемии.

Таблица 5

Содержание глутатиона (ммоль/мг белка), активность СОД (усл. ед/мг белка) и каталазы (мкмоль Н202/мг белка/мин) в синаптосомах из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии (М± ш; п=4-6)

Состояние животного Содержание глутатиона Активность сод Активность каталазы

Контроль 0,975 ± 0,007 182,8 ±0,1 3,88 ±0,15

Ишемия 60 мин 0,491 ±0,024 Р<0,001 107,2 ± 0,5 Р< 0,001 2,92 ± 0,04 Р<0,05

Ишемия 60 мин +реперфузия 60 мин 0,362 ± 0,025 Р<0,001 Pi<0,05 65,1 ± 0,8 Р<0,001 Pi< 0,001 1,19 ±0,02 Р<0,001 Р,< 0,001

Примечание: Р - достоверные различия относительно контроля, Р, - относительно ишемии 60 мин.

Ключевым ферментом антиокислительной защиты является СОД, так как при ее участии прерывается цепь СРП в начале своего зарождения на стадии одноэлектронного восстановления кислорода с образованием 02' (Рпс1оу1сЬ, 1997). Ишемия снижает активность СОД на 41% относительно контроля (табл. 5). При реперфузии происходит дальнейшее снижение активности фермента. Степень ингибирования СОД при этом составляет 60% относительно контроля.

СОД катализирует реакцию диспропорционирования двух молекул 02' с образованием одной молекулы 02 и одной молекулы Н202. Одним из главных регуляторов концентрации Н202 в клетках со стороны антиоксидантной системы является каталаза. Считается, что для надежной антиоксидантной защиты

соотношение активностей СОД и пероксидаз, в частности, каталазы и глутати-онпероксидазы должно быть сбалансировано.

Исследование каталазы показало, что при ишемии активность фермента в синаптосомах снижается, но в меньшей степени (на 25%), чем активность СОД (табл. 5). Однако при реперфузии активность каталазы, как и активность СОД, снижается примерно на 60% относительно контроля.

Исходя из полученных данных можно предположить, что снижение активности антиоксидантной защиты синаптосом является фактором способствующим ингибированию Иа, К-АТФазы и АХЭ и повреждению нейронов при ишемии и реперфузии.

В следующей серии экспериментов было исследовано влияние даларгина на интенсивность СРП в мозге. Выяснилось, что даларгин полностью предотвращает повышение исходного уровня МДА в синаптосомах при ишемии (рис. 5). При этом пептид уменьшает также аскорбат-индуцированное накопление МДА в суспензии синаптосом.

Исходный уровень

Прирост за 15 мин

□ контроль ЕЭ ишемия Ш ишемия+даларгин

Рис. 5. Влияние даларгина (0,5 мг/кг) на содержание МДА и его накопление в присутствии прооксидантов в синаптосомах из коры головного мозга крыс при ишемии 60 мин. * - р<0,05 относительно контроля.

Даларгин влияет и на содержание карбонильных групп в белках мембран синаптосом при ишемии (рис. 6). Предварительное введение даларгина полностью предотвращает повышение исходного уровня карбонильных групп в мембранных белках при ишемии. При ишемии на фоне даларгина в суспензии мембран синаптосом меньше образуются карбонилы в присутствие ОН-радикалов по сравнению с ишемией без введения пептида.

Исходный уровень Прирост за 15 мин

□ контроль Ш ишемия Ш) ишемия+даларгин

Рис. 6. Влияние даларгина (0,5 мг/кг) на содержание карбонильных групп и их накопление в присутствии прооксидантов в белках мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии 60 мин; * - р<0,05 относительно ишемии.

Таким образом, однократное внутрибрюшинное введение аналога опио-идных пептидов даларгина предупреждает повышение уровня ПОЛ и окислительной модификации белков мембран синаптосом при ишемии.

Исследование влияния даларгина на активность антиоксидантной защиты синаптосом показало, что опиоидный пептид предотвращает падение уровня глутатиона в синаптосомах при ишемии: содержание глутатиона в синаптосомах при ишемии составляет 0,491 ±0,024 ммоль/мг, а при ишемиии на фоне введения даларгина - 0,845±0,025 ммоль/мг (контроль - 0,975 ± 0,007 ммоль/мг).

При ишемии даларгин не только предотвращает ингибирование СОД и катапазы в синаптосомах, но существенно активируют их (рис. 7). При ишемии на фоне даларгина активность СОД повышается на 38%, каталазы - на 113% относительно контроля.

Эти результаты свидетельствуют о том, что защита мембранных липидов и белков от окислительной модификации при ишемии на фоне даларгина связана с активацией пептидом антиоксидантной системы синаптосом.

Таким образом, введение даларгина предотвращает развитие окислительного стресса в синаптических окончаниях нервных клеток при ишемии.

Рис. 7. Влияние даларгина (0,5 мг/кг) на активность СОД и каталазы в синаптосомах из коры головного мозга крыс при ишемии. К - контроль; И - ишемия 60 мин; И60+Д - введение даларгина и последующая ишемия 60 мин; * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно ишемии.

Исследование влияния гипотермии на процессы ПОЛ показало, что мягкая гипотермия, вызванная во время ишемии, снижает исходный уровень МДА в синаптосомах на 17% относительно контроля (рис. 8). Однако при ишемии на фоне гипотермии увеличивается аскорбат-индуцированное накопление МДА в суспензии синаптосом.

* *

1 —

—

Исходный уровень Прирост за 15 мин

□ контроль И ишемия Ш ишемия+гипотермия

Рис. 8. Влияние гипотермии на содержание МДА и его накопление в присутствии прооксидантов в синаптосомах из коры головного мозга крыс при ишемии 60 мин. * - р<0,05 относительно контроля. # - р<0,05 относительно ишемии.

Гипотермия 33-34°С, вызванная во время ишемии, также снижает исходный уровень карбонильных групп в белках синаптосом на 16% относительно их содержания при ишемии (рис. 9). Однако при ишемии на фоне гипотермии в инкубируемых in vitro пробах суспензии мембран синаптосом карбонилы образуются в таком же количестве, как и при ишемии.

Исходный уровень Прирост за 15 мин

□ контроль И ишемия □ ишемия+гипотермия

Рис. 9. Влияние гипотермии на содержание карбонильных групп и их накопление в присутствии прооксидантов в белках мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии 60 мин; * - р<0,05 относительно контроля.

Таким образом, гипотермия при ишемии снижает интенсивность окислительной модификации как липидов, так и белков мембран синаптосом. Причем, липидов в большей степени, чем белков. Прямой вывод из этих фактов состоит в том, что гипотермия снижает интенсивность СРП в пресинаптическом ком-партменте. Однако при гипотермии уровень индуцируемого накопления МДА и карбонилов в суспензии синаптосом возрастает при ишемии. Этот показатель отражает происходящее не in vivo, a in vitro, т.е. свойства синаптосом, извлечённых из ишемического нормотермического и гипотермического мозга. Почему гипотермия не препятствует увеличению уровня накопления МДА и карбонилов в мембранах синаптосом при ишемии? Либо потому, что при ишемии на фоне гипотермии содержание субстратов окисления увеличиваются in vivo, либо потому, что они обладают большей реакционной способностью (более доступны).

Снижение интенсивности СРП в синаптосомах при ишемии на фоне гипотермии однако не связано с активацией антиоксидантной защиты. Наоборот, снижение температуры тела животных при ишемии приводит к гораздо большему падению уровня восстановленного глутатиона в синаптосомах, чем при

ишемии. Так, содержание глутатиона в синаптосомах при ишемии составляет 0,491± 0,024 ммоль/мг, а при ишемии на фоне гипотермии - 0,350±0,025 ммоль/мг (контроль - 0,975 ± 0,007 ммоль/мг).

Гипотермия при ишемии также существенно снижает активность СОД и каталазы синаптосом (рис. 10). При ишемии на фоне гипотермии активность СОД снижается на 61,7%, каталазы - на 60,1% относительно контроля.

Рис. 10. Влияние гипотермии на активность СОД и каталазы в синаптосомах из коры головного мозга крыс при ишемии. К - контроль; И60 - ишемия 60 мин; И60+Г - ишемия 60 мин на фоне гипотермии; * - р<0,05 относительно контроля; # - р<0,05 относительно ишемии.

Таким образом, снижение температуры тела крыс во время ишемии приводит к существенному подавлению антиоксидантной защиты синаптосом. Поскольку при ишемии на фоне гипотермии исходные уровни продуктов окислительной модификации мембранных липидов и белков синаптосом снижаются, то можно предположить, что защитный эффект гипотермии заключается в снижении генерации АФК.

ВЫВОДЫ

1. При окклюзии сонных артерий имеет место ингибирование К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом, выраженность которого прямо связана с длительностью ишемии. При этом степень ингибирования N8, К-АТФазы выше, чем АХЭ. В период реперфузии активность N8, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом возрастает относительно уровня их активности при ишемии.

2. Опиоидный нейропептид даларгин в дозе, проникающей в головной мозг, предотвращает ингибирование N8, К-АТФазы и АХЭ синаптических мембран как в период ишемии, так и реперфузии.

3. Мягкая гипотермия во время ишемии, а не в период реперфузии, защищает Na, К-АТФазу и АХЭ мембран синаптосом от ишемического повреждения.

4. Через 1 ч после окклюзии сонных артерий имеет место возрастание степени окислительной модификации липидов и белков мембран синаптосом при одновременном снижении активности антиоксидантной защиты. В период реперфузии снижается степень окислительной модификации липидов и белков мембран синаптосом относительно уровня при ишемии на фоне дальнейшего снижения активности антиоксидантной защиты.

5. Предварительное введение даларгина при ишемии полностью предотвращает окислительную модификацию липидов и белков мембран синаптосом, а также активирует антиокислительную защиту.

6. Мягкая гипотермия, вызванная во время ишемии, полностью предотвращает окислительную модификацию мембранных липидов и лишь частично белков. Гипотермия при ишемии не предотвращает повышения доступности мембранных липидов и белков оксидантам, а также существенно подавляет активность антиокислительной защиты синаптосом.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список работ, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Мохаммед М.Т., Кличханов Н.К. Влияние даларгина на активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии // Изв. Дагестанского гос. педагогического ун-та. Естеств. и точные науки. - 2010. - №2. - 69-73.

2. Мохаммед М.Т., Кличханов Н.К. Влияние даларгина на активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии // Изв. Самарского науч. центра РАН. - 2011. - Т. 13. - № 1. - С. 260-263.

3. Мохаммед М.Т., Кличханов Н. К. Свободнорадикапьные процессы в синаптосомах из коры головного мозга крыс при окклюзии сонных артерий // Вести. Дагестанского ГУ. Естественные науки. - 2011. - №1. - С. 124-128.

Статьи, опубликованные в других журналах, а также в сборниках научных трудов, конференций, симпозиумов и конгрессов

4. Кадималиева З.Ф., Мохаммед М. Т., Кличханов Н.К. Механизмы повреждения головного мозга при ишемии // Вестник ДГУ. Естеств. науки. -2008, вып.6. - С. 60-66.

5. Кадималиева З.Ф., Мохаммед М. Т., Кличханов Н.К. Роль гипотермии в защите мозга при ишемическом инсульте // Сб. трудов Междун. конф. «Молекулярные механизмы адаптацию), Махачкала. - 2008. - С.35-37.

6. Мустафа Taxa Мохаммед. Влияние даларгина на активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и ре-

перфузии // Труды молодых ученых ДГУ. Махачкала. - 2009. - С.104-105.

7. Мустафа Taxa Мохаммед. Механизмы ишемического повреждения головного мозга // Сборник докл. II Всероссийской научно-практической конф. «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов». Томск. -2009. -С.281-289.

8. Мохаммед М.Т., Аль-Саеди С. М. К., Кличханов Н.К. Влияние гипотермии на активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии // Закономерности распространения воспроизведение и адаптаций растений и животных. Махачкала. - 2010. - С. 296-298.

9. Мохаммед М.Т., Аль-Саеди С. М. К., Кличханов Н.К. Влияние далар-гина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии // Сборник докл. III Всероссийской научно-практической конф. «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов». Томск. - 2010. - С.306-307.

10. Мохаммед М.Т. Влияние гипотермии на свободнорадикальные процессы в мозге крыс при окклюзии сонных артерий // Сборник докл. IV Всероссийской научно-практической конф. «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов». Томск. -2011.-С. 353.

Тезисы

11. Мохаммед М.Т., Кличханов Н.К. Влияние ишемии на активность N а,К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс // Мат. II Междун. конф «Актуальные проблемы биологии, нанотех-нологий и медицины». Ростов-на-Дону. - 2008. - С. 34-35.

12. Исмаилова Ж.Г., Астаева М.Д., Мохаммед М.Т., Кличханов Н.К. Интенсивность перекисного окисления липидов мозга крыс в ходе самосогревания после перенесенной глубокой гипотермии // Сб. тез. 12-ой Междунар. Пущин-ской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. -2008.-С.88.

13. Мохаммед М.Т., Кличханов Н.К. Влияние даларгина на активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии // Сб. тез. 13-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино. - 2009. - С. 76.

14. Мохаммед М.Т., Аль-Саеди С.М.К., Шихамирова З.М., Кличханов Н.К. Влияние даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии // Сб. тез. 14-ой Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино. - 2010. - С. 47.

15. Кличханов Н.К., Мохаммед М.Т., Исмаилова Ж.Г. Влияние гипотермии на свободнорадикальные процессы в мозге крыс при окклюзии сонных артерий // Труды 7-го Междунар. междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым) - М.: МАКС Пресс, 2011. - С. 218219.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

АХЭ - ацетилхолинэстераза

МДА - малоновый диапьдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРП - свободнорадикальные процессы

Формат 60x84 1/16. Гарннтура Тайме. Бумага офсетная. Тир. 120 экз. Размножено ИП «Султанбегова Х.С.» Махачкала, ул. М.Гаджиева, 34.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мохаммед Мустафа Таха

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные механизмы повреждения головного мозга при нарушении мозгового кровообраще

1.1.1. Основные этапы повреждения мозга при ишемии.

1.1.2. Развитие ацидоза при ишемии мозга.

1.1.3. Биохимический каскад и его последствия при ишемии

1.1.4. Состояние свободнорадикальных процессов при ишемических острых нарушениях мозгового кровообращения

1.1.5. Пути гибели нервных клеток при ишемии головного мозга.

1.2. Реперфузионные повреждения головного мозга.

1.3. Механизмы нейропротекторного действия гипотермии при ишемии мозга.

1.3.1. Влияние гипотермии на объем зоны инфаркта.

1.3.2. Влияние гипотермии на метаболизм и кровоток в мозге при ишемии

1.3.3. Влияние гипотермии на эксайтотоксичность.

1.3.4. Влияние гипотермии на окислительный стресс и апоптоз при ишемии мозга.

1.3.5. Влияние гипотермии на воспалительные процессы.

1.3.6. Влияние гипотермии на гематоэнцефалический барьер и развитие отеков при ишемии.

1.4. Ыа, К-АТФаза и ее взаимодействие с активными формами кислорода.:.

1.5. Ацетилхолинэстераза и ее взаимодействие с активными формами кислорода.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объект исследования.

2.2. Постановка эксперимента.

2.2.1. Моделирование неполной ишемии мозга у крыс.

2.2.2. Условия гипотермии.

2.2.3. Методы инъекций животным.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Выделение из коры головного мозга синаптосом и их плазматических мембран.

2.3.2. Определение активности К-АТФазы в мембранах синаптосом

2.3.3. Методика определения неорганического фосфора.

2.3.4. Определение активности ацетилхолинэстеразы в мембранах синаптосом

2.3.5. Определение содержания малонового диальдегида в си-наптосомах.

2.3.6. Определение окислительной модификации белков мембран синаптосом из коры головного мозга крыс.

2.3.7. Определение содержания глутатиона в синаптосомах

2.3.8. Определение активности супероксиддисмутазы в синаптосомах.

2.3.9. Определение активности каталазы в синаптосомах.

2.3.10. Определение содержания белка.

2.4. Статистический анализ данных.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Влияние даларгина и гипотермии на активность Ыа, К-АТФазы синаптосом при ишемии.

3.1.1. Влияние ишемии и реперфузии на активность К-АТФазы мембран синаптосом мозга крыс.

3.1.2. Влияние даларгина на активность Ыа, К-АТФазы мембран синаптосом мозга крыс при ишемии и реперфузии.

3.1.3. Влияние гипотермии на активность Ыа, К-АТФазы мембран синаптосом мозга крыс при ишемии и реперфузии.

3.2. Влияние даларгина и гипотермии на активность ацетилхо-линэстеразы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии.

3.2.1. Влияние ишемии и реперфузии на активность ацетилхо-линэстеразы мембран синаптосом мозга.

3.2.2. Влияние даларгина на активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом мозга крыс при ишемии и реперфузии.

3.2.3. Влияние гипотермии на активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом мозга крыс при ишемии и реперфузии.

3.3. Влияние даларгина и гипотермии на свободнорадикальные процессы в синаптосомах мозга при ишемии и реперфузии.

3.3.1. Влияние ишемии и реперфузии на интенсивность свобод-норадикальных процессов в синаптосомах мозга.

3.3.2. Влияние даларгина на интенсивность свободнорадикаль-ных процессов в синаптосомах мозга при ишемии.

3.3.3. Влияние гипотермии на интенсивность свободнорадикаль-ных процессов в синаптосомах мозга при ишемии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гипотермии и даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при ишемии"

Нарушения кровоснабжения головного мозга инициируют каскад биохимических реакций, лежащих в основе тканевого повреждения. Основные механизмы нейрональных повреждений включают истощение энергетических ресурсов в условиях ацидоза ткани мозга, нарушение ионного гомеоста-за, избыточное накопление возбуждающих аминокислот, обладающих нейро-токсическим действием, и возрастание активных форм кислорода (АФК), индуцирующих развитие окислительного стресса (Гусев, Скворцова, 2002; Р1зкит е1 а1., 2004; ЗгусИо^/Бка, ТугшапБк!, 2010). Образующиеся при этом АФК способствуют окислительной модификации не только мембранных ли-пидов, но и цитозольных и мембранных белков нервных клеток. Высокой чувствительностью к АФК обладают такие важнейшие ферменты мембран синаптосом как Ыа, К-АТФаза и ацетилхолинэстераза (АХЭ). Ишемия мозга приводит к снижению активности Ыа, К-АТФазы (БоЬп^а ег аГ, 1999), в результате чего нарушается транспорт ионов, развивается деполяризация мембраны, нейроны утрачивают свою важнейшую функцию - электрическую проводимость. Вместе с тем не совсем ясно, как изменяется активность Ыа,

К-АТФазы мембран синаптосом в динамике неполной глобальной ишемии и в ближайшем постишемическом периоде.

АХЭ является одним из основных компонентов холинергической системы мозга. В нейронах головного мозга АХЭ расположена на внешней поверхности постсинаптической мембраны холинергических синапсов, где регулирует временной профиль концентрации медиатора ацетилхолина в си-наптической щели (Zimmerman, Soreq, 2006). Установлено, что повреждение нейронов, связанное с ишемией, сопровождается изменениями в холинергической системе (Kataoka et al., 1991). Однако нет единого мнения относительно того, как влияет ишемия на активность АХЭ в мозге (Saez-Valero et al., 2003; Ни et al., 2009).

В настоящее время многие вопросы, связанные с механизмами защиты головного мозга от окислительного стресса в условиях ишемии и рециркуляции, остаются невыясненными. Является очевидной необходимость как систематических исследований биологического действия природных и синтетических антиоксидантов, так и поиск новых соединений, обладающих протекторной способностью к нарушениям кислородного обмена. В этой связи интерес представляет синтетический аналог природного лей-энкефалина D-Ala2, Leu5, А1^6-энкефалин - даларгин. Этот пептид активирует опиоидные ц-и 8-рецепторы и проникает через гематоэнцефалический барьер только при его использовании в дозах не менее 0,5 мг/кг (Полонский и др., 1987; Лиш-манов, Маслов, 1994). В экспериментах на животных (Маслов и др., 2002а) и в клинических условиях (Казанцев и др., 2000) даларгин оказывал противо-ишемическое действие, но механизмы такого действия пептида не изучены.

Цель работы и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы является изучение активности мембранных ферментов и свободнорадикальных процессов в синаптосомах при ишемии/реперфузии головного мозга крыс до и после коррекции нарушений даларгином и гипотермией.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить активность Иа, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при окклюзии сонных артерий разной длительности и реперфузии.

2. Изучить влияние даларгина и гипотермии на активность К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии.

5. Изучить влияние ишемии головного мозга на состояние антиокси-дантной системы защиты синаптосом (восстановленного глутатиона, активности СОД и каталазы).

Положения, выносимые на защиту

1. Двусторонняя окклюзия сонных артерий приводит к повреждению мембран синаптосом из коры головного мозга крыс, ингибируя важнейшие ферменты мембран синаптосом - Ыа, К-АТФазу и АХЭ, увеличивая окислительную модификацию мембранных липидов и белков, подавляя активность антиоксидантной защиты синаптосом.

2. Опиоидный гексапептид даларгин оказывает эффективное нейропро-текторное действие при острой ишемии/реперфузии головного мозга у экспериментальных животных. Это подтверждается не только положительной динамикой соответствующих биохимических показателей окислительной модификации мембранных липидов и белков синаптосом, повышением активности антиоксидантной защиты, но и защитой мембранных ферментов N3, К-АТФазы и АХЭ от ингибирования.

Научная новизна исследования. Установлено, что активность К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом из коры головного мозга при неполной глобальной ишемии снижается, а в период реперфузии возрастает. Впервые показано, что снижение активности 1Ма, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом усиливается при увеличении длительности нарушения мозгового кровообращения. Впервые установлено, что даларгин снижает повреждающее влияние двусторонней окклюзии сонных артерий на синаптические окончания нейронов мозга путем активации антиоксидантной системы защиты, в результате чего происходит уменьшение накопления продуктов переокисления липидов и белков, т.е. нарушения клеточных мембран, что, в свою очередь положительно отражается на активность К-АТФазы и АХЭ мембран. Получены конкретные значения доз даларгина, проявляющих и не проявляющих выявленные эффекты.

Впервые установлено, что мягкая гипотермия защищает К-АТФазу и АХЭ мембран синаптосом от ингибирования при ишемии и одновременно подавляет активность антиоксидантной защиты синаптосом.

Теоретическая значимость работы. Полученные в работе результаты доказывают участие окислительного стресса в развитии ответа ткани мозга на нарушения мозгового кровообращения, что является существенным вкладом в понимание патогенеза ишемических повреждений головного мозга. Проведенные исследования указывают на то, что окислительные повреждения мембран синаптосом начинаются уже на ранних этапах окклюзии сонных артерий и постепенно усиливаются по мере развития тяжести ишемии.

Практическая значимость работы. Ишемия мозга и ее последствие -ишемический инсульт являются тяжелейшими формами сосудистых поражений мозга, занимающимися одно из первых мест в структуре общей смертности населения и являющаяся лидирующей причиной инвалидизации. В связи с этим поиск способов коррекции ишемии представляется важным для фундаментальной и практической медицины. Гипотермия является одним из потенциальных терапевтических подходов к защите мозга в клинической неврологии у больных с инсультом и травмами мозга. Понимание механизмов этого феномена может дать основу для создания фармакологических препаратов, предназначенных для предупреждения последствий ишемиче-ского поражения мозга.

Внедрение результатов работы в практику. Основные результаты работы внедрены в учебный процесс в виде методических разработок для проведения практических и семинарских занятий на кафедре биохимии и биофизики Дагестанского государственного университета и включены в спецкурс «Свободнорадикальные процессы в биологических системах».

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на Международной научной конференции «Молекулярные механизмы адаптации» (Махачкала, 2008); на II Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); на 12, 13, 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2009, 2010); на II, III и IV Всероссийской научно-практической конференции «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов» (Томск, 2009, 2010, 2011); на Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптаций растений и животных» (Махачкала, 2010); на седьмом Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, 2011).

Публикации. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мохаммед Мустафа Таха

ВЫВОДЫ

1. При окклюзии сонных артерий имеет место ингибирование Ыа, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом, выраженность которого прямо связана с длительностью ишемии. При этом степень ингибирования К-АТФазы выше, чем АХЭ. В период реперфузии активность Иа, К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом возрастает относительно уровня их активности при ишемии.

2. Опиоидный нейропептид даларгин в дозе, проникающей в головной мозг, предотвращает ингибирование К-АТФазы и АХЭ синаптических мембран как в период ишемии, так и в период реперфузии.

3. Мягкая гипотермия во время ишемии, а не в период реперфузии, защищает Ыа, К-АТФазу и АХЭ мембран синаптосом от ишемического повреждения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние 15 лет отмечается стойкая тенденция к «омоложению» контингента больных с цереброваскулярной патологией не только с острым инсультом, но и хронической ишемией мозга. Это может быть связано с недостаточной реализацией программ профилактики социально значимых заболеваний, каковыми являются артериальная гипертония и атеросклероз -главные этиологические факторы возникновения цереброваскулярных болезней (Румянцева и др., 2009). Цереброваскулярные заболевания ишемического генеза сопряжены с тяжелым клиническим течением, высокими показателями инвалидности и смертности. Поиск новых подходов к терапии острого ишемического инсульта является одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической неврологии (Виничук, 2009).

Развитие ишемии головного мозга - мультифакторный патофизиологический процесс, включающий снижение энергопродукции с нарушением активного транспорта разных ионов через мембраны, отклонения в функции эксайтотоксических медиаторов возбуждения в структурах мозга, возрастание уровня ионизированного кальция в нейронах. На фоне развивающегося метаболического ацидоза происходят гиперпродукция АФК и развитие окислительного стресса (Warner et al., 2004). Совокупность этих патобиохимиче-ских реакций приводит к развитию инфаркта головного мозга.

Na, К-АТФаза - молекулярная машина (натриевый насос), интегральный белок плазматических мембран, использующий свободную энергию гидролиза АТФ для транспорта ионов натрия и калия против электрохимического градиента (Болдырев и др., 2008). В нейронах головного мозга млекопитающих Na, К-АТФаза играет центральную роль, обеспечивая ряд важнейших функций. Градиенты ионов натрия и калия, создаваемые активностью Na, К-АТФазы, являются физической основой электрической активности нейронов, обеспечивают осмотический баланс в системе нейронэкстраклеточный компартмент, служат для транспорта аминокислот, нейро-медиаторов (Kaplan, 2002).

Na, К-АТФаза может иметь ключевое значение для развития ишемии и постишемических повреждений нейронов. Изменения активности Na, К-АТФазы при ишемии головного мозга или гипоксии были изучены ранее, но были получены противоречивые результаты. В большинстве работ обнаружено снижение активности Na, К-АТФазы мозга при различных моделях ишемии на животных (Nagafuji et al., 1992; Matejovicova et al., 1996; Wyse et al., 2000). Однако в некоторых работах обнаружено повышение активности Na, К-АТФазы мозга при ишемии и последующей реперфузии (Villa et al., 2002).

Ацетилхолинэстераза (АХЭ) является одним из основных компонентов холинергической системы в центральной и периферической нервной системе. АХЭ нейронов головного мозга расположена на внешней поверхности пост-синаптической мембраны холинергических синапсов, где регулирует временной профиль концентрации медиатора ацетилхолина в синаптической щели (Zimmerman, Soreq, 2006). АХЭ играет важную роль в поддержании многих функций головного мозга и является мишенью при лечении различных заболеваний мозга.

Установлено, что повреждение нейронов, связанное с ишемией, сопровождается изменениями в холинергической системе (Hou et al., 2008). Так, после окклюзии средней мозговой артерии (МСАО), широко признанной моделью для изучения ишемии мозга, происходит дисфункция холинергическо-го пути между фронтальной корой и базальным ядром Мейнерта (Kataoka et al., 1991). Тем не менее, не было достигнуто согласия относительно того, как изменяется уровень ключевого фермента холинергической системы - АХЭ при ишемических состояниях. По данным различных авторов активность АХЭ в различных отделах головного мозга после экспериментальной модели ишемии головного мозга снижалась (Malatova et al., 1999; Schetinger et al., 1999; Saez-Valero et al., 2003) или увеличивалась (Hu et al., 2009).

Ясно, что на молекулярные события, лежащие в основе вызванных ишемией изменений активности Ыа, К-АТФазы и АХЭ, могут повлиять использованная модель ишемии, ее характер - является ли окклюзия обратимой или постоянной, а также тяжесть ишемии ткани за период исследования. Несмотря на неоднозначность данных, все эти исследования позволяют предположить, что активность Ыа, К-АТФазы и АХЭ может изменяться во время и после ишемического повреждения мозга. Однако почти отсутствуют данные о зависимости активности АХЭ синаптических мембран из коры мозга от длительности ишемии и реперфузии.

Любой этап ишемического каскада и сопровождающего его окислительного стресса является потенциальной мишенью для коррекции антиокси-дантами и антигипоксантами (Федин, Румянцева, 2004). В этом плане интерес представляет синтетический нейропептид даларгин. Этот пептид активирует ¡1- и 5-рецепторы и проникает через гематоэнцефалический барьер при его использовании в дозах не менее 0,5 мг/кг (Лишманов, Маслов, 1994). Для даларгина характерна большая терапевтическая широта и выраженное проти-воишемическое действие, что получило подтверждение на модели острой ишемии миокарда (Маслов и др., 2002а), а также при снижении перфузион-ного давления в системе кровоснабжения мозга при реконструктивных операциях на сонных и позвоночных артериях мозга (Казанцев и др., 2000). Пептид повышает устойчивость организма и отдельных тканей к гипоксии разной этиологии (Ясенцев, 1988; Хугаева, 1988; Хомутов, Плохов, 2005). Даларгин, противодействуя гиперпродукции свободных радикалов, ослабляет проявление оксидативного стресса в ишемизированной ткани (Лишманов и др., 1991; 1992). Вместе с тем нейропротекторное действие даларгина при ишемии/рперфузии головного мозга не изучено.

В последнее время активно ведутся исследования, посвященные нейропротективному влиянию гипотермии. Гипотермия замедляет церебральный метаболизм и защищает нейроны в неблагоприятных условиях, прежде всего - при острой ишемии. В экспериментальных и клинических исследованиях неоднократно было показано, что раннее использование гипотермии мозга как в случае остановки сердца (Bernard, Buist, 2003), так и при отеке мозга (Georgiadis et al., 2002) улучшает неврологические исходы. Такие же данные получены и в отношении ишемических инсультов, по крайней мере - в эксперименте (van der Worp et al., 2007). Существуют исследования, которые указывают на то, что гипотермия может быть полезной и достаточно безопасной при остром ишемическом инсульте (De Georgia et al., 2004). Однако до настоящего времени не существует четкого представления о том, до какого уровня лучше всего снижать температуру тела для защиты мозга от ишемического повреждения (Ратманова, 2008).

Целью данной работы явилось изучение влияния даларгина и гипотермии на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы, а также на сво-боднорадикальные процессы в синаптосомах из коры головного мозга крыс, находящихся в условиях окклюзии сонных артерий разной продолжительности и репрфузии.

Нам удалось установить, что при ишемии активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом снижается. Причем степень ингибирования фермента зависит от длительности ишемии. В ближайшем постишемическом периоде активность Na, К-АТФазы возрастает. При ишемии/реперфузии подобно Na, К-АТФазе изменяется и активность АХЭ мембран синаптосом. Однако при ишемии степень ингибирования АХЭ меньше, чем Na, К-АТФазы (рис. 14). Различия в степени ингибирования исследованных ферментов при ишемии, видимо, связаны с особенностями их локализации на мембране. Na, К-АТФаза является интегральным белком, экспонирующим участки в интра- и экстраклеточное пространство (Болдырев и др., 2008). В мембране фермент существует в виде тетрамера.

АХЭ синаптических мембран в мозге млекопитающих представлена, практически, всего лишь одной (тетрамерной G4) формой (синаптическая форма), которая прикрепляется к мембране с помощью богатого пролинами пептидного якоря (PRiMA) (Dvir et al., 2004). Таким образом, каталитические субъединицы фермента непосредственно не контактируют с липидами мембраны, а находятся в экстраклеточном пространстве.

120

100

80 60

20 0

К ИЗО И60 И90 Р60 Р90

К-АТФаза -о- АХЭ

Рис. 14. Зависимость активности (в % от контроля) К-АТФазы и АХЭ мембран синаптосом от длительности ишемии/реперфузии. К - контроль; И30-И90 - длительность ишемии в мин; Р60-Р90 - длительность реперфузии в мин после ишемии 60 мин.

Корреляционный анализ показал, что между изменением активности Ыа, К-АТФазы и АХЭ синаптических мембран при ишемии/реперфузии имеется достоверная в высокой степени положительная связь (г = 1,00; р<0,05). Это означает, что ингибирование исследуемых ферментов при ишемии происходит вследствие воздействия на них одних и тех же факторов. Полученные нами данные позволяют предположить, что ингибирование исследованных ферментов синаптических мембран при ишемии связано в большей степени с окислительным повреждением молекул самих ферментов. Об этом свидетельствует тот факт, что при ишемии снижение активности N3, К-АТФазы и АХЭ коррелирует с накоплением карбонильных групп в мембранных белках в большей степени, чем со степенью накопления МДА (табл. 6).

Как известно, основным источником АФК в клетке являются митохондрии, а в нейронах еще и моноаминокидаза (Halliwell, 2006). При ишемии в синаптических окончаниях нейронов, видимо, увеличивается количество АФК, чему способствует существенное подавление антиоксидантной защиты. Образующиеся при этом АФК окисляют преимущественно белки синаптических мембран. Об этом свидетельствует тот факт, что количество карбонильных групп при ишемии 60 мин возрастает в 2 раза, а МДА - только на 20% относительно контроля. Преимущественное окисление белков в условиях окислительного стресса обнаружено и при других экстремальных состояниях и связывают это с разнообразием их химического строения (Дубинина, Пустыгина, 2008; Муравлева и др., 2010). Ясно, что в условиях окислительного стресса при ишемии окислительной модификации в первую очередь подергаются те мембранные белки, которые имеют участки, расположенные внутриклеточно. Отсюда, по-видимому, и обнаруженные различия в степени ингибирования Na, К-АТФазы (интегральный белок) и АХЭ (экстраклеточный белок).

Таким образом, снижение активности Na, К-АТФазы при ишемии может произойти не только из-за уменьшения содержания АТФ в нейронах, но и в результате окислительного повреждения самого фермента, в результате чего может происходить нарушение клеточного ионного гомеостаза и деполяризация мембран. Это способствует чрезмерной секреции нейротрансмит-теров, кальциевой перегрузка нейронов, и далее к таким вторичным ишеми-ческим повреждениям, как активации фосфолипаз, липаз, протеаз, эндо-нуклеаз, неконтролируемому фосфорилированию, деградации мембран, и отеку мозга (Zipfel et al., 1999).

Ингибирование АХЭ может быть защитным механизмом для мозга от ишемического повреждения. Показано, что ацетилхолин способствует значительному расслаблению артерий (Furchgott, Zawadzki, 1980), поэтому уменьшение его деградации при ингибировании АХЭ может способствовать сохранению церебральной микроциркуляции и, следовательно, метаболизма

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мохаммед Мустафа Таха, Махачкала

1. Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H. Методы оценки свободно-радикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекомендации. - СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. - 104 с.

2. Ашмарин И.П. (ред.). Биохимия мозга. СПб., 1999. - 325 с.

3. Белоус Ю. А. Индуцированный ренальный апоптоз и его регуляция при повреждении почки. Автореф. док. мед. наук. М. 2010. 34 с.

4. Болдырев A.A. Na/K-АТФаза как олигомерный ансамбль // Биохимия. -2001.-Т. 66, вып. 8.-С. 1013-1025.

5. Болдырев A.A. Парадоксы окислительного метаболизма мозга // Биохимия. 1995. - Т. 60, вып. 9. - С. 1536-1542.

6. Болдырев A.A. Роль Na/K-Hacoca в возбудимых тканях // Журн. Сибирского федерального ун-та. Биология. 2008. - Т. 3, № 1. - С. 206-225.

7. Болдырев A.A., Булыгина Е.Р., Крамаренко Г.Г. Является ли Na, К-АТФаза мишенью окислительного стресса? // Бюл. эксп. биол. и мед. -1996.-№3.-С. 275-278.

8. Булыгина Е.Р., Ляпина Л.Ю., Болдырев A.A. Активация глутаматных рецепторов ингибирует Na/K-АТФазу гранулярных клеток мозжечка // Биохимия. 2002. - Т.67, вып.9. - С. 1209-1214.

9. Глебов Р.Н., Крыжановский Г.Н. Функциональная биохимия синапсов.

10. М: Медицина, 1978.- 328 с.

11. Гомазков O.A. Нейрохимия ишемических и возрастных патологий мозга: информ.-аналит. изд. М., 2003. - 235 с.

12. Гусев Е. И., Скворцова В. И. Глутаматная нейротрансмиссия и метаболизм кальция в норме и при ишемии головного мозга // Успехи физиолог. наук. 2002. - № 33. - С. 80-93.

13. Гусев Е.И, Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001.-С. 327.

14. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Крылов В.В. Снижение смертности и инвалидности от сосудистых заболеваний мозга в Российской Федерации // Неврол. вестник. 2007. - Т. 39, вып. 1.-С. 128-133.

15. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Мартынов М.Ю. Церебральный инсульт: проблемы и решения // Вестник РАМН. 2003. - № 11. - С. 44-48.

16. Дубинина Е. Е., Пустыгина А. В. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях // Укр. 6ioxiM. журн. 2008. -Т. 80, №6.-С. 5-18.

17. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. С.Петербург, 2006. - 400 с.

18. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молеул в метаболизме тканей при состояниях окслительного стресса // Вопр. мед. химии. 2001. - Т. 47. - С. 561-581.

19. Захарова И.О., Аврова Н.Ф. Влияние адаптации к холоду на содержание ганглиозидов в субклеточных фракциях мозга крыс и состав их жирных кислот // Журн. эвол. биохим. и физиол. 1998. - Т. 34, № 5. - С. 555563.

20. Зинчук В.В., Борисюк М. В., Максимович H.A. Функциональная система транспорта кислорода: фундаментальные и клинические аспекты / под ред. Зинчука В.В. Гродно, 2003 .-236 с.

21. Командресова Т. М. Роль оксида азота в опиоидергической модуляции стрес с обусловленной вазоконстрикции. Автореф. канд. биол. наук. Архангельск. 2006. 18 с.

22. Комаревцева И.А, Комаревцева Е.В., Белоус Ю.А. Роль опиатов и К+-АТФ каналов плазматической и митохондриальной мембран клеток почек в развитии апоптоза // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. 2009. - № 2. - С. 83-88.

23. Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. - № 1. - С. 16-19.

24. Короткина Р.Н., Шлозников Б.М., Донич С.Г., Гребенчиков O.A., Ситников A.B., Карелин A.A. Изучение активности ксантиноксидазы в ткани головного мозга на фоне миоплегии // Бюлл. экспер. биол. и мед. -1990.-Т. 59, №2.-С. 145-146.

25. Куклей М.Л., Стволинский С.Л., Шавкрацкий В.Х., Шатрова Ю.В. Пере-кисное окисление липидов в мозге крыс при ишемии // Нейрохимия. -1995.-Т. 12, вып. 2.-С. 28-35.

26. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.М. Опиатергическая регуляция состояния центральной гемодинамики // Пат. физиол. эксперим. терапия. 2003. -№1. - С. 2-10.

27. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.М. Опиатные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. Томск: Изд-во ТГУ, 1994. - 352 с.

28. Лишманов Ю.Б., Травков Ю.А., Федотов Г.В., Реброва Т.Ю. Влияние опиоидных нейропептидов на систему простагландинов и процессы ПОЛ в миокарде при его стрессорном повреждении // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1991.-T. CXI, № 6.-С. 619-621.

29. Лопина О.Д. Взаимодействия каталитической субъединицы Na, К-АТРазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами // Биохимия.-2001.-Т. 66, вып. 10.-С. 1389-1400.

30. Львова С.П., Горбунова Т.Ф., Абаева Е.М. Влияние гипотермии и далар-гина на перекисное окисление липидов в тканях крыс // Вопр. мед. химии. 1993.-Т. 39, вып. З.-С. 21-24.

31. Маслов Л.В. Лишманов Ю.Б., Лопотухин Э.Ю. Даларгин это пептидный агонист ц- и ô-опиоидных рецепторов // Клинич. фармакол. и терапия. - 2004. - №4. - С. 47-52.

32. Маслов Л.В. Лишманов Ю.Б., Смагин Г.Н. Опиоидные рецепторы. Состояние проблемы и перспективы // Эксперим. и клинич. фармакол. -2002в. Т. 65, №2. - С. 70-75.

33. Маслов Л.М., Лишманов Ю.Б., Гросс Г.Дж., Стефано Дж. Феномен повышенной устойчивости сердца к аритмогенному действию ишемии и реперфузии при активации периферических опиатных рецепторов // Вестн. аритмол. 2002а. - №26. - С. 77-90.

34. Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., Гросс Г.Дж., Шультц Дж.Э., Стефано Дж.

35. Активация опиатных рецепторов изменяет устойчивость сердца к ише-мическим и реперфузинонным повреждениям // Вестник аритмологии. -2002.-№23.-С. 67-78.

36. Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., Ласукова Т.В., Там C.B. Мю-опиатергическая стимуляция КАТф-каналов как способ профилактики ре-перфузионного повреждения сердца // Кардиология. 2001. - № 2. - С. 39-45.

37. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиокси-данты. М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.

38. Миронова Г. Д., Качаева Е. В., Копылов А. Т. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал. I. Структура канала, механизмы его функционирования и регуляции // Вестн. РАМН. 2007а. - №. 2. - С. 34-43.

39. Миронова Г.Д., Качаева Е.В., Крылова И.Б., Родионова О.М., Балина М.И., Евдокимова Н.Р., Сапронов Н.С. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал. 2. Роль канала в защите сердца от ишемии // Вестн. РАМН. 20076. - № 2. - С. 44-49.

40. Муравлева Л.Е., Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Бакенова P.A., Култанов Б.Ж., Танкибаева H.A., Койков В.В., Омарова Г.А. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования //

41. Фундамент, исследования. 2010. - №1. - С. 74-78.

42. Нечипуренко Н.И. Роль оксида азота при ишемии головного мозга // Медицинские новости. 2004. - №1. - С. 7-10.

43. Нечипуренко Н.И., Пашковская И.Д., Мусиенко Ю.И. Основные патофизиологические механизмы ишемии головного мозга // Медицинские новости.-2008.-№1,-С. 7-13.

44. Ратманова А. Ишемический инсульт и нейропротекция: поиск продолжается // Medicine Review. 2008. - №3(03). - С. 38-44.

45. Рожанец В.В., Козлова В.Н., Родина Р.И., Швец В.П., Глебов Р.Н. Действие противосудорожных веществ на Na, К-АТФазу синаптических мембран головного мозга животных // Биохимия. 1978. - Т. 43, вып. 5. -С. 892-898.

46. Румянцева С.А., Афанасьев В.В., Силина Е.В. Патофизиологическая основа комплексной нейропротекции при ишемии мозга // Журн. неврол. и психиатрии. 2009. - Т. 3. - С. 64-68

47. Самойленкова Н. С. Гаврилова С. А., Кошелев В. Б. Нейропротекторный и ангиопротекторный эффекты ишемического/гипоксического прекон-диционирования мозга // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2008. - Т. 7.-№1.(25).-С. 82-91.

48. Симбирцев А. С. Цитокины: Классификация и биологические функции // Цитокины и воспаление. 2004. - Т. 3, № 2. - С. 16-22.

49. Супрун Э. В., Громов JI. А., Беленичев И. Ф. Коррекция антагонистом рецепторов интерлейкина-1 неврологических и когнитивных нарушений при экспериментальном ишемическом инсульте // Укр. Bích. Психонев-рол.-2010.-Т. 18, вип. 2.-С. 39-43.

50. Федин А.И., Румянцева С.А. Интенсивная терапия ишемического инсульта. М: Медицинская книга, 2004. - 284 с.

51. Хомутов А.Е., Плохов Р.А. Влияние даларгина на устойчивость животных к гипоксии в условиях модификации гепаринового статуса и нейро-лепсии // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. М., 2005. - С. 117-118.

52. Хугаева В.К. Влияние даларгина на микрогемо- и микролимфоциркуля-цию // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1988. - №3. - С. 300-302.

53. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА, 2002. - 266 с.

54. Ясенцев В.В. Антигипоксические свойства эндорфинов, энкефалинов и их аналогов // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1988. - № 8. - С. 174-177.

55. Adibhatla R. М., Hatcher J.F. Phospholipase А2, reactive oxygen species, and lipid peroxidation in cerebral ischemia // Free Radical. Biol. Med. 2006. -V. 40.-P. 376-387.

56. Ames A. 3rd. CNS energy metabolism as related to function // Brain Research Rev. 2000. - V. 34. - P. 42-68.

57. Aoyama K., Watabe M., Nakaki T. Regulation of neuronal glutathione synthesis//! Pharmacol. Sci. 2008. - V. 108 (3).-P. 227-38.

58. Arsov Z., Schara M., Zorko M., Strancar J. The membrane lateral domain approach in the studies of lipid-protein interaction of GPI-anchored bovine erythrocyte acetylcholinesterase // Eu. Biophys. J. 2004. - V. 33. - P. 715725.

59. Astrup J., Siesjo B.K. Symon L. Thresholds in cerebral ischemia the ischemic penumbra// Stroke. - 1981. - V. 12. - P. 723-725.

60. Astrup J., Symon L., Branston N.M., Lassen N.A. Cortical evoked potentialand extracellular K+ and H* at critical levels of brain ischemia // Stroke. -1977.-V. 8 (l).-P. 51-57.

61. Aydemir-Koksoy A., Allen J.C. Regulation of Na(+) pump expression by vascular smooth muscle cells // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001. -V. 280.-P. HI869-1874.

62. Baker C. J., Fiore A. J., Frazzini V. I., Choudhri T. F., Zubay G. P., Solomon R. A. Intraischemic hypothermia decreases the release of glutamate in the coures of permanent focal cerebral infarcts // Neurosurgery. 1995. - V. 36. -P. 994-1001.

63. Barres B.A. New roles for glia // J. Neurosci. 1991. - V. 11. - P. 3685-3694.

64. Bartus R.T., Dean R.L., Mennerick S., Eveleth D., Lynch G. Temporal ordering of pathogenic events following transient global ischemia // Brain Res. -1998.-V. 790 (1,2).-P. 1-13.

65. Bernard S.A., Buist M. Induced hypothermia in critical care medicine: a review // Crit. Care Med. -2003. V. 31.-P. 2041-2051.

66. Bogdanova A., Petrushanko I., Boldyrev A., Gassmann M. Oxygen- and re-dox-induced regulation of the Na/K ATPase // Current Enzyme Inhibition. -2006.-Vol. 2.-P. 37-59.

67. Broughton B. R.S., Reutens D. C., Sobey C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia // Stroke. 2009. - V. 40. - P. e331 -e339.

68. Busto R., Dietrich W. D., Globus M. Y., Valdes I., Scheinberg P., Ginsberg M. D. Small differences in intraischemic brain temperature critically determine the extent of ischemic neuronal injury // J. Cereb. Blood Flow Metab. -1987.-V. 7.-P. 729-738.

69. Cadenas E., Davies K.J.A. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging // Free Radic. Biol. Med. 2000. - V. 29. - P. 222-230.

70. Campanella M., Sciorati C., Tarozzo G. Beltramo M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain // Stroke. 2002. - Vol. 33, N 2. - P. 586-592.

71. Candelario-Jalil E., Mhadu N. H„ Al-Dalain S. M., Martinez G., Leon O. S.

72. Time course of oxidative damage in different brain regions following transient cerebral ischemia in gerbils // Neurosci. Res. 2001. - V. 41. - P. 233241.

73. Cao G., Xiao M., Sun F., Xiao X., Pei W., Li J., Graham S.H., Simon R.P., Chen J. Cloning of a novel Apaf-1-interacting protein: a potent suppressor of apoptosis and ischemic neuronal cell death // J. Neurosci. 2004. - V.24. - P. 6189-6201.

74. Charriaut-Marlangue C., Aggoun-Zouaoui D., Represa A. Apoptotic features of selective neuronal death in ischemia, epilepsy and gp 120 toxicity // Trends Neurosci. 1996,-V. 19.-P. 109-114.

75. Chi O. Z., Liu X., Weiss H. R. Effects of mild hypothermia on blood-brain barrier disruption during isoflurane or pentobarbital anesthesia // Anesthesiology. 2001. - V. 95. - P. 933-938.

76. Chiueh C. C. Neuroprotective properties of nitric oxide // An. N. Y. Acad. Sci. 1999. - V. 890. - P. 301 -311.

77. Clements J.D. Transmitter time course in the synaptic cleft: its role in central synaptic function // Trends Neurosci. 1996. - V. 19. - P. 163-170.

78. Cuenca-López M.D., Brea D., Galindo M.F., Antón-Martínez D., Sanz M.J., Aguila J., Castillo J., Jordán J. Inflammatory response during ischaemic processes: adhesion molecules and immunomodulation // Rev Neurol. 2010. -V. 51(1).-P. 30-40.

79. Protein Sci. -2004. V. 13.-P. 1347-1355.

80. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M.A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view // Trends Neurosci. 1999. - V. 22. - P.391-397.

81. Dobrota D., Matejovicova M., Kurella E.G., Boldyrev A.A. Na/K-ATPase under oxidative stress: molecular mechanisms of injury // Cell Mol. Neurobi-ol.- 1999.-Vol. 19. P. 141-149.

82. Donnan G.A., Baron J.C., Ma H., Davis S.M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy // Lancet Neurol. 2009. - V. 8. - P. 261 -269.

83. Dumuis A., Pin J.P., Oomagari K., Sebben M., Bockaert J. Arachidonic acid released from striatal neurons by joint stimulation of ionotropic and metabo-tropic quisqualate receptors // Nature. 1990.-V. 347,- 182-184.

84. Durukan A., Tatlisumak T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia // Pharmacol. Biochem. Behav. 2007. - Vol. 87. - P. 179-197.

85. Dvir H., Harel M., Bon S., Liu W.-Q., Vidal M., Garbay C., Sussman J. L, Massoulie J., Silman I. The synaptic acetylcholinesterase tetramer assembles around a polyproline II helix // The EMBO J. 2004. -V. 23. - P. 4394-4405.

86. Dvir H., Silman I., Harel M. Rosenberry T. L., Sussman J. L. Acetylcholinesterase: from 3D structure to function // Chem. Biol. Interact. 2010. -V. 187.-P. 10-22.

87. Ellman Y.L., Courtney K.D., Andres V.J., Feathestone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961.-V. 7, N. 1. - P. 88-95.

88. Erecinska M., Thoresen M., Silver I. A. Effects of hypothermia on energy metabolism in mammalian central nervous system // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003. - V. 24.-V. 513-530.

89. Fisher M., Tacano K. In: Ballierie's clinical neurology, cerebrovascular disease. (Hachinski V. ed.). London, 1995. - P. 279-296.

90. Fiskum G., Rosenthal R. E., Vereczki V., Martin E., Hoffman G. E., Chino-poulos C., Kowaltowski A. Protection against ischemic brain injury by inhibition mitochondrial oxidative stress // J. Bioenerg. Biomembr. 2004. - Vol. 36, No. 4.-C. 347-352.

91. Forman L. J., Liu P., Nagele R. G., Yin K., Wong P. Y-K. Augmentation of nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite production during cerebral ischemia and reperfusion in the rat // Neurochem. Res. 1998. - V. 23(2). - P. 141-148.

92. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochem. 1975. - V. 57, N.5. - P. 557-560.

93. Fukuda H., Tomimatsu T., Watanabe N., Mu J. W., Kohzuki M., Endo M., Fujii E., Kanzaki T., Murata Y. Post-ischemic hypothermia blocks caspase-3 activation in the newborn rat brain after hypoxia-ischemia // Brain Res. -2001.-V. 910. P. 187-191.

94. Fukuda S., Harada K., Kunimatsu M., Sakabe T., Yoshida K. Postischemic reperfusion induces a-fodrin proteolysis by m-calpain in the synaptosome andnucleus in rat brain // J. Neurochem. 1998. - Vol. 70. - P. 2526-2532.

95. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature. 1980. - V. 288.-P. 373-376.

96. Garthwaite J. Concepts of neural nitric oxide-mediated transmission // Eur. J. Neurosci. 2008. - V. 27(11).-P. 2783-2802.

97. Georgiadis D., Schwarz S., Aschoff A., Schwab S. Hemicraniectomy and moderate hypothermia in patients with severe ischemic stroke // Stroke. -2002.-V. 33.-P. 1584-1588.

98. Gilbert J., Sawas A.H. ATPase activities and lipid peroxidation in rat brain cerebral cortex synaptosomes // Arch. Int. Pharmacodyn. 1983. - V. 263. -P. 189-196.

99. Globus M. Y., Alonso O., Dietrich W. D., Busto R., Ginsberg M. D. Glutamate release and free radical production following brain injury: effects of posttraumatic hypothermia // J. Neurochem. 1995 a. - V. 65. - P. 17041711.

100. Globus M. Y., Busto R., Lin B., Schnippering,H., Ginsberg M. D. Detection of free radical activity during transient global ischemia and recirculation: effects of intraischemic brain temperature modulation // J. Neurochem. 1995b. -V. 65.-P. 1250-1256.

101. Goldstein B.D., Searle J., Willson L. The susceptibility of red cell acetylcholinesterase to radiation-induced free radicals // Arch. Biochem. Biophys. -1980.-V. 201, N. l.-P. 235-240.

102. Graham S. H., Chen J. Programmed cell death in cerebral ischemia // J. Cereb. Blood Flow Metab. -2001. V. 21, No. 2.-P. 99-109.

103. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity//Brain Res. 1975. - V. 93, N. 3.-P. 485-489.

104. Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? // J. Neurochem. 2006. -V. 97. - P. 1634-1658.

105. Hammer M. D., Krieger D. W. Acute ischemic stroke: Is there a role for hypothermia? // Cleveland Clinic J. Med. 2002. - V. 69, N. 10. - P. 770-785.

106. Han H. S., Karabiyikoglu M., Kelly S., Sobel R. A., Yenari M. A. Mild hypothermia inhibits nuclear factor-kappa B translocation in experimental stroke // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2003. - V. 24. - P. 589-598.

107. Hannenhalli S., Kaestner K. H. The evolution of Fox genes and their role in development and disease // Nat Rev Genet. 2009. - V. 10(4). - P. 233-240.

108. Heiss W.D. Experimental evidence of ischemic thresholds and functional recovery // Stroke. 1992. - V. 23. - P. 1668-1672.

109. Horiguchi T., Shimizu K., Ogino M., Suga S., Inamasu J., Kawase T. Postishemic hypothermia inhibits the generation of hydroxyl radical following transient forebrain ischemia in rats // J. Neurotrauma. 2003. - V. 20. - P. 511-520.

110. Hossmann KA. Viability thresholds and the penumbra of focal ischemia // Ann. Neurol. 1994. - V. 36(4). - P.557-565.

111. Hou S.W., Wang Y.Q., Xu M., Shen D.H., Wang J.J., Huang F., Yu Z., Sun F.Y. Functional integration of newly generated neurons into striatum aftercerebral ischemia in the adult rat brain // Stroke. 2008. - V. 39. - P. 2837— 2844.

112. Hu T., Fu Q., Liu X., Zhang H., Dong M. Increased acetylcholinesterase and capase-3 expression in the brain and peripheral immune system of focal cerebral ischemic rats // J. Neuroimmunol. 2009. - V. 211. - P. 84-91.

113. Huang F. P., Zhou L. F., Yang G. Y. Effects of mild hypothermia on the release of regional glutamate and glycine during extended transient focal cerebral ischemia in rats//Neurochem. Res. 1998. -V. 23. - P. 991-996

114. Huang Z., Huang P.L., Ma J., Meng W., Ayata C., Fishman M.C., Moskowitz M.A. Enlarged infarcts in endothelial nitric oxide synthase knockout mice are attenuated by nitro-L-arginine // J. Cerebr. Blood Flow Metab. 1996. - Vol. 16.-P. 981-987.

115. Iadecola C., Zhang F., Casey R., Nagayama M., Ross M. E. Delayed reduction of ischemic brain injury and neurological deficits in mice lacking the inducible nitric oxide synthase gene // J. Neurosci. -1997. Vol. 17. - P. 91579164.

116. Iadecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury // Trends Neurosci. 1997.-Vol. 20.-P. 132-139.

117. Inamasu J., Suga S., Sato S., Horiguchi T., Akaji K., Mayanagi K., Kawase T. Post-ischemic hypothermia delayed neutrophil accumulation and microglial activation following transient focal ischemia in rats // J. Neuroimmunol. -2000.-V. 109.-P. 55-74.

118. Inserte J., Garcia-Dorado D., Hernando V., Soler-Soler J. Calpain-mediated impairment of Na+/K+-ATPase activity during early reperfusion contributes to cell death after myocardial ischemia // Circulation Res. 2005. - Vol. 97. -P.465-473.

119. Ito Y., Ohkubo T., Asano Y., Hattori K., Shimazu T., Yamazato M., Nagoya H., Kato Y., Araki N. Nitric oxide production during cerebral ischemia and reperfusion in eNOS- and nNOS-knockout mice // Cur. Neurovascul. Res. -2010. -V. 7. -P. 23-31.

120. Ji X., Luo Y., Ling F., Stetler R.A., Lan J., Cao G., Chen J. Mild hypothermia diminishes oxidative DNA damage and pro-death signaling events after cerebral ischemia: a mechanism for neuroprotection // Front Biosci. 2007. - V. 12.-P. 1737-1747.

121. Jin R, Yang G, Li G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells // J. Leukoc. Biol. 2010. - V. 87(5). - P. 779-789.

122. Kalivas P. W. The glutamate homeostasis hypothesis of addiction // Nature Rev. Neuroscience. 2009. - V. 10.-P. 561-572.

123. Kaplan J.H. Biochemistry of Na, K-ATPase // Annu. Rev. Biochem. 2002. -V. 71.-P. 511-35.

124. Kataoka K., Yanase H. Mild hypothermia a revived countermeasure against ischemic neuronal damages //Neurosci. Res. - 1998. -V. 32. - P. 103-117.

125. Kataoka K., Hayakawa T., Kuroda R., Yuguchi T., Yamada K. Cholinergic deafferentation after focal cerebral infarct in rats // Stroke. 1991. - V. 22. -P. 1291-1296.

126. Kimelberg H.K. Astrocytic edema in CNS trauma // J. Neurotrauma. 1992. -Vol. 9 (Suppl. 1).-P. 71-81.

127. Kimelberg H.K. Current concepts of brain edema. Review of laboratory investigations // J. Neurosurg. 1995. - Vol. 83, No. 6. - P. 1051 -1059.

128. Kollmar R., Blank T., Han J. L., Georgiadis D., Schwab S. Different degrees of hypothermia after experimental stroke short- and long-term outcome // Stroke. 2007. - V. 38. - P. 1585-1589.

129. Kono Y., Fridovich I. Superoxide radical inhibits catalase // J. Biol. Chem. -1982.-V. 257.-P. 5751-5754.

130. Kopito R.R., Sitia R. Aggresomes and Russell bodies. Symptoms of cellular indigestion? // EMBO Rep. 2000. - V. 1, N. 3. - P. 225-231.

131. Kriz J. Inflammation in ischemic brain injury: timing is important // Crit. Rev. Neurobiol. 2006. - V. 18(1-2). - P.145-57.

132. Lanier W. L. Cerebral metabolic rate and hypothermia: their relationship with ischemic neurologic injury // J. Neurosurg. Anesthesiol. 1995. - V. 7. - P. 216-221.

133. Lau A., Tymianski M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration // Pflugers Arch. 2010. - V. 460(2). - P. 525-542.

134. Lehotsky J., Kaplan P., Matejovicova M., Murin R., Racay P., Raeymaekers L. Ion transport systems as targets of free radicals during ische-mia/reperfusion injury // Gen. Physiol. Biophys. 2002. - V. 21. - P. 31-37.

135. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent I., Lenz A.-G., Ahn B.-W., Shaltiel S., Stadtman E.R. Determination of carbonyl content in oxida-tively modified proteins // Methods in Enzymol. 1990. - V. 186. - P. 464478.

136. Li C., Jackson R. M. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2002. - V. 282. - P. C227-C241.

137. Liebetrau M., Staufer B., Auerswald E.A., Gabrijelcic-Geiger D., Fritz H., Zimmermann C., Pfefferkorn T., Hamann G.F. Increased intracellular calpain detection in experimental focal cerebral ischemia // Neuroreport. 1999. - V. 10(3).-P. 529-534.

138. Lipton S.A., Rosenberg P.A. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders // N. Engl. J. Med. 1994. - V. 330. - P. 613622.

139. Liu L., Yenari M. A. Therapeutic hypothermia: neuroprotective mechanism // Front. Biosci. 2007. - V. 12.-P. 816-825.

140. Liu P. K. Ischemia-reperfusion-related repair deficit after oxidative stress: implications of faulty transcripts in neuronal sensitivity after brain injury // J. Biomed. Sci. -2003. V. 10.-P. 4-13.

141. Lo E. H., Steinberg G. K. Effects of hypothermia on evoked potentials, magnetic resonance imaging, and blood flow in focal ischemia in rabbits // Stroke. 1992.-V. 23.-P. 889-893.

142. Logue ES, McMichael MJ, Callaway CW. Comparison of the effects of hypothermia at 33 degrees C or 35 degrees C after cardiac arrest in rats // Acad. Emerg. Med. 2007. - V. 14(4). - P.293-300.

143. Lowry D.H., Rosebrough H.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193, № 1. - P. 265-275.

144. MacPhee-Quigley K., Vedvick T.S., Taylor P., Taylor S.S. Profile of the disulfide bonds in acetylcholinesterase // J. Biol. Chem. 1989. - V. 261. - P. 13565-13570.

145. Magistretti P.J., Pellerin L. The central role of astrocytes in brain energy metabolism // Neurosci., neurology and health. Geneva:WHO, 1997. - P. 5364.

146. Malatova Z., Gottlieb M., Marsala J. Depression of acetylcholinesterase synthesis following transient cerebral ischemia in rat: phamacohistochemical andbiochemical investigation // Gen. Physiol. Biophys. 1999. - V. 18. - P. 5771.

147. Manzoni O., Prezeau L., Marin P., Deshager S., Bockaert J., Fagni L. Nitric oxide-induced blockade of NMD A receptors // Neuron. 1992. - V. 8. - P. 6S4-662.

148. Markowitz A.J., White M.G., Kolson D.L., Jordan-Sciutto K.L. Cellular interplay between neurons and glia: toward a comprehensive mechanism for ex-citotoxic neuronal loss in neurodegeneration // Cellscience. 2007. - V. 4 (1). - P.l 11-146.

149. Massoulie J. The origin of the molecular diversity and functional anchoring of cholinesterases //Neurosignals. -2002. V. 11.-P. 130-143.

150. Matejovicova M., Machac S., Lehotsky J., Jakus J., Mezesova V. Synaptosomal Na, K-ATPase during forebrain ischemia in Mongolian gerbils // Mol. Chem. Neuropathol. 1996. -V. 29. - P. 67-78.

151. Meldrum B. S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology//J. Nutrition.-2000,-V. 130.-P. 1007S-1015S.

152. Millard C. B., Shnyrov V. L., Newstead S., Shin I., Roth E., Silman I., Weiner L. Stabilization of a metastable state of Torpedo californica acetylcholinesterase by chemical chaperones // Protein Science. 2003. - V. 12. -P. 2337-2347.

153. Mishra O.P., Delivoria-Papadopoulos M. Cellular mechanisms of hypoxic injury in the developing brain // Brain. Res. Bull. 1998. - V. 48 (3). - P. 233238.

154. Morel N., Bon S., Greenblatt H.M., Van Belle D., Wodak S.J., Sussman J.L., Massoulie J., Silman I. Effect of mutations within the peripheral anionic siteon the stability of acetylcholinesterase // Mol. Pharmacol. 1999. - V. 55. -P. 982-992.

155. Mori K., Maeda M., Miyazaki M., Iwase H. Effects of mild and moderate hypothermia on cerebral metabolism and glutamate in an experimental head injury//Acta Neurochir. Suppl.- 1998,-V. 71 P. 222-224.

156. Nagafuji T., Koide T., Takato M. Neurochemical correlates of selective neuronal loss following cerebral ischemia: role of decreased Na+, K+-ATPase activity//Brain Res. 1992. - V. 571.-P. 265-271.

157. Nakagawa I., Alessandri B., Heimann A., Kempski O. MitoK(ATP)-channel opener protects against neuronal death in rat venous ischemia // Neurosurgery. 2005. - Vol. 57. - N. 2. - P. 334-340.

158. Nicholls D.G. Spare respiratory capacity, oxidative stress and excitotoxicity // Biochem. Soc. Trans. 2009. - V. 37 (Pt 6). - P. 1385-1388.

159. Obrenovitch T. P., Richards D. A. 3 Neurotransmitter dynamics in cerebral ischaemia // Bailliere's Clinical Anaesthesio. -1996. V. 10(3). - P. 427-444.

160. Oishi K., Zheng B., Kuo J.F. Inhibition of Na, K-ATPase and sodium pump by protein kinase C regulators sphingosine, lysophosphatidylcholine and oleic acid // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 70-75.

161. Olsen T.S., Weber U.J., Kammersgaard L.P. Therapeutic hypothermia for acute stroke //Lancet Neurol. 2003. - V. 2. - P. 410-416.

162. Pawlowska Z., Hogan M.V., Kornecki E., Ehrlich Y.H. Ecto-protein kinase and surface protein phosphorylation in PC 12 cells: Interactions with nerve growth factor//J. Neurochem. 1993. -V. 60. - P. 678-686.

163. Pivovarova N. B., Andrews S. B. Calcium-dependent mitochondrial function and dysfunction in neurons // FEBS J. 2010. - V. 277. - P. 3622-3636.

164. Polderman K.H. Induced hypothermia and fever control for prevention and treatment of neurological injuries//Lancet. 2008, - V. 371.-P. 1955-1969.

165. Rao V. R., Finkbeine S. NMDA and AMPA receptors: old channels, new tricks // Trends in Neurosci. 2007. - V. 30, No. 6. - P. 284-291.

166. Raval A.P., Dave K.R., DeFazio R.A., Perez-Pinzon M.A. EpsilonPKC phos-phorylates the mitochondrial K+ATP channel during induction of ischemic preconditioning in the rat hippocampus // Brain Res. 2007. - Vol. 1184. - P. 345-353.

167. Reith J., Jorgensen H. S., Pedersen P. M., Nakayama H., Raaschou H. O., Jeppesen L. L., Olsen T. S. Body temperature in acute stroke: relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome // Lancet. 1996. - V. 347.-P. 422-425.

168. Rosenberg G. A. Matrix metalloproteinases in brain injury // J. Neurotrauma. 1995.-V. 12(5).-P. 833-842.

169. Rosenblum W. I. ATP-sensitive potassium channels in the cerebral circulation // Stroke.-2003.-Vol. 34.-N. 6.-P. 1547-1552.

170. Saez-Valero J., Gonzalez-Garcia C., Cena V. Acetylcholinesterase activity and molecular isoform distribution are altered after focal cerebral ischemia // Mol. Brain Res. 2003. - V. 117. - P. 240-244.

171. Saito M., Kubo K. Relationship between tissue lipid peroxidation and perox-idizabilty index after a-linolenic, eicosapentaenoic, or docosahexaenoic acid intake in rats // British J. Nutrition. 2003. - V. 89. - P. 19-28.

172. Salo D.C., Pacifici R.E., Lin S.W., Giulivi C., Davies K.J.A. Superoxide dis-mutase undergoes proteolysis and fragmentation following oxidative modification and inactivation // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265, N. 20. - P. 1191911927.

173. Salvador A., Sousa J., Pinto R.E. Hydroperoxyl, superoxide and pH gradients in the mitochondrial matrix: a theoretical assessment // Free Radic. Boil. Med. -2001.-V. 31.-P. 1208-1215.

174. Sarre S., Ebinger G., Michotte Y. Effect of resuscitative mild hypothermia on glutamate and dopamine release, apoptosis and ischaemic brain damage in the endothelin-1 rat model for focal cerebral ischaemia // J. Neurochem. 2003. -V. 87.-P. 66-75.

175. Schallreuter K.U., Elwary S.M., Gibbons N.C., Rokos H., J.M. Wood. Activation deactivation of acetylcholinesterase by H2O2: more evidence for oxidative stress in vitiligo // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 315. -P. 502-508.

176. Scheinberg P. The biologic basis for the treatment of acute stroke // Neurology.-1991.-V. 41(12).-P. 1867-73.

177. Scremin O.U., Li M.G., Scremin A.M., Jenden D.J. Cholinesterase inhibition improves blood flow in the ischemic cerebral cortex // Brain Res. Bull. -1997.-V. 42.-P. 59-70.

178. Shioda N., Fukunaga K. The functional roles of constitutively active calcineu-rin in delayed neuronal death after brain ischemia // Yakugaku Zasshi. 2011.-V. 131(1). — P. 13-20.

179. Shringarpure R., Grune T., Davies K. J. A. Protein oxidation and 20S pro-teasome-dependent proteolysis in mammalian cells // Cell. Molec. Life Sci. -2001,-V. 58.-P. 1442-1450.

180. Siesjo B.K. Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia. I. Pathophysiology // J. Neurosurg. 1992. -Vol. 77, N2.-P. 169-184.

181. Silman I., Sussman J. L. Acetylcholinesterase: How is structure related to function?//Chemico-Biol. Interact. 2008. - V. 175.-P. 3-10

182. Smith M. A., Sayre L. M., Monnier V. M., Perry G. Radical AGEing in Alzheimer's disease // Trends Neurosci. 1995. -V. 18. - P. 172-176.

183. Sribnick E.A., Del Re A.M., Ray S.K., Woodward J.J., Banik N.L. Estrogen attenuates glutamateinduced cell death by inhibiting Ca2+ influx through L-type voltage-gated Ca2+ channels // Brain Res. 2009. - V. 1276. - P. 159170.

184. Sugawara T., Fujimura M., Noshita N., Kim G.W., Saito A., Hayashi T., Narasimhan P., Maier C.M., Chan P.H. Neuronal death/survival signaling pathways in cerebral ischemia // NeuroRx. 2004. - V. 1. - P. 17-25.

185. Sun H.S., Feng Z.P., Miki T., Seino S., French R.J. Enhanced neuronal damage after ischemic insults in mice lacking kir6.2-containing ATP-sensitive K+ channels // J. Neurophysiol. 2006. - Vol. 95, N. 4. - P. 2590-2601.

186. Sussman J. L., Harel M., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L, Silman I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototype acetylcholine-binding protein // Science. 1991. - V. 253. - P. 872-879.

187. Szabo C., Ischiropoulos H., Radi R. Peroxynitrite: biochemistry, pathophysiology and development of therapeutics // Nature Reviews. 2007. - Vol. 6. -P. 662-680.

188. Szydlowska K., Tymianski M.l. Calcium, ischemia and excitotoxicity // Cell Calcium. 2010. - V. 47(2). - P. 122-129.

189. Tang X.N., Yenari M.A. Inflammation in stroke / Glia and Inflammation in Neurodegenerative Disease. Yenari M.A., Giffard R.G. (Eds.). Hauppauge:

190. Nova Science Publishers, Inc., 2006. P. 85-115.

191. Terry H.D., Rainer F. Effects of superoxide radicals of transport (Na-K) adenosine triphosphatase and protection by superoxide dismutase // Neuro-chem. Res. 1979. - V. 4, N. 1. - P. 73-82.

192. Therien A., Blostein R. Mechanisms of sodium pump regulation // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. - V. 279. - P. 541-566.

193. Tipton K.F., Houslay M.D., Turner A.J. Metabolism of aldehydes in brain // Essayas in Neurochem. Neuropharm. 1977. - V. l.-P. 103-138.

194. Van Dongen A. M. (Edit.). Biology of the NMDA Receptor. Boca Raton: CRC Press, - 2009. - 342 p.

195. Venditti P., Rosa R.D., Meo S.D. Effect of cold-induced hyperthyriodism on H202 production and susceptibility of stress conditions of rat liver mitochondria // Free Rad. Biol. Med. 2004. - V. 36, N. 3. - P. 348-358.

196. Villa R. F., Gorini A., Hoyer S. ATPases of synaptic plasma membranes from hippocampus after ischemia and recovery during ageing // Neurochem. Res. -2002.-Vol. 27, No. 9.-P. 861-870.

197. Wahl F., Obrenovitch T. P., Hardy A. M., Plotkine M., Boulu R., Symon L. Extracellular glutamate during focal cerebral ischaemia in rats: time course and calcium dependency //J. Neurochem. 1994. - V. 63. - P. 1003-1011.

198. Wang L., Zhu Q.L., Wang G.Z., Deng T.Z., Chen R., Liu M.H., Wang S.W. The protective roles of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during hypoxia-ischemia-reperfusion in brain // Neurosci Lett. 2011. - V. 491 (l).-P. 63-67.

199. Wang L.S., Yu L.J., Shao X.M. Mild hypothermia attenuates neuronal apop-tosis after cerebral hypoxia-ischemia in neonatal rats // Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2007.-V. 9(1).-P. 37-41.

200. Wang Z.F., Wang J., Zhang H.Y., Tang X.C. Huperzine A exhibits antiinflammatory and neuroprotective effects in a rat model of transient focal cerebral ischemia // J. Neurochem. 2008. - V. 106.-P. 1594-1603.

201. Warner D. S., Sheng H., Batinic-Haberle I. Oxidants, antioxidants and the ischemic brain // J. Exp. Biol. 2004. - V. 207. - P. 3221-3231.

202. Webster C. M., Kelly S., Koike M. A., Chock V., Giffard R. G., Yenari M. Inflammation and nfrcb activation is decreased by hypothermia following global cerebral ischemia//Neurobiol. Dis. 2009. - V. 33(2). - P. 301-312.

203. Weiner L., Kreimer D., Roth E., Silman I. Oxidative stress transforms acetylcholinesterase to a molten-globule-like state // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.-V. 199, No. 3.-P. 915-922.

204. Wyse S. A T, Streck E. L., Worm P., Wajner A., Ritter F., Netto C. A. Preconditioning prevents the inhibition of Na+ ,K+-ATPase activity after brain ischemia // Neurochemical Research. 2000. - V. 25, No. 7. - P. 971-975.

205. Xie Y.C, Li C.Y., Li T., Nie D.Y., Ye F. Effect of mild hypothermia on angi-ogenesis in rats with focal cerebral ischemia // Neurosci Lett. 2007. - V. 422 (2).-P. 87-90.

206. Xiong M., Yang Y., Chen G.Q., Zhou W.H. Post-ischemic hypothermia for 24h in P7 rats rescues hippocampal neuron: association with decreased astrocyte activation and inflammatory cytokine expression // Brain Res Bull. -2009.-V. 79(6).-P. 351-357.

207. Yanagawa Y., Kawakami M., Okada Y. Moderate hypothermia alters inter-leukin-6 and interleukin- 1 alpha reactions in ischemic brain in mice // Resuscitation. 2002. - V. 53. - P. 93-99.

208. Yenari M., Kitagawa K., Lyden P., Perez-Pinzon M. Metabolic downregula-tion a key to successful neuroprotection? // Stroke. 2008. - V. 39. - P. 29102917.

209. Zhang F., Casey R.M., Ross M.E., Iadecola C. Aminoguanidine ameliorates and L-arginine worsens brain damage from intraluminal middle cerebral artery occlusion // Stroke. 1996. - Vol. 27. - P. 317-323.

210. Zhang Z., Sobel R. A., Cheng D., Steinberg G. K., Yenari M. A. Mild hypothermia increases Bcl-2 protein expression following global cerebral ischemia // Brain Res. Mol. Brain Res 2001. - V. 95. - P. 75-85.

211. Zhanga J.-Y., Jianga H., Gaoa W., Wua J., Penga K., Shib Y.-F. , Zhanga X.-J. The JNK/AP1/ATF2 pathway is involved in H202-induced acetylcholinesterase expression during apoptosis // Cell. Mol. Life Sci. 2008. - V. 65. - P. 1435-1445.

212. Zhao H., Steinberg G. K., Sapolsky R. M. General versus specific actions of mild-moderate hypothermia in attenuating cerebral ischemic damage // J. Cerebral Blood Flow Metab. 2007. - V. 27. - P. 1879-1894.

213. Zheng Z., Yenari M.A. Post-ischemic inflammation: molecular mechanisms and therapeutic implications // Neurol. Res. 2004. - V. 26(8). - P. 884-892.

214. Zhou L., Zhu D.Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications // Nitric Oxide. 2009. - V. 20(4).-P. 223-230.

215. Zimmerman G., Soreq H. Termination and beyond: acetylcholinesterase as a modulator of synaptic transmission // Cell Tissue Res. 2006. - V. 326. - P. 655-669.

216. Zimmermann H. ATP and acetylcholine, equal brethren // Neurochem. Intl. -2008.-V. 52.-P. 634-348.

217. Zipfel G.J., Lee J.M., Choi D.W. Reducing calcium overload in the ischemic brain // New England J. Med. 1999. - V. 341 (20). - P. 1543-1544.

Информация о работе

Мохаммед Мустафа Таха
кандидата биологических наук
Махачкала, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Влияние гипотермии и даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при ишемии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние гипотермии и даларгина на активность Na, К-АТФазы и ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при ишемии - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы