Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях"

На правах рукописи

005001150

Матхкур Тикра Хасан

Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях

Специальность 03.01.04 - биохимия

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Воронеж-2011

005001150

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мейланов Иззет Сиражудинович доктор биологических наук, профессор Наквасина Марина Александровна

кандидат биологических наук Семёнова Елена Васильевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « 9 » декабря 2011 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл. 1. /

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан « у/ » ноября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Ацетилхолинэстераза - фермент, выполняющий важную функцию в нервной системе млекопитающих. Он непосредственно участвует в передаче информации между нервными клетками, а также своей активностью влияет на взаимодействие удалённых друг от друга нейронов. При изменении физиологических условий в мозге, например, при гипотермии, ишемии или гипоксии активность фермента изменяется. Эти изменения могут отражать как проявление процессов адаптации к новым условиям, так и патологические процессы, вызванные действием экстремального фактора. Выяснение механизмов изменений активности этого важного фермента при различных физиологических состояниях является актуальной проблемой молекулярной физиологии. Обычно для оценки того, что происходит в клетках ткани того или иного органа при изменениях физиологических процессов измеряют активности соответствующих ферментов, обеспечивающих данный физиологический процесс. Однако чаще всего этой информации бывает недостаточно для получения ясной картины происходящего. Измерение кинетических и термодинамических характеристик ферментов может дать ценную информацию для выяснения сложных механизмов ответной реакции клеток на изменение состояния клеток. В настоящей работе исследованы кинетические характеристики, а также кинетика тепловой денатурации ацетил-холинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при общей гипотермии. Исследована также тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в динамике зимней спячки.

Цель и задачи. Целью данной работы было выяснение изменений кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга при искусственных (крысы) и естественных (суслики, зимняя спячка) гипотермических состояниях. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. исследовать концентрационные зависимости активности фермента из мозга крыс при различных искусственно созданных гипотермических состояниях,

2. исследовать кинетику тепловой денатурации фермента при различных гипотермических состояниях,

3. исследовать влияние глицерина на термоденатурацию ацетилхолинэстеразы из мозга крыс,

4. исследовать тепловую денатурацию ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке.

Положения, выносимые на защиту.

1. кинетические характеристики активности ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях изменяются: максимальная скорость и константа Михаэлиса увеличиваются.

2. кинетика термоденатурации ацетилхолинэстеразы из мозга крыс и из мозга сусликов имеет две стадии - быструю и медленную - и хорошо соответствует модели двух экспонент

3. термостабильность ацетилхолинэстеразы из мозга крыс при гипо-термических состояниях уменьшается: константы скорости денатурации увеличиваются

4. активность ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в состоянии глубокой спячки увеличивается по сравнению с летним контролем, а при межбаутном пробуждении уменьшается по сравнению с летним контролем

5. термостабильность ацетилхолинэстеразы мембран мозга сусликов как в бауте глубокой спячки, так и при межбаутном пробуждении выше, чем в летнем контроле: константы скорости денатурации уменьшаются, энергии активации увеличиваются.

Научная новизна и значимость работы. Впервые исследованы кинетические и термодинамические характеристики ацетилхолинэстеразы, а также кинетика тепловой денатурации синаптических мембран мозга крыс при различных гипотермических состояниях. Впервые исследована тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в динамике зимней спячки.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для анализа экспериментальных данных по регуляции активности ацетилхолинэстеразы в мозге млекопитающих при различных физиологических состояниях организма. Они могут быть использованы для построения теории функционирования мозга млекопитающих при гипобиотических состояниях.

Апробация работы. Работа апробирована на Всероссийской конференции, посвященной 80-летию проф. Юсуфова А.Г. (Махачкала, 2010), Конференции молодых учёных ДГУ (Махачкала, 2010), Региональной научно-практической конференции, посвящённой году учителя в России (Махачкала, 2010), 13-той Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2009), 15-той Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2011), на годичной научной сессии профессорско-преподавательского состава ДГУ (апрель 2011).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 277 источников. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 6 таблиц. Опыты проведены на 75 крысах и 16 сусликах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе обобщены литературные данные по структуре, механизму катализа и функциям ацетилхолинэстеразы в мозге млекопитающих. Во второй главе описаны материалы и методы исследования. В третьей главе приведены результаты исследования и их обсуждение. Животные. Опыты проведены на 75 половозрелых нелинейных лабораторных белых крысах-самцах массой 150-180 г и 12 кавказких сусликах (Sper-mophilus pygmaeus Pall) обоего пола массой 200-250 г, содержавшихся в условиях вивария на полном пищевом рационе.

Искусственную гипотермию у крыс создавали в специальных камерах, в «рубашке» которых циркулировала холодная вода. По достижении необходимой температуры тела животных декапитировали и брали ткань мозга для исследования.

Синаптические мембраны из коры мозга выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Активность ацетилхолинэстеразы определяли методом Эллмана с ацетил-тиохолином в качестве субстрата.

Термоденатурация ацетилхолинеэстеразы проводилась в фосфатном буфере рН 8.0 при различных температурах инкубации.

Зимняя спячка. Сусликов, отловленных в окрестностях г. Махачкала летом, содержали в стеклянных баллонах с подстилкой из древесных опилок в виварии. Часть этих животных была взята в опыт летом. Другая часть отловленных животных осенью (в ноябре) была помещена в неотапливаемое тёмное помещение. По достижении необходимого состояния животных брали в эксперимент.

Исследовали животных в следующие сроки:

1. Летний бодрствующий контроль (температура тела 37-38°С)

2. Через 1 месяц с момента впадения в спячку, баут глубокого оцепенения (температура тела 7-10°С);

3. Через 1 месяц с момента впадения в спячку, межбаутное пробуждение (температура тела 30-34°С);

Статистический анализ данных. Достоверность различия средних определяли с помощью критерия Стьюдента [Лакин, 1990]. Каждая кривая на графиках концентрационной зависимости скорости гидролиза АТХ и кинетики термоденатурации АХЭ есть среднее 4-5-ти независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

^Концентрационная зависимость активности АХЭ синаптических мембран мозга.

На Рис.1(а) приведены графики концентрационной зависимости активности АХЭ синаптических мембран мозга крыс в контроле. Кривые имеют характерную колоколообразную форму, свидетельствующую о наличии субстратного ингибирования (СИ). Простейшая схема СИ с одним ингибитор-ным местом связывания имеет следующий вид

где Е - фермент, 5 - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс, SES -двойной фермент субстратный комплекс, Р - продукт, а над стрелками указаны соответствующие константы скорости реакции.

Этой схеме соответствует кинетическое уравнение Холдейна

Е + S

ES- -2—► Е + Р

*_3î4 v

SES

{1}

VJ

(1)

K^S+S'IK,

где V- скорость реакции, Ут - максимальная скорость, Кт - константа Миха-элиса, К; - константа субстратного ингибирования, 8 - концентрация субстрата.

Кссрсь

\

: / \ \

; / \

;/ \ \

/ \

-1 1 3

¡гцогтмвя!

(а)

ГшгкршЙ'С

| : : ;

; t

; /N :

■ / \

н ■ X

/ i \:

/' ■ ; \;

/ : \

/ Т : Т

¡сежя^Н cjfcpQifjO (б)

Гшстчко ЗС'СЗбчян. ГгочадЭЙУг

ростра fci^EpsmafapsBioiii

(в) (г)

Рис.1 Концентрационная зависимость скорости гидролиза АТХ АХЭ синап-тических мембран мозга крыс, (а) контроль, (б) гипотермия 20 С, (в) гипотермия 30 °С,30 мин., (г) гипотермия 30 °С,3 часов.

Экспериментальные данные хорошо описываются уравнением Холдей-на. Кинетические характеристики АХЭ синаптических мембран мозга крыс суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Кинетические параметры АХЭ мембран синаптосом коры мозга крысы в контроле, при гипотермии 30 °С,30 мин., 30 °С,3 часа и 20°С.

V т шах мкмоль/мг/мин кш мМ К1 мМ

Контроль 63.25 ± 2.3 0.0342 ± 0.009 29.10 ± 2.6

Гипотермия 30 "С,30 мин. 99.26 ± 7.8* 0.0794 ± 0.005* 10.51 ± 0.7*

Гипотермия 30 °С,Зч. 130.91 ±7.2* 0.2014 ± 0.038* 10.675 ± 3.1*

Гипотермия 20 °С 101.20 ±11.5* 0.1072 ± 0.038* 32.13 ± 5.3

Примечание: * - означает достоверность различий при р<0.05

Видно, что максимальная скорость и эффективная константа Михаэли-са при различных гипотермических состояниях закономерно изменяются. Причём между этими важнейшими характеристиками фермента имеется линейная корреляция (рис.2). Обе величины возрастают при гипотермических состояниях. При этом отношение Ушах/Кт при умеренной кратковременной гипотермии увеличивается, а при умеренной пролонгированной гипотермии уменьшается. Отношение Ушах/Кш определяет каталитическую активность фермента при низких (меньше константы Михаэлиса) концентрациях субстрата. Таким образом, кратковременная гипотермия увеличивает активность фермента при физиологических концентрациях субстрата, а пролонгирование гипотермии приводит к её снижению.

0,22 0,20 : 0,18 0,16 0,14 ^ ¿,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02

60 70 80 90 100 110 120 . 130 140

V так

Рис.2. Корреляция между максимальной скоростью и константой Михаэлиса , при различных физиологических состояниях крыс.

2. Термоденатурция АХЭ синаптических мембран мозга крыс.

На рис.3 приведена кинетическая кривая тепловой денатурации АХЭ при температуре инкубации 48°С в координатах ^(Ао/А^ -1, где Ао- исходная активность фермента, А, - активность фермента в данный момент времени, I - время инкубации. Видно, что эта зависимость нелинейна. Это говорит о том, что кинетика денатурации имеет, как минимум, две стадии.

Рис.3. Кинетическая кривая тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при температуре инкубации 48°С (контроль). По оси абсцисс - время в минутах, по оси ординат - ^(Ао/А().

Нелинейность кинетики денатурации в простейшем случае может быть обусловлена двухстадийностью процесса денатурации белка:

И-^Х^Э {2}

где И, X и Б - нативная, промежуточное состояние и денатурированная формы фермента соответственно.

Математическая модель, соответствующая этой схеме, имеет вид

где А0 - начальная активность фермента, А, - активность в момент времени I, к] и к2 - константы скорости денатурации для быстрой и медленной стадий, I - время денатурации, 0>р>1 - относительная активность промежуточной формы по сравнению с нативной формой, активность которой принята равной 1.

Такая же кинетика соответствует и параллельной схеме с двумя натив-ными состояниями, денатурирующими с разными константами скорости

где а и Ъ - начальные доли двух нативных (N1, Л';) форм, (а + Ь = 1).

{3}

где N1, Ы2- нативные состояния.

Этой схеме соответствует уравнение

Однако поскольку в литературе отсутствуют данные о наличии в мозге крыс двух тетрамерных изоформ АХЭ, экспериментальные данные нами обработаны в соответствии с последовательной схемой денатурации.

(а) (б)

Рис.4 Кинетические кривые термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при разных температурах инкубации, (а) Контроль, (б) в присутствии 2% глицерина.

На рисунках 4(а и б) приведены кривые кинетики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных температурах инкубации. Добавление глицерина к среде инкубации приводит к стабилизации АХЭ при относительно невысоких температурах. Однако при 52°С глицерин уже не стабилизирует АХЭ (табл.2).

Таблица 2. Кинетические характеристики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс без глицерина и в присутствии 2% глицерина в

А ^.^(ехре^О-ехре^г)) соответствии с уравнением — = ехр(-к^)+-

А0 *1-*2

Условия денатурации Константы Температура инкубации (°С)

42 44 46 48 52

Контроль к! (мин"1) 0.4530 0.4840 0.5680 0.6740 0.7020

Глицерин (2%) 0.1260 0.2340 0.2190 0.5270 0.7460

Контроль к2 (мин1) 0.0177 0.0201 0.0268 0.0501 0.0897

Глицерин (2%) 0.0072 0.0127 0.0217 0.0266 0.0930

Контроль р 0.7820 0.6590 0.6350 0.5500 0.4370

Глицерин (2%) 0.5860 0.5970 0.7090 0.7220 0.4690

На рисунках 5 и 6 приведены зависимости констант скорости денатурации АХЭ в Аррениусовских координатах.

3,10 3.12 3.« 3.16 З.Ш

!(Ю0/Г

(а) (б)

Рис. 5. Аррениусовские графики температурной зависимости константы скорости денатурации (а) быстрой и (б) медленной стадии. Контроль.

Контроль

Рис.6. Аррениусовские графики температурной зависимости константы скорости денатурации (а) быстрой и (б) медленной стадий. Глицерин.

Соответствующие энергии активации приведены в таблице 3.

Таблица 3. Энергии активации быстрой и медленной стадий кинетики денатурации АХЭ синаптических мембран в контроле и при 2%-ой концентрации глицерина.

Условия денатурации Энергия активации кДж/моль

быстрая стадия медленная стадия

Контроль 108 ± 31 144 ± 17

Глицерин (п=4) 151+27 210 ± 15 Р<0.01

Примечание: в скобках указано число животных в выборке.

Исходя из полученных данных, можно предложить следующую схему процесса термоденатурации АХЭ.

Координата денатурации АХЭ

Рис. 7. Схема процесса денатурации АХЭ

На этой схеме Ы, X и Б - соответственно нативное, промежуточное и денатурированное состояния фермента, ДЕ! и ДЕ2 - энергии активации переходов К->Х и X—>Э соответственно.

3. Влияние гипотермин на термостабильность АХЭ синаптиче-ских мембран мозга крыс.

В таблице 4 приведены константы скорости денатурации двух стадий АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных температурах денатурации и при различных гипотермических состояниях. Видно, что увеличение температуры денатурации в диапазоне 40-46°С ускоряет процесс денатурации (увеличивает константы скорости денатурации обеих стадий). То же наблюдается при глубокой гипотермии 20°С. Однако при умеренной кратковременной и пролонгированной гипотермии 30°С температураня зависомсть процесса термоденатурации сложнее. Параметр (3 при глубокой гипотермии закономерно увеличивается при увеличении температуры инкубации. В контроле, напротив, при высоких температурах наблюдается тенденция к снижению параметра р. Изменение параметра р с температурой, возможно, связано с тем, что траектории перехода из нативного состояния в денатурированное при разных температурах отличаются. То есть, промежуточное состояние при разных температурах денатурации имеет разную структуру, а, следовательно, и разную активность.

На рис.8 приведены кривые кинетики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных гипотермических состояниях (температура инкубации 40°С. Хорошо видно, что глубокая гипотермия и пролонгированная умеренная гипотермия дестабилизируют структуру АХЭ. Кратковременная умеренная гипотермия существенно не повлияла на кинетику термоденатурации АХЭ.

Таблица 4. Кинетические характеристики термоденатурации АХЭ синапти-ческих мембран мозга крыс при различных температурах инкубации и гипо-термических состояниях в соответствии с уравнением

Л р-к, (ехрС-М-ехрС-^О)

= ехр(-^г)+—1-6-

А0 к\~к2

Состояние животного Константы Температура инкубации ("С)

40 43 46 49

Контроль к! (мин"1) 0,0829 + 0,038 0,5448 ± 0,218 0,6866 ± 0,237 0,4202 + 0,113

Гипотермия 30° С, 30 мин. 0,1840 ± 0,025 0,2791 ± 0,050 0,1432 ± 0,018 0,2048 ± 0,020

Гипотермия 30 "с Зч. 0,4161 ± 0,203 0,1765 ± 0,121 0,1445 ± 0,016 0,2332 + 0,032

Гипотермия 20 °С 0,1316 + 0,025 0,4317 + 0,074 0,9528 ± 0,404 2,2613 ± 0,358

Контроль к2 (мин1) 0,0037 ± 0,001 0,0124 ± 0,0006 0,0159 ± 0,0006 0,0158 + 0,001

Гипотермия 30 "с, 30 мин. 0,0101 + 0,001 0,0124 ± 0,0005 0,0092 ±0,001 0,0145 + 0,001

Гипотермия 30 °С,Зч. 0,0060 ± 0,0003 0,0093 ± 0,001 0,0083 ± 0,001 0,0086 + 0,002

Гипотермия 20 "С 0,0071 + 0,001 0,0129 ± 0,0006 0,0198 ± 0,001 0,0421 ±0,004

Контроль р 0,8231 ± 0,061 0,8712 ± 0,019 0,8599 ± 0,017 0,7224 ± 0,030

Гипотермия 30 0С,30 мин. 0,6692 + 0,026 0,8045 ± 0,018 0,6270 ± 0,030 0,5751 + 0,025

Гипотермия 30 °С,Зч. 0,9364 ± 0,013 0,8294 ±0,075 0^931 ± 0,028 0,5210 ±0,035

Гипотермия 20 °С 0,7037 ± 0,036 0,7609 ± 0,016 0,8096 ± 0,024 0,8186 ± 0,058

Рис. 8. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при температуре денатурации 40°С .

При высокой температуре инкубации кинетика денатурации в контроле и при гипотермических состояниях примерно одинакова (рис.9).

время (мин.) Хч Гипотермия 30 0С.З ч.

Контроль

Рис. 9. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при температуре денатурации 46°С .

4. Термостабильность АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке

В таблице 5 приведены данные по активности АХЭ синаптических мембран нейронов мозга сусликов в динамике зимней спячки. Видно, что в состоянии глубокого оцепенения активность АХЭ заметно превышает контрольное значение (летние бодрствующие животные). При межбаутном пробуждении, когда температура тела близка к норме, активность АХЭ снижается. Пробуждение требует, по-видимому, активации холинергических механизмов. Поэтому активность АХЭ снижается.

Таблица 5. Активность АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при

Состояние животного Активность АХЭ (мкмоль/час на 1 мг белка)

Летний контроль 44.05 ± 0.90

Баут глубокой спячки 49.68 ± 0.97 Р<0.005

Межбаутное пробуждение 40.47 ± 0.29 Р<0.007

Примечание: указана достоверность различий по отношению к контролю.

На рис.10 приведены кривые термоденатурации АХЭ синаптических мембран нейронов мозга сусликов в динамике зимней спячки. Анализ кривых показывает, что в период спячки константы скорости денатурации АХЭ уменьшаются. Это означает, что структура АХЭ при спячке стабилизируется. Несмотря на то, что при межбаутном пробуждении активность АХЭ существенно снижается по сравнению с баутом глубокой спячки, термостабильность АХЭ не изменилась (таблица 6). Это говорит о том, что активность АХЭ во время спячки регулируется автономным механизмом, отдельным от механизма стабилизации. Обращает на себя внимание и тот факт, что параметр р во время спячки также уменьшается. Это говорит о том, что активность промежуточной формы при спячке снижается в большей степени, чем нативной формы. Действительно, отношение константы скорости термоденатурации нативной формы (кО в контроле к той же константе в бауте глубокой спячки равно 1.283, а отношение констант скорости термоденатурации промежуточной формы (к2) составляет 1.428. При межбаутном пробуждении эти отношения равны соответственно 2.335 и 4.444. Параметр Р уменьшается в бауте глубокой спячки в 1.429 раза, а при межбаутном пробуждении в 1.694 раза. Таким образом, промежуточное состояние стабилизируется при спячке

сильнее, чем нативное, а поскольку между стабильностью и активностью имеет место отрицательная корреляция, параметр р при спячке уменьшается.

Рис. 10. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга сусликов: о- контроль, □- баут глубокой спячки, 0- межбаутное пробуждение.

Таблица. 6. Кинетические характеристики тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга суслика при зимней спячке и при пробуждении (п = 4-5).

Состояние животного Параметры регрессионного уравнения А _ехр( ^ , /Н (ехр(-*,/)-ехр(-*,')) о к^

к! (мин"1) к 2 (мин'1) Р

Контроль 0.376±0.09 0.040±0.003 0.649Ю.055

Спячка 0.293+0.03 0.028±0.004* 0.454Ю.038*

Пробуждение 0.161+0.01* 0.009 +0.003' 0.383 ±0.030*

Примечание: * - Р<0.05 по отношению к контролю.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами исследованы кинетические и термодинамические характеристики ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс и сусликов при разных гипотермических состояниях. В контроле кинетические характеристики АХЭ из мозга сусликов и крыс близки друг другу. У сусликов активность АХЭ (в расчёте на белок) синаптических мембран нейронов мозга на 26% выше, чем у крыс. Это может быть связано с тем, что суслики являются гетеротермами. Температура тела у них гомеостатирована не так строго как у настоящих гомойотермов. И они могут использовать свою способность снижать температуру тела для сохранения энергетических запасов. Торпид-ные состояния требуют для своего поддержания, чтобы уровень возбудимости нейронов головного мозга был низкий. Поэтому при зимней спячке или суточном оцепенении уровень ацетилхолина в мозге должен быть достаточно низким. Ацетилхолинэстераза может играть важную роль в поддержании низкой концентрации ацетилхолина в экстраклеточном пространстве головного мозга. Повышение активности ацетилхолинэстеразы, при прочих равных условиях, должно снизить концентрацию ацетилхолина в экстраклеточном пространстве. Напротив, состояние бодрствования требует активации нейронов головного мозга. Поэтому в состоянии бодрствования активность ацетилхолинэстеразы должна быть меньше.

При гипотермии активность АХЭ синаптических мембран мозга крыс увеличивается. Можно предположить, что снижение температуры тела приводит к снижению производства АТФ в клетках. В ответ на дефицит энергии включается механизм снижения потребности в энергии. Для этого нужно снизить возбудимость нейронов, чтобы энергия не тратилась на восстановление ионных градиентов после прохождения потенциалов действия и постси-наптических потенциалов. Повышение активности АХЭ, снижая концентрацию ацетилхолина, должно способствовать сохранению энергии в нейронах мозга.

Механизм изменений активности АХЭ при изменениях физиологического состояния организма не вполне ясен. Исследование влияния гипотермии на термостабильность АХЭ синаптических мембран показало, что при гипотермии термостабильность АХЭ уменьшается. Константы скорости денатурации возрастают. Это означает, что структура АХЭ становится более подвижной.

Исследование термостабильности АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке показало, что термостабильность при погружении в глубокую спячку сопровождается увеличением активности АХЭ и увеличением её термостабильности. Спячка сусликов отличается от состояния искусственной гипотермии крыс тем, что спячка - эволюционная адаптация гетеротермов, а искусственная гипотермия - это экстремальное состояние гомойотермного организма. Может быть, поэтому увеличение активности АХЭ при низкой температуре тела у сусликов сопровождается повышением термостабильности, а повышение активности АХЭ у крыс при искусственной

гипотермии сопровождается уменьшением термостабильности. Отсюда следует важный вывод, что активность фермента и его термостабильность могут регулироваться в мозге отдельно друг от друга.

ВЫВОДЫ

1. Кратковременная гипотермия 30°С достоверно увеличивает максимальную скорость (Уга) и константу Михаэлиса (Кш) ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс. При этом константа субстратного ингибирования (К;) также увеличивается.

2. Пролонгирование гипотермии 30°С в течение 3 часов приводит к дальнейшему увеличению Ут и Кт, а константа субстратного ингибирования остается такой же, как и при кратковременной гипотермии.

3. Глубокая гипотермия 20°С приводит к достоверному увеличению Ут и Кт по сравнению с интактным контролем, при этом константа субстратного ингибирования остается на уровне контроля.

4. Имеет место линейная корреляция (г=0.955) между Ут и Кт при разных температурах тела животного.

5. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс имеет две стадии - быструю и медленную. Экспериментальные данные хорошо согласуются со схемой трех состояний: нативное —»промежуточное —> денатурированное, - которой соответствует математическая модель суммы двух экспонент.

6. Константа скорости денатурации быстрой стадии примерно в 10 раз больше, чем медленной.

7. Глицерин в концентрации 2% заметно уменьшает константы скорости денатурации обеих стадий в диапазоне температур инкубации 42-50°С. При температуре инкубации 52°С кинетика термоденатурации в контроле и при добавлении глицерина примерно одинакова.

8. Энергия активации быстрой стадии денатурации меньше энергии активации медленной стадии. Глицерин (2%) увеличивает энергии активации обеих стадий.

9. Параметр [3 (отношение активности промежуточной формы к активности нативного состояния) в контроле уменьшается при увеличении температуры инкубации. В присутствии глицерина наблюдается увеличение этого параметра с повышением температуры.

10. Пролонгированная гипотермия 30°С и кратковременная гипотермия 20 С приводят к увеличению констант скорости денатурации АХЭ по сравнению с контролем при температуре инкубации 40°С. При более высоких температурах инкубации эффекты гипотермии уменьшаются.

11. Кинетика термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга сусликов сходна с таковой для крыс. В состоянии глубокой спячки термостабильность АХЭ увеличивается и остается таковой при межбаутном пробуждении.

12. Активность АХЭ при глубокой спячке выше, чем в летнем контроле. При межбаутном пробуждении активность АХЭ падает ниже уровня летнего контроля.

Основные публикации по теме диссертации

1 .Тикра М.Х., Джафарова А.М., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран из мозга крыс//Вестник ДГУ. 2011. Вып. 1. С. 107-112.

2. Тикра М.Х., Джафарова A.M., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях//Вестник ДГУ. 2011. Вып.1. С. 147-150.

3.Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M., Тикра М.Х. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы мембран мозга сусликов при зимней спячке// Нейрохимия. 2010,- Т.27. №4. -С.280-285.

4.Джафарова A.M., Гусейнова 3., Тикра Матхкур Хасан Особенности структуры и функций ацетилхолинэстеразы//Биология, Экология, Охрана окружающей среды. Сборник статей студентов, аспирантов, преподавателей. Махачкала. 2010. С.67-80.

5.Тикра М.Х., Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран из мозга крыс//Материалы Всероссийской конференции, посвященной 80-летию проф. А.Г.Юсуфова. Махачкала. 2010. - С.312-315.

6.Тикра М.Х. Влияние глицерина на кинетику тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из мозга крыс//Труды молодых учёных ДГУ. Махачкала. Издательство ДГУ. 2010- С.17-18.

7. Джафарова A.M., Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Матхкур Т.Х. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран из мозга крыс и сусликов//13-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. Пущино. 2009. - С.137-138.

8. Тикра М.Х., Джафарова А.М., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Термоденатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс//15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. Пущино. 2011. - С.117.

9. Джафарова A.M., Мейланов И.С. Кличханов Н.К., Тикра М.Х. Исследование тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке//15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. Пущино. 2011. - С.128.

Статьи № 1-3 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Бумага №1. Гарнитура «Тайме» Усл. печ.л - 1,5. Заказ № 1012. Тираж 150

Отпечатано в типографии "Радуга-1" г. Махачкала, ул. Коркмасова, 11 "а"