Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях

Матхкор Тхикра Хасан

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях"

На правах рукописи

Матхкор Тхикра Хасан

Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях

Специальность 03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж-2011

005015062

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Мейланов Иззет Сиражудинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Наквасина Марина Александровна

Защита состоится « 9 » декабря 2011г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

кандидат биологических наук Семёнова Елена Васильевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « ноября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Ацетилхолинэстераза - фермент, выполняющий важную функцию в нервной системе млекопитающих. Он непосредственно участвует в передаче информации между нервными клетками, а также своей активностью влияет на взаимодействие удалённых друг от друга нейронов. При изменении физиологических условий в мозге, например, при гипотермии, ишемии или гипоксии активность фермента изменяется. Эти изменения могут отражать как проявление процессов адаптации к новым условиям, так и патологические процессы, вызванные действием экстремального фактора. Выяснение механизмов изменений активности этого важного фермента при различных физиологических состояниях является актуальной проблемой молекулярной физиологии. Обычно для оценки того, что происходит в клетках ткани того или иного органа при изменениях физиологических процессов измеряют активности соответствующих ферментов, обеспечивающих данный физиологический процесс. Однако чаще всего этой информации бывает недостаточно для получения ясной картины происходящего. Измерение кинетических и термодинамических характеристик ферментов может дать ценную информацию для выяснения сложных механизмов ответной реакции клеток на изменение состояния клеток. В настоящей работе исследованы кинетические характеристики, а также кинетика тепловой денатурации ацетил-холинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при общей гипотермии. Исследована также тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в динамике зимней спячки.

Цель и задачи. Целью данной работы было выяснение изменений кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга при искусственных (крысы) и естественных (суслики, зимняя спячка) гипотермических состояниях. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. исследовать концентрационные зависимости активности фермента из мозга крыс при различных искусственно созданных гипотермических состояниях,

2. исследовать кинетику тепловой денатурации фермента при различных гипотермических состояниях,

3. исследовать влияние глицерина на термоденатурацию ацетилхолинэстеразы из мозга крыс,

4. исследовать тепловую денатурацию ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке.

Положения, выносимые на защиту.

1. кинетические характеристики активности ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях изменяются: максимальная скорость и константа Михаэлиса увеличиваются.

2. кинетика термоденатурации ацетилхолинэстеразы из мозга крыс и из мозга сусликов имеет две стадии - быструю и медленную - и хорошо соответствует модели двух экспонент

3. термостабильность ацетилхолинэстеразы из мозга крыс при гипо-термических состояниях уменьшается: константы скорости денатурации увеличиваются

4. активность ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в состоянии глубокой спячки увеличивается по сравнению с летним контролем, а при межбаутном пробуждении уменьшается по сравнению с летним контролем

5. термостабильность ацетилхолинэстеразы мембран мозга сусликов как в бауте глубокой спячки, так и при межбаутном пробуждении выше, чем в летнем контроле: константы скорости денатурации уменьшаются, энергии активации увеличиваются.

Научная новизна и значимость работы. Впервые исследованы кинетические и термодинамические характеристики ацетилхолинэстеразы, а также кинетика тепловой денатурации синаптических мембран мозга крыс при различных гипотермических состояниях. Впервые исследована тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в динамике зимней спячки.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для анализа экспериментальных данных по регуляции активности ацетилхолинэстеразы в мозге млекопитающих при различных физиологических состояниях организма. Они могут быть использованы для построения теории функционирования мозга млекопитающих при гипобиотических состояниях.

Апробация работы. Работа апробирована на Всероссийской конференции, посвященной 80-летию проф. Юсуфова А.Г. (Махачкала. 2010), •Конференции молодых учёных ДГУ (Махачкала, 2010), Региональной научно-практической конференции, посвященной году учителя в России (Махачкала, 2010), 13-той Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2009), 15-той Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2011), на годичной научной сессии профессорско-преподавательского состава ДГУ (апрель 2011).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 277 источников. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 6 таблиц. Опыты проведены на 75 крысах и 16 сусликах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе обобщены литературные данные по структуре, механизму катализа и функциям ацетилхолинэстеразы в мозге млекопитающих. Во второй главе описаны материалы и методы исследования. В третьей главе приведены результаты исследования и их обсуждение. Животные. Опыты проведены на 75 половозрелых нелинейных лабораторных белых крысах-самцах массой 150-180 г и 12 кавказких сусликах (Sper-mophilus pygmaeus Pall) обоего пола массой 200-250 г, содержавшихся в условиях вивария на полном пищевом рационе.

Искусственную гипотермию у крыс создавали в специальных камерах, в «рубашке» которых циркулировала холодная вода. По достижении необходимой температуры тела животных декапитировали и брали ткань мозга для исследования.

Синаптические мембраны из коры мозга выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Активность ацетилхолинэстеразы определяли методом Эллмана с ацетил-тиохолином в качестве субстрата.

Термоденатурация ацетилхолинеэстеразы проводилась в фосфатном буфере рН 8.0 при различных температурах инкубации.

Зимняя спячка. Сусликов, отловленных в окрестностях г. Махачкала летом, содержали в стеклянных баллонах с подстилкой из древесных опилок в виварии. Часть этих животных была взята в опыт летом. Другая часть отловленных животных осенью (в ноябре) была помещена в неотапливаемое тёмное помещение. По достижении необходимого состояния животных брали в эксперимент.

Исследовали животных в следующие сроки:

1. Летний бодрствующий контроль (температура тела 37-38°С)

2. Через I месяц с момента впадения в спячку, баут глубокого оцепенения (температура тела 7-10°С);

3. Через 1 месяц с момента впадения в спячку, межбаутное пробужде-

ние (температура тела 30-34°С); Статистический анализ данных. Достоверность различия средних определяли с помощью критерия Стьюдента [Лакин, 1990]. Каждая кривая на графиках концентрационной зависимости скорости гидролиза АТХ и кинетики термоденатурации АХЭ есть среднее 4—5-ти независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

І.Концентрационная зависимость активности АХЭ синаптических мембран мозга.

На Рис.1 (а) приведены графики концентрационной зависимости активности АХЭ синаптических мембран мозга крыс в контроле. Кривые имеют характерную колоколообразную форму, свидетельствующую о наличии субстратного ингибирования (СИ). Простейшая схема СИ с одним ингибитор-ным местом связывания имеет следующий вид

Е + S

=> ES--г—, Е + Р

_3ti k3s SE S

{1}

где E - фермент, S - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс, SES -двойной фермент субстратный комплекс, Р - продукт, а над стрелками указаны соответствующие константы скорости реакции.

Этой схеме соответствует кинетическое уравнение Холдейна

К- (,)

K^+S+S2/^ 1 '

где V- скорость реакции, Ут - максимальная скорость, Кт - константа Миха-элиса, К; - константа субстратного ингибирования, Б - концентрация субстрата.

Кжтрсл

Гшифи 20 ®С

\ i »яря я&фш ¡aii)

(a)

(6)

304r.se*

Гишгрюа ЗО^г

СпрЮк

•1 1

Сорю»

(В)

(Г)

Рис.1 Концентрационная зависимость скорости гидролиза АТХ АХЭ синап-тических мембран мозга крыс, (а) контроль, (б) гипотермия 20°С, (в) гипотермия 30 °С,30 мин., (г) гипотермия 30 °С,3 часов.

Экспериментальные данные хорошо описываются уравнением Холдей-на. Кинетические характеристики АХЭ синаптических мембран мозга крыс суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Кинетические параметры АХЭ мембран синаптосом коры мозга крысы в контроле, при гипотермии 30 °С,30 мин., 30 °С,3 часа и 20°С.

V * max мкмоль/мг/час кт мМ K¡ мМ

Контроль 63.25 ± 2.3 0.0342 ± 0.009 29.10 ± 2.6

Гипотермия 30 "Совмин. 99.26 ± 7.8* 0.0794 ± 0.005* 10.51 ± 0.7*

Гипотермия 30 °C¿4. 130.91 ±7.2* 0.2014 ± 0.038* 10.675 ± 3.1*

Гипотермия 20Х: 101.20 ± 11.5* 0.1072 ± 0.038* 32.13 ± 53

Примечание: * - означает достоверность различий при р<0.05

Видно, что максимальная скорость и эффективная константа Михаэли-са при различных гипотермических состояниях закономерно изменяются. Причём между этими важнейшими характеристиками фермента имеется линейная корреляция (рис.2). Обе величины возрастают при гипотермических состояниях. При этом отношение Утю/Кто при умеренной кратковременной гипотермии увеличивается, а при умеренной пролонгированной гипотермии уменьшается. Отношение Vm^Kn, определяет каталитическую активность фермента при низких (меньше константы Михаэлиса) концентрациях субстрата. Таким образом, кратковременная гипотермия увеличивает активность фермента при физиологических концентрациях субстрата, а пролонгирование гипотермии приводит к её снижению.

0.22 0.20 0.18 0,16 0,14 v| 0.12 о.ю 0,08 0,06 0,04 0.02

60 70 80 90 100 110 120 130 140

У max

Рис.2. Корреляция между максимальной скоростью и константой Михаэлиса при различных физиологических состояниях крыс.

2. Термоденатурция АХЭ синаптических мембран мозга крыс.

На рис.3 приведена кинетическая кривая тепловой денатурации АХЭ при температуре инкубации 48°С в координатах ^(А0/А,) -1, где Ао- исходная активность фермента, А[ - активность фермента в данный момент времени, 1 - время инкубации. Видно, что эта зависимость нелинейна. Это говорит о том, что кинетика денатурации имеет, как минимум, две стадии.

Рис.3. Кинетическая кривая тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при температуре инкубации 48°С (контроль). По оси абсцисс - время в минутах, по оси ординат - ^(Ао/АО.

Нелинейность кинетики денатурации в простейшем случае может быть обусловлена двухстадийностью процесса денатурации белка:

М^Х^Б {2}

где К, X и Б - нативная, промежуточное состояние и денатурированная формы фермента соответственно.

Математическая модель, соответствующая этой схеме, имеет вид

-кМ

к]—к2

(4)

где А0 - начальная активность фермента, А[ - активность в момент времени I, к! и к2 - константы скорости денатурации для быстрой и медленной стадий, I - время денатурации, 0>р>1 - относительная активность промежуточной формы по сравнению с нативной формой, активность которой принята равной 1.

Такая же кинетика соответствует и параллельной схеме с двумя натив-ными состояниями, денатурирующими с разными константами скорости

где аиЬ- начальные доли двух нативных ( Л',, Ы2) форм, (а + Ъ = 1).

{3}

где N1, Ы2 - нативные состояния.

Этой схеме соответствует уравнение

• ^ = [а • ехр(-^)+Ъ • ехр(—Аг2?)] (5)

Однако поскольку в литературе отсутствуют данные о наличии в мозге крыс двух тетрамерных изоформ АХЭ, экспериментальные данные нами обработаны в соответствии с последовательной схемой денатурации.

(а) (б)

Рис.4 Кинетические кривые термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при разных температурах инкубации, (а) Контроль, (б) в присутствии 2% глицерина.

На рисунках 4(а и б) приведены кривые кинетики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных температурах инкубации. Добавление глицерина к среде инкубации приводит к стабилизации АХЭ при относительно невысоких температурах. Однако при 52°С глицерин уже не стабилизирует АХЭ (табл.2).

Таблица 2. Кинетические характеристики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс без глицерина и в присутствии 2% глицерина в

А р-кл (ехр(-Л9/)-ехр(-і10) соответствии с уравнением —=ехр(-к^)+—і---1—

А0 ку-кг

Условия Константы Температура инкубации (°С)

денатурации 42 44 46 48 52

Контроль кі (мин1) 0.4530 0.4840 0.5680 0.6740 0.7020

Глицерин (2%) 0.1260 0.2340 0.2190 0.5270 0.7460

Контроль к2 (мин1) 0.0177 0.0201 0.0268 0.0501 0.0897

Глицерин (2%) 0.0072 0.0127 0.0217 0.0266 0.0930

Контроль 0.7820 0.6590 0.6350 0.5500 0.4370

Глицерин (2%) р 0.5860 0.5970 0.7090 0.7220 0.4690

На рисунках 5 и 6 приведены зависимости констант скорости денатурации АХЭ в Аррениусовских координатах.

Рис. 5. Аррениусовские графики температурной зависимости константы скорости денатурации (а) быстрой и (б) медленной стадии. Контроль.

(а) (б)

Рис.6. Аррениусовские графики температурной зависимости константы скорости денатурации (а) быстрой и (б) медленной стадий. Глицерин.

Соответствующие энергии активации приведены в таблице 3.

Таблица 3. Энергии активации быстрой и медленной стадий кинетики денатурации АХЭ синаптических мембран в контроле и при 2%-ой концентрации глицерина.

Условия денатурации Энергия активации кДж/моль

быстрая стадия медленная стадия

Контроль (п=4) 108 ± 31 144 ± 17

Глицерин (11=4) 151 + 27 210 ± 15 Р<0.01

Примечание: в скобках указано число животных в выборке.

Исходя из полученных данных, можно предложить следующую схему процесса термоденатурации АХЭ.

Координата денатурации АХЭ

Рис. 7. Схема процесса денатурации АХЭ

На этой схеме N. X и Б - соответственно нативное, промежуточное и денатурированное состояния фермента, ДЕ1 и ДЕ2 - энергии активации переходов И—>Х и Х->Б соответственно.

3. Влияние гипотермии на термостабильность АХЭ синантиче-ских мембран мозга крыс.

В таблице 4 приведены константы скорости денатурации двух стадий АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных температурах денатурации и при различных гипотермических состояниях. Видно, что увеличение температуры денатурации в диапазоне 40-46°С ускоряет процесс денатурации (увеличивает константы скорости денатурации обеих стадий). То же наблюдается при глубокой гипотермии 20°С. Однако при умеренной кратковременной и пролонгированной гипотермии 30°С температураня зависомсть процесса термоденатурации сложнее. Параметр р при глубокой гипотермии закономерно увеличивается при увеличении температуры инкубации. В контроле, напротив, при высоких температурах наблюдается тенденция к снижению параметра р. Изменение параметра р с температурой, возможно, связано с тем, что траектории перехода из нативного состояния в денатурированное при разных температурах отличаются. То есть, промежуточное состояние при разных температурах денатурации имеет разную структуру, а, следовательно, и разную активность.

На рис.8 приведены кривые кинетики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных гипотермических состояниях (температура инкубации 40°С. Хорошо видно, что глубокая гипотермия и пролонгированная умеренная гипотермия дестабилизируют структуру АХЭ. Кратковременная умеренная гипотермия существенно не повлияла на кинетику термоденатурации АХЭ.

Таблица 4. Кинетические характеристики термоденатурации АХЭ синапти-ческих мембран мозга крыс при различных температурах инкубации и гипо-термических состояниях в соответствии с уравнением

Ао \-кг

Состояние животного Константы Температура инкубации (°С)

40 43 46 49

Контроль кі (мин-1) 0,0829 ± 0,038 0,5448 ± 0,218 0,6866 ± 0,237 0,4202 ± 0,113

Гипотермия 30 "с,30 мин. 0,1840 ± 0,025 0,2791 ± 0,050 0,1432 ± 0,018 0,2048 ± 0,020

Гипотермия ЗО0С,Зч. 0,4161 ± 0,203 0,1765 ± 0,121 0,1445 ± 0,016 0,2332 ± 0,032

Гипотермия 20 °С 0,1316 ± 0,025 0,4317 ± 0,074 0,9528 ± 0,404 2,2613 ± 0,358

Контроль к2 (мин4) 0,0037 ± 0,001 0,0124 ± 0,0006 0,0159 ± 0,0006 0,0158 ± 0,001

Гипотермия 30°С,30 мин. 0,0101 ± 0,001 0,0124 ± 0,0005 0,0092 ± 0,001 0,0145 ± 0,001

Гипотермия 30 °С,Зч. 0,0060 ± 0,0003 0,0093 ± 0,001 0,0083 ± 0,001 0,0086 ±0,002

Гипотермия 20°С 0,0071 ± 0,001 0,0129 ± 0,0006 0,0198 ± 0,001 0,0421 ± 0,004

Контроль р 0,8231 ± 0,061 0,8712 ± 0,019 0,8599 ± 0,017 0,7224 ± 0,030

Гипотермия 300С,30 мин. 0,6692 ± 0,026 0,8045 ± 0,018 0,6270 ± 0,030 0^751 ± 0,025

Гипотермия 30 °С,Зч. 0,9364 ± 0,013 0,8294 ± 0,075 0,5931 ±0,028 0,5210 ± 0,035

Гипотермия 20 "С 0,7037 ± 0,036 0,7609 ± 0,016 0,8096 ± 0,024 0,8186 ± 0,058

Рис. 8. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при температуре денатурации 40°С .

При высокой температуре инкубации кинетика денатурации в контроле и при гипотермических состояниях примерно одинакова (рис.9).

вреия(мш.| Ч^Гвпотермп« ЗООС.Зч.

Контроль

Рис. 9. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при температуре денатурации 46°С .

4. Термостабильность АХЭ сииаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке

В таблице 5 приведены данные по активности АХЭ сииаптических мембран нейронов мозга сусликов в динамике зимней спячки. Видно, что в состоянии глубокого оцепенения активность АХЭ заметно превышает контрольное значение (летние бодрствующие животные). При межбаутном пробуждении, когда температура тела близка к норме, активность АХЭ снижается. Пробуждение требует, по-видимому, активации холинергических механизмов. Поэтому активность АХЭ снижается.

Таблица 5. Активность АХЭ сииаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке.

Состояние животного Активность АХЭ (мкмоль/час на 1 мг белка)

Летний контроль 44.05 ± 0.90

Баут глубокой спячки 49.68 ± 0.97 Р<0.005

Межбаутное пробуждение 40.47 ± 0.29 Р<0.007

Примечание: указана достоверность различий по отношению к контролю.

На рис.10 приведены кривые термоденатурации АХЭ сииаптических мембран нейронов мозга сусликов в динамике зимней спячки. Анализ кривых показывает, что в период спячки константы скорости денатурации АХЭ уменьшаются. Это означает, что структура АХЭ при спячке стабилизируется. Несмотря на то, что при межбаутном пробуждении активность АХЭ существенно снижается по сравнению с баутом глубокой спячки, термостабильность АХЭ не изменилась (таблица 6). Это говорит о том, что активность АХЭ во время спячки регулируется автономным механизмом, отдельным от механизма стабилизации. Обращает на себя внимание и тот факт, что параметр р во время спячки также уменьшается. Это говорит о том, что активность промежуточной формы при спячке снижается в большей степени, чем нативной формы. Действительно, отношение константы скорости термоденатурации нативной формы (к,) в контроле к той же константе в бауте глубокой спячки равно 1.283, а отношение констант скорости термоденатурации промежуточной формы (к2) составляет 1.428. При межбаутном пробуждении эти отношения равны соответственно 2.335 и 4.444. Параметр р уменьшается в бауте глубокой спячки в 1.429 раза, а при межбаутном пробуждении в 1.694 раза. Таким образом, промежуточное состояние стабилизируется при спячке

сильнее, чем нативное, а поскольку между стабильностью и активностью имеет место отрицательная корреляция, параметр р при спячке уменьшается.

1.0 0.9 0,8 0,7 0,6 £ 0,5 0,4 0,3 0.2 0.1

0,0 -

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Время(мин.)

Рис. 10. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга сусликов:о- контроль, □- баут глубокой спячки, 0- межбаутное пробуждение.

Таблица. 6. Кинетические характеристики тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга суслика при зимней спячке и при пробуждении (п = 4-5).

Состояние животного Параметры регрессионного уравнения ^=ехр( кхі)Л'к' (ехр(-У)-ехр(-У))

к! (мин1) к г (мин1) Р

Контроль 0.376±0.09 0.040±0.003 0.649±0.055

Спячка 0.293±0.03 0.028±0.004* 0.454±0.038*

Пробуждение 0.161±0.01' 0.009 ±0.003" 0.383 ±0.030*

Примечание: * - Р<0.05 по отношению к контролю.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами исследованы кинетические и термодинамические характеристики ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс и сусликов при разных гипотермических состояниях. В контроле кинетические характеристики АХЭ из мозга сусликов и крыс близки друг другу. У сусликов активность АХЭ (в расчёте на белок) синаптических мембран нейронов мозга на 26% выше, чем у крыс. Это может быть связано с тем, что суслики являются гетеротермами. Температура тела у них гомеостатирована не так строго как у настоящих гомойотермов. И они могут использовать свою способность снижать температуру тела для сохранения энергетических запасов. Торпид-ные состояния требу ют для своего поддержания, чтобы уровень возбудимости нейронов головного мозга был низкий. Поэтому при зимней спячке или суточном оцепенении уровень ацетилхолина в мозге должен быть достаточно низким. Ацетилхолинэстераза может играть важную роль в поддержании низкой концентрации ацетилхолина в экстраклеточном пространстве головного мозга. Повышение активности ацетилхолинэстеразы, при прочих равных условиях, должно снизить концентрацию ацетилхолина в экстраклеточном пространстве. Напротив, состояние бодрствования требует активации нейронов головного мозга. Поэтому в состоянии бодрствования активность ацетилхолинэстеразы должна быть меньше.

При гипотермии активность АХЭ синаптических мембран мозга крыс увеличивается. Можно предположить, что снижение температуры тела приводит к снижению производства АТФ в клетках. В ответ на дефицит энергии включается механизм снижения потребности в энергии. Для этого нужно снизить возбудимость нейронов, чтобы энергия не тратилась на восстановление ионных градиентов после прохождения потенциалов действия и постси-наптических потенциалов. Повышение активности АХЭ, снижая концентрацию ацетилхолина, должно способствовать сохранению энергии в нейронах мозга.

Исследование термостабильности АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке показало, что термостабильность при погружении в глубокую спячку сопровождается увеличением активности АХЭ и увеличением её термостабильности. Спячка сусликов отличается от состояния искусственной гипотермии крыс тем, что спячка — эволюционная адаптация гетеротермов, а искусственная гипотермия - это экстремальное состояние гомойотермного организма. Может быть, поэтому увеличение активности АХЭ при низкой температуре тела у сусликов сопровождается повышением термостабильности, а повышение активности АХЭ у крыс при искусственной

гипотермии сопровождается уменьшением термостабильности. Отсюда следует важный вывод, что активность фермента и его термостабильность могут регулироваться в мозге отдельно друг от друга.

ВЫВОДЫ

1. Кратковременная гипотермия 30°С достоверно увеличивает максимальную скорость (Ут) и константу Михаэлиса (К™) ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс. При этом константа субстратного ингибирования (К;) уменьшается.

2. Пролонгирование гипотермии 30°С в течение 3 часов приводит к дальнейшему увеличению Ут и Кт, а константа субстратного ингибирования остается такой же, как и при кратковременной гипотермии.

3. Глубокая гипотермия 20°С приводит к достоверному увеличению Ут и Кт по сравнению с интактным контролем, при этом константа субстратного ингибирования остается на уровне контроля.

4. Имеет место линейная корреляция (г=0.955) между Ут и Кт при разных температурах тела животного.

5. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс имеет две стадии - быструю и медленную. Экспериментальные данные хорошо согласуются со схемой трех состояний: нативное —»промежуточное —» денатурированное, - которой соответствует математическая модель суммы двух экспонент.

6. Константа скорости денатурации быстрой стадии примерно в 10 раз больше, чем медленной.

7. Глицерин в концентрации 2% заметно уменьшает константы скорости денатурации обеих стадий в диапазоне температур инкубации 42-50°С. При температуре инкубации 52°С кинетика термоденатурации в контроле и при добавлении глицерина примерно одинакова.

8. Энергия активации быстрой стадии денатурации меньше энергии активации медленной стадии. Глицерин (2%) увеличивает энергии активации обеих стадий.

9. Параметр р (отношение активности промежуточной формы к активности натйвного состояния) в контроле уменьшается при увеличении температуры инкубации. В присутствии глицерина наблюдается увеличение этого параметра с повышением температуры.

10. Пролонгированная гипотермия 30°С и кратковременная гипотермия 20°С приводят к увеличению констант скорости денатурации АХЭ по сравнению с контролем при температуре инкубации 40°С. При более высоких температурах инкубации эффекты гипотермии уменьшаются.

11. Кинетика термоденатурации АХЭ синалтических мембран мозга сусликов сходна с таковой для крыс. В состоянии глубокой спячки термостабильность АХЭ увеличивается и остается таковой при межбаутном пробуждении.

12. Активность АХЭ при глубокой спячке выше, чем в летнем контроле. При межбаутном пробуждении активность АХЭ падает ниже уровня летнего контроля.

Основные публикации по теме диссертации

1.Тикра М.Х., Джафарова A.M., Кличханов Н.К., Мей панов И .С. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран из мозга крыс//Вестник ДГУ. 2011. Вып. 1.С.107-112.

2. Тикра М.Х., Джафарова A.M., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях//Вестник ДГУ. 2011. Вып. 1.С. 147-150.

3.Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M., Тикра М.Х. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы мембран мозга сусликов при зимней спячке// Нейрохимия. 2010,- Т.27. №4. -С.280-285.

4.Джафарова A.M., Гусейнова 3., Тикра Матхкур Хасан Особенности структуры и функций ацетилхолинэстеразы//Биология, Экология, Охрана окружающей среды. Сборник статей студентов, аспирантов, преподавателей. Махачкала. 2010. С.67-80.

5.Тикра М.Х., Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран из мозга крыс//Материалы Всероссийской конференции, посвященной 80-летию проф. А.Г.Юсуфова. Махачкала. 2010. -С.312-315.

6.Тикра М.Х. Влияние глицерина на кинетику тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из мозга крыс//Труды молодых учёных ДГУ. Махачкала. Издательство ДГУ. 2010- С. 17-18.

7. Джафарова A.M., Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Матхкур Т.Х. Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран из мозга крыс и сусликов// 13-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. Пущино. 2009. - С.137-138.

8. Тикра М.Х., Джафарова A.M., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Термоденатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс//15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. Пущино. 2011. - С.117.

9. Джафарова A.M., Мейланов И.С. Кличханов Н.К., Тикра М.Х. Исследование тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке//15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. Пущино. 2011. - С.128.

Статьи № 1-3 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Формат 60x84/16. Печать офсетная. Бумага №1. Гарнитура «Тайме» Усл. п.л. - 1,50. Заказ № 1012. Тираж 150 экз.

Отпечатано в типографии "Радуга-Г' г.Махачкала, ул. Коркмасова, 11 "а"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матхкор Тхикра Хасан

Введение

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ (АХЭ)

1.1 Структура АХЭ

1.2 Локализация АХЭ

1.3 Функции АХЭ

1.4 Полиморфизм и множественные молекулярные формы АХЭ

1.5 Биосинтез АХЭ и его регуляция

1.6 Третичная структура АХЭ

1.7 Механизм действия и кинетика катализа АХЭ

1.8 Температурная зависимость АХЭ

ГЛАВА II

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Постановка экспериментов

Искусственное снижение температуры тела млекопитающих

Условия гибернации

2.2 Методы исследования

Определение активности АХЭ

Определение концентрационной зависимости активности АХЭ

Определение кинетических характеристик АХЭ

Тепловая денатурация АХЭ

Анализ кинетических кривых термоденатурации АХЭ

Определение содержания белка

2.3 Статистический анализ данных

ГЛАВА III

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Концентрационная зависимость активности АХЭ синаптических мембран мозга крыс

3.2. Термоденатурция АХЭ синаптических мембран мозга крыс

3.3. Влияние гипотермии на термостабильность АХЭ синаптических мембран мозга крыс

3.4. Термостабильность АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях"

Актуальность. Ацетилхолинэстераза - фермент выполняющий важную функцию в нервной системе млекопитающих. Он непосредственно участвует в передаче информации между нервными клетками, а также своей активностью влияет на взаимодействие удалённых друг от друга нейронов. При изменении физиологических условий в мозге, например, при гипотермии, ишемии или гипоксии активность фермента изменяется [Tekulics et al., 1999; Sun et al., 2007; Xie et al., 2011]. Эти изменения могут отражать как проявление процессов адаптации к новым условиям, так и патологические процессы, вызванные действием экстремального фактора. Выяснение механизмов изменений активности этого важного физиологического фермента при различных физиологических состояниях является актуальной проблемой молекулярной физиологии. Обычно для оценки того что происходит в клетках ткани при изменениях физиологических процессов измеряют активности соответствующих ферментов, обеспечивающих данный физиологический процесс. Однако, чаще всего этой информации бывает недостаточно для получения ясной картины происходящего. Измерение кинетических и термодинамических характеристик ферментов может дать ценную информацию для выяснения сложных механизмов ответной реакции клеток на изменение состояния клеток. В настоящей работе исследованы кинетические характеристики, а также кинетика тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы синап-тических мембран мозга крыс при общей гипотермии. Исследована также тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов в динамике зимней спячки.

Цели и задачи. Целью данной работы было выяснение изменений кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс и сусликов при гипотермических состояниях. Для этого были поставлены следующие задачи:

2. исследовать кинетику тепловой денатурации фермента при различных гипотермических состояниях,

3. исследовать влияние глицерина на термоденатурацию ацетилхолинэстера-зы из мозга крыс,

Положения, выносимые на защиту.

1. кинетические характеристики активность ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях изменяются: максимальная скорость и константа Михаэлиса увеличиваются

3. термостабильность ацетилхолинэстеразы из мозга крыс при гипотермических состояниях уменьшается: константы скорости денатурации увеличиваются

Новизна. Впервые исследованы кинетические и термодинамические характеристики ацетилхолинэстеразы, а также кинетика тепловой денатурации синаптических мембран мозга крыс при различных гипотермических состояниях. Впервые исследована тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке.

Апробация работы. Работа апробирована на Всероссийской конференции, посвященной 80-летию проф. Юсуфова А.Г. (Махачкала, 2010), Конференции молодых учёных ДГУ (Махачкала, 2010), Региональной научно-практической конференции, посвящённой году учителя в России (Махачкала, 2010), 13-той Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2009), 15-той Пущинской конференции молодых учёных (Пущино, 2011), на годичной научной сессии профессорско-преподавательского состава ДГУ (апрель 2011).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 277 источников. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 6 таблиц. Опыты проведены на 75 крысах и 16 сусликах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Матхкор Тхикра Хасан

ВЫВОДЫ

1. Кратковременная гипотермия достоверно увеличивает максимальную скорость (Ут) и константу Михаэлиса (Кт) ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс. При этом константа субстратного ингибирования (К;) уменьшается.

2. Пролонгированние гипотермии 30°С в течение 3 часов приводит к дальнейшему увеличению Ут и Кт, а константа субстратного ингибирования остается такой же как и при кратковременной гипотермии.

3. Глубокая гипотермия 20°С приводит к достоверному увеличению Ут и Кт по сравнению с интактным контролем., при этом константа субстратного ингибирования остается на уровне контроля.

4. Имеет место линейная корреляция (г=0.955) между Ут и Кт при разных температурах тела животного.

5. Кинетика тепловой денатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс имеет две стадии - быструю и медленную. Экспериментальные данные хорошо согласуются со схемой трех состояний: нативное —»промежуточное —► денатурированное, - которой соответствует математическая модель суммы двух экспонент.

6. Константа скорости денатурации быстрой стадии примерно в 10 раз больше, чем медленной.

9. Параметр (3 (отношение активности промежуточной формы к активности нативного состояния) в контроле уменьшается при увеличении температуры инкубации. В присутствие глицерина наблюдается увеличение этого параметра с повышением температуры.

11. Кинетика термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга сусликов сходна с таковой для крыс. В состоянии глубокой спячки термостабильность АХЭ увеличивается и остается таковой при межбаутном пробуждении.

12. Активность АХЭ при глубокой спячке выше чем в летнем контроле. При межбаутном пробуждении активность АХЭ уменьшается ниже уровня летнего контроля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами исследованы кинетические и термодинамические характеристики ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс и сусликов при разных гипотермических состояниях. В контроле кинетические характеристики АХЭ из мозга сусликов и крыс близки друг другу. У сусликов активность АХЭ синаптических мембран мозга на 26% выше чем у крыс. Это может быть связано с тем, что суслики являются гетеротермами. Температура тела у них гомеостатирована не так строго как у, настоящих гомойотермов. И они могут использовать свою способность снижать температуру тела для сохранения энергетических запасов. Торпидные состояния требуют для своего поддержания чтобы уровень возбудимости нейронов головного мозга был низкий. Поэтому при зимней спячке или суточном оцепенении уровень ацетилхолина в мозге должен быть достаточно низким. Ацетилхолинэстера-за может играть важную роль в поддержании низкой концентрации ацетилхолина в экстраклеточном пространстве головного мозга. Повышение активности ацетилхолинэстеразы, при прочих равных условиях, должно снизить концентрацию ацетилхолина в экстраклеточном пространстве. Напротив, состояние бодрствования требует активации нейронов головного мозга. Поэтому в состоянии бодрствования активность ацетилхолинэстеразы должна быть меньше.

При гипотермии активность АХЭ синаптических мембран мозга крыс увеличивается. Можно предположить, что снижение температуры тела приводит к снижению производства АТФ в клетках. В ответ на дефицит энергии включается механизм снижения потребности в энергии. Для этого нужно снизить возбудимость нейронов, чтобы энергия не тратилась на восстановление ионных градиентов после прохождения потенциалов действия и постси-наптических потенциалов. Повышение активности АХЭ снижая концентрацию ацетилхолина должно способствовать сохранению энергии в нейронах мозга.

Механизм изменений активности АХЭ при изменениях физиологического состояния организма не вполне ясен. Исследование влияния гипотермии на термостабильность АХЭ синаптических мембран показало, что при гипотермии термостабильность АХЭ уменьшается. Константы скорости денатурации возрастают. Это означает, что структура АХЭ становится более подвижной. Как уже отмечалось выше гипотермия приводит также к повышению максимальной скорости и константы Михаэлиса. Увеличение обоих этих показателей означает, что конформационная подвижность молекулы АХЭ увеличивается при гипотермии по сравнению с контролем. Увеличение константы Михаэлиса означает, что время удержания субстрата ферментом уменьшается. Но тогда и время удержания продукта гидролиза ацетилхолина - холина - тоже должно уменьшиться (поскольку холин, также как и ацетилхолин, содержит четвертичный азот, за счёт которого происходит связывание его в активном центре). Считается, что десорбция холина из активного центра фермента может быть лимитирующей стадией, определяющей скорость гидролиза ацетилхолина. Поэтому число оборотов должно возрасти, а, значит, и максимальная скорость должна возрасти. Увеличение конформационной подвижности молекулы АХЭ согласуется с уменьшением её термостабильности при гипотермии.

Исследование термостабильности АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке показало, что термостабильность при погружении в глубокую спячку сопровождается увеличением активности АХЭ и увеличением её термостабильности. Спячка сусликов отличается от состояния искусственной гипотермии крыс тем, что спячка - эволюционная адаптация гетеротермов, а искусственная гипотермия - это экстремальное состояние гомойотермного организма. Может быть, поэтому увеличение активности АХЭ при низкой температуре тела у сусликов сопровождается повышением термостабильности, повышение активности АХЭ у крыс при искусственной гипотермии сопровождается уменьшением термостабильности.

Спячка мелких грызунов — это адаптация к зимней бескормице. Снижение температуры тела при спячке снижает потребность в энергии, тем самым увеличивает вероятность выживания в условиях нехватки корма. Повышение активности АХЭ в мозге при глубокой спячке способствует переходу в торпидное состояние. При межбаутном пробуждении активность мозга должна быть восстановлена, поэтому активность АХЭ уменьшается. Интересно в связи с этим отметить, что ингибиторы АХЭ являются лекарствами при болезни Альцгеймера [Lanctót et al., 2003; De Jager, Hafler, 2007; Selkoe, 2001] . Эта болезнь сопровождается гибелью значительного количества хо-линергических нейронов в коре мозга. Это приводит к дефициту ацетилхоли-на в экстраклеточном пространстве. Ингибиторы АХЭ уменьшают этот дефицит, что приводит к снижению симптомов болезни. Изменения активности АХЭ при искусственном снижении температуры тела у крыс, и при естественном снижении температуры тела у сусликов, видимо, имеют разные механизмы. Уже тот факт, что увеличение активности при искусственной гипотермии крыс сопровождается лабилизацией структуры фермента, а при зимней спячке сусликов увеличение активности сопровождается увеличением стабильности говорит о различии этих механизмов.

Несмотря на очень большое количество работ посвященных исследованию структуры и каталитического механизма АХЭ, до сих пор нет ясного ответа на вопрос о том, как регулируется активность этого фермента in vivo. При сезонных изменениях, связанных с зимней спячкой более вероятна количественная стратегия (изменение числа молекул фермента). При гипотер-мических состояниях, создаваемых в лаборатории за относительно короткое время, более вероятна химическая модификация молекулы фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матхкор Тхикра Хасан, Махачкала

1. Глебов Р.Н., Кражановский Г.Н. Функциональная биохимия синапсов. -М: Медицина. 1978. - 328 с.

2. Джафарова A.M., Мейланов И.С., Кличханов Н.К. // Проблемы и перспективы современной науки // Ред. Ильинских H.H. Томск, 2008. С. 50.

3. Калабухов Н.И. Спячка млекопитающих. М Наука, 1985.-264 с.

4. Кличханов Н.К., Халилов P.A., Авшалумов М.В., Мейланов И.С. Температурная зависимость ацетилхолинэстеразы синаптических мембран коры головного мозга сусликов при зимней спячке и искусственной гипотермии//Биол. мембраны. 2001. Т.18.№2.- С.111-119.

5. Кличханов Н.К., Халилов P.A., Мейланов И.С. Температурная зависимость активности АХЭ синаптических мембран из мозга крыс при гипотермии // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2000. -Т. 129, № З.-С. 326328.

6. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран // Л.: Наука, 1981. 340 с.

7. Кривой И.И. О функциональной значимости синаптической АХЭ и способах оценки её активности // Вестник ЛГУ. 1986. - Вып.З, - С. 64-72.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, j 990. 352 с.

9. Захарова И.О., Аврова Н.Ф. Влияние адаптации к холоду на содержание ганглиозидов в субклеточных фракциях мозга крыс и состав ихжирных кислот // Ж. эвол. биохим. физиол. 1998. Т.34. №5.-С.555-563.

10. П.Любарев А.Е., Курганов Б.И. Кинетический анализ данных дифференциальной сканирующей калориметрии для случаев необратимой тепловой денатурации белков // Успехи биологической химии, 2000, т. 40, с. 43-84.

11. Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M. Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс // Биофизика -2008 -Т.53, № 4. С. 613-617.

12. Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M., Тикра М.Х. Тепловая денатурация АХЭ синаптических мембран мозга сусликов при зимней спячке // Нейрохимия 2010. -Т. 27, № 4. -С. 280-285.

13. Моралев С.Н., Нестеров В.П., Розенгарт В.И. Модуляция активности холинэстераз: теоретические и практические аспекты проблемы // Биол. мембраы. 1992.-Т.9, № 10-11.-С. 1030-1031.

14. Нетребко A.B., Кросс СВ., Романовский Ю.М. Модель АХЭ: диффузионные ограничения // 2-й съезд биофизиков России. Москва, 23-27 авг. 1999 // Тезисы докладов. Т. 2. - М. - 1999. - С 432-433.

15. Розенгарт Е.В., Балашов Е.К., Шерстобитов O.E. Аллостерические свойства АХЭ // Акад. Наук. СССР. Биохимия,—1977,— 42, № 9,— С. 1626—1630. 11.

16. Снетков В.А., Нигматулин Н.Р., Никольский Е.Е., Магазанник Л.Г. Моделирование действия блокаторов ионных каналов на постсинапти-ческие токи // Нейрофизиология. 1989. - Т. 21, № 4. - С. 476-484.

17. Чернышевская И.А., Федотов Е.В. Развитие активности холинэстераз некоторых чувствительных и двигательных ядер ствола мозга в раннем эмбриогенезе человека // Журн. эвол. биох. и физиол. 1996. -Т.32, № 1.-С. 15-23.

18. Alexsen Р.Н., Harel М., Silman I., Sussman J. Structure and dynamics of the active site gorge of AchE: synergistic use of molecular dynamics simulation and X-ray crystallography // Protein Sci. 1994. - V. 3. - P. 188-197.

19. A1-Jafari A.A., Kamal M.A. Optimization and kinetic studies of human erythrocyte membrane-bound AChE // Bioch. and Mol. Biol. Int. 1996. -V. 38, N.3.-P. 577-586.

20. Almeida J.P., Carvalho F., Martins-Silva J., Saldanha C. The influence of erythrocyte acetylcholinesterase effectors in the band 3-dependent mobilization of intracellular nitric oxide stores // J Vase. Res. -2006 V.43 (Suppl 1) -P.2-94. abstract.

21. Alvarez A., Opazo C., Alarcon R., Garrido J., Inestrosa N.C. Acetylcholinesterase promotes the aggregation of amyloid-b-peptide fragments by forming a complex with the growing fibrils // J. Moi. Biol. -1997 -V.272 -P.348 -361.

22. Anglister L., Roth E., Silman I. (1980) Quaternary structure of electric eel acetylcholinesterase. In Synaptic Constituents in Health and Disease, Brzin M, Sket D, Bachelard H (eds), -P. 533-540. New York: Pergamon

23. Antosiewicz J., Gilson M. K., McCammon J. A. Acetylcholinesterase: Effects of ionic strength and dimerization on the rate constants // Israel. J. Chem. -1994 -V. 34 -P.151-158.

24. Antosiewicz J., Wlodek S.T., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: role of the enzyme's charge distribution in steering charged ligands toward the active site // Biopolymers. 1996. - V. 39. - P. 85-94.

25. Appleyard M., Johnsen H. Action of acetylcholinesterase in the guinea pig cerebellar cortex in vitro //Neuroscience. 1992. -V.47,N.2. -P.291-301.

26. Arsov Z., Schara M., Zorko M. and Strancar J. The membrane lateral domain approach in the studies of lipid-protein interaction of GPI-anchored bovine erythrocyte acetylcholinesterase // Eur. Biophys. J. -2004 -V.33 -P.715-725.

27. Barboni E., Rivero B.P., George A.J., Martin S.R., Renoup D.V., Hounsell E.F., Barber P.C., Morris R.J. The glycophosphatidylinositol anchor affects the conformation of Thy-1 protein // J. Cell Sci. -1995-V.108 -P.487-497.

28. Bartolucci C., Perola E., Cellai L., Brufani M., Lamba D. "Back door" opening implied by the crystal structure of a carbomoylates acetylcholinesterase // Biochemistry. 1999. - V. 38, N. 18. - P. 5714-5719.

29. Bataille S., Portalier P., Coulon P., Ternaux J.P. Influence of acetylcholinesterase on embryonic spinal rat motoneurones growth in cell culture: a quantitative morphometric study // Eur. J. Neurosci. -1998 -V.10 -P.560-572.

30. Bazelyansky M., Robey E., Kirsch J. F. Fractional Diffusion-Limited Component of Reactions Catalyzed by Acetylcholinesterase // Biochemistry -1986 -V. 25 -P. 125-130.

31. Bearegard G., Roufogalis B.D. The role of tightly bound phospholipid in the activity of erythrocyte acetylcholinesterase // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1977.-V. 77,-P.211-219.

32. Beckman A.L., Satinoff E., Stanton T.L. Inhibition of the CNA trigger process for arousal from hibernation // Amer. J. Physiol. 1976. V. 230. P. 368-375.

33. Benedito M., Demosi M. The activity of acetylcholinesterase in subcellular fractions of the cerebral cortex from rats deprived of paradoxical sleep (PS) // Actos deFisiologia.-2001.-P. 165.

34. Benson D.L., Schnapp L.M., Shapiro L., Huntley G.W. Making memories stick: cell-adhesion molecules in synaptic plasticity // Trends Cell Biol. -2000 -V.10-P.473-482.

35. Birikh K.R., Sklan E.H., Shoham S., Soreq H. Interaction of "readthrough" acetylcholinesterase with RACK1 and PKC beta II correlates with intensified fear-induced conflict behavior // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-2003 -V. 100 -P.283-288.

36. Bloj B., Galo M.G., Morero R.D., Farias R.N. Heterogeneous Effect of Dietary Cholesterol on Acetylcholinesterase and ATPases of Rat Erythrocytes: Arrhenius Plots // J. Nutr. -1979 -V.109 -P.63-69.

37. Bloj B., Morero R.D., Farias R.N. Effect of essential fatty acid deficiency on the Arrenias plot of acetylcholinesterase from rat erythrocytes // J. Nuts. -1974. -V.104.-P.1265-1272.

38. Bon C.L., Greenfield S.A. Bioactivity of a peptide derived from acetylcholinesterase: electrophysiological characterization in guinea-pig hippocampus // Eur. J. Neurosci. -2003- V.17 -P.1991-1995.

39. Bon S., Ayon A., Leroy J., Massoulie J. Trimerization domain of the collagen tail of acetylcholinesterase //Neurochem. Res. -2003 -V.28 -P.523-535

40. Bon S., Coussen F., Massoulie' J. Quaternary associations of acetylcholinesterase. II. The polyproline attachment domain of the collagen tail // J Biol.

41. Chem. -1997 -V.272 -P.3016-3021.

42. Bon S., Vigny M., Massoulie S. Assymetric and globular form of acetylcholinesterase in mammals and birds // Proc. Nate. Acad. Set. USA. 1979. - V. 76. -P. 2546-2550.

43. Botti S. A., Felder C., Lifson S., Sussman J. L. & Silman I. A modular treatment of molecular traffic through the active-site of cholinesterases // Biophys. J. -1999 -V.77 -P.2430-2450.

44. Botti S.A., Felder C.E., Sussman J.L., Silman I. Electrotactins: a class of adhesion proteins with conserved electrostatic and structural motifs // Protein Eng. -1998 -V.l 1 -P.415-420.

45. Bourne Y., Grassi J., Bougis P.E., Marchot P. Conformational flexibility of the acetylcholinesterase tetramer suggested by X-ray crystallography // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 30370-30376.

46. Bourne Y., Taylor P., Bougis P.E., Marchot P. Crystal structure of mouse acetylcholinesterase. A peripheral site occluding loop in a tetrameric assembly // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. -P. 2963-2970.

47. Britto L., Alves A. S., Lindstrom J. M., Torrao A. S. Differential localization of acetylcholinesterase in relation to pre- and postsynaptic nicotinic receptors in the chick brain //BrainRes. -2001.-V. 898, N.l,-P. 158-161.

48. Brzin M., Sketeti I., Kliner B. Cholinesterases / Handbook of neurochemi-stry. -V. 4: Enzyme in the nervous system. 1983. -P. 251-292.

49. Buck C.L., Barnes B.M. Effects of ambient temperature on metabolic rate, respiratory quotient, and torpor in an arctic hibernator // Am. J. Physiol. 2000. V. 279. P. 255-262.

50. Bui J. M., Henchman R. H., McCammon J. A. The Dynamics of Ligand Barrier Crossing inside the Acetylcholinesterase Gorge // Biophys. J. -2003 -V.85 -P. 2267-2272.

51. Carey H.V., Andrews M.T., Martin M.T. Mammalian hibernation: cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature // Physiol. Rev. 2003. V. 83. P. 1153-1181.

52. Carvalho F. A., Lopes de Almeida J. P., Freitas-Santos T., Saldanha C. Modulation of Erythrocyte Acetylcholinesterase Activity and Its Association with G Protein-Band 3 Interactions // J. Membrane Biol. -2009 -V.228 -P.89-97.

53. Carvalho F.A., Mesquita R., Martins-Silva J. Saldanha C. Acetylcholine and choline effects on erythrocyte nitrite and nitrate levels // J. Appl. Toxicol. -2004 -V.24 -P.419-427.

54. Chai L., Goldberg R., Kampf N., Klein J. Selective adsorption of poly (ethylene oxide) onto a charged surface mediated by alkali metal ions // Lang-muir -2008 -V.24 -P. 1570-1576.

55. Chou T. C., Rotman S. R., Saper C. B. Lateral hypothalamic acetylcholines-terase-immunoreactive neurons co-express either orexin or melanin concentrating hormone//Neurosci. Lett. -2004. -V. 370, N.2-3. -P. 123-126

56. Dale HH. The action of certain esters and ethers of choline, and their relation to muscarine//J. Pharmacol. Exp. Ther. 1914. V.6. P.147-190.

57. Dani J.A., Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -2007. -V. 47 -P. 699-729

58. Davies D.R., Metzger H. Structural basis of antibody function // Ann. Rev. Immunol. -1983 -V.l -P.87-117.

59. De Jager P. L., Hafler D. A. New Therapeutic Approaches for Multiple

60. Sclerosis // Annu. Rev. Med.- 2007-V.58 -P.417-32.

61. Descarries L, Gisiger V, Steriade M. Diffuse transmission by acetylcholine in the CNS // Prog. Neurobiol.-1997 -V.53 -P.603-625.

62. Dietrich C, Bagatolli L.A, Volovyk Z.N, Thompson N.L, Levi M, Jacob-son K. and Gratton E. Lipid Rafts Reconstituted in Model Membranes // Bi-ophys. J. -2001-V.80, N.3 -P.1417-1428.

63. Dori A, Cohen J, Silverman W.F, Pollack Y, Soreq H. Functional manipulations of acetylcholinesterase splice variants highlight alternative splicing contributions to murine neocortical development // Cereb. Cortex. -2005. -V.15. -P.419-430.

64. Duval N, Krejci E, Grassi J, Coussen F, Massoulié J, Bon S. Molecular architecture of acetylcholinesterase collagen-tailed forms; construction of a glycolipid-tailed tetramer // EMBO J. -1992 -V.l 1,N. 9-P. 3255-3261.

65. Dvir H, Silman I, Harel M, Rosenberry T. L, Sussman J. L. Acetylcholinesterase: From 3D structure to function // Chemico-Biol. Interact. -2010 -V.l 87, N.1-3-P. 10-22.

66. Edwards, J. A. and Brimijoin S. Thermal inactivation of the molecular forms of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase // Biochem. et Biophys. Acta (BBA) -1983 -V.742, N.3. -P. 509-516.

67. Elcock A.H, Gabdoulline R.R, Wade R.C, McCammon J. A. Computessimulation of protein protein association kinetics: acetylcholinesterase -fasciculin // J. Mol. Biol. - 1999. - V.291, N. 1. - P.149-162.

68. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.JR., Feathestone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. - V. 7, N. 2. - P. 88-90.

69. Enyedy I.J., Kovach I.M., Brooks B.R. Alternative pathway for acetyc acid and acetate ion release from acetylcholinesterase: a molecular dynamics study // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. - P. 8043-8050.

70. Faerman C., Ripoll D., Bon S.L., Morel N., Massoulie J., Sussman J.L., Silman L. Site-directed mutant designed to test "back-door" hypothesis of acetylcholinesterase function // FEBS Lett. 1996. - V. 386. - P. 65-71.

71. Falasca C., Perrier N., Massoulie' J. , Bon S. Determinants of the t Peptide Involved in Folding, Degradation, and Secretion of Acetylcholinesterase // J. Biol. Chem . 2005. - V. 280, N. 2. - P. 878-886

72. Feher V.A., Baldwin E.P., Dahlquist F.W. Access of ligands to cavities within the core of a protein is rapid // Nat. Struct. Biol. -1996 -V.3, N 6 -P.516-521.

73. Felder C.E., Botti S.A., Lifson S., Silman I, Sussman J.L. External and internal electrostatic potentials of cholinesterase models // J. Mol. Graph. Mod. 1997. -V. 15.-P. 318-327.

74. Fernandez H.L., Hodges-Savola C.A. Trophic regulation of acetylcholinesterase isoenzymes in adult mammalian skeletal muscles // Neurochem. Res. -1992 -V.17 -P. 115-124.

75. Foot M., Cruz T.F., Clandinin M.T. Effect of dietary lipid on synaptosomal acetylcholinesterase activity. // Biochem. J. 1983. - V.211 - P.507-509.

76. Francesco C., Brodbeck U. Interaction of human red cell membrane acetylcholinesterase with phospholipids // Bioch. et Biophys. Acta 1981. - V. 640.-P. 359-364.

77. Frenkel E.J., Roelofsen B,. Brodbeck U., Van Deenen L.M., Ott P. Lipid-protein interaction in human erythrocyte-membrane acetylcholinesterase // Eur. J. Biochem. 1980. - V. 109, N. 2. -P.377-382.

78. Gan. L., Yang J.T, Wu C-S. Preparation of clean solution of reconstituted acetylcholinesterase: effect of ionic strength and lipid/protein ratio // Inter. J. Peptide and Protein Res. 1989. - V. 33, N. 4. - P.268-272.

79. Genever P.G., Birch M.A., Brown E. & Skerry T.M. Osteoblast-derived acetylcholinesterase: a novel mediator of cell-matrix interactions in bone? // Bone -1999 -V.24 -P.297-303.

80. Gilson, M. K., Straatsma, T. P., McCammon, J. A., Ripoll, D. R., Faerman, C. H., Axelsen, P. H., Silman, I. & Sussman, J. L. Open "back door" in a molecular dynamics simulation of acetylcholinesterase // Science -1994 -V.263 -P.1276-1278.

81. Glsiger V., M. Vlgny, J. Gautron, and Rieger F. Acetylcholinesterase of rat sympathetic ganglion: Molecular forms, localization and effects of denervation//J. Neurochem. -1978 -V.30 -P.501-516.

82. Gorfe A.A., Lu B., Yu Z., MacCammon J.A. Enzymatic activity versus structural dynamics: the case of acetylcholinesterase tetramer // Biophys. J. 2009. V. 97. P. 897-905.

83. Gough N., Randall W. Oligomerization of chiken acetylcholinesterase does not require intersubunit disulfide bonds // J. Neurochem. -1995 -V.65 ,N. 6. -P. 2734-2741.

84. Grassi J., Vigny M., Massoulie J. Molecular forms of acetylcholinesterase in bovine caudate nucleus and superior cervical ganglion: solubility properties and hydrophobic character // J Neurochem. -1982 -V.38 -P.457-469.

85. Greenblatt H. M., Silman I., Sussman J. L. Structural studies on vertebrate and invertebrate acetylcholinesterases and their complexes with functional ligands // Drug Devel. Res. -2000 -V.50, N. -P.573-583.

86. Greenfield S.A., Day T., Mann E.O., Bermudez I. A novel peptide modulates alpha7 nicotinic receptor responses: implications for a possible trophic-toxic mechanism within the brain // J. Neurochem. -2004 -V.90 -P.325-331.

87. Greenfield S.A., Jack J.J., Last A.T., French M. An electrophysiological action of acetylcholinesterase independent of its catalytic site // Exp. Brain. Res. -1988 -V.70 -P.441-444.

88. Grisaru D., Sternfeld M., Eldor A., Glick D., Soreq H. Structural roles of acetylcholinesterase variants in biology and pathology // Eur. J. Biochem. -1999 -V.264 -P.672-686.

89. Haas R., Adams E. W., Rosenberry M. A., Rosenberry T. L. (1992) in Mul-tidisciplinary Approaches to Cholinesterase Functions (ShafFerman A., and Velan B., eds) pp. 131-139, Plenum Publishing Corp., New York

90. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. - V. 93, N. 3. - P. 485-489.

91. Heger H.W. Effect of dietary phospholipid on acetylcholinesterase activity in the rat brain and on composition in liver and brain // Gen. Pharmac. -1979. -V. 10. -P.427-432.

92. Hegner D., Piatt D. Effect of essential phospholipid on the properties of ATPases of isolated rat liver plasma membranes of young and old animals // Mech. Ageing Devel. 1975.-V.4.-P.191-200.

93. Hosea N.A., Harvey A.B., Taylor P. Specifity and orientation of trigonal carboxyl esters and tetrahedral alkylphosphonyl esters in cholinestorases // Biochemistry. 1995.-V.34.-P.11528-11536.

94. Hubbard S.J., Argos P. A functional role for protein cavities in domain: domain motions // J. Mol. Biol. 1996. - V. 261. - P. 289-300.

95. Hutchins, J.B. Acetylcholine as a neurotransmitter in the vertebrate retina // Exp. Eye Res. -1987 -V.45 -P.l-38.

96. Inestrosa N., Perelman A. Association of the acetylcholinesterase with the cell surface // J. Membrane Biol. 1990. - V. 118, N. 1. - 1 -9.

97. Inkson C.A., Brabbs A.C., Grewal T.S., Skerry T.M. & Genever P.G. Characterization of acetylcholinesterase expression and secretion during osteoblast differentiation // Bone -2004 -V.35 -P.819-827.

98. Jiang H. and Zhang X. J. Acetylcholinesterase and apoptosis; Anovel per-pective for an old enzyme // FEBS J. -2008 -V.275 -P.612-617.

99. Johnson G., Moore S.W. Human acetylcholinesterase binds to mouse la-minin-1 and human collagen IV by an electrostatic mechanism at the peripheral anionic site // Neurosci. Lett-2003 -V.337 -P.37-40.

100. Kamal M.A., Al-Jafari A.A. The preparation and kinetic analysis of multiple forms of human erythrocyte acetylcholinesterase // Prep. Biochem. and Biotech. 1996. - V. 26, N. 2. - P. 105-119.

101. Karlsson E., Mbugua P.M., Rodriguez-Ithurralde. Fasciculin, anticholinesterase toxin from the venom of the green mamba Denderoaspis angusticeps // J. Physiol. (Paris). 1984. - V. 79. - P. 232-240.

102. Kaufer D., Friedman A., Seidman S., Soreq H. Acute stress facilitates long-lasting changes in cholinergic gene expression //Nature -1998 -V.393 -P.373-377.

103. Kayzer Ch. // The physiology of natural hibernation. N.Y.: Pergamon Press, 1961. 325 p.

104. Kihara T., Shimohama S. Alzheimer's disease and acetylcholine receptors // ActaNeurobiol. Exp. -2004 -V.64 -P.99-105.

105. Kiss J.P., Vizi E.S., Westerink B.H.C. Effect of neostigmine on the hippo-campal noradrenaline release: role of cholinergic receptors // Neuroreport.-1999 -V.10 -P.81-85, 1999.

106. Koellner G., Kryger G., Millard C.B., Silman I., Sussman J.L., Steiner T. Active-site gorge and buried water molecules in crystal structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica // J. Mol. Biol. 2000. - V. 296. - P. 713-735.

107. Krem M.M., Di Cera E. Conserved water molecules in the specificity pocket of serine proteases and the molecular mechanism of Na+ binding // Protein Struc. Funct. Bioinform. 1988. - V. 30. - P. 34-42.

108. Kristt D.A. Acetylcholinesterase in immature thalamic neurons: relation to afferentation, development, regulation and cellular distribution // Neuroscience -1989 -V.29 -P.27-43.

109. Kronman C., Chitlaru T., Elhanay E., Velan B., and Shafferman A. Hierarchy of post-translational modifications involved in the circulatory longevity of glycoproteins // J. Biol. Chem. -2000 -V.275 -P.29488-29502.

110. Kronman C., Ordentlich A., Barak D., Veilan B., Shafferman A. The "back door" hypothesis for product clearance in acetylcholinesterase challenged by site-directed mutagenesis. // J.Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 27819-27822.

111. Kryger G., Silman I., Sussman J.L. Structure of acetylcholinesterase complexed with E202Q. Implication for the design of new antiAlzheimer drugs // Structure -1999.-V. 7.-P.297-307.

112. Kua J., Zhang Y., MacCammon A.J. Studying enzyme binding spicifictyin acetylcholinesterase using a combined molecular dynamics and multiple docking approach // J. Am. Chem. Soc. -2002 -V.124 -P.8260-8267.

113. Kushner P. D., Stephenson D. T., Sternberg H., Weber R. Monoclonal Antibody Tor 23 Recognizes a Determinant of a Presynaptic Acetylcholinesterase // J. Neurochem. -1987 -V.48, N.6,-P. 1942-1953.

114. Lanctot K. L., Herrmann N., LouLou M. M. Correlates of response to acetylcholinesterase inhibitor therapy in Alzheimer's disease // J. Psychiatry Neurosci.- 2003 -V.28,N.l -P. 13-26.

115. Lawson A.A., Barr R.D. Acetylcholinesterase in red blood cells // Amer. J. of Hematology -1987. V. 26, N. 1. - P. 101-112.

116. Layer P.G. & Sporns O. Spatiotemporal relationship of embryonic choli-nesterases with cell proliferation in chicken retina and eye // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1987 -V.84 -P. 284-288.

117. Layer P.G. and Willbold E. Novel functions of cholinesterases in development, physiology and disease // Prog Histochem Cytochem -1995 -V.29 -P.1-94.

118. Legay C., Mankal F.A., Massoulie J., Jasmin B.J. Stability and secretion of acetylcholinesterase forms in skeletal muscle cells // J. Neurosci. -1999 -V.19 -P.8252-8259.

119. Lendvai B. and Vizi E.S. Nonsynaptic chemical transmission through nicotinic acetylcholine receptors //Physiol. Rev. -2008. -V. 88. -P. 333-349.

120. Levey A.I., Wainer B.H., Mufson E.J., Mesulam M.M. Co-localization of acetylcholinesterase and choline acetyltransferase in the rat cerebrum // Neurosci. -1983- V. 9, N.l-P.9-22.

121. Lev-Lehman E., Deutsch V., Eldor A. & Soreq H. Immature human megakaryocytes produce nuclear-associated acetylcholinesterase // Blood -1997 -V.89 -P.3644-3653.

122. Lev-Lehman E., Ginzberg D., Hornreich G., Ehrlich G., Meshorer A., Eckstein F., Soreq H. & Zakut H. Antisense inhibition of acetylcholinesterase gene expression causes transient hematopoietic alterations in vivo // Gene. Ther. -1994 -V.l-P.127-135.

123. Levi V., Rossi J., Catello P., Flecha L.G. Structural significance of the plasma membrane Calcium Pump oligomerization//Biophy.J. 2002. V. 82. P. 437-446.

124. Li Y., Camp S., Rachinsky T.L., Getman D., Taylor P. Gene structure of mammalian acetylcholinesterase. Alternative exons dictate tissue-specific expression // J. Biol. Chem. -1991 -V.266 -P.23083-23090.

125. Liesi P. Neuronal migration on laminin involves neuronal contact formation followed by nuclear movement inside a preformed process // Exp. Neurol.-1992 -V.l 17 -P.103-113.

126. Loewi O., Navratil I. Uber humorale Ubertragbarkeit der herznervenwir-kung // Pflugers Arch. -1926. -V.214. -P.689-696.

127. Logue J., De Vries A., Fodor E., Cossins A. Lipid compositional correlates of temperature-adaptive interspecific differences in membrane physical structure // J. Exp. Biol. 2000, V. 203. P. 2105-2115.

128. Lomo T., Slater C.R. Control of junctional acetylcholinesterase by neural and muscular influences in the rat // J. Physiol. (Lond) -1980 -V.303 -P. 191— 202.

129. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951 -V.l93 -P. 193198.

130. Luo L., O'Leary D. Axon Retraction and Degeneration in Development and Disease // Annu. Rev. Neurosci. -2005 -V.28 -P. 127-56.

131. Ma J.C., Dougherty D.A. The cation ti-interaction // Chem. Rev. 1997.1. V. 97. -P. 1303-1324.

132. MacPhee-Quigley K, Taylor P, Taylor S. Primary structure of the catalytic subunits from two molecular forms of acetylcholinesterase // J. Biol. Chem. -1985 -V.260 -P.12185 12189.

133. Mallender W.D, Szegletes T, Rosenberry T.L. Acetylthiocholine binds to Asp74 at the peripheral site of human acetylcholinesterase as the first step in the catalytic pathway // Biochemistry -2000 -V.39 -P.7753-7763.

134. Mallender W.D, Szegletes T, Rosenberry T.L. Organophosphorylation of acetylcholinesterase in the presence of peripheral site ligands: Distinct effects of propidium and fasciculin // J Biol. Chem. -1999 -V.274 -P.8491-8499.

135. Marsel V, Palacios L. G, Pertuy C, Mosson P, Fournier D. Two invertebrate acetylcholinesterases show activation followed by inhibition with substrate concentration // Biochem. J. 1998. - V.329. - P.329-334.

136. Masson P, Legrand P, Bartels C.F, Frömern M.P, Schopfer L.M, Lock-ridge O. Role of aspartate 70 and tryptophan 82 in binding of succinyldithi-ocholine to human butyrylcholinesterase // Biochemistry. 1997. - V. 36. -P. 2266-2277.

137. Massoulie J. The origin of the molecular diversity and functional anchoring of cholinesterases //Neurosignals -2002 -V.ll -P. 130-143.

138. Massoulie J, Anselmet A, Bon S, Krejci E, Legay C, Morel N, Simon S. The polymorphism of acetylcholinesterase: posttranslational processing, quaternary associations and localization // Chemico-Biol Interact -1999 -V. 119-120 -P.29-42

139. Massoulie J, Anselmet A, Bon S, Krejci E, Legay C, Morel N, Simon S. Acetylcholinesterase: C-terminal domains, molecular forms and functional localization // J. Physiol. (Paris) -1998 -V.92 -P.183-190.

140. Massoulie J, Bon S. The molecular forms of Cholinesterase and acetylcholinesterase invertebrates //Annu. Rev. Neurosci. 1982. - V. 5 -P. 57-106.

141. Massoulie J., Bon S., Vigny M. The polymorphism of cholinesterase in vertebrates //Neurochem. Int. -1980 -V.2 -P.161-84.

142. Massoulie J., Pezzementi L., Bon S., Krejci E., Vallette M. Molecular and cellular biology of cholinesterases // Prog, neurobiol. 1993. -V. 41. -P. 3191.

143. Meng F-G., Hong Y-K., He H-W., Lyubarev A. E., Kurganov B. I., Yan Y-B., Zhou H-M. Osmophobic Effect of Glycerol on Irreversible Thermal Denaturation of Rabbit Creatine Kinase // Biophys. J. -2004 -V.87, N.4 -P.2247-2254.

144. Meshorer E., Erb C., Gazit R., Pavlovsky L., Kaufer D., Friedman A., Glick D., Ben-Arie N. & Soreq H. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity // Science -2002. -V. 295 -P.508-512.

145. Meshorer E., Soreq H. Virtues and woes of AChE alternative splicing in stress-related neuropathologies // Trends Neurosci. -2006 -V.29, N.4 -P. 216-224.

146. Millard C.B., Shnyrov V.L., Newstead S., Shin I., Roth E., Silman I., Weiner L. Stabilization of a metastable state of Torpedo californica acetylcholinesterase by chemical chaperones // Protein Sci. -2003 -V. 12, N.10. -P. 2337-2347.

147. Morel N. and Dreyfus P. Association of acetylcholinesterase with the external surface of the presynaptic plasma membrane in Torpedo electric organ //Neurochem. Internat. -1982-V.4,N.4-P.283-288.

148. Niday E., Wang C.S., Aloupovic P. Kinetic evidence for allosteric substrate inhibition of human acetycholinesterase /./ Biochemica and Biophysica Acta. -1980.-V. 612.-P. 67-72.

149. Nishiyama H., Fukaya M., Watanabe M., Linden D. J. Axonal Motility and Its Modulation by Activity Are Branch-Type Specific in the Intact Adult Cerebellum // Neuron -2007. -V. 56, N. 3 -P. 472-487.

150. Nishiyama H., Linden D. J. Pure spillover transmission between neurons // Nat. Neurosci. -2007. V. 10. P. 675-677.

151. Nolte H.-J., Rosenberry T.L., Neumann E. Effective charge on acetylcholinesterase active sites determined from the ionic strength dependence of association rate constants with cationic ligands // Biochemistry -1980 -V.19 -P.3705-3711.

152. Ollis D. L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B., Frolow F., Franken S. ML, Harel M., Remington S.J., Silman I., Schrag J., Sussman J.L., Verschueren K.H.G. The a/p hydrolase fold//Protein Eng. -1992 -V.5 -P.197-211.

153. Ordentlich A., Barak D., Kronman C, Ariel N., Segall Y., Velan B., Shaf-ferman A. Functional characteristics of the oxyanion hole in human acetylcholinesterase//J. Biol. Chem. 1998. -V. 273, N. 31. - P. 19509-19517.

154. Pang Y.P., Quiram P., Jelacic T., Hong F., Brimijoin S. Highly potent selective and low cost bis-tetrahydroaminocrine inhibition of acetylcholinesterase // J. Biol. Chem. 1996. - V. 241, N. 31. - P. 23646-23649.

155. Paniker N.V., Arhold A.B., Hartman R.C. Solubilization and purification of human erythrocyte membrane acetylcholinesterase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1973.-V. 144.-P.492-497.

156. Paoletti F., Mocali A. & Vannucchi A.M. Acetylcholinesterase in murine erythroleukemia (Friend) cells: evidence for megakaryocyte-like expression and potential growth-regulatory role of enzyme activity // Blood -1992 -V.79 -P. 2873-2879.

157. Paraoanu L.E., Layer P.G. Acetylcholinesterase in cell adhesion, neurite growth and network formation // FEBS J. -2008 -V. 275 -P.618-624

158. Paraoanu L.E., Layer P.G. Mouse acetylcholinesterase interacts in yeast with the extracellular matrix component laminin-lbeta // FEBS Lett. -2004 -V. 576 -P.161-164.

159. Park S. E. and Yoo Y. H. Acetylcholinesterase as a Pharmacological Target in Cancer Research // Apoptosome. -2010 -P.221-236.

160. Paulus J.M., Maigne J. and Keyhani E. Mouse megakaryocytic secrete acetylcholinesterase // Blood -1981- V. 58. P. 1100-1106.

161. Pawlowska Z., Hogan M.V., Kornecki E., Ehrlich Y.H. Ecto-protein kinase and surface protein phosphorylation in PC 12 cells: interactions with nerve growth factor // J. Neurochem. 1993. V. 60. P. 678-686.

162. Payne C.S., Saeed M., Wolfe A.D. Ligand stabilization of cholinesterases // Biochem. et Biophys. Acta (BBA) -1989 -V. 999, N. 1. -P. 46-51.

163. Perrier A.L., Massoulie J., Krejci E. PRiMA: the membrane anchor of acetylcholinesterase in the brain // Neuron. -2002 -V.33 -P.275-285.

164. Popov V.I., Bocharova L.S. Hibernation-induced structural changes in synaptic contacts between mossy fibres and hippocampal pyramidal neurons //Neuroscience. 1992. V. 48. P. 53-62.

165. Popov V.I., Bocharova L.S., Bragin A.G. Repeated changes of dendritic morphology in the hippocampus of ground squirrels in the course of hibernation //Neuroscience. 1992. V. 48. P. 45-51.

166. Quinn D. M. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dynamics, and virtual transition states // Chem. Rev. -1987 -V.87, N.5 -P.955-979.

167. Radic Z., Duran R., Vellom D.C., Li Y., Cervenansky C, Taylor P. Site of fasciculin interaction with acetycholinesterase // J. Biol. chem. 1994. - V. 269.-P. 11233-11239.

168. Radic Z., Kirchhaft P., Quinn D.M., McCammon S.A., Taylor P. Electrostatic influence on the kinetics of ligand binding to acetycholinesterase. Distribution between active center ligands and fasciculin // J. Biol. Chem. -1997. V.272. -P.23265-23277.

169. Radic Z., Taylor R. Interaction kinetics of reversible inhibitors and substrates with acetylcholinesterase and its fasciculin 2 complex // J. Biol. Chem. 2001. -V.276, N. 7.-P. 4622-4633.

170. Reiner E., Norman A., Simeon V., Radic Z., Taylor P. Mechanism of substrate inhibition of acetylcholinesterase // Proc. Third Internal Meet choli-nesterase. 1993.-p.32.

171. Rieger F., Chetalat R., Nicolet M., Kama C., Poullet M. Presence of tailed, asymmetric forms of acetylcholinesterase in the central nervous system of vertebrates// FEBS Lett. 1980. - V. 121,- P. 169-174.

172. Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P.H., Silman I., Sussman J.L. An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase //Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1993. - V. 90. - P. 51285132.

173. Rivas R.J., Burmeister D.W. & Goldberg D.J. Rapid effects of laminin onthe growth cone//Neuron -1992 -V.8 -P.107-115.

174. Roberts W.L., Doctor B.P., Foster J.D. and Fvosenberry T.L. Bovine brain acetylcholinesterase primary sequence involved in intersubunit disulfide linkages // J. Bio. Chem. -1991 -V.266 -P.7481-7487.

175. Robertson R.T. A morphogenic role for transiently expressed acetylcholinesterase in developing thalamocortical systems? // Neurosci. Lett. -1987 -. V.75 -P.259-264.

176. Rosenberry T. L. Strategies to Resolve the Catalytic Mechanism of Acetylcholinesterase // J. Mol. Neurosci. -2010 -V.40 -P.32-39.

177. Rosenberry T. L., Johnson J. L., Cusack B., Thomas J., Emani S., Venka-tasubban K. S. Interactions between the peripheral site and the acylation site in acetylcholinesterase // Chemico-Biological Interactions -2005 -V.157-158 -P.181-189.

178. Rosenberry T.L. Acetylcholinesterase // Adv. Enzymol. 1975. - V. 43. -P. 103-218.

179. Rosenberry T.L., Neumann E. Interaction of iigands with acetylcholinesterase. Use of temperature-jump relaxation kinetics in the binding of specific fluorescent Iigands // Biochemistry 1977. - V. 16. - P. 3870-3878.

180. Rossi S.G., Vazquez A.E., Rotundo R.L. Local control of acetylcholinesterase gene expression in multinucleated skeletal muscle fibers: individual nuclei respond to signals from the overlying plasma membrane // J. Neurosci. -2000 -V.20 -P.919-928.

181. Rotundo R.L. Asymmetric acetylcholinesterase is assembled in the Golgi apparatus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1984 -V.81 -P.479-483.

182. Rotundo R.L. Biogenesis of acetylcholinesterase molecular forms in muscle. Evidence for a rapidly turning over, catalytically inactive precursor pool //J. Biol. Chem. -1988 -V.263 -P.19398-19406.

183. Rotundo R.L., Rossi S.G., Kimbell L.M., Ruiz C., Marrero E. Targeting acetylcholinesterase to the neuromuscular synapse // Chem. Biol. Interact2005 -V.157 -P.158:15-21.

184. Sanchez-Yague J., Cabezas J.A., Llanillo M. Regulation of acetylcholinesterase associated with platelet plasma membranes by changes in the environment//Biochem. Soc. Trans.-1989.-V. 17, N. 5.-P.1011-1012.

185. Sarter M., Bruno J.P. Cognitive functions of cortical acetylcholine: toward a unifying hypothesis // Brain Res. Rev. 1997. V. 23. P. 28-46.

186. Schellman J.A. Protein stability in mixid solvents: A balance of contact interaction and excluded volume // Biophys. J. -2003. -V.85, N.l -P. 108-125.

187. Scholl F.G., Scheiffele P. Making connections: cholinesterase- domain proteins in the CNS // Trends Neurosci. -2003 -V.26 -P.618-624.

188. Selkoe D.J. Alzheimer's Disease: Genes, Proteins, and Therapy // Physiol. Rev. -2001.-V. 81, N. 2 -P.741-766.

189. Selkoe D.J., Schenk D. Alzheimer's disease: Molecular Understanding Predicts Amyloid-Based Therapeutics // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -2003 -V. 43 -P.545-84.

190. Sharon F.J., Lehto M.T. Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins: structure, function, and cleavage by phosphatidylinositol-specific phospholi-pase C // Biochem. Cell Biol. -2002 -V.80 -P.535-549

191. Shen T., Tai K., Henchman R.H., McCammon J.A. Molecular dynamic of acetylcholinesterase // Acc. Chem. Res. -2002 -V.35, N.6 -P.332-340.

192. Shen T.Y., Tai K., McCammon A. Statistical analysis of the fractal gating motions at the enzyme acetycholinesterase // Phys. Rev.-2001. -V. 63. P. 41-49.

193. Shi J., Boyd A.E., Radic Z. and Taylor P. Reversibly bound and covalently attached ligands induce conformational changes in the omega loop, cys69

194. Cys96 of mouse acetycholinesterase // The Journal of Biol. Chem. 2001.-V.276 -P.42196-42204.

195. Shin I, Kreimer D, Silman I, Weiner L. Membrane-Promoted Unfolding of Acetylcholinesterase: A Possible Mechanism for Insertion into the Lipid Bilayer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1997 -V. 94, N.10 -P. 2848-2852.

196. Sihotang K. A simple method for purification of acetylcholinesterase from human erythrocyte membranes // Biochemica et Biophysica Acta. 1974. -V. 370.-P.468-476.

197. Sihotang K. Acetylcholinesterase and its association with lipid // Eur. J. Biochem. 1976.-V.63-P. 519-524.

198. Silman I, Sussman J.L. Acetylcholinesterase: 'classical' and 'non-classical' functions and pharmacology // Curr. Opin. Pharmacol. -2005 -V.5 -P. 293-302.

199. Smart J. L, McCammon J. A. Analysis of synaptic transmission in the neuromuscular function using a continuum finite element model // Biophys. J. -1998. -V. 75. P. 1679-1688.

200. Somogyi P. and Chubb I.W. The recovery of acetylcholinesterase activity in the superior cervical ganglion of the rat following the inhibition by diiso-propylphosphottuoridate: By a chemical and cvtochemical study // Neuroscience -1976 -V.l-P. 413-421.

201. Soreq H. and Seidman S. Acetylcholinesterase—new roles for an old actor //Nat. Rev. Neurosci. -2001 -V.2 -P.294-302.

202. Spinedi A., Rufini S., Luly P., and Farias R. N. The temperature-dependence of human erythrocyte acetylcholinesterase activity is not affected by membrane cholesterol enrichment // Biochem J. -1988 V.255, N.2 -P. 547-551.

203. Srivatson M., Peretz B. Acetycholinesterase promotes regeneration of neuritis in cultured adult neurons of Aplysia // Neuroscience. 1997. - V. 77.-P. 921-931.

204. Storey K.B., Storey J.M. Metabolic rate depression in animals transcriptional and translational controls // Biol. Rev. 2004. -V. 79. -P. 207-233.

205. Sun M., Lee C. J., Shin H-S. Reduced nicotinic receptor function in sympathetic ganglia is responsible for the hypothermia in the acetylcholinesterase knockout mouse // J Physiol -2007 -V.578.3 -P.751-764.

206. Sussman J.L., Harel M., Frolow F., Oefner C., Goldman A., Toker L., Sil-man I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein // Science -1991 -V.253 -P.872-879.

207. Suzuki K., Okumura Y. and Sunamoto J. Induction of acetylcholinesteraserelease from erythrocytes in the presence of liposomes // J. Biochem. -1999 -V.125, N.5 -P.876-882.

208. Szabo A., Shoup D., Northrup S. H., McCammon J. A. Stochastically gated diffusion-influenced reactions // J. Chem. Phys. -1982 -V.77 -P.4484-4493.

209. Szegletes T., Mallender W.D., Thomas P.J., Rosenberry T.L. Substrate binding to the peripheral site of acetylcholinesterase initiates enzymatic catalysis. Substrate inhibition arises as a secondary effect // Biochemistry -1999 -V.38 -P.122-133.

210. Tai K., Bond S. D., MacMillan H. R., Baker N. A., Hoist M. J., McCammon J. A. Finite Element Simulations of Acetylcholine Diffusion in Neuromuscular Junctions // Biophys. J. -2003. -V. 84, N4. -P.2234-2241.

211. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J. L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry -1993 -V.32, N.2 -P.401-^403.

212. Tara S.A, Helms V., Straatsma T. P., McCammon J. A. Molecular dynamics of mouse acetylcholinesterase complexed with huperzine A // Biopolymers -1999 -V.50, N.4 -P.347-359.

213. Taylor P. Acetylcholinesterase. In pharmacological basis of therapeutics: Hardman J.G., Limbird L.E., Moninoff P.B., Rudden R.W., Oilman A.O., McCraw-.NewYork.-l 996.-P. 161 -176.

214. Taylor P., Brown J. Acetylcholine //Neurochem. 1999. - P. 5-49.

215. Taylor P., Radic Z. The cholinesterases: from genes to proteins // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1994. - V. 34. - P. 281-320.

216. Tekulics P., Rakonczay Z., Szerdahelyi P., Kasa P.and Gulya K. Effects of ischemia on cholinergic neurotransmission and electrolyte content in newborn pig lumbar spinal cord // Life Sciences -1999 -V.46,N. 11 -P811-817.

217. Testa I., Rabini R.A., Fumelli P., Bertoli E.,Mazzati L. Abnormal membrane fluidity and acetylcholinesterase activity in erythrocytes from insulindependent diabetic patients // J. Clin. Endocrinal and Metab. 1988. - V. 67, N. 6.-P. 1129-1133.

218. Timofeeva O.A. and Gordon C.J. EEG spectra, behavioral states and motor activity in rats exposed to acetylcholinesterase inhibitor chlorpyrifos // Pharmacol. Biochem. Behav. -2002. -V.72. -P. 669-679.

219. Timasheff S.N. Protein Hydration, Thermodynamic binding, and preferential hydration // Biochemistry. 2002. V.41, N.46 -P. 13743-13782.

220. Topilko A., Caillou B. Acetylcholinesterase in human thymus cells // Blood. -1985.-V. 66.-P. 891-895.

221. Tsakiris S. Control of the activity of the brain synaptosome-associated acetylcholinesterase by acidic phospholipids // Z. Naturforsch C. 1985. - V. 40. - P. 97-101.

222. Voet D., Voet J.G. (1995) Biochemistry. 2nd ed. John Wiley and Sons, New York.

223. Wang L. C.H., Lee N.F. // Handbook of Physiology / Eds Fregly M.J., Blatteis C.M. N.Y.: Oxford University Press, 1996. P. 507-531.

224. Weeber E.J., Atkins C.M., Selcher J.C., Varga A.W., Mirnikjoo B., Paylor R., Leitges M., Sweatt J.D. A role for the beta isoform of protein kinase C in fear conditioning // J Neurosci.-2000. -V.20 -P.5906-5914.

225. Weikert T., Rathjen F.G., Layer P.G. Developmental maps of acetylcholinesterase and G4-antigen of the early chicken brain: long-distance tracts originate from AChE-producing cell bodies // J Neurobiol -1990 -V.21 -P.482-498.

226. Wessler I., Kilbinger H., Bittinger F., Unger R. and Kirkpatrick C. J. Thenon-neuronal cholinergic system in humans: Expression, function and pathophysiology // Science. -2003 -V. 72, N. 18-19 -P. 2055-2061.

227. Wessler I., Kirkpatrick C. J., Racke K. The cholinergic 'pitfall': acetylcholine, a universal cell molecule in biological systems, including humans // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology -1999 -V. 26 ,N. 3 -P. 198-205.

228. Wiedmer T., Di Francesco C, Brodbeck U. Effects of Amphiphiles on Structure and Activity of Human Erythrocyte Membrane Acetylcholinesterase // J. Biochem. -1979.-V. 102.-P.59-64.

229. Williams M.A., Goodfellow J.M., Thornton S.M. Buried water and internal cavities in protein // Protein Sci. 1994. -V.3 -P. 1224-1235.

230. Wilson I.B., Bergmann F. Acetylcholinesterase VIII. Dissociation constants of the active groups // J. Biol. Chem. -1950 -V.186 -P.683-692.

231. Wlodeck T.S., Clark T.W., Scott L.R., McCammon J. Molecular dynamics of acetylcholinesterase dimer complexes with tacrine // J. Am. Chem. Soc. -1997. -V. 119.-P. 9513-9522.

232. Wutrich K, Wagner G., Richarz R., Braun W'. Correlations between internal mobility and stability of globular proteins//Biophys.J. 1980. V.32(l). -P.549-560.

233. Yang L., He H.Y., Zhang X. Increased expression of intranuclear AChE involved in apoptosis of SK,N-SH cells // Neurosci. Res. -2002 -V. 42 ,N.4, -P. 261-268.

234. Zhang B.F., Peng F.F, Zhang J.Z., and Wu D.C. Protective effects of tacrine and donepezil against staurosporine-induced apoptotic death // Yao Xue Xue Bao -2002 -V.37 -P.98-102.

235. Zhang X.J., Yang L., Zhao Q., Caen J.P., He H.Y., Jin Q.H., Guo L.H., Alemany M., Zhang L.Y. & Shi Y.F. Induction of acetylcholinesterase expression during apoptosis in various cell types // Cell Death Differ -2002 -V.9 -P.790-800.

236. Zhang Y., Kua J., McCammon J.A. Role of the catalytic triad and oxya-nion hole in acetylcholinesterase catalysis: an ab initio QM/MM study // J. Am. Chem. Soc. -2002 -V.124, N.35 -P.10572-10577.

237. Zhou F.C. AND Azmitia E.C. Laminin facilitates and guides fiber growth of transplanted neurons in adult brain // J. Chem. Neuroanat. -1988 -V.l -P.133-146.

238. Zhou H-X. and Szabo A. Theory and simulation of the time-dependent rate coefficients of diffusion in uenced reactions // Biophys. J. -1996 -V.71 -P.2440-2457.

239. Zhou H-X., Briggs J.M., McCammon J.A. A 240-fold electrostatic rate enhancement for acetylcholinesterase substrate binding can be predicted by the potential within the active site // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118. -P.13069-13070.

240. Zhou H-X., Wlodek S.T., McCammon A. Conformation gating as a mechanism for enzyme specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 9280-9283

241. Zimmerman G., Soreq H. Termination and beyond: acetylcholinesterase as a modulator of synaptic transmission // Cell Tissue Res. -2006. -V.326 -P. 655-669.

242. Zimmermann H. ATP and acetylcholine, equal brethren // Neurochem. Intl. 2008. V. 52. P. 634-348.

243. Zimmermann H. Extracellular purine metabolism // Drug Dev. Res. 1996. V. 39.P. 337-352.

Информация о работе

Матхкор Тхикра Хасан
кандидата биологических наук
Махачкала, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга млекопитающих при гипотермических состояниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы