Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи

Кривой, Игорь Ильич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЬМ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КРИВОЙ Игорь Ильич

ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОИ

ПЕРЕДАЧИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в НИИ физиологии им. акад. А.А.Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Д.П.Матюшкин академик РАН А.Д.Ноздрачев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН Р.С.Орлов доктор биологических наук, профессор Г.А.Наследов доктор медицинских наук, профессор В.Б.Долго-Сабуров

Ведущее учреждение - Институт физиологии им.И.П.Павлова РАН

Защита состоится -19д8 г> в « /б и час

на заседании диссертационного Совета Д 063.57.19 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " ^ "--1998 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор биологических наук Н.Д.Ещенко

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема пластичности синаптичес-кой функции и нервной системы в целом одна из важнейших в современной нейрофизиологии (Экклс, 1966; Вартанян, Василевский, 1966; Турпаев, Сахаров, 1967; Кэндел, 1980; Воронин, 1982; Мокрушин, Емельянов, 1992; Zucker, 1989; Malenka, 1995). Холинергический нервно-мышечный синапс позвоночных является традиционной моделью исследований в этой области. В модуляции нервно-мышечной передачи могут участвовать самые различные факторы нервного и мышечного происхождения (Северин и др., 1970; Турпаев, Путинцева, 1974; Матюшкин, 1975,-1980; Болдырев, 1977; Hamilton, Smith, 1991), в том числе сам медиатор ацетилхолин (АХ). Классическая проблема физиологической роли медиаторов и вопрос о немедиаторной, регуляторной функции АХ (Ухтомский, 1940; Гинецинский, Михельсон, 1937; Коштоянц, 1951; Беритов, 1959; Зефиров, 1967; Полетаев, 1974; Никольский, 1974) сохраняют свою актуальность и в настоящее время. И это не случайно, если учесть широкий спектр действия АХ на самые различные биохимические системы клеток (Голиков и др., 1985; Долго-Сабуров, 1985). Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизмы хопинергической модуляции нервно-мышечной передачи остаются во многом не ясными.

Один из основных механизмов синаптической пластичности -модуляция секреции медиатора из нервных окончаний (Матюшкин, 1975;1980; Ноздрачев, Пушкарев, 1980; Zucker, 1989; Bowman, 1990; Voronin, 1993), которая может осуществляться через пре-синаптические ауторецепторы по принципу отрицательной или положительной обратной связи. До сих пор нет единого мнения о структуре, механизмах функционирования и о физиологической значимости ауторецепторов в нервно-мышечном синапсе позвоночных. В качестве пресинаптических мишеней медиатора АХ, через которые может осуществляться модуляция нервно-мышечной передачи, рассматривают самые различные структуры: Н- и М-холино-рецепторы (Никольский, 1990; Wessler, 1989; Wilson, Thomsen, 1991; Tian et al., 1994), К+-каналы (Зефиров, Шакирьянова, 1992; Hevron et al., 1986), некоторые ферментные системы, в частности, Ыа+/К+'-АТФазу и сопряженный с ней ионный насос. Однако механизм участия Na+/K+-насоса в холинергической регуляции квантовой секреции медиатора из моторных нервных терми-

налей и ее роль в модуляции нервно-мышечной передачи остаются неизвестными, несмотря на множество фактов, косвенно подтверждающих эту возможность (Глебов, Крыжановский, 1978; Никольский и др.1989; Vizi, 1978; Maeno et al., 1995).

Следующая проблема - постсинаптическая холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи, осуществляемая через постсинаптическую потенциацию и десенситизацию холинорецепто-ров (Магазаник, 1988; Гиниатуллин, 1992; Hartzell et al., 1975; Glavinovic, 1991). Постсинаптическая потенциация проявляется в увеличении амплитуды и длительности постсинаптичес-ких ответов при повышении концентрации АХ в синаптической щели, при десенситизации наблюдается обратная картина. К настоящему времени изучены далеко не все проявления и молекулярные механизмы этих феноменов. Это объясняется тем, что постсинаптическая потенциация, как правило, маскируется одновременно развивающейся десенситизацией и не было четкого критерия, позволяющего разделять и независимо изучать эти явления.

Проблема холинергической модуляции нервно-мышечной передачи тесно связана с механизмом формирования следовых реакций АХ, что во многом обусловлено особенностями функционирования синаптической ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Многочисленные данные свидетельствуют о высокой активности и "избыточности" синаптической АХЭ в фазных мышцах позвоночных (Прозоровский, Саватеев, 1976; Barstad, 1960; Barnard et al., 1971; Hobbi-ger, 1976). Вместе с тем, накоплены факты, противоречащие такому представлению (Кривой, 1984; Магазаник, 1988; Miledi et al., 1984; Nikolsky et al., 1994). Эти разногласия, имеющие непосредственное отношение к вопросу о функциональной роли синаптической АХЭ, также требуют своего объяснения.

Важным в исследовании функциональной роли синаптической АХЭ является поиск надежного метода определения ее активности. С этой проблемой непосредственно связано изучение особенностей кинетики ингибирования нативной АХЭ в интактных синапсах, которая существенно отличается от кинетики ингибирования очищенного фермента (Bullock et al., 1977; Laskowski, Dett-barn, 1979), а также вопрос о механизме восстановления синаптической передачи после отравления фосфорорганическими ингибиторами АХЭ, который имеет несомненное практическое значение, но окончательно не решен (Данилов, Иванов, 1972; Самой-

- 5 -

лова, 1983; Melchers, Van der Laaken, 1991).

Цель и задачи исследования.

1. Выяснить влияние изменения условий секреции, рецепции и гидролиза АХ, а также других факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи, на параметры постсинапти-ческих ответов.

2. Изучить условия диффузии медиаторного АХ и возможность формирования его следовых реакций в синаптической щели, а также функциональную значимость синаптической АХЭ при разных режимах активности нервно-мышечного синапса.

3. Проверить реальность участия Ыа+/К+-АТФазы в холинер-гической модуляции квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний и выяснить возможный механизм такой моду ляции.

4. Провести анализ проявлений постсинаптической потенци-ации в различных экспериментальных условиях и установить количественный критерий ее оценки.

5. Исследовать электрофизиологическим способом кинетику ингибирования синаптической АХЭ, используя в качестве критерия параметры постсинаптических потенциалов и токов.

6. Изучить механизм восстановления нервно-мышечной передачи после нарушений, вызванных фосфорорганическим ингибитором АХЭ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Благодаря особенностям структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса диафрагмы крысы при ин-тактной АХЭ имеется возможность задержки и накопления в синаптической микросреде АХ в концентрации, достаточной для модуляции пре- и постсинаптической функции. Синаптическая АХЭ выполняет двойственную функциональную роль, обеспечивая не только надежную передачу частотной импульсации мотонейронов, но и тонкую модуляцию нервно-мышечной передачи через изменение уровня АХ в синаптической щели.

2. Ацетилхолин в концентрации, сопоставимой с физиологическим его уровнем в синаптической щели в покое, способен вызывать долговременное следовое усиление вызванного квантового освобождения медиатора, функционально значимое в условиях сниженного гарантийного фактора нервно-мышечной передачи. Последействие АХ реализуется через структуру, отличающуюся по

- б -

фармакологическим характеристикам от постсинаптических Н- или М-холинорецепторов, при участии Ма+/К+-АТФазы и вторичных мессенджеров.

3. Постсинаптическая потенциация проявляется при полностью активной АХЭ и градуально усиливается по мере ее инги-бирования. Молекулярные механизмы связывания АХ, определяющие временное течение постсинаптических ответов и собственно постсинаптическую потенциацию, различны. Предложен критерий, позволяющий оценивать постсинаптическую потенциацию в условиях, когда это явление маскируется другими процессами, в том числе десенситизацией.

4. Амплитудно-временные характеристики постсинаптических токов содержат информацию об активности синаптической АХЭ и могут быть использованы для ее оценки. Такой электрофизиологический подход позволяет в условиях интактного синапса оценивать состояние именно функциональной АХЭ (непосредственно участвующей в гидролизе медиаторного АХ), что не обеспечивается другими методами.

Научная новизна. Проведен комплексный экспериментальный и теоретический анализ параметров спонтанных и вызванных постсинаптических ответов при изменении факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи: активности синаптической АХЭ, режима активации двигательного нерва, температуры, плотности распределения постсинаптических холинорецеп-торов. Впервые исследована кинетика активации постсинаптичес-кой мембраны в случае генерации миниатюрных и вызванных токов концевой пластинки (ТКП) при градуальном угнетении АХЭ с помощью ее ингибиторов разных типов.

Получены новые данные о возможности задержки и накопления медиаторного АХ в синаптической щели при нормальной активности АХЭ. Эти факты, свидетельствующие против традиционных представлений об "избыточности" синаптической АХЭ, наряду с другими нашими данными, подтверждающими эти представления, позволили по-новому оценить функциональную роль синаптической АХЭ в нервно-мышечном синапсе позвоночных. Предложена идея о двоякой функции синаптической АХЭ, обеспечивающей в зависимости от концентрации АХ не только проведение частотной им-пульсации мотонейронов, но и тонкую холинергическую пре- и постсинаптическую регуляцию нервно-мышечной передачи через

- 7 -

изменение уровня АХ в синаптической щели.

Обнаружена и исследована не известная ранее длительная следовая гиперполяризация мембраны мышечных волокон и нервных терминалей, вызываемая АХ в низкой концентрации, сопоставимой с физиологическим уровнем медиатора в синаптической щели. Установлено, что этот эффект АХ реализуется при участии На+/К+~АТФазы и лежит в основе изменения спонтанной и вызванной квантовой секреции АХ. Впервые показано, что вызываемое АХ следовое увеличение квантового состава ТКП приводит к повышению гарантийного фактора синаптической передачи и долговременному восстановлению работоспособности утомляемых мышц. Таким образом, получены новые данные, свидетельствующие об участии Ыа+/К+-АТФазы в пресинаптической холинергической модуляции, и продемонстрировано значение такого механизма в обеспечении эффективности нервно-мышечной передачи при сниженном гарантийном факторе.

Впервые исследованы проявления постсинаптической потен-циации и оценен молекулярный механизм этого явления в случаях спонтанных одноквантовых и вызванных многоквантовых ответов при градуальном снижении активности АХЭ; применены также изменение температуры, частичное блокирование постсинаптических холинорецепторов и разные режимы стимуляции двигательного нерва. В качестве критерия оценки постсинаптической потенциа-ции предложен и использован не применявшийся ранее показатель. Обоснована адекватность данного критерия, позволяющего экспериментально отделять постсинаптическую потенциацию от десенситизации и других маскирующих факторов.

Впервые применен электрофизиологический подход к оценке активности и кинетики ингибирования именно функциональной АХЭ, основанный на анализе амплитудно-временных характеристик спонтанных одноквантовых постсинаптических ответов. Полученные значения кинетических констант ингибиторов АХЭ обратимого и необратимого типов подтверждают представления об особенностях функционирования нативной АХЭ в синаптической щели. Такой же электрофизиологический подход, примененный при анализе механизма спонтанного восстановления нервно-мышечной передачи, нарушенной действием фосфорорганического соединения, подтвердил, что в основе этого явления лежит слабое повышение активности синаптической АХЭ.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование, связанное с выяснением механизмов холинер-гической модуляции и пластичности нервно-мышечной передачи, вносит несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы немедиаторной функции нейромедиатора АХ. Обобщение результатов работы существенно расширяет представления о структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса позвоночных, а также о механизмах секреции, рецепции и гидролиза медиатора АХ, обеспечивающих синаптическое проведение и функционирование нервно-мышечного аппарата в естественных условиях. Предположение о двойственности функции синаптической АХЭ позволяет по-новому оценить функциональную роль этой ферментной системы в нервно-мышечной передаче. Получены новые данные о механизмах, противодействующих периферическому утомлению.

Результаты проведенного в работе теоретического и экспериментального анализа следует учитывать при проведении физиологических и фармакологических исследовний на нервно-мышечных и других холинергических синапсах, при разработке весьма актуальных в настоящее время математических моделей синаптической передачи. Полученные данные могут оказаться полезными для понимания патогенеза и при лечении некоторых заболеваний нервно-мышечного аппарата; при поиске новых эффективных средств для предупреждения, диагностики и лечения интоксикаций, вызванных фосфорорганическими и другими ингибиторами АХЭ; при разработке и лабораторных испытаниях новых лекарственных препаратов синаптотропного действия.

Разработанные и примененные в диссертации методы, а также результаты исследований использованы в работе Института токсикологии МЗ РФ, внедрены в практикумы и курсы лекций на кафедре общей физиологии Санкт-Петербургского государственного университета и могут быть рекомендованы при составлении учебных программ физиологических кафедр университетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Представленные в диссертации материалы были доложены на: заседаниях Ленинградского отделения общества физиологов, биохимиков и фармакологов им.И.М.Сеченова (1983-1995); XXVIII конгрессе Международного Общества Физиологических Наук (Будапешт, 1980); III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии (Тбилиси,

1982) ; V и VI Всесоюзных симпозиумах "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1984, 1991); III, IV и V Всесоюзных конференциях "Физиология и биохимия медиаторных процессов", посвященных памяти Х.С.Коштоянца (Москва, 1980, 1985, 1990); V Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тепа-ви, 1985); IX совещании "Вопросы эволюционной физиологии" (Ленинград, 1986) ; I Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1986); XV съезде Всесоюзного физиологического общества им.и.П.Павлова (Кишинев, 1987); конференции ФНШ им.А.А.Ухтомского ЛГУ "Доминантные механизмы поведенческих адаптаций" (Ленинград, 1990); XXXII конгрессе Международного Общества Физиологических Наук (Глазго, 1993); XVII съезде Физиологического общества РАН (Пущино, 1993); Международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994); I Всероссийской конференции токсикологов "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" (Санкт-Петербург, 1995) ; Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996); XXXIII конгрессе Международного Общества Физиологических Наук (Санкт-Петербург, 1997); Международном симпозиуме "Молекулярные и генетические основы адаптивного поведения" (Колтуши, 1997) .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе 3 обзора и 3 главы коллективной монографии "Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества" (Л.: Изд-во ЛГУ, 1987).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; методического раздела; 4-х глав, включающих обзор литературы, собственные экспериментальные данные и заключение; общего заключения; выводов; списка цитированной литературы, содержащего 403 источника. Диссертация изложена на 314 страницах, иллюстрирована 54 рисунками и 12 таблицами.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная часть экспериментов выполнена на изолированных френико-диафрагмальных препаратах белых крыс с использованием проточного физиологического раствора, постоянно аэрируемого карбогеном, при температуре 28°С. Мышечные сокращения в условиях непрямого и прямого раздражения мышц регистрировали в изометрическом режиме с помощью механотрона. Наружными хлор-

серебряными электродами регистрировали суммарные мышечные потенциалы действия. Применяли следующие методики с использованием стеклянных микроэлектродов: внутриклеточная регистрация мембранного потенциала покоя (МПП) и потенциалов действия мышечных волокон; внутриклеточная и внеклеточная регистрация потенциалов и токов концевой пластинки (ПКП и ТКП); внутриклеточная регистрация ТКП в условиях двухмикроэлектродной фиксации потенциала; внеклеточная регистрация ионных токов нервных терминалей.

Для обездвиживания мышц при сохранении нормального квантового состава в большинстве случаев применяли поперечную перерезку мышечных волокон (Волкова и др., 1975; Glavinovic, 1979). В части опытов повышали концентрацию Мд2+ в растворе.

Аналоговые сигналы обрабатывали вручную, либо с помощью ЭВМ (шаг оцифровки 35-50 мкс) и специально разработанных программ. Измеряли МПП, а у мышечных потенциалов действия и постсинаптических ответов - амплитуду, длительность восходящей фазы (Тв) и время полуспада (Тпс). Квантовый состав нервно-мышечной передачи оценивали по отношению амплитуд вызванных и спонтанных ответов, а также по коэффициенту вариации амплитуд вызванных ответов. Применяли программы для статистической и графической обработки результатов Statgraph и Grapher; в тексте приведены средние значения величин с их ошибками (М±ш).

В экспериментах применяли АХ, карбахолин и ингибиторы АХЭ (армии, галантамин) отечественного производства; d-тубо-курарин (Orion); оксотреморин, скополамин, толбутамид и оуа-баин (все Sigma); гепарин (Sigma или СПОФА, Прага).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. ВОЗМОЖНОСТЬ ФОРМИРОВАНИЯ СЛЕДОВЫХ РЕАКЦИЙ АЦЕТИЛХОЛИНА В СИНА1ГГИЧЕСКОЙ ЩЕЛИ

Амплитудно-временные характеристики миниатюрных ТКП (МТКП) использовали для получения информации об особенностях структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса диафрагмы крысы. МТКП регистрировали при фиксации потенциала мембраны на уровне -100 мВ. Для разной степени угнетения АХЭ применяли галантамин (конкурентный ингибитор обратимого типа) в 5 концентрациях от 0,86х10~7 до 2,7хЮ~5 моль/л, а

также фосфорорганическое соединение армин, относящийся к конкурентным ингибиторам необратимого типа. "Гигантские" и прочие атипичные МТКП анализировались отдельно.

Амплитуда и длительность МТКП увеличивались в присутствии галантамина и достигали максимальных значений при концентрации 2,7х10~6 моль/л: амплитуда, Тв и Тпс МТКП составили, соответственно, 139%, 141% и 266% по сравнению с контролем (см.таблицу). Спад МТКП во всех случаях был близок к экспоненциальному. Таким образом, наиболее чувствительным показателем изменения активности АХЭ оказалось значение Тпс МТКП. Для оценки максимального эффекта ингибирования АХЭ использовали армин (4х10~7 моль/л). Величина Тпс МТКП в промежутке времени, когда еще не развивалась десенситизация (10-40 минут действия армина), составила 2,12+0,12 мс, п=Э (379% к контролю). Галантамин в концентрации 2,7х10~5 моль/л, при которой наблюдался "курареподобный" эффект, сопровождающийся появлением двухфазности спада МТКП, в дальнейшем не применяли.

Параметры МТКП в контроле и при действии галантамина

Концентрация галантамина (моль/л)

0 0,86х10"7 2,7x10"7 8,6х10"7 2,7х10"6

А (нА) 6,14+0,22 6,65+0,38 7,65+0,26 7,82±0,40 8,55±0,40

Тв (мс) 0,29+0,01 0,28+0,02 0,32+0,01 0,36+0,01 0,41+0,02

Тпс(мс) 0,56+0,02 0,66+0,02 0,80+0,02 1,04+0,05 1,49+0,08

п 34 19 17 24 21

В каждом синапсе амплитуда и длительность отдельных МТКП варьировали. Коэффициент вариации Тпс МТКП, составлявший 0,17+0,01 (п=34) при интактной АХЭ, возрастал до 0,30±0,01 (п=42) при угнетении АХЭ армином. Коэффициент вариации Тв МТКП увеличивался при этом с 0,16+0,01 до 0,31+0,02, соответственно. В присутствии сЗ-тубокурарина в концентрации (1,3-6,5)х10~8 моль/л (АХЭ инактивирована армином), вызывав-

:шего снижение амплитуды и Тпс МТКП в среднем в 1,6 раза, коэффициенты вариации Тпс и Тв МТКП уменьшались до 0,25+0,01 и 0,18+0,01 (п=24), соответственно.

При охлаждении раствора с 28°С до 18°С наблюдалось значительное увеличение длительности МТКП. Величина Q]_o для Тпс МТКП составила 3,16 при интактной АХЭ и была несколько ниже при ингибировании АХЭ армином - 2,72. Таким образом, величина QlO для фазы спада МТКП была около 3, что характерно для процесса, имеющего в своей основе химическую реакцию. Величина QlO Для Тв МТКП оказалась меньше и составила при интактной и ингибированной АХЭ 1,78 и 2,28, соответственно. При охлаждении наиболее заметно увеличивался коэффициент вариации Тв МТКП: до 0,34+0,02 (п=22) (интактная АХЭ) и до 0,38±0,03 (п=20) (ингибированная АХЭ).

Коэффициент вариации амплитуд МТКП, составлявший 0,18+0,01 (п=34) при интактной АХЭ, при угнетении АХЭ армином, действии d-тубокурарина и при охлаждении не изменялся.

Приняв, что длительность восходящей фазы МТКП отражает время распространения диффузионной волны АХ от места освобождения кванта (Matthews-Bellinger, Salpeter, 1978; Land et al., 1980; Madsen et al., 1987), мы оценили скорость диффузии АХ в синаптической щели по результатам измерения Тв МТКП при различной степени угнетения АХЭ галантамином. Основанное на этих данных моделирование условий распространения диффузионной волны АХ по площади связывания кванта АХ показало, что диффузия АХ в синаптической щели примерно на порядок замедлена по сравнению со свободной.

Косвенно этот вывод был подтвержден при оценке задержки и накопления в синаптической щели ионов К+, имеющих сходный с АХ коэффициент свободной диффузии (опыты на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки). Обнаруженный сдвиг определяемого экстраполяцией и интерполяцией потенциала реверсии ТКП при ритмическом раздражении нерва (50 имп/с) соответствовал повышению концентрации К+ в синаптической щели более чем на 3 ммоль/л.

Величина Тв атипичных медленных МТКП при интактной АХЭ (1,45+0,08 мс, п=37) была в 4,5 раза больше, чем у нормальных МТКП при ингибированной АХЭ. Увеличение амплитуды, Тв и Тпс медленных МТКП после ингибирования АХЭ (соответственно, в

1,26, 1,48 и 2,31 раза) характеризовало достаточно высокую исходную активность АХЭ в местах их генерации. Низкий температурный коэффициент Тв медленных МТКП (1,0 при интактной и 1,6 при ингибированной АХЭ) указывал на преимущественно диффузионный характер этого процесса. Данные позволяют предположить удаленность мест секреции некоторых квантов АХ от синап-тической щели и постсинаптических холинорецепторов, что возможно, например, в случае их освобождения из шванновской клетки в периаксональное пространство.

2. ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ ПРЕСИНАПТИЧЕСКОГО КВАНТОВОГО ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА

Повышение уровня АХ в синаптической щели моделировали с помощью аппликации АХ (1x10 моль/л) в раствор или путем те-танизации нерва (частота 20 имп/с, длительность -1с). Опыты проводили в условиях ингибирования АХЭ армином (4x10 моль/л). Мышцы утомляли, непрерывно раздражая нерв с частотой 1 имп/с, - модель утомления, в значительной мере обусловленного пресинаптическими нарушениями (Никольский, Полетаев, 1977; 31еск, РгакаэЬ, 1995) .

АХ добавляли в раствор на 15 минут через 3 0 минут утомления, когда сокращения ослабевали до 20,8±2,б% (п=10) по сравнением с контролем. После удаления АХ из раствора наблюдалось долговременное (1-2 часа) усиление мышечных сокращений до 56,6+9,5% (п=Ю, р>0,99) к контролю через 2 часа отмывания; одновременно увеличивалась амплитуда суммарных мышечных потенциалов действия. Амплитуда и длительность внутриклеточно регистрируемых потенциалов действия мышечных волокон, сила сокращений при одиночной прямой стимуляции мышц (каждые 5-10 минут), а также чувствительность к АХ постсинаптической мембраны, оцениваемая по параметрам МТКП, в ходе отмывания АХ не изменялись. Без применения АХ восстановления работоспособности мышц не происходило, но оно наблюдалось после однократных тетанизаций нерва, проводимых через каждые 15 минут.

Усиление сокращений после применения АХ отсутствовало на фоне й-тубокурарина (15 нмоль/л) и скополамина (0,1 мкмоль/л), частично имитировалось карбахолином (5-10 мкмоль/л), но не оксотреморином (1-20 мкмоль/л). На фоне бло-катора цАМФ-зависимой протеинкиназы А толбутамида (2-200

мкмоль/л) эффект последействия АХ полностью воспроизводился, но отсутствовал на фоне гепарина (1 мкмоль/л), блокирующего инозитолтрифосфатный путь освобождения внутриклеточного Са^+.

После добавления АХ в раствор наблюдалось следовое увеличение на 30,4+7,7% (п=7, р>0,99) амплитуды ТКП, следующих с частотой 1 ими/с (внеклеточная регистрация, концентрация Мд2+ повышена до 10-15 ммоль/л). Через 30-60 минут отмывания в некоторых мышечных волокнах появлялись потенциалы действия, которые "маскировали" ТКП (рис.1), начинались подергивания, осложняющие регистрацию и автоматическую обработку параметров ТКП. Оценка по параметрам МТКП, измеренным до начала стимуляции нерва и сразу по его окончании, а также по коэффициенту вариации амплитуд ТКП, показала соответствующее увеличение их квантового состава. Параллельно возрастала амплитуда Ыа+-тока пресинаптических спайков и снижалась частота МТКП: соответственно, до 125,8±7,2% (п=9, р>0,99) и до 12,3±5,3% (п=18, р>0,99) к исходному уровню через 1 час отмывания (рис.1). На фоне оуабаина (10 мкмоль/л) изменений амплитуды Ыа+-тока и

% ИВ

Рис.1. Изменение амплитуды ТКП (1), амплитуды Ыа+-тока нервной терминали (2), частоты МТКП (3) и МГШ мышечных волокон (4) после аппликации АХ. Справа - токи нервной терминали а токи концевой пластинки перед добавлением АХ (а), на 15-й минуте действия АХ (б), через 30 (в) и через 60 (г) минут отбывания. Стрелкой отмечено появление мышечных потенциалов действия. Калибровка: 200 мкВ, 2 мс.

частоты МТКП в присутствии АХ и при его отмывании не наблюдалось.

Добавление АХ в раствор вызывало гиперполяризацию внеси-наптического района мышечных волокон на 2,0+0,6 мВ (р>0,99), которая сохранялась и возрастала до 3,2±0,б мВ в течение 2-х часов отмывания (около 150 волокон в каждой серии измерений); этот эффект наблюдался как в утомляемых мышцах, так и в покое. Гиперполяризация (как и усиление мышечных сокращений) полностью воспроизводилась на фоне толбутамида и отсутствовала на фоне d-тубокурарина, скополамина, гепарина, а также блокатора Иа+/К+-АТФазы и электрогенного насоса оуабаина (20-50 мкмоль/л).

3. ПОСТСИШШТИЧЕСКАЯ ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ

Постсинаптическая модуляция нервно-мышечной передачи исследована на примере постсинаптической потенциации в двух вариантах ее проявления: 1) при генерации одноквантовых ответов, когда концентрация АХ повышается локально в зоне действия данного кванта; 2) при генерации многоквантовых ответов, когда концентрация АХ повышается в участках перекрывания зон действия отдельных квантов АХ. В обоих случаях постсинаптическая потенциация проявлялась в более медленном спаде высокоамплитудных ответов. Исходя из установленной пресинаптичес-кой природы вариабельности амплитуды МТКП, в качестве критерия постсинаптической потенциации впервые предложен и использован коэффициент корреляции между временем полуспада и амплитудой индивидуальных МТКП (г^/а)•

При интактной АХЭ и температуре 28°С (потенциал фиксации -100 мВ) величина гт/д составила 0,29+0,04 (п=30) и корреляция была положительной в 27 синапсах из 30. При ингибировании АХЭ галантамином увеличивалась не только длительность МТКП, но и величина г^/д, которая градуально возрастала по мере повышения концентрации галантамина, то есть степени ингибирова-ния АХЭ. Наибольшее значение г^/д составило 0,49±0,03 (п=42) при максимальном ингибировании АХЭ армином (4х10~7 моль/л), причем корреляция оказалась положительной во всех синапсах.

В присутствии d-тубокурарина (АХЭ инактивирована армином) , не влияющего на кооперативность связывания АХ с холино-рецепторами (Peper et al., 1982), амплитуда и тпс МТКП умень-

шались на 36%. При этом коэффициент вариации Тпс, возраставший при ингибированной АХЭ на 76%, уже только на 47% превышал контрольное значение, что свидетельствовало о снижении вероятности повторных связываний АХ с холинорецепторами, однако величина г^/д не изменялась: 0,48+0,02 (п=24). На фоне десенситизации, вызываемой при ингибированной АХЭ неквантовым АХ и приводящей к уменьшению амплитуды и длительности постсинапти-ческих токов (Гиниатуллин и др., 1990), величина г-р/д составила 0,56±0,03 (п=7), что даже несколько превышало ее значение в период максимального антихолинэстеразного эффекта арми-на до проявления десенситизации (0,48±0,05, п=8).

мс 3

0.6

Активная г АХЭ

I ' I I I I I I I I I I | I I I I I I I I II II.....

30 60 90 120 150 мин

0.4

0.2

0.0

ч1

Ингибированная АХЭ ,

гЬ

Рис.2. А - изменение времени полуспада (1) и величины гт/д (2) МТЮТ в ходе угнетения АХЭ армином. Аппроксимирующие кривые построены с помощью программы "СгарЬег" . Б - величина Гх/д в различных условиях: 1,3 - 18°С; 2,4,5,6 - 28°С; 5 - на фоне й-тубокурарина; 6 - в условиях десенситизации.

Охлаждение до 18°С приводило к полному исчезновению корреляции между Тпс и амплитудой МТКП при интактной АХЭ (гТ/А=-0,04+0,04, п=22) и существенному уменьшению величины ГТ/А Д° значения 0,33+0,04 (п=20) в условиях угнетения АХЭ армином, хотя, судя по эффекту ингибирования АХЭ (увеличение Тпс в 2,37 раза), повторное связывание АХ с холинорецепторами оставалось вполне эффективным.

В опытах с регистрацией одиночных вызванных ТКП их амп-

литуда и Тпс при интактной АХЭ (контроль) составили, соответственно, 98,7+7,0 нА и 0,70+0,05 мс (п=16); квантовый состав - около 50. Спад ТКП был близок к экспоненциальному и на

25% замедлен по сравнению со спадом МТКП. В присутствии га-

7 7

лантамина в концентрациях: 0,86x10 и 2,7x10 моль/л (снижение активности АХЭ, по нашим оценкам, на 25% и 50%) величина Тпс одиночных ТКП возрастала, соответственно, до 0,84±0,07 мс (п=9) и 0,97+0,09 мс (п=13) (120% и 139% к контролю). Спад ТКП сохранял экспоненциальность.

Постсинаптическую потенциацию оценивали, исходя из пре-синаптической природы (облегчение, депрессия) изменения амплитуд ритмических ТКП при частотах стимуляции нерва 20, 50 и 100 имп/с. Длительность таких ТКП изменялась в соответствии с их амплитудой, причем зависимость между этими параметрами была близка к линейной. Оценивали коэффициент корреляции между Тпс и амплитудой первых 15 ТКП в каждой серии.

В контроле (интактная АХЭ) такая корреляция наблюдалась при всех частотах стимуляции нерва. Величина гт/д варьировала от 0,64 до 0,77, причем в 32 из 38 волокон (84%) корреляция была достоверной (р>0,95). При частоте 50 имп/с величина г^/а возрастала от значения 0,73±0,057 (п=14) в контроле до 0,83±0,069 (п=8) и 0,92±0,015 (п=12) после икгибирования АХЭ на 25% и 50%, соответственно; корреляция была достоверной уже в 96% и 100% волокон. При прочих частотах стимуляции нерва отмечался сходный эффект. Во всех случаях возрастал (р>0,95) коэффициент линейной регрессии (тангенс угла наклона) зависимости Тпс от амплитуды ТКП. Величина поддерживающего тока в ходе ритмической стимуляции нерва в контроле и в опытах с га-лантамином не изменялась.

В условиях ингибирования АХЭ армином на спаде одиночных ТКП появлялась сверхмедленная компонента длительностью десятки миллисекунд. При действии й-тубокурарина в концентрации

1x10"' моль/л амплитуда одиночных ТКП снижалась на 4515%, тогда как величина Тпс - всего на 19+8% (п=8). Последнее объясняется замедлением в некоторых случаях первой фазы спада ТКП, причина которого пока не ясна. Тем не менее, общая длительность ТКП в присутствии с!-тубокурарина всегда уменьшалась, но, несмотря на это, двуфазность спада ТКП и угол наклона медленной фазы сохранялись.

4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗА И ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИЗМЕНЕНИЯ ЕЕ АКТИВНОСТИ

Для оценки изменения активности именно функциональной АХЭ впервые применен электрофизиологический подход, основанный на анализе амплитудно-временных характеристик спонтанных одноквантовых ответов при разной степени ингибирования АХЭ. Были использованы конкурентные ингибиторы АХЭ необратимого (армин) и обратимого (галантамин) типов, широко применяемые в лечебных целях и в электрофизиологических исследованиях (Прозоровский, Саватеев, 1976; Бородкин, Крауз, 1978).

В опытах с применением армина в 6 различных концентрациях (от 4x10"^ до 4х10~7 моль/л) определяли время достижения одинаковой степени угнетения АХЭ, оцениваемой по увеличению Тпс МПЮТ на 50% по сравнению с контролем. Моделировали кинетику необратимого ингибирования АХЭ с учетом ее псевдомономо-лекулярного характера. Полученное при наибольшей концентрации армина значение бимолекулярной константы ингибирования к.2 ^ = (12,0±1,7)х10^ моль_1мин_1 (п=6) существенно возрастало обратно пропорционально концентрации ингибитора.

При моделировании кинетики ингибирования синаптической АХЭ галантамином исходили из того, что соотношение между числом молекул АХ, связывающихся с холинорецепторами и с АХЭ, определяется соотношением констант скоростей устранения АХ из синаптической щели, соответствующих этим реакциям. При снижении активности АХЭ должна увеличиваться доля молекул АХ в кванте, связавшихся с холинорецепторами, и, соответственно, амплитуда МТКП. Модель, построенная на этих принципах с использованием уравнений ферментативной кинетики, характеризующих состояние системы субстрат-фермент-ингибитор в случае действия конкурентного ингибитора обратимого типа, позволила эмпирически установить вид связи между амплитудой МТКП и концентрацией ингибитора. Вид экспериментально полученной (см.таблицу, раздел 1) нами зависимости совпал с таковым, предсказываемым моделью. С помощью метода наименьших квадратов получено значение ингибиторной константы для галантамина - 2,8х10~7 моль/л и на его основании построена зависимость амплитуды и тпс МТКП от степени угнетения АХЭ (рис.3).

Изучение функциональной роли синаптической АХЭ было продолжено при исследовании работоспособности нервно-мышечного

Ад./Ао

1,4

200

1,2

150

1,0

_I_I_1

0 12 3

Галантамин (мкмояь/л)

100

0 25 50 75 100 Активность АХЭ (%)

Рис. 3. А - изменение амплитуды МТКП в зависимости от концентрации галантамина; Б - относительное изменение амплитуды (1) и Тле (2) МТКП при разной степени угнетения АХЭ.

собность мышц при непрямой и прямой стимуляции с частотой от 10 до 50 имп/с (длительность серий импульсов - 1 с) оценивали по площади под кривыми изометрических тетанических ответов, которая прямо пропорциональна среднему напряжению (СН), развиваемому мышцей.

Действие армина проявлялось в неспособности мышц удерживать тетанус при непрямом раздражении и в резком снижении СН при частотах свыше 20 имп/с (вплоть до блока) . При прямом раздражении пессимальные явления не возникали. При частоте 50 имп/с деполяризация постсинаптической мембраны достигала 10 мВ; в условиях фиксации потенциала поддерживающий ток возрастал на 25+6 нА при средней амплитуде первого ТКП в серии 50±9 нА (п=10). Наблюдалось усиление депрессии амплитуд ТКП: средняя амплитуда последних десяти ТКП в серии, отнесенная к амплитуде первого ТКП, составила 82+9% в контроле и 33±5% (п=6) в присутствии армина.

При удалении армина из раствора после 1 часа его действия уже через 15 минут заметно укорачивалась, а через 1 час практически полностью исчезала сверхмедленная компонента спада одиночных ТКП (см.раздел 3). Снижались уровень деполяризации постсинаптической мембраны, величина поддерживающего тока и степень депрессии амплитуд ПКП и ТКП. Восстанавливалась

аппарата после применения армина (4x10 моль/л). Работоспо

способность мышц удерживать тетанус. Величина СН, составлявшая в присутствии армина (частота стимуляции нерва 50 имп/с) 5±1% (п=15) от исходного значения, через 1,5 часа отмывания возрастала до 40±8% (п=5) к контролю. Параметры МТКП в ходе отмывания армина не изменялись.

В случае замены армина после 1 часа его действия на с!-тубокурарин (1х10~7 моль/л), вызывающий уменьшение амплитуды одиночных ТКП на 45±5%, наблюдалось снижение поддерживающего тока с 19+5 до 2+1 нА (п=8). Степень депрессии, оцениваемая как отношение средней амплитуды всех 50 ТКП в серии к амплитуде первого ТКП, снижалась до 42t7% по сравнению с 58±4% в присутствии армина (п=6, р>0,95). Ускорялось устранение пессимальных проявлений, восстановление СН было практически полным: до 88±6% (п=б) к контролю при частоте 50 имп/с. При сохранении армина в растворе эффект с1-тубокурарина был менее заметен.

При увеличении времени экспозиции мышц в армине до 2,5 часов никакого спонтанного восстановления СН не наблюдалось, а происходило дальнейшее угнетение мышечных ответов. При отмывании мышц раствором, содержащим армин в меньшей концентра-

ции (4x10 моль/л), наблюдалась лишь очень слабая тенденция к восстановлению СН и способности мышц удерживать тетанус.

Функционирование нервно-мышечного аппарата при разной степени угнетения АХЭ галантамином оставалось относительно нормальным в физиологическом диапазоне частот стимуляции нерва, без заметного усиления пессимальной реакции при снижении активности АХЭ вплоть до 10% от исходного уровня. Величина СН при частоте 50 имп/с снижалась всего на 12±2% (п=4) от контроля. Заметные пессимальные нарушения при такой активности АХЭ наблюдались только при частоте 100-150 имп/с. При угнетении АХЭ армином происходило резкое усиление пессимальных реакций уже при относительно невысоких частотах (20 имп/с) вплоть до полного блока при большей частоте стимуляции нерва.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе экспериментально получены и проанализированы амплитудно-временные характеристики постсинаптических потенциалов и токов при изменении факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи в изолированной диафраг-

ме крысы: активности АХЭ, режима активации двигательного нерва, температуры, плотности постсинаптических холинорецепто-ров. При этом кинетика активации постсинаптической мембраны медиатором впервые исследована при градуальном торможении активности АХЭ ингибиторами разных типов.

Установлено, что коэффициент вариации амплитуд МТКП не изменяется при угнетении АХЭ, при изменении температуры и при блокировании части постсинаптических холинорецепторов. Следовательно, вариации амплитуд МТКП имеют в основном пресинапти-ческую природу и отражают различия в количестве молекул АХ в отдельных квантах и в локальной концентрации АХ в синаптичес-кой щели. Этот вывод соответствует другим данным (Pennefat-her, Quastel, 1981; Glavinovic, 1986; Madsen et al., 1987), и именно пресинаптический характер вариации амплитуд МТКП лег в основу предложенного нами метода количественной оценки постсинаптической потенциации.

Обнаружены градуальное замедление восходящей фазы МТКП по мере ингибирования АХЭ, а также ее вариабельность при активной АХЭ, возрастающая при угнетении АХЭ и при охлаждении. Показано промежуточное положение температурного коэффициента Тв МТКП (Qio около 2) между температурными коэффициентами для диффузии и для химических реакций. Полученные данные подтверждают модель "насыщенного диска" (Matthews-Bellinger, Salpeter, 1978; Land et al., 1980; Madsen et al., 1987), согласно которой связывание кванта АХ, в том числе и при интактной АХЭ, происходит в ходе продольной диффузии молекул АХ в си-наптической щели. Оценка на основе этой модели условий диффузии АХ в синаптической щели показала существенное ее замедление по сравнению со свободной. Возможность задержки и накопления веществ в синаптической щели была продемонстрирована нами и на примере накопления при ритмической активности ионов К+, имеющих сходный с АХ коэффициент свободной диффузии. Наши расчеты подтверждают существование физических и химических барьеров, ограничивающих скорость диффузии веществ в синаптической щели (Матюшкин, 1980; 1994; Matyushkin et al., 1995).

Показаны также вариабельность длительности спада МТКП, более медленный по сравнению с МТКП спад ТКП и другие признаки постсинаптической потенциации (см.ниже) в синапсах с полностью активной АХЭ. Таким образом, повторное связывание АХ с

холинорецепторами и продольная диффузия АХ в синаптической щели возможны и при интактной АХЭ. Это подтверждается и способностью АХ в покое накапливаться в синаптической щели на уровне 5x10"® моль/л (Воронин, 1990; Nikolsky et al., 1994), несмотря на высокую активность синаптической АХЭ. Возможно, здесь важно снижение скорости гидролиза АХ при низкой концентрации субстрата (Ecobichon, Israel, 1967; Taylor, 1991). В целом же, наши данные, наряду с другими фактами (Кривой, 1986; Магазаник, 1988), свидетельствуют о возможности формирования следовых реакций АХ в нервно-мышечном синапсе диафрагмы крысы даже при нормальной активности АХЭ.

В опытах с моделированием повышения уровня АХ в синаптической щели (аппликация АХ, тетанизация нерва) впервые обнаружено долговременное (1-2 часа) восстановление работоспособности непрерывно утомляемых непрямой стимуляцией мышц с инги-бированной АХЭ. Установлена пресинаптическая природа этого эффекта АХ, обусловленного долговременным увеличением гарантийного фактора нервно-мышечной передачи за счет повышения амплитуды и квантового состава ТКП. Одновременное снижение частоты МТКП и увеличение амплитуды Na+-тока пресинаптических спайков свидетельствуют о следовой гиперполяризации мембраны нервных терминален, которая, по-видимому, и лежит в основе положительного пресинаптического последействия АХ. Показано, что эта гиперполяризация связана с активацией Ыа+/К+-АТФазы и электрогенного насоса, эффект которого в тонких нервных окончаниях с высоким входным сопротивлением может быть весьма существенным (см.Кубасов, Кривой, 1997). Последействие АХ сопровождается одновременно протекающей гиперполяризацией внеси-наптической мембраны мышечных волокон.

Проведенный анализ показал, что последействие АХ реализуется через мишень, отличающуюся по фармакологическим характеристикам от постсинаптических Н- или М-холинорецепторов, при участии Na+/K+-AT4>a3bi. Эта ферментная система, возможно, и является мишенью для АХ в механизме его последействия. Однако, окончательный вывод здесь делать преждевременно, поскольку известны многообразие и существенные особенности ней-рональных холинорецепторов, которые могут служить и ауторе-цепторами в двигательных нервных окончаниях (Tian et al., 1994; McGehee, Role, 1995; Tsuneki et et al., 1995).

Последействие АХ предположительно связано с инозитолтри-фосфатным механизмом регуляции уровня внутриклеточного Са2+. В таком случае нельзя исключить участие в гиперполяризации нервных и мышечных клеток Na+/Ca2+-обмена и Са2+-активируемых К+-каналов. Именно одновременной активацией электрогенного Na+/K+-Hacoca и Са2 + -активируемых К+-каналов объясняют следовую посттетаническую гиперполяризацию сенсорных нейронов {Parker et al., 1996). В регуляции секреции медиатора может быть задействован и кальмодулин, как например в случае преси-наптического действия катехоламинов (Chen et al., 1991). Следует также учитывать возможные эффекты выделяемых из нервных окончаний неквантового АХ и L-глютамата, которые, как предполагается, способны влиять на мембранный потенциал покоя мышечных волокон через систему хлорного транспорта сарколеммы, а также оказывать опосредованное пресинаптическое действие через оксид азота (Уразаев, 1997) .

Конкретный механизм регуляции квантовой секреции медиатора через изменение электрогенеза нервных терминалей можно объяснить зависимостью амплитуды и длительности пресинапти-ческих спайков от исходной инактивации Na+-каналов и величины реполяризующего К+-тока (Glavinovic, 1987; Robitaille, Charlton, 1992), которые при гиперполяризации терминалей должны уменьшаться. В результате увеличения амплитуды и длительности

пресинаптических спайков должно возрастать количество входя-

„ 2 +

щего в нервные терминали Са и усиливаться вызванное освобождение медиатора.

При исследовании постсинаптической потенциации установлено постепенное увеличение величины гт/д МТКП при градуальном ингибировании АХЭ, усиливающем проявление этого феномена. При частичном блокировании холинорецепторсв d-тубокурарином и в условиях десенситизации постсинаптической мембраны (факторы, не влияющие на кооперативность связывания АХ и на выраженность постсинаптической потенциации) величина гт/д МТКП не изменялась. Таким образом, изменение данного критерия оценки постсинаптической потенциации оказалось в хорошем соответствии с теоретически предсказанным.

Уменьшение величины r^/д при охлаждении указывало на ослабление постсинаптической потенциации, что противоречит результатам, полученным на мышце лягушки, когда оценивалась

постсинаптическая потенциация "во времени", обусловленная сохранением следовых явлений от предшествующей активности (Магазаник, Гиниатуллин, 1986; Гиниатуллин, 1992) . Возможно, именно в этом причина обнаруженного нами различия. Однако, известно, что в мышце мыши при охлаждении уменьшается коэффициент Хилла, по которому судят о кооперативности связывания АХ с холинорецепторами (Бгеуег et а1., 1976) . Не исключено, что у теплокровных вообще иная температурная зависимость постсинаптической потенциации, нежели у холоднокровных.

Таким образом, результаты наших исследований позволяют считать величину г^/д адекватным критерием оценки постсинаптической потенциации, в том числе в условиях, когда это явление маскируется одновременно развивающейся десенситизацией.

Постсинаптическая потенциация проявлялась тем сильнее, чем больше степень угнетения АХЭ и выше вероятность повторных связываний АХ с холинорецепторами, но сохранялась при снижении этой вероятности й-тубокурарином, и ослабевала при охлаждении, хотя повторное связывание при этом оставалось вполне эффективным. Наши данные подтверждают особенности молекулярных механизмов связывания АХ, отличающих постсинаптическую потенциацию от других факторов, формирующих временное течение постсинаптических токов (Магазаник, Гиниатуллин, 1986; Мада-гап1к еЬ а1., 1984) .

Постсинаптическая потенциация показана нами при полностью активной АХЭ, и впервые продемонстрировано ее усиление уже при относительно небольшом угнетении АХЭ (на 25%) . Таким образом, и эти данные подтверждают, что синаптическая АХЭ не является избыточной в синапсах с исходно высоким уровнем активности этого фермента (Кривой, 1984; Магазаник, 1988; МИе-сИ et а1., 1984). Известно, что активность синаптической АХЭ регулируется различными факторами нервного и мышечного происхождения (Елаев и др., 1982; ТоиЬап^ МаэБоиНе, 1988; Нау-пеэ, 1989; Бк^еЗо еЬ а1., 1991; Сгевпаг et а1., 1994) то есть, не остается постоянной. Следовательно, холинергическая модуляция, осуществляемая через постсинаптическую потенциацию, может зависеть не только от интенсивности функционирования нервно-мышечного аппарата (уровня АХ), но и от естественных колебаний активности синаптической АХЭ. При функциональной недостаточности АХЭ или в условиях ее ингибирования зна-

- 25 -

чимость постсинаптической потенциации должна возрастать.

Следующая часть нашей работы была посвящена проблеме функциональной АХЭ (Mclsaac, Koelle, 1959). В диафрагме крысы это молекулярные формы G4 и А12 (Busker et al., 1994), конкретная функциональная роль каждой из которых не ясна. Традиционные биохимические методы по ряду причин мало пригодны для количественной оценки активности функциональной АХЭ в натив-ном синапсе (Mittag et al., 1971; Lund Karisen, Fonnum, 1977; Miledi et al., 1984) . Для такой оценки мы впервые применили электрофизиологический подход, основанный на анализе амплитудно-временных характеристик спонтанных постсинаптических одноквантовых ответов.

Экспериментально полученные нами зависимости амплитуды и скорости спада МТКП от уровня активности АХЭ сходны с зависимостями, полученными с помощью математического моделирования (Магазаник и др., 1986; Нигматуллин и др., 1988). При этом важно отметить резкое замедление спада МТКП только при активности АХЭ ниже 10% от исходной. Рассчитанные нами значения ингибиторных констант армина и галантамина близки значениям, полученным биохимическими способами для АХЭ эритроцитов и сыворотки крови (Яковлев, 1965; Прозоровский, Саватеев, 1976). Вместе с тем, обнаруживаются отклонения, которые мы расцениваем как свидетельства особенностей функционирования нативной АХЭ и кинетики ее ингибирования в синаптической щели по сравнению с условиями in vitro.

Нами показано, что пессимальное торможение в нервно-мышечном аппарате при ингибированной АХЭ обусловлено не только деполяризацией постсинаптической мембраны, но и ускорением частотной депрессии амплитуд постсинаптических ответов; эти эффекты частично устранимы d-тубокурарином. Наши опыты подтверждают существование пресинаптического холинергического механизма регуляции вызванной секреции медиатора по типу отрицательной обратной связи (Большаков и др., 1985; Никольский, 1990; Wilson, Thomsen, 1991). Десенситизация холинорецепторов накапливающимся АХ (Гиниатуллин, 1990; Швецов, 1996) в данном случае представляется менее вероятной. Однако, независимо от природы депрессии амплитуд ритмических постсинаптических ответов при ингибированной АХЭ, наши данные свидетельствуют о существовании механизма "быстрой" холинергической регуляции

синаптической функции непосредственно в ходе секреции медиатора. Этот механизм регуляции, в отличие от обсуждавшегося выше модулирующего действия АХ в гораздо более низкой концентрации, можно отнести к кратковременным формам синаптической пластичности (Magleby, Pallotta, 1981; Zucker, 1989) .

Восстановление нервно-мышечной передачи после нарушений, вызванных армином, не было связано с устранением его неспецифических эффектов или с какими-либо адаптационными процессами. Исчезновение сверхмедленной компоненты спада ТКП после удаления армина из раствора свидетельствует о появлении, помимо диффузии, дополнительного фактора, устраняющего АХ из синаптической щели. По расчетам, основанным на соотношении скоростей диффузии и гидролиза АХ, появляется совсем небольшое (несколько процентов) количество свободной АХЭ, что объясняет отсутствие ее влияния на спад МТКП. Такое восстановление синаптической функции после отравления фосфорорганически-ми соединениями, считающимися необратимыми ингибиторами АХЭ, вполне возможно (Данилов, Иванов, 1972; Самойлова, 1983; Wecker et al., 1978; Laskowski, Dettbarn, 1979). Скорость синтеза АХЭ в диафрагме крысы составляет около 2% в час, но синтезированная внутриклеточная АХЭ за это время еще не достигает функционального состояния (см.Busker et al., 1994). Поэтому появление свободной АХЭ в нашем случае, скорее всего, обусловлено восстановлением активности ранее ингибированного армином фермента.

При оценке работоспособности мышц при разной степени ин-гибирования АХЭ установлено, что в диапазоне частот стимуляции нерва до 50 имп/с включительно сохраняется нормальное функционирование нервно-мышечного аппарата без заметного усиления пессимальной реакции при снижении активности АХЭ вплоть до 10% от исходного уровня, что подтверждает известные данные (Barstad, 1960; Barnard et al., 1971; Hobbiger, 1976), обычно трактуемые как свидетельство "избыточности" синаптической АХЭ. С другой стороны, хотя относительно небольшое ингибиро-вание АХЭ (на 25%) никак не сказывается на функционировании нервно-мышечного аппарата в целом, в таких условиях (более того, даже при интактной АХЭ), уже заметны проявления следовых реакций АХ и его модулирующего синаптического действия (см.выше). Эти факты противоречат традиционным представлениям

- 27 -

об "избыточности" синаптической АХЭ.

Обобщая полученные результаты, мы пришли к заключению, что синаптическая АХЭ выполняет двоякую функцию (Кривой и др., 1990): одновременно обеспечивает не только "релейное" проведение частотной импульсации мотонейронов и надежность нервно-мышечной передачи в целом, но и тонкую пре- и постси-наптическую ее модуляцию через изменение уровня АХ в синаптической щели. Для выполнения первой функции достаточно около 10% от общей активности синаптической АХЭ, тогда как в модуляции, по-видимому, участвует большая часть энзима. Как организовано "распределение" этих функций АХЭ, пока сказать трудно. С учетом особенностей гидролиза АХ, скорость которого существенно зависит от концентрации субстрата, такое распределение может определяться просто уровнем синаптического АХ, но, по нашему мнению, выполнение разных функций, скорее всего, осуществляется различными молекулярными формами синаптической АХЭ.

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа влияния различных факторов (активности ацетилхолинэстеразы, температуры, плотности холино-рецепторов и режимов активации двигательного нерва) на амплитудно-временные характеристики спонтанных и вызванных токов концевой пластинки в изолированной диафрагме крысы обоснована возможность задержки и накопления следового медиаторного аце-тилхолина в синаптической щели при полностью активной ацетил-холинэстеразе.

2. Ацетилхолин в концентрации, сопоставимой с уровнем неквантовой секреции, модулирует квантовое освобождение медиатора из двигательных нервных окончаний через изменение их электрогенеза. Усиление вызванного освобождения медиатора в результате такой модуляции способствует восстановлению работоспособности нервно-мышечного аппарата при нарушениях, вызывающих снижение гарантийного фактора синаптической передачи.

3. Долговременное модулирующее действие ацетилхолина в низкой концентрации реализуется через структуру, отличающуюся по фармакологическим характеристикам от типичных Н- или М-хо-линорецепторов, при участии Ш+/К+-АТФазы и вторичных мес-сенджеров.

4. Существует механизм "быстрой" холинергической регуля-

ции синаптической функции в ходе ритмической активности через изменение уровня медиаторного ацетилхолина в синаптической щели и степени частотной депрессии амплитуд постсинаптических ответов. Этот механизм можно отнести к кратковременным формам синаптической пластичности.

5. Предложен количественный критерий оценки постсинапти-ческой потенциации, позволяющий изучать это явление в условиях маскирующего действия десенситизации. Продемонстрированы особенности молекулярных механизмов связывания ацетилхолина, отличающих постсинаптическую потенциацию от других факторов, формирующих временное течение постсинаптических ответов.

6. Постсинаптическая потенциация проявляется при интакт-ной ацетилхолинэстеразе и усиливается при незначительном угнетении ее активности. Постсинаптический модулирующий эффект ацетилхолина зависит от колебаний активности ацетилхолинэсте-разы под влиянием различных эндогенных факторов.

7. На основе электрофизиологического способа оценки из-менения активности функциональной ацетилхолинэстеразы экспериментально получены константы ее ингибирования для конкурентных ингибиторов обратимого и необратимого типов. Обнаружены отклонения, свидетельствующие об особенностях функционирования нативной синаптической ацетилхолинэстеразы и кинетики ее ингибирования по сравнению с условиями in vitro.

8. Восстановление нервно-мышечной передачи после применения фосфорорганического ингибитора ацетилхолинэстеразы ар-мина обусловлено появлением небольшого количества свободного фермента. Критический уровень ацетилхолинэстеразы, ниже которого происходит резкое замедление постсинаптических ответов и утрачивается способность поддерживать функционирование нервно-мышечного аппарата, составляет около одной десятой части ее количества.

9. Синаптическая ацетилхолинэстераза выполняет двоякую функцию, обеспечивая не только надежное проведение частотной импульсации мотонейронов, но и пре- и постсинаптическую модуляцию нервно-мышечной передачи через изменение уровня ацетилхолина в синаптической щели. Разные функции ацетилхолинэстеразы определяются уровнем синаптического ацетилхолина и/или принадлежат различным молекулярным формам этого фермента.

- 29 -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шабунова и.А., Кривой И.И. О влиянии антихолинэстеразных веществ на пресинапс и электровозбудимую мембрану мышечного волокна лягушки // Физиология и биохимия медиаторных процессов. - Тез.докл. XII Всесоюзн.конф. - Москва, 1980. -С.220.

2. Matyushkin D.P., Shabunova I.A., Krivoi I.I. Potassium and histidine functional feed-back in neuromuscular synapse of the frog // XXVIII Congress Intern.Union Physiol.Sei. -Abstracts. - Budapest, 1980. - V.14. - P.573.

3. Кривой И.И., Кулешов В.И., Матюшкин Д.П., Саноцкий В.И., Шабунова И.А. Влияние армина на синаптическую передачу в нервно-мышечном препарате лягушки // Бюлл.экспер.биол. и мед. - 1981. - Т.91, N 6. - С.699-702.

4. Шабунова И.А., Кривой и.И., Кулешов В.и., Саноцкий

B.И. Матюшкин Д.П. О влиянии некоторых антихолинэстеразных препаратов на электровозбудимую мембрану мышечного волокна лягушки // Физиол.журн.СССР. - 1982. - Т.68, N 9.

C. 1229-1234.

5. Кривой И.И., Саноцкий В.И., Шабунова И.А. Исследование чувствительности холинорецепторов концевой пластинки лягушки в условиях действия некоторых антихолинэстеразных веществ // Тез.докл. III Всесоюзн.межуниверситетской конф. по физ.-хим. биологии. - Тбилиси, - 1982. - Т.1. - С.257-258.

6. Матюшкин Д.П., Кривой И.И., Шабунова И.А. Калиевое антидромное действие в нейромоторном синапсе // Физиол . журн . СССР . - 1984. - Т.70, N 5. - С.617-626.

7. Кривой И.И. Использование параметров миниатюрных токов концевой пластинки для оценки активности ацетилхолинэсте-разы // Физиология медиаторов. Периферический синапс. Тез.докл. V Всесоюзн.симп. - Казань, 1984. - С.126-129.

8. Шабунова И.А., Кривой И.И. Синаптическая передача в нейромоторном соединении: влияние ионов и антихолинэстеразных веществ // Физиология медиаторов. Периферический синапс. Тез.докл. V Всесоюзн.симп. - Казань, 1984. - С.253-255.

9. Кривой И.и., Шабунова И.А. Влияние длительной фиксации потенциала постсинаптической мембраны на разных уровнях на нервно-мышечную передачу лягушки // Физиол.журн.СССР. 1984. - Т.70, N 10. - С.1448-1453.

10. Matyushkin D.P., Krivoi 1.1., Shabunuva I.A. Reversal potential of the end-plate currents and potassium feed-back at the neuromuscular synapse // J.Neurosci.Res. 1984. - V.ll, N 3. - P.281-292.

11. Кривой И.И., Кулешов В.И., Матюшкин Д.П., Саноцкий В.И., Сей Т.П. Миниатюрные токи концевой пластинки мышечных волокон диафрагмы крысы при угнетении ацетилхолинэстеразы га-лантамином // Нейрофизиология. - 1985. - Т.17, N 5.

С - 607-614.

12. Кривой И.И., Сей Т.П. Оценка активности функциональной ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечном синапсе по электрофизиологическим показателям // Тез.докл. V Всесоюзн.конф. по биохимии мышц. - Телави, 1985. - С.56.

13. Кривой И.И., Сей Т.П. Электрофизиологический подход

к определению количественных закономерностей действия ингибиторов ацетилхолинэстеразы в синаптической щели // Физиология и биохимия медиаторных процессов. - Тез.докл. IV Всесо-юзн.конф. - Москва, 1985. - С.175.

14. Кривой И.И. О функциональной значимости синаптичес-кой ацетилхолинэстеразы и способах оценки ее активности // Вестник ЛГУ. - 1986. - Сер.3, вып.З. - С.64-73.

15. Матюшкин Д.П., Драбкина Т.М., Кривой И.И., Добрецов М.Г. Калий межклеточных пространств и передача сигналов в нейромоторном синапсе // Тез.докл. I Всесоюзн.конф. по нейро-наукам. - Киев, 1986. - С.97-98.

16. Кривой И.И. Неантихолинэстеразное пресинаптическое действие армина и пессимапьное торможение в нервно-мышечном аппарате // Функции двигательного аппарата человека и животных. Изд-во Казанского университета. - 1986. - С.57-65.

17. Драбкина Т.М., Кривой И.И. Положительная корреляция между амплитудой и длительностью спада одноквантовых постси-наптических ответов в фазных и тонических мышечных волокнах // Вопросы эволюционной физиологии. - Тез.докл. IX совещания по эволюц.физиол. - Ленинград, 1986. - С.85-86.

18. Кривой И.И., Кулешов В.И., Матюшкин Д.П. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества. Изд-во ЛГУ, 1987. - 240 с.

19. Кривой И.И., Сей Т.П. Постсинаптическая потенциация миниатюрных токов концевой пластинки мышечных волокон диафрагмы крысы. Влияние ингибитора ацетилхолинэстеразы, температуры и кураре // Нейрофизиология. - 1987. - Т.19, N 4.

С.504-512.

20. Матюшкин Д.П., Драбкина Т.М., Виноградова И.М., Кривой И.И. Радзюкевич В.К., Кубасов И.В., Добрецов М.Г. Надежность нервных проводников и синапсов : количественные характеристики и определяющие факторы // Тез.докл. XV съезда Все-союзн.физиол.общества. - Кишинев, 1987. - С.206.

21. Кривой И.И., Сей Т.П. Электрофизиологическая оценка кинетики ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы ар-мином в диафрагме крысы // Вестник ЛГУ. - 1987. - Сер.З, вып.3. N 17. - С.105-108.

22. Кривой И.И. Количественная оценка ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы галантамином по параметрам миниатюрных токов концевой пластинки // Бюлл.экспер.биол. и мед. - 1988. - Т.105, Мб.- С.665-667.

23. Кривой И.И., Сей Т.П. Восстановление нервно-мышечной передачи в диафрагме крысы после действия фосфорорганического ингибитора ацетилхолинэстеразы с помощью кураре // Физиол . журн . СССР . - 1988. - Т.74, N 12. - С.1751-1758.

24. Кривой И.И. Токи концевой пластинки и некоторые характеристики нервно-мышечного синапса // Успехи физиол.наук. - 1989. - Т.20, N 4. - С.42-58.

25. Кривой И.И. Попытка оценки некоторых характеристик нервно-мышечной передачи по восходящей фазе миниатюрных токов концевой пластинки // Нейрофизиология. - 1989. - Т.21, N 2. -С.272-275.

26. Кривой И.И., Сей Т.П. Пост- и пресинаптические меха-

низмы восстановления тубокурарином нервно-мышечной передачи после действия фосфорорганического ингибитора ацетилхолинэс-теразы // докл. АН СССР. - 1989. - Т.306, N 2. - С.499-502.

27. Виноградова И.М., Кривой И.И., Сей Т.П. Характеристика разных видов атипичных миниатюрных токов концевой пластинки крысы // Докл. АН СССР. - 1989. - Т.307, N 5.

С.1272-1275.

28. Виноградова И.М., Кривой И.И., Сей Т.П. Атипичные миниатюрные токи концевой пластинки в нервно-мышечном синапсе крысы в норме, после ингибирования ацетилхолинэстеразы и охлаждения // Бюлл.экспер.биол. и мед. - 1990. - Т.109, N 6. -С.523-525.

29. Кривой И.И., Сей Т.П., Кубасов И.В, Двоякая функция синаптической ацетилхолинэстеразы // Доминантные механизмы поведенческих адаптаций. - Тез.докл.конф.ФНИИ ЛГУ. - Ленинград, 1990. - Вып.2. - С.69-60.

30. Кривой И.И., Сей Т.П., Кубасов И.В. Модуляция нервно-мышечной передачи эндогенным ацетилхолином. Две роли синаптической ацетилхолинэстеразы? // Физиология и биохимия ме-диаторных процессов. - Тез.докл. V Всесоюзн.конф. - Москва, 1990. - С.155.

31. Кубасов И.В., Кривой И.И. Ацетилхолин снимает утомление в диафрагме крысы с ингибирозанной ацетилхолинэстеразой // Физиология медиаторов. Периферический синапс. - Тез.докл. VI Всесоюзн.симп. - Казань, 1991. - С.61.

32. Кривой И.И., Сей Т.П. Постсинаптическая потенциация в нервно-мышечных синапсах диафрагмы крысы при разной активности ацетилхолинэстеразы // Физиология медиаторов. Периферический синапс. - Тез.докл. VI Всесоюзн.симп. - Казань, 1991. - С.59.

33. Кривой И.И., Сей Т.П. Постсинаптическая потенциация токов концевой пластинки в диафрагме крысы при разной активности синаптической ацетилхолинэстеразы // Бюлл.зкспер.биол. и мед. - 1991. - Т.Ill, N 5. - С.458-460.

34. Кривой И.И., Сей Т.П. Механизмы возникновения и устранения низкочастотного пессимума в диафрагме крысы после торможения ацетилхолинэстертазы фосфорорганическим ингибитором // Функции двигательного аппарата человека и животных. Изд-во Казанского университета. - 1992. - с.40-48.

35. Кубасов И.В., Кривой И.И. Влияние ацетилхолина на нервно-мышечную передачу в утомленной диафрагме крысы с блокированной ацетилхолинэстеразой // Физиол.журн. им.И.М.Сеченова. - 1993. - Т.79, N 10. - С.39-45.

36. Matyushkin D.P., Krivoi I.I., Drabkina Т.М. The positive action of potassium ions outflow on the neuro-muscular transmission // XXXIII Congress Intern.Union Physiol.Sci. Abstracts. - Glasgow, 1993. - V.244. - 64/P.

37. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В. Исследование восстановления работоспособности утомляемой диафрагмы крысы после применения экзогенного ацетилхолина // Физиол.журн. им.И.М.Сеченова. - 1994. - Т.80, N 9. - С.61-66.

38. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В., Сей Т.П. Восстановление работоспособности утомляемой диафрагмы крысы

после действия экзогенного ацетилхолина // Тез.докл. XVII съезда Физиол.общества при РАН. Пущино, 1993. - Успехи физиол.наук. - 1994, - Т.25, вып.З. - С.60.

39. Кубасов И.В., Кривой И.И., Лопатина Е.В. Исследование влияния экзогенного ацетилхолина на эффективность нервно-мышечной передачи в утомляемой диафрагме крысы // Бюлл.экспер.биол. и мед. - 1994. - Т.118, N 11. - С.457-459.

40. Matyushkin D.P., Drabkina Т.М., Krivoi I.I., Kubasov I.V., Lopatina E.V., Radzjukevich V.K., Romanovsky D.Yu., Sei T.P. Regulation of efficiency of fatigued muscles mediated by substances of nervous and muscular origin // Biological Motility. Int.Symp. - Abstracts. - Pushchino, 1994. - P.126-127.

41. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В. Пресинапти-ческое последействие ацетилхолина в мышце крысы с ингибиро-ванной армином ацетилхолинэстеразой // Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии. - Тез.докл. I Все-росс.конф.токсикологов. - Санкт-Петербург, 1995. - Т.1.

С.57.

42. Матюшкин Д. П., Кривой И.И., Драбкина Т.М. Антидромное действие К+ в синапсах, усиливающее их ортодромное действие // Физиол.журн. им.И.М.Сеченова. - 1995. - Т.81, N 8. -С.152-154.

43. Matyushkin D.P., Krivoi I.I., Drabkina Т.М. Synaptic feed-backs mediated by potassium ions // Gen.Physiol.Biophys. - 1995. - V.14. - P.369-381.

44. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В., Сей Т.П. Роль Ма+/К+-АТФазы в вызываемом ацетилхолином долговременном повышении работоспособности мышцы крысы // Прикладные аспекты исследования скелетных, сердечных и гладких мышц. - Тез.докл. Всеросс.конф. - Пущино, 1996. - С.16-17.

45. Кубасов И.В., Кривой И.И. Роль электрогенного ионного насоса в регуляции мембранного потенциала моторных нервных терминален диафрагмы крысы // Вестник СПбГУ. - 1997. - Сер.З, вып.З (N 17). - С.80-88.

46. Drabkina Т.М., Krivoi I.I., Kubasov I.V., Lopatina E.V., Romanovsky D.Yu., Sei T.P. Modulation of quantal secretion at neuromuscular synapse by substances of nerve and muscle origin // XXXIII Intern.Congr.Physiol.Sci. - Abstracts. - St.Petersburg, 1997. - P075.26.

47. Matyushkin D.P., Drabkina T.M., Krivoi I.I., Kubasov I.V., Lopatina E.V., Romanovsky D.Yu., Sei T.P. Factors of synaptic plastisity in neuromuscular system // In: Molecular and genetic bases of adaptive behavior. Satellite symp. of the XXXIII Intern.Congr.Physiol.Sci. - 1997. - Abstracts. -Koltushi, - P.30.

48. Кубасов И.В., Кривой И.И., Лопатина Е.В. Роль Ыа+/к+-АТФазы в пресинаптическом последействии экзогенного ацетилхолина в диафрагме крысы // Бюлл.экспер.биол. и мед. -1997. - Т.123, N 5. - С.531-534.

49. Лопатина Е.В., Кривой И.И. Механизм вызываемой ацетилхолином долговременной следовой гиперполяризации мышечных волокон диафрагмы крысы // Вестник СПбГУ. - 1997. - Сер.З, вып.4 (N 24). - С.72-79.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Кривой, Игорь Ильич, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

03 .00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.................................. 5

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................... 15

1. Общая характеристика экспериментальных условий......... 15

2. Механографические исследования......................... 17

3. Микроэлектродные исследования.......................... 2 0

4. Обработка результатов.................................. 26

ГЛАВА 1. НЕРВНО-МЫШЕЧНЫЙ СИНАПС И ТОКИ КОНЦЕВОЙ ПЛАСТИНКИ

1.1. Факторы, определяющие временное течение токов концевой пластинки (обзор литературы)............................ 27

1.1.1. Кинетика активации постсинаптической мембраны.... 27

1.1.2. Восходящая фаза миниатюрных токов концевой пластинки........................................ 34

1.1.3. Диффузия ацетилхолина в синаптической щели....... 39

1.2. Исследование рецепции, диффузии и накопления ацетилхолина в синаптической щели (собственные результаты)............................................. 44

1.2.1. Исследование миниатюрных токов концевой пластинки при изменении активности ацетилхолинэстеразы, температуры и плотности холинорецепторов......... 44

1.2.2. Оценка скорости диффузии ацетилхолина в синаптической щели............................... 59

1.2.3. Оценка возможности задержки и накопления веществ

в синаптической щели............................. 65

1.2.4. Исследование атипичных миниатюрных токов концевой пластинки........................................ 72

1.3. Заключение.............................................. 80

ГЛАВА 2. ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ ПРЕСМНАПТИЧЕСКОГО КВАНТОВОГО

ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА 2.1. Холинергическая ауторегуляция квантового освобождения

медиатора в нервно-мышечном синапсе (обзор литературы).. 82

2.2. Холинергическая модуляция квантового освобождения медиатора и эффективности нервно-мышечной передачи (собственные результаты)................................ 95

2.2.1. Влияние тетанизации двигательного нерва на работоспособность утомляемой мышцы............... 95

2.2.2. Действие экзогенного ацетилхолина на эффективность нервно-мышечной передачи в утомляемой мышце...... 103

2.2.3. Влияние экзогенного ацетилхолина на мембранный потенциал покоя мышечных волокон. . ............... 114

2.2.4. Влияние экзогенного ацетилхолина на спонтанную и вызванную секрецию медиатора..................... 128

2.3. Заключение.............................................. 141

ГЛАВА 3. ПОСТСЗШАПШЧЕСКАЯ ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ

3.1. Постсинаптическая холинергическая модуляция в нервно-мышечном синапсе позвоночных (обзор литературы) ......... 143

3.2. Исследование постсинаптической потенциации

(собственные результаты)................................ 155

3.2.1. Влияние ингибирования ацетилхолинэстеразы, температуры и кураре на постсинаптическую

потенциацию миниатюрных токов концевой пластинки. 155 3.2.2. Постсинаптическая потенциация токов концевой

пластинки при разной активности

ацетилхолинэстеразы.............................. 169

3.2.3. Постсинаптическая потенциация в условиях

десенситизации................................... 178

3.3. Заключение.............................................. 184

ГЛАВА 4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АЦЕТШ1ХОЛИНЭСТЕРАЗА В НЕРВНО-МЬШЕЧНОМ СИНАПСЕ И ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЕЕ АКТИВНОСТИ

4.1. О функциональной роли синаптической ацетилхолинэстеразы (обзор литературы)...................................... 185

4.1.1. Распределение холинорецепторов и ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечном синапсе........................ 185

4.1.2. Функциональная роль синаптической ацетилхолинэстеразы и способы оценки ее активности................... 192

4.2. Функциональная ацетилхолинэстераза и электрофизиологическая оценка изменения ее активности в нервно-мышечном синапсе (собственные результаты)................................ 199

4.2.1. Оценка ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы армином по параметрам миниатюрных потенциалов концевой пластинки................... 199

4.2.2. Оценка ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы галантамином по параметрам миниатюрных токов концевой пластинки. . ,.................................205

4.2.3. Пессимальные явления и восстановление нервно-мышечной передачи после угнетения

ацетилхолинэстеразы армином...................... 212

4.2.4. Эффекты d-тубокурарина в нервно-мышечном аппарате

с ингибированной армином ацетилхолинэстеразой... . 233

4.3. Заключение.............................................. 245

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................. 247

ВЫВОДЫ....................................................... 2 67

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................ 269

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ..................... 314

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема пластичности синаптической функции и нервной системы в целом одна из важнейших в современной нейрофизиологии (Экклс, 1966; Вартанян, Василевский, 1966; Турпа-ев, Сахаров, 1967; Кэндел, 1980; Воронин, 1982; Мокрушин, Емельянов, 1992; Zucker, 1989; Malenka, 1995). Холинергический нервно-мышечный синапс позвоночных является традиционной моделью исследований в этой области. В модуляции нервно-мышечной передачи могут участвовать самые различные факторы нервного и мышечного происхождения (Орбели, 1938; Северин и др., 1970; Турпаев, Путин-цева, 1974; Матюшкин, 1980; Болдырев, 1977; Hamilton, Smith, 1991), в том числе сам медиатор ацетилхолин (АХ). Классическая проблема физиологической роли медиаторов и вопрос о немедиатор-ной, регуляторной функции АХ сохраняют свою актуальность и в настоящее время (Ухтомский, 1940; Гинецинский, Михельсон, 1937; Коштоянц, 1951; Беритов, 1959; Зефиров, 1967; Полетаев, 1974; Никольский, 1974; Магазаник, 1988; Гиниатуллин, 1992; Glavinovic, 1991) . И это не случайно, если учесть, что АХ обладает широким спектром действия на самые различные биохимические системы клеток (Голиков и др., 1985; Долго-Сабуров, 1985). При этом особый интерес представляют долговременные следовые изменения синаптической функции. Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизмы холинергической модуляции и пластичности нервно-мышечной передачи остаются во многом не ясными.

Один из основных механизмов синаптической пластичности - регуляция секреции медиатора из нервных окончаний (Матюшкин, 1975;1980; Ноздрачев, Пушкарев, 1980; Zucker, 1989; Bowman, 1990; Voronin, 1993), которая может осуществляться освобождающимся АХ через пресинаптические ауторецепторы по принципу отрицательной

- б -

или положительной обратной связи. До сих пор нет единого мнения о структуре, механизмах функционирования и физиологической значимости ауторецепторов в нервно-мышечном синапсе позвоночных. В качестве пресинаптических мишеней медиатора АХ, играющих роль ауторецепторов, рассматривают самые различные структуры: Н- и М-холи-норецепторы {Никольский, 1990; Wessler, 1989; Wilson, Thomsen, 1991; Tian et al., 1994), калиевые каналы (Зефиров, Шакирьянова, 1992; Hevron et al., 1986), некоторые ферментные системы, в частности, Ыа+/К+-АТФазу и сопряженный с ней ионный насос. Однако механизм участия Ыа+/К+-насоса в холинергической регуляции квантовой секреции медиатора из моторных нервных терминалей и ее роль в модуляции нервно-мышечной передачи остаются неизвестными, несмотря на множество фактов, косвенно подтверждающих эту возможность (Глебов, Крыжановский, 1978; Никольский и др., 1989; Vizi, 1978; Maeno et al., 1995) . Это одна из проблем, рассматриваемых в диссертации .

Следующая проблема - изучение механизмов постсинаптической холинергической модуляции нервно-мышечной передачи, осуществляемой через постсинаптическую потенциацию и десенситизацию холино-рецепторов (Магазаник, 1988; Гиниатуллин, 1992; Hartzell et al., 1975; Glavinovic, 1991). Постсинаптическая потенциация проявляется в увеличении амплитуды и длительности постсинаптических ответов при повышении концентрации АХ в синаптической щели, при де-сенситизации наблюдается обратная картина. Предполагается, что в основе постсинаптической потенциации лежит нелинейность зависимости доза-ответ, определяемая кооперативностью связывания АХ с холинорецепторами, но изучены не все проявления и молекулярные механизмы этого феномена. Во многом это объясняется тем, что постсинаптическая потенциация, как правило, маскируется одновре-

менно развивающейся десенситизацией и пока нет четкого критерия, позволяющего разделять и независимо изучать эти феномены.

Проблема холинергической модуляции нервно-мышечной передачи тесно связана с выяснением условий возникновения следовых реакций медиатора АХ, которые во многом обусловлены особенностями его диффузии в синаптической щели и особенностями функционирования синаптической ацетилхолинэстеразы (АХЭ), гидролизующей АХ. Многочисленные данные свидетельствуют о высокой активности и "избыточности" синаптической АХЭ в фазных мышцах позвоночных, благодаря чему обеспечивается относительно нормальное функционирование нервно-мышечного аппарата даже при глубоком торможении активности АХЭ (Прозоровский, Саватеев, 1976; Barstad, I960; Barnard et al., 1971; Hobbiger, 1976). Вместе с тем, к настоящему времени накоплено множество данных о возможности повторного связывания медиа-торного АХ с холинорецепторами и задержки в синаптической щели негидролизованного АХ при интактной АХЭ, причем в синапсах с наиболее высоким ее уровнем (Магазаник, 1988; Miledi et al., 1984; Nikolsky et al., 1994), что свидетельствует против представлений об "избыточности" АХЭ. Эти разногласия в оценке значимости синаптической АХЭ, имеющие непосредственное отношение к вопросу о ее функциональной роли, также требуют своего объяснения.

Важным направлением в исследовании функциональной роли синаптической АХЭ является поиск надежного метода определения ее активности. Существующие биохимические методы малопригодны для оценки активности собственно синаптической (функциональной) АХЭ. Это связано с тем, что в гомогенатах тканей измеряется "общая" активность АХЭ, включая внутриклеточную и внесинаптическую, а в интактных мышцах проникновение экзогенного субстрата в синапти-ческие щели затруднено диффузионными барьерами (Mittag et al.,

1971; Miledi et al., 1984). К этой проблеме непосредственное отношение имеет изучение особенностей кинетики ингибирования натив-ной АХЭ в интактных синапсах, которая существенно отличается от кинетики ингибирования очищенного энзима (Bullock et al., 1977; Laskowski, Dettbarn, 1979), а также вопрос о механизме спонтанного восстановления синаптической передачи после отравления фосфо-рорганическими ингибиторами АХЭ, который не решен, хотя имеет несомненное практическое значение и исследуется давно (Данилов, Иванов, 1972; Самойлова, 1983; Melchers, Van der Laaken, 1991).

Цель и задачи исследования. Настоящая работа, выполненная в период с 1980 по 1997 гг. в рамках плановой тематики лаборатории нервно-мышечной физиологии ФНИИ им.акад.А.А.Ухтомского Санкт-Петербургского государственного университета, предпринята с целью решения изложенных выше вопросов относительно пре- и постсинапти-ческих механизмов холинергической модуляции нервно-мышечной передачи и функциональной роли АХЭ у позвоночных.

В работе поставлены следующие основные задачи.

1. Выяснить влияние изменения условий секреции, рецепции и гидролиза АХ, а также других факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи, на. параметры постсинаптических ответов.

3. Проверить реальность участия Ыа+/К+-АТФазы в холинергической модуляции квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний и выяснить возможный механизм такой модуляции.

4. Провести анализ проявлений постсинаптической потенциации в различных экспериментальных условиях и установить количествен-

ный критерий ее оценки.

5. Исследовать электрофизиологическим способом кинетику ин-гибирования синаптической АХЭ, используя в качестве критерия параметры постсинаптических потенциалов и токов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Благодаря особенностям структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса диафрагмы крысы при интактной АХЭ имеется возможность задержки и накопления в синаптической микросреде АХ в концентрации, достаточной для модуляции пре - и постси-наптической функций. Синаптическая АХЭ выполняет двойственную функциональную роль, обеспечивая не только надежную передачу частотной импульсации мотонейронов, но и тонкую модуляцию нервно-мышечной передачи через изменение уровня АХ в синаптической щели.

3. Постсинаптическая потенциация проявляется при полностью активной АХЭ и градуально усиливается по мере ее ингибирования. Молекулярные механизмы связывания АХ, определяющие временное течение постсинаптических ответов и собственно постсинаптическую потенциацию, различны. Предложен критерий, позволяющий оценивать постсинаптическую потенциацию в условиях, когда это явление мае-

кируется другими процессами, в том числе десенситизацией.

Научная новизна. Проведен комплексный экспериментальный и теоретический анализ параметров спонтанных и вызванных постсинаптических ответов при изменении факторов, определяющих эффективность нервно-мышечной передачи: активности синаптической АХЭ, режима активации двигательного нерва, температуры, плотности распределения постсинаптических холинорецепторов. Впервые исследована кинетика активации постсинаптической мембраны в случае генерации миниатюрных и вызванных токов концевой пластинки (ТКП) при градуальном угнетении АХЭ с помощью ее ингибиторов разных типов.

Получены новые данные о возможности задержки и накопления медиаторного АХ в синаптической щели при нормальной активности АХЭ. Эти факты, свидетельствующие против традиционных представлений об "избыточности" синаптической АХЭ, наряду с другими нашими данными, подтверждающими эти представления, позволили по-новому оценить функциональную роль синаптической АХЭ в нервно-мышечном синапсе позвоночных. Предложена идея о двоякой функции синаптической АХЭ, обеспечивающей в зависимости от концентрации АХ не только проведение частотной импульсации мотонейронов, но и тонкую холинергическую пре- и постсинаптическую модуляцию нервно-мышечной передачи через изменение уровня АХ в синаптической щели.

Обнаружена и исследована не известная ранее длительная следовая гиперполяризация мембраны мышечных волокон и нервных терми-

налей, вызываемая АХ в низкой концентрации, сопоставимой с физиологическим уровнем медиатора в синаптической щели. Установлено, что этот эффект АХ реализуется при участии Ыа+/К+-АТФазы и лежит в основе изменения спонтанной и вызванной квантовой секреции АХ. Впервые показано, что вызываемое АХ следовое увеличение квантового состава ТКП приводит к повышению гарантийного фактора синаптической передачи и долговременному восстановлению работоспособности утомляемых мышц. Таким образом, получены новые данные, свидетельствующие об участии Ыа+/К+-АТФазы в пресинаптической холинер-гической модуляции, и продемонстрировано значение такого механизма в обеспечении эффективности нервно-мышечной передачи при сниженном гарантийном факторе.

Впервые исследованы проявления постсинаптической потенциации и оценен молекулярный механизм этого явления в случаях спонтанных одноквантовых и вызванных многоквантовых ответов при градуальном снижении активности АХЭ; применены также изменение температуры, частичное блокирование постсинаптических холинорецепторов и разные режимы стимуляции двигательного нерва. В качестве критерия оценки постсинаптической потенциации предложен и использован не применявшийся ранее показатель. Обоснована адекватность данного критерия, позволяющего экспериментально отделять постсинаптичес-кую потенциацию от десенситизации и других маскирующих факторов.

Впервые применен электрофизиологический подход к оценке активности и кинетики ингибирования именно функциональной АХЭ, основанный на анализе амплит

Информация о работе

Кривой, Игорь Ильич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1998
ВАК 03.00.13

Диссертация

Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Кривой, Игорь Ильич, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Холинергическая модуляция нервно-мышечной передачи
ВАК РФ 03.00.13, Физиология