Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неквантовая секреция ацетилхолина в миокарде крысы и механизмы ее регуляции

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Неквантовая секреция ацетилхолина в миокарде крысы и механизмы ее регуляции"

На правах рукописи

БОРОДИНОВА Анастасия Александровна

НЕКВАНТОВАЯ СЕКРЕЦИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА В МИОКАРДЕ КРЫСЫ И МЕХАНИЗМЫ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 НОЯ 2013

Москва 2013

005537124

005537124

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова» (заведующий - д.б.н., профессор А.А. Каменский).

Научные руководители:

Сухова Галина Сергеевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Абрамочкин Денис Валерьевич, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

Дьяконова Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры физиологии Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова.

Маломуж Артем Иванович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Казанского Института Биохимии и Биофизики Казанского научного центра РАН.

Ведущая организация:

Федеральное государственное автономное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Защита состоится 2 декабря 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного ученого совета Д. 501.001.93 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991 Москва Ленинские горы, д.1. стр. 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27).

Автореферат разослан ¿/октября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Умарова Б.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Парасимпатическая регуляция чрезвычайно важна для нормального функционирования сердца у млекопитающих. Помимо очевидной адаптивной функции, позволяющей снижать синусный ритм и в меньшей степени - силу сокращений желудочков в зависимости от условий среды, холинергические нервные влияния выполняют также важную кардиопротекторную роль. Это делает исследование механизмов холинергической регуляции сердца востребованным не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения.

Парасимпатические механизмы регуляции сердечной деятельности издавна привлекали к себе внимание исследователей. Еще в 1845 году братья Вебер открыли эффект замедления работы сердца при раздражении продолговатого мозга, пропадавший после перерезки вагуса. А в 1921 году в экспериментах Отго Лёви именно благодаря основному парасимпатическому медиатору ацетилхолину (АЦХ) была доказана возможность химической передачи сигнала от нервов к эффекторному органу. Несмотря на то, что в течение прошлого века усилия физиологов были в большей степени сконцентрированы на выяснении адренергических механизмов регуляции сердца, к концу столетия сформировалась достаточно целостная картина парасимпатической регуляции. В настоящее время относительно хорошо исследованы рецепторные механизмы воздействия АЦХ на кардиомиоциты. Кроме того, в значительной степени известно, какие механизмы внутриклеточной сигнализации оказываются задействованы в реализации эффектов АЦХ и каковы конечные мишени данных сигнальных каскадов.

В настоящее время изучение регуляции сердечной деятельности развивается высокими темпами, что в первую очередь связано с остро стоящей перед человечеством проблемой сердечно-сосудистых заболеваний. Поэтому важно отметить, что выяснение тонких механизмов холинергической регуляции миокарда значительно ускорилось в связи с осознанием кардиопротекгорного значения парасимпатической регуляции сердца, пришедшим в конце прошлого века. На исключительную важность холинергических воздействий для выживания миокарда в условиях ишемии указывает целый ряд экспериментальных данных. К примеру, в известной работе академика Л.В. Розенштрауха было показано, что сердце кошки после блокирования всех парасимпатических влияний путем атропинизации или

введения коклюшного токсина становится многократно более склонным к возникновению фибрилляции желудочков в результате экспериментальной окклюзии коронарной артерии, чем сердце нормального животного (Rosenshtraukh et al, 1994). Нет сомнений в том, что раскрытие механизмов кардиопротекторного действия АЦХ поможет в борьбе с заболеваниями сердца. Поэтому изучение механизмов парасимпатической регуляции сердца является исключительно важной задачей для современной физиологии.

Несмотря на то, что механизмы воздействия АЦХ на кардиомиоциты изучены достаточно хорошо, другому важнейшему звену холинергической регуляции, выделению АЦХ из холинергических интрамуральных окончаний в миокарде, уделяется недостаточно внимания.

Практически все имеющиеся данные относительно секреции АЦХ из нервных окончаний были получены при изучении нервно-мышечной синаптической передачи. Помимо общеизвестной квантовой секреции медиатора, связанной с экзоцитозом синаптических везикул, уже более 30 лет назад был описан принципиально иной, неквантовый способ секреции, представляющий собой непрерывное выделение АЦХ из цитоплазмы в синаптаческую щель, опосредованное мембранными белками-транспортерами катионов. В нервно-мышечном синапсе в состоянии покоя подавляющее количество АЦХ секретируется неквантовым путем, в то время как квантовым способом выделяется всего около 2% молекул медиатора (Mitchell and Silver, 1963; Vizi and Vyskocil, 1979). Явление неквантовой секреции в скелетной мускулатуре было детально охарактеризовано в исследованиях, проводившихся в лаборатории академика Е.Е. Никольского (см. обзор Маломуж и Никольский, 2007). Тем не менее, несмотря на очевидную важность неквантовой секреции, нигде, кроме нервно-мышечного синапса, данный феномен обнаружен не был. В настоящей работе мы впервые демонстрируем наличие неквантового выделения АЦХ в миокарде и, кроме того, исследуем механизмы регуляции неквантовой секреции и, по крайней мере отчасти, выясняем физиологическое значение этого феномена.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось доказательство существования неквантовой секреции АЦХ в сердце крысы, а также выяснение некоторых характеристик этого процесса, в том числе физиологических механизмов его регуляции.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Используя ингибиторы ацетилхолинэстеразы (АХЭ) различных классов показать способность АЦХ накапливаться в изолированных препаратах миокарда, лишенных экстракардиальных нервных влияний.

2. Выяснить способ секреции АЦХ, накапливающегося в исследуемых препаратах. Поскольку в ходе работы нам удалось доказать неквантовый характер секреции аккумулирующегося АЦХ, последующие задачи были направлены на изучение феномена неквантовой секреции в миокарде.

3. Изучить влияние АТФ и оксида азота, признанных регуляторов неквантовой секреции АЦХ в нервно-мышечном синапсе, на интенсивность неквантового выделения АЦХ в предсердном миокарде крысы.

4. Исследовать влияние важнейшего кардиорегулятора норадреналина на интенсивность неквантового выделения АЦХ с выяснением подтипа адренорецепторов, опосредующих этот процесс.

5. Исследовать возможность существования миогенных источников неквантовой формы АЦХ в сердце крыс.

6. С целью выяснения времени становления неквантовой секреции АЦХ в процессе онтогенеза изучить действие ингибитора АХЭ параоксона на параметры электрической активности в предсердном миокарде новорожденных крыс, а также 19-дневных эмбрионов.

Научная новизна исследования

Впервые явление неквантовой секреции АЦХ обнаружено не в скелетной мускулатуре, а в миокарде млекопитающих. Показано, что значительная часть неквантового АЦХ выделяется из постганглионарных парасимпатических интрамуральных нейронов, причем механизм неквантовой секреции в данном случае представляется таким же, как и в нервно-мышечном синапсе, а именно основанным на функционировании транспортера обратного захвата холина высокого сродства.

В данной работе впервые описаны физиологические эффекты АЦХ кардиомиогенного происхождения в миокарде взрослых крыс. С другой стороны показано, что в миокарде новорожденных крысят неквантовый АЦХ имеет исключительно нейрональное происхождение.

Кроме того, впервые описан новый способ регуляции неквантовой секреции АЦХ - с участием медиатора симпатических постганглионаров норадреналина.

Научно-практическая значимость

Полученные данные существенно расширяют наши представления о механизмах парасимпатической регуляции миокарда. В связи с этим нужно отметить, что хорошо известно защитное действие АЦХ на кардиомиоциты в условиях ишемии, поэтому периодически предпринимаются попытки использовать естественные парасимпатические кардиотропные воздействия в терапевтических целях. К примеру, были предложены пути применения карбаматного ингибитора ацетилхолинэстеразы пиридостигмина для терапии хронических ишемических состояний (Castro et al, 2004; Zimerman et al, 2010). Поэтому выяснение механизмов и источников выделения АЦХ в миокарде представляет значительную практическую ценность.

Основные положения, выносимые на защиту

1. АЦХ способен выделяться неквантовым (невезикулярным) способом из окончаний постганглионарных парасимпатических нейронов в предсердном миокарде крысы.

2. В миокарде взрослых крыс АЦХ также может выделяться невезикулярным путем из кардиомиоцитов.

3. Неквантовая секреция АЦХ в миокарде является регулируемым процессом, по крайней мере, она может подавляться норадреналином и оксидом азота.

4. В миокарде плодов крысы, находящихся на стадии 19-21 дня внутриутробного развития, неквантовая секреция является единственным способом выделения АЦХ из окончаний парасимпатических постганглионарных нейронов.

Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены на II Съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдавия, 2008), Third International Symposium on Non-neuronal Acetylcholine (Groningen, The Netherlands, 2011) V Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения с международным участием (Москва, 2012), XI Всероссийской молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2012), 2nd Joint Meeting of the International Society for Autonomic Neuroscience and the European Federation of Autonomic Societies (Giessen, Germany, 2013). Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова 11 сентября 2013 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них статей в журналах, рекомендованных ВАК - 1, в международных журналах, индексируемых в системах Scopus и Web of Science - 4, материалов международных и российских конференций - 5.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, объектов и материалов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 170 листах, содержит 39 рисунков, 1 таблицу. Список литературы включает 265 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Большая часть экспериментов, выполненных в рамках нашей работы, проводилась с применением стандартной методики внутриклеточной регистрации электрической активности миокарда с помощью стеклянных микроэлектродов. Другая часть экспериментов была выполнена с применением флуоресцентной микроскопии для оценки процессов эндо- и экзоцитоза в интрамуральных нервах, а также определения эффективности ботулотоксина в отношении квантовой секреции медиатора.

Животные

В работе было использовано около 330 взрослых самцов белых беспородных крыс массой 300-400 грамм, 16 новорожденных крысят первого дня жизни и 9 19-дневных крысиных эмбрионов, полученных от трех беременных крыс.

Взрослых животных декапитировали с помощью гильотины, после чего немедленно вскрывали грудную клетку. Сердце быстро извлекали и помещали в физиологический раствор Тироде (состав в ммоль/л: NaCl 129; КС1 4; ЫаШРО^ШО 2,09; NaHCOs 20; MgSOW^O 0,5; CaCh^IhO 1,8; глюкоза 7,77; оксигенирован карбогеном (5%С02+95%02), рН 7,4±0,1). Затем сердце промывали от крови с помощью шприца, вставленного в аорту. Извлечение сердца и выделение предсердных препаратов у новорожденных крыс и 19-дневных эмбрионов проводили сходным образом с учетом многократно меньших размеров объекта.

Далее в зависимости от цели эксперимента проводили соответствующую препаровку. Полученный фрагмент сердечной ткани помещали в суперфузионную камеру, после чего во всех экспериментах проводили адаптацию препарата в течение

часа, поскольку это время необходимо для установления нормальных значений параметров электрической активности. В течение 1-1,5 часов после адаптации исследуемые в работе характеристики оставались на сравнительно постоянном уровне.

Используемые в работе предсердные препараты работали в синусном ритме, а препараты желудочковой ткани работали в навязанном ритме. Для стимуляции устанавливали следующие параметры: частота - 5 Гц, длительность стимула - 1 мс, амплитуда - в 1,2-1,5 раза больше пороговой. Стимуляция папиллярной мышцы осуществлялась электрическим полем, параметры стимуляции были такими же, как и в случае препарата стенки правого желудочка.

Хроническая десгшпатизация крыс

Элиминирование симпатических нейронов в нашей работе достигалось химическим путем с помощью гуанетидина, инъекции которого новорожденным крысам, как известно, приводят к остановке формирования симпатического компонента нервной системы (Johnson et al., 1975). В настоящей работе крысятам Wlstar ежедневно вводили подкожно сульфат гуанетидина из расчета 25 мг/кг в первые 14 дней после рождения и 50 мг/кг в период от 15 по 42 день после рождения. Гуанетидин разводили в солевом растворе 0,9% NaCl, поэтому аналогичный объем раствора 0,9% NaCl вводили группе контроля. Полученные десимпатизированные и контрольные животные были доставлены автотранспортом в Казанский Институт Биохимии и Биофизики РАН и использованы в течение 3 дней после прекращения введения гуанетидина.

Внутриклеточная регистрация электрической активности

Для регистрации ПД использовался классический метод внутриклеточных отведений электрической активности при помощи стеклянных микроэлектродов (сопротивление 20-30 МП) из боросиликатного стекла (Sutter Instruments, Великобритания). Регистрирующая часть установки состояла из усилителя для внутриклеточных отведений с высоким входным сопротивлением (Model 3100, А-М Systems, США) и приборов для визуализации и записи сигнала. Выходной сигнал усилителя подавался на аналогово-цифровой преобразователь El4-140 (L-card, Россия), подключенный к компьютеру. Для наблюдения и регистрации сигнала на компьютере использовалась программа PowerGraph 3.0.

Регистрацию ПД в сердечной ткани начинали после периода адаптации препарата. После получения устойчивого отведения начинали перфузию препарата раствором, содержащим ингибитор ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в исследуемой концентрации. Суммарная длительность записи в эксперименте варьировала в диапазоне 15-30 минут в зависимости от конкретного протокола. В каждом опыте проводили только одну запись действия ингибитора АХЭ, что связано с необратимостью действия фосфорорганических ингибиторов. Во всех экспериментах по исследованию действия различных химических веществ на эффективность ингибиторов АХЭ сперва проводили перфузию сердечной ткани раствором с одним из этих веществ, а затем подавали в камеру раствор, содержащий как это вещество, так и ингибитор АХЭ.

Обработка препаратов миокарда ботулиническнм токсином

В некоторых экспериментах с целью полной блокады молекулярных механизмов, обеспечивающих квантовую секрецию медиаторов, использовали токсин ботулизма типа А. Для обеспечения полного проникновения ботулинического токсина внутрь нервных окончаний, использовался протокол инкубации, аналогичный описанному в литературе (Bullens et al., 2002). После стандартной препаровки ткань правого предсердия инкубировалась в физиологическом растворе, содержащем ботулотоксин типа А (50 Ед/мл) (Disport, Ipsen, Великобритания) в течение 4 часов при температуре 32°С и постоянной оксигенации раствора. В качестве контроля были проведены эксперименты, в которых предсердные препараты инкубировались в аналогичных условиях, но без ботулотоксина. Для достижения более эффективного проникновения токсина в холинергические окончания предсердия проводили стимуляцию препарата серебряными электродами в тефлоновой изоляции (1 Гц).

Оценка динамики эндоцитоза и экзоцитоза в предсердиых препаратах с помощью флуоресцентной метки FM1-43

Отслеживание процессов эндо- и экзоцитоза во внутрисердечных нервных волокнах осуществлялось с помощью флуоресцентной метки FM 1-43 (Molecular Probes, Eugene, OR, США), способной связываться с поверхностью нейрональной мембраны и вместе с ее участками попадать в состав эндосом. Таким образом, загрузка красителя FM1-43 во внутрисердечные нервные волокна рассматривалась как маркер процесса эндоцитоза, а его интенсивность в постганглионарных нейронах

оценивалась по уровню флуоресценции нервных окончаний, в составе которых находятся везикулы с FM1-43 (2,5 мкМ) (Cochilla et al., 1999). С другой стороны, динамика экзоцитоза оценивалась по скорости обесцвечивания нервных окончаний.

Для активации процесса эндоцитоза проводили двадцатиминутную стимуляцию интрамуральных нервов в присутствии FM 1-43 согласно методике, впервые описанной в работе Vincenzi и West (Vincenzi and West, 1963). Частота стимуляции составила 100 Гц, продолжительность стимула 100 мс, амплитуда 15 В, длительность пачки стимулов 15 с, интервал между пачками стимулов 45 с. При соблюдении всех условий загрузка метки в нейроны была успешной.

После проведения протокола загрузки нейронов выполнялось промывание предсердного препарата физиологическим раствором с добавлением циклодекстрина ADVASEP-7 (200 мкМ, Sigma, St Louis, МО, США), который связывал и удалял FM1-43 из внеклеточной среды и, следовательно, снижал фоновый уровень флуоресценции (Cochilla et al., 1999). Аналогичная схема была использована в части экспериментов по разгрузке метки из нервных волокон, где в течение 50 минут осуществляли электрическую стимуляцию интрамуральных нервов по описанному выше протоколу.

Визуализация нервных волокон с загруженной меткой проводилась на флуоресцентном микроскопе Olympus ВХ51 с *40 водно-иммерсионным объективом (Olympus, Tokyo, Япония) и пропускающим фильтром 510 нм (Chroma, Rockingham, VT, США). Изображение было получено с помощью камеры AxioCam MRm (Zeiss, Jena, Германия). Возбуждающий свет (488 нм) испускался монохроматором Polychrome V (TILL Photonics, Munich, Германия). Анализ флуоресцентных данных был выполнен на базе программы ImageJ 1.42.

Обработка результатов

Обработку полученных записей проводили в программе MiniAnalysis v.3.0.1. (Synapthosoft, США). Определяли длительность ПД на уровне 50% и 90% реполяризации мембраны (ДПД50 и ДПД90, соответственно), а также длительность сердечного цикла (ДЦ) в течение всей записи. Затем находили время наиболее выраженного действия исследуемых химических веществ и далее работали именно с максимальными величинами. Все результаты были представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего для п экспериментов.

Статистическая обработка проводилась в программе Statistica 6.0. Для оценки изменения ДПД50, ДПД90 и ДЦ под действием исследуемых веществ по сравнению с контрольными величинами использовали непараметрический критерий Вилкоксона

10

для связанных выборок. Оценка подавления эффектов ингибиторов АХЭ теми или иными химическими агентами проводилась с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для несвязанных выборок. Уровень относительной флуоресценции РМ1-43 после удаления красителя в разных сериях экспериментов сравнивался с помощью критерия Манна-Уитни. Значение р£0,05 рассматривалось как уровень статистической значимости эффекта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе настоящей работы наши усилия были направлены на проверку существования неквантовой секреции АЦХ в миокарде. Для этого мы воспользовались тем же приемом, который ранее помог обнаружить процесс неквантового выделения АЦХ в нервно-мышечном синапсе (Кагг ап(1 МПе<Ц, 1977), а именно подавлением холинэстеразной активности.

Влияние различных ингибиторов ацетилхолинэстеразы на параметры электрической активности предсердного миокарда

Первым шагом в рамках нашей работы по изучению возможности существования неквантовой секреции АЦХ в сердечной ткани стало рассмотрение процессов, протекающих в исследуемых препаратах миокарда в условиях угнетения активности АХЭ.

В нормальных условиях значения ДПД50, ДПД90 и ДЦ составили 19±2 мс, 54±5 мс, 190±14 мс соответственно.

В работе использовали карбаматный ингибитор АХЭ прозерин (неостигмин), а также фосфороорганический ингибитор армин. На последующих этапах работы армин стал для нас недоступен, в связи с чем часть экспериментов была продублирована для его аналога - фосфороорганического ингибитора АХЭ параоксона. Дальнейшие этапы исследования также были выполнены с использованием параоксона. Все используемые ингибиторы АХЭ вызывали сходные изменения параметров электрической активности в предсердном миокарде крысы -уменьшение длительности ПД на уровне 50% (ДПД50) и 90% реполяризации (ДПД90), а также увеличение длительности сердечного цикла (ДЦ), то есть торможение ритмической активности синоатриального узла (см. рис.1-3).

2 -100

Рис.1. Оригинальная запись ПД, отражающая влияние ингибитора АХЭ (на примере параоксона) на параметры электрической активности в предсердном миокарде крысы

Изменения параметров электрической активности миокарда вследствие аппликации ингибиторов АХЭ снимались в присутствии неселективного блокатора мускариновых рецепторов атропина (см. рис.2, 3) и, следовательно, обусловлены накоплением эндогенного АЦХ в сердечной ткани и активацией мускариновых рецепторов.

Рис.2. Оригинальные записи, демонстрирующие изменение конфигурации ПД под действием ингибитора АХЭ (на примере армина). Изображение ПД в контроле, при действии 100 нМ и 1 мкМ армина, а также восстановление исходной длительности ПД под действием 1 мкМ атропина (после обработки 1 мкМ армина).

. Параоксон _ 5 мкМ

Контроль

100 мс

| | Армии 100 нМ, п=6 ВЦ Армии 10 мкМ, п=5

Ж Армии 1 мкМ, п=9 ^^ Армии 1 мкМ + атропин 1 мкМ, п=9 160

с; о о.

•8-о

Уменьшение ДПД60 Уменьшение ДПД90 Увеличение ДЦ

Рис.3. Эффекты армина в препарате правого предсердия крысы: укорочение ПД на уровне 50 и 90% реполяризации и увеличение ДЦ, а также снятие этих эффектов при аппликации 1 мкМ атропина. Здесь и далее по оси ординат: соответственно величина укорочения ПД в % от длительности ПД в контроле и увеличение длительности цикла в % от частоты следования ПД в контроле. * - достоверность эффекта по сравнению с контролем до действия вещества, тест Вилкоксона, р<0,05; & - статистически значимые различия между столбцами, тест Манна-Уитни, р<0,05

Далее мы попытались выяснить, какие механизмы лежат в основе накопления АЦХ в миокарде в условиях ингибирования холинэстеразной активности. Для достижения этой цели необходимо было рассмотреть участие классического квантового механизма выделения медиатора в опосредовании наблюдаемых эффектов. С другой стороны, не исключалась вероятность неквантового способа секреции АЦХ в миокарде, что также потребовало тщательной проверки.

Проверка гипотезы о вкладе квантовой секреции в накопление ацетилхолина в миокарде

Для выяснения роли квантовой секреции в накоплении АЦХ в миокарде мы прибегли к подавлению экзоцитоза синаптических везикул с помощью специфического блокатора - ботулотоксина (токсин ботулизма типа А).

13

Процессы эндо- и экзоцитоза в холинергических нейронах миокарда довольно плохо изучены, поэтому необходимо было удостовериться, что инкубация предсердных препаратов в растворе с ботулотоксином создает условия для его попадания в нервные окончания и нарушения молекулярного механизма экзоцитоза. Для выяснения этих вопросов был использован липофильный флуоресцентный маркер РМ1-43, способный связываться с нейрональной мембраной и оставаться на поверхности подвергшихся эндоцитозу везикул (СосЫНа е1 а!., 1999). Эксперименты этой части работы были выполнены на десимпатизированных крысах во избежание попадания красителя в адренергические нервные окончания. Анализ уровня флуоресценции меченных РМ1-43 везикул, образующихся в нервном волокне в ходе эндоцитоза, подтвердил существование квантовых процессов в интрамуральных холинергических волокнах правого предсердия крысы (см. рис.4а).

Далее исследовалась способность ботулотоксина подавлять динамику квантовой секреции АЦХ в предсердных препаратах крыс в наших экспериментальных условиях. Показателем интенсивности экзоцитоза в нервных окончаниях служила скорость разгрузки красителя РМ1-43. Оказалось, что в условиях стимуляции интрамуральных нервов в контрольных препаратах в течение 50 минут регистрировалось значительное снижение уровня флуоресценции (см. рис.4б), отражавшее интенсивность экзоцитоза везикул. С другой стороны, предварительная инкубация препаратов правого предсердия с ботулотоксином практически полностью подавляла разгрузку РМ1-43 (см. рис.46) и, следовательно, экзоцитоз везикул.

Рис.4. А. Флуоресценция РМ1-43 в интрамуральных холинергических нейронах. Б. Уменьшение относительной интенсивности флуоресценции в покое и в ходе

разгрузки БММЗ из парасимпатических нервных окончаний в норме, а также после предварительной инкубации препарата с ботулиническим токсином. * - различие между разгрузкой в норме и в присутствии ботулотоксина статистически значимо, критерий Манна-Уитни, р<0,05

На основании полученных экспериментальных данных мы заключили, что использованный протокол инкубации с ботулотоксином гарантирует полное подавление всех форм квантовой секреции АЦХ в препаратах правого предсердия. Поэтому мы перешли непосредственно к проверке влияния ботулотоксина на выраженность эффектов армина. После предварительной инкубации предсердной ткани по протоколу, описанному в методике, проводили перфузию препаратов правого предсердия раствором, содержащим армин в максимально эффективной концентрации (1 мкМ). Сравнение степени изменения параметров ДПД и ДЦ в опытной группе, где инкубация проводилась в присутствии ботулотоксина, и в контрольной группе, для которой использовался аналогичный протокол инкубации без токсина, не выявило статистически значимых различий (см. рис.5).

>3 I

ш

.0 Ц

о о.

X

о

0) #

-8-

Армии 1 мкМ, □ Армин 1 мкМ, (после обработки (контроль), п=6 ботулотоксином), п=7

Уменьшение ДПД50 Уменьшение ДПДЭ0 Увеличение ДЦ

Рис.5. Сравнение эффектов армина (1 мкМ) в препаратах, инкубированных в присутствии ботулинического токсина (50 Ед/мл) и без токсина. * - критерий Вилкоксона, р<0,05

Таким образом, экспериментально показано, что квантовая секреция не влияет на тенденцию накопления АЦХ в миокарде в условиях подавления ферментативной

активности АХЭ. Поэтому остается предположить, что накопление AIIX обусловлено преимущественно неквантовым выбросом медиатора из холинергических нервных окончаний в миокарде крыс, аналогичного описанному ранее в нервно-мышечных синапсах.

Рассмотрение механизма неквантовой секреции ацетилхолина в миокарде

В следующей части работы мы исследовали механизм неквантового выделения AT ТУ из внутрисердечных нейронов. Согласно одной концепции, неквантовая секреция молекул АЦХ обусловлена работой везикулярных транспортеров АЦХ (ВТацх), которые встраиваются в пресинаптическую мембрану в процессе экзоцитоза везикул (Edwards et al., 1985). Другая концепция предполагает осуществление неквантового выделения медиатора через транспортеры системы захвата холина высокого сродства (high affinity choline transporter, CHT), в норме обеспечивающие закачивание холина, продукта деградации АЦХ, обратно в нервное окончание (Nikolsky et al., 1991).

Наша задача свелась к проверке этих вариантов. Оценка вклада транспортных систем в процесс неквантового выделения АЦХ проводилась на основании изменения выраженности эффектов ингибиторов АХЭ в присутствии селективных ингибиторов ВТацх (везамикол) и СНТ транспортеров (гемихолиний III).

Было показано, что аппликация везамикола не приводила к статистически значимым изменениям выраженности эффектов ингибиторов АХЭ во всех сериях экспериментов (см. рис.6). Следовательно, накопление АЦХ в предсердном миокарде никак не связано с работой ВТацх, а обусловлено работой транспортеров системы обратного захвата холина. Действительно, полученные данные показали, что только на фоне гемихолиния III, блокатора СНТ транспортеров, происходило статистически значимое снижение эффективности всех ингибиторов АХЭ. Так, в присутствии гемихолиния III выраженность влияний армина (1 мкМ) в отношении измеряемых показателей ДПД50, ДПД90, ДЦ составила, соответственно, 37,1%, 44,9% и 12,5% от максимально возможных значений (см. рис.6); выраженность эффектов прозерина (5 мкМ) - 41,7%, 40,9%, 18,6% (не показано); а эффективность параоксона (5 мкМ) составила 50,7%, 46,4% и 25,8% от максимально возможных значений (не показано). Для того, чтобы окончательно удостовериться, что вызванные гемихолинием эффекты опосредованы накоплением АЦХ, а не каким-либо неспецифическим влиянием ингибитора на мускариновые рецепторы, была проведена серия

экспериментов, в которых сравнили действие АЦХ в норме и в присутствии гемихолиния (не показано). Статистически значимых различий между эффектами АЦХ на фоне ингибитора и в его отсутствие обнаружено не было.

| Армии | | Везамикол 1 мкМ + ЦЩ Гемихолиний 10 мкМ 1мкМ, п=9 армии, п=5 + армии, п=7

з

X

ш

У

га

I Р5 X

л

X

л §

о.

II

о

X У-

о

ш

-е-о

160 140 120 100 80 60 40 20 0

т-и

т м

Уменьшение ДПД50 Уменьшение ДПД90 Увеличение ДЦ

Рис.6. Влияние 10 мкМ гемихолиния и 1 мкМ везамикола на эффекты 1 мкМ армина в правом предсердии крысы. * - критерий Вилкоксона, р<0,05; & - критерий Манна-Уитни, р<0,05

Таким образом, полученные экспериментальные данные о подавлении эффектов ингибиторов АХЭ в присутствии гемихолиния подтверждают наше предположение о наличии неквантовой секреции АЦХ в миокарде. Поэтому следующую часть нашей работы мы посвятили выяснению возможности модуляции неквантовой секреции АЦХ в миокарде.

Исследование механизмов регуляции неквантовой секреции ацетилхолина

Многочисленные экспериментальные данные указывают на то, что в нервно-мышечных синапсах неквантовая секреция АЦХ представляет собой не простую утечку порций медиатора из пресинаптических окончаний, а ре1улируемый процесс. Нами же было проведено исследование аналогичных путей регуляции неквантовой секреции АЦХ в сердечной ткани. Поскольку на первом этапе нашей работы была

доказана обусловленность эффектов ингибиторов АХЭ неквантовым выделением АЦХ, в дальнейших экспериментах выраженность эффектов фосфорорганического ингибитора параоксона служила критерием интенсивности неквантовой секреции.

Регуляция неквантовой секреции ацетилхолина оксидом азота

При рассмотрении механизмов модуляции секреции медиаторов значительное внимание уделяется внутриклеточным и экстраклеточным газообразным посредникам, а особенно - оксиду азота (N0). Ранее было экспериментально подтверждено, что синтезированный в миоцитах N0 ретроградно действует на пресинаптическое окончание и участвует в подавлении процесса неквантовой секреции АЦХ в нервно-мышечном синапсе (Mukhtarov et al., 1999; Mukhtarov et al., 2000; Malomouzh et al., 2003; Malomouzh et al., 2005; Malomouzh et al., 2007).

В связи с этим мы исследовали роль NO в модуляции неквантового выделения АЦХ в миокарде. Для этого были проведены серии экспериментов с использованием доноров молекул оксида азота - нитропруссида натрия и SNAP (5-Нитрозо-Лг-ацетилпеницилламин). Оказалось, что аппликация нитропруссида (10 мкМ) вызывала статистически значимое ослабление эффектов параоксона (см. рис.7). Было также показано, что в присутствии другого донора NO - SNAP (100 мкМ) влияние параоксона на длительность ПД было выражено слабее, чем в норме (см. рис.7).

ЩИ Параоксон Нитропруссид 10 мкМ [ | SNAP 100 мкМ

5 мкМ. n=14 + naDaoKCQH. п=7 + параоксон, n=6

Рис.7. Влияние доноров N0 (10 мкМ нитропруссида натрия или 100 мкМ SNAP) на выраженность эффектов параоксона. * - критерий Вилкоксона, р<0,05; & - критерий Манна-Уитни, р<0,05

Таким образом, подавление эффектов параоксона в присутствии доноров N0 свидетельствует о наличии в миокарде отрицательной нитрергической регуляции интенсивности неквантовой секреции АЦХ, продемонстрированной ранее в препаратах нервно-мышечных синапсов.

Адреиергическая модуляция неквантовой секреции ацетшхолина

В нашей работе большой интерес представляло изучение вероятных воздействий важного кардиорегулятора и основного нейромедиатора симпатических постганглионарных нейронов - норадреналина (НА) на процесс неквантовой секреции АЦХ из окончаний парасимпатических постганглионарных нейронов.

Поскольку объектом нашего внимания являлось рассмотрение пресинаптических влияний НА, все эксперименты данного подраздела проводились в присутствии p-блокатора пропранолола для исключения прямого влияния НА на р-адренорецепторы, широко распространенные на мембранах кардиомиоцитов (Brodde et al., 1991, 2006). В присутствии пропранолола контрольные значения ДПД50, ДПД90 и ДЦ составили 15±3 мс, 41±6 мс, 271±8 мс, соответственно.

Перфузия предсердных препаратов раствором с параоксоном (5 мкМ) на фоне пропранолола (5 мкМ) вызывала развитие типичных холинергических эффектов (см. рис.8), аналогичных описанным ранее (см. рис.1).

В ходе исследования возможности адренергической модуляции неквантовой секреции АЦХ было продемонстрировано, что НА в используемых концентрациях (0,1 мкМ и 1 мкМ) приводит к статистически значимому ослаблению действия параоксона на регистрируемые параметры электрической активности (см. рис.8). Поскольку пропранолол присутствовал в перфузионном растворе на протяжении всего эксперимента и, следовательно, полностью исключал участие Р-адренорецепторов в модуляции неквантового выделения АЦХ, мы предположили, что эффекты НА опосредованы активацией а-адренорецепторов.

Попытка установления подтипа адренорецепторов, опосредующих негативное действие НА, привела к неоднозначным результатам. Так, на фоне сс2-антагониста йохимбина (1 мкМ) аппликация НА (1 мкМ) не приводила к статистически значимым изменениям выраженности эффектов параоксона (см. рис.8).

19

¡Параоксон НА 0,1 мкМ + НА 1 мкМ + Щ Йохимбин 1 мкМ 5 мкМ, п=7 Параоксон, Параоксон, + НА 1 мкМ +

п=7 п=6 Параоксон, п=7

Уменьшение ДПД60 Уменьшение ДПД90 Увеличение ДЦ

Рис.8. Влияние 0,1 мкМ и 1 мкМ Р1А на выраженность эффектов параоксона (5 мкМ), а также частичное снятие эффектов 1 мкМ НА в присутствии селективого аг-антагониста йохимбина (1 мкМ). Пропранолол присутствовал в течение всего времени эксперимента. * - критерий Вилкоксона, р<0,05; & - критерий Манна-Уитаи, р<0,05

Поскольку блокирование аг-адренорецепторов сопровождалось лишь частичным снятием эффектов НА, были проведены эксперименты с селективными аг и си агонистами (см. рис.9). Было показано, что на фоне селективного аг-агониста клонидина (1 мкМ) происходило статистически значимое подавление влияний параоксона, выраженное в снижении показателей ДПД50 и ДПД90 (см. рис.9). С другой стороны, аппликация избирательного оц-агониста фенилэфрина вызывала аналогичное статистически значимое снижение холинергических эффектов параоксона (см. рис.9). Из этого следует, что оба типа а-адренорецепторов принимают участие в опосредовании норадренергических влияний на интенсивность неквантовой секреции АЦХ миокарде.

Таким образом, важнейший кардиорегулятор норадреналин способен подавлять интенсивность неквантовой секреции АЦХ в миокарде. Его ингибиторное действие реализуется за счет влияния на адренорецепторы 01 и аг подтипов, однако вклад каждого из компонентов, а также синаптическая локализация щ и аг-адренорецепторов остаются вопросом для дальнейших исследований.

В Параоксон I i Фэнилэфрин 1 мкМ НЦ Клонидин 1 мкМ

Рис.9. Влияние ai-агониста фенилэфрина (1 мкМ) и а2-агониста клонидина (1 мкМ) на выраженность эффектов параоксона (5 мкМ). Пропранолол присутствовал в течение всего времени эксперимента. * - критерий Вилкоксона, р<0,05; & - критерий Манна-Уитни, р<0,05

До недавнего времени считалось, что единственным источником АЦХ в сердце являются нервные окончания. С другой стороны, в последние годы появились свидетельства в пользу существования дополнительных, ненейрональных, источников АЦХ в скелетной мускулатуре (Mitchell and Silver, 1963; Dolezal and Tucek, 1983) и в сердце (Kakinuma et al., 2009; Rana et al., 2010). Поэтому в следующей части нашей работы мы попытались ответить на вопрос об источниках неквантового АЦХ в миокарде.

Исследование возможности существования ненейрональных источников ацетилхолина неквантового происхождения

В отличие от взрослых крыс, кардиомиоциты которых способны синтезировать АЦХ, а также секретировать медиатор во внеклеточную среду (Kakinuma et al., 2009; Rana et al., 2010), миокард новорожденных крысят характеризуется отсутствием компонентов, ответственных за синтез АЦХ, а также неспособностью неонатальных кардиомиоцитов выделять АЦХ (Rana et al., 2010). Принимая во внимание эти

21

данные, мы попытались выяснить, возможно ли осуществление неквантовой секреции АЦХ в сердце новорожденных крыс, где весь медиатор имеет нейрональное происхождение, или же становление этого процесса приходится на более поздние периоды онтогенеза, когда в сердце появляется миогенный источник АЦХ.

Исследуемые параметры электрической активности в препаратах правого предсердия новорожденных крыс практически не отличались от аналогичных показателей у взрослых животных, однако сердечный ритм у первых был снижен. В контроле значения ДПД50, ДПД90 и ДЦ составили 20±2 мс, 46±2 мс, 284±15 мс, соответственно. В присутствии ингибитора АХЭ (параоксон, 5 мкМ) в миокарде новорожденных животных развивались типичные холинергические эффекты (см. рис.10), выраженные слабее, но сопоставимые с таковыми при действии параоксона в препаратах взрослых крыс.

Доказательство существования неквантовой секреции АЦХ в неонатальном миокарде, лишенном способности секретировать медиатор во внеклеточную среду, указывало на исключительную роль нейронов в опосредовании этого процесса. Действительно, подтверждения этого были получены в ходе экспериментов с аппликацией блокатора нейрональных СНТ транспортеров гемихолиния III (10 мкМ), приводившего к практически полному подавлению всех эффектов параоксона (см. рис.10) и, следовательно, неквантовой секреции АЦХ в сердечной ткани новорожденных крыс.

С другой стороны, в присутствии гемихолиния воздействие параоксона на параметры электрической активности миокарда взрослых крыс было значительно снижено, но не устранено полностью (см. рис.10). По всей видимости, это могло быть следствием существования дополнительного, ненейронального, источника неквантового АЦХ, роль которого могли выполнять сами кардиомиоциты.

IX £

I ®

т го

I п

X

л

I

■Я §

о. к

ш

к

си &

-& о

80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10

Взрослые:

Ц Параоксон 5 мкМ, п=10

рщ Параоксон 5 мкМ +

гемихолиний ЮмкМ, п-£

Новорожденные:

] Параоксон 5 мкМ, п=7

рр! Параоксон 5 мкМ +

гемихолиний 10 мкМ, п=6

Рис.10. Исследование действия 10 мкМ гемихолиния III на выраженность эффектов параоксона (5 мкМ) в предсердных препаратах взрослых и новорожденных крыс. * -критерий Вилкоксона, р<0,05; & - критерий Манна-Уитни, р<0,05

Некоторые авторы склоняются к тому, что в ненейрональных клетках секреция АЦХ может осуществляться через транспортеры органических катионов, экспрессирующихся там в больших количествах (Кекиёа е1 а1., 1998; е1 а!., 2000; КоервеН ег а1., 2003; КоервеП е! а!., 2007; Ьат1ю1ша11 е1 а1., 2009). Мы же проверили уместность этого предположения применительно к препаратам сердечной ткани, исследуемым в работе. Для этого были проведены эксперименты с кортикостероном, блокатором транспортеров органических катионов. Оказалось, что на фоне кортикостерона (100 мкМ) происходило статистически значимое снижение влияний параоксона (5 мкМ) на параметры электрической активности (см. рис.11), сопоставимое с изменениями при аппликации гемихолиния (см. рис.11). Более того, одновременная аппликация гемихолиния и кортикостерона вызывала практически полное подавление эффектов параоксона (см. рис.11) и, следовательно, неквантовой секреции АЦХ.

Уменьшение ДПД50 Уменьшение ДПД90_Увеличение ДЦ

Параоксон, п=10 | | Кортикостерон 100 мкМ + параоксон,

п=8

Гемихолиний 10 мкМ + кортикостерон 100 мкМ + параоксон, п=8 ЗГ

Гемихолиний 10 мкМ + параоксон, п=8

&

&

1 1 * т

- У. * т

1

*

II

Уменьшение ДПД50 Уменьшение ДПД90 Увеличение ДЦ

Рис.11. Исследование действия гемихолиния и кортикостерона на выраженность эффектов параоксона в предсердных препаратах взрослых крыс. * - критерий Вилкоксона, р<0,05; & - критерий Манна-Уитни, р<0,05

Основываясь на полученных экспериментальных данных, можно сделать вывод о дуализме природы неквантовой секреции АЦХ. На начальных этапах посткатального онтогенеза сердце новорожденных крыс характеризуется наличием лишь нейрональной формы неквантовой секреции АЦХ, обусловленной работой СНТ транспортеров (см. рис.12). Однако в процессе дальнейшего развития в дополнение к нейрональному ресурсу, по-видимому, появляется миогенный источник неквантового АЦХ, роль которого у взрослых крыс играют кардиомиоциты. Молекулы медиатора в этом случае секретируются из клеток через транспортеры органических катионов (см. рис.12).

Рис. 12. Схематическое изображение способов секреции неквантовой формы АЦХ в предсердном миокарде крысы (ХАТ - холинацетилтрансфераза, АХЭ -ацетилхолинэстераза)

На заключительном этапе работы был рассмотрен вопрос о времени появления неквантовой секреции АЦХ в сердце в процессе онтогенеза и связанной с этим возможной физиологической роли исследуемого феномена.

Появление неквантовой секреции ацетилхолина в процессе пренатального развития

Согласно экспериментальным данным, способность парасимпатических внутрисердечных нейронов выделять АЦХ в ответ на возбуждение (вызванная квантовая секреция) появляется в сердце крысы на 21 день развития, т.е. незадолго до рождения (Marvin et al., 1980). С другой стороны, некоторые свидетельства указывают на более раннее появление в пренатальном онтогенезе компонентов,

25

Гемихолиний III

• - АЦХ ф -холин

Неквантовая секреция Квантовая секреция

Парасимпатический нейрон

Система обратного захвата холина

• . ;

Неселективные транспортеры органических

катионов

ответственных за метаболизм АЦХ. Ключевой фермент холинацетилтрансфераза, ответственный за синтез АЦХ, обнаруживается в сердце крыс на 19 эмбриональный день (ED19) (Marvin et al, 1980). Поэтому совершенно логично предположить, что осуществление синтеза АЦХ и, тем более, его секреция отсутствует вплоть до фазы ED19. Принимая во внимание эти сведения, мы задались вопросом, возможно ли появление неквантовой секреции АЦХ в нейронах на этапе ED19, или же этот процесс формируется одновременно с квантовой секрецией незадолго до рождения.

Для выяснения вопроса были выполнены эксперименты на изолированных препаратах предсердного миокарда 19-дневных эмбрионов крыс, работавших в синусном ритме. В контроле значения ДПД50, ДПД90 и ДЦ составили 21±5 мс, 42±6 мс, 244±8 мс, соответственно. Как и в предыдущей части работы, выполненной на предсердных препаратах взрослых и новорожденных крыс, в присутствии параоксона мы наблюдали развитие типичных холинергических эффектов в эмбриональном миокарде крыс, выражавшееся в уменьшении ДПД и увеличении ДЦ (см. рис.13).

Взрослые. Параоксон 5 мкМ, п=10

| | Новорожденные. Параоксон 5 мкМ, п=7

| Эмбрионы (ED19). Параоксон 5 мкМ, п=7

Уменьшение ДПД50 Уменьшение ДПД90 Увеличение ДЦ

Рис. 13. Сравнение эффектов 5 мкМ параоксона в предсердных препаратах взрослых и новорожденных крыс, а также 19-дневных эмбрионов. * - критерий Вилкоксона, р<0,05

Полученные результаты свидетельствуют о существовании в онтогенезе значительного периода, когда неквантовое выделение АЦХ уже присутствует в миокарде, в то время как квантовые механизмы секреции медиатора еще не сформировались. В связи с этим представляется вероятной роль исследуемого феномена в становлении полноценной парасимпатической иннервации сердечной ткани на завершающих этапах пренатального онтогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы (армин, параоксон, прозерин) вызывают в изолированных препаратах миокарда холинергические эффекты - уменьшение длительности потенциала действия и замедление ритма, которые снимаются атропином и, следовательно, обусловлены накоплением АЦХ в миокарде.

2. АЦХ, аккумулирующийся в миокарде в отсутствие экстракардиальных нервных воздействий, выделяется из клеток в процессе неквантовой секреции, обусловленной работой транспортера обратного захвата холина высокого сродства.

3. Оксид азота снижает интенсивность неквантовой секреции АЦХ в миокарде, в то время как АТФ не оказывает влияния на данный процесс.

4. Норадреналин подавляет неквантовую секрецию ацетилхолина в миокарде крыс посредством активации си- и аг-адренорецепторов.

5. Существенная часть неквантового АЦХ в миокарде взрослых крыс имеет миогенную природу, в то время как в миокарде новорожденных крысят АЦХ выделяется неквантовым способом исключительно из интрамуральных парасимпатических нейронов.

6. Параоксон вызывает типичные холинергические эффекты в миокарде не только новорожденных крыс, но и 19-дневных эмбрионов, что указывает на наличие неквантовой секреции АЦХ в пренатальном онтогенезе, когда вызванная квантовая секреция отсутствует.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Borodinova A.A., Abramochkin D.V., Sukhova G.S. Non-quantal release of acetylcholine in rat atrial myocardium is inhibited by noradrenaline // Experimental Physiology. 2013. doi: 10.1113/expphysiol.2013.074989

2. Abramochkin D.V., Borodinova A.A., Rosenshtraukh L.V., Nikolsky E.E. Both neuronal and non-neuronal acetylcholine takes part in non-quantal acetylcholine release in the rat atrium // Life Sciences. 2012. V. 91(21-22). P. 1023-1026.

3. Абрамочкин Д.В., Бородинова A.A., Никольский E.E., Розенштраух Л.В. Модуляция оксидом азота интенсивности неквантовой секреции ацетилхолина в миокарде правого предсердия крысы // Биологические мембраны. 2012. Т. 29 (4). С. 1-7.

4. Abramochkin D.V., Borodinova А.А., Rosenshtraukh L.V. Effects of acetylcholinesterase inhibitor paraoxon denote the possibility of non-quantal acetylcholine release in myocardium of different vertebrates // J. Comparative Physiology. B. 2012. V. 182(1). P. 101-108.

5. Abramochkin D.V., Nurullin L.F., Borodinova A.A., Tarasova N.V., Sukhova G.S., Nikolsky E.E., Rosenshtraukh L.V. Non-quantal release of acetylcholine from parasympathetic nerve terminals in the right atrium of rats // Experimental Physiology. 2010. V. 95(2). P. 265-273.

Тезисы устных и стендовых докладов

1. Borodinova А.А., Abramochkin D.V. Noradrenergic regulation of non-quantal acetylcholine release from parasympathetic fibers in rat myocardium // Abstracts of 2nd Joint Meeting of the International Society for Autonomic Neuroscience and the European Federation of Autonomic Societies. Germany. Giessen. 2013. J Autonomic Neuroscience. V. 177(2). P. 312.

2. Бородинова A.A., Абрамочкин Д.В. Выяснение регуляторных механизмов неквантовой секреции ацетилхолина в предсердном миокарде крысы. Доклад на XI Всероссийской молодежной научной конференции Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике. Сыктывкар. 2012. С. 37.

3. Бородинова А.А., Сухова Г.С., Абрамочкин Д.В. Оксид азота и норадреналин ослабляют неквантовую секрецию ацетилхолина в предсердном миокарде крысы. Тезисы V Всероссийской с международным участием школы-конференции. Москва. 2012. С. 28.

4. Abramochkin DV, Borodinova AA, Nikolsky EE, Rosenshtraukh LV. Both neuronal and non-neuronal acetylcholine take part in non-quantal acetylcholine release in the rat atrium. Abstracts of Third Internationa! Symposium on Non-neuronal Acetylcholine. The Netherlands. Groningen. 2011.

5. Абрамочкин Д.В., Бородинова A.A., Никольский E.E., Розенштраух Л.В. Влияние ингибиторов ацетилхолинэстеразы на параметры электрической активности в предсердии крысы. Тезисы II Съезда физиологов СНГ. Молдавия. Кишинев. 2008. С. 118.

Заказ № Л ¿Объем 1п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». . Москва, ул. Палиха 2а. тел. 8(499)250-92-06 www.postator.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бородинова, Анастасия Александровна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

04201365373

Бородинова Анастасия Александровна

НЕКВАНТОВАЯ СЕКРЕЦИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА В МИОКАРДЕ КРЫСЫ И МЕХАНИЗМЫ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: к.б.н., доцент Сухова Г.С. к.б.н., Абрамочкин Д.В.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................8

1.1. Актуальность темы................................................................................8

1.2. Задачи исследования..............................................................................9

1.3. Научная новизна..................................................................................10

1.4. Научно-практическая значимость.............................................................10

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.............................................11

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................12

2.1. Экстракардиальные и интракардиальные влияния.........................................13

2.1.1. Интракардиальные ганглии..............................................................14

2.1.1.1.Пре- и постнатальное развитие внутрисердечных ганглиев..................14

2.1.1.2.Локализация внутрисердечных ганглиев и их проекции.....................16

2.1.1.3. Структурно-морфологические и нейрохимические особенности внутрисердечных ганглиев........................................................20

2.1.2. Структура вегетативных синапсов в сердечной ткани............................24

2.2. Симпато-парасимпатические взаимодействия.............................................28

2.2.1. Взаимодействия на уровне ганглиев.................................................28

2.2.2. Взаимодействия на пре- и постсинаптическом уровне...........................29

2.2.2.1.Пресинаптическое взаимодействие...............................................29

2.2.2.2.Постсинаптическое взаимодействие.............................................33

2.2.2.2.1. Мускариновые и адренергические рецепторы в миокарде.........33

2.2.2.2.2. Механизмы действия ацетилхолина и норадреналина на миокард. Аденилатциклазный и фосфоинозитольный каскады.......................................................................35

2.3. Жизненный цикл ацетилхолина...............................................................40

2.3.1. Синтез ацетилхолина в нейронах......................................................40

2.3.2. Синтез ацетилхолина в мышечных клетках........................................42

2.3.3. Квантовая секреция ацетилхолина.....................................................44

2.3.4. Распад ацетилхолина. Ацетилхолинэстераза.......................................47

2.3.5. Обратный захват холина. Система захвата холина высокого сродства.........50

2.3.6. Перенос холина и ацетилхолина. Транспортеры органических катионов...................................................................................52

2.4. Неквантовая секреция ацетилхолина...................... .....................................54

2.4.1. Открытие неквантовой секреции ацетилхолина...................................54

2.4.2. Механизм неквантового выделения ацетилхолина................................55

2.4.3. Неквантовая секреция ацетилхолина в нейронах, иннервирующих гладкие мышцы дыхательных путей............................................................57

2.4.4. Неквантовая секреция ацетилхолина в афферентных нейронах зрительной системы позвоночных и беспозвоночных...........................................58

2.4.5. Регуляция неквантовой секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах...............................................................................................................59

2.4.5.1 .Влияние температуры и ионного состава внешней среды на интенсивность неквантовой секреции............................................59

2.4.5.2.Влияние активности №+/К+-АТФазы на интенсивность неквантовой секреции ацетилхолина.............................................................60

2.4.5.3.Действие пероксида водорода на процесс неквантовой секреции ацетилхолина.........................................................................60

2.4.5.4.Влияние денервации мышцы на процесс неквантовой секреции ацетилхолина.........................................................................61

2.4.5.5.Динамика неквантовой секреции ацетилхолина в условиях гипоксии........................................................................................................61

2.4.5.6.Пуринергическая регуляция неквантовой секреции ацетилхолина.........62

2.4.5.7.Глутаматергическая регуляция неквантовой секреции ацетилхолина.................................................................................................64

2.4.5.8.Ауторегуляция неквантовой секреции ацетилхолина...............................66

2.4.6. Прочие виды неквантовой секреции.................................................70

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................76

3.1. Животные..........................................................................................76

3.1.1. Взрослые крысы...........................................................................76

3.1.2. Получение эмбрионов и новорожденных крыс....................................77

3.1.3. Хроническая десимпатизация крыс..................................................77

3.2. Препаровка........................................................................................78

3.2.1. Выделение препарата правого предсердия.........................................78

3.2.2. Препаровка стенки правого желудочка...............................................79

3.2.3. Выделение препарата папиллярной мышцы........................................79

3.3. Внутриклеточная регистрация электрической активности...............................80

3.4. Обработка препаратов миокарда ботулиническим токсином............................84

3.5. Оценка динамики эндоцитоза и экзоцитоза в предсердных препаратах с помощью флуоресцентной метки РМ1-43................................................................84

3.6. Обработка результатов.............................................................................85

4. РЕЗУЛЬТАТЫ........................................................................................87

4.1. Влияние различных ингибиторов ацетилхолинэстеразы на параметры электрической активности предсердного миокарда........................................87

4.1.1. Изучение влияний армина и прозерина на параметры электрической активности в правом предсердии крысы............................................88

4.1.2. Влияние параоксона на параметры электрической активности в правом предсердии крысы.......................................................................93

4.1.3. Аритмогенные эффекты ингибиторов ацетилхолинэстеразы...................95

4.1.4. Исследование влияния атропина на конфигурацию потенциалов действия предсердного миокарда крысы в нормальных условиях...............................96

4.2. Проверка гипотезы о вкладе вызванного квантового выделения в накопление ацетилхолина в миокраде........................................................................99

4.2.1. Эксперименты с тетродотоксином....................................................99

4.2.2. Эксперименты с бромидом гексаметония.........................................100

4.3. Проверка гипотезы о вкладе спонтанной квантовой секреции в накопление ацетилхолина в миокарде......................................................................101

4.3.1. Эксперименты с ботулотоксином. Проверка эффективности действия ботулотоксина в предсердных препаратах........................................103

4.3.2. Эксперименты с ботулотоксином. Влияние инкубации препарата с ботулотоксином на выраженность эффектов армина............................105

4.4. Рассмотрение механизма неквантовой секреции ацетилхолина в миокарде.......106

4.5. Исследование механизмов регуляции неквантовой секреции ацетилхолина.....................................................................................112

4.5.1. Изучение возможности пуринергической регуляции неквантовой секреции ацетилхолина..................................................................................112

4.5.2. Регуляция неквантовой секреции ацетилхолина оксидом азота..............115

4.5.3. Адренергическая модуляция неквантовой секреции ацетилхолина..........117

4.5.3.1. Исследование влияния норадреналина на неквантовую секрецию

ацетилхолина........................................................................118

4.5.3.2.Определение подтипа адренорецепторов, участвующего в модуляции неквантовой секреции ацетилхолина...........................................122

4.6. Исследование вопроса о тканеспецифичности неквантовой секреции

ацетилхолина.....................................................................................126

4.6.1. Сравнение эффектов параоксона в препаратах миокарда различных отделов

сердца крысы............................................................................127

4.6.2. Исследование возможности существования ненейрональных источников ацетилхолина неквантового происхождения............................................130

4.7. Появление неквантовой секреции ацетилхолина в процессе пренатального развития........................................................................................................................134

5. ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................137

5.1. Доказательство роли неквантовой секреции в накоплении ацетилхолина в миокарде и рассмотрение механизмов ее регуляции.................................................137

5.2. Симпато-парасимпатические взаимодействия и возможная кардиопротекторная роль ацетилхолина неквантовой формы....................................................140

5.3. Становление парасимпатической нейропередачи в сердце и возможное значение неквантовой секреции ацетилхолина........................................................143

5.4. Возможность участия неквантового ацетилхолина в прорастании нейронов к клеткам мишеням и формировании очагов синаптогенеза в процессе эмбрионального развития.....................................................................145

6. ВЫВОДЫ.............................................................................................148

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................149

8. БЛАГОДАРНОСТИ...............................................................................170

Список используемых сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

АЦ - аденилатциклаза

Ацетил-СоА - ацетил-коэнзим А

АЦХ - ацетилхолин

АЦХ-Э - ацетилхолинэстераза

ВНС - вегетативная нервная система

ВНСп - внутрисердечное нервное сплетение

ВТдцх - везикулярный транспортер ацетилхолина

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ГЦ - гуанилатциклаза

ДПД50 - длительность ПД на уровне 50% реполяризации ДПД90 - длительность ПД на уровне 90% реполяризации ДЦ - длина сердечного цикла

МВПСТ - миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи

МПКП - миниатюрные потенциалы концевой пластинки

НА - норадреналин

ПД - потенциал действия

ПЖ - правый желудочек

ПМ - папиллярная мышца

ПУ - ушко правого предердия

СЗХВС - система захвата холина высокого сродства

СПЖ - стенка правого желудочка

СПР - саркоплазматический ретикулюм

ТТХ - тетродотоксин

ФДЭ - фосфодиэстераза

ФОС - фосфорорганические соединения

ФЭ - фенилэфрин

ХАТ - холинацетилтрансфераза

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

СаМ - кальмодулин СагАТ - карнитинацетилтрансфераза CGRP - кальцитонин-подобный пептид ChAT - см. ХАТ

CHT - высокоаффинный транспортер холина

CNTF - цилиарный нейротрофический фактор

DAG - диацилглицерол

ED - эмбриональный день

Glu - глутамат

Н2О2 - пероксид водорода

IcaL - кальциевый ток L-типа

iKach - калиевый ацетилхолинзависимый ток

1кмз - калиевый ток, наблюдаемый при активации МЗ рецепторов 1Рз - инозитолтрифосфат

If - активируемый гиперполяризацией ток, ток Ди Франческо

LIF - лейкемия-ингибирующий фактор

NAAG - N-ацетиласпартилглутамат

nACh-R - никотиновые холинорецепторы

N0 - оксид азота

NOS - синтаза оксида азота

NPY - нейропептид Y

ОСТ - транспортеры органических катионов

РАСАР - гипофизарный активирующий аденилатциклазу полипептид

PIP2 - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

PLC - фосфолипаза С

SP - субстанция Р

SNAP - б'-Нитрозо-А^-ацетилпеницилламин

ТН - тирозингидроксилаза

VIP - вазоактивный интестинальный пептид

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы

Парасимпатическая регуляция чрезвычайно важна для нормального функционирования сердца у млекопитающих. Помимо очевидной адаптивной функции, позволяющей снижать синусовый ритм и в меньшей степени - силу сокращений желудочков в зависимости от условий среды, холинергические нервные влияния выполняют также важную кардиопротекторную роль. Это делает исследование механизмов холинергической регуляции сердца востребованным не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения.

Парасимпатические механизмы регуляции сердечной деятельности издавна привлекали к себе внимание исследователей. Еще в 1845 году братья Вебер открыли эффект замедления работы сердца при раздражении продолговатого мозга, пропадавший после перерезки вагуса. А в 1921 году в экспериментах Отто Лёви именно благодаря основному парасимпатическому медиатору ацетилхолину (АЦХ) была доказана возможность химической передачи сигнала от нервов к эффекторному органу. Несмотря на то, что в течение прошлого века усилия физиологов были в большей степени сконцентрированы на выяснении адренергических механизмов регуляции сердца, к концу столетия сформировалась достаточно целостная картина парасимпатической регуляции. В настоящее время относительно хорошо исследованы рецепторные механизмы воздействия АЦХ на кардиомиоциты. Кроме того, в значительной степени известно, какие механизмы внутриклеточной сигнализации оказываются задействованы в реализации эффектов АЦХ и каковы конечные мишени данных сигнальных каскадов.

В настоящее время изучение регуляции сердечной деятельности развивается высокими темпами, что в первую очередь связано с остро стоящей перед человечеством проблемой сердечно-сосудистых заболеваний. Поэтому важно отметить, что выяснение тонких механизмов холинергической регуляции миокарда значительно ускорилось в связи с осознанием кардиопротекторного значения парасимпатической регуляции сердца, пришедшим в конце прошлого века. На исключительную важность холинергических воздействий для выживания миокарда в условиях ишемии указывает целый ряд экспериментальных данных. К примеру, в известной работе академика Л.В. Розенштрауха было показано, что сердце кошки после блокирования всех парасимпатических влияний путем атропинизации или введения коклюшного токсина становится многократно более склонным к возникновению фибрилляции желудочков в результате экспериментальной окклюзии коронарной артерии, чем сердце нормального животного (Rosenshtraukh et al, 1994). Нет

сомнений в том, что раскрытие механизмов кардиопротекторного действия АЦХ поможет в борьбе с заболеваниями сердца. Поэтому изучение механизмов парасимпатической регуляции сердца является исключительно важной задачей для современной физиологии.

Несмотря на то, что механизмы воздействия АЦХ на кардиомиоциты изучены достаточно хорошо, другому важнейшему звену холинергической регуляции, выделению АЦХ из холинергических интрамуральных окончаний в миокарде, уделяется недостаточно внимания.

Практически все имеющиеся данные относительно секреции АЦХ из нервных окончаний были получены при изучении нервно-мышечной синаптической передачи. Помимо общеизвестной квантовой секреции медиатора, связанной с экзоцитозом синаптических везикул, уже более 30 лет назад был описан и неквантовый способ секреции, представляющий собой непрерывное выделение АЦХ из цитоплазмы в синаптическую щель, опосредованное мембранными белками-транспортерами катионов. В нервно-мышечном синапсе в состоянии покоя подавляющее количество АЦХ секретируется неквантовым путем, в то время как квантовым способом выделяется всего около 2% молекул медиатора (Mitchell and Silver, 1963; Vizi and Vyskocil, 1979). Явление неквантовой секреции в скелетной мускулатуре было детально охарактеризовано в исследованиях, проводившихся в лаборатории академика Е.Е. Никольского (см. обзор Маломуж и Никольский, 2007). Тем не менее, несмотря на очевидную важность неквантовой секреции, нигде, кроме нервно-мышечного синапса, данный феномен обнаружен не был. В настоящей работе мы впервые демонстрируем наличие неквантового выделения АЦХ в миокарде, кроме того, исследуем механизмы регуляции неквантовой секреции и по крайней мере отчасти выясняем физиологическое значение этого феномена.

Целью данной работы являлось доказательство существования неквантовой секреции АЦХ в сердце крысы, а также выяснение некоторых характеристик этого процесса, в том числе физиологических механизмов его регуляции.

1.2. Задачи исследования

1. Используя ингибиторы ацетилхолинэстеразы (АЦХ-Э) различных классов показать способность АЦХ накапливаться в изолированных препаратах миокарда, лишенных экстракардиальных нервных влияний.

2. Выяснить способ секреции АЦХ, накапливающегося в исследуемых препаратах. Поскольку в ходе работы нам удалось доказать неквантовый характер секреции

аккумулирующегося АЦХ, последующие задачи были направлены на изучение феномена неквантовой секреции в миокарде.

3. Изучить влияние АТФ и оксида азота, признанных регуляторов неквантовой секреции АЦХ в нервно-мышечном синапсе, на интенсивность неквантового выделения АЦХ в предсердном миокарде крысы.

4. Исследовать влияние важнейшего кардиорегулятора норадреналина на интенсивность неквантового выделения АЦХ с выяснением подтипа адренорецепторов, опосредующих этот процесс.

5. Исследовать возможность существования миогенных источников неквантовой формы АЦХ в сердце крыс.

6. С целью выяснения времени становления неквантовой секреции АЦХ в процессе онтогенеза изучить действие ингибитора АЦХ-Э параоксона на параметры электрической активности в предсердном миокарде новорожденных крыс, а также 19-дневных эмбрионов.

1.3. Научная новизна исследования

Впервые явление неквантовой секреции АЦХ обнаружено не в скелетной мускулатуре, а в миокарде млекопитающих. Показано, что значител�