Пуринергическая синаптическая модуляция сокращения различных типов скелетных мышц

Гришин, Сергей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пуринергическая синаптическая модуляция сокращения различных типов скелетных мышц
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пуринергическая синаптическая модуляция сокращения различных типов скелетных мышц"

На правах рукописи

Гришин Сергей Николаевич

ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ СИНАПТИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ СОКРАЩЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 9 СЕН 2011

ПУ ЩИНО - 2011

4855003

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО " Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева - КАИ" и ГОУ ВПО "Казанский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию"

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Зиганшин Айрат Усманович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Колесников Станислав Сергеевич

доктор физико-математических наук, профессор Скоринкин Андрей Иванович

доктор медицинских наук, профессор Ковалев Георгий Иванович

Ведущая организация: Казанская государственная академия

ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Защита состоится 19 октября 20 И г. в 15 часов 30 минут на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл. ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан " "_/ Д*_2011 г.

Ученый секретарь совета, кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Синаптическая модуляторная функция макроэргической молекулы аденозин-5'-трифосфата (АТФ) была открыта лишь в конце прошлого века, причем первоначально ей предпосылалось значение только как предшественника синаптически активного аденозина [Redman, Silinsky, 1996]. В последующем, работами других исследователей было доказано собственное модуляционное действие АТФ по принципу отрицательной обратной связи в синапсах фазных мышц амфибий [Гиниатуллин, Соколова, 1998]. Выделяясь из синаптических везикул нервного окончания мотонейрона совместно с основным медиатором ацетилхолином (АХ), АТФ угнетает секрецию АХ [Ziganshin et al., 2005].

АТФ угнетает квантовую [Giniatullin & Sokolova, 1998] и неквантовую [Galkin et al., 2001; Маломуж, Никольский, 2010] секрецию медиатора из пресинаптических окончаний мотонейроиов, действуя на Р2-рецегггоры, в то время как конечный продукт ее распада -аденозин реализует свое действие через аденозиновые рецепторы. Аденозиновые рецепторы являются по структуре метаботропными. Различают Ai, Агл, Агв и Аз подтипы аденозиновых рецепторов. Р2-рецепторы, агонистом которых является АТФ, делятся на ионотропные - P2X(i-7) и метаботропные - P2Y(ii2,4,6.ii.m) подтипы [Зигашшш, Зигашшша, 2009]. Выявление конкретных подтипов задействовашшх аденозиновых и Р2-рецепторов, их фармакологическая характеристика являются начальными этапами изучения эффекторных механизмов синаптической регуляции пуринами функции различных типов скелетных мышц.

Пресинаптическое ингибиторное действие АТФ и аденозина в нервно-мышечном синапсе было описано, в основном, на препаратах холоднокровных животных, при этом исследования были проведены лишь на быстрых фазных скелетных мышцах [Ribeiro & Sebastio, 1987; Fu, 1995; Sokolova et al., 2003]. В тех немногих работах [Salgado et al., 2000], где опыты ставились на теплокровных животных, эксперименты проводились, руководствуясь удобством препарирования, на синапсах диафрагмы, что не может быть экстраполировано как типичное воздействие пуринов на все фазные скелетные мышцы теплокровных. Кроме того, в упомянутых исследованиях синаптические эффекты пуринов не сопоставлялись с изменениями параметров сократительной активности самой мышцы. Также нет данных о роли АТФ и ее производных в аккумуляции мышечных усилий позвоночных, скрадывающей до двух третьих от абсолютных силовых возможностей [Hettinger, 1961]. Остается обойденной вниманием такая важная, пусть и не столь распространенная, тоническая мускулатура теплокровных, например, мышцы внутреннего уха и мышцы, приводящие глазное яблоко. Не изучена пуринергическая синаптическая регуляция тонических мышц холоднокровных животных, представленных в большем количестве в их организме.

Решению этих проблем и посвящено наше исследование. В нем мы представили результаты изучения механизмов пуринергической регуляции синапсов разных мышечных систем, имеющих разные условия функционирования. При этом мы исследовали и медленные фазные мышцы позвоночных в сравнении с быстрыми мышцами, чтобы выявить особенности их пуринергической регуляции и оценить задействованные рецепторные и метаболические системы.

Цель и основные задачи исследования.

Целью работы является исследование механизмов действия АТФ и аденозина на синаптическую передачу и параметры мышечного сокращения быстрых и медленных фазных, а также тонических мышц теплокровных и холоднокровных животных.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить эффекты АТФ и аденозина на параметры сокращения скелетных мышц различных типов.

2. Выявить подтип Р2-рецептора, опосредующего ингибиторный эффект АТФ на амплитуду токов концевой пластинки фазной мышцы озерной лягушки.

3. Определить подтипы аденозиновых рецепторов, участвующих в угнетающем действии аденозина на амплитуду токов концевой пластинки фазной мышцы озерной лягушки.

4. Выявить механизмы внутриклеточного опосредования эффектов АТФ и аденозина на амплитуду токов концевой пластинки фазной мышцы озерной лягушки.

5. Исследовать влияние агонистов пуриновых рецепторов на амплитуду токов концевой пластинки и параметры пресинаптических токов нервного окончания мотонейронов, интернирующих фазные мышечные волокна озерной лягушки.

6. Сравнить действие АТФ на силу сокращения медленных и быстрых фазных и тонических мышц холоднокровных и теплокровных.

7. Оценить действие аденозина на параметры сокращения медленных и быстрых фазных мышц, а также тонических мышц холоднокровных и теплокровных.

8. Исследовать действие АТФ и аденозина на уровень неквантовой секреции в синапсах медленных и быстрых фазных мышц, а также тонических мышц крысы.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые были выявлены различия в синаптяческом механизме, ответственные за специфику функционирования фазных и тонических скелетных мышц, а также отличие в степени угнетающего действия АТФ на силу сокращения быстрой и медленной фазных мышц теплокровных.

Были определены подтипы аденозиновых и Р2-рецепторов, вовлеченных в модуляцию мионевральной передачи синапсов фазных мышц позвоночных. Изучена задействованная в ингибиторном эффекте АТФ цепь внутриклеточных вторичных посредников Выявлены ее последовательные и параллельные звенья. Обнаружено, что конечным последовательным метаболическим звеном является протешисиназа С, после которой эффекхорная линия внутриклеточных вторичных посредников раздваивается. При этом за ингибиторный эффект активаторов этого фермента (АТФ и РМА) на кальциевый ток ответственна циклооксигеназная ветвь метаболшма арахидоновой кислоты. Кальцийнезависимое снижение квантового состава связано с синтезом перекиси водорода.

Впервые показано, что аденозин активирует сразу два подтипа аденозиновых рецепторов: Ai и Л2л. Обнаружено, что второй подтип рецепторов чувствителен к селективному агонисту Aja. рецепторов CGS21680 и ионам бария. Найдено, что селективный агонист А| аденозиновых рецепторов ССРА обладает более выраженным угнетающим действием на амплитуду ТКП, чем аденозин, при этом его эффект устранялся блокадой калиевых каналов А типа. Установлено отсутствие участия в эффектах аденозина каких-либо известных внутриклеточных посредников и ионных каналов, кроме А типа калиевых каналов.

Впервые выявлена синаптическая пуринергическая регуляция тонических мышц теплокровных и холоднокровных. АТФ не снижала, а увеличивала силу сокращения тонических мышц. Получены данные о том, что только в синапсе тонических мышц АТФ, в отличие от аденозина, устраняет неквантовую секрецию ацетилхолина.

Положения, выносимые па защиту:

1. АТФ и аденозин участвуют в пресинагггической модуляции сократительной активности различных типов скелетной мускулатуры. АТФ и аденозин имеют сходное по эффекту пресинаптическое ингибиторное действие па функциональное состояние фазных скелетных мышц холоднокровных и теплокровных животных, при этом каждый из изученных пуринов имеет свои особенности в механизме реализации этого действия. Аденозин оказывает угнетающее действие и на двигательную единицу тонических мышц, а АТФ, напротив, обладает облегчающим эффектом для этой ткани.

2. В механизм реализации пресинаптического действия АТФ в фазных мышцах вовлекаются P2Y рецепторы, РС-фосфолипаза С, протеинкиназа С, синтез перекиси водорода и простагландина Е2. В тонических мышцах приводящий к устранению неквантовой секреции медиатора эффект АТФ опосредуется также пресинаггтическими P2Y рецепторами и протеинюшазой С.

3. Пресинаптическое действие аденозина в фазных мышцах, складывающееся из активации Ai аденозиновых рецепторов, сопряженных с A-типом калиевых каналов, и А2а рецепторов, приводит к результирующему ингибиторному эффекту на амплитуду токов концевой пластинки и силу сокращения.

Научно-практическая ценность.

До настоящего времени не проводилось работ, посвященных раскрытию механизмов влияния эндогенных пуринов, в частности АТФ и аденозина, на процесс секреции медиатора из нервного окончания тонических и медленных фазных двигательных единиц.

Полученные данные вскрывают новые аспекты функционирования нервномышечного синапса, свидетельствуя о важной роли, наряду с уже известными звеньями, пурииовых механизмов. Эти данные могут служить основой для понимания возможных взаимодействий пуринергических агентов с системами других первичных посредников.

Определение подтипов аденозиновых и Р2-рецепторов, задействованных в пресинагггической пуринергической регуляции, позволит направить работу по синтезу новых эффективных фармакологических агентов, модулирующих мионевральную передачу.

Выявленные эффекты отмены тонического ингибиторного действия АТФ и аденозина могут позволить использовать вскрытые механизмы для обеспечения потенциации мышечных усилий.

Особо важной представляется обнаружение потенцирующего действия АТФ в синапсах тонических мышц позвоночных, что может обеспечивать присущую только этому типу мускулатуры возможность долговременной контрактуры.

Результаты данной фундаментальной работы могут иметь практическую значимость как для биофизиков и физиологов, так и для биохимиков и фармакологов. Выявленные пуринергические механизмы выглядят очень привлекательными в качестве мишени для фармакологического воздействия и, следовательно, создания лекарств принципиально нового механизма действия.

Апробации работы.

(Пущино, 2002-2004); II, III и VI Всероссийских с международным участием школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2011); International synaptogenesis meeting (Вена, Австрия, 2003); Международном симпозиуме «Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals (Москва, 2003); Международных чтениях «Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга: материалы» (Москва, 2003); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003); Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология» (Санкт-Петербург, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж,

2004), XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); Международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, 2004, 2006, 2008); Научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии; гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004); II международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004); conference «The world of the synapse: molecular basis, pathologies and drug discovery» (Жиф-сюр-Ивет, Франция, 2004); V общероссийский съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2005); X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань,

2005); 1 Съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005); IX Всероссийской школы «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2005); III Международной конференции «Болезни цивилизации в аспекте учения В.И.Вернадского» (Москва, 2005); I конференции с международным участием «Качественное использование лекарств и фармаконадзор» (Казань, 2005); I и III Всероссийских с международным участием конференциях «Управление движением» (Великие Луки, 2006, 2010); PENS summer course (Казань, 2007); XX съезде Физиологического общества им. И.П Павлова (Москва, 2007); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа объемом 242 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложенных в четырех главах результатов исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 314 источников, из них - 276 иностранных. Диссертация иллюстрирована 53 рисунками и содержит 8 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты по отведению токов концевой пластинки (ТКП) с частотой 0.033 Гц и миниатюрных ТКП (МТКП) проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах портняжной мышцы {т. sartorius) с иннервирующим ее седалищным нервом и вентральной головки трехглавой мышцы бедра Un. cruralis) озерной лягушки, а также выделенных длинного разгибателя пальцев (т. EDL), латеральной прямой глаза (т. rectus lateralis) и камбаловидной (т. so leus) мышц крысы в условиях двухэлектродной фиксации потенциала. Для предотвращения сокращений при отведении вызванных токов осуществляли поперечное рассечение мышечных волокон [Волкова и др., 1975]. Анализировались амплитудные, временные и частотные (для МТКП) характеристики постсинаптических токов.

Для отведения токов в периневральном пространстве нервно-мышечного препарата седалищный нерв - портняжная мышца озерной лягушки с частотой 0.033 Гц использовалась техника с использованием одного микроэлектрода, описанная R S. Redman и EM. Silinsky (1995). Для выявления кальциевого тока подавляли калиевую составляющую добавлением в раствор Рингера 100 мкМ 4-аминопиридина и 250 мкМ

тетраэтиламмония (ТЭА). Анализировались амплитудно-временные характеристики кальциевой и натриевой составляющих периневрального тока.

Параметры сокращений т. cruralis и портняжной мышцы озерной лягушки, а также т. EDL, т. rectos lateralis и камбаловидной мышцы крысы регистрировались изометрическим датчиком механической активности Linton FSG-01 (Великобритания) по стандартной методике [Ахметзянов, Филиппов, 1986; Ziganshin et al., 2005]. Средняя всех сокращений, полученных в течение 30 с (30 ответов) обрабатывалось как один результат. Оценивались силовые и временные характеристики получаемой кривой сокращения.

Для регистрации ТКП, МТКП, кальциевого тока и кривых сокращений использовались аналого-цифровой преобразователь и персональный компьютер с установленными на нем оригинальными программами регистрации и анализа экспериментальных данных.

Уровень неквантовой секреции ацстилхолина измеряется исключительно в мионевралышх синапсах теплокровных животных [Vyskocil et al., 1983; Nikolsky et al., 1991]. Для ингабирования холинэстеразы т. EDL, т. rectus lateralis и камбаловидную мышцу крысы обрабатывали 10 мкМ армина. Для оценки Н-эффекга в электрофизиологическом эксперименте измеряли микроэлектродом мембранный потенциал покоя отдельных волокон до и после аппликации 10 мкМ тубокурарина.

В течение всех экспериментов через ванночку с находящимся в ней препаратом непрерывно протекал стандартный раствор Рингера или Кребса (для тканей холоднокровных и теплокровных, соответственно), куда добавляли используемые в исследованиях агенты в действующих концентрациях.

Всех подопытных животных содержали и готовили к препарированию согласно Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, используемых в научных экспериментах.

Использованные в работе агенты были поставлены компаниями Sigma Chemical Company Ltd. (Великобритания), Tocris Cooksoll и Research Biochemicals International (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ЧАСТЬ 1. ЭКСПЕРИМЕНТЫ С ТОНИЧЕСКОЙ МУСКУЛАТУРОЙ

I. Действие аденозина на функциональное состояние тонических мышц

Общая характеристика эффекта аденозина на функциональное состояние тони ческих мы шц

Так как концентрация 100 мкМ для аденозина близка к насыщающей [Ribeíro & Walker, 1975; Giniatullin & Sokolova, 1998], а для его предшественника - АТФ подобная концентрация создается после прохождения одного импульса через синапс [Hume & Honig, 1986], для исследования механизма действия аденозина и АТФ в нервно-мышечном синапсе использовали именно эту концентрацию пуринов.

В экспериментах с тонической мышцей т. cruralis (вентральной головкой т. triceps femoris) озерной лягушки при аппликации 100 мкМ аденозина в омывающий стандартный раствор Рингера сила сокращения уменьшалась до 82.1+6.3% (п=5, р<0.05) относительно контроля. При этом не наблюдалось достоверных изменений временных параметров кривой сокращения. При отмывке от аденозина исходная сила сокращений восстанавливалась.

Известно, что распространенная у амфибий тоническая мускулатура в организме теплокровных представлена только в органах чувств - мышцах глазного яблока и среднего

уха [Матюшкин, 1961; Наследов, 1981]. Для оценки пуринергической модуляции в синапсах тонических мышц теплокровных мы использовали в качестве объекта исследования препарат латеральной прямой мышцы глаза {т. rectus lateralis) крысы. Как и в экспериментах с тонической мышцей лягушки, фиксировали обратимое ослабление сокращений под действием аденозина (73.4±7.9% (п=5, р<0.05) от контроля) без изменений временных контрактильных параметров.

После предварительной инкубации прямой мышцы глаза крысы с Н-холиноблокатором тубокурарином (ЮмкМ), стимуляция электрическим полем напряжением 10 В не вызвала сократительных ответов мышцы. При увеличении напряжения до 100 В на фоне тубокурарина происходило уже не модулируемое аденозином сокращение мышц, которое было более сильным по сравнению с кош-рольными сокращениями. Последняя серия экспериментов неопровержимо говорит о синалтическом характере ингибиторного действия аденозина на силу сокращения тонической мышцы.

Известно, что в состоянии покоя почти все выделение АХ из нервного окончания в синаптическую щель осуществляется неквантовым образом [Vyckocil et ai., 2009; Маломуж, Никольский, 2010]. Для выявления синаптического механизма ингибиторного действия аденозина мы в следующей серии экспериментов исследовали действие этого пурина на уровень неквантовой секреции АХ, так называемый «Н-эффект». Аденозин не оказывал какого-нибудь значимого эффекта на уровень неквантовой секреции латеральной прямой мышцы глаза крысы. Так, после аппликации 100 мкМ аденозина Н-эффект составил 5.2+0.7 (п=105), что практически совпадает (р>0.05) с контрольным значением: 5.0+0.4 (п=95).

Частота отводимых миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП) в условиях двухэлетродной фиксации потенциала от препарата т. rectus lateralis крысы на фоне 100 мкМ аденозина к 15 мин его действия снизилась и составила 53.6±9.1% (п=6; р<0.05) от контроля, при этом амплитудно-временные параметры МТКП не изменялись, что свидетельствует в пользу пресиналтической природы ингибиторного эффекта аденозина

Выявление рецепторов, опосредующих эффекты аденозина

Неспецифический антагонист аденозииовых рецепторов 8-SPT [Burnstock, 2009] устранял действие аденозина на сократительные ответы тонической мышцы озерной лягушки. Так, Сила сокращения т. cruralis при аппликации 100 мкМ аденозина в присутствии 100 мкМ 8-SPT составила 102.0±4.1% (п=5, р>0.05) от уровня в 8-SPT, который был в данном случае принят за 100%.

Также в присутствии 8-SPT пропадал и эффект аденозина на силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы: на фоне 100 мкМ 8-SPT аденозин в концентрации 100 мкМ подействовал только до 96.9+3.3% (п=5, р>0.05) от контрольных значений.

Результаты проведенных серий экспериментов говорят о том, что ингибиторный эффект аденозина на функциональное состояние тонической мышцы позвоночных осуществляется через аденозиновые рецепторы.

Специфический антагонист Ai рецепторов DPCPX (1,3-дипропил-8-циклопентилксантин), полностью устраняющий ингибиторное действие экзогенного аденозина, сам достоверно повышал силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы (116.8+5.2%, п=б, р<0.05), что может свидетельствовать об устранении этим агентом тонического ингибиторного действия эндогенного аденозина.

Вполне определенно мы установили, что аденозин ингибирует силу сокращения тонической мышцы посредством активации Ai аденозиновых рецепторов.

Выявление участия вторичных посредников в эффекте аденозина

Аденозиновые рецепторы, так как они являются метаботропньши, могут быть сопряжены с различными ферментами: PC- и PI- фосфолипазой С, фосфолипазой Аг, фосфолипазой D, гуанилатциклазой и аденилатцнклазой, образующими внутриклеточные метаболические пути вторичных посредников. Во всех этих случаях сопряжение реализуется через гстеротримерный ГТФ-связанный белок (G-белок) [Burnstock, 2006].

Чувствительные к теофиллину аденозиновые рецепторы могут проявлять эффект через тот или иной подтип G-белка. Поэтому в следующей серии экспериментов мы проверяли, не оказывают ли влияние блокатор G-белка N-этилмалеимид [Shapiro et al., 1994] на эффект аденозина, что свидетельствовало бы об опосредовании действия аденозина подтипом ГТФ-белка, чувствительном к N-этилмалеимиду.

N-этилмалеимид в концентрации 10 мкМ устранял ингибиторный эффект аденозина на силу сокращения как т. cruralis лягушки, так и латеральной прямой мышцы глаза крысы. Следовательно, действие аденозина по снижению силового параметра сокращения тонических мышц холоднокровных и теплокровных животных осуществляется через активацию подтипа ГТФ-белка, чувствительного к N-этилмалеимиду.

Возможными путями передачи активирующего сигнала с ГТФ белка являются белки-ферменты, активация которых приводит к образованию тех или иных вторичных посредников. Этими ферментами могут являться достаточно большой набор фосфолипаз и циклаз.

На фоне действующих концентраций [Sokolova et al., 2003] ингибиторов PI- и РС-фосфолипаз (10 мкМ U73122 и 100 мкМ D609, соответственно), а также фосфолипаз Д2 (20 мкМ ОВАА) и D (0.03% i-бутанол), протеинкиназы А (50 мкМ Rp-cAMP) и гуанилатциклазы (1мкМ ODQ) депрессорный эффект 100 мкМ аденозина на силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы достоверно не отличался от контрольного его действия.

То есть ингибиторный эффект данного пурина на функциональное состояние тонической мышцы, по-видимому, не связан с активацией ферментной цепи следующих внутриклеточных вторичных посредников: инозитолтрифосфата, диацилглицерина, арахидоновой и фосфатидной кислот, циклических аденозинмонофосфата и гуанозшшонофосфата.

Монооксид азота (NO) предполагался как возможный эффектор действия аденозина в нервно-мышечном соединении [Rochon et al., 2001; Auld & Robitaille, 2003]. В наших экспериментах блокатор NO-синтазы - //"-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME) никак не модулировал угнетающий эффект аденозина на силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы.

Показано наличие образовывающей монооксид углерода (СО) гемооксигеназы-2 в скелетных мышечных волокнах теплокровных [Baum et al., 2000; Kusner et al., 1999]. В следующей серии экспериментов с блокатором гемооксигеназы - цинк (II) протопорфирином (ZnPP-9) мы проверяли, не участвует ли СО в ингибиторном эффекте аденозина на силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы. В присутствии 10 мкМ ZnPP-9 ингибиторный эффект аденозина был полностью выражен.

Пировююградная кислота, являющаяся специфическим антиоксидантом, способным связывать перекись водорода (Н2О2) [Gyulkhandanyan et al., 2003], также не влияла эффект аденозина на силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы.

На основании приведенных данных мы делаем вывод, что эффекты аденозина на функциональное состояние тонической мышцы не опосредуются синтезом перекиси водорода, а также монооксидов азота и углерода.

II. Действие АТФ на функциональное состояние тонических мышц

Общая характеристика эффекта АТФ на функциональное состояние тонических мышц

При инкубации с АТФ (100 мкМ) временные параметры сокращения т. cruralis озерной лягушки не менялись, а сила сокращения возрастала до 123.7±7.7% (п=б, р<0.05) от контроля, то есть наблюдался эффект, противоположный тому, что оказывает аденозин на этот параметр сокращения тонической мышцы.

Так как в тонических волокнах внутриклеточные запасы кальция способны полностью обеспечить сокращение, то есть отсутствует необходимость входа внеклеточного кальция для активации и поддержания сокращения, АТФ может и не осуществлять свой ингибиториый эффект на функциональное состояние через присущее ей свойство блокирования кальциевых ионных каналов [Sokolova et al., 2003]. Для проверки этой гипотезы мы исследовали действие АТФ на препарате т. cruralis, предварительно выдержанном в тубокурарине. Оказалось, что потенцирующий эффект АТФ, как и ингибирующее действие аденозина, пропадал в случае блокирования Н-холинорецепторов тубокурарином. Следовательно, эффекты пуринов имеют местом приложения синаптический переход.

Эффект АТФ на силу сокращения т. cruralis был обратим, после отмывания раствором Рингера амплитуда мышечных ответов восстанавливалась до исходных величин (п=5; р>0.05).

Также нами наблюдалось усиление сокращения в присутствии АТФ и тонической мышцы теплокровных. Так, за 15 минут аппликации 100 мкМ АТФ повысила силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы до 130.5+6.2% (п~5, р<0.05; рис. 1). При блокаде тубокурарином холинорецепторов эффект АТФ, как это было отмечено в случае аденозина, пропадал.

Под действием 100 мкМ АТФ амплитудно-временные параметры МТКП т. rectus lateralis крысы не менялись, в отличие от частотного показателя, что может говорить о пресинапгическом эффекте действия. Частота МТКП к 15-той минуте аппликации АТФ составила 137.4±8.3% (п=6, р<0.05) от контроля.

Установлено, что усилению сокращения диафрагмы мыши под действием АТФ сопутствует устранение этим пурином неквантовой секреции [Teplov et а!., 2009]. Поэтому в следующей серии экспериментов мы оценивали влияние АТФ на уровень неквантовой секреции.

В отличие от аденозина, АТФ устраняла Н-эффеюг волокон латеральной прямой мышцы глаза крысы. Так, в присутствии 100 мкМ АТФ гиперполяризация мембраны волокон латеральной прямой мышцы глаза после блокирования постсинаптических холинорецепторов введением 10 мкМ тубокурарина составила всего 0.9±0.3 мВ (п=92, р<0.001), когда как в контроле Н-эффект был 5.0±0.4 (п=95). Итак, здесь мы сталкиваемся с коренным различием в действии двух изучаемых нами пуринов на такой значимый параметр, как уровень неквантовой секреции (рис. 2).

Тоническая мускулатура отличается полисинаптической, даже полинейрокальной иннервацией [Kuffler & Williams, 1953]. Тонические волокна характеризуются особой выраженностью суммации синаптических потенциалов, что в значительной мере определяется затянутостью отдельных потенциалов [Блохина, Зефиров, 1984]. Равновесие между выделением медиатора на постсинаптическую мембрану и пополнением его запасов у пресинаптической мембраны устанавливается здесь на более низком уровне, чем у фазных волокон [Наследов, 1981]. Это свидетельство о менее интенсивном пополнении запасов медиатора в нервных окончаниях тонических двигательных единиц коррелирует с представляемыми здесь экспериментальными данными. Действительно, здесь мы можем предположить пуринергическую регуляцию по принципу положительной обратной связи, в рамках которой АТФ способствует потенциации мышечных усилий облегчением восполнения медиатора, устраняя его неквантовый выброс. Другим объяснением

облегчающего эффекта при устранении АТФ неквантовой секреции является возможное повышение чувствительности постсинаптических холинорецепторов снятием их фоновой десенситизации [Vyskocil et al., 2009]. Однако это постсинаптическое действие должно бы было сопровождаться увеличением амплитуды МТКП, что нами не наблюдалось.

До этого пресинаптическую положительную обратную связь, реализуемую посредством внеклеточного действия АТФ на пресинаптические Р2-рецепторы, мы наблюдали лишь в экспериментах на диафрагмальной мышце [Grishiii et al., 2006], которая так же, как и тоническая мускулатура, характеризуется полинейрональной иннервацией.

Заметим, что метаболит, до которого разрушается АТФ в синапгической щели -аденозин обладает своим собственным независимым ингибиторным действием на функционирование тонической мышцы. В результате мы можем признать, что действия двух эффективных пуринов противопоставлены в синапсе тонической мускулатуры, и конечный эффект сложен для прогнозирования в случае высокочастотной ритмической стимуляции и требует дальнейших экспериментальных исследований.

Главное в нашей работе - выявление облегчающего регуляторного эффекта АТФ на функциональное состояние тонических мышц позвоночных. До нашей работы [Grishin et al., 2006], были известны либо медиаторная возбудительная (в уздечке головного мозга, некоторых участках ЖКТ и т.п. [Burnstock, 2006]), либо ингибиторная модуляционная роли АТФ [Giniatullin& Sokolova, 1998].

Выявление семейства Р2-рецепторов, задействованных в эффекте АТФ

В следующей серии экспериментов мы исследовали, какие рецепторы вовлечены в потенцирующее действие АТФ на силу сокращения тонической мышцы лягушки. 8-SPT (100 мкМ) не оказывал влияния на усиливающее сокращение действие АТФ, что исключает участие аденозиновых рецепторов. Вместе с тем, предварительная инкубация ткани с антагонистом Р2-рецепторов сурамином полностью устраняла действие АТФ. Так, при добавлении 100 мкМ АТФ на фоне 100 мкМ сурамина сила сокращения т. cnwalis озерной лягушки составила 104.1±4.7% (п=6, р>0.05) от контроля.

Что касается тонических мышц теплокровных, при аппликации 100 мкМ АТФ в присутствии 100 мкМ сурамина сила сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы составила 98.7+9.1% (п=5, р>0.05), что почти не отличается от значений этого контрактильного параметра до подачи пурина.

Сурамин полностью отменял эффект АТФ на уровень неквантовой секреции, что говорит об Р2-рецептор-опосредованномвоздействии АТФ на Н-эффект. Так, при аппликации АТФ в присутствии 100 мкМ сурамина Н-эффект т. rectus lateralis крысы составил 4.8±0.7 (п=100, р>0.05), что не отличается достоверно от контрольного значения этого параметра.

Эти эксперименты позволяют сделать вывод, что эффект АТФ на функциональное состояние тонической мышцы реализуется через Р2-рецепторы.

Для определения того, какое семейство: Р2Х или P2Y рецепторов АТФ задействованы в потенцирующем эффекте этого пурина на функциональное состояние тонической мышцы, в следующей серии экспериментов мы оценили влиняие рН, поскольку известно, что Р2Х рецепторы имеют высокую чувствительность к рН, тогда как Р2Y рецепторы таким свойством не обладают [King et al., 1996; Stoop et al., 1997].

В экспериментах с щелочной средой (рН=8) сила сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы при аппликации 100 мкМ АТФ увеличивалась до 133.1±7.6% (п=5, р<0.05), с кислой средой (рН=6) - до 128.9±8.1% (п=5, р<0.05), то есть примерно на такую же величину, что и при физиологической рН. В итоге при сравнении эффективности АТФ в трех экспериментальных условиях (рН=6, рН=7.2, рН=8) выяснилось, что активная реакция среды не влияет на степень потенциации силы сокращения. Эти результаты свидетельствуют о том, что пуриновые рецепторы, задействованные в облегчающем эффекте АТФ на силу сокращения тонических мышц, относятся к P2Y семейству.

Выявление участия вторичных посредников в эффекте АТФ

В следующих сериях экспериментов мы решали вопрос: какими внутриклеточными путями реализует свой эффект АТФ в синаптических образованиях тонических мышц теплокровных? Для этого исследовали действие этого пурина на сокращение тонической мускулатуры крыс на фоне ингибиторов различных внутриклеточных метаболических путей вторичных посредников (рис. 1).

На фоне N-этилмалеимида, ингибитора ГТФ-белка, устранялось потенцирующее действие АТФ на силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы, что говорит об опосредовании действия этого пурина G-белком, чувствительным к N-этилмалеимиду.

На фоне 50 мкМ Rp-cAMP, ингибитора протеинкиназы А, АТФ в концентрации 100 мкМ увеличивала силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы до 125.7+8.0% (п=5, р<0.05) от исходного значения Также никак не модифицировал эффект АТФ ингибитор фосфолипазы Ai - ОВАА в своей действующей концентрации 20 мкМ. Так, на его фоне АТФ в концентрации 100 мкМ подействовала до 123.3+11.7% (п=5, р<0.05). На фоне ингибитора фосфолипазы D - 1-бутанола в концентрации 0.03% сокращение латеральной прямой мышцы глаза крысы под действием АТФ усилилось до 132.6+3.9% (п=5, р<0.05). В присутствии 1 мкМ блокатора гуанилатциклазы ODQ 100 мкМ АТФ потенцировала силу сокращения до 134.2+4.8% (п=5, р<0.05), что также достоверно не отличается от обычного действия этого пурина на тоническую мышцу. Когда мы апплицировали АТФ на фоне 5 мкМ блокатора протенкиназы С хелеритрина сила сокращения прямой латеральной мышцы глаза крысы существенно не изменилась. Она составила 103.6+7.4% (п=5, р<0.05) от контроля. Мы делаем вывод, что усиливающее сокращение латеральной прямой мышцы глаза действие АТФ опосредуется активацией протеинкиназы С.

Сходная картина наблюдалась при оценке действия АТФ на уровень неквантовой секреции в присутствии блокаторов синтеза внутриклеточных вторичных посредников. Так, в присутствии 10 мкМ N-этилмалеимида эффект АТФ на неквантовую секрецию не реализовывапся. На фоне ингибитора протеинкиназы A, Rp-cAMP в концентрации 50 мкМ, АТФ подействовала до значения Н-эффекта, равного 1.2±0.б мВ (11=100, р<0.001). В присутствии 20 мкМ ОВАА, ингибитора фосфолипазы А? 100 мкМ АТФ проявила свое действие до 1.1±0.4 мВ (п=Ю5, р<0.001). На фоне ингибитора фосфолипазы D (1-бутанола в концентрации 0,03%) АТФ подействовала до 0.9+0.6 мВ (п=95, р<0.001), а в присутствии блокатора гуанилатциклазы - ODQ в концентрации 1 мкМ снижение величины Н-эффекта под действием АТФ происходило до 1.0±0.3 мВ (п=90, р<0.001), что также достоверно не отличалось от обычного действия этого пурина на латеральную прямую мышцу глаза крысы.

В присутствии же 5 мкМ хелеритрина, ингибитора протеинкиназы С устранялось влияние АТФ на Н-эффект m. rectus lateralis (5.1±0.5 мВ, п=89, р>0.05; рис. 2). Итак, мы подтвердили участие протеинкиназы С в синаптических эффектах АТФ на препаратах латеральной прямой мышцы глаза крысы.

На фоне блокаторов синтеза СО, NO, а также Н202 эффекты АТФ на уровень неквантовой секреции и силу сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы не менялись, что говорит об отсутствии участия данных вторичных посредников в действии этого пурина.

В сериях экспериментов с блокаторами различных метаболических ветвей вторичных посредников мы выяснили, что устраняющее неквантовую секрецию действие АТФ опосредуется активацией протеинкиназы С. Это согласуется и с результатами приведенных серий экспериментов, в которых мы тестировали облегчающее действие АТФ на силу сокращения тонической мышцы на фоне тех же блокаторов, и с литературными данными, где в ряде случаев нейромышечные эффекты АТФ опосредуется протеинкиназой С [Kim et al., 2002; Теплов и др., 2006]. Что характерно, потенцирование сокращений диафрагмы мыши под действием АТФ, сопутствующее устранению Н-эффекта, также реализуется с помощью протеинкиназы С [Teplov et al., 2009].

о: х х <и 3 го а.

ЬЙ

о о

пз с;

н <

< +

5 га

а. >>

л.

а. СИ

м «Г =т о а. с; I- §

е ®

"["Сила сокращения до подачи АТФ

ь-<

й У

с с

Рис. 1. Изменение силы сокращения латеральной прямой мышцы глаза крысы под действием АТФ в концентрации 100 мкМ отдельно и в присутствии сурамина (100 мкМ), ОВАА (20 мкМ), ООС2 (1 мМ), 1-бутанола (0.03%), Яр-сАМР (50мкМ), хелеритрина (5 мкМ). * - р < 0.05 по сравнению с величиной исходной силы сокращения.

6-,

■9-8- . <п

0 5

< +

I ГО

а.

1 I

а о

ь-<

2 ? §

? а.

Н-эффест в контроле

в с

< +

I ¡5

о.

I-

О. ф

с; ф х

о а с

Рис. 2. Величина Н-эффекта, определенного на латеральной прямой мышце глаза крысы под действием АТФ в концентрации 100 мкМ отдельно и в присутствии сурамина (100 мкМ), ОВАА (20 мкМ), СЮС} (1 мМ), 1-бутанола (0.03%), Яр-сАМР (50мкМ), хелеритрина (5 мкМ). * - р < 0.001 по сравнению с исходной величиной Н-эффекта.

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТЫ С ФАЗНОЙ МУСКУЛАТУРОЙ

Ш. Действие аденозина на функциональное состояние фазных мышц

Общая характеристика эффекта аденозина на функциональное состояние фатыхмышц

Для оценки действия аденозина на уровень неквантовой секреции в синапсах фазной мускулатуры в следующих сериях экспериментов мы использовали препараты фазных мышц крысы: быстрой (т. ЕОЦ и медленной (камбаловидной).

Мембранный потенциал покоя у интактных т. £0£ был -76.4+0.51 мВ (п=П0 волокон). После действия армина мембранный потенциал покоя в области концевых пластинок т. Е01 снижался до 71.8+0.9 (п=110 волокон). Далее, после добавления тубокурарина, наблюдалась гиперполяризация до 76.6±0.8 (п= 110). Таким образом, Н-эффект составил 4.8+0.4 мВ. После добавления 100 мкМ аденозина значение Н-эффекта было 4.9±0.5 мВ (п=100).

При исследовании влияния аденозина на уровень неквантовой секреции представителя другого морфолого-функционального типа фазной мускулатуры — медленной камбаловидной мышцы крысы, аденозин также не влиял на уровень неквантовой секреции (5.1+0.9 мВ (п=110), что почти не отличается (р>0.05) от контроля).

В следующей серии экспериментов мы проверяли повторяемость ингибигорного действия аденозина на силу сокращения на препаратах фазных мышц. Аденозин обратимо снижал амплитуду вызванных стимуляцией электрическим полем сокращений камбаловидной мышцы до бб.8±7.5% (п=4, р<0.05), что, в общем, воспроизводит действие этого пурина на силу сокращения тонической мускулатуры. Временные параметры сокращения камбаловидной мышцы под действием аденозина оставались неизменны. Антагонист аденозиновых рецепторов, 8-ЗРТ почти полностью предотвращал действие аденозина на сокращение камбаловидной мышцы (83.3±7.4%; п=3)

Аденозин оказывал равноэффективное действие и на фазную мышцу другого типа. К 15-той минуте его действия в концентрации 100 мкМ сила сокращения т. Е01 составила 70.3±5.3% (п=б, р<0.05). 8-8РТ полностью угнетал эффект аденозина на сокращение т. ЕОЬ (93.9±8.7%; п=6). При блокаде холинорецепторов тубокурарином устранялся эффект аденозина на силу сокращения скелетных мышц, что говорит о синаптической природе его воздействия.

Получив данные о равноэффективном ингибировании аденозином функционального состояния тонических мышц холоднокровных и теплокровных, а также двух типов фазных мышц теплокровных, в следующей серии экспериментов мы исследовали действие этого пурина на силу сокращения фазной мышцы холоднокровных. Аденозин в концентрации 100 мкМ угнетал сокращения т. 5агЮгаи озерной лягушки до 81.1 ±2 4% от контроля (п-22, р<0.05; рис. ЗГ), что достаточно точно воспроизводит отмеченное ранее действие этого пурина на силу сокращения скелетных мышц. Ингибиторньш эффект аденозина на сокращение портняжной мышцы лягушки блокировался 8-ЯРТ и не блокировался антагонистом Р2-рецепторов РРАОЭ, что говорит в пользу вовлечения имешю аденозиновых рецепторов в действие данного пурина.

Для выявления механизма ингибигорного действия аденозина на функциональное состояние портняжной мышцы лягушки в следующей серии экспериментов мы оценивали действие экзогенного аденозина на характеристики многоква1гговых токов концевой пластинки (ТКП) портняжной мышцы озерной лягушки. При фиксации потенциала на уровне -40 мВ средняя амплитуда многоквантовых ТКП составила 138±25 нА (п=25). Спад токов описывался одной экспоиекгой с постоянной времени спада 1.41±0.12 мс (п=25). Добавление аденозина в микромолярных концентрациях вызывало снижение амплитуды токов концевой пластинки. При использовании аденозина в концентрации 100 мкМ снижение амплитуды токов происходило до 70.4±1.3% (п=26; р<0.001; рис ЗА).

Экзогенный аденозин не влиял существенно на время роста и постоянную времени спада токов (п=25; р>0.05). Эффект аденозина на амплитуду токов был обратим, после

отмывания раствором Рингера амплитуда сигнала восстанавливалась до исходных величин (п=25; р>0.05).

После аппликации аденозина снижалась частота возникновения спонтанных миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП). Так, частота МТКП на фоне 100 мкМ аденозина к 15 мин его действия составляла 46±5% (п=7; р<0.05). При этом не снижалась амплитуда миниатюрных токов (9б±6% от контроля; п=7; р>0.05; рис. ЗБ). Таким образом, аденозин обладает выраженным угнетающим действием на синаптическую передачу в нервно - мышечном синапсе, уменьшая число квантов ацетилхолина, выделяемых из двигательной нервной терминали.

Рис. 3. Эффект аденозина в концентрации 100 мкМ на функциональное состояние портняжной мышцы озерной лягушки. А - усредненные ТКП (20 реализаций). Б - усредненные МТКП (20 реализаций). В - усредненные электрограммы кальциевого тока (20 реализаций). Г- механограммы сократительных ответов.

Аденозин также не влиял на амплитудно-временные параметры МТКП камбаловидной мышцы и т. Е01 крысы. При этом аденозин воспроизводил свой ингибиторный эффект на частоту МТКП на ранее исследованных препаратах. На камбаловидной мышце частота МТКП к пятнадцатой минуте действия 100 мкМ аденозина упала до 49±8% (п=6; р<0.05) от значений до подачи этого пурина, взятых за 100 %. В синапсах т. ££>£ это падение произошло до 44±10% (п=6; р<0.05) от контроля.

Отсутствие изменений в амплитудно-временных параметрах МТКП говорит о неизменности состояния постсиналтических холинорецепторов.

Способность аденозина снижать количество квантов медиатора может быть объяснена прямым воздействием этого пурина на претерминальные кальциевые токи. С помощью методики выделения периневралыюго кальциевого тока мы провели серию экспериментов по изучению влияния на его параметры аденозина. Оказалось, что этот пурин в концентрации 100 мкМ никак не влиял ни на амплитуду (98.7±4.6% от контроля (п=8; р>0.05); рис. ЗВ), не на временные параметры претерминального кальциевого тока.

Влияние блокаторов калиевых ионных каналов на эффект аденозина

Нами показано, то аденозиновые рецепторы, через которые осуществляет свой ингибиторный эффект аденозии, связаны с Gi/„ подтипом ГТФ-белка, так как его специфический ингибитор PIX [Torres et al., 2002] устраняет эффект этого пурина. Но эффект аденозина не опосредуется производством диацилглицерина, инозитолфосфата, перекиси водорода, монооксидов азота и углерода, арахидоновой и фосфатидной кислот, а так же, как нами было показано ранее, активацией аценилатциклазы и гуанилатциклазы (табл.1). Какие же структуры сопряжены с метаботропными аденозиновыми рецепторами?

То, что аденозин является модулятором секреции нейротрансмиттера, мы судим по снижению им амплитуды ТКП. Ингибиторы секреции медиаторов могут осуществлять свое действие напрямую, воздействуя на секреторный аппарат, или ингибируя кальциевые каналы, либо активируя калиевые каналы. В экспериментах с кальциевым током мы наблюдали отсутствие влияние аденозина на входящий ионный ток через трансмембранные кальциевые ионные каналы.

Во многих тканях аденозиновые рецепторы сопряжены с К+-каналами [King et al., 1996]. Поэтому далее мы исследовали, может ли иигибиторное действие аденозина на секрецию ацетилхолина быть сопряжено с различными подтипами Ю-каналов двигательного нервного окончания. Вначале для оценки участия А типа калиевых каналов мы провели серии экспериментов с действием аденозина на фоне блокаторов этих каналов: 4-аминопиридина и катехола.

4-аминопиридин в концентрации 100 мкМ значительно повышал амплитуду ТКП. Так, через 15 минут после его действия амплитуда ТКП составила 205.6±27.1% (п=6, р<0.05) от контроля. Ингибиторный эффект аденозина пропадал при блокировании А типа калиевых каналов. Как показано на рисунке 4, после 15 минут действия аденозина в концентрации 100 мкМ на фоне 100 мкМ 4-аминопиридина амплитуда ТКП составила 94.8+3.2% (п=7, р>0.05) от значения до аппликации блокатора.

Чтобы подробнее проанализировать вопрос участия калиевых каналов А типа в эффекте аденозина, применили другой блокатор этих каналов - катеход. При добавлении в раствор Рингера 10 мкМ катехола амплитуда ТКП возросла в среднем до 225.3±31.4% (п=5, р<0.05) от контроля. После аппликации аденозина амплитуда ТКП на 15 минуте его действия составила 97.3±4.4% (п=6, р>0.05; рис. 4) от контроля, то есть, как и в случае с 4-аминопиридином, эффект аденозина существенно снизился. Это означает, что калиевые каналы А типа задействованы в эффекте аденозина.

На фоне 10 мкМ катехола аденозин перестает угнетать силу сокращения т. rectus lateralis, т. EDL и камбаловидной мышцы крысы, что говорит об общности опосредования калиевыми каналами А типа угнетения аденозином функционального состояния скелетных мышц.

В последующем нами были проведены исследования об оценке участия других калиевых каналов в ингибиторном действии аденозина. По неизменному действию аденозина в присутствии соответствующих блокаторов разных типов калиевых каналов мы выяснили, что ингибиторный эффект аденозина на нервно-мышечную передачу не связан с активацией калиевых каналов задержанного выпрямления, Са2+ активируемых К+ каналов большой и малой проводимости и АТФ-чувствительных К* каналов, а также каналов, активируемых гиперполяризацией. Эти данные отображены на рисунке 4.

Известно, что ионы бария являются неспецифическими блокаторами ионных каналов [Latorre & Miller, 1983]. Ионы бария могут входить в нервное окончание [Silinsky et al., 1978, 2000]. Эксперименты по изучению действия аденозина на фоне ионов бария могут позволить прояснить роль К+-каналы-зависимых процессов в реализации ингибиторного эффекта аденозина. В а полностью устранял ингибиторный эффект аденозина. В присутст вии 1 мМ Ва + после 15 минут действия 100 мкМ аденозина средняя амплитуда ТКП была 94.9±7.3% (п=5, р>0.05; рис. 4). Но, как известно, Ва2+ не блокирует калиевые каналы как раз А типа [Rudy, 1988; Castle et al., 1989]. Так каков механизм отмены действия аденозина барием?

80-

Is c; с

5 <

40-

20-

Амплитуда ТКП до "подач й аденозйи а *

X X

s Ф

OJ et

О ra

X s X ф +

РЭ О X s

X 0

ш X

ч X 0

га S h-

+ Ct s O s

X s m a. ф ID

Ь s

х s со

1 (I)

X s =t s О. S с о

X s 2 га

Р>

X ф

<=г га

с: о

х g

(D М

1 I 8. « а §

1 « Ё §

1 I

х s ст О X 0)

£ +

го

<0 ю

s р

X s «о о

X ф

Ч го

го m

Рис. 4. Изменение амплитуды ТКП под действием аденозина в концентрации 100 мкМ отдельно и в присутствии блокаторов различных типов калиевых каналов: 1„ типа (10 мкМ ZD-7288), задержанного выпрямления (1 мМ ТЭА и 30 мкМ квинидина), SK каналов (25 нМ иберисгсоксина и 200 нМ апамина), А типа (100 мкМ 4-ашшопиридина и 100 мкМ катехола), КАТФ (50 мкМ глибенкяамнда) и неслецифического блокатора калиевых каналов (1мМ Ва:+). * - р<0.05 по сравнению с исходной амплитудой ТКП.

Выявление подтипов аденозиновых рецепторов, задействованных в пресинаптическом эффекте аденозина

Решая вопрос, каким образом ионы бария блокируют действие аденозина, мы изучили действие ионов бария на фоне веществ, активирующих рецепторы аденозина.

Для этого мы применили агонист одного из подтипов (А2Л) адепозиновых рецепторов CGS21680 (М'-замсщешгый аналог MECA). В отличие от аденозина, CGS21680 в концентрации 10 нМ не только не подавлял, но даже вызывал незначительное повышение амплитуды ТКП - до 106.912.1% от контроля (п=5). Как было показано, на фоне ионов бария происходит снятие ингибиторного эффекта аденозина. CGS21680 на фоне 1 мМ Ва2+ увеличивал амплитуду до 124.8+4.3% от контроля (п=5; р<0.05).

На пресинаптической мембране существуют Ai и А2 типы аденозиновых рецепторов, причем активация первых приводит к ингибировашпо амплитуды ТКП, в то время как активация вторых - к противоположному эффекту [Tian et al., 2010]. При отсутствии активности рецепторов А2 типа аденозин приводил бы к большему угнетающему действию.

Для проверки этого в следующей серии экспериментов мы изучали действие селективного агониста Ai рецепторов ССРА (2-chloro-N6-cycIopentyl-adenosine) [Fredholm et al., 2001] на амплитуду ТКП. ССРА в действующей концентрации 500 нМ [Ballard-Croft

е{ а!., 2008] снижал амплитуду ТКП до 56.4±4.4% от контроля (п=4; р<0.05), что достоверно (р<0.05) отличается от действия 100 мкМ аденозина

Как же будут влиять ионы бария на эффект специфического агониста А| аденозиновых рецепторов? На фоне I мМ Ва2+ ССРА в концентрации 500 нМ проявлял свое действие в полной мере: до 65.0±6.9% от контроля (п=4), что не отличается достоверно (р>0.05) от действия данного агента в контроле.

Итак, наблюдаемое в наших экспериментах снятие ионами бария эффекта аденозина, а также дальнейшее увеличение амплитуды под действием СОЭ21680 на фоне Ва2+ и сохранение в этих условиях эффекта ССРА позволяет нам сделать вывод о преимущественно Аг-рецеггтор-зависимом действии ионов бария на нервно-мышечную передачу.

В предыдущем разделе мы описывали устранение Агрецептор-опосредованого ингибиторного действия аденозина блокаторами А типа калиевых каналов. Чтобы проверить, не будет ли проявляться подобный эффект и для специфического агониста А1 рецепторов, мы в следующей серии экспериментов апплицировали ССРА на фоне 10 мкМ катехола. В этом случае амплитуда ТКП на 15 минуте действия ССРА составила 92.3+9.2% (п=4, р>0.05) от контроля, то есть, как и в случае с аденозином, эффект агониста существенно снизился. Мы предполагаем, что калиевые каналы А типа участвуют в эффекте ССРА.

Определяющим результатом данного этапа исследований является раскрытие механизма ингибиторного действия аденозина в плане участия пресинаптических мембранных и внутриклеточных структур. Очень важно, что в ходе исследования был обнаружен новый блокатор действия аденозина - ионы бария, по сути, не принадлежащие к классу антагонистов рецепторов. Более того, в ходе исследования способа блокирования ионами бария эффекта аденозина были вскрыты тонкие механизмы баланса разных типов рецептора аденозина при модуляции синаптической передачи (рис. 7).

IV. Действие АТФ на функциональное состояние фазных мышц

Общая характеристика эффекта А ТФ на функциональное состояние фазных мышц

В следующих сериях экспериментов мы исследовали: не проявляется ли действие АТФ на уровень неквантовой секреции и в синапсах фазных мышц теплокровных?

АТФ, подобно аденозину, не оказывала заметного влияния на Н-эффект т. ЕП1. Так, после аппликации 100 мкМ АТФ уровень неквантовой секреции составил 4.7±0.3 мВ (п=100) при контрольном Н-эффекте, составляющим 4.8+0.4 мВ.

На медленной камбаловидной мышце крысы также не было обнаружено сколько-то заметного влияния АТФ на Н-эффект. Так, под влиянием 100 мкМ АТФ Н-эффект составил 4.8+0.8 мВ (п=110), что не отличается достоверно от контрольного Н-эффекта на этой мышце: 5.2±0.6 мВ (п=110). Мы делаем вывод, что АТФ не влияет на уровень неквантовой секреции в синапсах как быстрых, так и медленных фазных мышц крысы.

Таким образом, в экспериментах по оценке Н-эффекта мы установили, та) АТФ устраняет неквантовую секрецию ацетилхолина только в синапсах тонической мускулатуры, увеличивая запас медиатора для квантового выхода. Это может приводить, в конечном счете, к усилению сокращения тонической мускулатуры. В синапсах фазных мышц подобных механизмов, очевидно, нет. Противоположные эффекты пуринергической регуляции отражают коренные различия в функциональной организации фазной и тонической мышечных систем.

АТФ (100 мкМ) угнетала вызванные электрической стимуляцией сокращения камбаловидной мышцы до 64.9±7.6% от исходных значений (п=Н, р<0.05). Также АТФ в концентрации 100 мкМ вызывала достоверно снижение силы сокращения т. ЕОЬ, тем не менее, оно было в полтора раза менее выраженным, чем в случае камбаловидной мышцы. В присутствии 100 мкМ АТФ сила сокращения т. £Ж была 79.6±3.2% (п=6) и эти данные достоверно отличаются (р<0.05) как от интактных сокращений, так и от выраженности

эффекта АТФ у камбаловидной мышцы. Итак, в наших экспериментах мы установили, что АТФ угнетает сократительную активность медленной камбаловидной мышцы крысы и, чуть менее, быстрого типа мышцы - длинного разгибателя пальцев. Эти два типа мышц имеют определенные различия [Мавринская и Резвяков, 1978; Glisovic et al., 2010].

Отмена ингибиторного действия АТФ происходила на фоне неселективного антагониста Р2-рецепторов сурамина в концентрации 100 мкМ. Так, в его присутствии 100 мкМ АТФ действовала лишь до 95.5±8.1% (п=6, р>0.05) от силы контрольных сокращений (в отсутствии АТФ), взятых за 100%.

АТФ угнетала вызванные стимуляцией электрического поля сокращения и портняжной мышцы лягушки. При концентрации АТФ 100 мкМ угнетение достигало 77.8±2.4% (п=12) по отношению к контролю, принятому за 100% (рис. 5Г). Действие АТФ предотвращалось предварительной инкубацией ткани стубокурарином.

Для всех фазных мышц: как холоднокровных, так и теплокровных наблюдалась аддитивность ингибиторного действия аденозина и АТФ на силу их сокращения. Общий вклад пуринов сравним с аккумуляционным запасом силы мышц в норме [Hettinger, 1961].

Далее для поисков механизмов найденного эффекта мы исследовали влияние АТФ на многоквантовые и миниатюрные токи концевой пластинки портняжной мышцы лягушки. После аппликации АТФ наблюдалось снижение амплитуды многоквантовых ТКП (рис. 5А). Так, АТФ в концентрации 100 мкМ к 15 минуте снижала амплитуду ТКП до 66.1+1.1% (п=25, р<0.001) от контрольного значения. Таким образом, снижение амплитуды при действии АТФ и аденозина в этой концентрации было равноэффективным. Причем, как для АТФ, так и для аденозина падение амплитуды было обратимым при отмывке физиологическим рас/вором.

В следующей серии экспериментов анализировали влияние АТФ на миниатюрные токи концевой пластинки. На интактной нерассеченной портняжной мышце лягушки (мембранный потенциал -73 мВ) АТФ не изменяла параметров МТКП. Амплитуда МТКП в контроле составляла 2.97+0.20 нА, а постоянная времени спада - 1.01+0.05 мс (п~10 синапсов). После аппликации АТФ амплитуда МТКП равнялась 2.86±0.15 нА (п=8, р>0.05), постоянная времени спада также значительно не изменялась, составляя 0.91 ±0.07 мс (п=8, р>0.05). То, что АТФ, как и аденозин, не меняла амплитуду и длительность миниатюрных ТКП (рис. 5Б), подтверждает предположение о том, что эффекты этих пуринергических агентов реализуются на пресинаптической мембране. Этот вывод совпадает с результатами, полученными другими авторами [Гиниатуллин, Соколова, 1998; Giniatullin & Sokolova, 1998]. Присутствие АТФ приводило к уменьшению частоты МТКП до 65±5% (п=6; р<0.05). Подобное снижение частоты МТКП хорошо согласуется со снижением квантового состава многоквантовых ТКП и еще раз говорит в пользу сугубо пресинаптического действия этого вещества.

АТФ в концентрации 100 мкМ не влияла ни на амплитудные, ни на временные параметры МТКП т. EDL и камбаловидной мышцы крысы. Зато под действием этого пурина достоверно снижалась частота этих спонтанных токов. Так, при проведении эксперимента на не рассеченном препарате камбаловидной мышцы крысы в присутствии 100 мкМ АТФ частота МТКП упала до 63±7% (п=6; р<0.05) от контрольных значений. Для ra.EDL крысы падение частоты МТКП под действием 100 мкМ АТФ зафиксировано до уровня 80±9% (п=6; р<0.05) от контроля.

В отличие от аденозина, АТФ оказывала влияние на периневральный кальциевый ток, что подтверждает наши предыдущие данные о кальций-опосредованном (и кальцийзависимом) действии АТФ. Установлено, что аппликация 100 мкМ АТФ обратимо ингибирует кальциевые токи до 83.0±3.1% (¡1=8; р<0.01) от контроля, без изменения натриевой компоненты (98.9±4.5% от контроля; п=8; р>0.05) (рис. 5В). Действие АТФ на кальциевые токи предотвращается неселективньш антагонистом Р2-рецепторов сурамином в концентрации 100 мкМ (100.3±1.9%; п=6; р>0.05).

Ml ж

Рис. 5. Влияние АТФ в концентрации ши мкМ на функциональное состояние портняжной мышцы озерной лягушки. Л - усредненные ТКП (20 реализаций). Б- усредненные МТКП (20 реализаций). В - усредненные электрограммы кальциевого тока (20 реализаций). Г - механограммы сократительных ответов.

Выявление подтипа пресинаптического Р2-рецептора, задействованного в эффекте АТФ

Поиск специфических антагонистов является ключевым в характеристике рецепторов и выяснении их функциональной роли. Ранее нами были получены данные, что неселективный антагонист аденозиновых рецепторов, 8-SPT не оказывал влияния на угнетающее действие АТФ, что исключает влияние аденозина, полученного в результате разложения АТФ. Эти данные согласуются с предшествующими исследованиями [Giniatullin & Sokolova, 1998], в которых при регистрации ТКП показано, что АТФ и аденозин угнетают выброс медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки посредством активации каждый своих пресиналтических рецепторов. Причем, нами ранее было доказано [Sokolova et al., 2003], что АТФ в мионевральном синапсе фазной мышцы действует через Р2У, а не Р2Х рецепторы. Однако, конкретные подтипы рецепторов, участвующих в модуляции АТФ секреторного процесса, до сих пор оставались неизвестными.

Ранее в кашей лаборатории установлены факты, что пресинаптйческое ингибиторное действие АТФ на амплитуду ТКП устраняется антагонистом широкого спектра Р2-рецепторов сурамином [Giniatullin & Sokolova, 1998], но не блокатором P2Yi, P2Y4, P2YH подтипов рецепторов Реактивом синим 2 [Sokolova et al., 2003].

В различных тканях, включая нервную, широко распространенными являются P2YiiUiU подтипы рецепторов [Choi et al., 2003]. Ранее нами было показано, что являющийся специфическим только для P2Yi, P2YU и P2Yn рецепторов агонист 2-МеЗАДФ угнетал амплитуду ТКП в полтора раза больше, чем АТФ. Такое убывание активности агонистов Р2-рецепгоров (2-Ме8АДФ>АТФ) характерно только для P2Y| P2YU и P2Yu [Зиганшин, Зиганшина, 2009], тем более, что еще один агонист, и опять только этих подтипов рецепторов - АДФ проявлял выраженное ингибиторное действие.

Чтобы выяснить, какой из этих трех подтипов P2Y рецепторов задействован в пресинаптическом ингибиторном эффекте АТФ, необходимо исследовать ее действие на фоне хотя бы двух га трех специфических антагонистов P2Yi, P2Y¡2 и P2Y13 рецепторов.

В наших предыдущих исследованиях мы показали, что антагонист P2Yi рецепторов MRS-2I79 не устранял эффект АТФ [Giiiiatullin et al., 2005]. Следовательно, P2Y¡ рецепторы не участвуют в ингибиторном действии этого пурина.

Оставшиеся два рецептора характеризуется тем, что только они из всех P2Y связаны с Gi/o ГТФ-белками, чувствительными к коклюшному токсину (РТХ) и N-этилмалеимиду [Burnstock, 2006]. Поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние этих агентов на эффект АТФ. РТХ, как и N-этилмалеимид, значительно нивелировал действие экзогенного АТФ (таб. I). В наших исследованиях N-этилмалеимид проявил себя как контрактильный агент, вызывающий, возможно, сокращение портняжной мышцы лягушки за счет устранения им ингибиторного действия эндогенных пуринов [Гришин и др., 2006]. Следовательно, действие АТФ на секрецию ацетилхолина осуществляется через рецепторы P2Yi2, либо P2Y13. связанные с G¡/0 подтипом ГТФ-белка, чувствительного к РТХ и N-этилмалеимиду.

Для выяснения того, какой же из двух подтипов - P2Yu или P2Yi3 рецепторов задействован в мионевральном синапсе лягушки, в следующей серии экспериментов мы применили специфический антагонист для P2Yu рецептора - MRS2211. В эффективной концентрации 10 мкМ [Amisten et al., 2010] MRS2211 сам несколько снизил амплитуду ТКП до 81.2±7.0% (п=6, р<0.05). На его фоне действие 100 мкМ АТФ проявило себя в полной мере. Так, к 15-той минуте действия этого пурина амплитуда ТКП составила 67.1±5.5% (п=6, р<0.05) от взятого за 100% уровня в присутствии только MRS2211.

Таким образом, мы исключили участие одного из двух последних возможных подтипов Р2-рецегггоров в реализации ингибиторного эффекта АТФ, и можем утверждать, что в этом эффекте задействован P2YU подтип рецептора (рис. 6). Что характерно, известно, что АТФ ингибирует экзоцитоз норадреналина по принципу отрицательной обратной связи также через P2Yn рецепторы в синапсах симпатической нервной системы крыс [Quintas et al., 2009]. _

Рис. 6. Схема, отображающая поиск рецептора, задействованного в ингибиторном эффекте АТФ на функциональное состояние фазной мускулатуры лягушки. Показано окончание мотонейрона. Слева нарисован синагггический пузырек - везикула, заполненная, помимо медиатора ацетилхолина, АТФ. Показан экзоцитоз содержимого везикул и потенциальный выбор активации АТФ Р2У,г и Р2Уц подтипов рецепторов. Схематически отображено стрелками со знаком «плюс» возможное активирующее рецепторы действие АТФ, стрелками со знаком «минус» действие специфического антагониста М11822П на Р2У,3 рецептор и действие РТХ, блокатора ГТФ-белка, связанного с Р2Уа и Р2У), подтипами рецепторов АТФ.

Выявление последующих звеньев вторичных посредников эффекта ЛТФ Метаботропные P2Y12 рецепторы могут быть сопряжены с различными каскадами вторичных посредников: РС- и PI-фосфолипазой С, фосфолипазой Аг, фосфолипазой D, гуанилатциклазой и аденилатциклазой. Во всех этих случаях сопряжение реализуется через гетеротримерный ГТФ-связанный белок (G-белок). P2Y рецепторы могут проявлять эффект через G¡/„ или G^¡ подтип G-белка [Ralevic & Burnstock, 1998]. Ранее мы в данной работе показали, что эффект АТФ опосредуется P2Yi2 рецептором, связанным с Gi/a ГТФ-белком, чувствительным к коклюшному токсину (рис. 6). В более ранних работах [Sokolova et al., 2003] нами уже было показано, что ингибиторное действие АТФ не реализуется аденилатциклазным и гуанилатциклазным внугриклеточным метаболическим путем. В следующих сериях экспериментов мы выясняли, не участвуют ли другая разновидность производящих вторичные посредники внутриклеточных белков-ферментов, а именно - фосфолипаз.

В некоторых тканях АТФ может реализовывать свой эффект через фосфолипазу D, гидролизукнцую фосфодиэфирную связь между остатком фосфатидной кислоты фосфолипида и головной группой полярной части [Bocckino et al., 1987]. Ингибитор фосфолипазы D - 1-бутанол не оказывал никакого влияния на ингибиторный эффект АТФ (табл. 1). Эти данные позволяют нам считать, что пресинаптическое действие АТФ не связано с образованием фосфатидной кислоты фосфолипазой D.

Gi/o тип ГТФ-белка способен передавать активирующий сигнал на другую фосфодиэстеразу - фосфолипазу С через Ру комплекс. Выделены два типа фосфолипазы С -PI и PC [Neary et al., 1999]. Активация первого типа приводит к увеличению количества инозитолтрифосфата, а активация РС-фосфолипазы С влечет за собой синтез диацилглицерина, активирующего перспективную мишень - протеинкиназу С. Поэтому следующим этапом исследования было установление вовлеченности в пресинаптическое действие АТФ на секрецию АХ из двигательного нервного окончания РС-фосфолипазы С. Для этого мы использовали ее специфический блокатор - D609 [Balboa & Insel, 1998].

D609 в концентрации 100 мкМ значительно повышал амплитуду ТКП. При этом предварительное ингибирование ФЛС агентом D609 полностью предотвращало угнетающее действие АТФ на секрецию АХ (табл. 1). Мы делаем вывод о том, что РС-фосфолипаза С вовлечена в действие АТФ.

Выявлено, что инициация P2Y рецепторов может приводить к активации фосфатидил-инозитол-специфичной фосфолипазы С (PI-фосфолипазы С) [Ralevic & Burnstock, 1998]. В следующую серию экспериментов мы проводили с U73122, специфическим ингибитором PI-фосфолипазы С. К 20-й минуте аппликации U73122 в действующей концентрации [Baryshnikov et al., 2003] 10 мкМ амплитуда ТКП немного снизилась и на фоне этого агента АТФ не меняла свой эффект (табл. 1).

РС-фосфолипаза С производит гидролиз фосфолипидов, приводящий к появлению вторичного посредника - диацилглицерина, который является естественным активатором протеинкиназы С [Ralevic & Burnstock, 1998]. В следующей серии экспериментов для оценки вовлеченности протеинкиназы С в модулирующее действие АТФ выясняли, не оказывает ли влияние блокатор этого фермента хелеритрин на угнетающий эффект этого пурина. Хелеритрин в концентрации 5 мкМ [Xu et al., 2009] достоверно повышал амплитуду ТКП и снимал действие АТФ (табл. 1). Итак, это свидетельствует о сопряжении P2Y рецепторов в нервно - мышечном синапсе с протеинкиназой С. При этом мы можем сказать, что получено еще одно свидетельство возможного участия эндогенной АТФ в фоновом ингибировании секреции АХ. Что характерно, в присутствии как 100 мкМ D609, так и 5 мкМ хелеритрина ингибиторное действие 100 мкМ АТФ на силу сокращения т. EDL и камбаловидной мышцы крысы пропадало, что говорит о непосредственном участии РС-фосфолипазы С и протеинкиназы С в этом эффекте,

Активация протеинкиназы С может приводить к фосфорилированию белков-эффекторов, либо вовлекать последующие каскады вторичных посредников, таких как

фосфолипаза А2 [Ralevic & Buriistock, 1998; Torres et al., 2002]. Для оценки участия фосфолипазы Аз в пресинаптическом действии АТФ в следующей серии экспериментов проверяли, не оказывает ли влияние специфический ингибитор ФЛАг 4-(4-октадесуфенул)-4-о-бутеноидная кислота (ОВАА) на пресинаптический эффект АТФ.

ОВАА значительно повышала амплитуду ТКП (табл. 1). На 15-ой минуте действия 100 мкМ АТФ на фоне 20 мкМ ОВАА амплитуда ТКП составила 85±б% (п=7), что достоверно (р<0.05) отличалось от контроля, свидетельствуя, что АТФ продолжает угнетать секрецию на фоне этого агента. Однако дальнейший анализ показал, что степень снижения ТКП в присутствии ОВАА достоверно отличается (р<0.05) от степени угнетения сигнала в контроле. Таким образом, ОВАА в концентрации 20 мкМ снижает, но не устраняет угнетающее действие АТФ на секрецию, следовательно, фосфолипаза А2 частично вовлечена в пресинаптическое действие АТФ. Можно отметить, что агент снижает эффективность эндогенного АТФ, вновь проявляя собственный облегчающий эффект на ТКП, как это наблюдалось с другими антагонистами действия АТФ.

В присутствии 10 мкМ другого ингибитора фосфолипазы Аг PACOCF3, структурно отличного от ОВАА [Jan et al., 2000] эффект 100 мкМ АТФ также был наполовину снижен. Он составил 84.3±3.4% (п=4, р<0.05) от контроля, что подтверждает участие фосфолипазы Аг в эффекте АТФ.

Активация фосфолипазы А2 приводит к появлению арахидоновой кислоты и ее производных, обладающих собственным физиологическим метаболизмом. Одними из таких соединений являются простагландины, продуцируемые ферментом циклооксигеназой. Выяснить роль продуктов превращения арахидоновой кислоты можно с помощью ингибиторов циклооксигеназы: индометацина и ацетилсалициловой кислоты.

Индометацин и ацетилсалициловая кислота достоверно повышали амплитуду ТКП и наполовину устраняли ингибиторный эффект АТФ (табл. 1). Одним из объяснений частичного устранения эффекта АТФ могла быть недостаточно ингнбированная циклооксигеназы индометацином в концентрации 10 мкМ. Поэтому мы провели дополнительную серию экспериментов с индометацином в концентрации 50 мкМ. 100 мкМ АТФ в присутствии 50 мкМ индометацина подействовала до 84.3±7.2% (п=6, р<0.05), то есть в такой же степени, как и при концентрации 10 мкМ. Это свидетельствовало о том, что этот метаболический каскад принимает дополнительное, но не основное участие в ингибиторном действии АТФ.

Арахидоновая кислота и ее метаболит циклооксигелазного пути простагландин Ег частично, моделируют ингибиторное действие АТФ на амплитуду ТКП и частоту МТКП, при этом полностью повторяют действие этого пурина на периневральный кальциевый ток. 10 мкМ арахидоновой кислоты снижают амплитуду ТКП до 81.1±2.2% (п=7, р<0.05), что составляет половину от значения ингибиторного эффекта 100 мкМ АТФ. Метаболит циклооксигеназного пути арахидоновой кислоты простагландин Hi в концентрации 50 мкМ оказывал подобное же действие, снижая амплитуду ТКП до 87.0+5.6% (п=б, р<0.05). Помимо того, что простагландин Е2 наполовину воспроизводил действие АТФ на ТКП, он в той же мере повторял действие этого пурина на частоту МТКП (обратимо снижая ее до 85.8+2.1% (п=6, р<0.05) от контроля), не изменяя их амплитудно-временных параметров".

Уменьшение секреции медиатора под влиянием арахидоновой кислоты может быть связано с ее непосредственным угнетающим действием на кальциевый ток. Добавление арахидоновой кислоты в концентрации 10 мкМ не изменяло натриевую составляющую периневрального ответа (до 96.1±5.0 % (п=6; р>0.05)), но уменьшало амплитуду кальциевой составляющей до 83.3±2.3 % (п=6; р<0.05) относительно контрольных значений. При этом длительность кальциевой составляющей не изменялась.

В нашей следующей серии экспериментов, которые мы провели с метаболитом арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути, простагландин Ег в концентрации 50 мкМ уменьшал амплитуду кальциевого тока до 88.0+1.2 % (д=6; р<0.05) от контроля. При

- Данные исследование выполнены совместно с ассисгешои кафедры физиологии человека и животных КФУ. к.б.н. О-В. Яковлевой

этом длительность составляющих периневрального отведения не изменялась. Также не менялась и амплитуда натриевой компоненты (100.9±6.2 %; п=6; р>0.05).

Для изучения роли циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты использовали ингибитор циклооксигеназы - индометацин в концентрации 10 мкМ. Индометацин устранял ингибиторный эффект арахидоновой кислоты, но не простагландина Е2, на амплитуду ТКП и кальциевые токи. Так, при аппликации 10 мкМ индометацина арахидоновая кислота в концентрации 10 мкМ не изменяла кальциевую (99.5±1.9%; п=7; р>0.05) и натриевую составляющие (97.9±1.3%; п=7; р>0.05).

В соответствии с полученными нами данными мы можем говорить, что после протеинкиназы С, которая полностью опосредует эффект АТФ, часть дальнейшего ингибиторного механизма реализуется путем производства арахидоновой кислоты и, далее, простагландина Ег, который в свою очередь снижает квантовый состав, блокируя кальциевые каналы нервной терминали. Необходимо выяснить, на какое звено параллельно передает протеинкиназа С вторую часть активирующего импульса АТФ, модулятора секреции нейротрансмиттера? Это может быть ингибиторное действие либо посредством активации калиевых; каналов, либо блокадой пресинаптических кальциевых каналов или подавляя секреторный аппарат посредством производства таких вторичных посредников, как активные формы кислорода (АФК) или газы-монооксиды. Ранее нами было показано [Grishin et al., 2005], что ни один из известных типов калиевых каналов не являются прямыми исполнительными элементами в пресинаптическом действии АТФ, в противоположность аденозину. Эффекторная роль кальциевых каналов уже выявлена, они являются конечным звеном метаболического пути АТФ посредством синтеза арахидоновой кислоты. Поэтому в следующих сериях экспериментов мы исследовали роль АФК и газов-монооксидов в ингибиторном действии АТФ.

При проверке действия этого пурина в присутствии блокатора N0 синтазы - L-NAME эффект АТФ реализовывался в полной мере (табл. 1). Итак, оксид азота (II) никак не участвует в пуринергической синаптической модуляции.

Известна другая внутриклеточная сигнальная монооксидная газообразная молекула-СО. И на фоне 10 мкМ блокатора синтезирующей СО гемооксигеназы ZnPP-9 АТФ в концентрации 100 мкМ полностью проявила свое ингибиторное действие (табл. 1).

У лягушки существует АФК-зависимый путь реализации эффекта АТФ. Однако, вопрос о причастности Р2-рецепторов к процессу образования эндогенных АФК и монооксидов в нервно-мышечном соединении, и выяснения механизмов регуляции секреции АХ при их активации, требует дальнейшего исследования. Показано, что одна из форм АФК - Н2О2 оказывает серьезное влияние на работу скелетной мышцы. Есть данные о том, что АТФ стимулирует образование Н2О2 посредством никотинамид аденин динуклеотид фосфат-оксидазы [Parvathenani et al., 2003].

Поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали действие АТФ в присутствии антиоксиданта, который эффективно устраняет эффекты Н2О2. Пировиноградная кислота непосредственно связывает Н2О2 [Gyulkhandanyan et al., 2003]. Эффект АТФ в присутствии 100 мкМ пировиноградной кислоты был ослаблен по сравнению с контролем2' (табл. 1).

Целью очередного этапа настоящей работы стало исследование эффектов внеклеточных АТФ и Н202 на синаптическую передачу в нервно-мышечном синапсе и изучение механизмов, лежащих в их основе. В нашей лаборатории было показано, что Н2О2 может обратимо угнетать как вызванную, так и спонтанную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки [Gimatullin & Giniatullin, 2003]. Амплитудно-временные параметры МТКП при действии Н202 не меняются, что указывает на отсутствие влияний на постсинаптическую мембрану.

В наших опытах Н2О2 в физиологической концентрации 3 мкМ [Murrant & Reíd, 2001] никак не влияла на параметры кальциевой и натриевой фаз периневрального тока._

■•' - Данные исследования выполнены совместно со ст преподавателем кафедры нормальной физиологии КГМУ. к.б.н. А.Р Гиниатуллнным

Для доказательства вовлечения Н2О2 только в «некальциевую» ветвь внутриклеточной сигнализации АТФ в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние антиоксиданта на периневральный ингибиторный эффект этого пурина. На фоне 100 мкМ пировиноградной кислоты 100 мкМ АТФ в полной мере, как в экспериментах с отдельной аппликацией, подействовала на кальциевую составляющую периневрального ответа - до 86.2±5.4% (п=6; р<0.05) от контроля. В итоге мы делаем вывод, что из исследованных низкомолекулярных липофильных агентов: монооксидов и перекиси водорода вовлечена в ингибиторное действие АТФ только Н;02, причем ее эффект реализуется не через блокирование кальциевых каналов Мишенью действия Н2О2, вероятней всего, являются белки экзоцитоза нервного окончания [Knapp & Klann, 2000].

Руководствуясь тем, что антиоксидаты только частично нивелируют действие АТФ, при этом полностью предотвращая эффекты Н2О2, и учитывая полученные данные по цепям вторичных посредников, а также то, что на фоне даже 1 мМ антиоксиданта N-ацетилцистеина [Reid et al., 1994], устраняющего действие Н2О2, не изменялось ингибиторное действие арахидоновой кислоты на амплитуду ТКП (83.0+5.1%; п=5; р<0.05 от контроля), мы можем сделать предположение о том, что та часть действия АТФ, которая не реализуется по арахидонат - зависимому механизму, после протеишшназы С опосредуется синтезом Н2О2. Известны данные, что эффекты протенкиназы С и Н2О2 в клетках некоторых тканей связаны между собой [Konishi et al., 1997; Servitja et al., 2000].

Исходя из вышеизложенного в следующих сериях экспериментов мы задались целью напрямую доказать параллельность следующих за протеинкиназой С внутриклеточных метаболических звеньев. Для этого мы решили воспользоваться специфическим активатором протенкиназы С - РМА (форболовым эфиром) [Searl & Silinsky, 1998]. PMA воспроизводил действие АТФ на ТКП и МТКП. Так РМА в концентрации 500 нМ снижал амплитуду ТКП до 68.4±3.7% (п=5; р<0.05) от контроля, не менял амплитудно-временные характеристики МТКП, уменьшая их частоту до 69.5±8.0% (п=5; р<0.05) от контроля. Также РМА воспроизводил эффект АТФ на составляющие периневрального тока. РМА в концентрации 500 нМ ингибировал кальциевые токи до 84.2±7.3% от контроля (п=6; р<0.05), но не натриевую компоненту (100.1±6.0%; п=6; р>0.05).

Что касается оксидантной и арахидонатной метаболических ветвей внутриклеточных вторичных посредников, на фоне 100 мкМ пировиноградной кислоты 500 нМ РМА проявлял половинный по силе эффект снижения амплитуды ТКП (87.4±5.3% от контроля (п=5; р<0.05). В то же время, что характерно, ингибиторный эффект РМА на кальциевую составляющую кальциевого тока проявлялся в полной мере (82.8±б.9% от контроля (п=5; р<0.05)). Из этих данных мы делаем вывод, что РМА воспроизводит оксидативное действие АТФ. В присутствии ингибитора циклооксидазной ветви метаболизма арахидоновой кислоты 10 мкМ индометацина 500 нМ РМА снижал амплитуду ТКП до 82.2±3.4% (п=5; р<0.05), что составляет половину от его нормального эффекта. При этих условиях на амплитуду кальциевой составляющей периневрального тока РМА уже не оказывал никого действия. К 15 мшгуте действия 500 нМ РМА на фоне индометацина она составила 96.9±8.3% от контроля (п=5; р>0.05). При сочетанном действии 100 мкМ пировиноградной кислоты и 10 мкМ индометацина РМА в концентрации 500 нМ перестал оказывать влияние и на амплитуду ТКП (103.0±4.7% от контроля; п=4; р>0.05). Значит, эффект РМА действует двумя аддитивными но действию путями - через синтез Н202 и производство циклооксигеназой простагландина Ег, угнетающего кальциевый ток (рис. 7).

В заключительных сериях экспериментов мы исследовали, задействованы ли подобные механизмы в пуринергической модуляции двигательных единиц теплокровных. При использовании 20 мкМ ОВАА, 10 мкМ индометацина, а также 100 мкМ пировиноградной кислоты, ингибиторный эффект АТФ на силу сокращения m.EDL и камбаловидной мышцы крысы был наполовину снижен, как и портняжной мышцы лягушки, что говорит о схожем механизме модуляции АТФ функционального состояния фазных мышц позвоночных.

Табл. 1. Влияние аденозина (100 мкМ) и АТФ (100 мкМ) на амплитуду ТКП портняжной мышцы лягушки на фоне ингибиторов систем вторичных посредников

Агент, концентрация Амплитуда ТКП, % от контроля

Агент + аденозин + АТФ

Контроль - 70.4±1.3% (п=26; р<0.001) 66.1+1.1% (п=25, р<0.001)

РТХ 1 мкг/мл ингибитор С,/0 подтипа ГТФ-белка - 86.4+5.7% (п=5, р>0.05) 96.0+3.3% (п=6, р>0.05)

Ы-этилмалеимид 10 мкМ ингибитор ГТФ-белка 133.2+7.9% (п=6, р<0.05) 91.5+6.4% (п=5, р>0.05) 103.1±7.3% (п=4, р>0.05)

В609 100 мкМ ингибитор РС-ФЛС 151.4±1б.1% (п=6, р<0.05) 65.3+9.0% (п=4, р<0.05) 102.3±4.4% (п=6, р>0.05)

1173122 10 мкМ ингибитор Р1-ФЛС 88.9+4.6% (п=7, р>0.05) 70.8±5.5% (п=4, р<0.05) 68.5+3.6% (п=4, р<0.05)

Хелеритрин 5 мкМ ингибитор ПКС 119.7±3.5% (п=7, р<0.05) 69.7+3.2% (п=4, р<0.05) 98.6+2.4% (п=7, р>0.05)

ОВАА 20 мкМ ингибитор ФЛА; 149.3+7.4% (п=4, р<0.05) 66.8±7.9% (п=6, р<0.05) 84.9+6.0% (п=7, р<0.05)

индометацин 10 мкМ ингибитор ЦОГ 118.8±4.0% (п=5, р<0.05) 69.4+3.1% (п=4, р<0.05) 86.1 ±3.4% (п=5, р<0.05)

ацетилсалициловая к-та 100 мкМ ингибитор ЦОГ 119.4+5.3% (п=4, р<0.05) 68.6+6.7% (п=4, р<0.05) 87.0+5.2% (11=5. р<0.05)

1-бутанол 0.03% ингибитор ФЛЭ 79.2±4.3% (п=5, р<0.05) 70.7±2.5% (11=6, р<0.05) 64.3+3.5% (п=6, р<0.05)

Яр-сАМР 50 мкМ ингибитор ПКА 79.7+5.8% (п=5, р<0.05) 73.5±6.2% (п=5, р<0.05) 66.8+6.5% (п=8, р>0.05)

ООО 1мкМ ингибитор ГЦ 84.1±5.0% (п=5, р>0.05) 52.9±12.4% (п=4, р<0.05) 58.7±7.9% (и=5, р<0.05)

Ь-ЫАМЕ 100 мкМ блокатор Ш-синтазы - 70.9+4.8% (п=7, р<0.05) 64.3±1.2% (п=6, р<0.05)

гпРР-9 10 мкМ блокатор гемооксигеназы 83.9±4.2% (п=6, р<0.05) 71.3±5.3% (п=6, р<0.05) 67.1+8.0% (п=7, р<0.05)

пировиноградная к-та 100 мкМ антиоксидант 155.2±6.4% (п=5, р<0.05) 68.9±9.1% (1\=6, р<0.05) 86.0±4.1% (и=6. р<0.05)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы установили, что вызванные действием АТФ и аденозина изменения амплитуды ТКП прямопропорциональны изменениям силы сокращения скелетной мышцы. Известно, что запускающий сокращение потенциал действия мембраны мышечного волокна подчиняется закону «все или ничего», но инициирующий его при непрямой стимуляции постсинаптический потенциал градуален. Он зависим, как мы показали в данной работе, от аддитивного действия пуринов, и его в норме, видимо, становится недостаточно для получения потенциала действия в окружающих концевую пластинку участках мембраны большего числа мышечных фазных волокон.

Различия в синаптическом механизме, ответственные за специфику функционирования фазных и тонических скелетных мышц, заключаются в следующем. В нервно-мышечном синапсе фазных мышц АТФ угнетает выброс медиатора, активируя P2Y[2 рецепторы. Активирующий импульс переходит через Gl/a подтип ГТФ-белка на РС-фосфолипазу С, а потом на протеинкиназу С. Далее сигнализация проходит двумя параллельными путями: через производство перекиси водорода и через активацию фосфолипазы Аг, производство арахидоновой кислоты и посредством циклооксигеиазы синтез простагландина Е2, блокирующего кальциевые каналы нервной терминали. В то время как пресиналтический ингибиторный эффект аденозина на амплитуду ТКП и силу сокращения скелетных мышц осуществляется посредством активации А] аденозиновых рецепторов, сопряженных с A-типом К+-ка«алов, и А2а рецепторов (рис. 7).

В окончании нейрона синапса фазной мышцы амфибий внутриклеточная сигнализация, опосредованная P2Y)2 рецепторами, задействует больше метаболических звеньев, более эффективна, чем вызванная активацией аденозиновых рецепторов.

Рис. 7. Схема пуринергической регуляции мионевральной передачи фазных мышц позвоночных. Показано окончание мотонейрона. Показан синаптический пузырек - везикула, заполненная, помимо медиатора ацетилхолина, АТФ. Показан экзоцитоз содержимого везикул, гидролиз АТФ до аденозина в синаптической щели; активация аденозином пресинаптических А| и А2 рецепторов, а АТФ - Р2Уи рецепторов, и регуляция ими экзоцитоза по принципу обратной связи посредством пресинаптических внутриклеточных механизмов.

Облегчающее действие АТФ реализуется в синапсах тонических мышц посредством устранения неквантовой секреции при активации чувствительного к М-зтилмалеимиду ГТФ-белка и протеинкиназы С (рис. 8).

Рис. 8. Схема пуринергической регуляции мионевральной передачи тонических мышц позвоночных. Показано окончание мотонейрона. Показан синаптический пузырек - везикула, заполненная, помимо медиатора ацетилхолина (АХ), АТФ. Показан экзоцитоз содержимого везикул, активация АТФ Р2У рецепторов и регуляция ими экзоцитоза посредством иигибирования механизма неквантового освобождения АХ.

1. Впервые оценен вклад АТФ и аденозина как пресинаптических модуляторов в сократительную активность различных типов скелетной мускулатуры. В фазных скелетных мышцах холоднокровных и теплокровных животных АТФ и аденозин имеют сходное по результату пресинаптическое ингибиторное действие, при этом каждый из изученных пуринов имеет свои собственные независимые механизмы реализации этого действия. Результат аддитивного действия этих пуринов выражается в аккумуляции большей части силы фазной мускулатуры при произвольном усилии.

2. Впервые показано, что АТФ угнетает амплитуду токов концевой пластинки фазной скелетной мышцы, активируя Р2У|г рецепторы, которые передают активирующий импульс через 0,/„ подтип ГТФ-белка на РС-фосфолипазу С, а затем на протеинкиназу С. Далее сигнализация проходит двумя параллельными путями. Первый связан с производством перекиси водорода. Вторым является циклооксигеназный путь образования простагландина Еа, ингибирующего претерминальяый кальциевый так.

АТФ

выводы

3. Обнаружено, что аденозин снижает силу сокращения тонической мускулатуры, активируя аденозиновые рецепторы. Также, аденозин, влияя на А1 и Агл аденозиновые рецепторы, ингибирует функциональную активность фазных скелетных мышц.

4. Ионы бария снимают ингибиторный эффект аденозина путем усиления сигнализации Лгл-рецепторной системы.

5. Селективный агонист А1 аденозиновых рецепторов ССРА обладает большим угнетающим действием на амплитуду токов концевой пластинки. Ингибиторные эффекты как ССРА, так и аденозина устраняются при блокаде калиевых каналов А типа.

6. Аденозин не влияет на уровень неквантовой секреции медиатора ацетилхолина в мионевральном синапсе.

7. Ингибиторный эффект АТФ более выражен на силу сокращения медленной фазной мышцы крысы, чем быстрой фазной мышцы.

8. АТФ увеличивает силу сокращения тонических мышц, активируя Р2У рецепторы. АТФ в синапсах тонической мускулатуры теплокровных устраняет неквантовую секрецию медиатора ацетилхолина и не влияет на ее уровень в синапсах медленной и быстрой скелетных фазных мышц.

Список публикаций по материалам диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Grishin S.N. Role of adenosine receptors in modulation of synaptic transmission / S.N. Grishin, A.V. Galkin, E.G. Priazhnikov, E.M. Sokolova, R.A. Giniatullin // Neurophysiology. - 2002. - Vol. 34. - P. 155-157.

2. Sokolova E.M. Distinct receptors and different transduction mechanisms for ATP and adenosine at the frog motor nerve endings / Sokolova E.M., Grishin S.N., Shakirzyanova A.V., Talantova M.V., Giniatullin R.A. // Eur. J. Neuroscience. - 2003. - Vol. 18. - P. 12541264.

3. Grishin S. Mechanisms of ATP action on motor nerve terminals at the frog neuromuscular junction / S. Grishin, A. Shakirzyanova, A Giniatullin, R. AfzaJov, R. Giniatullin // Eur. J. Neuroscicnce. - 2005. - Vol. 21. - P. 1271-1279.

4. Ziganshin A.U. The influence of hypothermia on P2 receptor-mediated responses of frog skeletal muscle / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, L.E. Ziganshina, A.L. Zefirov, G. Burnstock// Eur. J. Pharmacol. - 2005. - Vol. 21. - P. 187-193.

5. Ситдикова Г.Ф. Пресинаптические эффекты монооксида углерода в мионевральном синапсе лягушки / Г.Ф. Ситдикова, С.Н. Гришин, А Л. Зефиров // Докл Акад. Наук -2005.-Т. 403.-С. 233-236.

6. Giniatullin A.R. Reactive oxygen species contribute to the presynaptic action of extracellular ATP at the frog neuromuscular junction / A.R. Giniatullin, S.N. Grishin, E.R. Sharifullina, A.M. Petrov, A.L. Zefirov, R.A. Giniatullin // J Physiol. - 2005. - Vol. 15. - P. 229-242.

7. Архипова О.В. Пресинаптические эффекты арахидоновой кислоты и простагландина Е2 в нервно-мышечном синапсе лягушки I О.В. Архипова, С.Н. Гришин, Г.Ф. Ситдикова, А.Л. Зефиров // Рос. Физиол. Журн. им. И.М.Сеченова. - 2005. - Т. 91.- № 3 - С 268276.

8. Grishin S.N. Different effects of ATP on the contractile activity of mice diaphragmatic and skeletal muscles / S.N. Grishin, A Y. Teplov, A.V. Galkin, A.M. Devyataev, A.L. Zefirov, M.A. Mukhamedyarov, A.U. Ziganshin, G. Burnstock, A. Palotas // Neurochemistry International. - 2006. - V. 49. - P. 756-763.

9. Mukhamedyarov M.A. Evidences for calcium-dependent inactivation of calcium current at the frog motor nerve terminal / M.A. Mukhamedyarov, S.N. Grishin, A.L. Zefirov, A. Palotas // Brain Research Bulletin. - 2006. - Vol. 69. - P. 652-655.

10. Гришин C.H. Механизм вызванного N-этилмалеимидом сокращения портняжной мышцы лягушки / С.Н. Гришин, АВ. Шакирзянова, А.Ю. Теплов, И.М. Фатхутдинов, В.В. Валиуллин, A.JI. Зефиров // Бюл. Эксперим. Биол. и Медицины. - 2006. - Т. 141. -№ 3. - С. 248-251.

11. Ziganshin A.U. Interaction of hydrocortisone with ATP and adenosine on nerve-mediated contractions of frog skeletal muscle / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, B.A. Ziganshin, G. Burnstock//Eur. J. Pharmacol. - 2009. - Vol. 607. - P. 54-59.

12. Камалиев P.P. Воздействие гидрокортизона, АТФ и аденозина на скелетную мышцу крысы / P.P. Камалиев, С.Н. Гришин, Ж.Ю. Фалу, А.У. Зиганшин // Казан. Мед. Журн. - 2009. - Т. 90. - № 4. - С. 556-559.

13. Гришин С.Н. Пуринергическая регуляция синаптической передачи фазных и тонических мышц позвоночных / С.Н. Гришин, О.Г. Морозов, В.И. Анфиногентов, P.P. Камалиев, Г.А. Морозов, А.У. Зиганшин // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2010. - Т. 12(33). - №4(3). - С. 710-713.

14. Гришин C.II. Разнонаправленное действие АТФ на силу сокращения тонической и фазной скелетных мышц лягушки / С.Н. Гришин, P.P. Камалиев, А.Ю. Теплов, А.У. Зиганшин //Бюл. Эксперим. Биол. и Медицины. -2011. - Т. 151. - К» 3. - С. 251-254.

Другие публикации:

15. Гришин С.Н. Кальциевый ток / С.Н. Гришин - Казань: Изд-во Казан, гос. техн. ун-та, 2010.-90 с.

16. Гришин С.Н. Взаимодействие пуринергических и холинергических механизмов синаптической передачи / С.Н. Гришин, А.Р. Гиниатуллин // Вестник РГМУ. - 2002. -Т. 22. - К» 1. - С. 127-128.

17. Гиниатуллин А.Р. Влияние глюкокортикоидных гормонов на модулирующие эффекты пуринов в нервно-мышечном соединении амфибий / А.Р. Гиниатуллин, С.Н. Гришин, A.B. Шакирзянова, P.A. Гиниатуллин // Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии: тезисы докладов II научной конференции с Международным участием. - Новосибирск. - 2002. - С. 39.

18. Гришин С.Н. Влияние катионов щелочно-земельных элементов на Ca''-зависимый ингибиторный эффект аденозинтрифосфата/ С.Н. Гришин, A.B. Галкин, АР. Гиниатуллин, Л.Х. Галеева, P.A. Гиниатуллин // Растущий организм - адаптация к физической и умственной нагрузке: VI Всероссийский симпозиум и школа семинара молодых ученых и учителей. - Казань. - 2002. - С. 59-60.

19. Ситдикова Г.Ф. Роль цикла арахидоновой кислоты в эффектах АТФ на нервномышечную передачу / Г.Ф. Ситдикова, С.Н. Гришин, О.В. Архипова, A.B. Яковлев, A.JI. Зефиров // Растущий организм - адаптация к физической и умственной нагрузке: VI Всероссийский симпозиум и школа семинара молодых ученых и учителей. - Казань. 2002. - С. 153-154.

20. Гришин С.Н. Активирующее действие пуринов на внутриклеточные посредники в синапсе мыши / С.Н. Гришин, A.B. Галкин, А.Р. Гиниатуллин, P.A. Гиниатуллин // Биология -наука XXI века: 6-я путинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино. - 2002. -С. 71.

21. Гиниатуллин А.Р. Влияние стероидных гормонов на ингибиторные эффекты пуринов при экспериментальном моделировании стрессового состояния / А.Р. Гиниатуллин, С.Н. Гришин, P.A. Гиниатуллин // Труды II международной научно-практической конференции Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования. - Витебск, Беларусь. - 2002. - С. 79-82.

22. Камалиев P.P. Определение величины периневрального кальциевого тока седалищного нерва лягушки методом сравнения / P.P. Камалиев, С.Н. Гришин // Вестник РГМУ-2003.-Т. 28. -№2.-С. 171.

23. Гришин C.II. Влияние блокаторов подтипов фосфолипазы С на ингибиторное действие пуринов в нервно-мышечном синапсе / С.Н. Гришин, А Р. Гиниатуллин, Г.Ф. Ситдикова, A.JI. Зефиров, Р.А. Гиниатуллин // Материалы II Международной конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности. - Москва. - 2003. - С. 52.

24. Yakovlev A.V. Targets and effects of nitric oxide (II) in synaptic transmission / A.V. Yakovlev, G.F. Sitdikova, S.N. Grishin, O.V. Arkhipova, A.L. Zefirov // Transmitters and guiding signals in the formation of cortical networks: 2nd inmed conference.- La Ciotat, France. - 2003. - P. 20-22.

25. Камалиев P.P. Анализ кальциевого периневрального тока седалищного нерва озерной лягушки / P.P. Камалиев, С.Н. Гришин // Биология - наука XXI века: 7-я пущинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино. - 2003. - С. 61.

26. Giniatullin R.A. The functional role of ATP receptors at the neuromuscular junction / R.A. Giniatullin, S.N. Grishin, E.M. Sokolova// International synaptogenesis meeting. - Vienna. -2003.-P. 21.

27. Arkhipova O.V. Role of cyclooxygenase pathway in the arachidonic acid effects on neuromuscular transmission / O.V. Arkhipova, G.F. Sitdikova, S.N. Grishin, A.V. Yakovlev A.L. Zefirov // Neuron Differentiation and Plasticity Regulation by Intercellular Signals.-Moscow. -2003.-P. 61.

28. Гришин С.Н. Влияние входящего мембранного тока двухвалентных катионов на эффекты пуринов у холоднокровных и теплоковных / С.Н. Гришин, Г.Ф. Ситдикова, A.JI. Зефиров // Фундаментальные и клинические аспекты ингегративной деятельности мозга: материалы Международных чтений, посвященных 100-летшо со Д[И рождения Э.А. Асратяна. - Москва. - 2003. - С. 79-80.

29. Giniatullin A R. Epinephrine prevents the depressant action of ATP / A.R. Giniatullin, S.N. Grishin, G.F. Sitdikova, A.L. Zefirov // Фундаментальные и клинические аспекты ингегративной деятельности мозга: материалы Международных чтений, посвященных 100-летию со дня рождения Э.А. Асратяна. - Москва. - 2003. - С. 70-71.

30. Архипова О.В. Эффекты циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания / О.В. Архипова, С.Н. Гришин, Г.Ф. Ситдикова, А.Л. Зефиров // Рецепция н внутриклеточная сигнализация: материалы международной конференции. - Пущино. 2003. - С. 21-24.

31. Галкин А.В. Калиевая природа ингибиторного действия аденозина на амплитуду токов концевой пластинки / А.В. Галкин, Л.В. Семенова, М.А. Мухамедьяров, В Т. Латыпова, П.К. Омарова, С.Н. Гришин // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: материалы международной конференции. - Пущино. - 2003. - С. 147-149.

32. Teplov A Y. ATP influence on mechanisms of the contraction and reception of mediator in mouse diaphragm muscle / A.Y. Teplov, S.N. Grishin, A.M. Deviataev, A.L. Zefirov // J. of Muscle Research and Cell Motility. - 2003. - V. 24. - № 4-6. - P. 332.

33. Гиниатуллин A.P. Экспериментальное моделирование стрессовых состояний: эффект стероидных гормонов на ингибирующее действие пуринов на процесс высвобождения нейротрансмиттера / А Р. Гиниатуллин, С.Н. Гришин, Р.А. Гиниатуллин, А Л. Зефиров // Нейроэндокринология - 2003: тезисы докладов Всероссийской конференции с Международным участием. - Санкт-Петербург. - 2003. - С. 178-180.

34. Теплов А.Ю. Изменение параметров N-этилмалеимид-вызванного сокращения скелетной мышцы активными формами кислорода / А.Ю. Теплов, С.Н. Гришин, А.В. Шакирзянова, Г.Ф. Ситдикова, А,Л. Зефиров // Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии; гистогенез и регенерация тканей. - Санкт-Петербург. - 2004. - С. 58-59.

35. Teplov A.U. Contractility and condition of postsynaptic membrane of mouse diaphragm and m.EDL: the role of ATP ) A.U. Teplov, S.N. Grishin, A.L. Zefirov И Патофизиология и современная медицина: вторая Международная конференция. - Москва. - 2004. - С 384-386.

36. Kamaliev R.R. Temperature regulates ATP inhibitory effect on responses of the frog skeletal muscle / R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, A.U. Ziganshin, A.L. Zefirov // Biological motility: International symposium. - Pushino. - 2004. - P. 33-35.

37. Sitdikova G.F. Effects of heme oxygenase inhibitor zinc protoporphyrine IX on spontaneous and evoked transmitter release in frog neuromuscular junction/ G.F. Sitdikova, S.N. Grishin, V.R. Bikeeva, G.R. Burhanova, E.R. Valiullina // Biological motility: International symposium. - Pushino. - 2004. - P. 65.

38. Teplov A.Y. ATP modulation of the contractility and condition of postsynaptic membrane of the mouse diaphragm and m. EDL / A.Y. Teplov, S.N. Grishin, A.L. Zefirov // Biological motility: International symposium. - Pushino. - 2004. - P. 159-161.

39. Бутинова H.B. Выявление протеинкиназа С - опосредованных эффектов сокращения мышц теплокровных / Н.В.Бугинова, С.Н. Гришин, А.Ю. Теплов, P.P. Сафин, В В. Валиуллин, АЛ. Зефиров // Растущий организм - адаптация к физической и умственной нагрузке: VII Всероссийский симпозиум и школа семинара молодых ученых и учителей. - Казань. - 2004. - С. 33-34.

40. Бикеева В.Р. Влияние протопорфирина на параметры вызванных и спонтанных синаптических ответов нервно-мышечного соединения амфибий / В.Р. Бикеева, Г Р. Бурханова, С.Н. Гришин, Г.Ф. Ситдикова, А Л. Зефиров // Биология - наука XXI века: 8-я путинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино. - 2004. - С. 103.

41. Гришин С.Н. Периневральные токи в нервном окончании двигательного нейрона озерной лягушки / С.Н. Гришин, Н.К. Хабибуллина, Л.Х. Галеева // Морф, ведом. -2004. - № 1-2. - С. 28.

42. Камалиев P.P. Температурная зависимость ингибиторного эффекта пуринов и ее влияние на параметры сокращения скелетной мускулатуры / P.P. Камалиев, С.Н. Гришин // Вестник РГМУ. - 2004. - Т. 34. - № 3. - С. 163.

43. Giniatullin R.A. Two-component action of ATP on transmitter release from the motor nerve endings at the neuromuscular junction / R.A. Giniatullin, S.N. Grishin, A.R. Giniatullin // The world of the synapse: molecular basis, pathologies and drug discovery.- Gif-sur-Yvette, France. - 2004. - P. 46.

44. Минлебаев М.Г. Изменение электрогенеза и секреции медиатора в двигательном нервном окончании при длительной ритмической активности / М.Г. Минлебаев, М.А. Мухамедьяров, C.1I. Гришин // Рос. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т. 90. -№ 8. - С. 264.

45. Гришин С.Н. Исследование механизма секреции квантов медиатора в синапсах тонических мышечных волокон лягушки / Гришин С.Н., Бутинова Н.В., Камалиев P.P., Зиганшин Б.А. // Санкт-Петербургские научные чтения: Международный молодежный медицинский Конгресс. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 58-59.

46. Бикеева В.Р. Влияние монооксида углерода на спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки/В.Р. Бикеева, Г.Ф. Ситдикова, С.Н. Гришин, А Л. Зефиров // Физиология мышц и мышечной деятельности: Материалы III, Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности, посвященной МГУ им. М.В.Ломоносова. - Москва. - 2005. -С. 6.

47. Камалиев P.P. Влияние АТФ на сокращения медленной скелетной мышцы / P.P. Камалиев, Б.А.Зиганшин, С.Н. Гришин, А.Л. Зефиров, А.У. Зиганшин // Физиология мышц и мышечной деятельности: Материалы III, Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности, посвященной МГУ им. М.В.Ломоносова. - Москва. - 2005. - С. 19.

48. Бутинова H.B. Сократительные особенности быстрых и медленных мышц крысы / Н.В. Бутинова, P.P. Сафин, С.Н. Гришин, В В. Валиуллин//Молодые ученые в медицине: X Всероссийская научно-практическая конференция. - Казань. - 2005. - С. 215.

49. Зиганшин А.У. Гидрокортизон и эпинефрин отменяют модулирующее действие АТФ на сократимость скелетной мышцы озерной лягушки / А.У. Зиганшин, P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин, С.Н. Грншип, AJI. Зефиров // Научные труды I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». - Сочи. - М.: Медицина «Здоровье». - 2005 -С. 120.

50. Мухамедьяров М.А. Изменение кальциевого тока двигательного нервного окончания при высокочастотной активности синапса / М.А. Мухамедьяров, С.Н. Гришин, М.М. Абдрахманов // Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей.

- Санкт-Петербург. - 2005. - С. 79-80.

51. Теплое АЛО. Роль протеишашазы С в механизмах влияния АТФ на сокращение полоски диафрагмы мыши in vitro / А.Ю. Теплов, С.Н. Гришин, A.JI. Зефиров // Бюл. Сиб. Медицины. - Т. 4. Приложение 1. - 2005. - С. 120-121.

52. Теплов А.Ю. Механизмы влияния белковой сенсибилизации на сократительную функцию изолированной т. EDL мыши / А.Ю. Теплов, С.Н. Гришин, AJI. Зефиров // Материалы Iii Международной конференции «Болезни цивилизации в аспекте учения

B.И.Вернадского». - Москва. -2005. - С. 315-317.

53. Камалиев P.P. Влияние гидрокортизона на Р2-рецептор-опосредованную модуляцию активности скелетной мышцы / P.P. Камалиев, Б.А. Зиганшин, С.Н. Гришин, А.У. Зиганшин // Тезисы I конференции «Качественное использование лекарств и фармаконадзор» с международным участием. - Казань. - 2005. - С. 207-208.

54. Giniatullin R. Two-component action of ATP on transmitter release from the motor nerve endings at the neuromuscular junction / R. Giniatullin, S. Grishin, A. Giniatullin // J. of Physiol.

- Paris - 2006. - Vol. 99. - Issues 2-3.

55. Гришин С.Н. Изменение параметров сокращения быстрой и медленной мышц крысы при спинальном шоке / С.Н. Гришин, Н.В. Бутинова, В.В. Валиуллин // Управление движением: Материалы I Всероссийской, с международным участием, конференции по управлению движением. - Великие Луки. - 2006. - С. 24.

56. Giniatullin A.R. Redox dependent action of ATP / A.R. Giniatullin, S.N. Grishin, A.M. Petrov, A L. Zefirov, R.A. Giniatullin // 5,k Forum of European neuroscience, FENS Forum Abstracts. - Vienna, Austria. - 2006. - P.457.

57. Гришин C.H., Камалиев P.P., Зиганшин А.У. Влияние АТФ на тонические мышечные волокна озерной лягушки / С.Н. Гришин, P.P. Камалиев, А.У. Зиганшин // Сборник докладов XX Съезда Физиологического Общества им. И.П. Павлова, - Москва. - 2007. -

C. 204.

58. Kamaliev R.R. Hydrocortisone interaction with P2 receptors in the frog skeletal muscle / R.R. Kamaliev, B.A. Ziganshin, A.U. Ziganshiti, S.N. Grishin // PENS summer course. - Kazan. -

2007.-P. 14-15.

59. Теплов А.Ю. Механизмы изменения сократительной функции различных скелетных мышц мыши in vitro в условиях иммунобиологической перестройки организма / А.Ю. Теплов, С.Н. Гришин // Научные труды II Съезда физиологов СНГ. - Кишинев, Молдова. -

2008.-С. 172.

60. Еремеев A.A. Сократительные характеристики трехглавой мышцы голени крысы в условиях опорной разгрузи! / A.A. Еремеев, Т В. Балтина, И.Н. Плещинский, С.Н. Гришин, М.А. Чеботарев // В сб.: «Управление движением. Северное измерение». - Петрозаводск: Изд.-во Петр ГУ. - 2008. - С. 39-41.

61. Фархутдинов A.M. Влияние экзогенной АТФ на сократительную функцию и состояние постсцнаптической мембраны изолированных скелетных мышц мыши / А.М.Фархутдинов, С.Н.Гришин, А.Ю.Теплов // Мед. Вестник Башкортостана. - Т.4. - №2. - 2009 - С 189-192.

62. Фархутдинов А.М. Механизмы изменения функциональных свойств поперечнополосатых мышц в условиях аллергической перестройки организма / А,М. Фархутдинов, С.Н. Гришин, А.Ю. Теплов // Рос. Аллерголог. Журн. - 2009. - № 3. - С. 308.

63. Гришин С.Н. Изменение силы сокращения камбаловидной мышцы крысы под действием крайне высокочастотного излучения in vivo / С.Н.Гришин, О.Г.Морозов, А.А.Еремеев, Г.А.Морозов // Управление движением. Материалы III Всероссийской с международным участием конференции по управлению движением. - Великие Луки. - 2010. - С. 73-74.

64. Гришип С.Н. Особенности пуринергической синаптической регуляции функционального состояния фазных и тонических мышц позвоночных / С.Н.Гришин // Материалы X юбилейной Всероссийской научной конференции с международным участием "Физиологические механизмы адаптации растущего организма". - Казань. - 2010 - С 57-62.

65. Гришин С.Н. Влияние АТФ на неквантовую секрецию ацегилхолина в синапсах тонической и фазной мышц крысы / Гришин С.Н. // Сборник докладов XXI Съезда Физиологического Общества им. И.П. Павлова. - Калуга. - 2010. - С. 163.

Работа выполнена при финансовой поддержке: грантов РФФИ (01-04-06307-мас; 02-04-49944; 02-04-06И5-мас; 03-04-06453-мас; 03-04-48379; 06-04-49120; 09-04-00573), регионального гранта РФФИ 03-04-96252; МК-2081.2003.04; НИОКР 03-3.8-92/2002(Ф); гранта ШТАБ 99-1147.

Список использованных сокращений:

2-МеЭАДФ - 2-метилтиоаденозин-5'-дифосфорная кислота;

8-SPT — 8-пара-сульфофенилтеофиллин;

АДФ - аденозин-5'-дифосфорная кислота;

АМФ - аденозш1-5'-монофосфорная кислота;

АТФ - аденозин-5'-трифосфорная кислота;

АТФуБ - аденозин 5'-0-(3-тиотрифосфат);

АФК - активные формы кислорода;

АХ - ацетилхолин;

КАТФ - АТФ-чувствительные К+ каналы; МТКП - миниатюрный ток концевой пластинки; МПП - мембранный потенциал покоя; ПГЕг - простагландин Ei; , ПКА - протешшшаза А; ПКВ - протеинкиназа В; ПКС - протеинкиназа С; СЭП - стимуляция электрическим полем; ТКП - ток концевой пластинки; ТЭА - тетраэтиламмоний; УДФ - уридин-5'-дифосфорная кислота; УТФ - уридин-5'-трифосфорная кислота; ФЛАг - фосфолипаза Аг; ФЛС - фосфолипаза С; Ф.ГШ - фосфолипаза D; ЦОГ - циклооксигеназа; ССРА - 2-хлоро-К6-циклопентил-аденозин;

CGS21680 - 2-[р-(2-карбонил-эшл)-фенилэтиламино]-5'-Лг-этнлкарбоксамидоаденозин;

СО - монооксид углерода;

DPCPX - 1,3-дипропил-8-циклопентилксантин;

I ЬОг - перекись водорода;

L-NAME - Л""-нитро-1.-аргинин метиловый эфир;

ra.EDL - мышца длинный разгибатель пальцев (musculus extensor digitorum longus); NO - монооксид азота; ЮМ - N-этилмалеимид;

OB АА - 4-(4-октадесуфенул)-4-о-бутеноидная кислота;

PPADS - пиридоксальфосфат-б-азофенил-2'4'-дисульфоновая кислота;

SNAP - 5-нитрозо-Ы-ацетилпеницилламин;

ZnPP-9 - цинк (II) протопорфирин.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность за содействие в научной работе доктору медицинских наук, профессору Гиниатуллину Pauiudy Асхатовичу, заместителю председателя Казанского научного центра РАН по научной работе, доктору медицинских наук, члену-корреспонденту РАН Никольскому Евгению Евгеньевичу, заведующему кафедрой нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета, доктору медицинских наук, члену-корреспонденту РАМН Зефирову Андрею Львовичу; заведующему кафедрой ТМС Казанского национального исследовательского технического университета им. А.Н. Туполева - КАИ, доктору технических наук, профессору Морозову Олегу Геннадьевичу и директору Научно-исогедовагельского цыпра ПРЭ Казанского национального исследовательского технического университета им. А.Н. Туполева - КАИ, доктору технических наук, профессору Морозову Геннадию Александровичу.

Подписано в печать 07.09.2011. Бумага офсетная. Гарнитура "Тайме". Формат 60x90,,,,.,. Усл.печл. 2,0. Уч.-изд.л. 2,25. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 09/18. Издательство ЗАО "Новое знание". 420029, г.Казань, ул.Сибирский тракт, 34, корп.Ю, оф.6., а/я 25.

Отпечатано с готового оригинал-макета на полиграфическом участке ЗАО "Новое знание". 420029, г.Казань, ул.Сибирский тракт, 34.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гришин, Сергей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ПУРИНЫ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ.

2.1.1. История изучения.

2.1.2. Классификация пуринорецепторов.

2.1.3. Аденозиновые (PI) рецепторы.

2.1.4. Р2-рецепторы.

2.1.4.1. Р2Х-рецепторы.18"

2.1.4.2. Р2Y-рецепторы.

2.1.5. Вовлечение PI- и Р2-рецепторов в сокращение скелетных мышц.

2.1.6. Пресинаптические эффекты АТФ.

2.1.7. Аддитивность эффектов АТФ и аденозина.

2.2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ.

2.2.1. Роль цАМФ-зависимой системы во внутриклеточной сигнализации.

2.2.2. Роль цГМФ-зависимой системы во внутриклеточной сигнализации.

2.2.3. Роль ионов кальция во внутриклеточной сигнализации и связанных с ними внутриклеточных рецепторов.

2.2.4. Роль метаболитов фосфолипазы С во внутриклеточной сигнализации.

2.2.5. Роль системы арахидоновой кислоты во внутриклеточной сигнализации.

2.2.6. Роль системы фосфолипазы D во внутриклеточной сигнализации.

2.2.7. Роль и мишени оксида азота II.

2.2.8. Роль и мишени оксида углерода II.

2.2.9. Роль и мишени перекиси водорода.

2.3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ.

2.3.1. Классификация и типы мышечных волокон позвоночных.

2.3.2. Фазные мышцы.

2.3.3. Тонические мышцы.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Миографические эксперименты с мышцами озерной лягушки.

3.2. Миографические эксперименты с мышцами крысы.

3.3. Регистрация спонтанных и вызванных токов концевой пластинки.

3.4. Оценка величины неквантовой секреции.

3.5. Прямая регистрация кальциевых токов нервного окончания методом периневрального отведения.

3.6. Использованные вещества.

3.7. Анализ данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. ЭКСПЕРИМЕНТЫ С ТОНИЧЕСКОЙ МУСКУЛАТУРОЙ.

4.1.1. ДЕЙСТВИЕ АДЕНОЗИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТОНИЧЕСКИХ МЫШЦ.

4.1.1.1. Действие аденозина на параметры сокращения т. cruralis лягушки

4.1.1.2. Действие аденозина на параметры сокращения т. rectus lateralis крысы.

4.1.1.3. Действие аденозина на параметры миниатюрных токов т. rectus lateralis крысы.

4.1.1.4. Действие аденозина на уровень неквантовой секреции т. rectus lateralis крысы.

4.1.1.5. Выявление класса рецепторов пуринов, задействованного в эффекте аденозина.

4.1.1.6. Выявление участия вторичных посредников в эффекте аденозина.79 4.1.2. ДЕЙСТВИЕ АТФ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТОНИЧЕСКИХ МЫШЦ.

4.1.2.1. Действие АТФ на параметры сокращения т. cruralis лягушки.

4.1.2.2. Действие АТФ на параметры сокращения т. rectus lateralis крысы

4.1.2.3. Действие АТФ па параметры миниатюрных токов т. rectus lateralis крысы.

4.1.2.4. Действие АТФ на уровень неквантовой секреции т. rectus lateralis крысы.

4.1.2.5.' Выявление семейства Р2 рецепторов, задействованных в эффекте атф.:.;.

4.1.2.6. Выявление участия вторичных посредников в эффекте АТФч.

4.2. ЭКСПЕРИМЕНТЫ С ФАЗНОЙ'МУСКУЛАТУРОЙ'.

4.2.1. ДЕЙСТВИЕ АДЕНОЗИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ФАЗНЫХ МЫШЦ.'.

4.2.1.1. Действие аденозина на уровень неквантовой секреции т. EDL и камбаловидной мышцы крысы.

4.2.1.2. Действие аденозина на параметры.сокращения т. EDL и " камбаловидной мышцы крысы.

4.2.1.3. Действие аденозина на параметры сокращения портняжной мышцы лягушки.'.

4.2.1.4. Действие аденозина на параметры миниатюрных токов концевой пластинки т. EDL и камбаловидной мышцы крысы.

4.2.1.5. Действие аденозина на параметры миниатюрных токов концевой пластинки портняжной мышцы лягушки.

4.2.1.6. Действие аденозина на параметры вызванных токов концевой пластинки портняжной мышцы лягушки.

4.2.1.7. Действие аденозина на параметры периневрального тока.

4.2.1.8. Эффекты антагонистов аденозиновых рецепторов.

4.2.1.9. Выявление участия вторичных посредников в эффекте аденозина.

4.2.1.9.1. Определение типа ГТФ-белка, сопряженного с пресинаптическими аденозиновыми рецепторами.

4.2.1.9.2. Роль фосфолипаз Аг, С и D; аденилатциклазы и гуанилатциклазы в действии аденозина.

4.2.1.9.3. Роль перекиси водорода, монооксидов азота и углерода в действии аденозина.

4.2.1.10. Влияние блокаторов калиевых ионных каналов на эффект аденозина.

4.2.1.10.1. Влияние калиевых каналов А типа на эффект аденозина.

4.2.1.10.2. Роль других типов калиевых каналов.

4.2.1.10.3. Влияние ионов бария на эффект аденозина.

4.2.1.11. Зависимость эффекта аденозина от значения потенциала действия нервного окончания.

4.2.1.12. Эффекты агонистов аденозиновых рецепторов.

4.2.2. ДЕЙСТВИЕ АТФ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ФАЗНЫХ МЫШЦ.

4.2.2.1. Действие АТФ на уровень неквантовой секреции т. EDL и камбаловидной мышцы крысы.

4.2.2.2. Действие АТФ на параметры сокращения т. EDL и камбаловидной мышцы крысы.

4.2.2.3. Действие АТФ на параметры сокращения портняжной мышцы лягушки.

4.2.2.4. Действие АТФ на параметры миниатюрных токов концевой пластинки т. EDL и камбаловидной мышцы крысы.

4.2.2.5. Действие АТФ на параметры миниатюрных токов концевой пластинки портняжной мышцы лягушки.

4.2.2.6. Действие АТФ на параметры вызванных токов концевой пластинки портняжной мышцы лягушки.

4.2.2.7. Действие АТФ на параметры периневрального тока.

4.2.2.8. Выявление подтипа пресинаптического Р2 рецептора, задействованного в эффекте АТФ.

4.2.2.8.1. Эффекты агонистов и антанистов Р2Х рецепторов.

4.2.2.8.2. Выявление подтипа пресинаптического P2Y рецептора, задействованного в эффекте АТФ.

4.2.2.9. Исследование участия вторичных посредников в эффекте АТФ .157 4.2.2.9.1. Влияние ингибитора фосфолипазы D на эффект АТФ.

4.2.2.9.2. Влияние ингибитора РС-фосфолипазы С на эффект АТФ

4.2.2.9.3. Влияние ингибитора Р1-фосфолипазы С на эффект АТФ.

4.2.2.9.4. Влияние ингибитора протеинкиназы С на эффект АТФ.

4.2.2.9.5. Влияние ингибиторов фосфолипазы Аг на эффект АТФ.

4.2.2.9.6. Влияние ингибиторов циклооксигеназы на эффект АТФ.

4.2.2.9.7. Влияние арахидоновой кислоты и простагландина Ег на синаптические токи.

4.2.2.9.8. Роль перекиси водорода, монооксидов азота и углерода в действии АТФ.

4.2.2.9.9. Воспроизведение специфическим активатором протеинкиназы С ингибиторного эффекта АТФ.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пуринергическая синаптическая модуляция сокращения различных типов скелетных мышц"

Актуальность исследования.

Синаптическая модуляторная функция макроэргической молекулы аденозин-5'-трифосфата (АТФ) была открыта лишь в конце прошлого века, причем первоначально ей предпосылалось значение только как предшественника синаптически активного аденозина [Redman, Silinsky, 1996]. В последующем, работами других исследователей было доказано собственное модуляционное действие АТФ по принципу отрицательной обратной связи в синапсах фазных мышц амфибий [Гиниатуллин, Соколова, , 1998]. Выделяясь из синаптических ' везикул нервного' окончания мотонейрона совместно с основным медиатором ацетилхолином (АХ), АТФ угнетает.секрецию AX [Ziganshin et al., 2005].

АТФ'угнетает квантовую [Giniatullin & Sokolova, 1998] и неквантовую [Galkin ct al.,. 2001; Маломуж, Никольский^ 2010] секрецию медиатора; из пресинаптических окончаний мотонейронов; действуя на,Р2-рецепторы, в то время как конечный продукт ее распада - аденозин реализует свое действие через аденозиновые рецепторы. Аденозиновые рецепторы являются: по структуре метаботропными. Различают Аь А2д, А2в и А3 подтипы аденозиновых рецепторов. Р2-рецепторы, агонистом которых является АТФ, делятся на ионотропные - Р2Х(].7) и метаботропные - P2Y(i,2;4,6,i i-ы) подтипы. [Зиганшин, Зиганшина, 2009]: Выявление конкретных подтипов задействованных аденозиновых и Р2-рецепторов, их фармакологическая характеристика являются начальными этапами изучения, эффекторных механизмов: синаптической> регуляции пуринами- функции различных типов скелетных мышц.

Sokolova et al„ 2003]. В тех немногих работах [Salgadc et al, 2000], где опыты ставились „а теплокровных животных, эксперименты проводились, руководствуясь удобством препарирования, на синапсах диафрагмы, что не может быть экстраполировано как типичное воздействие пуринов „а все

Фазные скелетные мышцы теплокровных. Кроме того, в упомянутых исследованиях синаптические эффекты пуринов не сопоставлялись с изменениями параметров сократительной активности самой-мышцы. Также нет данных о роли АТФ и-ее производных в аккумуляции,мышечных усилий позвоночных, скрадывающей до двух третьих от абсолютных силовых возможностей [Hettinger, 1961]. Остается обойденной вниманием такая важная, пусть „ не столь распространенная, тоническая мускулатура теплокровных, например, мЫШцы среднего уха и мышцы, приводящие глазное яблоко. Не изучена пуринергическая синаптическая регуляция тонических мышц холоднокровных животных, представленных в большем количестве в их организме.

Цель и основные задачи исследования.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить эффекты АТФ и аденозина на параметры сокращения скелетных мышц различных типов.

5. Исследовать влияние агонистов пуриновых рецепторов на амплитуду токов концевой пластинки и параметры пресинаптических токов нервного окончания мотонейронов, иннервирующих фазные мышечные волокна озерной лягушки.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые были выявлены различия в синаптическом механизме, ответственные за специфику функционирования фазных и тонических скелетных мышц, а также отличие в степени угнетающего действия АТФ на силу сокращения быстрой и медленной фазных мышц теплокровных.

Были определены подтипы аденозиновых и Р2-рецепторов, вовлеченных в модуляцию мионевральной передачи синапсов фазных мышц позвоночных. Изучена задействованная в ингибиторном эффекте АТФ- цепь внутриклеточных вторичных посредников. Выявлены ее последовательные и параллельные звенья. Обнаружено, что конечным- последовательным метаболическим звеном является протеинкиназа С, после которой эффекторная линия внутриклеточных вторичных посредников раздваивается. При этом за ингибиторный эффект активаторов этого фермента (АТФ и РМА) на кальциевый ток ответственна циклооксигеназная ветвь метаболизма арахидоновой кислоты. Кальцийнезависимое снижение квантового состава связано с синтезом перекиси водорода.

Впервые показано, что аденозин активирует сразу два подтипа аденозиновых рецепторов: А! и А2Л. Обнаружено, что второй подтип рецепторов чувствителен к селективному агонисту А2л рецепторов cgs21680 и ионам бария. Найдено, что селективный агонист А] аденозиновых рецепторов ССРА обладает более выраженным угнетающим действием на амплитуду ТКП, чем аденозин, при этом его эффект устранялся блокадой калиевых каналов А типа. Установлено отсутствие участия в эффектах аденозина каких либо известных внутриклеточных посредников и ионных каналов, кроме А типа калиевых каналов.

Положения, выносимые на защиту:

1. АТФ и аденозин участвуют в пресинаптической модуляции сократительной активности различных типов скелетной мускулатуры. АТФ и аденозин имеют сходное по эффекту пресинаптическое ингибиторное действие на функциональное состояние фазных скелетных мышц холоднокровных и теплокровных животных, при этом каждый из изученных пуринов имеет свои особенности в механизме реализации этого действия. Аденозин оказывает угнетающее действие и на двигательную единицу тонических мышц, а АТФ, напротив, обладает облегчающим эффектом для этой ткани.

2. В механизм реализации пресинаптического действия АТФ в фазных мышцах вовлекаются Р2У рецепторы, РС-фосфолипаза С, протеинкиназа С, синтез перекиси водорода и простагландина Е2. В тонических мышцах приводящий к устранению неквантовой секреции медиатора эффект АТФ опосредуется также пресинаптическими Р2У рецепторами и протеинкиназой С.

3. Пресинаптическое действие аденозина в фазных мышцах, складывающееся из активации А] аденозиновых рецепторов, сопряженных с А-типом калиевых каналов, и А2а рецепторов, приводит к результирующему ингибиторному эффекту на амплитуду токов концевой пластинки и силу сокращения.

Научно-практическая ценность.

Полученные данные вскрывают новые аспекты функционирования нервно-мышечного синапса, свидетельствуя о важной роли; наряду с уже известными звеньями, пуриновых механизмов. Эти данные могут служить основой для понимания возможных взаимодействий пуринергических агентов с системами других первичных посредников.

Определение подтипов аденозиновых и Р2-рецепторов, задействованных, в пресинаптическойпуринергической регуляции, позволит направить работу по синтезу новых эффективных фармакологических агентов, модулирующих мионевральную передачу.

Особо важным представляется обнаружение потенцирующего действия АТФ в синапсах тонических мышц позвоночных, что может обеспечивать присущую только этому типу мускулатуры возможность долговременной контрактуры.

Апробации работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговой конференции Казанского научного центра РАН (Казань, 2002); II научной конференции с Международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); II международной научно-практической конференции «Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования» (Витебск, Беларусь, 2002); VI, VII и X Всероссийских научных конференциях с международным участием «Физиологические механизмы адаптации растущего* организма» (Казань, 2002, 2004, 2010); 6, 7, 8-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2004); II, Ш< и VI Всероссийских с международным участием школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2011); International synaptogenesis meeting (Вена, Австрия, 2003); Международном симпозиуме «Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals (Москва, 2003); Международных чтениях «Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга: материалы» (Москва, 2003); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003); Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология» (Санкт-Петербург, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004); Интернациональных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, 2004, 2006, 2008); Научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии; гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004); II международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004); conference «The world of the synapse: molecular basis, pathologies and drug discovery» (Жиф-сюр-Ивет, Франция, 2004); V общероссийский съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт

Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2005); X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005); IX Всероссийской школы «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2005); III Международной конференции «Болезни цивилизации в аспекте учения В.И.Вернадского» (Москва, 2005); I конференции с международным участием «Качественное использование лекарств и фармаконадзор» (Казань, 2005); I и III Всероссийских с международным участием конференциях «Управление движением» (Великие Луки, 2006, 2010); PENS summer course (Казань, 2007); XX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Гришин, Сергей Николаевич

Результаты исследования рекомендуется использовать в учебном процессе при изучении биофизики и нормальной физиологии в разделе "синаптическая передача возбуждения" и фармакологии в разделе "механизмы действия лекарственных средств".

Работа выполнена при финансовой поддержке: грантов РФФИ (01-04-06307-мас; 02-04-49944; 02-04-06115-мас; 03-04-06453-мас; 03-04-48379; 0604-49120; 09-04-00573), регионального гранта РФФИ 03-04-96252; МК-2081.2003.04; НИОКР 03-3.8-92/2002(Ф); гранта ШТА8 99-1147.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гришин, Сергей Николаевич, Казань

1. Ахметзянов Р.Х. Измерение силовых характеристик мышечных волокон с помощью фотоэлектрического преобразователя / Р.Х. Ахметзянов, Е.Б. Филиппов // Физиол. журн. СССР. 1986. - -Т.72, -№3, -С.387-390.

2. Ашмарин И.П. Нейрохимия / И.П. Ашмарин, П.В. Стукалов.- М.: Изд. Инст. биомедиц. хим. РАМН.- 1996.- 469 с.

3. Блохина Г.И. Исследование механизма секреции квантов медиатора в синапсах тонических мышечных волокон лягушки / Г.И. Блохина, A.JI. Зефиров //ВИНИТИ. 1982. - № 5159-84. с. 1-17.

4. Блохина Г.И. Электрофизиологическое и морфологическое исследование синаптической организации тонических мышечных волокон лягушки / Г.И.Блохина, А.Л.Зефиров // Физиол. журн. СССР. -1984. T.LXX. - №2. С. 157-165.

5. Валиуллин В.В. Нейротрофический контроль синтеза миозинов медленной мышцы морской свинки / В.В. Валиуллин, P.P. Исламов, М.Е. Валиуллина, Г.И. Полетаев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1991. - T.l 11, N 2. - С.201-203.

6. Волкова И.Н. Блокирование потенциалов действия и сокращения скелетной мышцы лягушки поперечным рассечением / И.Н. Волкова, Е.Е. Никольский, Г.И. Полетаев // Физиол. журн. СССР. 1975. - Т.61. -№9,,С.1433-1436.

7. Гинецинский А.Г. Влияние симпатической нервной системы на функции поперечнополосатой мышцы / А.Г. Гинецинский // Русский физиологический журнал. 1923. - Т. 6. - С. 1-3.

8. Горен А.К.Ф. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота / А.К.Ф. Горен, Б. Майер // Биохимия. 1998. - Т. 63. Вып. 7. - С. 870-880.

9. Давиденко Д.Н. Проблема резервов адаптации организма спортсменов / Д.Н. Давиденко // Ученые записки университета им. П.Ф.Лесгафта. — 2005.-№ 18.-С. 15-24.

10. Жуков Е.К. К вопросу об эволюции физиологических механизмов тонуса в ряду позвоночных. — В кн.: Проблемы эволюции функций и энзимохимии процессов возбуждения. М.: Изд. АН СССР. — 1961. - С. 128-139.

11. Жуков Е.К. Влияние аденозинтрифосфорной кислоты и ингибиторов обмена веществ на тетанус и контрактуру скелетных мышц / Е.К. Жуков // Цитология. 1965. - Т. 7. - С. 510-520.

12. Жуков E.K. Кальциевый обмен через мембрану саркоплазматического ретикулума в фазных и тонических мышечных волокнах. — Биофизика. 1968.-Т. 13.-С. 354-357.

13. Жуков Е.К. Очерки по нервно-мышечной физиологии. JL: Наука. -1969.-288 с.

14. Зефиров A.J1. Эффекты экзогенного N0 на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания / A.JI. Зефиров, P.P. Халиуллина, A.A. Анучин // Бюлл. эксперимен. биол. и мед. 1999. - ' Т.128. - №8. - С.144-147.

15. Казанский В.В. Методика изготовления "самозаполняющихся" микроэлектродов / В.В. Казанский // Физиол. журнал СССР. 1973. - Т. 59, №6. - С. 695-696.

16. Костюк П. Г. Кальций и клеточная проводимость. М.: Наука. - 1986. -256 с.

17. Костюк П. Г. Микроэлектродная техника / П. Г. Костюк Киев: Hayкова думка, 1960. - 175 с.

18. Кривой И.И. Роль К+-каналов и Na+-, К+-АТР-азы в гиперполяризации мембраны скелетных мышечных волокон, вызываемой ацетилхолином / И.И. Кривой, Е.В. Лопатина, В.В. Кравцова // Биологические мембраны. 2001. - Т. 18. - С. 10-15.

19. Крутецкая З.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации / З.И. Крутецкая, O.E. Лебедев, Л.С. Курилова Спб.: Изд-во С.Петер. Ун-та. -2003.-С. 208.

20. Мавринская Л.Ф. Экстрафузальные мышечные волокна, их типы и биологическая характеристика / Л.Ф. Мавринская, Н.П. Резвяков // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1978. - № 11. - С. 23-40.

21. Маломуж А.И. Неквантовая секреция ацетилхолина из двигательных нервных окончаний: молекулярный механизм, физиологическая роль, регуляция / А.И. Маломуж, Е.Е. Никольский // Нейрофизиология. -2007. Т. 39. - № 4/5. - С. 352-363.

22. Маломуж А.И. Неквантовое освобождение медиатора: миф или реальность? / А.И. Маломуж, Е.Е. Никольский // Успехи физиологических наук. 2010. - Т. 41. - № 2. - С. 27-43.

23. Матюшкин Д.П. О наличии фазных и тонических нейромоторных единиц в глазодвигательном аппарате кролика / Д.П. Матюшкин // Физиол. ж. СССР. 1961. - Т.47. - С. 960-976.

24. Мухамедьяров М.А. Влияние блокаторов потенциалзависимых и кальцийактивируемых К+-каналов на развитие облегчения нервно-мышечной передачи / М.А.Мухамедьяров, М.Г.Минлебаев, А.Л.Зефиров // Бюлл. эксперимен. биол. и мед. 2004. - № 4. - С. 364368

25. Наследов Г.А. Тоническая мышечная система позвоночных / Г.А. Наследов. Л.: Наука. - 1981. - 187 с.

26. Ноздрачев А. Д. Анатомия крысы (Лабораторные животные) / А. Д. Ноздрачев, Е. Л. Поляков // Под ред. академика А. Д. Ноздрачева. — СПб.: Издательство «Лань». 2001. — 464 с.

27. ЗЗ.Орбели Л.А. Симпатическая иннервация скелетных мышц / Л.А. Орбели // Бюлл. Инст. им. П.Ф.Лесгафта. 1923. - Т. 6. - С. 194-197.

28. Радзюкевич Т.Л. Взаимоотношение пре- и постсинаптических элементов в нервно-мышечных окончаниях разного функционального профиля у лягушки Rana temporaria / Т.Л. Радзюкевич // Журн. эвол. биох. и физиол. -1994. -Т.30. №3. - С. 420-423.

29. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник / А.А. Сосунов // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6. - № 12.- С. 27-34.

30. Теплов А.Ю. Роль протеинкиназы С в механизмах влияния АТФ на сократительную функцию изолированной полоски диафрагмы мыши / А.Ю. Теплов, С.Н. Гришин, A.JI. Зефиров, А.У. Зиганшин // Бюлл. эксперимен. биол. и мед. 2006. - Т. 141. - №4. - С. 389-392.I

31. Терентьев П.В. Лягушка / П. В.Терентьев; под ред. М. А. Воронцова. -Москва: Советская наука. 1950. - 344 с.

32. Шамарина Н.М. Синаптическая передача в тонических и нетонических мышцах / Н.М. Шамарина. М.: Наука. - 1971. -283 с.

33. Abbracchio М.Р. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? / M.P. Abbracchio, G. Burnstock // Pharmacol Ther. 1994. -V. 64. - №. 3. - P. 445-475.

34. Abbracchio M.P. Purinergic and pyrimidinergic signalling / M.P. Abbracchio, M. Williams'// Springer, Berlin; New York. 2001. - V. 151/1.- P. 289-304.

35. Alberts B. Molecular Biology of the Cell / B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M.Raff, K. Roberts, P. Walter // Garland Science. 2008. - P. 1392 .

36. Alexander S.P. Guide to Receptors and Channels / S.P. Alexander, A. Mathie, J.A. Peters // Br J Pharmacol. 2008. - V. 153 Suppl 2.- P. SI-209.

37. Amisten S. ADP mediates inhibition of insulin secretion by activation of P2Y13 receptors in mice / S. Amisten, S. Meidute-Abaraviciene, C. Tan, B.

38. Olde, I. Lundquist, A. Salehi, D. Erlinge // Diabetologia. 2010. - V. 53. -P. 1927-1934.

39. Anderson A.J. Effects of charybdotoxin, a blocker of Ca2+-activated K+ channels on motor nerve terminals / AJ. Anderson, A.L. Harvey, E.G. Rowan, P.N. Strong // Br.J. Pharmacol. 1988. - V.95. - P.1329-1335.

40. Andreopoulos S. Molecular aspects of soluble guanylyl cyclase regulation / S. Andreopoulos, A. Papapertropoulos // General Pharmacology. 2000. -V.34. - P. 147-157.

41. Angaut-Petit D. Membrane currents in lizard motor nerve terminals and nodes of Ranvier / D. Angaut-Petit, E. Benoit, A. Mallart // Pflugers Arch.,-1989. V.415. -P.81-87.

42. Anglister L. Acetylcholinesterase density and turnover number at frog neuromuscular junctions, with modeling of their role in synaptic function / L. Anglister, J.R. Stiles, M.M. Salpeter // Neuron. 1994. - V. 12(4). - P. 783-794.

43. Asmussen G. Histochemische charakterisierung der verschiedenen muskelfasertypen in der auseren augenmuskelen von saugetleren / G. Asmussen , A. Kiessling, F. Wohlrab // Acta Anat. (Basel). 1971. - V. 79. -P. 526-545.

44. Asmussen G, Maréchal G. Maximal shortening velocities, isomyosins and fibre types in soleus muscle of mice, rats and guinea-pigs / G. Asmussen, G. Maréchal // J Physiol. 1989. - V. 416. - P. 245-254.

45. Auld D.S. Glial cells and neurotransmission: an inclusive view of synaptic function / D.S. Auld, R. Robitaille // Neuron. 2003. - V. 40(2). - P. 389400.

46. Axelrod J. PLA2 and G proteins / J. Axelrod // Trends Neurosci. 1995. -V. 18.-P. 64-65.

47. Balboa M.A. Stimulation of phospholipase D via alpha 1-adrenergic receptors in Madin-Darby canine kidney cells is independent of PKC-alphaand epsilon activation / M.A. Balboa, P.A. Insel // Molecular Pharmacology. 1998. - V. 53.-P. 221-227.

48. Baryshnikov S.G. Calcium signaling mediated by P2Y receptors in mouse taste cells / S.G. Baryshnikov, O.A. Rogachevskaja, S.S. Kolesnikov // J. Neurophysiol. -2003. V. 90(5). - P. 3283-3294.

49. Bartschat D.K. Calcium-activated potassium channels in isolated' presynaptic berve terminals from rat brain / D.K. Bartschat, M.P. Blaustein //J.Physiol. (Lond.). 1985. - V.361. - P.441-457.

50. Baum O. Irregular costameres represent nitric oxide synthase-1-positive sarcolemma invaginations enriched in contracted skeletal muscle fibres / O. Baum, G. Planitzer, H. Richter, R. Gossrau // Histochem. J. 2000. - V. 32(12).-P. 743-751.

51. Beguin P. Adrenergic, dopaminergic, and muscarinic receptor stimulation leads to PKA phosphorylation of Na-K-ATPase / P. Beguin, A. Beggah, S. Cotecchia, K. Geering // Am. J. Physiol. 1996. - V. 270. - P. 131-137.

52. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and diacylglycerol: Two interacting second messengets / M.J. Berridge // Annu. Rev. Biochem. 1987. - V. 56. -P. 159-193.

53. Bielefeldt K. A calcium-activated potassium channel causes frequency-dependent action-potantial failures in mammalian nerve terminal / K. < Bielefeldt, M.B. Jackson // J.Neurophysiol. 1993. - V.70. - P.284-298.

54. Bishop C.A. Physiological consequences of a peptide cotransmitter in a crayfish nerve-muscle preparation / C.A. Bishop, J.J. Wine, F. Nagy, M.R. O'Shea // J. Neurosci. 1987. - V. 7(6). - P. 1769-1779.

55. Blundon J.A. Presynapric calcium-activated potassium channels and calcium channels at a crayfish neuromuscular junction / J.A. Blundon, S.N. Wright, M.S. Brodwick, G.D. Bittner // J. Neurophysiol. 1995. - V.73. - P.178-189;

56. Bocckino S. Phosphatidate accumulation in hormone-treated hepatocytes via a phospholipase D mechanism / S. Bocckino, P. Blackmore, P. Wilson, J. Exton// J: Biol. Chem. 1987. - V. 262 (31).-P. 15309-15315.

57. Bocckino S. Ga2+-mobilizing hormones: elicit phosphatidylethanol accumulation via phospholipase D activation / S. Bocckino, P. Wilson; J1 Exton // FEBS Lett. 1987;-V. 225 (1-2).-P. 201-204.

58. Bodin P: Purinergic signalling: ATP release / P. Bodin, G: Burnstock // Neurochem Res. 2001. - V. 26. No.,8-9; - P: 959-69.

59. Borodinsky E.N. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction / L.N. Borodinsky, N.C. Spitzer // Proc. Natl1. Acad. Sci. USA.- 2007.-V. 104. No. l.- P: 335-401 .'.■, ■•

60. Boyer J.L. Differential effects of P2-purinoceptor antagonists on phospholipase C- and adenylyl cyclase-coupled P2Y-purinoceptors / J.L. Boyer, I.E. Zohn, K.A. Jacobson, T.K. Harden // Br. J. Pharmacol. 1994. -V. 113. No. 2.-P. 614-620.

61. Burke W. The action of the neuromuscular transmiiter on the slow fibre membrane / W. Burke, B.L. Ginsborg // J. Physiol. 1956. - V. 132. - P. 599-610.

62. Burnstock G. Is there a basis for distinguishing two types of P2-purinoceptor? / G. Burnstock, C. Kennedy // Gen Pharmacol. 1985. - V. 16. No. 5.- P. 433-440.

63. Burnstock G. Numbering of cloned P2 purinoceptors / G. Burnstock, B.F King// Drug Rev. Res. 1996. - V. 38.- P. 67-71.

64. Burnstock G. Cellular distribution and functions of P2 receptor subtypes in different systems / G. Burnstock, G.E. Knight // Int Rev Cytol. 2004. - V. 240.- P. 31-304.

65. Burnstock G. Purinergic nerves / G. Burnstock // Pharmacol Rev. 1972. -V. 24(3).-P. 509-581.

66. Burnstock G. Purinergic receptors / G. Burnstock // J Theor Biol. 1976. -V. 62. No. 2.- P. 491-503.

67. Burnstock G. Distribution and roles of purinoceptor subtypes / G. Burnstock // Nucleos. Nucleot. 1991. - V. 10.- P. 917-930.

68. Burnstock G. Current status of P2X receptors: distribution and pathophysiological roles / G. Burnstock // Proc West Pharmacol Soc. 1999. -V. 42.-P. 119-121.

69. Burnstock G. Purine-mediated signalling in pain and visceral perception / G. Burnstock// Trends Pharmacol Sci. 2001. - V. 22. No. 4.- P. 182-188.

70. Burnstock G. Cotransmission / G. Burnstock // Curr Opin Pharmacol. -2004,-V. 4. No. 1.- P. 47-52.

71. Burnstock G. Purine and pyrimidine receptors / G. Burnstock // Cell Mol Life Sci. 2007. - V. 64. No. 12.- P. 1471-1483.

72. Burnstock G. Adenosine Triphosphate (ATP) / G. Burnstock // In: Encyclopedia of neuroscience. L.R. Squire, ed. eds. Elsevier, Boston. -2009a.-V. l.-P. 105-113.

73. Burnstock G. Purines and Purinoceptors: Molecular Biology Overview / G. Burnstock //In: Encyclopedia of neuroscience. L.R. Squire, ed. eds. Elsevier, Boston. 2009b. - V. 7. - P. 1253-1262.

74. Castillo del J. Statistical factors involved in neuromuscular facilitation and depression / del J. Castillo, B. Katz // J. Physiol. 1954. - V. 124(3). -P. 574-585.

75. Castle N.A. Toxins in the characterization of potassium channels / N.A. , Castle, D.G. Haylett, D.H. Jenkinson // Trends Neurosci. 1989. - V. 12(2). -P. 59-65.

76. Ceccarelli C. Fast and' slow, myosins as specific markers of muscle: an immunocytochemical-study / C. Ccccarelli, V. Eusebi, G. Bussolati // Basic. Appl. Mistochem. 1986. - V. 30(2). P. 139-146. 1 <

77. Charlton S.J. PPADS and suramin as antagonists at cloned P2Y- and P2U-purinoceptors / S.J. Charlton, C.A. Brown, G.A. Weisman, J.T. Turner; L. ErbiM.R. Boarder //Br. J. Pharmacol. 1996.-V. 118; №. 3; - P. 704-710.

78. Chen W. NMDA-regulated ectoprotein-kinase in hippocampal neurons: role in LTP7 W. Chen, MiV. Hogan, A. Wieraszko, Z. Pawlowska, D. Soifer, Y.H. Ehlich // Soc. Neurosci. Abstr. 1994. - V. 20. - P. 263.

79. Chen C. Cyclooxygenase-2 regulates prostaglandin E2 signaling in hippocampal long-term plasticity / C. Chen, J.C. Magee, N.G. Bazan // J. Neurophysiol. 2002. - V. 87. - P. 2851-2857. :

80. Close R.I. Dynamic properties of mammalian skeletal muscles / R.L Close // Physiol. Rev. 1972. - V. 52(1).-P. 129-197.

81. Collis M.G. Adenosine receptor subtypes / M.G. Collis, S.M. Hourani // Trends Phannacol Sci. 1993. - V. 14. №. 10. - P. 360-366.

82. Connor J.A. Prediction of repetitive firing behaviour from voltage clamp date on an isolated neuron soma / J.A. Connor, C.F. Stevens // J. Physiol. -1971. V.213. - P.31-53.

83. Cooper R.L. Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target / R.L. Cooper, A. Donmezer, J. Shearer // Neurosci Res. 2003. - V. 45(2). - P. 163-172.

84. Counter S.A. A histochemical characterization of muscle fiber types in the avian M. stapedius / S.A. Counter, E. Hellstrand; E. Borg // Сотр. Biochem. Physiol. А Сотр. Physiol. 1987. - V. 86(1).-P. 185-187.

85. Csillik B. On the histochemical structure of tetanic, and tonic myoneural synapses / B. Csillik , I. Schneider , G. Kalman // Acta Neuroveg (Wien). -1961.-V. 22.-P. 212-224.

86. Cusack N.J. P2 receptor: subclassification and! structure-activity relationships / N.J. Cusack // Drug Development Research. 1993. - V. 28.-P. 244-252.

87. De Lorenzo S. Presynaptic inhibition of spontaneous acetylcholine release mediated by P2Y receptors at the mouse neuromuscular junction / S. De Lorenzo, M'. Veggetti, S. Muchnik, A. Losavio // Neuroscience. 2006. -V. 142. №. 1.-P: 71-85.

88. Denninger J.W. Guanylate cyclase and the NO/cGMP signaling pathway / J.W. Denninger, M.A. Marietta // Biochimica et Biophysica Acta.- 1999.-V. 1411.-P. 334-350.

89. Denny-Brown D. The histological features of striped muscle in relation to its functional activity / D. Denny-Brown // Proc. Roy. Soc. B. -1929.-V. 104.-P. 371-411.

90. Dlouha H. Activation of membrane Na+/K+-ATPase of mouse skeletal muscle by acetylcholine and its inhibition by alpha-bungarotoxin, curare and atropine / H. Dlouha, J. Teisinger, F. Vyskocil // Pflugers Arch. -1979.-V. 380.-P. 101-104.

91. Downes C.P. Myo-inositol metabolites as cellular signals / C.P. Downes, C.H. Macphee // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 193. P. 1-18.

92. Dubyak G.R. Go it alone no more P2X7 joins the society of heteromeric ATP-gated receptor channels / G.R. Dubyak // Mol Pharmacol.- 2007. V. 72. №. 6. - P. 1402-1405.

93. Edman KA. Double-hyperbolic force-velocity relation in frog muscle fibres / KA. Edman // J Physiol. 1988. - V. 404. - P. 301-321.

94. Edwards F.A. ATP receptor-mediated synaptic currents in the central nervous system / F.A. Edwards, A.J. Gibb, D. Colquhoun // Nature. 1992.-V. 359. - P. 144-147.

95. Evans R.J. ATP mediates fast synaptic transmission in mammalian neurons / R.J. Evans, V. Derkach, A. Surprenant // Nature. 1992. — V. 357. -P. 503-505.

96. Evans R.J. Pharmacological characterization of heterologously expressed ATP-gated cation channels (P2x purinoceptors) / R.J. Evans, C.1.wis, G. Buell, S. Valera, R.A. North, A. Surprenant // Mol Pharmacol. -1995: V. 48. №. 2.- P. 178-183.

97. Farabee M.J. Muscular and skeletal systems / M.J. Farabee // Biology. 2001. -Vol. 2009, ed. eds.

98. Fatt P. An analysis of end-plate potential recorder with an intracellular electrode / P. Fatt, B. Katz// J. Physiol. 1951. - V. 115. - P. 320-369.

99. Fatt P. Spontaneous subthreshold activity at motor nerve endings-/ P. Fatt, B. Katz // J. Physiol. - 1952. - V. 117. - P. 109-128.

100. Ferrari D. The P2X7 receptor: a key player in- IL-1 processing and' . release / D. Ferrari; C. Pizzirani, E. Adinolfi, R.M. Lemoli, A. Curti, M.1.zko, E. Panther, F. Di Virgilio // J Immunol. 2006. - V. 176. №. 7.- P. 3877-3883.

101. Francis S.H. Cyclic nucleotide-dependent protein kinases: intracellular receptors for cAMP and cGMP action / S.H. Francis, J.D. Corbin // Grit. Rev. Clin.Lab. Sci. 1999. -V. 36 (4).-P. 275-328.

102. Fredholm B.B. Nomenclature and classification of purinoceptors / B.B. Fredholm, M P. Abbracchio, G. Burnstock, J.W. Daly, T.K. Harden, K.A. Jacobson, P. Leff, M. Williams // Pharmacol Rev. 1994. - V. 46: №. 2.-P. 143-156.

103. Fredholm B.B. Towards a revised nomenclature for PI and P2 receptors / B.B. Fredholm; M.P. Abbracchio, G. Burnstock, G.R: Dubyak, T.K. Harden, K.A. Jacobson, U. Schwabe, M: Williams // Trends. Pharmacol. Sci. 1997. - V. 18. №. 3.- P. 79-82.

104. Fredholm B.B. International; Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine receptors / B.B: Fredholm, I. J: AP, K.A. Jacobson, K.N.Klotz, J. Linden // Pharmacol. Rev. 2001. - V. 53. №. 4.-P. 527-552.

105. Fryer M.W. Total and sarcoplasmic reticulum calcium contents of skinned fibres from rat skeletal muscle / M.W. Fryer, D.G. Stephenson // J. Physiol. 1996. - V. 493 (Pt 2).- P. 357-370.

106. Fu W.M. Potentiation by ATP of the postsynaptic acetylcholine response at developing neuromuscular synapses in Xenopus cell cultures / W.M. Fu // J. Physiol. 1994. - V. 477 (Pt 3).- P. 449-458.

107. Fu W.M. Regulatory role of ATP at developing neuromuscular junctions / W.M. Fu // Prog. Neurobiol. 1995. -V. 47(1). - P. 31-44.

108. Gever J.R. Pharmacology of P2X channels / J.R. Gever, D.A. Cockayne, M.P. Dillon, G. Burnstock, A.P. Ford // Pflugers Arch. 2006. -V. 452. №.5.- P. 513-537.

109. Giniatullin A.R. Dual action of hydrogen peroxide on synaptic transmission at the frog neuromuscular junction / A.R. Giniatullin, R.A. Giniatullin // J. Physiol. 2003. - V. 552. - P. 283-293.

110. Giniatullin R.A. ATP and adenosine inhibit transmitter release at the frog neuromuscular junction through distinct presynaptic receptors / R.A.

111. Giniatullin, E.M. Sokolova I I Br J Pharmacol. 1998. - V. 124. №. 4-839-844.

112. Glisovic S. The asymmetric molecular forms of AChE and expression of collagen Q in mature and immature fast and slow rat muscl^5 ^ S. Glisovic, M. Trinkaus, P. Pregelj, J. Sketelj // Chem. Biol. Interact- " 2010.-V. 187(1-3).-P. 90-95.

113. Golan H. Block of glutamate decarboxylase decreases GABAerigP0 inhibition at the crayfish synapses: possible role of presynaptic metabotroj^0 mechanisms / H. Golan, Y. Grossman // J Neurophysiol. 1996. - V.- P. 2089-2098.

114. Goldstein L. Hemin induces an iron-dependent, oxidative injury human neuron-like cells / L. Goldstein, Z.P. Teng, E. Zeserson, M. Pat^l* R.F. Regan // J. Neurosci. Res. 2003. - V. 73. - P. 113-121.

115. Gordon G. Slow and rapid components in a flexor muscle / C3"-Gordon, C.G. Phillips // Q. J. Exp. Physiol. Cogn. Med. Sci. 1953. - "V^-38(1).-P. 35-45.

116. Gorza L. Identification of a novel type 2 fiber population x^m mammalian skeletal muscle by combined use of histochemical myosiJ^ ATPase and anti-myosin monoclonal antibodies / L. Gorza // J. Histochenct— Cytochem. 1990. - V. 38(2). - P. 257-265.

117. Grinnell F. Fibroblast-collagen-matrix contraction: growth-factor"" signalling and mechanical loading / F. Grinnell // Trends. Cell. Biol. 2000--V. 10(9). - P. 362-365.

118. Granit R. The functional role of the muscle spindles facts and hypotheses / R. Granit // Brain. - 1975. - V. 98(4). - P. 531-556.

119. Grishin S. Mechanisms of ATP action on motor nerve terminals at the frog neuromuscular junction / S. Grishin, A. Shakirzyanova, A. Giniatullin, R. Afzalov, R. Giniatullin // Eur J Neurosci. 2005. - V. 21. №. 5,- P. 1271-' 1279.

120. Gyulkhandanyan A.V. Modulation of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production by copper in astrocytes /

121. A.V. Gyulkhandanyan, C.J. Feeney, P.S. Pennefather // J Neurochem. -2003. V. 87(2). - P. 448-460.

122. Hamilton B.R. Autoreceptor-mediated purinergic and cholinergic inhibition of motor nerve terminal calcium currents in the rat / B.R. Hamilton, D.O. Smith // J. Physiol. (Lond.) 1991. - V. 432. - P. 327-341.

123. Hanks S.K. The Eukaryotic Protein- Kinase Superfamily: Kinase (Catalytic) Domain Structure and Classification / S.K. Hanks, T. Hunter // FASEB-J. 1995. - V. 9. - P. 576-596.

124. Hardie R.C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors / R.C. Hardie // J. Neurosci. 1991. - V.l 1. - №10. - P.3079-3095.

125. Hardman J. Guanylycyclase, an enzyme catalyzing the formation of guanosine3\5"-monophoshate from guanosine triphosphate / J. Hardman, E. Sutherland // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244. - P. 6363-6370.

126. Harms L. Depolarization of rat locus coeruleus neurons by adenosine 5'-triphosphate / L. Harms, E.P. Finta, M. Tshopl, P. Illes // J. Neurosci. -1992.-V. 48.-P. 941-952.

127. Hettinger, Th. Der Sportarzt vereinigt mit Sportmedizin / Th. Hettinger. New York, 1961.

128. Hodgkin M. Diacylglycerols and phosphatidates: which molecular species are intracellular messengers? / M. Hodgkin, T. Pettitt, A. Martin, R. Michell, A. Pemberton, M. Wakelam // Trends. Biochem. Sci. 1998. - V. 23 (6). - P. 200-204.

129. Hoyle C.H. Pharmacological activity of adenine dinucleotides in; the periphery: possible receptor classes and transmitter function / C.H. 1 Ioyle // Gen Pharmacol; 1990. - V. 21. №: 6.- P: 827-831:.

130. Hoyle C.H: Suramin antagonizes responses to P2-purinoceptor agonists and purinergic nerve stimulation in the guinea-pig urinary bladder and taenia coli / C.H.Hoyle, G.E. Knight, G. Burnstock // Br. J. Pharmacol. -1990. V. 99. №. 3.-P. 617-621.

131. Hudlicka O. Resting and postcontraction blood flow in; slow and;fast muscles of the chick during development / O. Hudlicka // Microvaso. Res. — 1969. -V. 1(4). -P. 390-402.

132. Hume R.I. Excitatory action of ATP on embryonic chick muscle / R-T-Hume, M.G. Honig // J: Neurosci: 1986.- V. 6(3). P. 681-690.

133. Hutter O.F. Nature of neuromuscular facilitation by sympathetic stimulation in the frog / O.F. Hutter, Loewenstein W.R. // J. Physiol- — 1955--V. 130.-P. 559-571.

134. Illes T. Osteogenetic cells in myositis ossificans / T. Illes, D. Jean, JVi-Szendroi, J. Fischer // Magy. Traumatol. Ortop. Kezseb. Plasztikai. Seb. — 1993.-V. 36(5).-P. 461-467.

135. Ito I. Catechol: a potent and specific inhibitor of the fast potassium-channel in frog primary afferent neurones / I. Ito , T. Maeno // J. Physiol. — 1986.-V. 373.-P. 115-127.

136. Johnson K.R. An Evolutionary Analysis Of cAMP-Specific Phosphodiesterase 4 Alternative Splicing / K.R. Johnson, J.D. Nicodemus-Johnson, R.S. Danziger//BMC. Evol. Biol. 2010. - V. 11; 10(1). - P. 247.

137. Kanfer J.N. Phospholipase D activity of rat brain neuronal nuclei / J.N. Kanfer, D. McCartney, I.N. Singh, L. Freysz // J. Neurochem. 1996. — V. 67.-P. 760-766.

138. Katz B. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate / B. Katz, S. Thesleff// J. Physiol. 1957. - V. 138. - P. 63-80.

139. Kelso T.B. Some properties of different skeletal muscle fiber types: comparison of reference bases / T.B. Kelso, D.R. Hodgson, A.R. Visscher, P.D. Gollnick // J. Appl. Physiol. 1987. -V. 62(4). P. 1436-1441.

140. Kennedy C. How should P2X purinoceptors be classified pharmacologically? / C. Kennedy, P. Leff // Trends. Pharmacol. Sei. 1995. -V. 16. №.5.- P. 168-174.

141. Koles L. Interaction of P2 purinergic receptors with cellular macromolecules / L. Koles, Z. Gerevich, J.F. Oliveira, Z.S: Zadori, K. Wirkner, P. Illes // Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. 2008. - V. 377. №. l.-P. 1-33.

142. Koles L. Purine ionotropic (P2X) receptors / L. Koles, S. Fürst, P. Illes // Curr. Pharm. Des. 2007. - V. 13. №. 23.- P. 2368-2384.

143. Konishi H. Activation of protein kinase C by tyrosine phosphorylation in response to H202 / H. Konishi, M. Tanaka, Y. Takemura, H. Matsuzaki, Y. Ono, U. Kikkawa, Y. Nishizuka // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997- -V. 14;94(21).-P. 11233-11237.

144. Krenäcs T. Characterization of striated muscle fiber types by Ca ATPase and myoglobin immunohistochemistry of the sarcoplasmic reticulum / T. Krenäcs, E. Molnar, E. Dobö, L. Dux // Morphol. Igazsagugyi. Orv. Sz. 1989. - V. 29(2). P. 106-118.

145. Kress G.J. The relationship between intracellular free iron and cell injury in cultured neurons, astrocytes, and oligodendrocytes / G-J- Kress, K.E. Dineley, I.J. Reynolds // J. Neurosci. 2002. - V. 22. P. 5848-5855.

146. Krishtal O.A. Rapid extracellular pH transients related to synaptic transmission in rat hippocampal slices / O.A. Krishtal, Y.V. Osipchuk, T.N. Shelest, S.V. Smirnoff// Brain. Res. 1987. - V. 436. - P. 352-356.

147. Kuffler S.W. The small-nerve motor system to skeletal muscle / S.W. Kuffler, R.W. Gerard // J Neurophysiol. 1947. - V. 10(6). - P. 383-394.

148. Kuffier S.W. Small-nerve junction potentials. Distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle and membrane characteristics of the fibres they innervate/ S.W. Kuffier, E. M. Vaughan Williams // J. Physiol- -1953.-V. 121.-P. 229-317.

149. Kullberg R. Comparative development of end-plate currents in two muscles of Xenopus laevis / R. Kullberg , J. L. Owens // J Physiol. — 1986. — V. 374.-P. 413-427.

150. Kusner L.L. Heme oxygenase-2 expression at ratneuromuscularjunctions / L.L. Kusner, E. Kim, H.J. Kaminski // Neurosci. Lett. — 1999. — V. 8;273(3). P. 143-146.

151. Lee A. Ca2+/calmodulin binds to and modulates P/Q-type calcium channels / A. Lee, S.T. Wong, D. Gallagher, B. Li, D.R. Storm, T. Scheuer, W.A. Catterall//Nature. 1999.- V. 399. - P. 155-159.

152. Levitan I.B. It is calmodulin after all! Mediator of the calciTJ-i11 modulation of multiple ion channels / I.B. Levitan // Neuron. 1999. —22.-P. 645-648.

153. Li C. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenati«^*1 injury / C. Li, R.M. Jackson,// Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2002. -282(2).-P. C227-241.

154. Lin-Liu S. Migration of cell surface concanavalin. A receptors yu^ipulsed electric fields / S. Lin-Liu, W.R. Adey, M. Poo // Biophys. J. 198^3-i- V. 45.-P. 1211-1217.

155. Liou J.C. Additive effect of ADP and CGRP in modulation of ttxo acetylcholine receptor channel in Xenopus embryonic myocytes / J.C. Liou -, W.M. Fu //Br J Pharmacol. 1995. - V. 115. №. 4.- P. 563-8.

156. Litosch I. 5-Methyltryptamine stimulates phospholipase C-mediatec3L breakdown of exogenous phosphoinositides by blowfly salivary glaticJL membranes /1. Litosch, J.N. Fain // J. Biol. Chem. 1985. - V. 25;260(30) -P. 16052-16055.

157. Lu B. Regulation of postsynaptic responses by calcitonin gene related peptide and ATP at developing neuromuscular junctions / B. Lu, W.M. Fu // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1995. - V. 73. №. 7.- P. 1050-1056.

158. Lucas K.A. Guanylyl cyclase and signaling by cyclic GMP / K.A. Lucas, G.M. Pitary, J. Park // Pharmocol. Rev. 2000. - V. 52. - P. 375-413.

159. Liithi A. Periodicity of thalamic spindle waves is abolished by ZD7288, a blocker of Ih / A. Liithi, T. Bal, D.A. McCormick // J Neurophysiol. 1998. - V. 79(6). - P. 3284-3289.

160. MacDonald J.A. Protein phosphatase type-1 from skeletal muscle of the freeze-tolerant wood frog / J.A. MacDonald, K.B. Storey // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2002. - V. 131. №. 1.- P. 27-36.

161. Macdonald W.A. Effect of ADP on slow-twitch muscle fibres of the rat: implications for muscle fatigue / W.A. Macdonald, D.G. Stephenson // J: Physiol. 2006. - V. 573. №. Pt l.- P. 187-198.

162. Mallart A-. Presynaptic cuiTents in frog motor endings / A. Mallart // Pflugers Arch.- 1984";-V. 400;-P; 8^13.

163. Mallart A. Electric current flow inside perineural sheaths of mouse motor nerves / A. Mallart // J. Physioi.- 1985.- V. 368.- P: 565-575.

164. Meir A. Ion channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release / A. Meir, S. Ginsburg, A. Butkevitch, S. Kachalsky, I.

165. Kaiserman, R. Ahdut, S. Demirgoren, R. Rahamimoff // Physiol. Rev. -1999. V.79. - №3. - P. 1019-1088.

166. Meriney S.D. Endogenous adenosine modulates stimulation-induced depression at the frog neuromuscular junction / S.D. Meriney, A.D. Grinnell // J Physiol. 1991. - V. 443.- P. 441-455.

167. Miledi R. Effect of a «fast» nerve on «slow» muscle fibres in the frog / R. Miledi, P. Orkand // Nature. 1966. - V. 209. - P. 717-718.

168. Miledi R. Miniature potentials in denervated slow muscle fibers of the , . frog / R. Miledi, E. Stefani // J. Physiol. 1970. - V. 209. - P. 1-79-186.

169. Miledi R. Induction of the action potential mechanism in* slow muscle fibers of the frog / R. Miledi, E. Stefani, A.B. Steinbach// J. Physiol. 1971., -V. 217.-P. 737-754'.

170. Molgo J. Electronic properties of motor nerve terminals / J. Molgo, S. Thesleff // Actaphysiol. scand. 1982. - V.114. - №2. - P.271-275.

171. Moores T.S. Properties of presynaptic P2X7-like receptors at the neuromuscular junction / T.S. Moores, B. Hasdemir, L. Vega-Riveroll, J. Deuchars, S.H. Parson // Brain Res. 2005. - V. 1034(1-2). - P. 40-50.

172. Morita K. Evidence for, two calcium dependent potassium conductances in lizard motor nerve terminals / K. Morita, F. Barret // J. Neurosci. 1990. - V.10. - P.2614-2625.

173. Morita S. Histochemical localization of myoglobin in skeletal muscle of rabbit, pig and ox / S. Morita, R.G. Cassens, E.J. Briskey // J. Histochem. Cytochem. 1970. - V. 18(5). - P. 364-366.

174. Mozrzymas J.W. ATP activates junctional and extrajunctional acetylcholine receptor channels in isolated adult rat muscle fibres / J.W. Mozrzymas, F. Ruzzier // Neurosci. Lett. 1992. - V. 139. №. 2,- P. 217220.

175. Murrant C.L. Detection of reactive oxygen and reactive nitrogen species in skeletal muscle / C.L. Murrant, M. Reid // Microsc. Res. Tech. — 2001.-V. 55.-P. 236-248.

176. Y. Kang, Y. Bu, E. Yu, K. Akong, C.M. Peters // J. of Neurosci. 1999-1. V. 19.-P. 4211-4220.

177. Needham D. M. The Hydrogen-ion Concentration and the Oxidation-reduction Potential of the Cell Interior / D. M. Needham // Proc. Roy. Soc. London, Series B. 1925. - V. xcviii. - P. 259.

178. Nestler EJ. Distribution of protein I and regulation of its state of phosphorylation in the rabbit superior cervical ganglion / E.J. Nestler, P-Greengard // J. Neurosci. - 1982. - V. 2(8). P. 1011-1023.

179. Nicholls J.G. From neuron to brain / J.G. Nicholls, A.R. Martin, B-G. Wallace, P.A. Fuchs // Sinauer Associates, Inc.- 2001.- P. 672.

180. Nikolsky E.E. Non-quantal acetylcholine release in the mouse diaphragm after phrenic nerve crush and during recovery / E.E. Nikolsky» T.I. Oranska, F. Vyskocil // Exp. Physiol. 1996. - V. 81. - P. 341-348.

181. Nikolsky E.E. Role of non-quantal acetylcholine release in surplus polarization of mouse diaphragm fibres at the endplate zone / E.E. Nikolsky, H. Zemkova, V.A. Voronin, F. Vyskocil // J. Physiol. 1994. - V. 477. -497-502.

182. Nikolsky E.E. The dependence of non-quantal acetylcholine release on the choline-uptake system in the mouse diaphragm / E.E. Nikolsky, V-^-Voronin, T.I. Oranska, F. Vyskocil // Pflugers Arch. 1991. - V. 418. -74-78.

183. North R.A. Molecular physiology of P2X receptors / R.A. North I I Physiol. Rev. 2002. - V. 82. №. 4.- P. 1013-1067.

184. North R.A. Pharmacology of cloned P2X receptors / R.A. North, A. Surprenant // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000. - V. 40. - P. 563-580.

185. Ogata T. An electron microscopic study on the red, white and intermediate muscle fibers of mouse / T. Ogata // Acta Med. Okayama. -1964.-V. 18.-P. 271-280.

186. Ohtani Y. Expression of inducible nitric oxide synthase mRNA and production of nitric oxide are induced by adenosine triphospKate in cultured rat microglia / Y. Ohtani, M. Minami, M. Satoh // Neurosci. Lett. 2000. -V. 293. - P. 72-74.

187. Oomura Y. Study on properties of neuromuscular junction / Y. Oomura, T. Tomita // In: Electrical activity of single cells. Ed. Y. Katsuki. Tokyo.- 1960.-P. 181-205.

188. Page SG. A comparison of the fine structures of frog slow and twitch muscle fibers / S.G. Page // J Cell Biol. 1965. - V. 26(2). P. 477-497.

189. Peachey L.D. Structural identification of twitch and slow striated muscle fibers of the frog / L.D. Peachey, A.F. Huxley // J Cell Biol. 1962. -V. 13.-P. 177-180.

190. Peterson B.Z. Calmodulin, is the Ca2+ sensor for Car -dependent inactivation of L-type calcium channels / B.Z. Peterson, C.D. DeMaria, J.P. Adelman, D.T. Yue // Neuron. 1999. - V. 22. - P 549-558.

191. Pfeiffer-Linn C. A neuronal nicotinic acetylcholine receptor in crayfish neurons / C. Pfeiffer-Linn, R.M. Glantz // Neurosci Lett. 1990. -V. 120(2).-P. 234-236.

192. Redman R.S. ATP released together with acetylcholine as the mediator of. neuromuscular depression at frog motor nerve endings / R.S. Redman, E M. Silinsky // J. Physiol: 1994. - V. 477 ( Pt 1). - P. 117-127.

193. Redman R.S. On the simultaneous electrophysiological measurements of neurotransmitter release and perineural, calciun currents from, frog nerve: endings / R.S. Redman, E.M. Silinsky // J. of Neurosci. methods.- 1995.' Vol. 57.-P. 151-159. . .

194. Regenold J.T. Inhibitory adenosine A1 -receptors on rat locus coeruleus neurones. An intracellular electrophysiological study / JIT. Regenold, P. Illes //Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol; — 1990::- V. 341(3).-P. 225-231.

195. Reid M.B. N-acetylcysteine inhibits muscle fatigue in humans / M.B: Reid, D.S. Stokic, S.M. Koch, F.A. Khawli, A.A. Leis // J. Clin. Invest.1994. V. 94. - P. 2468-2474. V

196. Ribeiro C.P. Prevention of alpha 2-adrenergic inhibition on ADH action by pertussis toxin in rabbit CCT / C.P. Ribeiro, F. Ribeiro-Neto, J.B. Field, W.N. Suki // Am. J. Physiol. 1987. - V. 253(1 Pt 1). - P. CI05-112.

197. Ribeiro J.A. On the role, inactivation and origin of endogenous adenosine at the frog neuromuscular junction / J. A. Ribeiro, A.M. Sebastiao // J. Physiol. 1987. - V. 384.- P. 571-585.

198. Ribeiro J. The effects of adenosine triphosphate and adenosine diphosphate on transmission at the rat and frog neuromuscular junctions / J. Ribeiro, J. Walker // Br. J. of Pharmacol. 1975. - V. 54. -P. 213-218.

199. Rice C.L. Comparison of the histochemical and contractile properties of human triceps surae / C.L. Rice, D.A. Cunningham, A.W. Taylor, D.H. Paterson // Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1988. - V. 58(1-2). - P. 165-170.

200. Roberts J.A. Molecular properties of P2X receptors / J.A. Roberts, C. Vial, H.R. Digby, K.C. Agboh, H. Wen, A. Atterbury-Thomas, R.J. Evans // Pflugers Arch. 2006. - V. 452. №. 5. - P. 486-500.

201. Robertson SJ. Synaptic P2X receptors / S.J. Robertson, S.J. Ennion, R.J. Evans, F.A. Edwards // Curr. Opin. Neurobiol. 2001. - V. 11. №. 3. -P. 378-386.

202. Robitaille R. Purinergic receptors and their activation by endogenous purines at perisynaptic glial cells of the frog neuromuscular junction / R. Robitaille//J Neurosci. 1995. - V. 15. №. 11.-P. 7121-7131.

203. Robitaille R.M. Functional colocalization of calcium and calcium-gated potassium channels in control of transmitter release / R.M. Robitaille, M.L. Garcia, G.J. Kaczorowski, M.P. Charlton // Neuron. 1993. - V.l 1- -P.645-655.

204. Rochon D. Synapse glia interactions at the mammalian neuromuscular junction / D. Rochon, I. Rousse, R. Robitaille // J. Neurosci. -2001.-V. 21.-P. 3819-3829.

205. Romanul F.C. Distribution of capilaries in relation to oxidative metabolism of skeletal muscle fibres / F.C. Romanul // Nature. 1964. - V. 201.-P. 307-308.

206. Scefner S.A. Adenosine , inhibits locus coeruleus neurons: an intracellular study in a rat brain slice preparation / S.A. Scefner, Т.Н. Chiu // Brain. Res. 1986. - V. 366. - P. 364-368.

207. Schmalbruch H. "Red" muscle fibres / H. Schmalbruch // Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 1971. - V. 119(1). - P. 120-146.

208. Schmidt A.P. Proposal of a guanine-based purinergic system in the mammalian central nervous system / A.P. Schmidt, D.R. Lara, D.O. Souza // Pharmacol Ther. 2007. - V. 116. №. 3. - P. 401-16.

209. Searl T.J. Increases in acetylcholine release produced by phorbol esters are not mediated by protein kinase C at motor nerve endings / T.J. Searl, E.M. Silinsky // J. Pharmacol. Experim. Therap. 1998. - V. 285. - P. 247-251.

210. Servitja J.M. Effects of oxidative stress on phospholipid signaling in rat cultured astrocytes and brain slices / J.M. Servitja, R. Masgrau, R. Pardo, E. Sarri, F. Picatoste // J. Neurochem. 2000. - V. 75. - P. 788-794.

211. Shapiro M.S. Modulation of Ca2+ channels by PTXsensitive G-proteins is blocked by N-ethylmaleimide in rat sympathetic neurones /M.S. Shapiro, L.P. Wollmuth, B. Hille // J. Neurosci. 1994. - V. 14. - P. 710971116.

212. Shen K-Z. Excitation of rat locus coeruleus neurons by adenosine 5'-triphosphate: ionic mechanism and receptor characterization / K-Z. Shen, R.A. North // J. Neurosci. 1993. - V. 13. - P. 894-899.

213. Shin E.Y. Involvement of phospholipase D in oxidative stress-induced necrosis of vascular smooth muscle cells / E.Y. Shin, D.S. Min, J.C. Shin, K.S. Shin, M.S. Hyun, K.S. Ha, H.S. Kim, H.Y. Ahn, E.G. Kim // FEBS Lett.-2001.-V. 508. P. 277-281.

214. Shupliakov O. Presynaptic glutamate levels in tonic and phasic motor axons correlate with properties of synaptic release / O. Shupliakov, H.L. Atwood, O.P. Ottersen, J. Storm-Mathisen, L.Brodin // J Neurosci. -1995. -V. 15(11).-P. 7168-7180.

215. Siddiqui R.A. Oleate stimulation of diacylglycerol formation from phosphatidylcholine through effects on phospholipase D and phosphatidate phosphohydrolase / R.A. Siddiqui, J.H. Exton // Eur. J. Biochem. 1992. -V. 210(2).-P. 601-607.

216. Silinsky E.M. On the association between transmitter secretion and the release of adenine nucleotides from mammalian motor nerve terminals / E.M. Silinsky//J Physiol. 1975. - V. 247. №. 1. - P. 145-162.

217. Silinsky E.M. On the role of barium in supporting the asynchronous release of acetylcholine quanta by motor nerve impulses / E.M. Silinsky // J. Physiol. (Lond.). 1978. - V. 274. - P. 157-171.

218. Silinsky E.M. ATP mediates excitatory synaptic transmission in mammalian neurons / E.M. Silinsky, V. Gerzanich, S.M. Vanner // Br. J. Pharmacol. 1992. - V. 106. - P. 762-763.

219. Silinsky EM. Antagonism of calcium currents and* neurotransmitter release by barium ions at frog motor nerve endings / EM. Silinsky // Br J Pharmacol. 2000. - V. 129(2). - P. 360-366.

220. Silinsky E.M. Adenosine decreases both presynaptic calcium currents and neurotransmitter release at the mouse neuromuscular« junction / EM. Silinsky // J Physiol. 2004. - V. 558. Pt 2. - P. 389-401.

221. Silinsky E.M. Synchronous release of ATP and neurotransmitter within milliseconds of a motor nerve impulse in the frog / E.M. Silinsky, R.S. Redman // J. Physiol. 1996. - V. 492 (Pt 3). - P. 815-822.

222. Slutsky I Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction / I. Slutsky, G. Rashkovan, H. Parnas, I. Parnas // J Neurosci. 2002. - V. 22(9). - P. 3426-3433.

223. Smith D.O. Sources of adenosine released during neuromuscular transmission in the rat / D.O. Smith // J Physiol. 1991. - V. 432. - P. 343354.

224. Snider B.J. Nitric oxide reduces Ca2+ and Zn2+ influx through voltage-gate Ca2+ channels and reduces Zn2+ neurotoxicity / B.J. Snider, J. Choi, D.M. Turetsky, L.M. Canzoniero, S.L. Sensi // Neurosci. 2000. - V- 100, №3. -P. 651-661.

225. Sokolova E.M. Distinct receptors and different transduction mechanisms for ATP and adenosine at the frog motor nerve endings / E-M.

226. Sokolova, S.N. Grishin, A.V. Shakirzyanova, M.V. Talantova, R.A. Giniatullin // Eur. J. Neuroscience. 2003. - V. 18. - P. 1254-1264.

227. Solito E. Modulation of phospholipase A2 activity in human fibroblasts / E. Solito, L. Parente // Br J Pharmacol. 1989. - V. 96. №. 3.- P. 656-660.

228. Staron R.S. Correlation between myofibrillar ATPase activity and myosin heavy chain composition in rabbit muscle fibers / R.S. Staron, D. Pette // Histochem. 1986. - V. 86(1). - P. 19-23.

229. Stein J.M. Histochemical classification, of individual1 skeletal muscle . fibers of the rat/ J.M. Stein, H.A. Padykula// Am. J. Anat. 1962. T-V. 110. -P; 103-123. '

230. Stengel D Di fferent chromosomal localization of two adcnylyl cyclase genes expressed in human brain / D. Stengel, J. Parma, M.H. Gannage; N. Roeckel, M.G. Mattei, R. Barouki, J, Hanoune//Hum. Genet. 1992. - V. 90 (1-2).-P. 126-130.

231. Stout T.J. High-throughput structural biology in drug discovery: protein kinases / T.J. Stout, P.G. Foster, D.J. Matthews // Curr. Phami. Des. 2004. -- V. 10 (10). - P. 1069-1082. '

232. Sutherland E. W. Fractionation and characterization of a cyclic adenine ribonucleotide formed by tissue particles / E.W. Sutherland, T.W. Rail'// J; Biol. Chem.- 1958.-V. 232(2); P. 1077-1091.

233. Tasaki I. Comparative studies on the activities of the muscle evoked by two kinds of motor nerve fibres / I. Tasaki, K. Mizutani // Part I. Myographic studies. Jap. J. med. Sci. Biophys. 1944. - V. 10. - P. 237244.

234. Tasaki I. Comparative studies on the activities of the muscle evoked by two kinds of motor nerve fibres / I. Tasaki, M. Tsukagoshi, // Part II. The electromyogram. Jap. J. med. Sci. Biophys. 1944. - V. 10. - P. 245-251.

235. Thesleff S. The mode of neuromuscular block caused by acetylcholine, nicotine, dccametonium and succinilcholine / S. Thesleff // Acta physiof Scand.- 1955. V. 34; - P: 218-23K . ; ;

236. Thomas S. Differential; frequency-dependent regulation of transmitter release by endogenous nitric oxide at the amphibian neuromuscular synapse / S. Thomas , R. Robitaille // J. Neurosci. -2001.- V. 21(4). P. 1087-1095.

237. Torres B. P2Yn receptors activate adenylyl cyclase and' contribute to.' nucleotide-promoted cAMP formation in MDCK-D1 cells / B.Torres, A.C. Zambon, P.A. Insel // J. Biological Chem. 2002. - V. 277. - P. 7761-7765.

238. Van der Kloot W. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction / W. Van der Kloot, J. Molgo // Physiol. Rev. -1994.-V. 74.-P. 899-991.

239. Van der Laarse W.J. Relationship between myoglobin and succinate dehydrogenase in mouse soleus and plantaris muscle fibres / W.J. Van der Laarse, S. Maslam, P.C. Diegenbach // Histochem. J. 1985. - V. 17(1). - P. 1-11.

240. Vial C. Molecular properties of ATP-gated P2X receptor ion channels / C. Vial, J.A. Roberts; R.J. Evans // Trends. Pharmacol. Sci. 2004. - V. 25. №. 9.r P. 487-493.

241. Villacres E.C. Cloning, chromosomal mapping, and expression of human fetal brain type I adenylyl cyclase / E.C. Villacres, Z. Xia, L.H. Bookbinder, S. Edelhoff, C.M. Disteche, D.R. Storm // Genomics. 1993. -V. 16(2).-P. 473-478.

242. Vyskocil F. An analysis of the mechanisms underlying the non-quantal release of acetylcholine at the mouse neuromuscular junction / F. Vyskocil, E.E. Nikolsky, C. Edwards // Neurosci. 1983. - V. 9. - P. 429435.

243. Vyskocil F. Non-Quantal Acetylcholine Release at the Neuromuscular Junction / F. Vyskocil, A.I. Malomouzh, E.E. Nikolsky // Physiol. Res. — 2009.-V. 58.-P. 763-784.

244. Villacres E.C. Cloning, chromosomal mapping, and expression of human fetal brain type I adenylyl cyclase / E.C. Villacres, Z. Xia, L.H.

245. Bookbinder, S. Edelhoff, C.M. Disteche, D.R. Storm // Genomics. 1993. -V. 16(2).-P.473-478.

246. Wangemann P. The Na+/H+ exchanger in transitional cells of the inner ear / P. Wangemann, N. Shiga, D.C. Marcus // Hear Res. 1993. - V. 69(1-2).-P. 107-114.

247. Wirkner K. Regulation of human recombinant P2X3 receptors by . ecto-protein kinase C / K. Wirkner, D. Stanchev, L. Koles, M. Klebingat, H.

248. Dihazi, G. Flehmig, G. Vial, R.J. Evans, S. Furst, P.P. Mager, K. Eschrich, P. Illes // J Neurosci. 2005. - V. 25. №.34.- P. 7734-7742.

249. Wolin M.S. Guanylate cyclase from bovine lung. A kinetic analysis of the regulation of unpurified soluble enzyme by protoporphyrin IX, heme and nitrosyl-heme / M.S. Wolin, K.S. Wood, L.J. Ignarro // J.Biol.Ghem. 1982.- V. 257. P. 11312-11320.

250. Yao Y. Adenosine A3 receptor agonists protect HL-60 and U-937 cells from apoptosis induced by A3 antagonists / Y. Yao, Y. Sei, M.P.

251. Abbracchio, Y-C. Kim, K.A. Jacobson // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997. -V. 232. P. 317-322.

252. Zezula J. The A(2a)-adenosine receptor: a GPCR with unique features? / J. Zezula, M. Freissmuth // Br J Pharmacol. 2008. - V. 153 Suppl 1. - P. SI 84-190.

253. Ziganshin A.U. PPADS selectively antagonizes P2X-purinoceptor-mediated responses in the rabbit urinary bladder / A.U. Ziganshin, C.H.

254. Hoyle, X. Bo, G. Lambrecht, E. Mutschler, H.G. Baumert, G. Burnstock //

255. Br. J. Pharmacol. 1993.-V. 110.- №. 4. - P. 1491-1495.

256. Ziganshin A.U. The influence of hypothermia on> P2 receptor-mediated responses of frog skeletal muscle / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, L.E. Ziganshina, A.L. Zefirov, G. Burnstock // Eur. J. Pharmacol. 2005. - V. 21. - P. 187-193.

257. Ziganshin A.U. Interaction of hydrocortisone with ATP and adenosine on nerve-mediated contractions of frog skeletal muscle / A.U. Ziganshin, R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, B.A. Ziganshin, G. Burnstock // Eur. J. Pharmacol.- 2009.- Vol. 607.- P. 54-59.

258. Ziganshin A.U. Selective antagonism by. PPADS at P2X-purinoceptors in rabbit isolated blood vessels / A.U. Ziganshin, C.H. Hoyle, G. Lambrecht, E. Mutschler, H.G. Bumert, G. Burnstock // Br. J. Pharmacol.- 1994.-V. 111. №. 3. P. 923-929.

259. Ziganshin A.U. Temperature dependency of P2 receptor-mediated responses / A.U. Ziganshin, A.V. Rychkov, L.E. Ziganshina, G. Burnstock // Eur. J. Pharmacol. 2002. - V. 456. №. 1-3. - P. 107-114.

260. Zimmermann H. Extracellular metabolism of ATP and other nucleotides / H. Zimmermann // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. -2000. V. 362. №. 4-5. - P. 299-309.

261. Zor U. A novel mechanism of glucocorticosteroid (GC) action in suppression of phospholipase A2 (PLA2) activity stimulated by Ca" ionophore A23187: induction of protein phosphatases / U. Zor, E. Her, P.

262. Braquet, E. Ferber, N. Reiss // Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res. 1991.-V. 21A.-P. 265-271.

263. Zucker R.S. Short-term synaptic plasticity / R.S. Zucker // Ann. Rev. Neurosci. 1989. - V. 12. - P. 13-31.

264. Zuhlke R.D. Calmodulin supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels / R.D. Zuhlke, G.S. Pitt, K. Deisseroth, R.W. Tsien, H. Reuter // Nature. 1999. - V. 399. - P. 159-162.

Информация о работе

Гришин, Сергей Николаевич
доктора биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Пуринергическая синаптическая модуляция сокращения различных типов скелетных мышц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы