Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пуринергическая регуляция нервно-мышечной передачи

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Пуринергическая регуляция нервно-мышечной передачи"



^ А

На правах рукописи

Соколова Елена Михайловна

ПУРИНЕРГИЧЕСКЛЯ РЕГУЛЯЦИЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОЙ

ПЕРЕДАЧИ

03.00.13 - физиология человека и животных

- - > .--¿ С

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1999

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор P.A. Гиниатуллин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.Е. Никольский кандидат биологических наук, доцент A.M. Еремеев

Ведущая организация - институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, С.-Петербург.

заседании диссертационного Совета К 113.19.02 по присуждению ученой

физиология человека и животных при Казанском государственном педагогическом университете по адресу: 420021, г.Казань, ул. Межлаук, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного педагогического Университета по адресу: Казань, ул. Межлаук, 1.

Защита состоится

на

степени кандидата биологических наук по специальности 03.00,13.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, профессор

f

РОССИЙСКАЯ ОСУДЛРСТВЕННЛЯ БИБЛИОТЕКА

$ Ь до ~~ О С ВВЕДЕНИЕ

ктуальность исследования. В последнее время накопились данные о том, что АТФ омимо внутриклеточной роли макроэргического соединения, может принимать частие в межклеточной передаче сигналов [Bumstock, 1996; Bumstock & King, 1996; bbracchio, 1997], выступая как трансмиттер [Edwards et al., 1992], или как ^трансмиттер [Bumstock & King, 1996; Redman & Silinsky, 1996]. Особый интерес в гом вопросе представляет нервно-мышечный синапс, для которого прямым методом ;гистрации было установлено выделение АТФ в синаптическую щель во время гимуляции двигательного нервного окончания [Redman & Silinsky, 1996]. Эти шные делают вполне обоснованным предположение о том, что АТФ может ыступать в роли эндогенного модулятора нервно-мышечной передачи, ействительно, еще в 1975 году было показано, что в нервно-мышечном соединении сзогенная АТФ подавляет синаптическую передачу [Ribeiro & Walker, 1975]. Однако з всех последующих работах предполагалось, что механизм угнетающего действия ТФ основан на непрямом эффекте, в результате гидролиза АТФ до гтресинаптичсски стивного аденозина [Ribeiro & Sebastiao, 1987; Meriney & Griimell. 1991; Redman & ilinsky, 1994]. Аденозин, действительно, известен как агент, который ингибирует юнтанную и вызванную секрецию нейротрансмитгера [Ginsbovg '& Hirst, 1972]. злее того, было предположено, что именно эндогенный аденозин опосредует шаптическуга депрессию во время ритмической стимуляции двигательного нерва Легтеу & Griimell, 1991; Redman & Silinsky, 1994].

С другой стороны, исследования последних лет показали широкое юпространение как ионотропных Р2Х рецепторов, так и G-белок связанных етаботропных P2Y рецепторов во многих тканях организма, включая нервно-ышечную систему [Bumstock & Kennedy, 1985; Chen et al., 1995; Collo et al., 1996]. аким образом, согласно последним данным литературы, вероятность собственного |эфекта АТФ в нервно-мышечном синапсе довольно высока. Недавно [Robitaille, >95] появились новые данные о том, что скорость деградации эндогенной АТФ до инозина п нервно-мышечном синапсе в сравнении со скоростью гидролиза' ^етилхолина относительно невысока. Для синапсов ресничного ганглия было ;тановлено прямое действие АТФ на преситаптическую терминаль через шотропные Р2Х рецепторы [Sun & Stanley, 1996]. Наличие рецепторов АТФ, >пряженных с секреторным процессом, показано и для хромаффинных клеток щпочечников [Fuchs et al., 1994]. Эти данные литературы, а также наличие гнтезированных в последнее время агонистов и антагонистов рецепторов АТФ 'iganshin et al, 1994] и послужили основанием для более детального исследования ' шяния АТФ и ее производных на функцию нервно-мышечного синапса.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучен] модулирующей роли пуринергических соединений в регуляции синаптичесвд передачи в нервно-мышечном синапсе. В соответствии с этой целью бьи сформулированы следующие задачи:

1. Изучить пресинаптические эффекты АТФ и продуктов ее гидролиза в нервн мышечном синапсе.

2. Исследовать действие пуринергических соединений на постсинаптическу мембрану.

3. Изучить влияние АТФ и ее производных на проведение ритмических сер} импульсов через нервно-мышечный синапс.

4. Исследовать влияние антагонистов Р1 и Р2 рецепторов на пресинаптичесю эффекты АТФ и аденозина.

5. Установить подтип (Р2Х или Р2У) пресинаптических рецепторов, опосредуют! действие АТФ на секрецию медиатора.

Положение, выносимое на защиту:

В нервно-мышечном соединении АТФ способна ингибировать секрецш трансмиттера через собственный рецептор на пресинаптической мембране, отличны от рецептора для аденозина и относящийся к Р2У подтипу. В соответствии с эти» АТФ, так же как аденозин, может выступать в качестве эндогенног пресинаптического нейромодулятора в нервно-мышечном соединении.

Научная новизна. В настоящем исследовании впервые было показано, что АТС высвобождающаяся вместе с ацетилхолнном из синаптических везикул в нервщ мышечном синапсе, может модулировать секрецию ацетилхолина через собственны пуриноцептор, отличный от пресинаптического аденозинового рецептор; Установлена аддитивность действия АТФ и аденозина на секрецию медиатора, чт предполагает реализацию их эффектов через различные внутриклеточные екгнальны механизмы. Выяснено, что пресинаптические ингибиторные эффекты АТФ в нервне мышечном синапсе не зависят от рН. Впервые выявлено, что УТФ являете агонистом пресинаптических пуриноцепторов в нервно-мышечном синапсе способна оказывать угнетающее влияние на секрецию ацетилхолина. Установлен сравнительная активность широкого круга агонистов пресинаптически пуриноцепторов в их влиянии на секрецию ацетилхолина из двигательного нервног окончания. Показано, что пресинаптические пуриновые рецепторы в нервне мышечном соединении относятся к Р2У подтипу. Впервые исследовано влияние АТС и продуктов ее гидролиза на кратковременную пресинаптическую пластичность проявляющуюся в условиях ритмической активности. Новыми являются данные и влиянию пуринергических соединений на постсинаптическую потенциацию. I

J , ■

(астности, установлено, что экзогенная АТФ устраняет явление погенциации, что юзволяет думать, что и эндогенная АТФ, выделяемая в виде котрансмиттера. пособна участвовать в формировании кратковременной постсинаптической гластичиости в синапсе.

Научно-практическая ценность. Полугенные данные расширяют наши [редставления о функциональной организации двигательного нервного окончания. Эти данные вскрывают новые пути модуляции синаптической передачи на [ресинаптическом уровне. Результаты проведенного исследования позволяют половому взглянуть на роль АТФ в нервно-мышечном синапсе, где она можег ;ыступать эндогенным модулятором синаптической передачи, а ее Фармакологические аналоги могут быть использованы в качестве средств для (еленаправленной регуляции секреторного процесса через Р2 рецептор на шш ательном нервном окончании.

\пробация работы. Основные результаты доложены на 9 Международном импозиуме по холинергическим механизмам (Майнц, Германия, 1995), I (IX) Леждународном совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996). на 5сероссийской конференции «Растущий организм, адаптация к возрастающей жзической нагрузке» (Казань, 1996), на конференции молодых ученых по олинергическим и пуринергическим механизмам (Казань, 1996,1997), на Международной конференции «Модуляция синаптической передачи» (Париж. 1997), ia 3 Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), 17 Съезде шзиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), на Российской конференции «Физиология игнальных молекул» (Москва, 1998), V Всероссийской школе «Актуальные (роблемы нейробиологии» (Казань, 1998), на заседании кафедры нормальной шзиологии КГМУ (1998).

Гтруктура и объем диссертации. Диссертация объемом 140 страниц состоит из ведения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов сследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой итературы. Список цитируемой литературы включает 226 источников, из них 196 ностранных авторов. Диссертация содержит 16 рисунков и 5 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования был нервно-мышечный препарат седалищный нерв -ортняжная мышца лягушек Rana rídibunda и Rana temporaria. Для предотвращения [ышечных сокращений во время регистрации сигналов и сохранения высокого ровня квантового освобождения медиатора, мышечные волокна поперечно

рассекали [Волкова и др., 1975]. Ванночка, в которой размещался нервно-мышечны препарат, имела рабочую емкость 2 мл. В течение эксперимента через ванночк непрерывно протекал раствор Рингера, содержащий (в ммоль/л): МаС1 - 115,0; КС1 2,5; СаСЬ - 1,8; Ыа2НС03 - 11,0. рН растворов поддерживали на уровне 7,2-7,4. Дя ингибирования ацетилхолинэсгеразы использовали обратимый ингибитор прозерин концентрации 3x10"6 моль/л. В экспериментах применяли следующи фармакологические препараты: АТФ, АДФ, АМФ, аденозин, теофиллин, БРСРХ (1,3 дипропил-8-диклоиентилксантин), сурамин, конканавалин А, сс,Р-метиленАТФ РРАББ (пиридоксальфосфат-6-азафенкл-2',4'-дисульфоновая кислота), УТФ Эксперименты проводили при температуре 20±2°С. Токи концевой пластинки (ТКП и миниатюрные токи (МТКП) отводили в условиях двухэлектродной фиксацш потенциала. Регистрацию потенциалов действия нервного окончания 1 экстраклеточных ТКП осуществляли с помощью внеклеточных микроэлектродов Накопление и усреднение синапгических сигналов производили при помонц персонального компьютера с периодом опроса 5-20 мкс на точку. Расчет параметро] и характера спада МТКП и многоквантовых ТКП производили при помопи оригинальных компьютерных программ. Достоверность различий оценивали п< критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ПРЕСИНАПТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ АТФ И АДЕНОЗИНА Влияние АТФ и аденозина на многоквантовые ТКП

В первой серии экспериментов на рассеченной мышце исследовали влияние АТФ и аденозина на много квантовые ТКП. В контроле при потенциале фиксации -4( мВ 0 = 20+2 °С) и частоте стимуляции двигательного нерва 0,03 Гц амплитуда ТКГ составляла 155±34 нА (п=19 синалсов). После аппликации АТФ наблюдалос! снижение амплитуды многоквантовых ТКП (рис. 1А). АТФ в концентрации 10" моль/л снижала амплитуду ТКП до 65±4% (п=11, Р<0,05) от контрольного значения Аденозин в той же концентрации уменьшал амплитуду ТКП до 70±3% (п=16, Р<0,05] (рис. 1А). Как для АТФ, так и для аденозина падение амплитуды было обратимым при отмывке физиологическим раствором. Таким образом, оба пуринергическю агента оказывали сходное пресинаптическое ингибиторное влияние на вызванную активность нервно-мышечного синапса.

Влияние ЛТФ и аденозина на амплитудно-временные характеристики миниатюрных TKXI

На не рассеченной мышце (мембранный потенциал -70 мВ) ни АТФ. ни |Денозин не меняли амплитуды и длительности одноквантовых ответов - МТКП (рис. Б). Не менялся и коэффициент потенциалозавнсимости спада МТКП «Н» [Anderson i Stevens, 1973], который равнялся 106±10 мВ в контроле (п=Т0), а в присутствии шенозина - П8±10 мВ (п=11, Р>0,05). АТФ также не меняла этот параметр, Н-юэффициент в этом случае был равен 95± 11 мВ (п=8, Р>0,05). Эти данные ;видетельствовали о том, что АТФ и аденозин не вызывают блока открытого ионного :аиала холинорецептора. Эти данные говорят также о том, что АТФ и аденозин тнетают амплитуду ТКП только через пресинаптический механизм.

А

Б

контроль А ТФ

ТКП!

1 MC

IOC) iiA

1 мс

контроль аденозин

контроль АТФ

контроль аденозин

МТКП

Рис. 1

Влияние АТФ и аденозина на многоквантовые ТКП (А) и миниатюрные ТКП (Б) в нервно-мышечном синапсе лягушки. Концентрация АТФ и аденозина - 10'4 иоль/л.

Аденозин приводил к выраженному снижению спонтанной секреции нервного 'кончания. Так, в контрольных условиях частота МТКП была равна 0,91±0,21 Гц п=13), а в присутствии аденозина частота снизилась до 0,40±0,11 Гц (п=6, Р<0,05). *ТФ не меняла достоверно частоты МТКП. К 5 мин действия АТФ частота составила ,06+0,17 Гц (п=6, Р>0,05), а к 15 мин действия этого агента - 0,73±0,1 Гц (п=6; '"-•0,05). Таким образом, несмотря на сходный эффект АТФ и аденозина на

вызванную секрецию, влияние этих пуринов на спонтанную секрецию трансмиттера синапсе различалось.

В следующей серии экспериментов мы попытались ответить на главный вопро! способна ли АТФ самостоятельно оказывать пресинаптическое ингибиторнс действие или для этого необходима деградация АТФ до аденозина. Для ответа на этс вопрос была проведена серия экспериментов с использованием блокаторов Р1 и Р пуриноцепторов.

АТФ И АДЕНОЗИН - ДВА РАЗЛИЧНЫХ МОДУЛЯТОРА НЕРВНО-МЫШЕЧНОЙ ПЕРЕДАЧИ

Эффекты антагонистов Р1 рецепторов

Для того чтобы разделить эффекты АТФ и аденозина первоначальн использовали неспецифический блокатор аденозиновых рецепторов теофиллт Теофиллин полностью снимал угнетающее действие аденозина. Так, в присутстви теофиллина (10"3 моль/л) амплитуда ТКП при аппликации аденозина в концентраци Ю'4 моль/л составила 99±10% (п=5, Р>0,05), то есть не отличалась от контрольно величины. Если же на фоне теофиллина апллицировали АТФ (104 моль/л), то ладени амплитуды ТКП сохранялось в той же мере - 71±4% (п=5, Р<0,05), как и в раствор без теофиллина.

Аналогичный результат был получен с использованием селективног блокатора А] подтипа аденозиновых рецепторов - БРСРХ. ЭРСРХ (10"7 моль/л полностью предотвращал пресинаптический эффект аденозина. Амплитуда пр: аппликации аденозина (104 моль/л) оставалась на контрольном уровне - 94±7% (п=4 Р>0,05). В этих же условиях ингибиторный эффект АТФ сохранялся в полной мере Амплитуда ТКП под действием АТФ снизилась до 57±9% (п=4, Р<0,05), что н отличалось от эффекта этого агента в отсутствии блокатора.

Таким образом, сохранение депрессорного действия АТФ на фоне блокаторо; аденозиновых рецепторов, которые полностью устраняли эффекты аденозина говорит в пользу прямого пресинаптического эффекта АТФ в нервно-мышечжм синапсе.

Эффекты антагонистов Р2 рецепторов

В следующей серии экспериментов исследовали влияние антагонистов Р: рецепторов на эффекты АТФ и аденозина. Для этого использовали неселективньп антагонист Р2 пуриноцепторов сурамин, блокатор фермента экто-5'-нуклеотцдазь конканавалин А и стойкий аналог АТФ ос,р-метиленАТФ.

Сурамин (К)"4 моль/л) предотвращал снижение амплитуды ТКП, вызванно< АТФ (амплитуда ТКП составила 98±11% от исходной; п=7, Р>0,05). Е

цгативоположностъ этому, пресинапгический эффект аденозина (10"4 моль/л) юхранялся. Амплитуда ТКП в присутствии аденозина снижалась до 78+5% (п=4; '<0,05), что достоверно не отличалось от падения амплитуды при аппликации иенозина в отсутствии сурамина.

Последний этап превращения АТФ в аденозин регулируется экто-5'-1уклеотидазой, которую можно ингибировать коканавалином A [Kreutzberg et al., 1986]. Если бы АТФ оказывала свое влияние после превращения в аденозин. то' UH 1)оне конканавалина Л не наблюдалось бы депрессорного эффекта АТФ. Однако'в шлих экспериментах конканавалии А (0,1 мг/мл) не изменял пресинаптического »ффекта АТФ. На фоне конканавалина А АТФ снижала амплитуду ТКП до 75±3% п=5, Р<0,05), го есть также, как и в контроле. ■1' • '

Стойкий аналог АТФ «,|3-метиленЛТФ способна маскировать эффекты АТФ, ;лабо проявляя при этом собственную активность агониста [Kliakh et al., 1995]. Действительно, при введении КГ4 моль/л АТФ на фоне а,[3-метиленАТФ (1СГ4 моль/'л). :нижения амплитуды ТКП не наблюдалось (91±П%, п=б, Р>0,05). Наоборот, щенозин (10"4 моль/л) продолжал снижать амплитуду ТКП на фоне а,р-метиленАТФ Ю 65±5% (п=3, Р<0,05).

Эти экспериментальные данные подтверждают гипотезу о том, что АТФ и щенозин осуществляют свои эффекты через разлившие пресинаптические рецепторы m нервной терминали. •

.J' т

Аддитивность эффектов АТФ и аденозина

Дополнительное свидетельство того, что АТФ и аденозин реализуют фесинаптическое ингибиторное влияние на нервно-мышечную передачу через >азличные рецепторы двигательного нервного окончания, было получено в |кспериментах с комбинированной аппликацией АТФ и аденозина. Даже когда юнцентрация аденозина (10"4 моль/л) была близка к насыщающей (Ribeiro & Walker, 975; Giniatullin & Sokolova, 1998), аппликация 10"* моль/л АТФ приводила к юполнительному снижению амплитуды. Так, амплитуда в контроле была равна 05±7 нА (п=3), при аппликации аденозина амплитуда снизилась и достигла 65±5 нА п=3, Р<0,05), АТФ на фоне аденозина дополнительно снизила амплитуду до 36±8 нА п=3, Р<0,05).

Аддитивность эффектов АТФ и аденозина говорила в пользу не только уществования различных пресинаптических рецепторов, но и разных лутриклеточных сигнальных систем, с которыми взаимодействуют два этих пурина.

ЭФФЕКТЫ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА АТФ НА НЕРВНО-МЫШЕЧНУЮ

ПЕРЕДАЧУ

Влияние продуктов расщепления АТФ на многоквантовые ТКП в условиях редкой стимуляции Помимо аденозина, продуктами гидролиза АТФ являются АДФ и АМФ. Дл; более систематического анализа модулирующей роли эндогенных пуринов мь исследовали влияние продуктов гидролиза АТФ на многоквантовые ТКП (рис. 2).

Депрессорное действие АДФ было выражено слабее, чем у АТФ. АДФ (10" моль/л) уменьшала амплитуду до 80±4% (п=б, Р<0.05), что достоверно (Р<0,05 отличалось от снижения амплитуды при аппликации АТФ. АМФ также приводила i депрессии амплитуды ТКП до 71±10% (п=7, Р<0.05), что могло объяснять^ действием АМФ на Р1 или Р2 рецептор. В пользу эффекта АМФ через Р1 рецепторь стали эксперименты с блокатором Р1 рецепторов теофиллином. АМФ не вызывал, снижения амплитуды, когда в растворе присутствовал теофиллин (10"3 моль/л) Амплитуда ТКП при этом составила 96+5% (п=3, Р>0.05) по сравнению с исходной Следовательно, действие АМФ реализуется в основном через Р1 рецептор.

Таким образом, АТФ и все рассмотренные ее производные оказали« эффективными регуляторами секреции медиатора. Все они оказывают тормозное влияние на секрецию медиатора из нервных окончаний. Можно думать, что реальная степень участия эндогенных продуктов гидролиза АТФ в модуляции синаптическо» передачи in vivo будет зависеть от активности ферментов гидролизующих АТФ, г также от типа и плотности пуринергических рецепторов.

Б

180

аденошн

20

контроль

80

О

АТФ АДФ АМФ аденозин

О 5 10 15 20 25 номер ТКП

Рис. 2

Эффекты АТФ и продуктов ее гидролиза на одиночные (А) и ритмические ТКП (Б). Для Б - частота стимуляции 60 Гц. Концентрация всех веществ - 10'4 моль/л. Звездочкой показано достоверное отличие.

Влияние АТФ и продуктов ее расщепления на ритмическую активность нервно-мышечного синапса

Поскольку естественной формой функционирования синапса является передача оротких высокочастотных пачек импульсов, было интересно выяснить, какое лияние оказывают экзогенные пурины на синаптические токи при ритмической тимуляции двигательного нерва. В следующей серии экспериментов изучали лияние АТФ и ее производных, на динамику ТКП при ритмической стимуляции вигательного нерва с частотой 60 Гц (рис. 2Б).

В контроле в пачке, состоящей из 20 импульсов, следующих с частотой 60 Гц, аблюдалось первоначальное облегчение до 5 сигнала с последующей депрессией.

При введении АТФ и ее производных (АДФ, АМФ и аденозина) в онцентрации 10"4 моль/л происходило усиление начального облегчения амплитуд итмических ТКП, что хорошо согласуется с описанным выше пресинаптическим нгибиторным эффектом пуринов. Особенно выраженным был эффект АТФ и денозина, указывая на то, что именно эти два агента могут быть наиболее ффективными модуляторами синапгической передачи.

Таким образом, АТФ и ее производные способны модулировать проведение итмических серий импульсов через нервно-мышечный синапс.

ТИП РЕЦЕПТОРА АТФ

Установленный нами факт прямого ингибиторного действия АТФ на секрецию едиатора закономерно привел к необходимости выяснения подтипа рескнаптического Р2 рецептора. Известно, что Р2 рецепторы подразделяются на онотропные (Р2Х) и метабогропные (P2Y) подтипы (Abbracchio, 1997). Поэтому ледуюшая серия экспериментов была посвящена определению подтипа рецепторов *ТФ на пресинаптической мембране нервно-мышечного синапса холоднокровных.

Влияние селективного антагониста Р2Х рецепторов

Для того чтобы разделить эффекты АТФ реализуемые через Р2Х и P2Y ецепгоры, первоначально использовали специфический блокатор Р2Х уриноцепторов PPADS.

PPADS в концентрации 10"5 моль/л, в которой он эффективно блокирует Р2Х гцепторы в других тканях (Ziganshin et al., 1996), не устранял ингибиторного дияния АТФ на ситаптическуто передачу (рис. ЗА). При аппликации АТФ (10"4 оль/л) в присутствии PPADS происходило снижение амплитуды ТКП до 68±4% 1=4, Р<0,05), что достоверно не отличалось от снижения амплитуды в отсутствии PADS в растворе. Это было первым свидетельством того, что эффект АТФ :уществляется не через Р2Х рецепторы.

А

100r

Р 50

*

контроль PPADS PFADS+ АТФ

В

контроль

Б

160, ) I

I

140 120 10D 80

60L

рН=8

Г

АТФ

УТФ

Ю 20 30 40 50 М) ирсмя, мин

Рис. 3

Влияние селективного агониста Р2Х рецепторов РРАБЙ (А) и рН среды на эффекты АТФ (Б); влияние АТФ на потенциал действия нервного окончания (В); эффекты АТФ и УТФ на амплитуду ТКП (Г). Концентрация АТФ и УТФ во всех экспериментах - 10"4 моль/л. Звездочкой показано достоверное отличие.

Влияние рН на эффекты АТФ

В качестве дополнительного подхода, позволяющего разделить эффект! активации Р2Х и P2Y рецепторов, мы использовали высокую чувствителыюст; подтипов Р2Х рецептора к рН, тогда как P2Y рецепторы таким свойством н обладают [King et al„ 1996; Stoop et al„ 1997].

В экспериментах с кислой средой (рН=6) падение амплитуды ТКП (рис. ЗБ при аппликации КГ4 моль/л АТФ происходило до 62+9% (п=3, Р<0,05), с щелочи«; средой (рН=8) - до 68±10% (п=4, Р<0,05). В итоге при сравнении эффективности ATit

трех экспериментальных условиях (рН=6, рН=7,2, рН=8) выяснилось, что активная еакция среды не влияет на степень угнетения амплитуды ТКП. Этот результат одтвердил вывод о том, что пуриновые Р2 рецепторы, расположенные на ресинаптической мембране нервного окончания, не относятся к Р2Х подтипу.

Влияние АТФ на потенциал действия нервного окончания

В ресничном ганглии в условиях прямой внутриклеточной регистрации был бнаружен пресинаптический деполяризующий эффект АТФ [Sun & Stanley, 1996]. ели пуриновые рецепторы на нервном окончании нервно-мышечного синапса гносятся к Р2Х подтипу, то введение АТФ также должно вызывать изменения араметров потенциала действия нервного окончания. Однако в наших кспериментах, проведенных в условиях внеклеточной регистрации потенциала ействия, после аппликации 1СГ4 моль/л АТФ потенциал действия не изменился (рис. В). В контроле амплитуда натриевого компонента потенциала действия составила ,22±0,02 мВ (n=5), а в присутствии АТФ - 0,25+0,04 мВ (п=5, Р>0,05).

Таким образом, три использованных теста однозначно показали, что ресинаптические рецепторы на двигательном нервном окончании не относятся к одтипу ионотропных Р2Х рецепторов. Если этот вывод является справедливым, то ресинаптическим действием должен обладать агонист P2Y рецепторов УТФ.

Эффекты УТФ на многоквантовые ТКП

При введении УТФ в концентрации 10"4 моль/л наблюдалось снижение мплитуды ТКП (рис. ЗГ). Если в контроле амплитуда ТКП составляла 185±41 нА 1=8), то при аппликации УТФ она равнялась 150+38 нА (п=8, Р<0,05). Степень нижения амплитуды при действии УТФ достоверно отличалась от таковой при АТФ i2±6% и 65+4%, соответственно, Р<0,05). Во время ритмической активности синапса частотой 60 Гц УТФ вызывала облегчение амплитуд ТКП в пачке. Следовательно, ТФ как и ранее исследованные пурины, была способна оказывать ингибиторное гйствие на синаптическую передачу, оказывая влияние на одиночные ТКП и одулируя проведение ритмических серий импульсов.

Таким образом, нечувствительность ингибиторного эффекта АТФ к пагонисту Р2Х рецепторов PPADS, к сдвигам рН, а также неизменность кплитудно-временных параметров потенциала действия нервного окончания в рисутствии АТФ, как и проявление ингибиторного влияния УТФ, говорит в пользу гализации эффектов пуринов в нервно-мышечном синапсе через P2Y подтип уриноцепторов, который согласно данным литературы является G-белок связанным зцептором [Abbracchio & Bumstock, 1994; Fredholm et al., 1994]. Так как, активность -онистов Р2 рецепторов в нервно-мышечном соединении убывает в следующей эследовательности: АТФ>АДФ=УТФ, можно сделать вывод о том, что ресинаптические Р2 рецепторы относятся к Р2У2 подтипу.

ПОСТСИНАПТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ АТФ

Из данных литературы известно, что АТФ, в отличие от аденозина, способ] потенциировать ответы постсинаптический мембраны на ацетилхолин [Akasu et а 1981; Igusa, 1988; Lu & Smith, 1991], возможно за счет непосредственной активащ АТФ ионного канала ацетилхолинового рецептора [lgusa, 1988]. Моял предположить, что, АТФ увеличивая чувствительность постсинаптической мембран к ацетилхолину, будет участвовать в процессах синаптической пластичност Поэтому мы по ряду тестов анализировали возможность постсинаптическо) действия АТФ в нервно-мышечном синапсе.

Влияние АТФ на постсннаптическую мембрану

В первой серии экспериментов исследовали чувствительное' постсинаптической мембраны к АТФ. На не рассеченной мышце (мембраянь потенциал -70 мВ, активная ацетилхолинэстераза) АТФ даже в концентрации It моль/л не влияла на мембранный потенциал покоя мышечного волокна. В контро) мембранный потенциал составлял -75+5 мВ (п=15), а в присутствии АТФ составил 73+4 мВ (п=Т5, Р>0,05), что говорило против деполяризующего эффекта этого агента

Как уже указывалось ранее, АТФ не меняла амплитуду и длительное! миниатюрных ТКП. Единственным признаком, свидетельствующим иостсинаптнческом эффекте АТФ, оказался феномен постсииаптическс потенциации.

Известно, что при парной стимуляции двигательного нерва происход» замедление спада второго ТКП за счет проявления функциональной роли компяек холинорецеитор - одна молекула ацетидхолина [Magazanik, Nikolsky & Giniatulli; 1984]. Аппликация АТФ в концентрации 10"3 моль/л привела к уменьшению этог проявления постсинаптической потенциации от 121±3% (п=8) в контроле до 104+2' (п=8, Р<0,05). Важно отметить то, что в отличие от снижения потенциаци; вызванной аденозином или ионами магния, постоянная времени спада первого ТК при этом практически не менялась. Постсинаптическое действие АТФ на постоянну: времени спада и постсннаптическую потенииацию полностью совпадало аналогичным действием самого ацетидхолина [Feltz & Trautmann, 1980; Гиниатулли и др., 1986]. Вполне вероятно, что АТФ, так же как ацетилхолин, имеет повышенну; вероятность активации комплексов холинорецептор - одна молекула ацетилхолин: ответственных за феномен постсинаптической потенциации. В пользу этого говорит тот факт, что никотиновый рецептор имеет внеклеточные центры связывания АТ< [Carlson & Raftery, 1993].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование было посвящено изучению модулирующей роли неклеточной АТФ в нервно-мышечном синапсе. Наши результаты, также как и анные других авторов, полученные в последнее время, значительно расширяют редставление о физиологической роли АТФ в организме. Главным результатом вляется то, что в отличие от распространенного мнения [Ribeiro & Sebastiao, 1987; leriney & Grinnell, 1991; Hamilton & Smith, 1991; Redman & Silinsky, 1994], мы олучили несомненные свидетельства того, что АТФ в нервно-мышечном синапсе :ожет быть не только источником другого активного пурина - аденозина, но и бладает собственной активностью как на пре-, так и постсинаптическом уровне, [аши экспериментальные данные показали, что АТФ способна угнетать секрецию :едиатора через собственный рецептор, отличный от рецептора для аденозина. далось выяснить, что этот пресинаптический рецептор относится не к онотропному, как в некоторых других нервных окончаниях [Sun & Stanley, 1996], а к етаботропному типу. Оказалось, что как другие пурины, являющиеся продуктами вдролиза АТФ, так и фармакологическими агонистами Р2 рецепторов, способны риводить к угнетению синаптической передачи. Однако пик активности приходится а два соединения - АТФ и аденозин. На постсинаптической мембране АТФ может одулировать феномен постсинаптической потенциации, в основе которого лежит как гашение вероятности повторной активации зон постсинаптической мембраны, так и ероятное взаимодействие АТФ с комплексом холинорецептор - одна молекула цетилхолина, ответственных за феномен постсинаптической потенциации. Таким эразом, полученные экспериментальные результаты позволяют считать уринергические соединения вполне вероятными эндогенными модуляторами ;креции ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе.

ВЫВОДЫ

АТФ и аденозин оказывают пресннаптическое угнетающее влияние на нервно-мышечную передачу, снижая квантовый состав многоквантовых токов концевой пластинки. Аденозин вызывает снижение частоты миниатюрных токов концевой пластинки, АТФ существенно не меняет частоты спонтанной секреции медиатора. Антагонисты Р1 пуриноцепторов теофиллин и DPCPX устраняют угнетающее влияние аденозина на вызванную секрецию трансмиттера, не влияя на пресинаптический эффект АТФ.

Антагонист Р2 пуриноцепторов сурамин и стойкий аналог АТФ а,(3-метиленАТФ устраняют угнетающий эффект АТФ на секрецию ацетилхолина, не влияя на пресинаптический эффект аденозина.

4. Ингибитор реакции превращения АТФ в аденозин конканавалин А не влияет ( угнетающее действие АТФ на синаптическую передачу. Это указывает на то, чт влияние АТФ не реализуется через ее превращение в аденозин.

5. Снижение амплитуды синаптических токов при аппликации АТФ и аденозш является аддитивным, свидетельствуя о том, что АТФ и аденозин тормоз« активность нервно-мышечного синапса через различные пресинаптичесю; рецепторы и разные внутриклеточные механизмы.

6. Продукты гидролиза АТФ (АДФ, АМФ, аденозин) обладают способность! угнетать синаптическую передачу по пресинаптическому механизму. Угнетающе действие АДФ на вызванную секрецию выражено меньше, чем у АТФ.

7. Пресинаптические эффекты АТФ в нервно-мышечном синапсе опосредуются чере метабогропные Р2У рецепторы в нервных окончаниях. Об этом свидетельствует т< что: а) селективный антагонист ионотропных Р2Х пуриноцепторов РРА08 н влияет на эффекты АТФ; б) амплитуда и длительность потенциала действи двигательного нервного окончания не меняется при аппликации АТФ; I ингибиторное влияние АТФ не зависит от смещения рН как в кислую, так и щелочную сторону.

8. Агонист Р2У пуриноцепторов УТФ снижает амплитуду токов концевой пластинк в меньшей степени, чем АТФ в той же концентрации. Активность агонистов Р рецепторов в нервно-мышечном соединении убывает в следующе последовательности: АТФ>АДФ=УТФ. Эти данные свидетельствуют о том, чт пресинаптические Р2 рецепторы относятся к Р2У2 подтипу.

9. АТФ не влияет на мембранный потенциал покоя мышечного волокна и не изменяе амплитудно-временных характеристик МТКП, но снижает проявление феномен постсинаптической потенциации в условиях парной стимуляции двигательног нерва.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Гиниатуллин P.A., Соколова Е.М. Влияние пуринергических соединений на постсинаптическую потенциацию в нервно-мышечном синапсе. // Тез. I Междунар. совещания по эволюционной физиологии, С.-Петербург, 1996, стр. 47-

. Соколова Е.М., Гиниатуллин Р.А., Зиганшин А.У. Возможная роль АТФ в процессах постсинаптической пластичности. // Тез. Всерос. симп. и школы-семинара молодых ученых и учителей: Проблемы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке, Казань, 1996, стр. 90. . Khiroug L, Giniatullin R„ Sokolova E., Talantova M., Nistri A. Imaging of intracellular calcium during desensitization of nicotinic acetylcholine receptors of rat chromaffin cells. // Br. J. Pharmacol., 1997, vol. 122, pp. 1323-1332. . Соколова E.M., Чикаев В.Ф., Гиниатуллин P.A., Агаджанян С.И. Влияние антисептиков ЭХАРа и хлоргексидина на функциональное состояние периферического нервно-мышечного аппарата. П Казанский медицинский журнал, 1997, том 78, N2, стр. 107-110. . Соколова Е.М., Р.А. Гиниатуллин. Действие АТФ и аденозина на токи концевой пластинки лягушки. // Тез. научно-практ. конф. молодых ученых КГМУ, Казань,

1997, стр. 49.

. Giniatullin R., Khiroug L., Sokolova E„ Talantova M., Nistri A. Intracellular calcium keeps neuronal acetylcholine receptors in a desensitized state. // Abstr. Conference Internationale: La tramsmission synaptique et sa modulation, Paris, 1997, p. 31. Giniatullin R.A., Sokolova E.M. ATP and adenosine inhibit transmitter release at the frog neuromuscular junction through distinct presynaptic receptors. // Br. J. Pharmacol..

1998, vol. 124, pp. 839-844.

. Khiroug L., Sokolova E., Giniatullin R., Afzalov R., Nistri A. Recoveiy from desensitization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors of rat chromaffin cells is modulated by intracellular calcium through distinct second messengers. // J. Neurosci., 1998, vol.18, N7, pp.2458-2466.

Гиниатуллин P. А., Соколова E.M.. Модулирующая роль АТФ в нервно-мышечном синапсе. // Российский физиологический журнал, 1998, N10, стр. 1132-1138. Э. Гиниатуллин Р.А., Соколова Е.М., Талантова М.В., Афзалов Р.А., Хируг JI.C., Нистри А. Роль ионов кальция и вторичных посредников в десенситизации холинорецепторов. // Тез. 17 Съезда физиологов России, Ростов-на-Дону, 1998, стр. 222.

1. Гиниатуллин Р. А., Соколова Е.М., Пряжников Е.Г., Галкин А.В. Пресннаптические эффекты АТФ и ее производных в нервно-мышечном синапсе. // Тез. V Всерос. школы: Актуальные проблемы нейробиологни., Казань, 1998, стр.

48.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Елена Михайловна, Казань

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

>1 Ь

Соколова Елена Михайловна

ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ НЕРВНО-МЫШЕЧНОЙ ПЕРЕДАЧИ

03.00.13. - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Гиниатуллин Рашид Асхатович

КАЗАНЬ - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ___стр.

1.1. Актуальность исследования _5

1.2. Цель и задачи исследования_6

1.3. Положение, выносимое на защиту_7

1.4. Научная новизна__7

1.5. Научно-практическая ценность_8

1.6. Апробация работы_8

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

ПУРИНЫ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

2.1. Хранение и высвобождение АТФ_11

2.2. Метаболизм АТФ _12

2.3. Классификация пуринергических рецепторов_14

2.3.1.1. Классификация Р1 рецепторов__15

2.3.1.2. Агонисты и антагонисты аденозиновых рецепторов_16

2.3.1.3. Характеристика вторичных посредников аденозиновых рецепторов_17

2.3.1.4. Распространение в организме и функциональная роль аденозиновых рецепторов.

Ах рецепторы_______20

А2а рецептор ы__21

Взаимодействие между А\ и А2а рецепторами_24

А2ь рецепторы_25

А3 рецепторы_______26

2.3.2.Классификация Р2 рецепторов^_27

2.3.2.1. Распространение в организме и функциональная роль пуриновых рецепторов

Р2Х рецепторы _28

Р2У рецепторы_31

2.3.2.2. Агонисты и антагонисты Р2 пуриноцепторов_36

2.3.2.3. Характеристика вторичных посредников Р2У рецепторов_37

2.4. Возможные механизмы регуляции нервно-мышечной передачи аденозином_38

2.5. Пресинаптические эффекты: АТФ или аденозин_40

2.6. Постсинаптические эффекты АТФ_

44

З.ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объект исследования________47

3.2. Ванночка. Система перфузии_____47

3.3. Растворы_____48

3.4. Микроэлектроды_49

3.5. Усилительная и регистрирующая аппаратура_49

3.6. Стимуляция двигательного нерва__50

3.7. Анализ вызванной секреции медиатора_51

3.8. Анализ спонтанной квантовой секреции медиатора_51

3.9. Анализ амплитудно-временных параметров составного потенциала действия нервного окончания____52

3.10. Статистическая обработка экспериментальных данных_53

4.РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Пресинаптические эффекты АТФ и аденозина_55

4.1.1. Влияние АТФ и аденозина на многоквантовые ТКП_55

4.1.2. Влияние АТФ и аденозина на амплитудно-временные характеристики миниатюрных ТКП _59

4.2. АТФ и аденозин - два различных модулятора нервно-мышечной передачи_63

4.2.1. Эффекты антагонистов Р1 рецепторов_63

4.2.2. Эффекты антагонистов Р2 рецепторов_66

4.2.3. Аддитивность эффектов АТФ и аденозина_70

4.3. Эффекты продуктов гидролиза АТФ на нервно-мышечную передачу_73

4.3.1. Влияние продуктов расщепления АТФ на многоквантовые ТКП в условиях редкой стимуляции________73

4.3.2. Влияние АТФ и продуктов ее расщепления на ритмическую активность нервно-мышечного синапса_76

4.4. Тип рецептора АТФ____79

4.4.1. Влияние селективных агонистов и антагонистов Р2Х рецепторов_79

4.4.2. Влияние рН на эффекты АТФ_81

4.4.3. Влияние АТФ на потенциал действия нервного окончания_84

4.4.4. Эффекты УТФ на много квантовые ТКП_86

4.5. Постсинаптические эффекты АТФ и аденозина_88

4.5.1. Влияние АТФ на постсинаптическую мембрану_88

4.5.2. Влияние аденозина на постсинаптическую мембрану_92

4.5.3. Зависимость постоянной времени спада от амплитуды многоквантовых ТКП при действии Mg2+, аденозина и АТФ_93

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ_96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ_107

6. ВЫВОДЫ_108

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ_110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Химические соединения: АТФ - аденозин 5'-трифосфорная кислота; АДФ - аденозин 5'-дифосфорная кислота; АМФ - аденозин 5'-монофосфорная кислота; УТФ - уридин 5'-трифосфорная кислота;

РРАОБ - пиридоксальфосфат-6-азафенил-2',4'-дисульфоновая кислота; ВРСРХ - 1,3-дипропил-8-циклопентилксантин;

а,Р-метиленАТФ - а,Р-метилен аденозин 5'-трифосфат (модификация в молекуле АТФ трифосфатной группы).

Электрофизиологичесие термины:

ТКП - ток концевой пластинки;

МТКП - миниатюрный ток концевой пластинки.

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность исследования. В последнее время накопились данные о том, что АТФ, помимо внутриклеточной роли как макроэргического соединения, может принимать участие в межклеточной передаче сигналов [Burnstock & King, 1996; Burnstock, 1996b; Abbracchio, 1997], выступая как трансмиттер [Edwards et at, 1992], или как котрансмиттер [Burnstock & King, 1996; Redman & Silinsky, 1996]. Особый интерес в этом вопросе представляет нервно-мышечный синапс, для которого прямым методом регистрации было установлено выделение АТФ в синаптическую щель во время стимуляции двигательного нервного окончания [Redman & Silinsky, 1996]. Эти данные делают вполне обоснованным предположение о том, что АТФ может выступать в роли эндогенного модулятора нервно-мышечной передачи. Действительно, еще в 1975 году было показано, что в нервно-мышечном соединении экзогенная АТФ подавляет синаптическую передачу [Ribeiro & Walker, 1975]. Однако во всех последующих работах предполагалось, что механизм угнетающего действия АТФ основан на непрямом эффекте, в результате гидролиза АТФ до пресинаптически активного аденозина [Ribeiro & Sebastiao, 1987; Meriney & Grinnell, 1991; Redman & Silinsky, 1994]. Аденозин, действительно, известен как агент, который ингибирует спонтанную и вызванную секрецию нейротрансмиттера [Ginsborg & Hirst, 1972]. Более того, было предположено, что именно эндогенный аденозин опосредует синаптическую депрессию во время ритмической стимуляции двигательного нерва [Meriney & Grinnell, 1991; Redman & Silinsky, 1994].

С другой стороны, исследования последних лет показали широкое распространение как ионотропных Р2Х рецепторов, так и G-белок связанных метаботропных P2Y рецепторов во многих тканях организма, включая нервно-

мышечную систему [Burnstock & Kennedy, 1985; Chen et al., 1995; Collo et al., 1996]. Таким образом, согласно последним данным литературы, вероятность собственного эффекта АТФ в нервно-мышечном синапсе довольно высока. Недавно [Robitaille, 1995] появились новые данные о том, что скорость деградации эндогенной АТФ до аденозина в нервно-мышечном синапсе, в сравнении со скоростью гидролиза ацетилхолина, относительно невысока. Для синапсов ресничного ганглия было установлено прямое действие АТФ на пресинаптическую терминаль через ионотропные Р2Х рецепторы [Sun & Stanley, 1996]. Эти данные литературы, а также наличие синтезированных в последнее время агонистов и антагонистов рецепторов АТФ [Ziganshin et al, 1994], и послужили основанием для более детального исследования влияния АТФ и ее производных на функцию нервно-мышечного синапса.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучение модулирующей роли пуринергических соединений в регуляции синаптической передачи в нервно-мышечном синапсе. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить пресинаптические эффекты АТФ и продуктов ее гидролиза в нервно-мышечном синапсе.

2. Исследовать действие пуринергических соединений на постсинаптическую мембрану.

3. Изучить влияние АТФ и ее производных на проведение ритмических серий импульсов через нервно-мышечный синапс.

4. Исследовать влияние антагонистов Р1 и Р2 рецепторов на пресинаптические эффекты АТФ и аденозина.

5. Установить подтип (Р2Х или Р2У) пресинаптических рецепторов, опосредующих действие АТФ на секрецию медиатора.

1.3. Положение, выносимое на защиту:

В нервно-мышечном соединении АТФ способна ингибировать секрецию трансмиттера через собственный рецептор на пресинаптической мембране, отличный от рецептора для аденозина и относящийся к Р2У подтипу. В соответствии с этим, АТФ, так же как аденозин, может выступать в качестве эндогенного пресинаптического нейромодулятора в нервно-мышечном соединении.

1.4. Научная новизна. В настоящем исследовании впервые было показано, что АТФ, высвобождающаяся вместе с ацетилхолином из синаптических везикул в нервно-мышечном синапсе, может модулировать секрецию ацетилхолина через собственный пуриноцептор, отличный от пресинаптического аденозинового рецептора. Установлена аддитивность действия АТФ и аденозина на секрецию медиатора, что предполагает реализацию их эффектов через различные внутриклеточные сигнальные механизмы. Выяснено, что пресинаптические ингибиторные эффекты АТФ в нервно-мышечном синапсе не зависят от рН. Впервые выявлено, что УТФ является агонистом пресинаптических пуриноцепторов в нервно-мышечном синапсе и способна оказывать угнетающее влияние на секрецию ацетилхолина. Установлена сравнительная активность широкого круга агонистов пресинаптических пуриноцепторов в их влиянии на секрецию ацетилхолина из двигательного нервного окончания. Показано, что пресинаптические пуриновые рецепторы в нервно-мышечном соединении относятся к Р2У подтипу. Впервые исследовано влияние АТФ и продуктов ее гидролиза на кратковременную пресинаптическую пластичность,

проявляющуюся в условиях ритмической активности. Новыми являются данные по влиянию пуринергических соединений на постсинаптическую потенциацию. В частности, установлено, что экзогенная АТФ устраняет явление потенциации, что позволяет думать, что и эндогенная АТФ, выделяемая в виде котрансмиттера, способна участвовать в формировании кратковременной постсинаптической пластичности в синапсе.

1.5. Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют наши представления о функциональной организации двигательного нервного окончания. Эти данные вскрывают новые пути модуляции синаптической передачи на пресинаптическом уровне. Результаты проведенного исследования позволяют по-новому взглянуть на роль АТФ в нервно-мышечном синапсе, где она может выступать эндогенным модулятором синаптической передачи, а ее фармакологические аналоги могут быть использованы в качестве средств для целенаправленной регуляции секреторного процесса через Р2 рецептор на двигательном нервном окончании.

1.6. Апробация работы. Основные результаты доложены на 9 Международном симпозиуме по холинергическим механизмам (Майнц, Германия, 1995), I (IX) Международном совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996), на Всероссийской конференции «Растущий организм, адаптация к возрастающей физической нагрузке» (Казань, 1996), на конференции молодых ученых по холинергическим и пуринергическим механизмам (Казань, 1996,1997), на Международной конференции «Модуляция синаптической передачи» (Париж, 1997), на 3 Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), 17 Съезде

физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), на Российской конференции «Физиология сигнальных молекул» (Москва, 1998), V Всероссийской школе «Актуальные проблемы нейробиологии (Казань, 1998), на заседаниях кафедры нормальной физиологии КГМУ (1998) и кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека КГПУ (1998).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПУРИНЫ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ: ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

Помимо хорошо известной роли АТФ как внутриклеточного энергетического субстрата, к настоящему времени получены убедительные данные о том, что АТФ может выполнять функцию возбуждающего нейротрансмиттера в центральной [Evans et al., 1992] и периферической [Burnstock et al., 1985] нервной системе. Еще в 1972 году Burnstock предположил, что АТФ может выполнять роль эффектора в автономных неадренергических и нехолинергических процессах проведения возбуждения. Пуринергические синапсы описаны во многих органах и тканях, они широко представлены в желудочно-кишечном тракте, в мочевом пузыре, семявыносящем протоке, пищеводе, матке, трахее, а также в центральной нервной системе. Кроме того, АТФ является котрансмиттером, сопровождающим ряд классических нейромедиаторов и выделяется при активации пре- и постсинаптической мембраны в синаптическую щель. Можно предположить, что в таких синапсах АТФ выполняет модулирующую роль в синаптической передаче. Одно из первых предположений о модулирующей роли АТФ и родственных соединений в холинергической передаче в сердце было высказано Т.М. Тур паевым (1965). Однако для нервно-мышечного синапса такая возможность изучена недостаточно. Настоящий обзор данных литературы и собственных экспериментальных результатов позволяет считать, что в нервно-мышечном синапсе АТФ может выполнять двойную модулирующую роль, самостоятельно влияя на функциональное состояние пре- и постсинаптической мембраны и являясь источником другого модулятора синаптической передачи - аденозина.

2.1. Хранение и высвобождение АТФ

В настоящее время содержание АТФ вместе с ацетилхолином в синаптических везикулах является общепризнанным фактом. Соотношение между содержанием АТФ и ацетилхолина в синаптической везикуле в ЦНС составляет 1:7 [Abbracchio, 1997], в эмбриональных мышцах цыпленка это соотношение соответствует 1:6 [Hume & Honig, 1986]. Кроме АТФ вместе с ацетилхолином в везикуле могут содержаться и другие нуклеотиды: ГТФ, УТФ, АДФ, диаденозин-фосфаты [Zimmermann, 1994]. Помимо того, что АТФ упакована в синаптических везикулах вместе с ацетилхолином, показано, что она высвобождается вместе с ним в ответ на нервный импульс [Silinsky, 1975]. Количество адениновых нуклеотидов, высвобождаемых при стимуляции седалищного нерва лягушки, составляет примерно 0,15x10"12 моль/л на одиночный стимул [Cunha & Sebastiao, 1993]. По данным других авторов синаптическая концентрация АТФ после нервного импульса может колебаться от 3-10x10"6 моль/л [Silinsky & Redman, 1996] до 25x10"6 моль/л [Ribeiro et al, 1996], а в работе Hume & Honig (1986) указывается, что концентрация АТФ может достигать 50х10"6 моль/л. Прямым свидетельством того, что АТФ высвобождается вместе с ацетилхолином при электрической стимуляции нервного окончания, стали эксперименты с использованием детекторных фрагментов мембран симпатических нейронов морской свинки [Silinsky & Redman, 1996]. Мембрану, содержащую ацетилхолиновые и АТФ-ионные каналы, обрабатывали гексаметонием, чтобы предотвратить никотиновые ответы. При стимуляция диафрагмального нерва было зарегистрировано синхронное открывание АТФ-каналов в приближенных к нервному окончанию фрагментах мембран (на расстоянии 10 мкм от нервного окончания) с латентным

периодом менее 5 мс, что явилось ярким доказательством синхронного выброса АТФ вместе с ацетилхолином.

В экспериментах, где использовалась электрическая стимуляция иннервированной скелетной мышцы, было установлено, что половина от общего выброса нуклеотидов происходит из нервной терминали, а вторая половина - из мышечного волокна [Israel et al., 1976; Smith, 1991; Cunha & Sebastiao, 1993]. В адренергическом синапсе соотношение АТФ/норадреналин гораздо более низкое, и появление АТФ в синаптической щели после стимуляции нерва происходит преимущественно за счет выброса АТФ из мышцы [Kurz et al., 1994]. Можно предположить, что в тех синапсах, где высоко соотношение АТФ/нейротрансмиттер в синаптической везикуле, появление АТФ со стороны пресинаптической мембраны имеет огромное физиологическое значение.

2.2. Метаболизм АТФ

В последующем, высвободившаяся в синаптическую щель АТФ, подвергается ферментативному расщеплению. Ферменты, ответственные за последовательность превращений АТФ, являются мембраносвязанными комплексами, их присутствие на экстраклеточной стороне мембраны показано в нейрональных, глиальных и эндотелиальных клетках. Инактивация АТФ включает в себя цепочку последовательного вовлечения экто-АТФаз, экто-АДФаз, и экто-5'-нуклеотидазы, которая производит гидролиз АМФ в аденозин. Эту цепочку в общем виде можно представить как:

ИМФ

АТФ -> АДФ -> АМФ

инозин

аденозин

[ШЬеп-о & а1, 1996].

Существует несколько путей катаболизма АТФ, включающих различные

1). АТФаза АТФ -> АДФ + Ф

2). АТФ-дифосфогидролаза (апираза) АТФ АМФ + 2Ф

3). Аденилат-киназа (АТФ:АМФ-фосфотрансфераза, миокиназа) АТФ + АМФ -> 2 АДФ

4). АТФ-пирофосфатаза АТФ АМФ + ФФ

5). Аденилат-циклаза АТФ цАМФ + ФФ

(Ф - неорганический фосфат, ФФ - неорганический пирофосфат)

В основном наиболее распространенным путем катаболизма АТФ на внеклеточной стороне мембраны являются примеры реакций 1-3. Существование реакции 4 показано лишь в некоторых тканях, а реакция 5 специфична для внутриклеточного образования цАМФ.

Интересным отличием пуринергического синапса от холинергического является то, что АДФ, АМФ, и в значительно большей степени аденозин высокоэффективные агонисты для различных типов пуриноцепторов, в то время как продукты гидролиза ацетилхолина значительно менее активны, или даже не

ферменты:

активны в сравнении с самим ацетилхолином. Более того, АТФ оказывая свои эффекты через Р2 пуриноцепторы, может приводить к тем же изменениям, что и аденозин, вызывающий сходные эффекты чрез Р1 пуриноцепторы, затрудняя правильную интерпретацию результатов [21§апзЫп е1 а!., 1994].

Кроме существования мембраносвязанных комплексов ферментов, ответственных за метаболизм АТФ, в 1997 году Тос1огоу и соавторы показали, что при стимуляции симпатического нерва морской свинки, помимо АТФ высвобождаются еще и растворимые нуклеотидазы. Они также способны расщеплять АТФ до аденозина. Подобное высвобождение специфических нуклеотидаз совместно с АТФ может представлять еще один механизм �