Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение кальциевого транзиента в двигательном нервном окончании под действием холинергических агентов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение кальциевого транзиента в двигательном нервном окончании под действием холинергических агентов"

На правах рукописи

Хазиев Эдуард Фаритович

ИЗМЕНЕНИЕ КАЛЬЦИЕВОГО ТРАНШЕ ИТ А В ДВИГАТЕЛЬНОМ НЕРВНОМ ОКОНЧАНИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ

АГЕНТОВ

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 МАЙ 2015

005568461

Казань 2015

005568461

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук (КИББ КазНЦ РАН)

Научный руководитель: Самигуллин Дм итрий Владимирович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биофизики синаптаческих процессов ФГБУН КИББ КазНЦ РАН, г. Казань

Официальные оппоненты: Зефиров Андрей Львович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВПО Казанского государственного медицинского университета Минздрава России, г. Казань

Никитин Евгений Сергеевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной нейробиологии обучения ФГБУН Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, г. Москва

Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург.

Зашита состоится «18» июня 2015 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 при Казанском институте биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН по адресу: 420111 г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31, тел/факс.: (843)2927347

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Казанского научного центра РАН. Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте КИББ КазНЦ РАН http://'www.kibb.knc.m

Автореферат разослан «77 2015 г.

Ученый смфетарь диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: dissovet@kibb.knc.ru

Пономарёва Анастасия Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Известно, что ацетилхолин, освободившийся в синоптическую икль из нервных окончаний после их деполяризации потенциалом действия, вызывает не только генерацию постсинаптического потенциала в мышечной клетке, по и модулирует интенсивность процесса выделения последующих порций медиатора (Dodge, Rahamimof? 1967). Процесс модуляции синап-пиеской передачи ацетилхолином за счет активации пресннаптических холннорецепторов рассматривается как один из механизмов, обеспечивающих синаптическую пластичность.

Несмотря на большое количество исследований (Никольский, Гиниатуллин, 1979; Wessfer, 1989; Macleod et al, 1994; Van der К toot et aL, 1997; Nikolsky et al., 2004), на сегодняшний день детали молекулярного механизма аугорегуляции синаптической передачи изучены недостаточно. Ряд авторов постулируют способность ацетилхолиновых рецепторов нервных окончаний модулировать выброс медиатора за счет изменения эффективности работы машины экзоцитоза. Поскольку ключевую роль в инициации процесса выделения медиатора выполняют ионы кальция, было выдвинуто предположение о том, что активация пресннаптических холннорецепторов угнетает вход кальция в нервное окончание при его деполяризации (Katz, Miledi, 1965 а). Однако прямого подтверждения справедливости этой гипотезы до последнего времени не было получено.

В последнее десятилетие для анализа метаболизма кальция в нервном окончании применяют оптические методы регистрации, основанные на использовании кальций чувствительных флуоресцентных 1фасителей, изменяющих уровень своего свечения при взаимодействии со свободными ионами кальция (кальциевый транзиент). Таким образом, можно оценивать изменение концентрации ионов, входящих в нервное окончание во время потенциала действия (Tsien, 1989). Также используя эту методику можно оценивать вклад различных модуляторов синаптической передачи в формирование уровня концентрации ионов кальция в нервных окончаниях. Для изучения роли изменения пресннаптического уровня кальция в процессе аугорегуляции секреции квантов медиатора в нашей лаборатории была налажена методика регистрации кальциевого транзиента в нервно-мышечном синапсе. В данном исследовании мы экспериментально оценивали вход кальция в нервное окончание при различных воздействиях на пресинаптические холинорецепторы.

Цель исследования

Целью исследования является изучение роли ионов кальция в реализации процесса аугорегуляции секреции ацетилхолина в нервно-мышечном соединешш лягушки.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить действие экзогенных холинершческих агентов на амплитуду кальциевого транзиента в нервном окончании лягушки.

2. Сопоставить действие холиномиметиков на параметры квантовой секреции и на амплитуду кальциевого транзиента.

3. Изучить влияние специфических агонистов и блокаторов холннорецепторов на кальциевый транзиент в двигательном нервном окончании.

4. Проверить гипотезу об участии кальциевых каналов и внутриклеточных кальциевых депо в реализации действия агонистов холинорецепторов на кальциевый транзиент.

5. Исследовать эффекты эндогенного ацетилхолипа на кальциевый транзиент.

6. Изучить влияние холинергических агентов на параметры вызванной секреции квантов медиатора при высокочастотной стимуляции двигательного нерва.

Положение, выносимое на защиту

В нервно-мьшЕчном синапсе лягушки активация пресинаптических мускариновых холинорецепторов Мг-подтипа и д-тубокурарин-чувствительных никотиновых холинорецепторов экзогенными холиномиметиками и ацетилхолином эндогенного происхождения снижают квантовую секрецию медиатора за счет уменьшения входа ионов кальция в цитоплазму нервного окончания через потенциал-зависимые кальциевые каналы М-тапа. "

Научная ноеизна работы

Впервые проведен анализ изменения Са2+-транзиента, который отражает вход ионов кальция в аксоплазму двигательного нервного окончания лягушки, при активации и блокаде холинергических рецепторов разных типов. Установлено, что активация холинорецепторов ацетилхолином или его негидролизуемым аналогом - карбахолином снижает пресинаптаческий уровень кальция (оцениваемый по величине кальциевого транзиента) в нервном окончании. Показано, что активация мускариновых рецепторов мускарином и никотиновых - никотином приводит к сходному эффекту - уменьшению Са2+-тржзиента. Впервые было показано, что блокада никотиновых рецепторов д-тубокурарином приводит к увеличению Са2+-транзиента. Впервые было показано, что блокада мускариновых рецепторов атропином и м его ктр амином (блокатором М2-подтипа мускариновых рецепторов) повышает Са2+-транзиент. Мстоктрамин предотвращал эффекты мускарина, а д-тубокурарин - никотина на Са2+-транзиент. При обобщении данных об уменьшении Са2+-транзиента под действием ингибитора холинэсгеразы прозерина и об увеличении Са2+-транзиента под действием блокаторов холинорецепторов с данными, полученными элекгрофизиологическими методами исследований, было сделано заключение о том, что эндогенный ацетилхолин, выделившийся в синаптаческую тель во время стимуляции двигательного нерва в физиологических условиях работы нервно-мышечного аппарата, участвует в регуляции входа кальция и уменьшает выброс квантов медиатора по принципу обратной отрицательной связи через никотиновые и мускариновые рецепторы М2-подтипа.

Научно-практическая значимость работы

Основное научно-практическое значение результатов проведенных исследований состоит в получении новых данных о наличии цепи обратной связи, регулирующий вход кальция в нервное окончание за счет активации пресинаптических холинорецепторов эндогенным ацетилхолином, освобожденным в ходе предшествующей активности или экзогенными холиномиметиками. Сравнение полученных результатов флуоресцентного исследования с данными электрофнзиологических экспериментов указывает на то, что описанные ранее эффекты ацетилхолина и его миметиков на параметры вызванной секреции квантов медиатора связаны с изменением входа Са2+ в нервное окончание. Исследования

показали, что эффекты холиномиметинов наиболее сильно проявляются при высокочастотной стимуляции двигательного нерва. Поскольку данный вид стимуляции наиболее близок к условиям естественной физиологической активности синапса, можно полагать, что обнаруженный нами путь регуляции квантового освобождения, включающий в себя изменение входа кальция в нервное окончание посредством системы хотшергических аугорецепторов, может играть существенную роль в обеспечении надежности работы синаптического аппарата.

Участие пресинаптических рецепторов в регуляции квантовой секреции ацетилхолина из двигательного нервного окончания необходимо учитывать при создании новых фармакологических препаратов, используемых в качестве миорелаксантов. Наличие у миорелаксантов деполяризующего типа выраженного пресинашического эффекта требует большэй осторожности их применения у пациентов, имеющих пресинаптические дефекты синаптической функции.

Личный «клад диссертанпш в исследования

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных основана на большом объеме результатов экспериментальных исследований с использованием адекватных методических подходов и статистической обработки полученных результатов.

Апробация работы

Материалы работы представлены на Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2011, 2012, 2013, 2014 гг.); XI и XII Всероссийской с международным участием научной школе-конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2012 и 2014 гг.); Международной конференции «От нейрона к мозгу» (Казань, 2013 г.); Международной научной конференции «Современные технологии в нейробиологии» («Technological Trends in Neurobiology») (Казань, 2013 г.); IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012 г.); XXII съезде физиологического общества имени И. П. Павлова (Волгоград, 2013 г.); Международной конференции «Assembly and Disassembly of the Nervous System», Реховот, Израиль, 2015 г.; Итоговой научной конференции КазНЦ РАН за2014 год (Казань, 2015 г.).

Работа выполнена при поддержке грантами РФФИ № 13-04-00886, «Ведущая научная школа» НШ-5584.2014.4 и Программы №7 Президиума РАН.

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах (из списка ВАК).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, иллюстрирована 41 рисунком и 1 таблицей. Список цитируемой литературы содержит 243 источника, из них 227 - иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект. Эксперименты выполняли на изолированном нервно-мышечном препарате кожно-грудинной мышцы (т. cutaneus pectoris) озерной лягушки (Rana ridibunda) в осенне-зимний период. Животных анестезировали и декапетировали в соответствии с требованиями этических норм по работе с лабораторными животными (директива совета ЕС 86/609/ЕЕС от 24 ноября 1986 года).

Регистрация Са2*-транзиента. Оценку входа Са2+ в нервное окончание (Са2+-транзиент) осуществляли с помощью измерения интенсивности свечения Са2+-чувсгвительного флуоресцентного красителя, взаимодействующего с кальцием, входящим в нервное окончание (НО) после развития пресинаптического потенциала действия (Tsien, 1989). После выделения нервно-мышечного препарата осуществляли загрузку двигательных НО флуоресцентным Са2+-красителем Oregon Green 488 ВАРТА-1 Hexapotassium Salt (cell impermeant) в концентрации 50 мМ. Загрузку осуществляли через кутплто нерва (Peng, Zucker, 1993; Wu, Betz, 1996; Tsang et al, 2000). Короткий отрезок нерва длиной ~3 мм помещали в канюлю, изолируя его от раствора Рингера. На срез нерва помепвли каплю краски объемом 0,1-0,3 мкл. Далее производили инкубацию препарата в течение 4-6 часов во влажной камере и 15-20 часов в холодильнике при температуре 8±2 "С. Выделенную мышцу помешали в экспериментальную ванночку объемом 5 мл, через которую протекал раствор Рингера следующего состава (мМ): NaCl- 113.0, КС1-2.5, NaHCOs -3.0, MgCb -6.0, CaCfe - 0.9. pH раствора поддерживали на уровне 7.2-7.4. Мышечные сокращения блокировали снижением содержания ионов кальция в растворе (0,9 мМ) и добавлением магния (6,0 мМ). Эксперименты проводили при температуре 20.0 ±0.3 "С. Регистрацию флуоресцентного сигнала осуществляли с помощью фотометрической установки на базе микроскопа Olympus ВХ-51 с водноиммерсионным объективом х60 и высокочувствительным регистратором на основе фотодиода S1087 (Hamamatsu) (Sinha, Saggau, 1999; Самигуллин и др., 2010). Настройку фотодиода на фокальную плоскость микроскопа и выбор области регистрации осуществляли при помоши оптической системы Viswfinder (Till Photonics). Данная система позволяет выводить на экран монитора изображение объекта исследования и диафрагмы, при помоши которой осуществляется выбор зоны, с которой будет производиться регистрация сигнала. Размер области регистрации настраивали, изменяя размер щелевой диафрагмы. Для регистрации выбирали удлиненную терминалшую веточку. Затем устройство переводили в режим регистрации, и сигнал с выбранной области поступал на фотодиод. В качестве источника света использовали монохроматор Polyhrom V (Till Photonics, Munich, Germany), настроенный на длину волны возбуждения красителя - 488 нм. Для уменьшения выцветания красителя, освещение препарата осуществляли только при регистрации кальциевых сигналов в ответ на раздражение нерва. Время, необходимое для регистрации сигнала, составляло 400 мс, ограничение времени освещения выполняли при помоши акустооптического затвора, встроенного в монохроматор. Для проведения статистической обработки данных делали

выборку из 60 сигналов. Раздражение нерва осуществляли прямоугольными импульсами сверхпороговой амплитуды длительностью 0.2 мс с частотой 0.5 имп/с при помошд «всасывающих») электрода. Сигнал от фотодиода оцифровывали с помощью АЦП Digidata 1450В (Axon Instruments, California, USA). Регистрацию кальциевых сигналов, синхронизацию освещения и стимуляции производили при помоши программы WinWcp Stanford University (Strathclyde University, Glasgow, UK). Для обработки флуоресцентных сигналов в каждом эксперименте измерялась, помимо изменения интенсивности свечения красителя AF, интенсивность свечения красителя без стимуляции Fo. Изменение интенсивности флуоресцентного сигнала выражали через отнопвние изменения флуоресценции к базовому свечению AF/Fo=CF-Fo)/Fo, гду F - уровень свечения красителя при стимуляции (Sinha, Saggau, 1999; Shahrezaei et al, 2006). В каждом эксперименте проводили усреднение 60 флуоресцентных ответов в контроле и после действия исследуемых веществ.

Электрофизиологические исследования. Спонтанные и вызванные токи концевой пластинки (соответственно, мТКП и ТКП) регистрировали методом двухэлекгродной фиксации мембранного потенциала мышечного волокна на уровне -60 мВ. Использовали усилитель Axoclamp 900А. Внутриклеточные электроды, заполненные раствором ЗМ KCl, имели сопротивление 5-10 мОм. Величину среднего квантового состава ТКП оценивали методом деления площадей ТКП и мТКП. Одновременную регистрацию токов НО и ТКП осуществляли микроэлектродами с диаметром кончика 2.5-3.5 мкМ, заполненными раствором Рингера или NaCl(0.5 мМ) с сопротивлением 1.0-1.5 МОм. Отведенные сигналы после фильтрации до 10 кГц усиливали и подавали на вход 16 разрядного АЦП, квантуя с интервалом 10 мкс. Регистрацию и анализ сигналов осуществляли с помощью программы Axioskop.

Реагенты. В экспериментах были использованы вещества (Sigma): карбахолин, ацетилхошш, прозерин, атропин, д-тубокурарин, мускарин, никотин, пирензепин, мегокграмин, мекамиламин, метилликаконитин (MLA), рианодин, конотоксин GVIA.

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки экспериментально полученных сигналов Са2+-транзиента использовали программу Origin версий 7.5 и 8.1. Использовали стандартные методы определения средних величин, стандартных ошибок, параметрический t-критерий Стьюдента для попарно связанных вариант (Бронштейн, Семендяев, 1986; Гланц, 1999). Достоверность различия средних значений определяли по стандартным 1фитериям при Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние ацетилхолина и карбахолина на Ca2*-транзиент и квантовый состав пюков концевой пластинки1

Производили регистрацию миниатюрных токов концевой пластинки (мТКП) и токов концевой пластинки (ТКП). Добавление карбахолина в концентрации 10 мкМ приводило к снижению амплитуды мТКП и ТКП на 26±5% (п=4, Р<0.05) и 61±8% (п=4, Р<0.05), соответственно. В присутствии карбахолина квантовый состав уменьшался на 46±10% (п=4,

1 Данная серия экспериментов выполнена совместно с м.н.с. Оатнховым Н.Ф.

Р<0.05) по сравнению с контролем (Рис. 1 А, Б). Под влиянием ацетилхолина в концентрации 100 мкМ квантовый состав снижался на 49±7% (п=18, Р<0.05).

А Б

— контроль

• •• карбахолин 80

100

о 1 мс

60 40

20

карбахолин ацетилхолин

Рис. 1. А — Усредненные вызванные токи концевой пластинки в контроле и под действием карбахолина. Б - изменение квантового состава под действием карбахолина

Добавление в перфузионный раствор карбахолина в концентрации 10 мкМ приводило кдостоверному снижению амплитуды Са2+-транзиента на 11±1% (п=5, Р<0.05) по сравнению с контролем (Рис. 2 А, Б). Под влиянием ацетилхолина наблюдалось достоверное снижение амплитуды кальциевого транзиента на 13±4% (п=6, Р<0.05. Рис. 1).

—контроль .карбахолин

100 мс

100 80

40 20 0

карбахолин ацетилхолин

Рис. 2. А - Изменение интенсивности флуоресцентного сигнала /У-'/Р'с в контроле и под действием карбахолина. Б - Изменение амплитуды Са2+-транзиента под действием карбахолина и ацетилхолина по отношению к контролю в % (контроль принят за 100 %)

Поскольку ацетилхолин и карбахолин уменьшали Са2,-транзиент и квантовый состав токов концевой пластинки, можно сделать вывод о наличии холинергической модуляции процесса выделения медиатора посредством изменения входа Са2+ в моторное НО (Хазиев, 2012). Обращает на себя внимание тот факт, что относительно небольшое изменение входа кальция в терминал!, вызывает существенное угнетение вызвашгого освобождения медиатора (Рис. 2). Это можно объяснить, принимая во внимание тот факт, что зависимость величины квантового состава от содержания Са2+ является экспоненциальной (Dodge, Rahamimoff, 1967).

Поскольку эффекты карбахолина и экзогенного ацетилхолина схожи, в дальнейших экспериментах использовали карбахолин, так как он не подвергается гидролизу, вследствие чего его концентрация остается постоянной в ходе всего эксперимента.

2. Действие холиномиметика карбахолина и специфических агонистов холинорецепторов никотина и мускарина на Со2" -транзиент до и после обработки препарата антагонистами никотиновых и мускариновых холинорецепторов

Очевидно, что действие холинергических агентов может быть опосредовано пресинаптическими рецепторами никотинового и мускаринового типов (Dodge, Rahamimoff, 1967; Nikolskv et al., 2004). Для выяснения типов рецепторов, опосредующих эффекты холиномиметиков на Са2+-транзиент, исследовали влияние специфических никелиновых и мускариновых агонистов на величину Са2+-транзиента. Никотин - активатор всех типов никотиновых рецепторов (Wonnacott, 1997) в концентрации 10 мкМ достоверно снижал амплитуду Са2+-транзиента на 15±3% (п=6, Р<0 05, Рис 3 Б). После добавления в перфузионный раствор активатора всех типов мускариновых рецепторов мускарина (10 мкМ) наблюдалось (Рис. 3 Б) снижение амплитуды Са2+-транзиента на 8±2% (п=5, Р<0.05). Для проверки специфичности описанного действия агонистов были проведены серии экспериментов, в которых агонист вводился после обработки нервно-мышечного препарата блокатором рецепторов соответствующего типа. Эксперименты показали, что частичная блокада никотиновых рецепторов d-тубокурарином (10 мкМ) вызывала достоверное уменьшение эффекта никотина на Са2+-транзиент. Обработка препарата блокатором мускариновых рецепторов атропином (1 мкМ) полностью устраняла пресинаптический эффект мускарина.

120-,

Рис. 3. А - Изменение интенсивности флуоресцентного сигнала ЛР/Ь'о под действием карбахолина на фоне предварительной обработки препарата блокаторами - атропином и д-тубокурарином. Б - Изменение амплитуды Са2+-транзиенга под действием карбахолина и специфических агонистов никотиновых и мускариновых рецепторов до и после обработки препарата блокаторами холинорецепторов. На рисунке обозначены: дтк - д-тубокурарин, атр - атропин, карбахол - карбахолин

10 время, 100 мс

— д-тубокурарин + атропин карбахолин

Приведенные выше данные дают основания думать, что эффекты карбахолина и ацетилхолина могут быть связаны с активацией как никотиновых, так и мускариновых пресиналтических ацетилхолиновых рецепторов. Для проверки этой гипотезы изучали действие карбахолина на фоне блокаторов никотиновых и мускариновых рецепторов. В присутствии атропина карбахолин снижал Са2+-транзиент на 9±5% (п=6, Р<0.05, Рис. 3 Б), а в присутствии д-тубокурарина - на 18±9% (п=4, Р<0.05, Рис. 3 Б) Предварительная инкубация нервно-мышечного препарата в растворе, содержащем как д-тубокурарин, так и атропин, полностью устраняла эффекты карбахолина на Са2+-транзиент (Рис. 3 А, Б) Полученные данные свидетельствуют о том, что эффекты холинергических агентов связаны с активацией как никотиновых, так и мускариновых рецепторов. Далее определяли подтипы мускариновых и никотиновых рецепторов, участвующих в регуляции входа кальция в нервное окончание

3. Выявление подтипов мускариновых рецепторов, опосредующих эффекты холиномиметиков на Са2+-транзиент

Известно, что на мембране НО могут присутствовать мускариновые рецепторы подтипов М| и М2, которые участвуют в регуляции квантового освобождения медиатора (Fukuda et al., 1987; Tomas et al., 2014). Также есть данные о регуляции кальциевого тока через Мг-подтип мускариновых рецепторов (Slutsky, 2001) Для выяснения подтипа мускариновых рецепторов, реализующих эффект снижения Са2+-транзиента мускарином, изучали влияние блокаторов, специфичных для этих подтипов рецепторов. Под действием блокатора Mi -подтипа рецепторов пирензепина (100 нМ) наблюдали снижение амплитуды Са2+ -транзиента на 14±7% (п=5, Р<0.05, Рис. 4 А), но на его фоне мускарин по-прежнему вызывал падение амплитуды Са2+-сигнала (Рис. 4 А).

— пирензепин! - пирензепин + мускарин j

100 80 60

%

пирензепин пирензепин + мускарин

метоетрамин метоктрамин + мускарин

Рис. 4. Изменение амплитуды Са2+-транзиента под действием мускарина на фоне пирензепина (А) и метоктрамина (Б)

Добавление в перфузируемый раствор метоктрамина (10 нМ), специфического блокатора М2-подтнна мускариновых рецепторов, не приводило к изменению параметров Са2+-ответа. Однако в его присутствии не наблюдали угнетающего действия мускарина (Рис. 4 Б). Таким образом, блокирование Mr подтипа мускариновых рецепторов устраняло угнетающее Са2+-транзиент действие мускарина. Можно заключить, что действие холинергических агентов на Са2+-транзиент связано с активацией мускариновых рецепторов подтипа Мг.

4. Выявление подтипов никотиновых рецепторов, опосредующих эффекты холиномиметиков на Са2+-транзиент

Далее изучали, через какие подтипы никотиновых рецепторов может осуществляться ингибирующее действие холиномиметиков на Са2+-транзиент в нервном окончании лягушки. Известно, что на НО представлены никотиновые рецепторы, различающая субъединичным составом (Wonnacott, 1997; Gargao et al, 2014). Исследовали влияние специфических блокаторов 4 подтипов никотиновых холинорецепторов на Са2+-транзиент. Мекамиламин блокирует различные подтипы никотиновых рецепторов при увеличении концентрации от 640 нМ до 6,9 мкМ (Papke et al, 2001; Rabenstein et al., 2006; Ostroumov et al, 2008).

Мекамиламин в концентрации 640 нМ блокирует o3[W-подтип никотиновых рецепторов. В наших экспериментах добавление мекамиламина в данной концентрации вызывало увеличение Са2+-транзиента на 18±3% (п=5, Р<0.05, Рис. 5). Добавление в раствор никотина после обработки блокатором аЗр4-подтипа вызывало снижение Са2+-транзиента на 9±4% (п=5, Р<0.05, Рис. 5).

Мекамиламин в концентрации 2,5 мкМ блокирует, помимо аЗр4-, еще и «4 р2-подтип щткотиновых холинорецепторов. Добавление в раствор Рингера мекамиламина в концентрации 2,5 мкМ, приводило к увеличению Са2+-транзиента на 16±2% (п=3, Р<0.05, Рис. 5). Никотин при заблокированных аЗрФ- и а4р2-подтииах вызывал снижение Са2+-транзиента на 19±4% (п=3, Р<0.05, Рис. 5).

В концентрации 3,6 мкМ мекамиламин является блокатором аЗр4-, а4р2 и аЗр2-подтипов никотиновых рецепторов. Добавление мекамиламина в данной концентрации вызывало увеличение Са2+-транзиента на 23±7% (п=6, Р<0.05, Рис. 5). Никотин на фоне заблокированных аЗ(}4-, о4р2 и аЗр2-подпшов снижал Са2+-транзиент на 14±2% (п=6, Р<0.05, Рис. 5).

Мекамиламин в концентрации 6,9 мкМ, помимо вышеперечисленных подтипов мускариновых рецепторов, также вызывает блокаду а7-субъедшшцы. Эксперименты показали, что добавление его в данной концентрации приводило увеличению Са2+-транзиента на 15±8% (п=3, Р<0.05, Рис. 5) Добавление никотина при заблокированной а7-субъединице мекамиламином вызывало снижение Са2+-транзиепта на 8±2% (п=3, Р<0.05, Рис. 5).

Метилликаконнтнн (MLA) является специфическим блокатором а7-субъединицы никотпнового рецептора. Добавлеш1е в раствор MLA в концентрашш 10 нМ увеличивало Са2+-транзиент на 13±11% (п=5, Р<0.05, Рис 5). Однако, добавление в раствор с MLA никотина приводило к снижению Са2+-транзиента на 11±5% (п=6, Р<0.05, Рис. 5).

120 100 80 604020-

*

X

*

JL

*

1

Рис. 5. Изменение амплитуды Са2+-транзиента под действием никотина на фоне обработки препарата раствором с добавлением MLA (блокада о7) и мекамиламина в концентрациях, блокирующих «7-, аЗр2-, а4р2-, а3|34-подтипы холинорецепторов никотинового типа. На рисунке обозначены: ник - никотин, мекам - мекамиламин. Контроль принят за 100%

Важно заметить, что под действием каждого из блокаторов наблюдали увеличение кальциевого транзиента. Возможно, это является следствием того, что эндогенный ацетилхолин в нормальных физиологических (интактных) условиях угнетает вход Са2+ в НО через исследованные подтипы никотиновых рецепторов. Таким образом, никотиновые холинорецепторы следующею субъединичного состава - а7, св(52, а4р2, аЗД4 -задействованы в реализации угнетающего действия эндогенного ацетилхолин а, выделяющегося в синаптическуто щель при низкочастотной стимуляции, на содержание кальция в НО. Однако, ни один из проверявшихся подтипов рецепторов не участвует в реализации угнетающего действия никотина (экзогенного модулятора) на амплитуду Са2*-транзиента, поскольку на фоне каждого из блокаторов никотин снижал амплитуду С а2 транзиента. Можно предположить возможность существования другого подтипа никотиновых рецепторов, который может опосредовать действие никотина на содержание С а2 в пресинапсе.

5. Участие Са2+-каналое в реализации эффектов холиномимепшков на Са2*-транзиент

Одним из механизмов уменьшения входа Са2+ в нервное окончание при активации холинорецепторов может быть прямое воздействие на проводимость потенциал-зависимых С а-'-канатов N типа. Это основной тип Са2+-каналов, который представлен в нервном окончании лягушки. Van der Kloot et aL (1997) наблюдали снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки в синапсах лягушки под действием карбахолина,

выраженность которого уменьшалась в присутствии со-конотоксина С}VIА. блокирующего каналы Ы-тапа. В следующей серии экспериментов мы проверяли, не могут ли эффекты холиномиметиков на вход С а2' в нервное окончание быть связанными с регуляцией работы Са2+-каналов. Эксперименты показали, что обработка препарата со-конотоксином ОVIА снижает Са2+-транзиент на 35±7% (пг=5, Р<0.05, Рис. 6 А). При заблокированных каналах Ы-типа угнетающее действие карбахолина отсутствует (Рис. 6 Б). Можно заключить, что в реализации эффекта карбахолина на уровень Са2+ в нервном окончании лягушки участвуют Са2+-каналы Ы-типа.

— контроль

— ю-конотоксин вУ1А

%

100 80 60 40 20 0

Ь время, 100 мс

контроль ю-конотоксин С\/\А

-ю-конотоксин СУ1А <о-конотоксин б\/1А + карбахолин

100 80 60 40 20

%

5> время, 100 мс

о-конотоксин ю-конотоксин С\/|А С\/|А + карбахолин

Рис. 6. А - Изменение амплитуды Са2+-транзиента под действием блокатора Ы-типа Са2+-каналов конотоксина по отношению к контролю (100 %). Б - действие карбахолина на Са2+-транзиентна фоне блокады кальциевых каналов со-конотоксином ОУ1А

6. Проверка гипотезы об участии эндоплазматического ретикулума в формировании угнетающих эффектов холиномиметиков на Са2+-транзиент

Пресинаптический уровень Са2+ формируется кальцием, входящим через потенциал-чувствительные кальциевые каналы и посредством выброса С а24 из внутриклеточных депо. Одним из основных внутриклеточных депо в нервном окончании является эндоплазматический ретикулум (ЭР), на поверхности которого находятся рианодиновые рецепторы. Эффекты холиномиметиков на Са2+-транзиент могут быть связаны с модуляцией выброса кальция из ЭР. Для проверки гипотезы об участии внутриклеточного ЭР в реализации угнетающего действия карбахолина на Са2+-транзиент использовали блокагор рианодиновых рецепторов - рианодин в концентрации 10 мкМ. Предварительная аппликация рианодина приводила к снижению Са2+-транзиента на 19±4% (п=5, Р<0.05, Рис. 7 А). Причем применение рианодина в блокирующей концентрации не снимает угнетающего действия карбахолина. Карбахолин. как и в отсутствие блокатора, снижал Са2+-транзиент. Изменение амплитуды Са2+-ответа составило 12±8% (п=5, Р<0.05, Рис. 7 Б).

%

ю время, 100 мс

— рианодин рианодин + карбахолин

%

în время, 100 мс

100 80 60 40 20 0

100 80 60 40 20 0

контроль

рианодин *

.....é

рианодин рианодин + карбахолин

Рис. 7. А - Изменение амплитуды Са2+-транзиента по отношению к контролю (100 %) при блокаде рианодиновых рецепторов ЭР. Б - Действие карбахолина на Са2+-транзиент на фоне заблокированных рианодиновых рецепторов ЭР

Можно заключить, что выброс Са2+ из ЭР при активации рианодиновых рецепторов участвует в формировании Са2+-транзиента в условиях низкочастотной стимуляции. Однако, угнетающий эффект холиномиметиков не связан с модуляцией выброса Са2+ из ЭР

7- Са2+-транзиент в присутствии антагонистов никотиновых и мускариновых холинорецепторов

Поскольку известно, что ацетилхолин из НО выделяется в синаптическую щель при стимуляции двигательного нерва, а также спонтанно в квантовой и неквантовой форме (delCastillo, Engback, 1954; Boyd, Martin, 1956), можно предположить его тоническое угнетающее пресинаптическое действие на Са2+-транзиент через пресинантические никотиновые и мускариновые рецепторы.

Для проверки этой гипотезы изучали эффекты блокады этих рецепторов в отсутствие экзогенных агонистов соответствующих типов рецепторов.

Блокада никотиновых рецепторов блокатором всех типов никотиновых рецепторов д-тубокурарином (10 мкМ) вызывала увеличение Са2+-транзинета на 11±3% (п=15, Р0.05, Рис. 8 А). Добавление в раствор неспецифического блокатора мускариновых рецепторов атропина в концентрации I мкМ увеличивало Са2+-транзиент на 9±2%(п=¡9, Р<0.05, Рис. 8 Б).

*

-I-

' &

■ ■

г" ...

«> время, 100 мс

---ШУ-

контроль д-тубокурарин

Б ь — контроль

*

100 80

5> время, 100 мс

20 0

контроль атропин

Рис. 8. Изменение амплитуды Са2+-транзиента под действием д-тубокурарина (А) и атрошша (Б) по отношению к контролю

Совместная аппликация д-тубокурарина и атропина увеличивала амплитуду Са2+-транзиента на 7±2% (п=7, Р<0.05). То, что это изменение сопоставимо по величине с эффектами блокаторов по отдельности, указывает на отсутствие аддитивности облегчающих эффектов д-тубокурарина и атропина на Са2+-транзиент.

Наблюдаемое возрастание Са2*-ответа в присутствии блокаторов холиноредепторов позволяет предполагать, что в области пресинаптической мембраны может находиться некоторое количество эндогенного ацетилхолина, который, взаимодействуя с никотиновыми и мускариновыми рецепторами, обусловливает подавление входа ионов Са2+ в НО. По этим результатам можно заключить, что эндогенный ацетилхолин, который выделяется в синаптическую щель во время стимуляции двигательного нерва или спонтанно, может активировать в нормальных интактных условиях никотиновые и мускарнновые рецепторы и, таким образом, модулировать вход кальция в нервное окончание. Это может свидетельствовать о наличии цепи обратной связи регуляции пресинаптического уровня Са2+ при стимуляции двигательного нерва, которая осуществляется при помощи выделяемого в синаптическую щель медиатора - ацетилхолина.

8. Действие ингибитора ацетилхолинзстеразы - прозерина на Са2+-транзиент

Проверить гипотезу о тоническом угнетающем действии эндогенного ацетилхолина на вход кальция в нервное окончание можно еще одним способом Известно, что применение антихолинэстеразных препаратов приводит к накоплению эндогенного ацетилхолина в синаптической шели (Рес1огоу, 1976). Для того, чтобы оценить, может ли эндогенный ацетилхолин, освобождающийся из НО как в квантовой, так и в неквантовой форме, изменять величину кальциевого ответа, исследовали влияние на Са2+-транзиекгг ингибирования синаптической ацетилхолинэстеразы прозерином В этих условиях, когда

происходило накопление ацетилхолина в синаптической щели при низкочастотной стимуляции двигательного нерва, наблюдали уменьшение Са2+-ответа: прозерин в концентрации 1 мкМ вызывал уменьшение амплитуды Са2+-транзиента на 13±5% (п=5, Р<0.05, Рис. 9 А, Б). Как и в экспериментах с карбахолином. угнетающее действие прозерина полностью снималось путем обработки препарата блокаторами никотиновых и мускариновых рецепторов (Рис. 9 Б). Эта результаты подтверждают гипотезу о том, что эндогенный ацетилхолин может модулировать содержание Са2+ в пресинапсе за счет воздействия на никотиновые и мускариновые рецепторы.

А

— контроль

— прозерин

«о время, 100 мс

Рис. 9. А - Изменение интенсивности флуоресцентного сигнала ДК/Ро в контроле и под действием прозерина Б - Изменение амплитуда Са2+-транзиента по отношению к контролю под действием прозерина и прозерина на фоне блокаторов никотиновых и мускариновых рецепторов. Для сравнения эффектов приведено действие экзогенного ацетилхолина

Таким образом, как экзогенный, так и эндогенный ацетилхолин, накапливаемый в щели при блокаде ацетилхолинэстеразы, уменьшали Са2+-транзиент. Эти данные вместе с увеличением Са2+-транзиента иод действием блокаторов никотиновых и мускариновых рецепторов свидетельствует о том, что эндогенный ацетилхолин, выделяющийся в синаптическую щель в условиях низкочастотной стимуляции нерва действует угнетающе на вход С а2" в нервное окончание Этот угнетающий эффект лежит в основе пресинаптического действия холиномиметиков на процесс выделения медиатора и осуществляется через систему никотиновых и мускариновых рецепторов.

9. Влияние блокады Мз-холинорецепторов на интенсивность квантовой секреции ацетилхолина при высокочастотной активности синапса2

Стимуляция нерва с высокой частотой не только приводит к аккумуляции в околосиналтическом пространстве нейромедаатора, но и способствует повышению концентрации ионов Са2+ в НО. Таким образом, холинергическая регуляция Са2+-

2 Данная серия экспериментов выполнена совместно с кбн Ковязиной И.В.

метаболизма и квантовой секреции могла бы быть значимой именно в условиях высокого, близкого к физиологическому, уровня нейросекреции. При высокочастотной стимуляции двигательного нерва с частотой 100 имп/с в условиях близкого к физиологическому уровня секреции (содержания ионов Са2+ 1.8 ммоль/л) наблюдали кратковременное возрастание амплитуды ТКП с последующим ее снижением (синаптическая депрессия). В присутствии блокатора М2 рецепторов метоктрамина (10 нМ) динамика амплитуды ТКП изменялась (Рис. 10). Повышение амплитуды синаптических сигналов по сравнению с контролем можно расценивать как свидетельство устранения блокатором М2 рецепторов эффекта эндогенного ацетилхолина, накапливающегося в ходе высокочастотной стимуляции нерва.

Рис. 10. Относительное изменение амплитуды токов концевой

пластинки (ЖП) в ходе высокочастотной пачки импульсов (100 имп/с, за единицу принята

амплитуда первого ТКП в пачке) в интактных препаратах и в

присутствии М2

блокатора метоктрамина (10 нМ).

время, с

Таким образом, активация М2-холинорецепторов при повышенном выделении эндогенного ацетилхолина в случае высокочастотной активности синапса, может угнетать квантовую секрецию ацетилхолина, предположительно за счет снижения уровня внутриклеточного кальция.

I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование посвяшено изучению влияния холинергических агентов на изменение внутриклеточной концентрации ионов С а2*, оцениваемой по интенсивности флуоресценции специфического Са2+-чувсгвительного красителя, и на параметры синаптической передачи. Ранее был получен экспериментальный материал, который свидетельствует о том, что холиномиметики модулируют синаптическую передачу. Причем никотиновые рецепторы отвечают за изменение кинетики секреции и квантового состава, а мускариновые рецепторы - за регуляцию квантового состава (ЫкоЫсу й а1., 2004). В свою очередь квантовый состав и кинетика секреции медиатора зависят от п ре си н ап та чес ко го уровня концентрации ионов Са2+ в двигательном нервном окончании (Никольский и др., 2000; 8атщи11т е1 а1., 2005). Была выдвинута гипотеза о том, что эффекты холиномимстиков на квантовую секрецию медиатора могут быть связаны с модуляцией входа кальция в нервное окончание. Для проверки этой гипотезы мы использовали методику оценки

▼ контроль О— метоктрамин

пресинаптнческого уровня кальция по интенсивности свечения флуоресцентного кальциевого красителя. В ходе проведенного исследования получен экспериментальный материал, который свидетельствует о том, что карбахолин и ацетилхолин уменьшают интенсивность флуоресцентного Са2+-ответа. Также получены данные о том, что в условиях ингибирования синаптической ацетилхолинэсгеразы прозерином наблюдается уменьшение кальциевого транзиента. Это свидетельствует о том, что как экзогенные, так и эндогенные холиномиметнки способны модулировать вход кальция в нервное окончание. При блокировании мускариновых и никотиновых рецепторов всех подтипов атропином и д-тубокурарином наблюдалось изменение флуоресцентного Са2+-ответа. Повышение амплитуды Са2+-транзиента под действием атропина согласуется с ранее описанным возрастанием интенсивности секреции в синапсах лягушки при действии атропина, снимающего тоническое действие эндогенного ацетилхолина. Обобщая данные об уменьшении Са2+-транзиента под действием ингибитора холинэстеразы прозерина и об увеличении Са2+-транзиента под действием блокаторов холинорецепторов с данными о повышении аиплитуды токов концевой пластинки при блокаде мускариновых рецепторов, можно заключить, что эндогенный ацетилхолин, выделившийся в синашическую щгль во время стимуляции двигательного нерва в физиологических условиях работы нервно-мышечного аппарата, участвует в регуляции входа Са2+ и регулирует выброс квантов медиатора по принципу обратной отрицательной связи. Эта регуляторная цепочка связана с активацией мускариновых и никотиновых рецепторов. Фармакологическое исследование показало, что реализация угнетакшкго действия холиномиметиков на Са2+-транзиент связана с активацией М2-подгипа мускариновых рецепторов. Об этом свидетельствует тот факт, что метокграмин, специфический блокатор этого подтипа м-холинорецоггоров, снимает угнетающее действие мускарина, агониста мускариновых рецепторов. В то время как блокада М]-подгипа рецепторов пирензепином, не снимала угнетающее действие мускарпна на Са2+-транзиент.

Никотиновые холинорецепторы подтипов а7, аЗр2, а4р2, аЗр4 задействованы в реализации угнетающего действия эндогенного ацетилхолина на содержание в нервном окончании ионов Са2+, которые выделяется в синашическую пуль при стимуляции двигательного нерва. Этот вывод сделан на основе экспериментов, показавших, что в условиях блокады этих подтипов рецепторов происходит достоверное увеличение Са2"1"-транзиента. Но блокада этих подтипов холинорецепторов не снимает угнетающего действия никотина на Са2+-транзиент. Это может указывать на наличие другого подтипа никотиновых рецепторов, который может опосредовать действие никотина на содержание Са2+ в нервном окончании.

Анализ действия карбахолина при блокаде Са2+-каналов N типа показал, что регуляция пресинаптнческого уровня Са2+ холиномиметиками осуществляется посредством модуляции входа кальция через потенциал-чувствительные кальциевые каналы N типа Блокада Са2+-каналов конотокеином ОУ1А снимала эффекты карбахолина на Са2+-транзиент. Рианодин-чувствительные кальциевые депо вносят вклад в формирование Са2+-транзиента, поскольку под действием рианодина уменьшалась амплитуда Са2+-сигнала. Но они не задействованы в реализации эффектов холиномиметиков, т.к. блокада рианодиновых рецепторов рианодином не снимала эффекта карбахолина на Са2+-транзиент.

Было показано, что мускариновые агонисты угнетающе действует на количество освобождаемых квантов в ответ на стимуляцию двигательного нерва (Arenson, 1989; Slutsky et aL, 1999, Самигуллин и др., 2014). Повышение амплитуды кальциевого транзиента под действием атропина согласуется с ранее описанным возрастанием интенсивности секреции в синапсах лягушки при действии атропина, снимающего тоническое действие эндогенного ацетилхолина, что свидетельствует о наличии связи между этими эффектами (Tomas et aL, 2014). Что подтверждается представленными в работе данными, демонстрирующими увеличение амплитуды постсинаптических токов и уменьшение уровня синашической депрессии в ходе высокочастотной пачки (100 имп/с) в присутствии метокграмина.

Таким образом, в условиях высокочастотной активности, наиболее характерной для физиологических условий работы синаптического аппарата, связанной с большим расходом медиатора за короткие временные интервалы, осуществляется мускариновая регуляция кальциевого метаболизма и квантовой секреции.

ВЫВОДЫ

1. Изменение интенсивности вызванной квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки под действием экзогенных холиномиметиков обусловлено снижением входа ионов кальция в моторное нервное окончание.

2. Угнетаю нес действие холиномиметиков на вход ионов кальция в двигательное нервное окончание связано с активацией мускариновых рецепторов М^-подтипа и никотиновых д-тубокурарин-чувсгвительных пресинаптических холинорецепторов.

3. Угнетающий эффект ацетилхолина и его миметиков на кальциевый транзиент связан со снижением входа ионов кальция в цитоплазму нервных окончаний через потенциал-зависимые кальциевые каналы N-типа.

4. Рианодин-чувствительные кальциевые депо двигательных нервных окончаний участвуют в формировании кальциевого транзиента, возникающего при низкочастотном раздражении двигательного нерва, но не вносят заметного вклада в реализацию угнетаю ив го пресинапшческого действия холиномиметиков на кальциевый транзиент.

5. Частичное ингибнрование ацетилхолинэстеразы, способствующее накоплению эндогенного ацетилхолина в синаптической области, приводит к снижению кальциевого транзиента.

6. Неспецифические антагонисты никотиновых и мускариновых холинорецепторов (д-тубокурарин и атропин) увеличивают кальциевый транзиент в нервных окончаниях нервно-мьшвчных препаратов с интакпюй ацетилхолинэстеразой, что свидетельствует о наличии <сгонического» эффекта эндогенного ацетилхолина на процесс секреции медиатора.

7. Как экзогенные холиномиметики, так и эндогенный ацетилхолин участвуют в модуляции процесса освобождения медиатора путем изменения входа ионов кальция в нервное окончание. Данный способ модуляции нейросекреции посредством активации пресинаптических ацетилхолиновых рецепторов можно рассматривать как один из конкретных молекулярных механизмов, обеспечивающих аугорегуляцию процесса синаптической передачи возбуждения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Хазиев, Э.Ф. Снижение входа кальция в моторное нервное окончание при активации пресинаптических холинорецепторов / Э.Ф. Хазиев, Н. Ф. Фатихов, Д. В. Самигуллин, Г. Л. Барретг, Э. А. Бухараева, академик Е. Е. Никольский //Доклады академии наук - 2012. Т. 446, № 5, с. 590-593.

2. Samigullin D.V. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes / D.V. Samigullin, N.F. Fatächov, E.F. Khaziev, A.I. Skorinkin, E.E Nikolsky, E.A. Bukharaeva//Front Synaptic Neurosci. -2015. 629. doi: 10.3389/fosya2014.00029

3. Самигуллин, Д.В. Регуляция мускариновыми рецепторами кальциевого транзиента и синаптической передачи в нервно-мышечном соединении лягушки / Д.В. Самигуллин, Э.Ф. Хазиев, И.В. Ковязина, Э.А. Бухараева, ЕЕ. Никольский//Гены и клетки. -2014. - Т. 9, №3, с. 1-6.

Работы, опубликованные в материалах конференций п иных научных изданиях

4. Tsentsevitsky, A.N. Presynaptic Voltage-Dependent Calcium Channels at the Frog Neuromuscular Junction / A.N. Tsentsevitsky, D.V. Samigullin, L.F. Nuruli in, E.F. Khaziev, EE Nikolsky, E.A. Bukharaeva // Frogs: Genetic Diversity, Neural Development and Ecological Implications. NOVA Puplishers, New-York, Henry Lambert editor. - 2014. Chapter V. P.179-194.

5. Ковязина, И.В. Роль мускариновых холинорецепторов в модуляции кальциевого транзиента и вызванной секреции медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки / И.В. Ковязина, А.Н. Ценцевицкий, Э.Ф. Хазиев, Д.В. Самигуллин // Сборник статей международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». - Пушино, 2013.-Т. 1,-С. 328-331

6. Хазиев, Э.Ф. Участие Cav2.3 (ale) кальциевых каналов в регуляции синаптической активности в нервном окончании лягушки / Э. Ф. Хазиев, А.Н. Ценцевицкий, Д.В. Самигуллин // XIII съезд Белорусского общества физиологов и II Международная научная конференция. - Минск, 2012. - Тезисы докладов. - С. 147.

7. Хазиев, Э.Ф. Действие холинергических соединений на кальциевый транзиент в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев, Д.В. Самигуллин // XI Всероссийская с международным участием научная школа-конференция «Механизмы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке». - Казань, 2012. - Тезисы докладов. - С. 154-155.

8. Фатихов, Н.Ф. Роль эндоплазматического ретикулума в регуляции внзтриклеточного кальция и секреции медиатора при высокочастотной стимуляции пресинаптнческого нервного окончания лягушки / Н.Ф. Фатихов, Э.Ф. Хазиев, Д.В. Самигуллин // XVI Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». - Пушино, 2012. - Тезисы докладов. - С. 448-449.

9. Фатихов, Н.Ф. Экспериментальная регистрация и математическое моделирование кальциевого транзиента в прешнаптическом нервном окончании лягушки / Н.Ф. Фатихов, Э.Ф. Хазиев, Д.В. Самигуллин // XI Всероссийская с международным участием научная школа-конференция «Механизмы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке». - Казань, 2012. - Тезисы докладов. - С. 150-151.

10. Хазиев, Э.Ф. Эффект карбахолина на кальциевый транзиент в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев, Н.Ф. Фатихов // XIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». - Москва, 2012. -Тезисы докладов. - С. 261.

11. Хазиев, Э.Ф. Холинершческая регуляция кальциевого транзиента в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев, Н.Ф. Фатихов // XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». - Москва, 2011. -Тезисы докладов. - С. 273-274.

12. Хазиев, Э.Ф. Действие холинергических соединений на кальциевый транзиент в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев, Д.В. Самигуллин // XI Всероссийская с международным участием научная школа-конференция «Механизмы адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке». - Казань, 2012. - Тезисы докладов. - С. 154155.

13. Фатихов, Н.Ф. Экспериментальная регистрация и математическое моделирование кальциевого транзиента в пресинаптическом нервном окончании лягушки / Н.Ф. Фатихов, Э.Ф. Хазпев, Д.В. Самигуллин // XI Всероссийская с международным участием научная школа-конференция «Механизмы адаптации растут:го организма к физической и умственной нагрузке». -Казань, 2012. - Тезисы докладов. - С. 150-151.

14. Самигуллин, Д.В. Участие эндоплазматического ретикулума в регуляции кальциевой сигнализации в двигательном нервном окончании лягушки / Д.В. Самигуллин, Н.Ф. Фатихов, Э.Ф. Хазиев // IV Съезд биофизиков России. - Нижний Новгород, 2012. - Тезисы докладов. - С. 127

15. Хазиев, Э.Ф. Влияние эндогенного и экзогенного ацетилхолина на кальциевый транзиент в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев // XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». — Москва, 2013. — Тезисы докладов. - С. 261.

16. Самигуллин, Д.В. Регистрация и свойства флуоресцентного кальциевого транзиента в периферических синапсах / Д.В. Самигуллин, Э.Ф. Хазиев, Н.Ф. Фатихов, Э.А. Бухараева, Е Е. Никольский // Международная научно-техническая конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Прикладная электродинамика, фотоника и живые системы». -Казань, 2013. - Тезисы докладов. - С. 166-171.

17. Самигуллин, Д.В. Кальциевый метаболизм в двигательных нервных окончаниях и оценка его изменения при модуляции синаптической передачи / Д.В. Самигуллин, Э.Ф. Хазиев, Н.Ф. Фатихов, Е.Е. Никольский, Э.А. Бухараева // XXII съезд физиологического общества имени И. П. Павлова. - Волгоград, 2013. - Тезисы докладов. - С. 463.

18. Хазиев, Э.Ф. Роль мускарнновых холинорецепторов в модуляции кальциевого транзиента и интенсивности вызванной секреции медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев, ИВ. Ковязпна, Д.В. Самигуллин // Международная научно-техническая конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Прикладная электродинамика, фотоника и живые системы». - Казань, 2013. - Тезисы докладов. — С. 187188.

19. Хазиев, Э.Ф. Роль мускарнновых и никотиновых рецепторов в реализации эффектов холиномиметиков на вход кальция в нервно-мышечном соединении лягушки / Э.Ф. Хазиев //

XXI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2014». - Москва, 2014. - Тезисы докладов. - С. 428-429.

20. Хазиев, Э.Ф. Участие кальциевых каналов в реализации эффектов холиномиметиков на кальциевый транзиент / Э.Ф. Хазиев, Э.А. Бухараева, Е.Е Никольский, Д.В. Самигуллин // XII Международная школа-конференция «Адаптация растущего организма». - Казань, 2014. - Тезисы докладов. - С. 113.

Подписано в печать 16.04.2015.. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 120. Заказ № 1604/2. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru