Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое и экспериментальное исследование кинетики ионных токов двигательного нервного окончания

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое и экспериментальное исследование кинетики ионных токов двигательного нервного окончания"

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Л П

На правах рукописи

ГАФУРОВ БОРИС ШАМИЛЕВИЧ

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ИОННЫХ ТОКОВ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕРВНОГО

ОКОНЧАНИЯ

03.00.13- физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань, 1996

Работа выполнена в Казанском государственном медицинско уш верситете им.С.В.Курашова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор А.Л.ЗЕФИРОВ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор КАТАЛЫМОВ Л.Л., доктор биологических наук, профессор ГАЙНУТДИНОВ Х.Л.

Ведущее учреждение: Московский государственный универси-

тет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "_"_ 199 г. в_ час. на заседаю

диссертационного совета К-113.19.02 по присуждению ученой степе! кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. физиология ч ловека и животных при Казанском государственном педагогическом ун: верситете по адресу: 420021, г.Казань, ул. М.Межлаука, д.1.

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке педагогач ского университета по адресу: Казань, ул. М.Межлаука, д.1. Автореферат разослан "_"_199 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

доцент И.Ш.Макалеев

Актуальность. Изучение механизмов синаптической передачи является юй из фундаментальных проблем современной нейрофизиологии. Пере-ia возбуждении в нервно-мышечном синапсе представляет собой слож-й моногоэтапный процесс, который начинается с момента деполяриза-'Л пресинаптической мембраны распространяющимся потенциалом дей-ия (ПД). Деполяризация мембраны нервного окончания (НО) приводит открыванию потенциалозависимых кальциевых каналов и входу ионов [ьцня в НО, которые вызывают освобождение медиатора из нервных миналей. Установлено, что характер секреции медиатора из НО в зна-гельной степени определяется амплитудно-временными параметрами ПД itz, Miledi, 1965,1967,1969; Магазаник, 1979: Llinas et al.; 1981,19S2; 3e-ров и др. 1984,1985,1987,1990; Van der KJoot, Molgo, 1994).

В то же время, экспериментальные методы изучения электрической ивности НО сопряжены с большими трудностями из-за незначительных меров терминалей, которые позволяют производить только внеклеточ-о регистрацию реакции синапса на раздражение двигательного нерва, тютрируемый сигнал включает в себя как ответы мембраны НО ¡мбранный ток), так и ответ постсинаптической мембраны на выделив-[йся медиатор. При этом невозможно регистрировать ни сам ПД. возни-ощий в терминали ни конкретные ионные токи, и тем более кальцие-й ток, который слишком мал в нормальных условиях.

Известно, что по ходу НО форма регистрируемого электрического гнала претерпевает значительные изменения - от преимущественно элек-ютрицательной в претерминалыюй и проксимальных областях до элек-яюложительной в дистальных. Используя блокаторы ионных каналов ло обнаружено, что регистрируемые ответы образуются преимушествен-натриевыми, калиевыми, кальции-активируемыми калиевыми токами, сущими через соответствующие каналы в мембране НО (Mallart, 1985: }>иров и др., 1985). Однако, неизвестно каким образом меняется времен-й ход ионных токов вдоль НО. а также какова их связь с умень-1юшейся по ходу НО секрецией медиатора (Зефиров, 1983).

Ранее было предположено, что изменение ответа по ходу НО может ть связано с изменением проводимости мембраны для некоторых ионов шенение плотности ионных каналов) от проксимальных к дистальным меткам (Mallart, 1985; Зефиров и др., 1985). Однако это предположение не ло экспериментально подтверждено. Ответить на этот вопрос можно с мощью моделирования всей совокупности ионных токов, существующих ЛО.

Цели и задачи исследования: Целью настоящего исследования является зработка на основе существующих моделей нервных волокон модели ектрической активности НО холоднокровных и теплокровных животных.

С использованием этой модели объяснить изменения регистрируемого < вета по ходу НО лягушки и мыши.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Зарегистрировать и проанализировать ответы НО лягушки и мыши;

2. Разработать модель электрогенеза двигательного нервного окончан лягушки и мыши, учитывая наиболее характерные ионные токи нервн терминал ей животных и локальные токи;

3. Промоделировать различное распределение плотности натриевых, I лиевых, кальциевых, кальций-активируемых калиевых каналов в НО;

4. Воспроизвести картину электрофизиологически регистрируемого отвс НО лягушки и мыши в соответствующих моделях;

5. В рамках моделирования ионных токов объяснить уменьшение секрец медиатора по ходу НО,

Новизна. Впервые разработана модель электрической активности I-теплокровных и холоднокровных животных, учитывающая натриевые, } лиевые, кальциевые, кальций-активируемые калиевые и локальные то НО. Проанализирована кинетика ионных токов терминали лягушки и м ши. Доказано уменьшение плотности ионных каналов по ходу НО и вы* лено распределение плотности каналов по ходу НО лягушки и мыл Вскрыты причины снижения секреции медиатора по ходу синапса. Поь зано, что уменьшение кальциевого тока происходит без изменения каг циевой проводимости мембраны НО при уменьшении проводимости ме браны для ионов натрия и калия.

Положения выносимые на защиту

1. Изменение ответа НО и секреции медиатора от проксимальных к д стальным отделам синапса, как холоднокровных так и у теплокровных ж вотных, связано с изменением плотности натриевых и калиевых канал по ходу НО. Плотность натриевых, потенциалозависимых и калъци активируемых калиевых каналов вдоль нервного окончания уменьшает по экспоненте;

2. Константы спада плотности натриевых и калиевых каналов в НО тепл кровных и холоднокровных животных различны и определяются прот женностью НО; -

3. Уменьшение квантового состава тока концевой пластинки по хс нервной терминали связано с уменьшением кальциевого тока за с1 уменьшения плотности натриевых, потенциалозависимых и кальцп активируемых калиевых каналов, при постоянной плотности кальциев каналов.

Научно-практическая ценность. Проведенное исследование имеет ф> даментальное теоретическое значение, поскольку позволяет раскрыть ис ные механизмы, лежащие в основе ответа мембраны НО, ПД и регуляц освобождения медиатора. Результаты проведенного исследования мо.

ти применение в теоретической и экспериментальной нейрофизиоло-, в исследованиях по моделированию нейронных сетей и процессов си-тическои передачи.„ ......-

Апробаиия работы. Основные положения работы доложены и обсуждена следующих конференциях: Всероссийский Съезд физиологов, щино,1994); Всероссийская научная конференция, "Растущий орга-м; адаптация к физической и умственной нагрузке", (Казань, 1994); кдународная зимняя школа молодых ученых по нейрохимии временные достижения в изучении метаболизма мозга", (С-Петербург, 5); IX Международный Симпозиум по холинергическим механизмам. ,йнц, Германия, 1995>: Нейрохимическая школа, второй курс "От пере-i сигналов к экспрессии генов", (Оказаки, Япония, 1995). А так же на дании Татарского отделения всероссийского физиологического об-тва (Казань, 1995) и на заседании кафедры физиологии Казанского пе-»гического университета (Казань, 1995).

Реализация результатов исыедования. Материалы исследования отра-ы в 8 публикациях. Структура и объем. Диссертация состоит из введения, обзора литера->[. описания методик, результатов исследования и их обсуждения, заменил, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 21 рисунок и 3 таблицы. Список литературы со-кит 150 источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Электрофизиологические исследования

Эксперименты проводили на нервно-мышечных препаратах кожногру-ной мышцы лягушки и мышцы длинного поднимателя уха мыши, вно-мышечный препарат выделяли и помешали в ванночку из органи-сого стекла с рабочим объемом 3 мл. Для работы с холоднокровными ользовали стандартный раствор Рингера следующего состава (в •ль/л): NaCl-118,0; KCl-2,5; СаС12 -1,8; NaHC03 -2,4 для работы с теп-ровными использовали раствор Кребса следующего состава (в >ль/л): NaCl-154.0; KCl-5,0; NaHP04-l,0; MgCb-1,0; СаС12-0,4; 1СОз-1,8: глюкоза-11,0 при температуре 22°С, рН среды поддерживали 'ровне 7.2. До начала опыта раствор Кребса в течение 40-50 мин насы-и карбогеном (02-95%, С02-5%). Раствор аэрировали и во время экстента. В некоторых экспериментах для блокирования ПД мышечного жна (сокращения мышцы) в раствор добавляли тубокурарин (2x10"8 ь/л). Ответы НО отводили внеклеточно, используя стандартную микро-стродную установку под визуальным контролем (Зефиров и 984,1985; Добрецов,1990). Ответы НО регистрировали при помощи

стеклянных микроэлектродов с диаметром кончика 2-3 мкм, заполне. ми 2 моль/л раствором NaCl (сопротивление 2-5 МОм). Раздражение i гательного нерва производили прямоугольными электрическими имп; сами длительностью 0,2-0,3 мсек, сверхпороговой амплитуды. Электр! с кие сигналы после усиления усредняли (интервал измерения сигналг мксек) с помощью синхронного цифрового накопителя Ф-36 и peraci ровали на бумаге при помощи двух-координатного самописца.

Математическая модель к

Система уравнений Ходжкина-Хаксли (Hodgkin,Huxley,1952) была ми использована для описания распространения возбуждения вдоль ] Распространение ПД вдоль немиелинизированного нервного волокна в описывается уравнением теплопроводности:

= + (1).

Râx1 ât у '

/{-сопротивление аксоплазмы, К-потенциал, С-емкость мембраны, ионный ток, /-тип ионов. В случае немиелинизированного волокна ион токи описываются по закону Ома (Hodgkin, Huxley, 1952):

rj=ij(Y-rjU 2)

в случае миелинизированных нервных волокон уравнением Голдм (Frankenhaeuser, Huxley,1971):

h ~ 4 ßT г ■ W

RT , ... ( EF_ ,RT.

eXPl ]

Проводимость gj в уравнении(2) и проницаемость Р] ионов в ура! нии (3) мембраны зависит от констант активации и инактива, gj = g¡mkn', Р1 = Р}ткп!, которые в общем случае зависят от мембрана потенциала, и носят независимый характер, эти константы тип опи ваются уравнением релаксации:

dt

(l-Y(t))ar(.V)-y(t)br(V),(4)

где a(V)- и b(V)- скорости движения частиц к ионному каналу и него, соответственно (Hodgkin,Huxley, 1952). Е-V-Vj, ^-равновесный тенциал, /'-постоянная Фарадея, /d-постоянная Больцмана, Т-абсолют температура, ////^-концентрация ионов внутриклеточная и внеклеточ) Скорости a(V)- и b(V)- описываются эмпирическими уравнени: (Hodgkin,Huxley, 1952; Frankenhaeuser,Huxley,1971).

Для калиевых каналов инактивация очень медленная, поэтому ее не нтывают; количество активирующих частиц необходимых для открыва-:я одного калиевого канала - четыре, т.е. /=4, для натриевых - три при ной инактивирующей, т.е. fc=l, /= 3 (Hodgkin,Huxley, 1952; ankenhaeuser, Huxley, 1971).

Для воспроизведения реальной картины кинетики ионных токов НО в ;ше описанную модель мы включили кинетики кальциевых и кальций-тивируемых калиевых токов (Llinas et al, 1981):

/ -, «gW'-foWif) p _Tji

1.[С4,АехР1—j

Кальций-активируемые калиевые токи описывали согласно работе лдмана (Goldman,Tomas, 1989), что в принципе аналогично приведение выше уравнениям Гольдмана и примененным Франкенхаузером rankenhaeuser, Huxley, 1971) :

teE[Cal-[Ca].„ pfif

Как было показано (Dodge, Cool 1946, Hodgkin,Huxley, 1952), разност-ie схемы позволяют решить с хорошей точностью систему уравнений (1-

что допустимо и в случае нашей расширенной системы Ходжкина-.ксли. Уравнения интегрировали с помощью разностных схем методом 1лера первого порядка (Турчак. 1981). Начальные и граничные условия я решения "задачи Коши" для уравнения теплопроводности мы взяли алогично с работой Ходорова и Тимина(1969), в которой распростране-е ПД происходит одинаково в обе стороны от стимулирующего перехва-, а на конце НО потенциал равен нулю. Начальные условия - нулевые тенциалы.

Описание локального взаимодействия

В отличии от существующих моделей общий мембранный ток из сег-нта мембраны полагали одновременно взаимодействующим не только со ежными участками, но и с более удаленными. Закон взаимодействия исывали согласно экспоненциальному спаду на основе решения одно-дного уравнения электрохимической диффузии (Рубин, 1969, Ходов, 1975), который описывает пассивное распространение деполяризации оль мембраны:

V(x) = V0cxpfCj

где Vo- деполяризация в точке х=0, I- постоянная длины мембра нервного волокна (в нашем случае НО).

Метод разностных схем Эйлера, первого порядка

Любое дифференциальное уравнение типа = может бь

преобразовано в алгебраическую систему уравнений:

здесь каждое последующее (i+I) значение функции находится предыдущего (0 (Турчак,1981). Аналогичным образом разрешаются урав} ния релаксации для констант т, п, Лил Двойной дифференциал для ург нения (1) расписьшается аналогичным образом:

d'Y Г(/,)-2Г(/м) + Г</,„)

dt1 Д/г

Для решения двухмерного уравнения (1)(искомая функция потегщи зависит от двух аргументов) теплопроводности необходимо применять : висимые от переменной разности. Пусть у- индекс по длине х, а /- инде по времени t.

Я Ах1 с Д/ +

отсюда можно выразить значение потенциала в сегменте j в i+1 м мент времени:

"+1 _ ^'[v ТП/'\ К' + ^7+2

УГ = ^{Z /07) - ^ '"J + V].

Зная потенциал в начальный момент времени во всех сегментах мож вычислить потенциал в сегментах мембраны в любой момент времени.

Физическая и электрическая модель НО

Исходя из известных данных о строении нервно-мышечного синап лягушки и мыши (Birks et al., 1960,1966; McArdle et al., 1981; Angaut-Petit al., 1987; Diaz et al.,1988,1989; Dunia, Herrera, 1993) для проведения ко пьютерных экспериментов нами была принята следующая структурная с> ма модели. Нервное волокно, имеющее три перехвата Ранвье длиной мкм, разделенных миелиновыми сегментами протяженностью 12 мкм, г реходит в безмиелиновое НО. Нерное окончание в модели состояло нескольких одинаковых веточек. Каждая из веточек представляла соб< униформный цилиндрический кабель, длина которого у лягушки составл ла 100 мкм, а диаметр 2 мкм. В модели НО мыши по ходу каждой терм нали в трех местах производилось постепенное увеличение и уменьшен диаметра осевого цилиндра в три раза. Длина каждой ветви составляла мкм, диаметр 2 мкм (в местах расширения 6 мкм). Однако компьютерн моделирование показало, что распространение возбуждения в каждой веточек происходит одинаково, что соответствует материалам раб

'indrielti, Peres, 1985), поэтому дальнейшее моделирование электрической стивности НО производилось по одной терминальной веточке.

В проксимальном участке терминали была расположена геминодаль-1Я область протяженностью 2-3 мкм, аналогичная по своим электриче-сим свойствам перехвату Ранвье. Через мембрану перехвата текут натрие-ле, небольшой калиевый ток и ток утечки, а через мембрану НО- натрие-»ie, калиевые, кальциевые и кальций-активируемые калиевые токи.

Изменение wiomnocmu ионных каналов мембраны

Изменение общего количества каналов изменяет максимальную про->димость сегмента мембраны. Следовательно, для изменения плотности эшгых каналов достаточно менять максимальную проводимость gj. В мо-:ли изменение плотности j -тых каналов производили изменением соот-

¡тствуюшего типа gj. Итак, gj gj exp^- , где х- расстояние вдоль мем-

)аны, Ij- константа длины спада плотности каналов.

Стабильность метода

Стабильность метода сохраняется при выполнении следующего нера-

■нетва: RC < , где D/ и D* шаги интегрирования по времени и про-

ранству(Ои Fort,Frankel,1953). В терминали, по сравнению с нервным ътокном, нами было увеличено внутреннее сопротивление в 2-3 раза, что 1равдывается большим количеством органелл внутри нее .indgren,Moore, 1989). Это привело к уменьшению шага по времени в 5 13. Время счета уменьшилось и составило на IBM PC486/DX2-66 30 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Электрогенез нервного окончания лягушки

Анашз регистрируемых ответов нервного окончания мгушки

При сверхпороговом раздражении двигательного нерва импульсом то-i регистрировали электрический ответы НО, состоящий из трех фаз ис.1). Первая положительная фаза ответа возрастает плавно до половины ишы НО, затем постепенно падает до 50% от своей максимальной ам-шгуды и остается на этом уровне до конца НО. Вторая (отрицательная) шжается по ходу НО почти до нуля. Третья фаза отсутствует в начале О, постепенно увеличивается в первой четверти терминали, затем умень-ается и после середины НО исчезает. Все эти изменения происходят с сличением длительности фаз ответа. Анализ амплитуды и квантового со-ава тока концевой пластинки показал, что по ходу НО секреция медиа-ipa сначала растет (первая треть НО), а затем постепенно падает.

Рис.1. Электрогенез нервно-мышечного синапса лягушки.

а- нервное окончание, стрелками указаны места регистраций, электрические сигналы, регистрируемые вдоль 100 мкм нервной те минали с шагом 20-25 мкм, токи концевой пластинки указаны стре ками. НО- нервное окончание, ПТ- претерминальная область, Р миелинизированный сегмент, ПР- перехват Ранвье.

Моделирование электрогенеза нервного окончания лягушки

В компьютерных экспериментах на модели НО, имеющем длину 1 мкм изменение плотности каналов производили по различным закон! (линейная, степенная, экспоненциальная зависимость). Форма мембранн го тока, наиболее полно соответствующая ответу НО в электрофизиолог ческих экспериментах, была получена при экспоненциальном уменьшен! плотности каналов. Были проведены варианты моделирования при сл дующих условиях: постоянная плотность каналов по ходу НО, уменьшен плотности натриевых каналов, уменьшение плотности калиевых канале уменьшение плотности натриевых и калиевых каналов, уменьшение плс ности натриевых, калиевых и кальций-активируемых калиевых канале Только последний вариант моделирования (рис.2) показал хорошее сос ветствие регистрируемых ответов (рис. 1) и модельных мембранных токов.

Натриевые каналы. Известно, что входящий ток ионов натрия чер потенциалозависимые натриевые каналы образует вторую негативную фа ответа. В модельных экспериментах производили уменьшение плотное натриевых каналов, что приводило к уменьшению по ходу НО второй о рицательной фазы мембранного тока. Амплитуда ПД постепенно уменьш лась, длительность фазы деполяризации увеличивалась. В модели конста та спада плотности натриевых каналов подбиралась так, чтобы возбужд ние охватывало все НО. Исходя из этого нами была получена констан слада плотности этих каналов 60 мкм.

Потенциагозависшше калиевые канат. Уменьшение плотности поте циалозависимых калиевых каналов вызывало некоторое увеличение ампл туда ПД и длительности фазы ре поляризации. В мембранном токе возн

ло уменьшение амплитуды третьей фазы и увеличение ее длительности, эстоянная спада этого типа каналов составила 40 мкм.

Калъций-активируемые калиевые каналы. Данный тип каналов как и по-шиалозависимые калиевые каналы образуют выходящий калиевый ток. иду того, что этот тип каналов образует более поздний выходящий' ток , в основном, влияет на вторую половину фазы реполяризации ПД, уко-чивает ее и создает фазу гиперполяризации ПД. В мембранном токе льиий-активируемый калиевый ток участвует в формировании третьей ложительной фазы. Константа спада этих каналов составила 40 мкм.

Кальциевые каналы. По ходу НО нами не производилось уменьшение отности этих каналов, однако кальциевый ток, в результате изменения отности вышеперечисленных каналов, уменьшался по амплитуде по ходу .). Это вызвано тем, что кальциевый ток является потенциалозависимым определяется возникающим ПД в нервной терминали. Форма же ПД ределяется распределением потенциалозависимых натриевых и калиевых кальций-активируемых калиевых каналов вдоль НО. Уменьшение ампли-ты ПД вызывает уменьшение кальциевого тока.

1К(Са>

-\> Сгс, О' - —

■Р> о "вЕ с * ~

•V

Рис.2. Модельный электрогенез нервного окончания лягушки при уменьшении плотности натриевых, калиевых и кальций-активируемых калиевых каналов вдоль мембраны с учетом локальных токов.

Потенциалы действия (ПД) и ионные токи (МТ- мембранный ток, 1ыа,к,К(Са),Са.ь- ионные токи) по ходу нервного окончания лягушки длиной 100 мкм при экспоненциальном уменьшении плотности натриевых, калиевых и кальций-активируемых калиевых каналов с константой 30 мкм. 1-5 точки соответствующие экспериментальным реги-страциям (рис.1).

Локальный ток. Включение в модель расширенного взаимодейсп участков мембраны НО привело к тому, что увеличилось длина пассив» распространения деполяризации. Амплитуда ионных токов и ПД, скоро проведения увеличились. Длительность фаз де- и реполяризации I уменьшились. Поэтому для соответствия модельного мембранного ток; регистрируемого ответа НО вышеполученые константы спада плотно< натриевых и калиевых каналов уменьшили, т.е. ускорили падение пл ности этих каналов вдоль НО. Константа спада плотности каналов сос вила 30 мкм.

Электрогенез нервного окончания мыши

.Анализ внеклеточных ответов мембраны нервного окончания мыши

В зависимости от расположения внеклеточного отводящего moq электрода на нервной терминали мыши регистрировали различные отве НО. В претерминальной области ответ состоял из первой положительн фазы (пассивный деполяризующий ток из последнего перехвата Ранвье) второй и третьей отрицательных фаз, которые образуются входящим в п| терминали натриевым и выходящим в НО калиевыми токами, cootbi ственно, что подтверждает ранее полученные данные (Mallart, 1985). следующих за претерминалью участках НО третья отрицательная фаза oti та менялась на положительную. Амплитуда второй отрицательной фазы ( вета при этом прогрессивно уменьшалась так, что в центральном и д стальном отделах терминали регистрировался электроположительный ote НО, состоящий из двух положительных фаз, создаваемых протекают пассивного деполяризующего и калиевых токов НО (рис.36). Амплитуда длительность второй положительной фазы к дистальному концу НО пост пенно уменьшалась.

Элеетрогеиьз НО мыши

Рпс.З. Электрогенез нервного окончания мыши.

Электрическая активность мембраны нервного окончания, мыши, имеющего длину 15-20 мкм с интервалом 3-5 мкм. НО- нервное окончание, ПТ- претерминальная область, М- миелинизированный сегмент, ПР- перехват Ранвье.

Моделирование электрогенеза нервного окончания мыши

Нами были промоделированы различные ситуации распределения калов, которые были основаны на предположении, высказанных в работах laUart, 1982,1985; Konishi,1985; Lindgren,Moore, 1989). В самом общем ви-эти предположения заключаются в том, что в претерминальной области основном расположены натриевые каналы, а в остальном НО калиевые налы. Форма мембранного тока, наиболее полно соответствующая ответу Э, была получена при экспоненциальном уменьшении плотности канав. При этом, константа спада плотности для натриевых каналов состави-1 мкм, а для потенциалозависимых и кальций-активируемых калиевых налов 6 мкм в терминали длиной 15 мкм с учетом локального взвимо-йствия участков мембраны НО (рис.4).

уменьшении плотности натриевых, калиевых и кальций-активируем каналов вдоль НО с изменением диаметра нервной терминали.

Потенциалы действия и-ионные токи по ходу нервного окончан мыши длиной 15 мкм при экспоненциальном спаде плотности натр! вых каналов (константа длины 1 мкм), калиевых и кальщ-активируемых калиевых каналов (константа - 6 мкм) показаны в тс ках, соответствующих местам регистрации ответов в электрофизио; гических экспериментах. В сегментах 2,4,6 диаметр НО увеличен в т раза (с 2 до 6 мкм). lNa,K,K(Ca),Ca,L - ионные токи, ПД- потенцг действия, МТ- мембранный ток.

Натриевые каналы. В ходе экспериментов были опробованы различи ситуации в распределении плотности этих каналов. Мы пришли к выво, что несмотря на литературные данные (Mallart, 1985) в НО мыши сохраг ются в незначительном количестве натриевые каналы, плотность котор уменьшается по ходу НО довольно быстро (1=1мкм). При моделирован полного выключения натриевых каналов из мембраны терминали уже первом сегменте НО появлялся выраженный положительный двухфазн: мембранный ток, что не соответствует регистрируемым ответам.

Калиевые каналы. На модели были опробованы различные ситуац распределения этих каналов: увеличение плотности каналов согласно раС там (Lindgren, Moore, 1989), постоянная плотность (Mallart, 1989), перво! чальное увеличение с последующим уменьшение плотности (Mallart, 198 Наиболее реальное изменение третьей фазы (отрицательной в претер\: нальных и положительной в проксимальных участках) и второй поло» тельной фазы (в дистальных участках) в мембранном токе было получе при уменьшении плотности этих каналов вдоль всего НО (рис.4). Это щ водило к появлению увеличивающейся третьей положительной фазы ме бранного тока в проксимальном отделе НО с дальнейшим уменьшениел центральных и дистальных участках НО второй положительной фазы ме бранного тока.

Кальций-активируемые кмиевые каналы. Включение этих каналов в \ дель приводило к укорочению длительности третьей фазы мембранного ' ка в претерминальной и проксимальной областях и второй положительн фазы в дистальной, причем соотношение временных характеристик эт фаз приближалось к реальному в электрофизиологических эксперимен' (вторая фаза в 1,5-2,0 раза более длительна чем первая) (рис.4). В ПД yi рачивалась фаза реполяризации и появлялась фаза гиперполяризации (~ мВ).

Кальциевые каналы. Полученные кривые кальциевых токов noKa3aj что в результате особенностей распределения натриевых, калиевых и Kaj ций-активируемых калиевых каналов и возникновения ПД в кажд участке НО наиболее быстрое развитие кальциевого тока происходит

ервой трети НО, т.е. в этом месте рост внутриклеточной концентрации '.а2" происходит быстрее по сравнению с центральными и дисталъными частками при постоянной плотности кальциевых каналов. По ходу НО мплитуда кальциевого тока падает.

Изменение диаметра нервной терминами. Как известно из морфологиче-ких исследований, нервные окончания мыши имеют особенности строе-ия, заключающиеся как в сложной системе терминальных веточек, так и изменении толщины самой тер.минали (Birks, 1960; Nowycky et al.,1985; ermet,Lavidis,1988). Таким образом, HO мыши образуют подобие бутонов увеличение диаметра в нескольких местах вдоль терминал!!. В ходе мо-ельных экспериментов нами было учтено такое строение НО. Расширение грминали приводит к увеличению радиуса и скорости распространения озбуждения в НО, (снижение внутреннего сопротивления волокна), а при меньшении наоборот. В модельном электрогенезе это привело к увеличе-ию первой фазы мембранного тока и амплитуды ПД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе сопоставления данных модельных экспериментов с элек-эофизиологическими данными можно предложить следующую картину аспределения каналов по ходу НО как холоднокровных, так и теплокров-ых животных. Натриевые, потенциалозависимые. а так же кальций-ктивируемые кашевые канаты имеют максимальную плотность в прокси-альной части НО. По ходу НО происходит уменьшение плотности этих аналов, при неизменной плотности кальциевых канатов. Использование элъко закона экспоненциального спада дало хорошее соответствие экспе-иментальных и модельных данных.

Каждый ионный ток выполняет определенную роль в организации :>ехфазного ответа мембраны НО. Пассивный сдвиг потенциала за счет окальных токов впередилежащих возбужденных участков образует первую ■азу мембранного тока. Этот сдвиг вызывает возникновение входящего атриевого тока. Происходит формирование второй отрицательной фазы ембранного тока. Позже возникает выходящий калиевый ток, который эзврашает мембранный потенциал к исходному уровню и прекращает эанс-мембранный ионный ток. Формируется ПД. Во время фазы реполя-изации в НО происходит активация кальциевых канатов, приводящая к эзникновению входящего кальциевого тока, амплитуда и длительность оторого определяет внутриклеточную концентрацию ионов кальция в, НО, интенсивность секреции медиатора. Внутриклеточный кальций активи-ует кальций-активируемые калиевые каналы, возникает выходящий каль-ий-активируемый калиевый ток, влияющий на скорость реполяризации и :м самым регулирующий величину кальциевого ионного тока. В наших

модельных экспериментах кальций-акгивируемый калиевый ток укорач] вал временное течение кальциевого тока и тем самым синхронизиров. выброс медиатора. Кальций-активируемый калиевый ток является поздни выходящим током, поэтому в мембранном токе появляется третья полож] тельная фаза, а в ПД наблюдается фаза гиперполяризации.

Изменение плотности каналов хорошо объясняет динамику вызваннс секреции медиатора, оцениваемой по амплитуде токов концевой пластш ки. Как показано ранее наибольший квантовый состав токов концевс пластинки наблюдается в первой половине НО (Зефиров, Куртас нов, 1994), что коррелирует с максимальной амплитудой и длительность кальциевого тока в начале модельного НО. Было показано, что во вторе половине НО секреция медиатора начинает уменьшаться, что по наше модели связано с уменьшением плотности натриевых, потенциалозавис] мых и кальций-активируемых калиевых каналов. Интересным является т что для уменьшения кальциевого тока НО не обязательно уменьшен! плотности кальциевых каналов в модели НО.

Таким образом, на основе полученных результатов можно сделать о( щее заключение. Двигательные нервные терминали холоднокровных и те1 локровных животных функционально неоднородны. По ходу НО этих жз вотных происходит постепенное уменьшение плотности ионных канало токи через которые образуют ответ мембраны нервной терминали. Закон« мерность распределения натриевых, потенциалзависимых и кальцш активируемых калиевых ионных каналов в НО теплокровных и aмфиб^ одинаковы, различие в пространственных константах снижения плотное! каналов, повидимому, определяется только формой нервной терминали.

ВЫВОДЫ

1. Электрический ответ нервного окончания лягушки при внеклеточне отведении в претерминальном отделе имеет двухфазную форму (первая ги ложительная вторая отрицательная). В проксимальных участках НО поя ляется третья положительная фаза. В направлении дистальных участке происходит постепенное уменьшение второй и третьей фазы. В централ ных участках третья фаза исчезает, а в самых дистальных участках реп стрируется только положительный ответ.

2. Электрический ответ НО мыши при внеклеточном отведении в прете] минали состоит из первой положительной, второй и третьей отрицател ных фаз. В направлении от проксимальных к центральным участкам Н третья отрицательная фаза меняется на положительную, а . вторая отриц тельная исчезает. На протяжении остального НО регистрируемый ответ с< стоит из двух положительных фаз, в дистальных участках амплитуда вторе

зы уменьшается.

Созданная модель электрической активности НО лягушки и мыши, учи-вающая как локальный, так и все основные ионные токи мембраны, по->ляет получить модельный мембранный ток, соответствующий реальным ;ктрическим ответам нервных терминален этих животных.

Изменение плотности натриевых, потетщиалозависимых и калъций-ивируемых калиевых каналов в электрической модели нервного окон-тя определяет кинетику натриевых, калиевых и кальциевых токов и об-совливает форму возшткагащего мембранного тока. Полное соответствие цельного мембранного тока и регистрируемого ответа по ходу нервных энчаний лягушки и мыши достигается только за счет экспоненциально-уменьшения плотности этих каналов по ходу нервного окончания.

Локальный ток в модельных нервных окончаниях лягушки и мыши уве-швает амплитуду первой фазы мембранного тока, обеспечивает распро->анение деполяризации до конца терминали и уменьшает константы ща плотности каналов в среднем на 20-30%. Наличие локальных токов

шшает скорость распространения потенциала действия в 1.5-2 раза и ;ньшает длительность фаз де- и реполяризашш.

Натриевые и калиевые токи в модели нервного окончания образуют рую отрицательную и третью положительную фазы мембранного тока и зы де- и реполяризашш потенциала действия. Фаза гиперполяризации генииала действия образуется в основном за счет кальций-ивируемого калиевого тока.

В модели электрической активности нервного окончания лягушки дли-\ 100 мкм плотности натриевых, потенциалзависимых и кальций-

ивируемых калиевых каналов уменьшаются с константой экспоненпи-ного спада 30 мкм.

В модели электрической активности нервного окончания мыши длиной мкм плотности натриевых, потенциалзависимых и кальций-

ивируемых калиевых каналов снижаются с константами 1, б и б мкм ггветственно для каждого типа каналов.

При моделировании уменьшения плотностей ионных каналов в нервном »нчании лягушки и мыши происходит уменьшение амплитуды распро-аняющегося потенциала действия в 1.5-2 раза к концу терминали. Дли-ьность фаз де- и реполяризации потенциала действия в терминали ляпси увеличивается, а амплитуда фазы гиперполяризации уменьшается, в зремя, как у мыши временной ход потенциала действия меняется незна-ельно.

Уменьшение плотности натриевых, потенциалзависимых и кальций-

активируемых калиевых каналов в модели нервных окончаний лягушки мыши даже при постоянной плотности кальциевых каналов приводит уменьшению по ходу терминали амплитуды кальциевого тока, инищ рующего освобождение медиатора в синапсе. В проксимальном отделе с< реция медиатора максимальна и снижается в дистальных участках. .

11. В двигательном нервном окончании холоднокровных и теплокровн животных закономерности распределения ионных каналов одинако! Различие в пространственных константах снижения плотности каналов < условлены различной протяженностью и формой терминалей.

Материалы исследования отражены в следующих публикациях:

1. Зефиров A.JL, Гафуров Б.Ш. Теоретическое и экспериментальное исс. дование кинетики ионных токов в двигательном нервном окончании Успехи физиологических наук, 1994, т.25, №4, с. 17.

2. Зефиров A.JI., Гафуров Б.Ш. Модель электрогенеза двигательного не] ного окончания //Тез. докл. Всеросс. съезда "Растущий организм", 3.06.1994, Казань; Казань, 1994, с.51-52.

3. Гафуров Б.Ш. Электрогенез нервного окончания в модели с учетом J кального тока // Нейрохимия, 1995, т.12, №2, с.63.

4. Gafurov B.Sh., Zeflrov A.L. The nerve ending electrogenesis in model w regard of local currents // Abstr. IXth Int. Symposium Cholinergic Mech., 10.06.1995, Mainz, Germany; Mainz, 1995, P.36.

5. Gafurov B.Sh. The nerve ending electrogenesis in model with regard of lc currents and nonhomogeneous density of ion channels // Abstr. Advanced S Neurochem., 28.06-02.07.1995, Okazaki, Japan; Okazaki, 1995, p.38.

6. Гафуров Б.Ш. Моделирование электрогенеза двигательных нервг окончаний // Тез. докл. Съезда физиологов Сибири и Дальнего Восто 15-17.06.1995, Новосибирск; Новосибирск, 1995, с.18.

7. Зефиров А.Л., Гафуров Б.Ш. Исследование кинетики ионных toj нервного окончания с неоднородным распределением плотности иода каналов // Биофизика, 1996 (в печати).

8. Гафуров Б.Ш., Зефиров А.Л., Шакирьянова Д.М. Электрогенез дви тельного нервного окончания мыши (электрофизиология и компьютер] моделирование) // Нейрофизиология, 1996 (в печати).

9. Gafurov B.Sh., Zeflrov A.L. The effect of nonhomogeneous ion char densities on nerve ending electrogenesis // Physiol. Res., 1996 (в печати).