Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы в норме и при низких температурах тела

Джафарова, Альбина Мехьядиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы в норме и при низких температурах тела
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы в норме и при низких температурах тела"

На правах рукописи

ДЖАФАРОВА АЛЬБИНА МЕХЬЯДИНОВНА

ТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В НОРМЕ И ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ ТЕЛА

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Махачкала - 2004

Работа выполнена на кафедре биохимии и НИИ биологии Дагестанского государственного университета.

Научные руководители: кандидат биологических наук,

доцент Кличханов Н. К.

кандидат биологических наук, доцент Эмирбекова А. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Горошинская И. А. (Ростов-на-Дону)

кандидат биологических наук ст. науч. сотр. Аливердиееа Д. А. (Махачкала)

Ведущая организация: Ростовский государственный

университет

Защита состоится _2004 г. в часов

на заседании диссертационного совета К 212.053 12 в Дагестанском Государственном Университете, биологическом факультете, по адресу: 367000, г. Махачкала, Батырая, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Даггосуниверситета, 367000, Махачкала, Батырая, 4.

Автореферат разослан » о/у*»^-- 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук.

доцент '

Нурмагомедова П.М.

2005-4 12071

тм/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ацетилхолинэстераза — это ключевой фермеш холинэр! ической нейро-медиаторной передачи импульсов (Ven-turino et al., 2002). Холинэр1 ические синапсы распределены по всему мозгу, в том числе и коре больших полушарий, и играют важную роль в регуляции активности мозга (Br7in et al., 1983).

Основная функция aueiплхолинэсмеразы ( ААа1ХюЭе|)я в 1ид-ролизе ацегилхолина, поступающего в синаптическую щель в ответ на приходящий в герминаль импульс, с образованием ацетата и холина (Taylor, Brown, 1999). Активность фермента непосредственно влияет на ход физиологического процесса, занимающего несколько миллисекунд (Куф-флер, Николе, 1979). Интегрированность химической реакции в быстрый физиологический процесс определила кинетические особенности АХЭ: высокая специфичность, наличие двух мест связывания и

эффекта субстратного ингибирования (Mallender et al., 2000).

АХЭ - эго эктофермент, которой в основном, локализован на внешней стороне мембраны, рядом с холинорецептором, и прикреплен к мембране синапсов с помощью «якорной» субъединицы, в качестве которой выступает фосфатидилинозитол (Haas et al, 1996). Известно, что фосфолшшдный п жирнокислотный состав оказываю] влияние на фазово-структурное состояние мембраны, от которого зависисят актив-нос ib м кинешчеекме характеристики АХЭ (Frenkel et al., 1980; Bloi et al, 1974). Одним из факторов, определяющих фазово-структурное состояние мембран, является и температура (Крепе, 1981). Вместе с тем неизвестно, как физико-химическое состояние подложки влияет на кинетические свойства АХЭ. Сравнительное исследование мембранносвязанного и со-любилизилированного фермента возможно, позволит выяснить роль мембраны в функционировании АХЭ.

Установлено, что изменение температуры тела приводит к изменению электрической активности мозга (Deboer, 1998), основой которой является холинэргическая передача импульсов. Снижение температуры тела при гипотермии (зимняя спячка) сопровож-

дается снижением частоты электроэнцефалограмм (Wang, Lee, 1996; Deboer, Tobler, 1995). Такое падение импульсной активности мозга сопровождается соответствующими изменениями во всех звеньях синаптической передачи, в том числе и в ферментативном. В связи с этим исследование ключевою фермента нейромедиагорной системы мозга - ацетилхолинэ-стеразы представляет несомненный интерес.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилось сравнительное изучение температурной кинетических характеристик, а также термодинамических параметров АХЭ мембран

коры головного мозга и солюбилизированной (рекомбинантной) АХЭ мембран эритроцитов человека в норме и гипотермических состояниях. Для дос жжения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать температурную зависимость кинетических характе-рисчик и термодинамические параметры АХЭ мембран коры головною мозга крыс.

2. Исследовав 1емпера1урпую зависимость кинетических характеристик и термодинамические параметры рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека.

3. Изучить влияние разных концентраций глицерина на концентрационную и температурную зависимость активности мембранносвязанной и рекомбинантной АХЭ.

4. Исследовать особенности температурной зависимости кинетических характеристик и термодинамические параметры АХЭ мембран синап-юсом коры головного мозга гомойо- и гетеротермных животных при искусственной гипотермии и зимней спячке.

Основные положения, выносимые на защиту. 1 .Температурные зависимости кинетических параметров мембранносвязанной

(мембраны синатосом) и солюбилизированной (мембраны эритроцитов) АХЭ существенно различаются. Степень субстратного ингибирования АХЭ из разных снижается при снижении температуры инку-

бации Температурная зависимость активности АХЭ определяется кон-цент рацией субст рата.

2. Глицерин оказывает существенное влияние на кинетические характеристики и термодинамические параметры АХЭ, однако его эффекты на мембранносвязанную и солюбилизированную (рекомбитантную) формы фермента различаются.

3. Глубокая (20°) гипотермия крыс и зимняя спячка сусликов оказывают различные эффекты на кинетические характеристики и термодинамические параметры АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга, несмотря на то, что все эти эффекты преследует общую цель - снижение электрической

Научная новизна. В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте исследованы температурные зависимости кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс и рекомби-натной АХЭ мембран эритроцитов человека Установлено, что К.т, Ут, Пн и степень субстратного ингибирования являются температурнозависимы-ми величинами.

Обнаружено, что характер температурной зависимости фермента и соответствующие ей термодинамические параметры зависят от концентрации субстрата

ких icMiiepaiyp и снижае! эффеюивнь[е '.»неpi ни активации. Однако имеется и существенные различия в эффектах глицерина: если при низких концентрациях активность рекомбинантиной АХЭ в

среде с глицерином выше таковой контроля, то у мембранносвязанной, наоборот, существенно ниже его.

Получены новые результаты по температурной зависимости и по термодинамическим параметрам АХЭ мембран синаптосом крыс при глубокой гипотермии (20°) и сусликов при гибернации и спонтанном пробуждении. Показано, что глубокая гипотермия приводит к падению величин и степени субстратного ингибирования фермента при всех температурах инкубации, термодинамические параметры при этом не претерпевают изменений. При гибернации же, наоборот, повышаются и степень субстратного ингибирования фермента почти при всех исследованных в работе температурах инкубации. Существенные изменения претерпевают термодинамические параметры АХЭ: температура излома смещается в сторону низких температур, повышаются эффективные энергии активации как выше, и ниже точки излома.

Теоретическое и практическое значение результатов работы. Полученные в работе данные о температурной зависимости кинетических характеристик и об изменении термодинамических параметров мембран-носвязанной и солюбилизированной АХЭ расширяют представления о молекулярных механизмах функционирования фермента.

Результаты исследования представляют интерес для понимания механизмов формирования патогенеза холодового повреждения, компенса--торно - приспособительных и адаптивных реакций при снижении температуры тела гомойогермных и гетеротермных животных. Решение указанных теоретических проблем, может иметь большое практическое значение для различных медико-биологических приложений.

Полученные в диссертации результаты используются при чтении спецкурсов «Биофизика», «Кинетика ферментативных реакций», «Молекулярная биофизика» в Дагестанском Государственном Университете.

Апробация Материалы диссертации докладывались на ито-

говых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ДГУ, на Всероссийской научно-практической конференции (Махачкала, 2001), на XVIII двухгодичном съезде Международного нейрохимического общества (Буйенес-Айрес, 2001), 6-й Г1у щи некой школе-конференции

(Пущино, 2002), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 5 работ, одна работа находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 42 отечественные и 168 иностранные источники. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 40 белых беспородных половозрелых лабораторных крысах (Ratus alba), массой 170-200 г и на 15 малых кавказских сусликах (Citelus pygmaeus Pall.). Глубокую гипотермию вызывали в хо-лодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода температурой 4-7°С. Температуру тела снижали до 20°С. С целью вызывания состояния гибернации, сусликов, пойманных в конце октября, переводили в темное и неотапливаемое помещение, В начале ноября температура тела многих животных падала (до 5-10°С) и они впадали в состояние зимнего оцепенения. После одномесячной спячки животных исследовали в середине баута (t тела = 5-6°С) и после спонтанного пробуждения между баутами спячки (t тела = 34-36°С). В качестве контроля служили летние бодрствующие суслики.

Животных забивали декапитацией, быстро извлекали головной мозг. На холоде отделяли кору больших полушарий головного мозга и методом низкоскоростного ультрацентрифугирования (Hajos, 1975) выделяли синап-тосомы и их плазматические мембраны. Рекомбинантная АХЭ мембран эритроцитов человека была любезно предоставлена профессором Терренэ Розенберри из Майо-Клиник (Флорида, США). Перед работой фермент освобождали от связанного с ним ингибитора (декаметониум) путем диализа. Активность АХЭ определяли методом Эллмана (Ellman et al., 1951) в модификации М.Н. Масловой и Л.В. Резника (1976) по скорости гидролиза ацетилтиохолина (АТХ) и выражали в мкМ тиохолина / мг белка ч.

Для определения максимальной скорости (Vm), константы Михаэли-са (Кга) и коэффициента кооперативности Хилла (пн), измеряли скорость ферментативной реакции в диапазоне концентраций АТХ 1,56* 10"5 - 8*10"3 мМ в отсутствии и присутствии в среде инкубации 1-2% глицерина. Затем строили линейные анаморфозы в координатах Лайнуивера-Берка и Хилла и находили соответствующие кинетические характеристики. Для определения температурной зависимость активности АХЭ скорость гидролиза

измеряли в диапазоне lewnepaiyp 5-37°С при концентрации АТХ 0,2; 0,5 и 2,0 мМ, а 1акже в присуссгвии глицерина Затем по графикам в Аррениу-совских координатах вычисляли положение (очки изломай энергии активации выше и ниже точки излома

Содержание белка в пробах определяли по меюду Лоури (Lowry et al, 1951)

Ситсшческая обрабо1ка ре^лыагов проведена меюдом вариационной статистики с применением t-кригерия Стьюденш (Кокунин идр, 1975)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.Темпера1урная зависимость кннешческих характеристик АХЭ мембран синаптосом мозга крыс.

Была исследована концентрационная зависимость активности АХЭ мембран синап юсом коры головного мозга крыс при различных температурах инкубации На рис 1 представлены зависимости скорости катализа от концент рации cy6cipara в диапазоне 0,0156 - 8,00 мМ при различных температурах инкубации

Рис 1 Концентрационная ывиеимосгь скорости гидролиза аце!илтиохолина АХЭ мембран синаптосом головного мозга крыс при различных температурах инкубациии (■ - 37" С, о-30° С, А-27° С, Т-23" С, ♦-20° С, «-1511 С, 10°

lg|ATX] мМ

Видно, чю кривые зарисимосш имею! колоколообразную форму, те скорость i идролиза раиегдо определенного оптимального значения концентрации субстрата (Sopt), за1ем, по мере дальнейшею увеличения концентрации АТХ, падает Таким образом, кинетика реакции характеризуется наличием субстратного ингибирования, что согласуется с литературными данными (Botti et al ,1999, Greenblatt et al , 2000) При 37°С инкубации Sopt соответствует значению 0,5 мМ АТХ Концентрационные кривые, снятые при различных [емпературах инкубации, имеют сходные характер и значение

Из рис 1 видно, что повышение температуры инкубации увеличивает скорость реакции во всем диапазоне исследованных концентраций Об-

ращает на себя внимание тот факт, что крутизна правого (ингибиторного) склона концентрационной кривой увеличивается с повышением температуры инкубации, т.е. степень субстратного ингибирования при высокой температуре выше, чем при низкой. Количественно cieneHb субстратного ингибирования можно охарактеризовать величиной Q, вычисляемой как ошошсние скоросж гидролиза при оптимальной концешрации cyGcipaia (0,5 мМ) к максимально использованной в работе концентрации (8 мМ) При разных температурах инкубации получены следующие значения Q: 37°С - 2,22; 30°С- 1,89; 27°С - 2,1; 23°С-1,97; 20°С- 1,87; 15°С-1,7; 10°С - 1,64. Таким образом, Q является гемпера[урнозависимой величиной: с снижением температуры инкубации значение Q уменьшается. Известно, что субстратное ингибирование пропорционально концентрации комплекса SEP, где S — молекула субстрата, Е — молекула фермента, Р — молекула холина (Venturino et al., 2003). Возможное объяснение уменьшения субстратного ингибирования при снижении температуры — это уменьшение [SEP] при низких температурах вследствие уменьшения скорости образования ЕР. Из этого следуе!, что уменьшение Vm должно сопровождаться уменьшением субстратного ингибирования, а возрастание Vm — возрастанием субстратного ингибирования (Mallender et al., 2000), что и наблюдается в наших экспериментах.

Результаты исследования температурной зависимости кинетических параметров АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс приведены на рис.2. Видно, что по мере повышения температуры существенно увеличивается Vm. График Аррениуса для Vm линеен (рис. 2а). В диапазоне температур 5 — 15 °С К, слабо зависит от температуры (рис 26), однако при дальнейшем повышении температуры значение Кга возрастает. На графике Аррениуса для Кт обнаруживается излом при температуре 20°С. Значение коэффициента Хилла скачкообразно меняется в узком промежутке температур. В диапазоне температур 37 - 23°С значение пн больше

единицы, а в диапазоне температур 23 - 10°С меньше единицы. Это означает, что в области температур выше 23°С фермент связывает АТХ с положительной кооперативное! ью, а ниже 23°С кооперативность по субстрату переходит в отрицательную. Таким образом, кинетические параметры АХЭ критически изменяются в области температур 20-23°С, что, возможно, связано с кооперашвнымн фазовыми переходами в самой молекуле или в мембране.

Учитывая сложный характер субстратной зависимости АХЭ, температурная зависимость активности фермента была анализирована при оп-шмальной (0,5 мМ), ниже ошимальной (0,2 мМ) и выше оптимальной (2,0 мМ) концентрациях АТХ. Соответствующие экспериментальные данные приведены на рис. 3. График температурной зависимости активности

1 8

090 8 . i ■—г——,—.—,——т—.—.....

3 20 3 25 3 30 3 35 3 40 3 45 3 50 3 55 3 60 3 65 1/(Т 10!)

Рис 3 Температурная зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при разных концентрациях субстрата: -

2 0мМ

АХЭ при S-0,5 мМ в координатах Аррениуса имеет два линейных участка с изломом при 21,5°С. При S = 0,2 мМ график также имеет два линейных участка с изломом при 22,5°С. Однако в области температур выше точки излома график имеет меньший наклон, чем при S =0,5 мМ. При S = 2 мМ, что соответствует области субстратного ингибирования, график Аррениуса не имеет излома. Эффективные энергии активации (Еа) гидролиза АТХ также зависят от концентрации субстрата (табл. 1). Выше точки излома Еа по мере повышения концентрации

In vivo фермент всегда работает в уникальном компартменте, где все особенности компартмента оказывают влияние на катализ: скорость диффузии, вязкость растворителя, геометрия компартмента, рН, ионы и т.д. (Диксон, Уебб, 1982). Весь каталитический процесс можно разбить на последующие стадии, каждая из которых занимает определённый промежуток времени (Gentry et al., 1995) и имеет свою температурную зависимость. Изменяя физико-химические условия в компартментах, можно влиять на разные стадии катализа. В случае АХЭ весь каталитический акт можно разбить на две стадии: 1. диффузия субстрата из объёма к активному центру; 2. каталитическое превращение субстрата в активном центре с

образованием продукта и регенерацией активного центра. Так как диффузия представляет собой физический процесс, то ее температурная зависимость гораздо меньше температурной зависимости химического процесса превращения субстрата в продукт. Для того, чтобы выяснить вклад различных стадий в температурную зависимость катализа АХЭ, нами было исследовано влияние глицерина на кинетику АХЭ при разных температурах инкубации.

Таблица 1

Точки перегиба и энергии активации АХЭ мембран синаптосом коры головною мозга крыс при различных концентрациях субстрата (М±т: п — 8)

№

Концентрация АТХ, мМ

Температура Излома, °С

Энергия активации, кДж/моль

выше излома

ниже излома

0,2

22,5+0,1

12,08+0,30

32,45+2,03

0,5

21,2+1,2

18,64+0,46 Pl-2<0,01

28,86+1,73 p1-,<0,05

2.0

излома нет

31,67 +0,66

Результаты исследования влияния глицерина на концентрационную зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс представлены на рис. 4. Оказалось, что глицерин оказывает существенное влияние на кинетику АХЭ. При низкой температуре инкубации (10°С) 2% глицерин увеличивает скорость гидролиза АТХ во всем диапазоне исследуемых концентраций, тогда как в присутствии 1% глицерина наблюдается увеличение активности фермента только в диапазоне от 0,5 до 4 мМ.

Рис.4.. Влияние глицерина на концентрационную зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при разных температурах инкубации: ■ - без глицерина,

2% глицерин; пунктирная линия - 10°С, сплошная - 37°С.

1д [АТХ].мМ

При высокой температуре инкубации (37°С) глицерин дозозависимо снижает активность АХЭ при низких концентрациях субстрата (о г 0,0156 до 1мМ). При высоких же концентрациях ацетилтиохолина, наоборот, 1% и 2% глицерин приводят к повышению скорости ферментативной реакции. Обращает на себя внимание тот факт, что низкие концентрации

глицерина смещают точки ошимума (8ор1) на концентрационной кривой в область высоких концентраций. Это смещение точки оптимума, скорее всего, указывает на конкурентное снижение константы связывания с>бстра1а в переферическом мес1е, за счет чет К, увеличивается, а поскольку 50|П=л/^Г7о , то добавление глицерина увеличивает К, и соотвег-счвенно способствует смещению 8ор1 в сюрону высоких конценграций субстрата.

Глицерин оказывает влияние и на степень субстратное ингибирова-ние. если при низкой темперагуре эю влияние незначительно, то при 37 С явно видно, чю 1%и2% ижцерпн эффективно снижают значение д на 12,3% и 18,6%.

Глицерин оказывает действие на температурную зависимость кинетических параметров АХЭ (табл. 2). Он дозозависимо влияет на Уш АХЭ. При температуре инкубации 10°С в зависимости от концентрации глицерина наблюдается некоторое повышение Уш, а при 37°С, наоборот, снижение максимальной скорости гидролиза При низ-

кой температуре глицерин не влияет на константу Михаэлиса-Мэнтен. При 37°С он снижает сродство фермента к АТХ, причем 2% глицерин достоверно повышает Кш АХЭ.

Таблица 2

Влияние глицерина на кинетические характеристики АХЭ мембран синаптосом коры головною мозга крыс (М±т; п=5)

Условия Темперту- Кинетические параметры

№ Опыта ра инкубации °С Кш, мМ Уш, мкМ/ мг-ч

1 Без глицерина 10 0,059+0,00015 23,25+0,31 0,89+9,46-Ю"3

37 0,061 ±0,0006 64,43+0,70 1,75+7,50-103

2 1% глицрин 10 0,058+0,0008 24,65+0,28 0,88+6,63-103

37 0,062+0,0007 61,55+0,57 1,66+0,01 Р|-2<0 01

3 2% глицрин 10 О,О58±О,ОО11 26,27+0,40 Р|-2<0,01 0,87+0,02

37 0,072+0,0024 Ри<0,05 58,75+0,63 Р1 з<0,001 1,64+0,02 Р, ,<0,001

Из табл. 2 видно, что при низкой температуре глицерин не влияет на кооперативность связывания АТХ. При 37°С наблюдается достоверное снижение пн АХЭ в среде как с 1%, так и 2% глицерином.

Глицерин влияе! на темпера 1урную зависимость аюивности АХО.

Оказалось, что он дозозависимо повышает скорое 1ь гидролиза АТХ ниже точки излома и существенно снижает ее выше точки излома (рис. 5) Глицерин смещает позицию nepei иба, причем, чем выше концентрация глицерина в среде, тем ниже температурная точка излома на графике Арре-ниуса.

1 6т ,

3 20 3 25 3 30 3 35 3 40 3 45 3 50 3 55 3 60

•цтю3)

Рис 5 Влияние глицерина на температурную зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс ■ - без глицерина, о- 1% глицерин. • -2% глицерин

Таблица 3

Влияние глицерина на положение точки излома п онер! ию активации АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс (М±т; п-5)

№

Условия опыта

Точка излома,

Энергия активации, кДж / моль

Выше излома

ниже излома

Без глицерина

22,5+0,1

12,39+0,30

33,18+2,03

1% глицерин

20,8+0,3

10,47+0,33 Р, 2<0,01

31,58+0,57 Р| 2>0,01

2% глицерин

18,6+0,2 P13<0 001

7,09+0,49 P13<0 001

28,16+0,74 Р,з<0 05

Pi 2<0,01

Выше точки излома 1% и 2% глицерин существенно снижает энергию активации АХЭ, ниже точки излома это снижение меньше (табл. 3) Интересно то, что в среде с глицерином на графике Аррениуса наблюдается явное смещение позиции перегиба в область низких температур.

в резульиие, коюрых образуется сфосвеi для выхода cy6crpaia из каталитической полосги Вполне верояшо, что глицерин, встраиваясь в третичную cipyKiypy фермента по гидрофильным местам связывания, действует как смазка, облегчая конформационную подвижность Из Э1их данных следуе1, чю, возможно, важное значение для функционирования фермен-ia iiMLt'i вязкоеII. среды сннанi пчеысои щели

Д 1я юн), чюбы исключиII. влияние мембранною окружения, н следующей серии эксперимент!* нами были исследована темпера(урная зависимое^ кипе)ических харак!ериС1ик рекомбинангной АХЭ эршроцп-юв человека

2. Температурная зависимое^ кинетических характеристик ре-комбннангном ацетилхолинэстеразы

Исследование концен(рационной зависимости скорости гидролиза АТХ рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека выявило наличие оптимума при концентрации субстрата примерно 4,0 мМ (рис.6) при 37°С инкубации Выше указанной концентрации скорость гидролиза падает, т е для рекомбинантной АХЭ, так же как и для АХЭ мембран си-нагпосом, характерен феномен cy6ciратного ингибирования. Этот эффект для рекомбинантной АХЭ выражен даже сильнее, чем для мембранносвя-занной Инкубация фермента при более низких 1емперагурах приводит к снижению ак1ивнос(и АХЭ во всем диапазоне исследуемых концешра-

Рис 6 Концентрационная зависимость рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека при разных темпера турах инкубации в-5°С. о-10°С, А - 15"С Т-20"С ♦ - 25"С. • -30°С. о~37°С

ций По мере снижения температуры инкубации уменьшается степень субстратною ингибирования Так, если при 37°С значение р составляет = 3,5, то при 5°С это о [ношение снижается до 2,08 (на 59,5%) Вычисленные из начальных значений скорости ферментативной реакции кинетические характеристики рекомбинатной АХЭ представлены на рис 7. Максимальная скорость рекомбинатной зависит от температуры С повышением температуры Уш растёт, однако наблюдается резкий скачок значения Уш в области температур 15-20°С (рис 7а) Из рис. 76 видно,

ню Кгп для рекомбинашной АХЭ ыкже является юмпературнозависимой величиной с повышением 1емпературы инкубации Кт уменьшается График температурной зависимости Кт представлен двумя не пересекающимися прямыми, поскольку наблюдается резкий скачок значения этою па раме фа в области 15 -20°С Фермент связывается с субстратом коо-нера/шшо Кох|)фпцен1 коопсра]пвнос!н завиии от юмперагуры В диапазоне 1смпера1ур 01 5 до 20" коопера)пвнос1Ь офицательна, выше 20°С она скачкообразно переходит в положительную кооперативноегь, которая

Таким образом, графики Аррениуса для Кт, V,,, и пн обнаруживают скачкообразный переход в диапазоне температур oт 15 до 20°С. Столь резкий переход нельзя в данном случае объяснить фазовыми переходами в мембране, так как фермент находится в солюбилизированной форме, следовательно, надо полагать, чю это резкое изменение кинетических характеристик обусловлено структурными переходами в самой молекуле фермента Вероятнее всего, этот структурный переход состоит в изменении внешнею расположения аминокислотных оста I ков фермента, при ко юром изменяйся количество Ван-дер-ваальсовых контактов, которые надо разорвать на пути каталитического акта Таким образом, характер ных зависимостей кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ значительно отличается от АХЭ, локализованной на синаптической мембране Это отличие - отличие разрывов у АХЭ - можно объяснить этой формы фермента с мембраной

При исследовании температурной зависимости активности АХЭ были использованы две концентрации АГХ ниже оптимальной (0,2 мМ) и

I'm Ь I curiqui \ рн 14 J imicimotiI (кьомон шитой ЛХ ) MLMopin ipnipoiiHiOH чслоиека при pa,ш 14 мшципрацияч Л1X ■ ()2мМ

выше оптимальной (16мМ, область субстратною ингибирования) Оказалось, чю концентрация cy6cipaia влияе) на температурную зависимость фермента (рис 8) Графики Аррениусадля рекомбинангной АХЭ при обеих концентрациях АТХ нелинейны каждый из них предсовлен двумя прямыми, пересекающимися в ючке излома, причем, i рафик температурной зависимоеiи АХЭ при концентрации АТХ 0,2 мМ лежит существенно ниже такового при 16мМ Оказалось, что точка излома на графике Арре-ниусазависти oi концетрации субстрат (рис 8, табл 4) С повышением концентрации АТХ позиция перегиба смещается в область высоких тем-uepaiyp Положение точки излома между двумя линейными учас1ками соответствует резкому изменению характеристик в том же диапазоне температур Изменения претерпевают и эффективные энергии активации рекомбинантной АХЭ ниже точки излома энергия активации при концентрации субстрата 0,2 мМ достоверно выше таковой при 16 мМ, а выше точки излома, наоборот, энергия активации выше при высокой концентрации АТХ. Таким образом, показано модулирующее влияние концентрации субстрата на температурную зависимость и термодинамические характеристики рекомбинантной АХЭ

Таблица 4

Точки излома и энергия АХЭ мембран

роиитов человека при различных концен!рациях субстрата fM+m. п-5)

, к'Дж/моль^)

№

Концентрация субстрата, мМ

Точка излома,

Энергия активации

выше излома

ниже ичлома

0,2

17,6+0,0

6,73+0,24

38,70+2,01

16,0

20,0+0,5 Р|2<0 01

7,27+0,21

31,9±1,34 1'12<0 001

Исследование влияния глицерина на концентрационную зависимой ь рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека (рис. 9) показало, чю при низких температурах он увеличивает скорость гидролиза субстраню сравнению с контролем во всем диапазоне исследуемых концен! рации (ог 0,0156 до 64мМ). Причем при низких концен Iрациях субстрата (до I мМ) аминируощее действие ищцерина на фермет выражено сильнее, недели при высоких концентрациях- I" тересно ю, что кривые концен-зависимости АХЭ под влиянием различных

Рис 9. Влияние пицерина на концентрационную зависимость рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека при разных температурах инубации Температура инкубации сплошная линия - 37 С, прерывистая -10"С, ■ - контроль,о - 1% глицерин. А- 2% глицерин;

концентраций итицерина мало отличаются друт от друта, ю есть увеличение концентрации глицерина с 1% до 2% незначительно сказывается на активности фермента. При 37°С глицерин увеличивает скорость гидролиза рекомбинантной АХЭ до тех пор, пока концентрация АТХ не достигнет I мМ. Вместе с тем как в том же диапазоне концентраций АТХ глицерин оказывал противоположный эффект на мембранносвязанную форму фермента. Возможно, что в рекомбинантной АХЭ глицерин, встраиваясь в структуру молекулы, влияет на ее конформационную подвижность, в результате чего скорость возрастает, В диапазоне концентраций от 1 мМ до 8 мМ активность АХЭ заметно уменьшается, а при высоких концентрациях (более 8мМ) глицерин снова способствует увеличению скорости Катализа.

Если при 10°С положение оптимума на концентрационной кривой в присутствии глицерина не изменяется, то при 37°С наблюдается явное смещение точки оптимума в область высоких концентраций (8 мМ). Глицерин снижает эффект субстратного ингибирования рекомбинантной АХЭ: при 10°С на 35,9% (1 % глицерин) и 34,5% (2% глицерин), при 37°С на 52 % (1% глицерин) и 59,5 (2% глицерин). Подобные эффект глицерина наблюдались и для синаптосомальной АХЭ.

Исследование температурной зависимости кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ в присутствии глицерина показало (табл. 5), что значение V,,, при темпера! у ре инкубации 37°С с повышением концентрации глицерина падает, а при температуре инкубации 10°С, наоборсн, повышается. Исследованные концентрации глицерина не влияют на Кт фермеша при 37°С, однако, при 1емиера1>ре инкубации Ю"С значение копси1Н1Ы Михазлнса досюверно снижаеюя Оказалось, чю глицерин не оказывает влияния на коэффициент Хилла.

Таблица 5

Влияние глицерина на кинетические характеристики рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека при различных температурах инкубации_

№

Условия опыта

КийМйЧШйтс^арактеристики

Кп1, мМ Уш, мкМ/мг-ч.

1 Без глице- 10 0,340±0,014 12805,0+365,3 0,88+0,03

рина 37 0,152+0,016 23189,9*378,3 1,23+0,09

2 1 % глицерин 10 0,284±0,022 Рю<0 05 13726,1=4=321,0 0,89+0,09

37" 0,155+0,015 2061,1 +768,61 "Т22 + 0,05

3 2% глицерин 10 0,292+0,021 Р,.з<0,05 14199,5+544,6 0,86+0,10

37 0,150+0,015 20858,7+389,8 Р|.з<0,01 1,22+0,03

Было исследовано влияние глицерина на температурную зависимость активности рекомбинантной АХЭ (рис. 10). Глицерин, в зависимости от своей концентрации увеличивает скорость ферментативной реакции во всем диапазоне исследованных температур. На графике Аррениуса темпера-

Рис. 10. Влияние глицерина на температурную зависимость рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека: • -без глицерина, о - 1% глицерин. • -2% глицерин ([АТХ]=0,2 мМ)

турная зависимость рекомбинангной АХЭ в присутствии глицерина аппроксимирована двумя пересекающимися прямыми лежащими выше таковых контроля. Глицерин дозозависимо снижает температурную зависимость активности АХЭ. Это выражается в снижении энергии активации как выше, так и ниже точки излома (табл.6) на графике. Кроме того, в

излома смещается в

низких температ}р. Эти же ^феюы ишцерина обнаружены и для синап-тосомальной АХЭ.

Таблица 6

Влияние глицерина на положение точки излома и энергию активации ре-

комбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека (М±т:

№ Условия Точка излома, °С Энергия активации, кДж/мЪль.^

опыта выше излома ниже излома

1 Без глицерна 16,0±0,3 9,71 ±0,46 35,66±1,93

2 1% глицерин 15,1±0,1 7,54±0,37 26,68±0,64

3 2% глицерин 15,2±0,3 Р, з<0 05 6,75±0,52 Р1 з<0,01 26,43±0,45 Р, 3<0,001

Таким образом, влияние глицерина на мембранносвязанную и солю-билизированную формы АХЭ отличаются, хотя имеется и ряд схожих черт. Поэтому особенности влияния глицерина на фермент нельзя объяснить с точки зрения одной, общей для обоих ферментов, позиции. Поскольку глицерин — вязкое вещество, он вполне может увеличивать вязкость окружающей среды фермента. Кроме того, как низкомолекулярный лиганд, он вполне может проникагь в полость фермента и замещять там молекулы воды, а также, присоединяясь к определенным участкам ущелья, менять его конформационную подвижность. Для выяснения механизма действия глицерина на фермент необходимо использование таких современных методов исследования, как рентгенострукгурный анализ, специфичный мутагенез, компьютерное моделирование.

3. Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии

Исследование концентрационной зависимости АХЭ показало, что при всех концентрациях субстрата и температурах инкубации при гипотермии наблюдается снижение скорости гидролиза АТХ относительно контроля (гипотермия - рис 11; контроль -рис.1) Активность фермента снижается в оптимуме при 37 °С на 21%.

Положение точки оптимума при гипотермии не меняется относительно контроля, составляя 0,5 мМ АГХ При гипотермии по сравнению с кон-

тролем уменьшайся степень субстратною иш ибированпя фермента, особенно при 30 и 37 °С Ут фермента при этом заметно уменьшается

Рис 11 Концом ртиоин 1Я зависимость ДХЭ МСМОрИ! СИИ IIIIОСОМ коры 10ЮВП0111 Ч01ГЛ крыс при гипо1ермии 20 С ■ - 10"С о —

(на 20%), однако характер температурной зависимости Уш при этом не изменяется Гипотермия 20 °С существенно не изменяет значения Кш, однако температурная зависимость этого параметра заметно уменьшается Гипотермия 20 °С также не повлияла на температурную зависимость пн, однако, в целом степень кооперативноспЬ несколько уменьшилась (при температуре инкубации 37°С на 14,9%) Как и при нормотермии в диапазоне температур 20 - 30 °С наблюдается резкое изменение (увеличение) пн

Температурная зависимость скорости ферментативной реакции при концентрации субстрата 0,2 мМ представлена двумя нелинейными участками (рис 12) с точкой пересечения 22,3 °С В целом график температурной зависимости АХЭ при гипотермии проходит ниже такового при нормотермии При этом почти не изменяются точка перегиба и углы наклона прямых температурной зависимости относительно контроля В свя-

1 /Т 10 '

Рис 12 Температурная зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии 200С • - контроль о - гипотермия

зи с этим термодинамические характеристики температурной зависимости АХЭ точка излома, эффективные энергии активации ниже и выше точки

излома при гипотермии также не подвергаются значbельным изменениям. В целом, эти данные указывают на то, что кинетические свойства самих молекул фермента не претерпевают изменений, а число активных молекул фермента уменьшается.

4. Темпера гурная зависимость кинешческих характеристик АХЭ мембрансннашосом коры юловною мола с^слнкон при лшнеи спячке

Исследование активности АХЭ мембран синаптосом коры головно-[О моз1а сусликов при температуре инкубации 37°С и оптимальной кон-

показало, что при зимней спячке она возрастает на 36 % относительно контроля, в то же время как при спонтанном пробуждении животных активность фермента снижается. Исследование концентрационной зависимости скорости гидролиза АТХ ферментом контрольных сусликов выявило наличие оптимума при концентрации фермента примерно 1 мМ при всех исследованных температурах инкубации (рис. 13). Следует отметить, что при гибернации и спонтанном пробуждении наблюдается сдвиг S в сторону меньших концентраций субстрата.

-2,0 -1,5 -1,0 -05 0,0 05 1,0 ^ [АТХ], мМ

01.......... ■ --.

-2 0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

^[АТХ], мМ

, 40

г 2

Рис 13 Концентрационная зависимость АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга контрольных (а), зимоспящих (б) и спонтанно проснувшихся (в) сусликов ■-5"С, •-)()"€, А-15"С, Т-20"С.

* 20 >

0^-■------—■—

-2 0 -15 -10 -0 5

0 0 0 5 1 0 »^"С. о-30°С. о-37°С

1 й ! АI XI мМ

Увеличение концеш рации субсфата выше Sopt снижает скорость гидролиза АТХ при всех исследованных состяниях. Интересен toi факт, что в динамике зимней спячки изменяется профиль конценфационных кривых, чю, возможно, свиде|ельсгвуе1 об изменении изоферменгно!о соиава АХЭ в динамике зимней спячки

Из рис I > видно, чю с понижением leMiiepaiypu инкубации cieneHb с> Gc I pa I hoi о iifii ибирования уменыиаек-я Оказалось, чю ск'иень Суб-сгражого hhiибирования зависит от физиоло!ическою сосюяния живо1-ною Ишересеи 101 фаю, чю при всех icMiiepaiypax инкубации аепень субсфажою iiHi ибирования при зимней спячке сущесизенно увеличивайся (почти на 50-60 %) Спонтанное пробуждение приводит к снижению значения Q (на 24-39 %) при температурах инкубации выше 20°С, но оно остается выше контроля.

Анализ кинетических характеристик АХЭ показал, что при зимней спячке существенно увеличивается значение максимальной скорости фермеша (рис 14а) Исследование температурной зависимости Vm фермеша у кошрольных сусликов выявило наличие излома при 28 °С. У iибернирующих сусликов излом на графике температурной зависимосш смещаекя в область низких температур (18 °С). При спонтанном пробуждении излом на графике (при 17 °С) еле заметен.

1 15 I................... .. | 1151....... ■■ I ■ . • I ■ I ' ---

3 20 3 25 3 30 3 35 3 40 3 45 3 50 3 55 3 60 3 65 3 20 3 25 3 30 3 35 3 40 3 45 3 50 3 55 3 60 3 65

1/Т103 1ЯЮЛ

ис 14 Гемперагурная зависимость \'„, (а), К,„(б), АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов при зимней спячке и спонтанном пробуждении ■ - контроль о - спячка, А- спонтанное пробуждение

Как видно из рис. 146 значение константы Михаэлиса у ибернирующих и спонтанно проснувшихся животных не отличается от такового у летних контрольных сусликов. Оказалось, что в исследованном интервале температур Кш сильно зависит от температуры. У контрольных сусликов на графике температурной зависимосш Кт наблюдаося излом при

27-30 °С, а у спящих и спонтанно проснувшихся сусликов при 26 °С. Значение коэффициента Хилла также зависит 01 температуры. У контрольных сусликов значение Пц снижается по мере снижения температуры, а при 28 °С кооперативное связывание субстрата исчезает. У зимос-пящих и спонтанно проснувшихся сусликов позиция перегиба на графиках 1елшера1>рноп завпсимосш козффицсн 1а Хилла перемещается в область низких температур (15-16 "С) Обращает на себя внимание юг фаг<1, чго при спонтанном пробуждении наблюдается значительное снижение коэффициента кооперативное!и Таким образом, в состоянии зимней спячки трафики зависимости пц, V,,, и 1Ст АХЭ мембран синап юсом коры головного мозга сусликов от температуры имеют изломы при более низкой температуре, чем у контрольных сусликов.

Была исследованна температурная зависимость скорости гидролиза АТХ АХЭ зимоспящих животных при концентрации субстрата ниже 8ор1 (0,2 мМ) Во всех физиоло! ических состояниях графики температурной зависимости представлены двумя пересекающимися линейными участками (рис 15) При зимней спячке происходит смещение точки излома в область низких темпера1ур (рис. 15, табл. 7) При спошанном пробуждении спящих сусликов [емпература, при которой наблюдается излом, несколько выше, чем при спячке, но достоверно ниже, чем в контроле. При зимней спячке достоверно повышается значение энергии активации как ниже, и выше точки излома (табл 7), что свидетельствует об увеличении температурной зависимости фермеша При спошанном пробуждении энергия активации несколько снижается, но остается достоверно выше контроля как выше, так и ниже точки излома.

Рис 15 1смнср<шриая чависимоиь АХЭ мембран сниатосом коры головного мозга сусликов при зимней спячке • - контроль, А - зимняя спячка, о - спонтанное пробуждение

Таблица 7

Точки перегиба и энергия активации АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов при зимней спячке и спонтанном пробуждении

(М±т; n=4)

№ Состояние жинот ного Температура излома, "С Энергия активац выше излома ии, кДж/моль ниже излома

» Контроль 26,85±0,78 10,63±1,56 28,33±2,08

2 Зимняя спячка 17,50±0,64 Р|2< 0.001 ' 15,06±0,76 Р,2< 0.001 42,65±2,17 Р, 0.001

3 Спонтанное пробуждение 18,10±0,64 Pi.i< 0,05 14,35±1,39 Р,.3< 0,001 36,10±0,69 Р|.з< 0.001

Известно, что АХЭ чувствительна к изменению фосфолипидного и жирнокислотного состава мембран (Tsakiris, 1985). Показано, что липиды, имеющие низкие температуры плавления способствуют смещению точки излома на графиках температурной зависимости АХЭ в сторону низких температур (ВЫ et а1., 1979). Возможно, что при зимней спяске происходит изменение липидного состава мембран в месте локализации АХЭ, что изменяет соответственным образом конформацию молекулы фермента. Действительно, было показано, что в синаптических мембранах сусликов существенно снижается количество насыщенных липидов (Коломийцева и др., 1997). Увеличение жидкостности мембранных липидов при низких температурах, возможно, ведет к смещению позиции перегиба на графиках Аррениуса в область низких температур и увеличению эффективной энергии активации для мембранносвязанных ферментов. Остается открытым вопрос, как реализуется влияние липидной подложки на АХЭ, так как связь между мембраной и ферментом осуществляется только лишь посредством якорной субъединицы.

Таким образом, явно видно, что снижение температуры тела у зи-моспящего животного приводит к противоположным изменениям по сравнению с исскуственной гипотермией незимоспящего животного. Изменение активности АХЭ, скорее всего, являются адаптивными, поскольку сама спячка есть результат адаптации к существенным изменениям температуры тела. Поэтому увеличение активности фермента, видимо, необходимо для нормального функционирования мозга животного при низких температурах. В ранней работе М. Б. Штарка (1970) было также обнаружено увеличение активности АХЭ синаптических мембран головного мозга. Поскольку искусственная гипотермия привела к противоположному изменению, более правдоподобно, что эти изменения есть результат

процессов, так как снижаются и активность, и степень субстратного ингибирования.

выводы

I КоиценIрационная завиеимоспь и С001ве1С1в\ющие ей кинешче-ские харак1ерис1 ики аце1нлхолинзс1еразы мембран спнашосом коры ю-ловною моз1а крыс и рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эршроцтов человека завися! от 1емиературы Для обеих форм фермета снижение 1емпера1уры инкубации приводи! к падению амивносги фермента во всем диапазоне исследованных концентраций субстрата, снижению V,,,, коэффициента Хилла (пн) и степени субстратного ингибирования Кп) для рекомбинантной АХЭ со снижением температуры увеличивается, в то время как для мембранносвязанной, наоборот, имеет тенденцию к снижению

2. Температурные зависимости К1П, Ут, и Пн претерпевают скачкообразные изменения в диапазоне температур 20-25°С (мебранносвязанная) и 15-20°С (рекомбинантная АХЭ) Эти изменения на графиках Аррениуса

для мебранносвязанной АХЭ проявляются в виде изломов, а для рекомби-нантной - в виде разрывов

3. Температурные зависимости активности мембранносвязанной и рекомбинантной АХЭ и соответствующие им термодинамические параметры зависят от концентрации субстрата При низких концентрациях аце-тилтиохолина на графиках Аррениуса обоих ферментов имеются изломы. Высокие концентрации ацетилтиохолина приводят к исчезновению перегиба у мембранносвязанного фермента, тогда как у рекомбинантной формы наблюдается лишь смещение позиции перегиба в область высоких температур.

4. Глицерин в конечной концентрации 1 и 2% оказывает существенное влияние на зависимость АХЭ и соответствующие кинетические характеристики Для обеих форм фермента при 37°С глицерин дозозависимо на концентрационной кривой в сторону высоких концентраций ацетилтиохолина, снижает степень субстратного ингибирования и V, фермента, однако КП1 при этом не изменяется Существенным различием в эффектах глицерина на активность АХЭ из разных источников является то, что у рекомбинантного фермента при низких концентрациях ацетилтиохолина активность фермента в присутствии

выше таковой контроля, то у мембранносвязанной, наоборот, существенно ниже ее. При 10°С для обеих форм фермента наблюдается повышение активности фермента во всем диапазоне исследуемых концентраций.

5 Глицерин дозозависимо смещает позицию перегиба на

температурной зависимости активности АХЭ из разных источников в область низких температур и снижает эффективные энергии активации.

6. Глубокая гипотермия (20°С) снижает активность, Vm, Пн и степень субстратного ингибирования АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс почти при всех температурах инкубации. При этом К^ не из-меняе1ся. Харамер температурных зависимости Kln, Vm, Пн остается таким же, как и контроле. Неизменными остаются и термодинамические характеристики фермента.

7. При зимней спячке повышаются активность, Vm и степень суб-страшого ингибирования АХЭ мембран синапгосом коры головного мозга сусликов, а при спонтанном пробуждении эти кинетические параметры снижаются до уровня контроля. Зимняя спячка и спонтанное пробуждение приводят к смещению позиций перегиба на графиках температурной зависимости активности фермента, Vm, Пн в область низких температур. При этом эффективные энергии активации АХЭ сусликов в состоянии торпид-ности и спонтанного пробуждения на обоих участках выше таковых летних сусликов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Меджидова (Джафарова) А. М., Шахбанова Ф. Ш., Ахмедова Г.А., Кличханов Н.К., Мейланов И. С. Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс // Химия в технологии и медицине. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. — Махачкала. - 2001. — С. 99-101.

2. Klichkhanov N. К., Meilanov I. S., Medjidova (Jafarova) A. M., Sha-hbanova F. Sh. Temperature dependence of kinetic characteristics of acetylcholinesterase of synaptic membranes from rat brain cortex. //J. Neurochem. — 2001. - V. 78, suppl. - p. 155.

3. Меджидова (Джафарова) А. М., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Температурная зависимость активности ацетилхолиэстеразы синаптиче-скпх мембран сусликов при зимней спячке // Ш съезд биохнм. общества. Тезисы научных докладов, Санкт-Петербург. - 2002. — с. — 378.

4. Меджидова (Джафарова) A.M., Кличханов Н.К., Мейланов И.С. Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэ-стеразы мембран синаптосом мембран коры головного мозга крыс // биология - наука XXI века. 6-я Пущинская школа - конф. Сб. тезисов Пущи-но, 2002.-Т. I.-с. 111-112.

5. Джафарова A.M., Кличханов Н.С. Температурная зависимость ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга сусликов при зимней спячке // Вестник ДГУ Ест. Науки. - 2003. - С.36-44.

Формат 60x84 1/16 Гарнитура Тайме. Бумага офсетная. Тир. 100 экз. Размножено на дупликаторе ПБОЮЛ «Ьисултанова»

04-15112

РНБ Русский фонд

2005-4 12071

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джафарова, Альбина Мехьядиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распределение ацетилхолинэстеразы.

1.2. Функции ацетилхолинэстеразы.

1.3. Молекулярные формы ацетилхолинэстеразы.

1.4. Структура ацетилхолинэстеразы.

1.5. Механизм действия.

1.6. Субстратная зависимость ацетилхолинэстеразы.

1.7. Влияние ингибиторов на ацетилхолинэстеразу.

1.8. Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования.

2.2. Постановка опытов.

2.2.1. Способ достижения глубокой гипотермии у крыс.

2.2.2. Способ вызывания зимней спячки у сусликов.

2.3. Препаративные методы исследования.

2.3.1. Выделение синаптических мембран.

2.4. Диализ рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека.

2.4.1. Определение активности АХЭ.

2.4.2. Определение кинетических характеристик АХЭ.

2.5. Статистическая обработка эксперементальных данных. синаптосом.

3.1.1. Исследование температурной зависимости кинетических кинетитических характеристик ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс.

3.1.2. Влияние глицерина на кинетику АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс.

3.2. Температурная зависимость кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ.

3.2.1. Температурная зависимость кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека.

3.2.2. Исследование температурной зависимости кинетических характеристик рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека в присутствии глицерина.

3.3. Температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга при гипотермических состояниях.

3.3.1 .Влияние гипотермии на температурную зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс.

3.3.2. Влияние зимней спячки на температурную зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы в норме и при низких температурах тела"

Актуальность проблемы. Ацетилхолинэстераза - это ключевой фермент холинэргической нейро-медиаторной передачи импульсов (Venturino et al., 2002). Холинэргические синапсы распределены по всему мозгу, в том числе и коре больших полушарий, и играют важную роль в регуляции активности мозга (Brzin et al., 1983).

Основная функция ацетилхолинэстеразы (АХЭ) заключается в гидролизе ацетилхолина, поступающего в синаптическую щель в ответ на приходящий в терминаль импульс, с образованием ацетата и холина (Taylor, Brown, 1999). Активность фермента непосредственно влияет на ход физиологического процесса, занимающего несколько миллисекунд (Куффлер, Николе, 1979). Интегри-рованность химической реакции в быстрый физиологический процесс определила кинетические особенности АХЭ: высокая специфичность, наличие двух мест связывания ацетилхолина и эффекта субстратного ингибирования (Mallen-der et al., 2000).

АХЭ - это эктофермент, который, в основном локализован на внешней стороне постсинаптической мембраны, рядом с холинорецептором, и прикреплен к мембране синапсов с помощью «якорной» субъединицы, в качестве которой выступает фосфатидилинозитол (Haas et al, 1996). Известно, что фос-фолипидный и жирнокислотный состав оказывают влияние на фазово-структурное состояние мембраны, от которого зависисят активность и кинетические характеристики АХЭ (Frenkel et al., 1980; Bloi et al, 1974). Одним из факторов, определяющих фазово-структурное состояние мембран является и температура (Крепе, 1981). Вместе с тем неизвестно, как физико-химическое состояние подложки влияет на кинетические свойства АХЭ. Сравнительное исследование мембранносвязанного и солюбилизилированного фермента, возможно, позволит выяснить роль мембраны в функционировании АХЭ.

Установлено, что изменение температуры тела приводит к изменению электрической активности мозга (Deboer, 1998), основой которой является хо-линэргическая передача импульсов. Снижение температуры тела при искусственной и естественной гипотермии (зимняя спячка) сопровождается снижением частоты электроэнцефалограмм (Wang, Lee, 1996; Deboer, Tobler, 1995). Такое падение импульсной активности мозга сопровождается соответствующими изменениями во всех звеньях синаптической передачи, в том числе и в ферментативном. В связи с этим исследование ключевого фермента нейромедиаторной системы мозга - ацетилхолинэстеразы представляет несомненный интерес.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы явилось сравнительное изучение температурной зависимости кинетических характеристик, а также термодинамических параметров АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга и солюбилизированной (рекомбинантной) АХЭ мембран эритроцитов человека в норме и гипотермических состояниях. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать температурную зависимость кинетических характеристик и термодинамические параметры АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс.

2. Исследовать температурную зависимость кинетических характеристик и термодинамические параметры рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека.

3. Изучить влияние разных концентраций глицерина на концентрационную и температурную зависимость активности мембранносвязанной и рекомбинантной АХЭ

4. Исследовать особенности температурной зависимости кинетических характеристик и термодинамические параметры АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга гомойо- и гетеротермных животных при искусственной гипотермии и зимней спячке.

Основные положения, выносимые на защиту. 1 .Температурные зависимости кинетических параметров (Km, Vm, Пн) мембранносвязанной (мембраны синаптосом) и солюбилизированной (мембраны эритроцитов) АХЭ существенно различаются. Степень субстратного ингибирования АХЭ из разных источников снижается при снижении температуры инкубации. Температурная зависимость активности АХЭ определяется концентрацией субстрата.

2. Глицерин оказывает существенное влияние на кинетические характеристики и термодинамические параметры АХЭ, однако его эффекты на мембран-носвязанную и солюбилизированную (рекомбинантную) формы фермента различаются.

Научная новизна. В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте исследованы температурные зависимости кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс и рекомбинантной АХЭ мембран эритроцитов человека. Установлено, что Km, Vm, Пн и степень субстратного ингибирования являются температурнозависимыми величинами.

Обнаружено, что характер температурной зависимости фермента и соответствующие ей термодинамические параметры зависят от концентрации субстрата.

Новыми являются данные по влиянию глицерина на температурную и концентрационную зависимость мембранносвязанной и рекомбинантной форм АХЭ. Для обеих форм фермента глицерин при высокий температуре (37 °С) смещает точку оптимума на концентрационной кривой в сторону высоких концентраций и снижает субстратное ингибирование; смещает позицию перегиба на кривой температурной зависимости в область низких температур и снижает эффективные энергии активации. Однако имеется и существенные различия в эффектах глицерина: если при низких концентрациях ацитилтиохолина активность рекомбинантиной АХЭ в среде с глицерином выше таковой контроля, то у мембранносвязанной, наоборот, существенно ниже его.

Получены новые результаты по температурной зависимости кинетических характеристик и по термодинамическим параметрам АХЭ мембран синаптосом крыс при глубокой гипотермии (20°) и сусликов при гибернации и спонтанном пробуждении. Показано, что глубокая гипотермия приводит к падению величин Vm, Пн и степени субстратного ингибирования фермента при всех температурах инкубации, термодинамические параметры при этом не претерпевают изменений. При гибернации же, наоборот, повышаются Vm, пн и степень субстратного ингибирования фермента почти при всех исследованных в работе температурах инкубации. Существенные изменения претерпевают термодинамические параметры АХЭ: температура излома смещается в сторону низких температур, повышаются эффективные энергии активации как выше, так и ниже точки излома.

Теоретическое и практическое значение результатов работы. Полученные в работе данные о температурной зависимости кинетических характеристик и об изменении термодинамических параметров мембранносвязанной и со-любилизированной АХЭ расширяют представления о молекулярных механизмах функционирования фермента.

Результаты исследования представляют интерес для понимания механизмов формирования патогенеза холодового повреждения, компенсаторно-приспособительных и адаптивных реакций при снижении температуры тела гомой-отермных и гетеротермных животных. Решение указанных теоретических проблем, может иметь большое практическое значение для различных медико-биологических приложений.

Полученные в диссертации результаты используются при чтении курсов «Биофизика», «Кинетика ферментативных реакций», «Молекулярная биофизика» в Дагестанском Государственном Университете.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ДГУ, Всероссийской научно-практической конференции (Махачкала, 2001), XVIII двухгодичном съезде Международного нейрохимического общества (Буйенес

Айрес, 2001), 6-й Пущинской школе-конференции (Пущино, 2002), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 5 работ, одна работа находится в печати.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Джафарова, Альбина Мехьядиновна

выводы

1. Концентрационная зависимость и соответствующие ей кинетические характеристики ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом коры головного мозга крыс и рекомбинантной ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека зависят от температуры. Для обеих форм фермента снижение температуры инкубации приводит к падению активности фермента во всем диапазоне исследованных концентраций субстрата, снижению Vm, коэффициента Хилла (пн) и степени субстратного ингибирования. Кт для рекомбинантной АХЭ со снижением температуры увеличивается, в то время как для мембранносвязанной, наоборот, имеет тенденцию к снижению.

2. Температурные зависимости Km, Vm, и пн претерпевают скачкообразные изменения в диапазоне температур 20-25°С (мебранносвя-занная) и 15-20°С (рекомбинантная АХЭ). Эти изменения на графиках Аррениуса для мебранносвязанной АХЭ проявляются в виде изломов, а для рекомбинантной - в виде разрывов.

3. Температурные зависимости активности мембранносвязанной и рекомбинантной АХЭ и соответствующие им термодинамические параметры зависят от концентрации субстрата. При низких концентра- ци-ях ацетилтиохолина на графиках Аррениуса обоих ферментов имеются изломы. Высокие концентрации ацетилтиохолина приводят к исчезновению перегиба у мембранносвязанного фермента, тогда как у рекомбинантной формы наблюдается лишь смещение позиции перегиба в область высоких температур.

4. Глицерин в конечной концентрации 1 и 2% оказывает существенное влияние на концентрационную зависимость активности АХЭ и соответствующие кинетические характеристики. Для обеих форм фермента при 37°С глицерин дозозависимо смещает точку оптимума на концентрационной кривой в сторону высоких концентраций ацетилтиохолина, снижает степень субстратного ингибирования и Vm фермента, однако Кт при этом не изменяется. Существенным различием в эффектах глицерина на активность АХЭ из разных источников является то, что у рекомбинантного фермента при низких концентрациях ацетилтиохо-лина активность фермента в присутствии глицерина выше таковой контроля, а у мембранносвязанной, наоборот, существенно ниже ее. При 10°С для обеих форм фермента наблюдается повышение активности фермента во всем диапазоне исследуемых концентраций.

5. Глицерин дозозависимо смещает позицию перегиба на графиках температурной зависимости активности АХЭ из разных источников в область низких температур и снижает эффективные энергии активации.

6. Глубокая гипотермия (20°С) снижает активность, Vm, пн и степень субстратного ингибирования АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс почти при всех температурах инкубации. При этом Кт не изменяется. Характер температурных зависимостей Km, Vm, пн остается таким же, как и контроле. Неизменными остаются и термодинамические характеристики фермента.

7. При зимней спячке повышаются активность, Vm и степень субстратного ингибирования АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга сусликов, а при спонтанном пробуждении эти кинетические параметры снижаются до уровня контроля. Зимняя спячка и спонтанное пробуждение приводят к смещению позиций перегиба на графиках температурной зависимости активности фермента, Vm, пн в область низких температур. При этом эффективные энергии активации АХЭ сусликов в состоянии торпидности и спонтанного пробуждения на обоих участках выше таковых летних сусликов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Ацетилхолинэстераза - это ключевой фермент холинэргической нейро-медиаторной системы. Холинэргические синапсы распределены по всему мозгу и играют важную роль в регуляции его активности. Особенностью ацетилхоли-нэстеразы является то, что является то, что она участвует в гидролизе ацетилхолина в синаптической щели после того, как тот связался с ацетилхолиновым рецептором (Хухо, 1990; Taylor, 1990; Soreq et al., 1995). Известны и не каталитические функции АХЭ в мозге, такие как участие в синаптогенезе (Feng et al., 1999) и формировании клеточных коммуникаций (Crisaru et al., 1999).

Ацетилхолинэстераза является эктоферментом, находящимся вне клетки и не зависящим от внутриклеточного метаболизма. Тем не менее, кинетические регуляторные характеристики фермента согласованы с кинетическими особенностями синаптической передачи (Smart, McCammon, 1998).

Особенностями ацетилхолинэстеразы являются:

1. Поверхностное расположение фермента на мембране (Feng et al., 1999; Bourne et al., 1999).

2. Высокая молекулярная активность и высокая специфичность (Nosea et al., 1995; Radic, Taylor, 2001; Shen et al., 2001).

3. Наличие эффекта субстратного ингибирования (Szegletes et al., 1999; Mallender et al., 2000).

4. Миллимолярные концентрации кальция снимают эффект субстратного ингибирования фермента (Глебов, Кржановский, 1983).

5. Наличие большого дипольного момента в молекуле, притягивающего положительно заряженные лиганды к активному центру (Botti et al., 1999).

6. Чувствительность к фосфорорганическим ингибиторам (Розенгард, Шестакова, 1999)

7. Расположение активного центра на некоторой глубине от поверхности белковой молекулы, на дне так называемого «ущелья» (Sussman et al., 1991).

8. Асимметричное распределение зарядов вдоль ущелья (Ripoll et al., 1993).9. Наличие периферического анионного места (Mallender et al., 2000).

Длительность постсинаптических потенциалов в холинэргических синапсах занимает несколько миллисекунд и за это время АХЭ должна снизить концентрацию нейромедиатора от миллимолярных концентраций в начале до микромолярных концентраций к концу импульса (Оке, 1969).

Наличие у фермента феномена субстратного ингибирования позволяет сохранять в синаптической щели высокие концентрации ацетилхолина для открытия ионных каналов на постсинаптической мембране (Глебов, Кржанов-ский, 1983). После того, как ацетилхолин вытеснит ионы кальция из мест связывания с постсинаптическими рецепторами, ионы кальция должны снять субстратное ингибирование, и тем самым, включить гидролиз ацетилхолина (Ма-газанник, 1992). Наличие субстратного ингибирования обеспечивает автокаталитический режим гидролиза ацетилхолина, что способствует резкому падению концентрации ацетилхолина, то есть такой режим обеспечивает дискретность синаптической передачи. Ингибирование АХЭ в математических моделях синаптической передачи затягивает время спада постсинаптических потенциалов (Tai et al., 2003).

При изменении температуры тела изменяются скорости отдельных звеньев синаптической передачи: скорость диффузии, скорости открывания и закрывания каналов, секреции нейромедиаторов, активного и пассивного транспорта. Поскольку все эти процессы имеют неодинаковую температурную зависимость, должно произойти согласование отдельных звеньев синаптической передачи.

Была исследована температурная и концентрационная зависимости скорости гидролиза ацетилтиохолина АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс в норме. Показано, что при всех исследованных температурах имеет место субстратное ингибирование, которое ослабевает при снижении температуры инкубации. Это проявляется в уменьшении крутизны правого ингибитор-ного склона по мере снижения температуры инкубации. Согласно современным представлениям, развитым в работах лаборатории Палмера Тейлора и Терронэ Розенберри (Taylor,Brown, 1999), каталитический акт начинается со связывания субстрата в периферическом анионном участке. Затем идёт двумерная диффузия субстрата в каталитическую полость, при этом субстрат проходит через «узкое горло», ведущее к активному центру фермента, после чего в активном центре субстрат связывается, эфирная связь между ацетатной и холиновой частью разрывается, и образуются продукты гидролиза.

Считается, что скорость ферментативной реакции лимитируется скоростью десорбции холина из активного центра. Связывание ацетилхолина в периферическом месте уменьшает константу скорости десорбции холина из активного центра, что приводит при высоких концентрациях субстрата к снижению скорости реакции, то есть к явлению, называемому субстратным ингибирова-нием (Szegletes et al., 1999).

Таким образом, субстратное ингибирование пропорционально концентрации комплекса SEP, где S - молекула субстрата, Е - молекула фермента, Р -молекула холина (Venturino et al., 2003). Возможное объяснение уменьшения субстратного ингибирования при снижении температуры - это уменьшение [SEP] при низких температурах вследствие уменьшения скорости образования ЕР. Из этой модели следует, что уменьшение Vm должно сопровождаться уменьшением субстратного ингибирования, а возрастание Vm - возрастанием субстратного ингибирования (Mallender et al., 2000). Из полученных данных видно, что со снижением температуры инкубации уменьшается Vm, что согласуется с основной моделью.

Была исследована температурная зависимость кинетических характеристик АХЭ мембран синаптосом коры головного мозга крыс. Кт находили из данных, соответствующих левому активаторному склону. Однако в этих условиях кинетика отклоняется от модели Михаэлиса-Ментэн, так как имеет место активация. Поэтому вычисленные параметры являются эффективными (формальными) величинами, отражающими изменение кинетики ферментативной реакции. Обращает на себя внимание то, что при снижении температуры инкубации Кт уменьшается, при этом температурная зависимость в районе 20°С обнаруживает излом. Vm в исследованном температурном диапазоне может быть аппроксимирована прямой с эффективной энергией активации, соответствующей 29 кДж/моль.

Коэффициент Хилла уменьшается по мере снижения температуры. При 23°С имеет место излом. Резкие изменения кинетических характеристик при некоторой температуре свидетельствуют о каком-то структурном кооперативном переходе. Однако на данном этапе исследования показать место локализации этого структурного перехода не представляется возможным.

В целом, температурная зависимость всех трёх кинетических параметров указывает на вклад различных движений в температурную зависимость каталитического процесса в целом.

Была исследована температурная зависимость скорости ферментативной реакции при различных концентрациях субстрата (0,2; 0,5 и 2,0 мМ). Эти концентрации соответствуют активаторному склону, оптимуму и ингибиторному склону концентрационной кривой. Видно, что при концентрации 0,2 мМ чётко выявляются два линейных участка на кривой температурной зависимости в Ар-рениусовских координатах, с изломом при 22,4°С. При концентрации субстрата 0,5 мМ излом хоть и сохраняется, но угол между линейными участками уменьшается, то есть меньше изменяется эффективная энергия активации. Наконец, при 2,0 мМ температурная зависимость может быть аппроксимирована одной эффективной энергией активации. Таким образом, характер температурной зависимости существенно изменяется при изменении концентрации субстрата, а именно, при низких концентрациях, соответствующих левому активаторному склону, имеется излом, причём Еа при низких температурах больше, чем при высоких. При высоких концентрациях субстрата, соответствующих ингибиторному склону, излом исчезает.

Отклонения от линейности в Аррениусовских координатах может иметь самые различные причины. Это могут быть квазифазовые переходы в самих молекулах биополимеров, в структурах мембран, к которым прикрепляется фермент. Кроме того, линейная зависимость должна иметь место только в том случае, если во всём температурном диапазоне имеется одна лимитирующая весь процесс стадия, энергия активации которой от температуры не зависит

Cavonau, 1950). Такая ситуация реализуется редко, поэтому в каждом конкретном случае необходимо выяснять причины отклонения от линейности.

В нашем случае полученную температурную зависимость можно объяснить по следующей схеме. При низких концентрациях субстрата температурная зависимость всего процесса катализа зависит как от температурной зависимости Vm, так и от температурной зависимости Кт. Из наших данных следует, что и Кт, и Vm при снижении температуры снижаются. При низких концентрациях субстрата уменьшение Vm и Кт при уменьшении температуры частично компенсирует друг друга (Хочачко, Сомеро, 1988). Ниже 20°С Кт перестаёт зависеть от температуры, поэтому при температуре инкубации меньше 20°С температурная зависимость скорости реакции определяется температурной зависимостью Vm. Выше 20°С имеет место компенсационный эффект и Еа меньше, чем при температурах ниже 20°С, где компенсационный эффект отсутствует.

При высокой концентрации ацетилтиохолина температурная зависимость Кт никак не сказывается на скорости реакции, поскольку фермент работает в условиях насыщения субстратом. В связи с этим температурная зависимость Кт не влияет на скорость реакции. Следовательно, во всём температурном диапазоне скорость реакции определяется температурной зависимостью Vm. Полагая, что Vm определяется прочностью комплекса ЕР, можно думать, что температурная зависимость Vm отражает температурную зависимость прочности этого комплекса. Чем выше температура, тем менее прочен этот комплекс, тем быстрее идёт реакция. Холин десорбируется из активного центра, расположенного на дне ущелья и поэтому вполне возможно, что изменение на периферии мало будет влиять на геометрию активного центра. Отсюда следует, что существование изломов на кривой температурной зависимости в Аррениусовских координатах для десорбции холина из активного центра не должно быть, что и наблюдается.

Из полученных данных следует, что температурная зависимость скорости гидролиза определяется концентрацией субстрата.

К проблеме механизма функционирования АХЭ можно подойти с точки зрения нескольких позиций. In vivo фермент всегда работает в уникальном ком-партменте, где все особенности компартмента оказывают влияние на катализ: скорость диффузии, вязкость растворителя, геометрия компартмента, рН, ионы и т.д. (Диксон, Уебб, 1982). Для описания кинетики ферментативных реакций в уникальных компартментах реальной клетки более адекватным является описание кинетики ферментативных реакций, развитое в работе Джентри (Gentry et al., 1995). Этот подход можно кратко назвать ферментативной микрокинетикой. Весь каталитический процесс разбивается на последующие стадии, каждая из которых занимает определённый промежуток времени. Весь процесс в целом занимает время, равное времени отдельных стадий. Разные стадии каталитического процесса могут иметь различные температурные зависимости, соответственно, и вклад каждой стадии в общее время каталитического процесса будет зависеть от температуры.

Изменяя физико-химические условия в компартментах, можно влиять на разные стадии, тем самым, изменять их начальный вклад в изменение каталитического процесса.

В случае АХЭ, в первом приближении, весь каталитический акт можно разбить на две стадии: 1. диффузия субстрата из объёма к активному центру; 2. каталитическое превращение субстрата в активном центре с образованием продукта и регенерацией активного центра.

Скорость диффузии определяется коэффициентом диффузии, который в свою очередь изменяется линейно, согласно уравнению Эйнштейна. В диапазоне температур 290-300°К QI0 для диффузии составит отношение этих двух температур — 1,03, что соответствует весьма слабой температурной зависимости процесса диффузии. Для химической реакции Q|0 в этом же температурном диапазоне составляет 2-4 (Хочачка, Сомеро, 1988).

В условиях низкой концентрации субстрата среднее расстояние между молекулами увеличивается и соответственно увеличивается расстояние, на которое надо продиффундировать, чтобы достичь активного центра. Поэтому, можно предположить, что при низких концентрациях субстрата диффузия будет вносить значительный вклад в общее время каталитического акта. Следовательно, при низких концентрациях субстрата температурная зависимость активности фермента может быть меньше, чем при высоких концентрациях. По мере снижения температуры, при прочих равных условиях (низкая концентрация субстрата), время, приходящееся на постоянное превращение субстрата в молекуле фермента, растёт, и, поскольку температурная зависимость химического процесса значительно сильнее температурной зависимости диффузии, при некоторой критической температуре, именно события, происходящие в полости АХЭ, будут определять температурную зависимость каталитического процесса в целом.

С целью проверки реалистичности такого подхода было исследовано влияние глицерина на концентрационную и температурную зависимость скорости гидролиза ацетилтиохолина АХЭ. Оказалось, что при температуре инкубации 37°С добавление глицерина к среде инкубации смещает оптимум на концентрационной кривой в область более высоких концентраций субстрата. Формально это соответствует предположению: действительно при низких концентрациях субстрата глицерин снижает скорость ферментативной реакции, а при высоких концентрациях, наоборот, повышает.

Полученные результаты соответствуют теоретическим предположениям, однако, смещение точки оптимума, скорее всего, указывает на конкурентное снижение константы связывания субстрата в периферическом месте, за счёт чего К, увеличивается, а поскольку S0pt— VKm • Ki, добавление глицерина увеличивает Kj и соответственно способствует смещению Sopt в сторону высоких концентраций субстрата. Однако, кроме этого смещения имеется и другой эффект: снижение скорости гидролиза субстрата в оптимуме.

Предположим, что глицерин может проникнуть в каталитическую полость, где он, вероятнее всего, может оказать два эффекта:

1. увеличивая вязкость, привести к снижению Vm;

2. уменьшить, конкурентно ингибировать связывание субстрата в активном месте, т.е. увеличить Кт.

При 2% концентрации глицерина и снижение Vm, и увеличение Кт проявляются более отчётливо, чем при 1%. Таким образом, судя по всему, глицерин влияет на кинетические процессы, как в периферии, так и в активном центре.

Добавление глицерина привело к существенным изменениям температурной зависимости скорости гидролиза АТХ. При концентрациях АТХ 0,2 мМ добавление глицерина привело к смещению точки излома в область более высоких температур. При этом наклоны низкотемпературных и высокотемпературных участков на графиках Аррениуса в присутствии глицерина уменьшается.

Смещение точки излома в присутствии глицерина мы объяснили увеличением времени диффузии вследствие увеличения вязкости, поэтому каталитический механизм становится лимитирующей стадией при более низких температурах. Уменьшение эффективной энергии активации при низких температурах можно объяснить тем, что энергетический барьер на пути реакции связан с движениями сегментов третичной структуры, в результате которых образуется просвет для выхода субстрата из каталитической полости. Вполне вероятно, что глицерин, встраиваясь в третичную структуру фермента по гидрофильным местам связывания, действует как смазка, облегчая конформационную подвижность.

Из этих данных следует, что, возможно, важное значение для функционирования фермента имеет вязкость среды синаптической щели. Можно полагать, что в примембранном слое гликолипиды могут увеличить вязкость среды, и, тем самым, замедлить диффузию. Из наших данных следует, что при обсуждении механизмов функционирования АХЭ ш vivo следует учитывать тот факт, что изменение вязкости среды может влиять на активность фермента.

Для того чтобы исключить влияние мембранного окружения, в следующей серии экспериментов нами были исследованы кинетические характеристики солюбилизированной (рекомбинантной) АХЭ из эритроцитов человека. Как и для мембранносвязанного фермента для рекомбинантной АХЭ имеет место, выраженное субстратное ингибирование при высоких концентрациях субстрания от температуры: чем выше температура, тем сильнее подавляется ферментативная активность при высоких концентрациях субстрата. Этот эффект для рекомбинантной АХЭ выражен даже сильнее, чем для мембранносвязанной.

Температурная зависимость Vm, Km и пн существенно отличается от таковых для ферментов синаптических мембран. Во-первых, снижение температуры приводит к увеличению Кт, то есть к эффекту прямо противоположному ферменту мембран синаптосом. Во-вторых, обращает на себя внимание резкий переход на кривой температурной зависимости при ~18°С для всех трёх параметров. Столь резкий излом нельзя в данном случае объяснить фазовыми переходами в мембране, так как фермент находится в солюбилизированной форме, следовательно, надо полагать, что это резкое изменение кинетических характеристик обусловлено структурным переходом в самой молекуле фермента. Согласно рентгеноструктурным данным, полученным группой Суссмана (Sussman et al., 1991) каталитическая субъединица фермента представляет собой структуру, состоящую из 12 (3-складок, окружённых 14 а-спиралями. Поскольку температура этого структурного перехода достаточно низкая, то вряд ли он заключается в плавлении а-спиральных участков. Вероятнее всего структурный переход состоит в изменении внешнего расположения аминокислотных остатков фермента, при котором изменяется количество Ван-дер-Ваальсовых контактов, которые необходимо разорвать на пути каталитического акта.

Если скорость реакции лимитирована скоростью выхода холина из каталитической полости через так называемые «backboor» (Bartolucci et al., 1999), то вполне возможно, что именно расположение крупных кинетических сегментов третичной структуры может повлиять на подвижность «backboor».

Таким образом, температурные зависимости кинетических характеристик рекомбинантной АХЭ заметно отличаются от АХЭ, локализованной на синаптической мембране. Эти отличия - отсутствие разрывов - можно объяснить взаимодействием синаптосомального фермента с мембраной.

Для рекомбинантой АХЭ с понижением температуры Кт увеличивается, Vm уменьшается, Пн тоже уменьшается. Таким образом, лишь поведение Кт рекомбинантной АХЭ существенно отличается от такового для мембраносвязан-ной.

Температурная зависимость рекомбинантной АХЭ имеет два линейных участка с эффективной энергией активации при высоких температурах 6-7 Дж/моль, а при низких - 32-40 кДж/моль. Увеличение эффективной энергии активации при низких температурах свидетельствует в пользу увеличения стабилизации структуры, в формировании которой участвует большое количество слабых связей. Положение точки излома между двумя линейными участками соответствует резкому изменению кинетических характеристик в этом же диапазоне температур, описанном выше.

Таким образом, эти данные согласуются с предположением о структурном переходе в молекуле фермента при этой же температуре.

Была исследованна температурная зависимость рекомбинантной АХЭ при концентрациях субстрата 0,2 и 16 мМ, при низкой ионной силе (36 мМ). В данном случае температурные зависимости АХЭ при разных концентрациях субстрата неодинаковы. При низкой концентрации субстрата в Аррениусовских координатах на графиках имеется два линейных участка с эффективными энергиями активации 9,7 и 35,7 кДж/моль и точкой излома - 16°С. При концентрации субстрата 16 мМ также имеется два линейных участка с точкой излома 20°С и энергиями активации 14 и 58 кДж/моль.

При низкой ионной силе точка оптимума на концентрационной кривой лежит в районе 1мМ и скорость реакции при этих двух концентрациях примерно одинакова. При высокой ионной силе Sopt соответствует 4 мМ. При этом скорость реакции при 0,2 мМ концентрации АТХ меньше, чем при 16 мМ. Различное положение оптимума при высокой и низкой ионной силе объясняется тем, что сродство субстрата к периферическому анионному участку при низкой ионной силе выше, чем при высокой ионной силе. Высокая ионная сила экранирует отрицательный заряд периферического места от положительно заряжённого субстрата. Надо полагать, что изменение ионной силы раствора влияет также на другие внутримолекулярные взаимодействия, чем и объясняется некоторое отличие в эффективных энергиях активации линейных участков при высокой и низкой ионной силе.

Было исследовано влияние глицерина на кинетику рекомбинантной АХЭ. Оказалось, что добавление глицерина до концентрации 1 и 2% повышает скорость реакции при низких концентрациях субстрата, уменьшает скорость каталитической реакции при Sopt, смещает Sopt в сторону более высокой концентрации субстрата, а также уменьшает степень субстратного ингибирования при 37°С. При низкой температуре инкубации глицерин увеличивает скорость ферментативной реакции во всём диапазоне концентраций АТХ.

Глицерин, являясь трёхатомным спиртом, может взаимодействовать с гидрофобными участками третичной структуры фермента, замещая в них молекулы воды. Согласно рентгеноструктурным данным (Koellner et al., 2000) в структуре молекулы АХЭ имеется 45 мест связывания молекул АТХ, которые заполняются в зависимости от условий. 22 молекулы воды, погружённые в структуру молекулы АХЭ, образуют кластеры. Всего таких кластеров 7: два из них содержат по 2 молекулы, три - по одному, один - по четыре и один - по пять. Вполне возможно, что глицерин, замещая молекулы воды в структуре молекулы АХЭ, изменяет тем самым конформационную подвижность молекулы.

Влияние глицерина на кинетику АХЭ можно объяснить следующим образом. Поскольку точка оптимума смещается в область высоких концентраций, но при этом Кт, согласно полученным данным, не изменяется, можно предположить, что глицерин уменьшает сродство АТХ к периферическому месту связывания. Поскольку, однако, он при низких концентрациях увеличивает скорость реакции, можно предположить, что, встраиваясь в структуру молекулы АХЭ и тем самым, влияя на её конформационную подвижность, глицерин увеличивает Vm, в результате чего скорость реакции возрастает. Но для количественного описания эффектов глицерина необходим компьютерный анализ соответствующих моделей.

Экспериментальные данные, полученные нами, указывают на весьма сложный механизм функционирования АХЭ, который не укладывается в простейшие схемы ферментативного катализа. В то же время, поскольку эффекты, вызываемые глицерином, для синаптосомальной АХЭ и рекомбинантной АХЭ различны, следует предположить, что эти различия обусловлены мембраной.

Холинэргические синапсы распределены по всему головному мозгу, в том числе, в коре больших полушарий, и играет важную роль в регуляции уровня активности мозга. Существенное снижение температуры при искусственной и естественной гипотермии, видимо, должно сопровождаться соответствующими адаптивными изменениями во всех звеньях синаптической передачи, в том числе и ферментативной. При этом существенно изменяется скорость метаболических процессов в тканях и химический состав мембранных структур (Коломийцева и др., 1997).

Концентрационные кривые скорости ферментативной реакции для АХЭ мембран синаптосом при гипотермии 20°С показывают, что, в целом, удельная активность фермента при гипотермии снизилась. Например, при температуре 37°С уменьшение при оптимальной концентрации субстрата составило 27%. При этом степень субстратного ингибирования также уменьшается, составляя при гипотермии ~1,7. При более низкой температуре инкубации изменения имеют ту же направленность, но величина их меньше. Гипотермия не повлияла на температурную зависимость активности фермента, измеренную при концентрации субстрата ~ 0,2 мМ: ни точка излома, ни энергия активации существенно не изменились. Температурная зависимость кинетических констант в общих чертах такая же, как и в контроле.

В целом, эти данные указывают на то, что кинетические свойства самих молекул фермента не претерпевают существенных изменений, а число активных молекул фермента при гипотермии уменьшается.

В контроле коэффициент Хилла увеличивается с повышением температуры. Увеличение коэффициента Хилла при повышении температуры свидетельствует об увеличении конформационной чувствительности структуры АХЭ с ростом температуры. При низкой температуре инкубации связывание субстрата в аллостерическом центре не приводит к изменению каталитической активности. При более высокой температуре связывание в аллостерическом центре вызывает конформационную волну, которая изменяет конфигурацию активного центра и тем самым активность фермента. В контроле увеличение коэффициента Хилла наблюдается уже при 20°С. При гипотермии же это увеличение начинается с 30°С. Причины такого изменения вряд ли связаны с химической модификацией, так как при этом кинетические характеристики молекулы фермента существенно не изменяются. Поэтому, можно предположить, что эти изменения обусловлены взаимодействием с липидами мембраны. Учитывая то, что температурная зависимость активности фермента значительно не изменяется, следует предположить, что характер этих изменений носит локальный характер. В связи с этим следует отметить работу Н. К. Кличханова и др. (2000), в которой исследовалась температурная зависимость активности АХЭ синапто-сомальной мембраны мозга, и были обнаружены аналогичные результаты: уменьшение Vmax, уменьшение Q, неизменность эффективных энергий активации и точки излома. Новым в нашей работе является то, что мы исследовали температурную зависимость Km, Vm и пн, которая выявила наличие более тонких изменений при гипотермии.

Были исследованны концентрационные зависимости скорости гидролиза АТХ в синаптосомальной мембране мозга сусликов при трёх функциональных состояниях:

1. летний бодрствующий контроль;

2. состояние зимней спячки (1 месяц), температура тела - 5°С;

3. спонтанное пробуждение между баутами спячки.

Видны закономерные изменения в целом активности фермента и его кинетических характеристик.

Состояние зимней спячки характеризуется существенным увеличением активности фермента: при оптимальной концентрации в состоянии гибернации активность АХЭ на 33% выше. При этом возрастает также и степень субстратного ингибирования: Q при зимней спячке равно 4,0, а в контроле - 1,56.

В отличие от зимней спячки, как было отмечено выше, при гипотермии у крыс активность фермента и степень субстратного ингибирования снизились. Таким образом, снижение температуры тела у зимоспящего животного в состоянии естественной гипотермии привело к противоположным изменениям, по сравнению с искусственной гипотермией нези-моспящего животного. При пробуждении между баутами глубокой спячки происходит снижение активности фермента: в оптимуме это снижение по сравнению с глубокой спячкой составило 38%. При этом Q тоже снизилось до 2,62. Обращает на себя внимание тот факт, что скорость в оптимуме в бауте пробуждения меньше по сравнению с контролем, однако при этом Q заметно выше. Это говорит о том, что, несмотря на корреляцию между скоростью реакции в оптимуме и Q, эти два параметра могут регулироваться раздельно.

Согласно теории Розенберри с сотрудниками (Szegletes et al., 1999) увеличение скорости превращения субстрата в продукт в активном центре должно вести к увеличению субстратного ингибирования, что и наблюдается в эксперименте. Однако на степень субстратного ингибирования могут оказывать влияние и другие параметры, например, увеличение сродства субстрата к инги-биторному центру связывания, которое должно увеличивать Q.

Изменение активности АХЭ в динамике зимней спячки являются адаптивными, поскольку сама спячка есть результат адаптации к периодическим и существенным изменениям температуры тела. Поэтому увеличение активности фермента при низких температурах тела, видимо, необходимо для нормального функционирования мозга животного при низких температурах.

Поскольку искусственная гипотермия у крыс привела к противоположному изменению, более правдоподобно, что эти изменения есть результат патологических процессов, так как активность снижается и субстратное ингибиро-вание уменьшается. Изменение степени субстратного ингибирования может служить характеристикой конформационной чувствительности фермента, его способности реагировать на химические сигналы. В условиях повышения жёсткости структуры, влияние её на положительно заряжённые лиганды тоже изменяется.

Важную роль в механизмах регуляции биохимических процессов при зимней спячке играет обратимое фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов (Storey et al., 2001). Известно, что фосфорилирование АХЭ приводит к увеличению активности АХЭ в 10 раз (Grifman et al., 1997), не влияя на сродство к субстрату, что и наблюдается в динамике зимней спячки. Поэтому можно предположить, что в динамике зимней спячки именно процессы фосфорилирования и дефосфорилирования регулируют активности АХЭ. Поскольку АХЭ является эктоферментом, то эта гипотеза предполагает наличие в экстраклеточном пространстве протеинкиназ и протеинфосфатаз.

Тот факт, что в динамике зимней спячки профиль концентрационных кривых существенно изменяется, возможно, свидетельствует об изменении изоферментного состава в динамике зимней спячки. Например, в состоянии ги-побиоза вершина концентрационной кривой более плоская, а при спонтанном пробуждении она уже обостряется. В связи с этим исследование изоферментного спектра АХЭ в динамике гипотермических состояний представляет значительный интерес.

Поскольку в состоянии глубокой спячки электрическая активность мозга близка к нулю (Wang, Lee, 1996), а, соответственно и интенсивной холинэрги-ческой передачи нет, увеличение активности АХЭ представляется загадочным. Можно предположить, что в динамике зимней спячки возрастает некаталитическая роль АХЭ.

Известно, что АХЭ играет важную роль в процессе синаптогенеза (Feng et al., 1999), с другой стороны, известно, что в период пробуждения и впадения в спячку происходит инвагинация и образование вновь синаптических контактов в мозге (Popov et al., 1992). Решение этого вопроса требует гистологических и биохимических исследований этого вопроса.

Повышение активности холинэстеразы различных отделов головного мозга при зимней спячке было обнаружено у сибирских краснощеких сусликов (Высоченко, 1980). Автор допускает возможность появления в течение зимней спячки новых форм АХЭ с иными свойствами; постоянно высокая её активность, возможно, нужна как охрана от пробуждающего действия ацетилхолина.

В ранней работе Штарка (1970) высказывается гипотеза о роли адренэр-гических и холинэргических систем в мозге суслика в цикле спячка-пробуждение. Предполагалось, что активность адренэргической системы направлена на выход из спячки, а активность холинэргической системы способствует вхождению в спячку, то есть способствует торможению общей активности мозга. Поэтому в состоянии зимней спячки содержание моноаминооксидазы низкая, а АХЭ высокая. В процессе пробуждения активность адренэргической системы растёт, а активность холинэргической уменьшается, соответственно, уменьшается содержание АХЭ.

Холинэргические синапсы могут проявлять как возбуждающую, так и тормозную активность, и соотношение тормозных и возбуждающих холинэргических синапсов не известно. Изменение содержания АХЭ при переходе от спячки к пробуждению в работе Штарка составило 7%, в наших экспериментах изменение активности составило 37%. Штарк определял общее содержание АХЭ синаптических мембран, поэтому, несмотря на то, что общая направленность изменений, полученных Штарком и нами, совпадают, требуются дополнительные исследования, изучающие роль холинэргических систем в динамике зимней спячки.

Аррениусовские графики скорости реакции, катализируемой АХЭ при концентрации АТХ ниже оптимальной, показали, что гибернация приводит как к увеличению энергии активации гидролиза субстрата, так и к смещению точки излома на температурных кривых в область низких температур. В связи с этим следует отметить работу Цакириса (Tsakiris, 1985), в которой добавление липо-сом из фосфатидилхолина и фосфатидилсерина к синаптическим мембранам смещало точку излома на графике температурной зависимости АХЭ от 23°С до 16°С. При этом изменялась также и энергия активации: она возрастала как выше точки излома, так и ниже, но в последнем случае это увеличение было больше. Цакирис также обнаружил, что добавление фосфатидилсерина увеличивает разность энтропий активации ниже и выше точки излома от 0,037 в контроле до 0,079 кДж/мольград. после обработки липосомами. Отсюда он заключает, что фосфатидилсерин увеличивает активность фермента за счёт увеличения энтропии активации.

О том, что АХЭ действительно чувствительна к химическому составу и физическому состоянию липидов мембраны, свидетельствуют многочисленные исследования влияния липидов in vivo и in vitro на активность АХЭ. Все эти эксперименты указывают на то, что липиды, имеющие низкие температуры плавления способствуют смещению точки излома на графиках температурной зависимости АХЭ в сторону низких температур (Bloi et al., 1979; Heger, 1979; Frenkey et al., 1980; Foot et al., 1983).

Возможно, что при зимней спячке происходит изменение липидного состава мембран в месте локализации АХЭ, что изменяет соответственным образом конформацию молекулы фермента. Действительно, было показано, что в синаптических мембранах сусликов существенно (в 6 раз) снижается количество самого насыщенного липида мембраны - сфингомиелина (Коломийцева и др., 1997). Автор обнаружил также уменьшение при зимней спячке фосфатиди-лэтаноламина, фосфатидилинозитола и лизофосфатидилхолина. Аналогичные изменения происходят и в липидах, экстрагированных из почек суслика при зимней спячке (Aloia et al., 1986). Голдман и Уиллис (Goldman, Willis, 1975) обнаружили увеличение дол ненасыщенных жирнокислотных остатков в микро-сомальной фракции мозга сирийских хомячков при спячке. Одновременно наблюдалось снижение холестерина в этой фракции. Все эти изменения носили локальный характер.

Таким образом, локальные перестройки липидов мембран можно интерпретировать как адаптации к низким температурам, поскольку они должны увеличивать жидкостность мембранных липидов при низких температурах, что, возможно, ведёт к смещению точки перегиба на графиках Аррениуса в область низких температур и увеличению эффективных энергий активации для мем-бранносвязанных ферментов.

Остается открытым вопрос о том, каким же образом реализуется влияние липидной подложки на АХЭ, так как связь между мембраной и ферментов осуществляется посредством только лишь «якорной субъединицы» - фосфатиди-линозитола.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Джафарова, Альбина Мехьядиновна, Махачкала

1. Брагинская Ф.И., Султанова Г.Г., Зорина О.М. Влияние некоторых хлорсо-держащих пестицидов на гемолитическую чувствительность и АХЭ активность эритроцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1996. - №. - С. 36-38.

2. Высочина Т.К. Влияние ионов кальция на активность холинэстераз головного мозга сусликов // Физиол. журн. Киев, 1980. - Т. 26, № 3. - С. 353369.

3. Глебов Р.Н., Кржановский Г.Н. Функциональная биохимия синапсов. М.: Медицина, 1978. 328 с.

4. Григорьева О. Н. Развитие холинэргических и серотонинэргических систем головного мозга в раннем онтогенезе птиц и млекопитающих // Журн. эво-люц. биохим. и физиол. 1981. - Т. XVII, N. 1. - С. 87-92.

5. Гущин Н.В., Хайдарова Д.С., Кугушова Л.И., Розенгарт В.И., Корнева Е.А. Активность ацетилхолинэстеразы лимфоцитов крыс при интоксикации пестицидами // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1991. - Т. XI, № 2. - С. 144-146.

6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 3-х т. М.: Мир. - 1982. - Т. 1. - С. 356.

7. Дядюша П.П. Ацетилхолинэстераза возбудимых мембран // Мол. биол. -1976.-Вып. 15.-С. 67-76.

8. Дядюша П.П. Ацетилхолинэстераза сарколеммы скелетных мышц. Фракционирование солевым раствором. Влияние катионов // Биохимия. 1973. -Т. 38, № 3. - С. 627-634.

9. Кабачник М.И., Годовиков Н.Н., Вихрова Л.А. О механизме «ацетиленового эффекта» при взаимодействии ФОС с холинэстеразой // Изв. РАН. Сер. биол. 1999.-№ 5. - С. 517-526.

10. Кличханов Н.К., Халилов Р.А., Мейланов И.С. Температурная зависимость активности АХЭ синаптических мембран из мозга крыс при гипотермии // Бюлл. эсперим. биол. и мед. 2000. - Т. 129, № 3. - С. 326-328.

11. Кокунин В.А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Укр. биохимии, журн. 1975. - Т. 47, № 6. - С. 776-791.

12. Коломийцева И.К., Потехина Н.И., Жарикова А.Д., Попов В.И., Кузин A.M. Сезонные изменения фосфолипидов в мембранах синаптосом головного мозга суслика Citellus undulates // Докл. АН. 1997. - Т. 352, № 3. - С. 413-415.

13. Конев С. В., Аксенцев С. Д., Окунь И. М., Миллютин А. А. Структурная реорганизация синаптических мембран мозга и старение // Физиологический журнал. 1990. - Т. 36, N. 5. - С. 36-42.

14. Крепе Е. М. Липиды клеточных мембран. JL: Наука, 1981. - 339 с.

15. Кривой И.И. О функциональной значимости синаптической АХЭ и способах оценки её активности // Вестник ЛГУ. 1986. - Вып. 3. - С. 64-72.

16. Куффлер С., Николе Дж. От нейрона к мозгу. М.: Мир. - 1979. - 439 с.

17. Магазанник Л. Г. Исследование постсинаптических механизмов, активируемых глутаматом и ацетилхолином / Клеточная сигнализация. М:. Наука, 1992.-С. 19-27.

18. Маслова М.Н., Озирская Е.В. Об использовании срезов мозга для определения внешней (функциональной) ацетилхолинэстеразы в филогенетических и онтогенетических исследованиях // Журн. эвол. биох. и физиол. -1978. Т. 14, № 5. - С. 505-507.

19. Маслова М.Н., Озирская Е.В., Резник Л.В. Некоторые биохимические свойства холинэстеразы в различных отделах головного мозга в ряду позвоночных. / Физиология и биохимия медиаторных процессов. М., 1976.-С. 88-89.

20. Моралев С.Н., Нестеров В.П., Розенгарт В.И. Модуляция активности холи-нэстераз: теоретические и практические аспекты проблемы // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9,№ 10-11.-С. 1030-1031.

21. Нетребко А.В., Кросс С.В., Романовский Ю.М. Модель АХЭ: диффузионные ограничения / 2-й съезд биофизиков России. Москва, 23-27 авг. 1999 // Тезисы докладов. Т. 2. - М. - 1999. - С. 432-433.

22. Оке. Основы нейрофизиологии. М.: Мир. 1969. - С. 448.

23. Пивоварова С.И., Лукичёва Т.Н. Результаты исследований по оптимизации фотометрического микрометода определения активности холинэстераз в сыворотке крови // Лаб. дело. 1985. - № 1. - С. 27-29.

24. Пятакова Н.В., Григорьева Н.Б., Северина И.С. Роль растворённой гуани-латциклазы в реактивировании холинэстеразы, ингибированной ФОС // Биохимия. 1999. - Т. 64, № 1. - С. 111-116.

25. Резник Л.В. Влияние ионофора А23/87 и валиномицина на активность АХЭ эритроцитов кролика // Вопр. мед. химии. 1983. - № 3. - С. 77-79.

26. Розенгарт В.Ш., Балашова Е.К., Шерстобитов О.Е. Аллостерические свойства АХЭ / Акад. наук СССР. Нейрохим. конфер. (тезисы научных сообщений).-Л., 1976.-С. 15.

27. Розенгарт Е.В., Шестанова Н.Н. Доступность атома фосфора и механизм антиферментного действия ФОС-ингибиторов холинэстеразного происхождения. Данные конформационного и корреляционного анализа // Журн. эвол. биох. и физиол. 1999. - Т. 3, № 1. - С. 36-39.

28. Снетков В.А., Нигматулин Н.Р., Никольский Е.Е., Магазанник Л.Г. Моделирование действия блокаторов ионных каналов на постсинаптические токи // Нейрофизиология. 1989. - Т. 21, № 4. - С. 476-484.

29. Таганович А.Д., Олецкий Э.И., Кухта В.К. Активность мембранносвязан-ных ферментов, показатели метаболизма в цитоплазме и некоторые физико-химические свойства эритроцитов с повышенным содержанием холестерина // Вопр. мед. химии. 1985. - № 5. - С. 75-79.

30. Хочачко П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация М.: Мир, 1988 - 568 с.

31. Хухо Ф. Нейрохимия. Основы и принципы. М.: Мир, 1990. 384 с.

32. Чернышевская И.А. Гистохимия холинэстераз коры головного мозга. М.: Наука. - 1983,- 104 с.

33. Чипашвилли М.Д., Белецкая Р.П., Алексидзе Г. Кинетические свойства ацетилхолинэстеразы сократительных белков головного мозга // Биохимия. 1984.-№3.-С. 609-611.

34. Штарк М.Б. Мозг зимнеспящих. Новосибирск: Наука, 1970. С. 239.

35. Шушнова Н.Д., Климова Н.В., Самойлов Д.Н. Ингибирование АХЭ бичет-вертичными аммонийными солями, содержащими гидрофобные радикалы // Хим.-фарм. журн. 1998. - Т. 22, № 9. - С. 1070-1073.

36. Ярв Я. Л., Аавикаар А.А., Годовиков Н. Н., Лангель Ю. Л., Паст У. Э. Аце-тилхолинэстереза яда кобры, определение концентрации активных центров // Биохимия. 1976.- Т.41, № 5. - б. С. 827-834.

37. Al Jafari А.А., Kamal М.А., Achomida A.S. Sensivity of bowine retinal acetylcholinesterase (E. S. 3.1.1.7) toward tactrine: Kinetic characterization // J. Biochem and Mol. Toxicol. 1998. - V.12, N. 4. - P.245-251.

38. Alexsen P.H., Harel M., Silman I., Sussman J. Structure and dynamics of the active site gorge of Ache: synergistic use of molecular dynamics simulation and X-ray crystallography // Protein Sci. 1994. - V. 3. - P. 188-197.

39. Al-Jafari A. A., Kamal M.A. Optimization and kinetic studies of human erythrocyte membrane-bound ACHE // Biochemical and Mol. Biol. Int. 1996. - V. 38, N. 3.-P. 577-586.

40. Alloja R.S., Auger M.L., Orr G.R., Raison I.K. A critical role for membranes in hibernation / Living in the cold: Physiological and biochemical adaptations // H.C. Helles et. al. (eds). -N.Y.: Elsevier. 1986. - P. 5714-5719.

41. Angeister L., Roth E., Silman F. Synaptic constituens in health and disease // Meadinska Kujuda Pergamon Press, Ljubejana - Oxford. - 1980. - P. 533540.

42. Antosiwier J., Gilson M.K., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: effect of ionic strength and dimerization on the rate constants // Isr. J. Chem. 1996. - V. 34. - P. 151-158.

43. Antosiwier J., Wlodek S.T., McCammon J.A. Acetylcholinesterase: role of the enzyme's charge distribution in sreering charged ligands toward the active site // Biopolymers. 1996. - V. 39. - P. 85-94.

44. Appleyard M., Johnsen H. Action of acetylcholinesterase in the guinea pig cerebellar cortex in vitro II Neuroscience. 1992. - V. 47, N. 2. - P. 291-301.

45. Ariel N., Ordentlich A., Barak D., Bino Т., Velan В., Shafferman A. The "aromatic patch" of three proximal residues in the human acetylcholinesterase active centre allow versative interaction models with inhibitors // Biochem J. 1998. -V. l.-P. 95-102.

46. Bar-On P., Harel M., Millard C.B., Enr A., Sussman S.L., Silman I. Kinetic and structural studies on the interaction of the anti-Alzhgeimer drug, ENA-713, with Torpedo californica acetylcholinesterase // J. Physiol (Raric). 1998. - V.92. -P.406-407.

47. Bartolucci C., Perrola E., Cellai L., Brufani M., Lamba D. "Back door" opening implucal by the crystal structure of a carbomoylates acetylcholinesterase // Biochemistry. 1999. - V. 38, N. 18. - P. 5714-5719.

48. Bataille S., Partalier P., Coulon P., Ternaux J.P. Influense of acetycholinesterase on embryonic spinal rat motoneurones growth in culture a quatitave morphomet-ric study // Eur. J. Neurosci. 1998 - V. 10. - P. 560-572.

49. Bearegard G., Roufogalis B.D. The role of tightly bound phospholipid in the activity of erythrocyte acetylcholinesterase // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1977.-V. 77.-P.211-219.

50. Benedito M., Demosi M. The activity of acetylcholinesterase in subcellular fractions of the cerebral cortex from rats deprived of paradoxical sleep (PS) // Actos de Fisiologia. 2001. - P. 165.

51. Bloj В., Gala M., Morero R.D., Farias R.N. Heterogeneous effect of directory cholesterol on acetylcholinesterase and ATPases of rat erythrocytes: Arrenius plots. // The Journal of Nutrition. 1979. - V. 109, N. 1. - P.63-69.

52. Bloj В., Morero R.D., Farias R.N. Effect of essential fatty acid deficiency on the Arrenias plot of acetylcholinesterase from rat erythrocytes // J. Nuts. 1974. -V.104. - P.1265-1272.

53. Bon S., Vigny M., Massoulie S. Assymetric and globular form of acetylcholinesterase in mammals and birds // Proc. Nate Acad. Set. USA. 1979. - V. 76. -P. 2546-2550.

54. Boschetti N., Brodbeck U.T. The membrane anchor of mammalian brain acetylcholinesterase consist of a single glycosylated protein of 22 kDa // FEBS Lett. -1996.-V. 380, N. 1-2. -P.133-136.

55. Botti S.A., Felder C.E., Lifson S. Sussman J.L., Silman I. A molecular treatment of molecular traffic through the active site of cholinesterase // Biophysical Journal. 1999. - V. 77. - P. 2430-2450.

56. Bourne Y., Taylor P., Boughs P.E., Marchot P. Crystal structure of mouse acetylcholinesterase. A peripheral site occluding loop in a tetrameric assembly // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 2963-2970.

57. Bourne Y., Taylor P., Marchot P. Ache inhibition by fasciculin. Crystal structure of the complex // Cell. 1995. - V. 83. - P. 503-512.

58. Brimijoin S., Wierman M.J. Rapid orthograde and retrograde axonal transport of acetylcholinesterase as characterized by the stop-flow technique // J. Physiol. (Lond)-1981.-P. 129-142.

59. Brzin M., Sketeti I., Kliner B. Cholinesterases / Handbook of neurochemistry. -V. 4: Enzyme in the nervous system. 1983. - P. 251-292.

60. Bucht G., Hjalmarsson R. Residues in Torpedo californica acetylcholinesterase necessary for processing to a glycosylphosphatidilinositol anchored form // Bio-chem. and Biophys. Acta. Protein struct, and Mol. Enzymol. 1996. - V. 1292, N.2.-P. 223-232.

61. Casanueva O., Depred P., Garsia-Huidobro, Inestova N. At least two synaptic basal lamina of Torpedo electric organ // Biochem and Biophys. Res. Commun.- 1998. V. 250, N. 2. - P. 312-317/

62. Cavonau J. L. Enzyme kinetics and the role of biological processes // J. of General Physiology. 1950. - V. 34, N. 5. - P. 193-209.

63. Chen C.-H., Zuklie B.M., Roth L.G. Elucidation of biphasic alteration on acetylcholinesterase (AchE) activity of tetracaine on AchE-associated membrane vesicles // Arch. Biochem. And Biophys. 1998. - V. 351, N. 1. - P.135-140.

64. Chubb I.W., Goodman S., Smith A.D. Is acetylcholinesterase rose secreted from cerebaral neurous into cerebrospinal fluid? // Neuroscience. 1976. - V. 1. - P. 62-67.

65. Crisaru D., Strenfeld, Eldor A., Click C., Soreq H. Structure roles of acetylcholinesterase variants in bio and patalogy // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 264, N. 3.-P. 672-689.

66. Das A., Rai D., Dikshit A., Ralit G., Nath C. Effect on unpredictable stress on cognition and brain acetylcholinesterase activity in adult and aget mice // Indian Journal of Pharmacology. 2002. - V. 34. - P. 416-421.

67. Deblaquise G.E., Wotus L., Blain P.G., Williams F.M. Electrophysiological and biochemical effect of single and multiple doses of the organophosphate diazinon in the mouse // Toxical, and Appl. Pharmacol. 2000. - V.166, N. 2. -P.81-91.

68. Deboer T. Brain temperature dependent changes in the electroencephalogram power spectrum of human and animals // J. Sleep. Res. 1998. - V. 7. - P. 254262.

69. Deboer Т., Tobler I. Temperature dependent of EEG frequencies during natural hypothermia // Brain. Res. 1995. - V. 670. - P. 153-156.

70. Deed M., Humphrey D.R., Yong S.H., Fergous Т., Reinhoed V.N., Rosenberry T. Glican component in the glycoinositolphospholipid anchor of human erythrocyte acetylcholinesterase. // J. Biol. Chem 1982. - V. 207, N. 26. - P. 1857318580

71. Dougherty D.A., Shouffer D. Acetylcholine binding by a synthetic receptor implication for biological recognition // Science. 1990. - V. 250. - P. 1558-1560.

72. Duval N., Krejci N., Crossi E., Coussen I. Molecular architecture of acetylcholinesterase collagen-tailed forms construction of glycolipid-tailed tetramer // EMBO Journal. 1992. - V. 11, N. 9. - P. 3255-3261.

73. Elcock A.H., Gandoulline R.R., Wade R.C., McCammon J. A. Computes simulation of protein protein association kinetics: acetylcholinesterase - fasciculin //J. Mol. Biol. - 1999,-V.291,N. 1. - P.148-162.

74. Ellman Y.L., Courtney K.D., Andres V.J., Feathestone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. - V. 7, N. 1. - P. 88-95.

75. Enyedy I.J., Kovach I.M., Brooks B.R. Alternative pathway for acetyc acid and acetate ion release from acetycholinesterase: a molecular dynamics study // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. - P. 8043-8050.

76. Faerman C., Ripoll D., Bon S.L., Morel N., Massoulie J., Sussman J.L., Silman I. Site-directed mutant designed to test "back-door" hypothesis of acetylcholinesterase function // FEBS Lett. 1996. - V. 386. - P. 65-71.

77. Felder C.E., Botti S.A., Lifson S., Silman I., Sussman J.L. External and internal electrostatic potentials of cholinesterase models // J. Mol. Graph. Mod. 1997. -V. 15.-P. 318-327.

78. Food M., Cruz F. Effect of dietary lipid on synaptosome acetylcholinesterase activity. // Biochem. 1983. - V.211 - P.507-509.

79. Francesco C., Brodbeck U. Interaction of human red cell membrane acetylcholinesterase with phospholipids // Biochemica et Biophysica. Acta 1981. - V. 640.-P. 359-364.

80. Frenkel E.S., Roelofsen B,. Brodbeck U. Lipid-protein interaction in human erythrocyte-membrane acetylcholinesterase // Biochem. 1980. - V. 104, N. 2. - P.377-382.

81. Fuxreiter M., Warshel A. Origin of the catalytic power of acetylcholinesterase:computer simulation studied // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. - P. 183194.

82. Gentry R., Ye L., Nemerson E. A microscopic model of enzyme kinetics // Biophysical J. V. 69. - P. 356-361.

83. Gilson M.K., Straltsma T.P., McCammon J.A., Pipoll D.R., Foerman E.M., Ax-elsen P.N., Silman I., Sussman J.L. Open "backdoor" in molecular dynamics simulation of acetycholinesterase // Science. 1994. - V. 263. - P. 1276-1278.

84. Gisiger V., Vigny M., Gautron J., Rieger F. Acetycholinesterase of rat sympathetic ganglion: molecular forms, localization and effect of denervation // J. Neu-rochem. 1978. - V. 30. - P. 501-516.

85. Goldman S.S., Willis J.S. Cold resistance of the brain during hibernation. II. Na, K-Activated ATPase // Cryobiology 1973. - V. 10. - P. 218-224.

86. Gough N., Kandall W. Oligomerization of chicken acetylcholinesterase does not require intersubunit disulfide bound // Neurochem. 1995. - N. 6. - P. 27342741.

87. Greenblatt H.M., Kryger C., Lewis Т., Silman J. Structure of acetylcholinesterase complexed with (-)-galantamine at 2,3 A0 resolution // FEBS Lett. -1999. V.463. - P.321-326.

88. Greenblatt H.M., Silman I., Sussman J.L. Structure studied on vertebrate and invertebrate acetycholinesterases and their complexes with functional ligands // Drug development research. 2000. - V. 50. - P. 573-583.

89. Gytles N.R., Polinsky R.Y., Sramek J.J., Enz A., Jhee S.S., Mancione L., Hou-rani J., Zolnouni P. Dose dependent CSP acetylcholinesterase inhibition by SDZ ENA 713 in Alzheimers disease // Acta Neural. Scand. 1998. - V. 97, N. 4. -P. 244-250.

90. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. - V. 93, N. 3. - P. 485-489.

91. Harel M., Klegnet G.J., Ravelli R.B., Silman I., Sussman J. Crystal structure of an acetylcholinesterase-fasciculin complex. Interaction of three-fmged toxin from shake venom with its target structure // Structure 1995. - V. 3. - P. 13551366.

92. Harel M., Schalk I., Ehret-Soboticr L., Bouet P.H., Silman I., Sussman S. Quaternary ligand binding to aromatic residues in the active site gorge to acetycholinesterase // Pros. Note Acad. Sci. USA. - 1993. - V.90. - P.9031-9035.

93. Heger D., Piatt R. Effect of essential phospholipid on the properties of ATPases is isolated rat liver plasma membranes of young and old animals // Mech. Ageing Devi. 1973. - V.4. - P.191-200.

94. Heger W.H. Effect of dietary phospholipid composite in the liver and brain // Gen. Pharmac. 1979. - V. 10. - P.427-432.

95. Herz F., Kaplan E. A review: human erythrocyte acetylcholinesterase // Pediatric Res. 1973. - V. 7, N. 4. - P. 204-214.

96. Hubbord G., Argas N. A functional role for protein cavities in domain: domain motions // J. Mol. Biol. 1996. - V. 261. - P. 289-300.

97. Hunther G., Luppa H. The multiple forms of brain acetylcholinesterase micro electrophoreses and topochemical analysis of the pattern // Histochem. 1977. -V. 53.-P. 317.

98. Inestosa N., Perelman A. Association on the acetylcholinesterase with the cell surface // Y. Membrane Biol. 1980. - V. 118, N. 1. - P.l-9.

99. Jancer-Yague I., Caberas J.A., Maneko M. Regulation of acetylcholinesterase associated with platelet plasma membranes by changes in the environment // BiochemJ. Trans. 1989.-V. 17, N. 5. -P.1011-1012.

100. Jason L., Smart C., McCammon A. Analysis of synaptic transmission in the neu-romuskular function using a continuum finite element model // Biophysican journal. 1998. - V. 75. - P. 1679-1688.

101. Kajya H., Kreutsberg G.W., Namba M. The distribution of acetylcholinesterase in the cell of nervous system // Brain Res. 1980. - V. 1871. - P. 369-382.

102. Kamal M.A., Al-Jafari A.A. The preparation and kinetic analysis of multiple form of human erythrocyte acetylcholinesterase // Prep. Biochem. and Biotech-nol. 1996. - V. 26, N. 2. - P. 105-119.

103. Karelsson E., Mbugua P.M., Rodriguez-Ithurralde. Fasciculin, anticholinesterase toxin from the venom of the green mamba Denderoaspis angusticeps // J. Physiol. (Paris). 1984. - V. 79. - P. 232-240.

104. Keyhani F., Maigne J. Acetylcholinesterase in mammalian erythrocyte cell // J. Cell. 1991.-V. 52.-P. 327-339.

105. Koelle G.B., Koelle A. M., Smyri E. G. Cytological distribution and physiological functions of cholinesterase // J. Neurochem 1977. - V. 28. - P. 313-319.

106. Koellner G., Kryger G., Millard C.B., Gilman I., Sussman J.L., Steiner T. Active-site gorge and buried water molecules in crystal structure of acetylcholinesterase from Torpedo califomica II J. Mol. Biol. 2000. - V. 296. - P. 713735.

107. Krem M.M., Dilero E. Conserved water molecules in the specificity pocket of serine proteases and the molecular mechanism of Na+ binding // Protein Struc. Funct. Senet. 1988. - V. 30. - P. 32-34.

108. Kronman C., Ordentlich A., Barac D., Vellan В., Shafferman A. The "back door" hypothesis for product clearance in acetylcholinesterase challenged by site-directed mutagenesis. // J.Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 27819-27822.

109. Kryci E., Legay C., Thomine S., Sketely J., Massaulie J. Differences in control the distribution on oligomerization of the collagen-tailed forms in fast and slow muscles //J. Neurosci. 1999. - V. 19, N. 24. - P. 10672-10679.

110. Kryger G., Silman I., Sussman J.L. Structure of acetylcholinesterase complexed with E2020. Implication for the design of new antiAlzheimer drugs // Structure -1999.-V. 7. P.207-307.

111. Lawson A.A., Barr R.D. Acetylcholinesterase in red blood cells // Amer. J. of Hematology. 1987. - V. 26, N. 1. - P. 101-112.

112. Lydia G., Tsi Y.Z., Chuen-Shang W. Preparation of clean solution of reconstituted acetylcholinesterase: effect of ionic stronge and lipid / protein ratio // Peptide and Protein Res. 1989. - V. 33, N. 4. - P.268-272.

113. Ma I.C., Dougherty D.A. The cation я-interaction // Chem. Rev. 1997. - V. 97. -P. 1303-1324.

114. Mallende W., Szegletes Т., Rosenberry T. Organophosphorylation of acetylcholinesterase in the presence of periferal site ligands. Distinct effect of propidium and fasciculin // J. Biol. Chem. 1999. - V.274, N. 13. - P.8481-8489.

115. Mallender W.P., Sregleets I., Rosenberry T.L. Acetycholinesterase binds to Asp 74 of the peripheral site of human acetycholinsterase as the first step in the catalytic pathway //Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 7753-7763.

116. Marsel V., Palacios L. G., Pertuy C., Mosson P., Fourmer D. Two invertebrate acetycholinesterases show activation followed by inhibition with substrate concentration // Biochem. J. 1998. - V.329. - P.329-334.

117. Masson P., Legrand P., Barters C.F., Froment M.P., Schopfer L.M., Locurid D. Role of aspartate 70 and tryptophan 82 in binding of succinyldithiocholine to human butyrylcholinesterase // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 2266-2277.

118. Massoulie J., Bon S. The molecular forms of cholinesterase and acetylcholinesterase in vertebrates // Annu. Rev. Neurosci. 1982. - V. 51. - P. 57-106.

119. Massoulie J., Perrement L., Bon S., Krejci E., Valentic F. Molecular and cellularbiology of cholinesterases // Prog, neurobiol. 1993. - V. 41. - P. 31-91.

120. Mohan C., Radha E. Circadion rhythm in acetylcholinesterase activity during aging of the central nervous system. // Line Sci. 1974. - V. 15., N. 2. - P. 231.

121. Muller M., Grubmiiller H. Systematic search for a "back door" acetylcholinesterase / Abstr. 3 rd European Biophysics Congress. Munchen. Sept. 9-13. -2000.-V. 26, N. 4-5.-P. 288

122. Myers C., Loctridge O., Lo Du B. Hydrolysis of methylprednisolone acetate of human cerum cholinesterase // Drug. Met. Disp. V. 10. - P. 279-280.

123. Niday E., Wang C.S., Aloupovic P. Kinetic evidence for allosteric substrate inhibition of human acetycholinesterase // Biochemica and Biophysica Acta. -1980.-V. 612.-P. 67-72.

124. Nosea N.A., Harvey A.B. and Taylor P. Specifity and orientation of trigonal car-boxyl esters and tetrahedral alkylphosphonyl esters in cholinestorases // Biochemistry. 1995. - V.34. - P.l 1528-11536.

125. Nunes-Tavares N., de Molta A., Silva C.M., Aroujo G.M., Lauro S.R., Hosson-Volock A. Inhibition of acetylcholinesterase from electrophorus electricus by tricyclyc antidepressants // Int. J. Biochem. And Cell. Biol. 2002. - V.34, N. 9. -P.1071-1078.

126. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijusta В., Frolow F., Frankel S.M., Harel M., Remingtom S.J., Silman I., Schrag J. et al. The a/p hydrolase fold // Protein Eng. 1992.-V. 5.-P. 197-211.

127. Ordentlich A., Barac D., Kronman C., Ariel N., Segall Y., Velan В., Shafferman A. Functional characteristics of the oxyanion hole in human acetylcholinesterase // The journal of biological chemistry. 1997. - V. 273, N. 31. - P. 1950919517.

128. Ordentlich A., Barak D., Kronman C., Flashner Y., Leitner N., Segall Y., Ariel

129. Pang Y.P., Quiram P., Jelack Т., Hang F., Drimijoin Highly potene selective and low cost bis-tetrahydroaminocrine inhibition of acetylcholinesterase // The J. of Biol. Chemistry. 1996. - V. 241, N. 31. - P. 23646-23649.

130. Paniker N.V., Arhold A.B., Hartman R.C. Solubilization and purification of human erythrocyte membrane acetylcholinesterase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1973.-V. 144,-P.492-497.

131. Paylus J.M., Maigne J., Keyhani E. Mouse megakaryocyte secrete acetylcholinesterase // Blood. V. 58. - P. 1100-1105.

132. Popov V. I., Bocharova L. S., Bragin A. G. Repeated changes of dendritic morphology in the course of hibernation // Neuroscience. 1992. - V. 48,

133. Radic Z., Duran R., Vellom D.C., Li Y., Cervenansky C., Taylor P. Site of fas-ciculin interaction with acetycholinesterase // The Journal of Biological chemistry. 1993. - V. 269. - P. 11233-11239.

134. Radic Z., Kirchhaft P., Quinm D.M., McCammon S.A., Taylor P. Electrostatic influence on the kinetics of ligand binding of acetycholinesterase. Distribution between active center ligands and fasciculin // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. -P.23265-23277.

135. Radic Z., Taylor R. Interaction kinetics of reversible inhibition and substrates with acetylcholinesterase and its fasciculin 2 complex// J. Biol. Chem. 2001. -V.276,N. 7.-P. 4622-4633.

136. Raves M.L., Harel M., Pang Y.P., Silman J., Kosikowski A.P., Sussman J.L.,

137. Structure acetylcholinesterase complexed with nootropic alcoloid (-)-huperzine A // Nature Structural biology. 1997. - V. 4, N. 1. - P. 314-320.

138. Reiner E., Norman A., Simeon V., Radic Z., Taylor P. Mechanism of substrate inhibition of acetylcholinesterase.//Pros. Third Internal Meet cholinesterase. -1993.-p.32.

139. Riger F., Chetalat R., Nicolet M., Kamal C., Rolett M. Asymmetric form of acetylcholinesterase of the rat brain // FEBS Lett. 1980. - V. 1211. - P. 169-174.

140. Riger F., Vigny M. Solubilisation and physiochemical characterization of rat brain acetylcholinesterase: development and maturation of its molecular form // J. Neurochem. 1976. - V. 27, N. 1. - P. 121.

141. Ripoll D., Faerman C.H., Axelsen P., Silman I., Sussman J.L. An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase // Biochemistry. 1993. - V. 90. - P. 5128-5132.

142. Rosenberry Т., Neuman L. Interaction of ligands with acetylcholinesterase. Use of temperature-jump relaxation kinetics in the binding of specific fluorescent ligands // Biochemistry 1977. - V. 16. - P. 3870-3877.

143. Rosenberry T.L. Acetylcholinesterase // Adv. Enzymol. 1975. - V. 43. - P. 103-218.

144. Rossi S., Rotundo R. Cell surface Ache are molecular a multinucleate myotubes are clustered over nucleus of origin // J. Cell. Biol. 1992. - V. 119, N. 6. - P. 1657-1667.

145. Shen T.X., Tai K., McCammon S.A. Statistical analysis of the fractal gating motions at the enzyme acetycholinesterase // Phys. Pa. E; Stat. Phys., Plasmas. Fluids, Petal. Interdiscip. Top. 2001. - V. 63. - P. 41-49.

146. Shi J., Boyd A.E., Radic Z. and Taylor P. Reversibly bound and covalently attached ligands induce conformational changes in the omega loop, cys69-Cys96of mouse acetycholinesterase 11 The Journal of Biol. Chem. 2001.- V.276, N. 45.-P.42196-42204.

147. Shin I., Silman I., Bon C., Weiner L. Liposome-catalyzed unfolding of acetylcholinesterase from Bungalus fasciculins // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 4310-4316.

148. Sihotang K. A simple method for purification of acetylcholinesterase from human erythrocyte membranes // Biochemica et Biophysica Acta. 1974. - V. 370.-P.418-476.

149. Sihotang K. Acetylcholinesterase and its association with lipid // J. Biochem. 1976.-V.63-P. 519-524.

150. Simone S., Goff A.L., Frobert Y., Grass J. and Massoulic J. The binding sites of inhibitory monoclonal antibodies on acetylcholinesterase rase // The Journal of biological Chemistry. 1999. - V.274, N. 39. - P. 27740 - 27746.

151. Skau K. Acetylcholinesterase molecular forms in serum and erythrocytes of laboratory animals // Сотр. Biochem. Physiol. 1985. - V. 80, N.l - P. 207210.

152. Smart J., McCammon J. A. Analysis of synaptic transmission of the neuromuscular function using a Continuum Finite Element Model // Biophysical J. 1998. -V. 76.-P. 1679-1688.

153. Soreq H., Zakut H. Human cholinesterase and anticholinesterases agent / Academic Press. 1993. - Son Diego. - С A. - 300 p.

154. Srivatson M., Perets M. Acetycholinesterase promotes regeneration of neuritis in cultured adult neurons of Aplysia // Neuroscience. 1997. - V. 77 - P. 921-951.

155. Storey K.B. Turning down the fires of life: metabolic regulation of hibernation and estivation // Molecular mechanisms of metabolic arrest: life in limbo / Ed. by Stored K.B. Oxford, Scientific Publishers Ltd. - 2001. - P. 1-21.

156. Sussman J.L., Harel M., Frolow I., Olfner C., Goldman A., Taker L., Silman I. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica. A prototypic acetylcholine-binding protein // Science. 1991. - V. 253. - P. 872-876.

157. Suzuki K., Okumura X., Sunamovo J. Induction of Ache release from erythrocytes in the presence of liposome's // J. Biochem. 1999. - V. 125, N. 5. - P. 876-882.

158. Szabo A., Shoup D., Northrup S.H., McCammon J.A. Stochastically gated diffusion-influenced reactions // J. Chem. Phys. 1982. - V. 77. - P. 4484-4493.

159. Szegletes Т., Mallender W.D., Thomas P.J., Rosenberry T.L. Substrate binding to the peripheral site of acetycholinesterase initiates enzymatic catalysis. Substrate inhibition arises as a secondary effect // Biochemistry. 1999. - V. 38. -P. 122-133.

160. Szelenyi J., Bertha E.A., Holland S.R. Acetylcholinesterase activity of lymphocytes. An enzyme characteristic of T-cells // Am. J. Hematology. 1982. - V. 50.-P. 241-245.

161. Tai K., Bond S., MacMillan H., Baker N., Hoist M., McCammon I. Finite element simulation of acetylcholins diffusion of neuromuscular functions // Biophysical Journal. 2003. - V. 84. - P. 22.

162. Tai K., Shen Т., Borjesson U., Philippopoulos M., McCammon J.A. Analysis of a 10-nanosecond molecular dynamic simulation of mouse acetycholinesterase // Biophys. J. 2001. - V. 81. - P. 715-724.

163. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry. 1993. -V. 32.-P. 401-403.

164. Тага S., Helms V., Straatsma T.P., McCammon J.A. Molecular dynamics of mouse acetycholinesterase complexes with hupersine A // Bioploymers. 1999.-V. 50.-P. 347-359.

165. Taylor P. Acetylcholinesterase / In pharmacological basis on therapeutics: Hardman J.G., Limbird L.E., Moninoff P.B., Rudden R.W., Gilman A.G., McCraw -.New York. 1996. - P. 161-176.

166. Taylor P. Cholinergic agonist, anticholinesterases agents / In: Gilman A.G., Kail T.W., Nies A.S., Taylor P. (Eds) Pharmacological Basis of Therapeutics, Perga-mon, New York. N.Y. 1990. - P. 122-130.

167. Taylor P., Brown J. Acetylcholine // Neurochem. 1999. - P. 5-49.

168. Taylor P., Radic Z. The cholinesterases: from genes to proteins // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1994. - V. 34. - P. 281-320.

169. Testa I.R., Rose A., Fumelli P., Bertoli E.M. Abnormal membrane fluidity and acetylcholinesterase activity in erythrocytes from insulin-dependent diabetic patients // J. Clin. Endocrinal and Metab. 1988. - V. 67, N. 6. - P. 1126-1133.

170. Timofeeva O., Gordon C. EEG spectra, behavioral states and motor activity in rats exposed to acetylcholinesterase inhibitor chlorpyrofos // Pharmacology. Biochemistry and Behavior. 2002. - V. 72. - P. 669-679.

171. Topico A., Caillou B. Acetylcholinesterase in human thymus cells // Blood. -1998.-V. 66.-P. 891-895.

172. Tsakiris S. Control of the activity of the brain synaptosome-associated acetylcholinesterase by acidic phospholipids // Z. Naturforsch. 1985. - V. 40. - P. 97-101.

173. Wang L., Radic Z., Bruggerman K., Nosea N., Berman H., Taylor P. Mechanismof oxime reactivation of ACHE analyzed by chirality's and mutagenesis // Biochemistry. 2000. - V.39, N. 19. - P.5750-5757.

174. Wang L.C.H., Lee T.F. Torpor and hibernation in mammals: metabolic, physiological and biochemical adaptations // Handbook of Physiology. Eds. M.J. Fre-gly, C.M. Blatteis. N.Y.: Oxford Univ. Press. 1996. - P. 507-531.

175. Wiedmer Т., Di Francesco C., Brodbeck U., Van Deenen U.M., Ott P. Lipid protein interaction of human erythrocyte membrane acetylcholinesterase // J. Bio-chem. 1979. - V. 102. - P.59-64.

176. Willian R., Phupendra P., Foster J.D., Rosenberry T.L. Bovine brain acetylcholinesterase primary sequence involved in intersubunit disulfide linkages // Biol. Chem. 1991. - V. 266, N. 12. - P. 7487-7488.

177. Willians M.A., Goodfellow J.M., Thornton S.M. Buried water and internal cavities in protein // Protein Sci. 1994. - P. 1224-1235.

178. Wlodeck T.S., Clork T.W., Scotti L.R., McCammon J. Molecular dynamics of acetycholinesterase dimer complexes with tacrine // J. Am. Chem. Soc. 1997 V. 119.-P. 9513-9522.

179. Wong R., Nichol C. The efficiency of various detergents for extraction and stabilization of acetylcholinesterase from bovine erythrocytes // Biochem and Cell-Biol. 1987. - V. 65, N. 1. - P.8-18.

180. Zhou H.X., Briggs J.M., McCammon J.A. A 240-fold electrostatic rate enhancement for acetylcholinesterase substrate binding can be predicted by the potential within the active site // J. Am. Chem. Cos. 1996. - V. 118. - P. 1306913070.

181. Zhou H.-X., Wlodek S.T., McCamman A. Conformation gating as a mechanism for enzyme specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 92809283.

Информация о работе

Джафарова, Альбина Мехьядиновна
кандидата биологических наук
Махачкала, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Температурная зависимость кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы в норме и при низких температурах тела - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы