Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы на разных этапах онтогенеза рыб

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Функциональные и структурные свойства лактатдегидрогеназы на разных этапах онтогенеза рыб"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 977.95:577.1 577.3

ПОЛОСУХИНА Екатерина Сергеевна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА РЫБ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный.руководитель:

доктор биологических наук Н.Д. ОЗЕРНЮК

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.А. НЕЙФАХ доктор биологических наук, профессор М.И. ШАТУНОВСКИЙ

Ведущая организация - Московский Государственный

Университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "3&" 199^ г. в часов на

заседании специализированного совета Д002.85.01 при Институте биологи развития им. Н.К Кольцова РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д. 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, д. 26

Автореферат разослан2^1 X/ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Е.М. Протопопова

ВВЕДЕНИЕ

Процессы развития (помимо дифференциальной активности генов) включают ряд преобразований различных метаболических систем. Эти преобразования касаются прежде всего направленности метаболических путей, что связано с различным характером превращения субстратов на тех или иных стадиях раннего онтогенеза. Поскольку на разных этапах онтогенеза (гаметогенез, созревание ооцитов, оплодотворение, эмбриональное и личиночное развитие) частично меняются и внутренние и внешние условия, в которых протекает развитие, переключение метаболических путей на данных этапах - необходимое условие нормального онтогенетического процесса (Нейфах, Тимофеева, 1977, 1978).

Значительные успехи достигнуты в изучении динамики изоферментных спектров на разных этапах развития (Магкег^ 1963; Маркерт, Уршпрунг, 1973; ИМ^, 1976; Корочкин, 1977). Смену изоформ тех или иных ферментов в процессе онтогенеза принято считать важным регуляторным компонентом развития.

Следует отметить, что при смене перечисленных выше этапов развития, в первую очередь при переходе от гаметогенеза к эмбриогенезу меняется направленность ряда метаболических процессов, в частности, углеводного обмена (Мильман, Юровицкий, 1973). Если для оогенеза характерна глюконеогенетическая направленность углеводного обмена, то для эмбрионального развития - гликолитическая направленность. Очевидно, что при этом должны меняться кинетические и структурные свойства ряда ферментов углеводного обмена, в первую очередь обратимых ферментов. Однако, этот аспект молекулярной биологии развития практически не исследован. Мало изучены также вопросы воздействия внешних факторов, в первую очередь температуры, на функциональные и структурные особенности ферментов на разных этапах онтогенеза.

Таким образом, одной из важных задач, требующих своего решения для понимания механизмов индивидуального развития, можно считать анализ структурных и функциональных изменений конститутивных белков, в первую очередь ферментов, на разных этапах онтогенеза.

Для изучения этих проблем важным представляется выбор адекватной экспериментальной модели. По ряду соображений для решения поставленных в работе вопросов удобной моделью можно считать фермент углеводного обмена лактатдегидрогеназу. Известно, что этот досконально изученный фермент проявляет высокую степень полиморфизма и можно ожидать, что изучение его структурных и функциональных особенностей на разных этапах онтогенеза, в том числе и у взрослых животных в различных условиях среды, может служить адекватной моделью, отражающей онтогенетическую регуляцию конститутивных белков.

Цель работы. Изучение кинетических и структурных особенностей лактатдегидрогеназы во время созревания ооцитов, в период зародышевого развития, а также в различных тканях взрослых рыб (вьюна и карпа) в норме и при температурной адаптации.

Актиальность задачи. Анализ функциональных и структурных особенностей ферментов на разных этапах онтогенеза имеет важное значение для понимания' регуляторных механизмов развития. Изменение характера метаболизма на разных стадиях онтогенеза обеспечивается соответствующим изменением кинетических свойств ферментов, что связано обычно со структурными изменениями этих молекул.

Новизна работы. Впервые показано изменение кинетических свойств лактатдегидрогеназы во время созревания ооцитов рыб. В этот период происходит изменение положения оптимума рН данного фермента, а также величины внутриклеточного рН ооцитов. В течение созревания ооцитов отмеченное изменение кинетики лактитдегидрогеназы происходит за 40 часов, тогда как при температурной акклимации рыб эти изменения в ооцитах и скелетных мышцах наблюдаются через 15 суток. Впервые установлено, что лактатдегидрогеназа из мышц рыб, адаптированных к низким температурам, обладает более высокой устойчивостью к денатурирующим агентам.

Практическая значимость. Полученные результаты являются важным звеном в понимании механизмов регуляции метаболизма на разных этапах индивидуального развития.

Обнаружены два механизма изменения кинетических свойств лактатдегидрогеназы: при созревании ооцитов и при температурной адаптации животных.

Апробация резильтатов. Материалы диссертации были представлены на VIII Научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992), на Всероссийской конференции "Регуляция энергетического обмена и энергетические основы жизни" (Санкт-Петербург, 1993), на Международной конференции "Механизмы развития: Онтогенетические и эволюционные аспекты" (Москва, 1994).

Стрцктцра и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 26 рисунков и две таблицы.

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проведена на ооцитах и зародышах вьюна (Misgurnus fossílis), а также на различных тканях и органах взрослых вьюнов и карпов (Cyprínus carpió). Ооциты вьюна на стадии окончания большого роста получали хирургическим путем: разрезали стенку тела самки, извлекали яичник, помещали в раствор Рингера и высыпавшиеся из стромы яичника ооциты ипользовали для анализа. Зародышей вьюна получали путем искусственного оплодотворения в условиях лаборатории (Нейфах, 1959; Костомарова, 1975).

Часть работы проводили на скелетных мышцах, сердце и гепатопанкреасе взрослых вьюнов и карпов. Эти органы и ткани получали хирургическим путем на холоде.

Для определения активности ЛДГ навеску мышц гомогенизировали в 0,1 М Фосфатном буфере (рН 7,2) в гомогенизаторе стекло-стекло во льду. Активность ЛДГ определяли спектрофотометрически при 34 0 нм по изменению оптической плотности НАДН+ (Cahn, 1964). Концентрацию белка определяли по поглощению при 280 нм на спектрофотометре Specord М40.

Выделение лактатдегидрогеназы проводили методом дробного высаливания сульфатом аммония с некоторыми модификациями применительно к тканям рыб (Place, Powers,

1984; Лущак, 1990) и последующей очисткой на хроматографической установке FPLC (LKB, Швеция).

Для расчета константы Михаэлиса (К„) был применен метод Лайнуивера-Берка.

Электрофорез ЛДГ в нативных условиях проводили в однородной буферной системе по методу Дэвиса (Davis, 1964). Для анализа степени чистоты фермента использовали метод диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, 1970).

Измерение внутриклеточного pH приводили при помощи сурьмяного микроэлектрода (Ремиш и др., 1990).

Результаты обрабатывали методами вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ЛДГ ВО ВРЕМЯ РАННЕГО

ОНТОГЕНЕЗА РЫБ.

1. Кинетические свойства ЛДГ из ооцитов вьюна. Для анализа изменения функциональных особенностей ЛДГ существенным представляется изучение кинетических свойств в период созревания ооцитов, а также влияние температуры на кинетику фермента из ооцитов. В связи с этим нами была изучена температурная зависимость кинетических свойств ЛДГ незрелых ооцитов вьюнов, адаптированных к 5 и 18°С. Как видно из рис. 1, минимум Км для ЛДГ из экстрактов и частично очищенного фермента из ооцитов рыб, акклимированных к низкой температуре отмечен при 5°С, тогда как у рыб при высокотемпературной адаптации минимум Км находился при 15°С.

Была изучена также динамика кинетических свойств ЛДГ на протяжении периода акклимации вьюнов (25 суток). Рыб, адаптированных в течение нескольких месяцев к 5°С, переносили в среду с температурой 18°С и определяли температурную зависимость Км для фермента из экстрактов ооцитов с периодичностью в 5 дней (рис. 2). После первых 5 дней, минимум Км отмечен при той же температуре, что и до начала акклимации. После 10 дней минимум сдвигался в сторону более высоких температур и находился при 9°С. Через 15 дней после перенесения рыб в новые температурные

условия, температурный минимум Км соответствовал 14°С и не менялся в течение дальнейшего периода акклимации.

Было высказано предположение, что в период созревания ооцитов изменение кинетических ЛДГ может происходить в течение более короткого периода.

0,3 0,2 0,1

0 5 10 15 20 Т,°с

Рис. 1. Температурная зависимость для пирувата у ДЦГ из незрелых ооцитов вьюнов, акклимированных к 5°С (А) и 18°С (Б). Клеточный экстракт (•), очищенный фермент (о).

2.Температурная зависимость Км для ЛДГ из незрелых ооцитов и зрелых яйцеклеток.

Для анализа кинетических свойств ЛДГ незрелых ооцитов и зрелых яйцеклеток была определена температурная зависимость К„. Эти опыты проводили на клеточных экстрактах ооцитов и на частично очищенном ферменте. В экстрактах незрелых ооцитов рыб, адаптированных в течение нескольких месяцев к 5°С, минимум К„ находился при 5°С (рис. 3). В процессе созревания ооцитов минимум Км сдвигался в сторону более высоких температур и в зрелых неоплодотворенных

0,15 -

О 5 10 15 20 Т,°С

Рис. 2. Температурная зависимость Км для пирувата у ЛДГ

из экстрактов незрелых ооцигов вьюнов при различных сроках акклимации.

яйцеклетках он располагался в области 11°С. Следует отметить, что в лабораторных условиях (после инъекции самке хорионического гонадотропина и инкубации рыб при 18°С) созревание ооцитов вьюна происходит в течение 40 часов.

Сдвиг положения минимума Км для ЛДГ экстрактов ооцитов был подтвержден и на частично очищенном ферменте. В последнем случае положение минимума отмечено при 5 и 12°С для незрелых ооцитов и зрелых яйцеклеток соответственно (рис. 3).

К^тМ 0,15-

0,10

0,05

0

0,15

3

0,10

0,05

0

5 10 15 Т,°С

Рис. 3. Температурная зависимость Км для пирувата у ЛДГ из незрелых (1, 2) и зрелых (3, 4) ооцитов вьюна. Клеточный экстракт (1, 3), чистый фермент (2, 4).

Различия в кинетических свойствах фермента могут быть вызваны появлением его новых изоформ. Эта возможность была проверена для ЛДГ в течение созревания ооцитов. В ооцитах и яйцеклетках вьюна этот фермент имеет несколько изоформ (Ботвинник, Нейфах, 1977; Кусень, Стойка, 1978). Поэтому для анализа данной проблемы необходимо было получить незрелые и зрелые ооциты от одной и той же самки. Для этой цели самке делали маленький надрез в районе яичника и извлекали несколько незрелых ооцитов. Зрелые яйцеклетки были получены от этой же самки после инъекции хорионического гонадотропина. В незрелых ооцитах и зрелых яйцеклетках изоферментные спектры ЛДГ были одинаковыми. Следовательно, различия кинетических свойств ЛДГ в период созревания не связаны с появлением новых изоформ.

Полученный сдвиг минимума Км является результатом комбинированного действия хорионического гонадотропина и повышенной температуры среды. Чтобы выявить различия между эффектом хорионического гонадотропина и влиянием повышенной температуры, были поставлены контрольные эксперименты. Во-первых, рыб инкубировали при 18°С в течение 40 часов без инъекции гонадотропина. В этом случае минимум Км для ЛДГ из незрелых ооцитов оставался при 5°С. Во втором опыте после инъекции гонадотропина самок инкубировали при 5°С. Минимум Км для фермента из незрелых ооцитов оставался при той же температуре. Следовательно, изменение кинетических свойств фермента при созревании связано с воздействием гонадотропина или непосредственно на ЛДГ, или опосредованно через изменение физиологического состояния ооцитов, например, вследствие изменения внутриклеточного рН этих клеток.

В связи с этим было проведено определение внутриклеточного рН в незрелых ооцитах и зрелых яйцеклетках вьюна. Величина рН значительно снижается в течение периода созревания ооцитов: в незрелых ооцитах эта величина равна 7,45±0Д8, тогда как в зрелых яйцеклетках -6,66±0,06.

Существенное изменение внутриклеточного рН во время созревания ооцитов может влиять на многие метаболические процессы, в частности, на оптимум рН и кинетические

свойства ферментов. В связи с этим было изучено влияние рН на активность ЛДГ, очищенной из незрелых и зрелых ооцитов. Оптимум рН в незрелых ооцитах находится при 8,0, тогда как в зрелых яйцеклетках - при 7,7 (рис. 4). Таким образом, можно предполагать существование взаимосвязи между изменением внутриклеточного рН, оптимума рН для ЛДГ и кинетических свойств этого фермента в период созревания ооцитов.

А, % 100

50

6,0 7,0 8,0 9,0 рн

Рис. 4. Влияние рН на относительную активность ЛДГ, очищенную из незрелых ооцитов (•) и зрелых яйцеклеток (о) вьюна.

3. Кинетические особенности ЛДГ в период зародышевого развития рыб.

Кинетические особености ЛДГ определяются в значительной мере температурными условиями, в которых протекает развитие того или иного вида. В связи с этим был проведен детальный анализ кинетических свойств ЛДГ из зародышей вьюна, развивающихся при относительно низкой и высокой температурах. Была изучена температурная зависимость К„ для развивающихся зародышей вьюна на двух стадиях: на стадии двух бластомеров и перед вылуплением из оболочек. Температурный минимум К« для ЛДГ на стадии двух бластомеров при их инкубации при 21°С находился в области

8-12°С. Перед вылуплением положение минимума Км для ЛДГ зародышей, инкубируемых при той же температуре (21°С), практически не менялось и находилось при 12°С. Этот результат вполне закономерен, поскольку эмбриогенез данного вида рыб в природных условиях, в отличие от радужной форели, протекает достаточно быстро и при относительно постоянной температуре среды. Следует отметить, что во время эмбриогенеза радужной форели, развитие которой в природных условиях протекает при повышающихся температурах среды, температурный минимум Км для ЛДГ смещается в сторону более высоких температур (К1уасЬко, Огегпуик, 1994).

Было изучено также влияние температуры акклимации на положение минимума Км для ЛДГ из зародышей вьюна. Для этого зародышей рыб после оплодотворения переносили в термостат на 11°С и через 9 дней на стадии перед вылуплением определяли температурную зависимость Км. Оказалось, что положение температурного минимума Км в этом случае не меняется и соответствует 11°С. Можно предположить, что отсутствие эффекта температуры на кинетические свойства ЛДГ у зародышей вьюна связано с тем, что изменение положения минимума Км для данного фермента происходит обычно через 15-20 дней акклимации.

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЛДГ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ РЫБ, АДАПТИРОВАННЫХ К РАЗНЫМ ТЕМПЕРАТУРНЫМ УСЛОВИЯМ.

Для изучения молекулярных механизмов температурной акклимации ЛДГ на разных стадиях онтогенеза в качестве экспериментальной модели были выбраны скелетные мышцы рыб, которых адаптировали к низким и высоким температурам.

Прежде всего была определена удельная активность (Е/мг белка) данного фермента, выделенного из скелетных мышц вьюнов, адаптированных к низким (5°С) и высоким (18°С) температурам среды. Установлены определенные различия между двумя типами ЛДГ. Удельная активность фермента, выделенного из мышц рыб, акклимированных к низким и высоким температурам составила 17б±24 и 141±14 Е/мг соответственно.

Для изучения кинетичесхих особенностей ЛДГ проводили определение Км для ЛДГ в экстрактах скелетных мышц и гепатопанкреаса рыб (вьюна и карпа), адаптированных к низким и высоким температурам. Кроме того, были исследованы кинетические особенности очищенного фермента из скелетных мышц вьюна.

Температурный минимум Км для ЛДГ из гепатопанкреаса и из скелетных мышц карпов, акклимированных к 5°С располагался при 5°С. При адаптации данного вида рыб к 2 0°С минимальная величина Км из этих двух типов тканей находилась при 18°С.

Минимум Км для ЛДГ из экстрактов скелетных мышц вьюнов, адаптированных к 5°С, находился при 6°С. При акклимации рыб к 18°С минимальная величина Ки наблюдалась в области 17°С (рис. 5А).

Для анализа механизмов появления этих различий кинетические свойства ЛДГ были изучены на очищенном ферменте, который выделяли из мышц вьюнов, адаптированных к низким ("холодный" фермент) и высоким ("теплый" фермент) температурам.

Минимум К„ для "холодного" фермента находился при 9°С, а для "теплого" /фермента - при 17°С, что совпадает с данными, полученными на мышечных экстрактах (рис. 5Б).

Для выяснения природы кинетических изменений ЛДГ, индуцируемых низкими и высокими температурами, важным представлялся вопрос о скорости данных изменений. Вьюнов, которые в течение нескольких месяцев содержались при 5°С, помещали в среду с температурой 18°С и через каждые 3 суток определяли температурную зависимость Кц. Перестройка кинетических свойств фермента на новую температуру среды (18°С) заканчивалась только к 15 суткам и температурный минимум К„ к этому времени соответствовал 17°С. Различия кинетических свойств ЛДГ при температурной акклимации рыб могут быть связаны с появлением новых изоформ данного фермента, как это было установлено для ацетилхолинэстеразы из мозга карпа (Baldwin, Hochachka, 1970).

Для проверки этого предположения было проведено

сравнение изоферментного состава ЛДГ в различных тканях и *

органах (красных и белых скелетных мышцах, сердце,

0,6 0,4 0,2

0 5 10 15 20 Т,°С

Рис. 5. Температурная зависимость Км для ЛДГ в мышечных экстрактах (А), очищенного фермента (Б), реактивированного фермента после инактивации мочевиной (В) при адаптации к 5°С (•) и 18°С (о).

гепатопанкреасе и яичниках) вьюнов, акклимированных к 5 и 18°С. Для каждого органа или ткани характерен свой изоферментный спектр ЛДГ, однако при адаптации рыб к низким и высоким температурам эти спектры не меняются.

Сходные результаты были получены при сравнении изоферментных спектров ЛДГ из красных и белых скелетных мышц и гепатопанкреаса карпов, акклимированных к низким и

высоким температурам. Таким образом, различия в кинетических характеристиках ЛДГ из мышц рыб, акклимированных к низким и высоким температурам, не связаны с изменениями изоферментных спектров.

Для выяснения механизмов отличий ЛДГ из мышц рыб, акклимированных к низким и высоким температурам, был проведен анализ некоторых функциональных и структурных особенностей двух форм фермента.

Оптимим рН. Изучение активности фермента в зависимости от рН показало, что для двух сравниваемых образцов ЛДГ оптимум рН одинаков и равен 7,2. Однако, фермент, выделенный из мышц рыб, акклимированных к низким температурам, обладает большей устойчивостью в области кислых значений рН (от 5 до 6.2).

Термоинактивация. Изучение процесса термоинактивации проводилось в трех направлениях. Во-первых, определяли температурный оптимум реакции путем измерения ферментативной активности при разных температурах инкубации. Во-вторых, уровень активности фермента определяли после нагрева образцов в течение 30 мин, затем охлаждения до 20°С и последующего определения активности. Наконец, анализировали • кинетику термоинактивации путем прогревания фермента при различных температурах и определения активности через разное время экспозиции. В сумме эти три подхода позволяют достаточно полно охарактеризовать процесс термоинактивации двух форм ЛДГ.

Оказалось, что температурный минимум двух форм фермента не отличается и соответствует 40-42°С, что не является неожиданным, поскольку различия в термостабильности гомологичных белков выявляются обычно у организмов, обитающих в разных тепературных условиях в природе (Александров, 1975). Характер термоинактивации также определяли путем 30-минутного прогрева образцов в интервале температур от 50 до 72°С, последующего охлаждения до 20°С и определения ферментативной активности при 20°С. В интервале температур от 50 до 60°С активность и "холодного", и "теплого" вариантов ЛДГ не менялась. Начиная с 62 до 66°С, отмечено снижение .активности, одинаковое для обоих образцов ЛДГ. Однако, при дальнейшем

повышении температуры (68-72°С) характер инактивации этих двух форм фермента существенно отличается. Активность "теплого" фермента резко снижается в данном температурном интервале. Напротив, "холодный" фермент в указанном интервале обладает более высокой термостабильно.стью. Температура, при которой происходит снижение активности на 50% (Т50), для "теплого" фермента равна 67°С, а для "холодного" - 70°С.

При изучении кинетики термоинактивации. ЛДГ из скелетных мышц вьюнов, акклимированных к 5°С и к 18°С, были выявлены определенные отличия. Для всех исследованных температур инактивации (66, 68, 70, 72°С) эти два препарата фермента отличаются степенью устойчивости к нагреванию. "Холодный" фермент обладает более высокой термоустойчивостью по сравнению с "теплым". Процесс термоинактивации ЛДГ имеет двухфазный характер: первая быстрая (предстационарная) фаза, соответствующая, как предполагается (Диксон, Уэбб, 1982), диссоциации фермента на субъединицы, и вторая медленная (стационарная) фаза, соответствующая денатурации субъединиц. Процесс термоинактивации фермента характеризовали константой инактивации кин (табл. 1.).

Таблица 1.

Константы инактивации (кин * 102) для "холодной" и "теплой" форм ЛДГ из скелетных мышц вьюна.

Форма ЛДГ 66°С 68°С 70°С 72°С

"Холодный" фермент 0 1,01±0,07 1,10±0,04 7Д9±0,40

"Теплый" фермент 0,30±0,03 1,42±0,03 2,72±0Д1 9,10±0,60

Как видно из табл. 1, величина кин для "теплого" фермента выше по сравнению с "холодным" ферментом, т.е. последний более стабилен при всех изученных температурах.

Энергия активации реакции. Была определена зависимость максимальной скорости реакции 'Утах от температуры в Аррениусовских координатах и рассчитана энергия активации (Еа) процесса для "холодного" и "теплого" ферментов. В использованном интервале температур (от 3 до 28°С)

Аррениусовские кривые (1п от 1/Т) были линейными, что

свидетельствует об отсутствии конформационных переходов в молекуле фермента в данном температурном интервале. Энергия активации (Еа) остается постоянной и одинаковой для обеих форм ЛДГ. Для "холодного" и "теплого" ферментов Еа равна 11,33 ккал/моль и 11,78 ккал/моль соответственно.

Инактивация мочевиной. Для анализа структурных различий двух форм ЛДГ из мышц рыб использовали мочевину. Была исследована зависимость активности фермента от концентрации мочевины. При изменении концентрации мочевины от 1 до 6 М происходило постепенное снижение активности ЛДГ и в 6 М мочевине фермент инактивировался на 80-90%. Однако "холодный" фермент обладал большей устойчивостью к действию мочевины по сравнению с "теплым". Концентрация денатурирующего агента, при которой активность фермента снижается на 50% (С50), для "холодного" фермента составляла 3,75 М, а для "теплого" - 3,25 М.

Собственная Флиоресценция ЛДГ. Изучение собственной флуоресценции белков дает важную информацию об особенностях их структуры. Спектры собственной флуоресценци нативных "холодного" и "теплого" ферментов не отличаются, однако при воздействи мочевины "холодная" форма ЛДГ проявляет более высокую стабильность по сравнению с "теплой" (рис. 6). Денатурация как "холодного", так и "теплого" белков происходила в одну стадию. Однако, при концентрации мочевины 5,5 М "теплый" вариант ЛДГ был полностью денатурирован, в то время как примерно 10% "холодного" находилось в неразвернутом состоянии. Эти данные свидетельствуют о большей стабильности "холодного" варианта ЛДГ к воздействию денатуранта по сравнению с "теплым".

Ренатцрация ЛДГ. Какого типа отличия в молекуле ЛДГ вызывает адаптация рыб к низким и высоким температурам и насколько глубоки эти отличия? Для ответа на эти вопросы образцы "холодного" и "теплого" ферментов, отличающиеся, как отмечалось выше, положением температурного минимума Кц, подвергали инактивации 3 М мочевиной (при этой концентрации ее воздействие полностью обратимо) и затем проводили реактивацию сравниваемых типов ЛДГ. Оказалось,

I 1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 С, М

Рис. 6. Зависимость интенсивности собственной флуоресценции ЛДГ (J) от концентрации мочевины (С). Фермент из скелетных мышц вьюнов, адаптированных к 5°С (•) и к 18°С (о).

что после реактивации различия в положении' температурного минимума Км между "холодным" и "теплым" ферментами исчезали. Оба образца ЛДГ приобретали новый температурный • минимум Км в районе 15°С, одинаковый для "холодного" и "теплого" ферментов (рис. 5В). Следует отметить, что новый минимум Км расположен ближе к исходному минимуму, характерному для "теплого" фермента.

Таким образом, 3 М мочевина "разрушила" вызванные температурой изменения в "холодном" и "теплом" ферментах, а реактивация привела к восстановлению активности ЛДГ, уже лишенной индуцированных изменений структуры. Поскольку мочевина воздействует на водородные связи (Hermans, 1966), гидрофобные взаимодействия (Wetlaufer, 1964) и гидратную оболочку молекул белка (Finer et al„ 1972), можно предполагать, что вызванные температурой отличия между "холодным" и "теплым" ферментами обусловлены этми связями и взаимодействиями.

i ° .

оо ,

ВЫВОДЫ

1. Установлены различия температурных минимумов К„ для пирувата у ЛДГ из незрелых ооцитов вьюнов, акклимированных в течение 20 суток к 5°С и 18°С. В первом случае температурный минимум наблюдается при 5°С, а во втором -при 14 °С. Эти различия формируются после 10 - 15 суток температурной акклимации рыб. Изоферментные спектры ЛДГ из ооцитов при температурной акклимации не меняются.

2. Сдвиг положения минимума К^ для ЛДГ наблюдается при созревании ооцитов вьюна в течение 40 час. В незрелых ооцитах минимум Км отмечен при 5°С, тогда как в зрелых ооцитах - при 11°С. Изоферментные спектры ЛДГ в этот период не меняются.

3. Во время созревания ооцитов изменяется оптимум рН для ЛДГ. В незрелых ооцитах оптимум рН для данного фермента равен 8,0, а в зрелых- яйцеклетках - 7,7.

4. При инкубации зародышей вьюнов при 11°С и 21°С, которая продолжалась до периода вылупления и составляла 9 и 2 суток соответственно, положение температурного минимума К„ не менялось и оставалось при 12°С. ■

5. При акклимации рыб (вьюнов и карпов) к низким (5°С) и к высоким (18°С) температурам меняются кинетические и структурные свойства лактатдегидрогеназы из различных органов и тканей. Положение минимума К„ для пирувата у ЛДГ соответствует температуре акклимации. Это характерно как для экстрактов из мышц рыб, так и для очищенного фермента. Изоферментные спектры ЛДГ из скелетных мышц и гепатопанкреаса при температурной акклимации не меняются.

6. ЛДГ из скелетных мышц вьюнов, адаптированных к низким температурам ("холодный" фермент), обладает большей термостабильностью и устойчивостью к действию мочевины по сравнению с ферментом из мышц рыб, адаптированных к высоким температурам ("теплый" фермент).

7. Спектры собственной флуоресценции для обеих форм ЛДГ не отличаются. Однако, денатурация образцов ЛДГ мочевиной протекает различно. "Холодный" фермент более устойчив к действию мочевины, чем "теплый" и начало кооперативного перехода у него происходит при более высоких концентрациях мочевины.

8. Кинетические различия между "холодной" и "теплой" ЛДГ исчезают в результате воздействия мочевиной и последующей реактивации. Предполагается, что различия между "холодным" и "теплым" вариантами ЛДГ вызваны конформационными отличиями, формирующимися во время синтеза фермента в разных температурных условиях.

Основные результаты диссертации опцбликованы в следующих работах:

1. Клячко О.С., Полосухина Е.С., Озернюк Н.Д'. Функциональные отличия лактатдегидрогеназы из мышц рыб, адаптированных к разным температурам среды. Докл. РАН, 1992, т.325, № 6, с. 1246-1251.

2. Клячко О.С., Полосухина Е.С., Озернюк Н.Д. Различия изоферментных спектров лактатдегидрогеназы в белой и красной скелетной мускулатуре рыб. Докл. РАН, 1993, т. 330, № 1, с. 113-115.

3. Клячко О.С., Полосухина Е.С., Озернюк Н.Д. Температура вызывает структурные и функциональные изменения лактатдегидрогеназы из скелетных мышц рыб. Биофизика, 1993, т. 38, № 2, с. 596-601.

4. Ozernyuk N.D., Klyachko O.S., Polosukhina E.S. Acclimation temperature affects the functional and structural properties of lactate dehydrogenase from fish (Misgurnus fossilis) skeletal muscles. Сотр. Biochem. Physiol., 1994, vol. 107B, p. 141-145.

5. Клячко O.C., Полосухина E.C., Озернюк Н.Д. Влияние температуры и хорионического гонадотропина на кинетические свойства лактатдегидрогеназы из ооцитов вьюна. Докл. РАН, 1994, т.339, № 2, с. 104-107.

6. Озернюк Н.Д., Клячко О.С., Полосухина Е.С., Ермолаева Л.П., Овсянникова О.Е. Температурные адаптации метаболизма у пойкилотермных животных на разных этапах онтогенеза на примере ферментов углеводного обмена. Известия РАН, сер. биол., 1994, № 4, с. 519-527.

7. Клячко О.С., Полосухина Е.С., Булычев А.А., Озернюк Н.Д., Роль рН в изменении функциональных свойств лактатдегидрогеназы во время созревания ооцитов рыб. Биофизика, 1994, т.39, № 4, с. 594-598.

8. Ozernyuk N.D., Klyachko O.S., Polosukhina E.S. The effects of temperature and chorionic gonadotropin on the functional properties of lactate dehydrogenase from oocytes of loach Misgurnis fossilis. Сотр. Biochem. Physiol, (in press).

9. Клячко O.C., Полосухина E.C., Персиков A.B., Озернюк Н.Д. Кинетические различия лактатдегидрогеназы из мышц рыб при температурной адаптации. Биофизика (в печати).