Активность и экспрессия генов некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена и размерно-весовые характеристики рыб семейств лососевые (Salmonidae) и сиговые (Coregonidae)

Чурова, Мария Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активность и экспрессия генов некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена и размерно-весовые характеристики рыб семейств лососевые (Salmonidae) и сиговые (Coregonidae)
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активность и экспрессия генов некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена и размерно-весовые характеристики рыб семейств лососевые (Salmonidae) и сиговые (Coregonidae)"

На правах рукописи

005015482

ЧУРОВА Мария Викторовна

АКТИВНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА И РАЗМЕРНО-ВЕСОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЫБ СЕМЕЙСТВ ЛОСОСЕВЫЕ (БАЬМОМВАЕ) И СИГОВЫЕ (СОЯЕЄОМВАЕ)

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 [.]*? 20(2

Петрозаводск 2012

005015482

Работа выполнена в лаборатории экологической биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии Карельского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Немова Нина Николаевна

Официальные оппоненты:

Шпаков Александр Олегович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии

Андреева Алла Михайловна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, заведующая Центром коллективного пользования «Молекулярные технологии» ИБВВ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится 15 марта 2012 года в 15.00 на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.087.02 при Карельской государственной педагогической академии по адресу: 185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельской государственной педагогической академии (185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17).

Автореферат разослан февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Важнейшим метаболическим фактором, определяющим функциональную активность клеток различных органов и, соответственно, процессы роста и развития рыб, является уровень энергетического обмена. Достаточный уровень образования АТФ определяет активный рост и развитие организма рыб, особенно в период раннего онтогенеза, когда требуются большие энергетические затраты на синтез структурных, функциональных и запасных соединений. Поэтому в исследованиях взаимосвязи биохимических параметров с размерными характеристиками рыб и темпами их роста большое внимание уделяется изучению активности и экспрессии генов ферментов энергетического обмена, участвующих в процессах аэробного и анаэробного синтеза АТФ. Исследование биохимических и молекулярно-генетических параметров энергетического метаболизма проводится главным образом в белых мышцах рыб, т.к. они составляют значительную часть тела (около 60% веса) и, таким образом, во многом определяют особенности метаболизма всего организма и отражают темны роста рыб (Goolish, Adelman 1987; Houlihan et al., 1993; Burness et al., 1999; Davies, Moyes, 2007; Savoie et al., 2008). Кроме того, активность ферментов гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи митохондрий, наряду с молекулярно-генетическими показателями - индексом РНК/ДНК и уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина, могут использоваться как индикаторы темпов роста и состояния рыб в исследованиях по изучению влияния различных условий на рост рыб. Например, эти показатели применяются при изучении влияния на рыб загрязнения окружающей среды, температуры, качества и количества пищи, паразитарной инвазии (Buckley et al., 1999; Overturf and Hardy, 2001; Imsland et al., 2006; Caldarone, 2006; Dhillon R. et al., 2008; Vinagre et al., 2008). Ряд работ в этом направлении посвящен также изучению механизмов регуляции активности ферментов у рыб разного размера, а именно исследованию взаимосвязи уровня экспрессии генов ферментов с активностью этих ферментов и массой тела (Yang, Somero, 1996; Burness et al., 1999; Davies, Moycs, 2007).

Рост рыб представляет собой сложный многофакторный процесс, определяющийся взаимодействием организма с абиотическими и биотическими факторами среды в процессе онтогенеза (Дгебуадзе, 1993, 2001; Павлов, 2010; Huss, 2009). В отличие от млекопитающих, рыбы растут в течение всей жизни. При этом особи одной когорты могут значительно отличаться размерами в зависимости от соотношения генетической и негенетической составляющих процесса их роста и влияния различных факторов среды. В связи с этим, линейные и весовые показатели, характеризующие размер особи, являются одними из наиболее изменчивых характеристик организма

рыб. Изучение биохимических и молекулярно-генетических закономерностей и механизмов формирования изменчивости и дифференциации рыб по размерам позволит значительно расширить представления об особенностях процесса роста у рыб и способов его регуляции в различные периоды онтогенеза, на разных стадиях жизненного цикла и при влиянии экологических условий. Несмотря на значительное число работ в этой области, ряд вопросов остается неизученным. Так, недостаточно данных по оценке взаимосвязи процессов энергетического и пластического обмена в мышцах и печени с размерами (длиной и массой рыб). Не исследован характер взаимосвязи показателей друг с другом, возрастные и половые особенности этой зависимости, влияние антропогенного фактора. Таким образом, исследование особенностей и механизмов роста рыб и формирования размерной изменчивости на биохимическом уровне является одним из важных вопросов биохимии и физиологии рыб, популяционной биологии, экологии.

Цель работы - исследовать взаимосвязь между активностью ферментов энергетического и углеводного обмена белых мышц и печени, уровнем экспрессии ряда генов в белых мышцах и размерно-весовыми характеристиками рыб некоторых видов семейств Лососевые Баїтопісіае и Сиговые Соге^опЫае.

Задачи исследования;

1. Изучить взаимосвязь между активностью ферментов цитохром с окси-дазы (ЦО), лакгатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ), альдолазы в мышцах и печени, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина (МуНС), показателем РНК/ДНК в мышцах и размерно-весовыми характеристиками особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой радужной форели.

2. Изучить возрастные и половые особенности взаимосвязи данных показателей с размерно-весовыми характеристиками рыб.

3. Сравнить характер взаимосвязи исследуемых показателей с размерно-весовыми характеристиками сигов, обитающих в водоемах с различной антропогенной нагрузкой.

4. Изучить взаимосвязь между уровнем экспрессии генов лактатде-гидрогеназы субъединицы А (ЮН-А), цитохром с оксидазы субъединиц I и IV (СОХ1 и СОХ4) и активностью этих ферментов в мышцах у рыб разных размеров.

Положения, выносимые на защиту:

І. Активность исследуемых ферментов энергетического и углеводного обмена, уровень экспрессии генов ферментов и тяжелой цепи миозина в белых мышцах и печени рыб изучаемых видов положительно коррелируют с длиной и массой их тела.

2. Изменение уровня экспрессии генов цитохром с оксидазы и лактатде-гидрогеназы является одним из возможных механизмов регуляции активности этих ферментов при формировании размерного разнообразия рыб.

Научная новнзна. Получены новые данные о взаимосвязи активности некоторых ферментов углеводного и энергетического обмена мышц и печени, уровня экспрессии генов МуНС, COXI, СОХ4, LDH-A и показателя РНК/ДНК мышц и печени с длиной и массой особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой форели, с учетом возраста и пола. Впервые проведено комплексное исследование взаимосвязи изучаемых показателей с массой и длиной сигов и при влиянии антропогенного фактора. Впервые определена взаимосвязь между уровнем экспрессии генов двух субъединиц цитохром с оксидазы и активностью этого фермента у рыб разных по размеру.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты и сделанные на их основании выводы расширяют существующие представления о биохимических и молекулярных механизмах и закономерностях процесса роста у рыб с учетом видового, возрастного, полового и экологического аспектов. Знание особенностей процесса роста рыб может служить основой для разработки точных, удобных физиолого-биохимиче-ских индикаторов роста рыб и оценки состояния их здоровья, что может быть использовано в мониторинговых исследованиях, определении ресурсного потенциала водоемов и развитии новых технологий аквакультуры. Результаты исследования могут быть использованы для разработки лекционных курсов по физиологии и биохимии рыб, экологической биохимии и эн-зимологни для студентов биологических факультетов ВУЗов.

ученых ФГУП «ВНИРО» «Современные проблемы и перспективы изучения мирового океана» (Москва, 2011); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), Научной конференции и школе молодых ученых, посвященных 65-летию КарНЦ РАН «Фундаментальная и прикладная наука в Республике Карелия: современное состояние и перспективы развития» (Петрозаводск, 2011); Молодежном инновационном конкурсе "МИК - 2011" (Петрозаводск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 9 статей в других изданиях и 8 тезисов докладов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 62 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 235 источников, в том числе 186 работ зарубежных авторов.

Благодарности. Автор искренне благодарна научному руководителю член.-корр. РАН H.H. Немовой и научному консультанту к.б.н. О.В. Мещеряковой, сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации, а также О.П. Стерлиговой, Н.В. Ильмасту и сотрудникам лаборатории экологии рыб ИБ КарНЦ РАН за помощь при получении биологического материала и консультации. Автор выражает огромную благодарность сотрудникам группы молекулярной биологии ИБ КарНЦ РАН JI.B. Топчиевой и лаборатории популяционной биологии ФГУП «ВНИРО» Н.С. Мюге за консультации по методам молекулярно-генетических исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 08-04-01140-а, 11-04-00167-а), программы Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-306.2008.4, НШ-3731.2010.4, НШ-1642.2012.4, проекта программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга», 2009-2011 г. (per. № 01200955241), гранта Правительства РФ (Постановление 220, ГК №11.634.31.0052, лаборатория молекулярной генетики врожденного иммунитета ПетрГУ, зав. лабораторией А.Н. Полторак).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава i. Обзор литературы

В обзоре литературы рассматривается роль аэробного и анаэробного энергетического обмена в процессах роста и развития рыб. Обобщены данные по взаимосвязи активности ферментов энергетического и углеводного

обмена в органах рыб с темпами роста и размерами особей. Приведены сведения о регуляции активности ферментов на уровне транскрипции их генов при формировании размерного разнообразия. Представлены данные о молекулярно-генетических показателях, использующихся в оценке темпов роста рыб. Рассмотрены особенности роста рыб и механизмы формирования размерной изменчивости.

Глава 2. Материал и методы исследования Материал исследования. В качестве объектов исследования были выбраны рыбы разных возрастных групп четырёх видов двух семейств Сиговые (Coregonidae) и Лососёвые (Salmonidae): естественных популяций, атлантический лосось Salmo salar L., обыкновенный сиг Coregonus lavareus L., ряпушка Coregonus albula L., а также искусственно выращиваемая радужная форель Parasalmo mykiss Walb. В зависимости от задач количество экземпляров в одной возрастной группе составило от 7 до 30.

Определение активности исследуемых ферментов. Активность ферментов определяли в белых мышцах и печени рыб. Ткань гомогенизировали в 0,01 М трис-HCl буферном растворе (pH 7,5). Общую активность ферментов лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27), малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49), 1-глицерофосфат-дегидроге-назы (КФ 1.1.1.8) определяли по общепринятым методам (Кочетов, 1980). Активность альдолазы (КФ 4.1.2.13) определяли по методике Beck в модификации Ананьева и Обуховой (Колб, Камышников, 1976). Активность указанных ферментов выражали в мкмоль субстрата/мин/г ткани. Активность цитохром с оксидазы (КФ 1.9.3.1.) в мышцах и печени определяли по методу Смита (Smith, 1955). Активность ЦО выражали в к/г ткани, где к - константа реакции 1-го порядка. Содержание белка в тканях определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта БСА.

Определение концентрации нуклеиновых кислот. Тотальную РНК выделяли из белых мышц по Хомчински и Саччи (Chomczynski, Sacchi, 1987) с помощью набора «для выделения тотальной РНК Yellow Solve» (Клоноген, С.-Петербург). ДНК белых мышц выделяли по методу Альа-наби и Мартинеса (Aljanabi, Martinez, 1997). Концентрации РНК и ДНК определяли спектрофотометрически (спектрофотометр "SmartSpec Plus", BioRad, США) (Маниатис и др, 1984).

Проведение полимеразпой цепной реакции в режиме реального времени. Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) (Силекс, Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из препарата тотальной РНК с использованием MMLV-обратной транскриптазы и случайных гексонуклеотидов (набор «Синтез первой цепи ДНК», Силекс). Амплифи-

кацию проводили на приборе i-Cycler с оптической приставкой IQ5 (BioRad) с использованием реакционной смеси 2.5 х для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Синтол, Россия). Праймеры к нуклеотидным последовательностям генов тяжелой цепи миозина (МуНС), цитохром с оксидазы субъединицы IV (СОХ4) и субъединицы I (СОХ1), лактатдегидрогеназы субъединицы А (LDH-A) и референсных генов фактора элонгации {EF-1) и ß-actin подбирали с помощью программы Beacon Designer 5.01 («Premier Biosoft», США). Концентрацию матричной РНК в виде кДНК определяли по стандартной кривой (Gahr et al., 2008). Данные выражались как отношение концентрации мРНК исследуемого гена к концентрации мРНК референсного гена.

Секвенирование. Для подтверждения того, что продукты амплификации кДНК являются фрагментами исследуемых генов, проводили секвенирование. Реакцию секвенирования ПЦР-продуктов выполняли с использованием наборов реагентов GenomLabTM DTCS-Quick Start Kit (Beckman Coulter, Inc., США) и BigDye version 1.1 (Applied Biosystems, США). Продукты реакции секвенирования очищали от невключенных нуклеотидов с флуорофорами путем осаждения 96% этанолом. Разделение синтезированных фрагментов проводили методом автоматического капиллярного электрофореза в генетическом анализаторе Beckman Coulter CEQTM 8000 (Beckman Coulter, Inc, США) и ABI 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США) на базе ИБ КарНЦ РАН и ВНИРО. Для редактирования полученных последовательностей использовали программу ChromasPro (http://v\'ww.tcchnelysium.com.au/CliiomasPro.htirf). Полученные последовательности нуклеотидов сравнивали с базой данных NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Гомология полученных фрагментов с последовательностью генов из генетического банка была не ниже 96%.

Статистическая обработка данных. В работе использовали общепринятые методы статистической обработки данных с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics 2.5 for Windows. Сравнение выборок проводили с применением непараметрического критерия Вил-коксона-Манна-Уитни. Степень влияния исследуемых факторов оценивали при помощи многофакторного дисперсионного анализа MANOVA. Взаимосвязь исследуемых показателей с размерами особей и между собой оценивали при помощи линейной регрессии и корреляционного анализа (Коросов, Горбач, 2007).

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение

1. Общие закономерности взаимосвязи исследуемых биохимических и молекулярно-генетических показателей с длиной и массой особей изучаемых видов рыб

По результатам анализа взаимосвязи между исследуемыми показателями мышц и печени и размерно-весовыми характеристиками особей рыб разного возраста, выловленных в летний нагульный период, были установлены некоторые общие тенденции. Установлена положительная корреляция активности ферментов мышц аэробного обмена - ЦО и анаэробного обмена - ЛДГ с длиной и массой особей внутри одновозрастных групп рыб из естественных водоемов: молоди лосося, сига и ряпушки (табл. 1). Аналогичная закономерность была показана и для искусственно выращиваемой форели. Положительная связь активности этих ферментов с размерами рыб объясняется необходимостью поддержания высокого уровня аэробного и анаэробного энергетического обмена для обеспечения необходимым количеством АТФ основных процессов жизнедеятельности, в том числе процессов синтеза структурных, функциональных и запасных соединений в мышцах, которые интенсивно протекают у активно растущих особей, особенно в раннем онтогенезе (Houlihan et al., 1995; Savoie et al., 2008; Gauthier et al., 2008). Установлена положительная корреляция массы рыб с активностью МДГ - фермента цикла трикарбоновых кислот, а также активностью альдолазы, характеризующей степень использования углеводов в гликолизе. Полученные результаты указывают на то, что более крупные особи имеют более высокие уровень аэробного и анаэробного обмена и степень использования углеводов в процессах энергетического метаболизма в мышцах рыб.

Таблица 1

Корреляция активности ЦО (к/г) и ЛДГ (мкмоль субстрата/мин/г) мышц с длиной (АС) и массой особей у разных возрастных групп рыб

Вид Возра ст Активность ЦО, М±т (АС) г (масса) Активность ЛДГ, М±т (АС) г (масса)

Лосось 0+ 1,21 ±0,03 0,56* 0,55* 98,8 ±12,03 0,73* 0,67*

1+ 1,88 ±0,08** 0,60* 0,62* 120,4 ±5,51** 0,58* 0,53*

2+ 1,02 ±0,06** 0,69* 0,70* 132,2 ±3,05** 0,79* 0,84*

Сиги 2+ 1,55 ±0,09 0,86* 0,75* 126,5 ± 10,06 0,51* 0,79*

3+ 1,61 ±0,05 0,71* 0,73* 133,2 ±4,51 0,46* 0,78*

Ряпушка 1+ 2,12 ±0,08 0,84* 0,75* 453,2 ± 11,8 0,68* 0,73*

2+ 1,83 ±0,09** 0,74* 0,65* 345,1 ±21,2** 0,50* 0,65*

3+ 1,91 ±0,07 0,44* 0,41 318 ± 19,1 0,31 0,40*

Форель 1+ 2,16 ±0,05 0,65* 0,78* 312,8± 12,1 0,45* 0,69*

2+ 1,82 ±0,04** 0,52* 0,51* 369,1 ± 12,6** 0,53* 0,64*

* - достоверные значения коэффициента корреляции при р < 0,05 ** - различия между возрастными группами достоверны при р < 0,05

X в

£ CU

(0+) y =4,4831-0,167

R2 - 0,54, p< 0,01 О *дл

' (1+) У

1,447* -2,077

R2 *=0,30,p < 0,01 (2+)y -0,197* -0,274 R2 * 0,59, p< 0,01 D i

¡T й.

tjO.6

I й0'3

4 б О 0+ А 1+ О 2+

(2+) у = 0,00бх - 0,097 R2 =0,68, р < 0,01

10 масса, г

(Э+)у-0,015*-0,70 R2 - 0,84, р< 0,01

«2+ А 3+

100 120 масса, г

1-1.5

0,5

Для всех исследуемых ВИДОВ рыб внутри каждой возрастной группы уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина (МуНС) в белых мышцах возрастал с увеличением массы и длины тела (рис. 1). Миозин является одним из основных белков в мышце и составляет 50% от количества всех мышечных белков (Wa-tabe, Ikeda, 2006). Согласно ряду исследовательских работ уровень экспрессии гена МуНС коррелирует с темпами роста радужной форели Oncorhynchus mykiss (Overturf, Hardy, 2001), атлантического лосося Salmo salar (Hevroy et al., 2006), некоторых других видов рыб (Imsland et al., 2006; Dhillon R. et al, 2008) и используется как показатель, отражающий темпы прироста мышечной массы и темпы роста рыб в целом. Таким образом, согласно результатам данного исследования более крупные особи отличаются высокими темпами прироста мышечной массы. Следует также отметить, что у исследованных видов рыб уровень экспрессии МуНС положительно коррелировал с активностью ЛДГ. Это указывает на то, что высокая активность ДЦГ у более крупных особей согласуется с высокими темпами прироста их мышечной массы.

В печени значения коэффициентов корреляции активности ЦО с массой одновозрастных рыб составили для лосося возраста 1+ и 2+: 0,46 и 0,52; для сига 2+ и 3+: 0,69 и 0,85; ряпушки 1+, 2+, 3+: 0,78, 0,56 и 0,86, соответственно (р<0,05). Вероятно, рыбы большие по размерам имеют более высокий уровень процессов аэробного обмена в связи с большими энергетическими затратами на поддержание функциональной активности печени на необходимом уровне.

Отмечены высокие значения положительной корреляции между активностью ферментов печени 1-ГФДГ, Г-6-ФДГ и длиной и массой осо-

(1+) у =0,0012* + 0,351 * R2 - 0,53, р< 0,05

/д &

А Д

'_(2+)у = 0,0007х-0,070 • 0,62, р< 0,05

500

1000 1500 « 1+ А 2+

2000 2500 масса, г

Рис. 1. Зависимость уровня экспрессии гена МуНС в белых мышцах от массы тела у лосося (А), сига (Б), форели (В)

Условные обозначения: - зависимость достоверна при р<0,05;-----зависимость недостоверна

бей лосося, сига, ряпушки, форели (табл. 2). Указанные ферменты печени играют важную роль в процессах пластического обмена, синтезе структурных и запасных липидов. Более высокая активность данных ферментов у крупных особей указывает на более высокий уровень синтеза глицерофосфата из углеводов (Harmon, Sheridan, 1992), который может использоваться для синтеза структурных и запасных липидов, и более высокий уровень окисления углеводов в пентозо-фосфатном пути, в результате которого происходит образование пентоз и генерируется восстановитель в форме НАДфН для реакций биосинтеза (Gauthier et al., 2008). Таким образом, отмеченная положительная корреляция активности ферментов 1-ГФДГ и Г-6-ФДГ с размерно-весовыми характеристиками особей, возможно, косвенно свидетельствует о более высоком уровне использования углеводов в реакциях биосинтеза, в том числе в реакциях синтеза запасных и структурных липидов.

Таблица 2

Корреляция активности Г-6-ФДГ и 1-ГФДГ в печени (мкмоль субстрата/мин/г) с длиной (АС) и массой особей у разных возрастных групп рыб

Вид Возраст Активность Г-6-ФДГ M ±m г (АС) г (масса) Активность 1-ГФДГ M ± m г (АС) г (масса)

Лосось 1 + 16,7 ± 1,3 0,74* 0,73* 71,1 ±2,2 0,72* 0,73*

2+ 14,1 ± 1,3 0,67* 0,74* 39,2 ±3,11** 0,62* 0,75*

Сиги 2+ 9,8 ± 0,9 0,75* 0,82* 17,5 ± 1,1 0,82* 0,64*

3+ 11,4 ± 1,1 0,65* 0,89* 36,2 ±5,2** 0,77* 0,89*

Ряпушка 1+ 10,9 ±0,5 0,55* 0,69* 45,5 ±2,21 0,50* 0,64*

2+ 13,1 ±0,9*» 0,59* 0,73* 56,2 ±2,3** 0,53* 0,65*

3+ 15,5 ±0,8** 0,59* 0,78* 69,1 ±2,2** 0,54 0,69*

Форель 1 + 12,1 ±0,9 0,53* 0,87* 56,8 ± 2,6 0,49* 0,54*

2+ 14,6 ± 1,2** 0,34 0,93* 69,3 ±2,1** 0,41 0,75*

2. Возрастные особенности взаимосвязи биохимических и молеку-лярно-генетических показателен с длиной и массой рыб

Доя большинства исследуемых видов рыб активность ЦО мышц с возрастом снижалась, что связано с общей закономерностью снижения уровня аэробного обмена, потребления кислорода, и, в целом, уровня стандартного обмена в онтогенезе (Озернюк, 1985; Hinterleitner et al.; 1987, Goolish, 1995). Общей тенденции изменення активности ДЦГ с возрастом у исследованных видов рыб не обнаружено (табл. 1), что, вероятно, является следствием видовых осо-

0,5

(0+)у«0391х+0,497 А

R3 = 0,21,p<0,05

(1+)у » 0,129х + 0,558 R'- 032, р <0,01

0 А

A(2+)y=--0,044x + fto8 R3=0,15

4 6 О0+ Al+ □ 2+

10 масса, г

A (3+)у = 0,007х+0,314 R3 =0,38, р <0,05

(2+) у = -0,020х +1,871 R3 = 0,27

100 120

масса, г

2>3 rn+iv-л-WW +п л<п А бенностей, в том числе, различием

образа жизни и физической активности. При этом возрастные вариации активности ЛДГ коррелировали с изменением активности альдолазы. Это указывало на то, что изменение в степени использования углеводов с возрастом скорее всего связано с изменением уровня анаэробного обмена в мышцах.

Несмотря на существующие возрастные изменения в активности ферментов ЦО и ЛДГ, внутри всех возрастных групп взаимосвязь активности этих показателей с размерами особей была положительной (табл. 1). Это указывает на то, что в первые годы жизни независимо от возраста более крупные особи характеризуются более высоким уровнем энергетического метаболизма.

Известно, что индекс РНК/ДНК отражает уровень синтеза белков в клетке (Buckley, 1984). Ранее было показано, что значение этого индекса положительно коррелирует с темпами роста лососевых (Varnavskiy et

al., 1991; Peragon, 2001) и других видов рыб (Vinagre, 2008). Согласно результатам нашего исследования характер взаимосвязи РНК/ДНК с размерами исследованных видов рыб различался в зависимости от вида и их возраста (рис. 2). Поскольку данный показатель отражает уровень синтеза всех белкой в клетке, то гложет значительно варьировать на разных стадиях онтогенеза, в зависимости от особенностей экологии вида и типа питания. Значение показателя также может зависеть от соотношения процессов гипертрофии и гиперплазии мышечных волокон (Peragon et al., 2001).

1,5

i¿ и

Pi 0,5

<l+)y =

R3 ■

♦

0 80 «2+ A 3+

'-0.0003X + 0,771 0,24, p< 0,03

■u

A A

A A *

(2+) у = 0,0001* +0,4995 R3 = 0,23

300

2000 2500 масса, r

1000 1500 «1+ А 2+

Рис. 2. Зависимость индекса РНК/ДНК в белых мышцах от массы тела у лосося (А), сига (Б), форели (В)

Условные обозначении: - зависимость

достоверна при р<0,05; ----- зависимость

недостоверна

С возрастом увеличивается активность ферментов 1-ГФДГ и Г-б-ФДГ, что было установлено как для естественных видов рыб - ряпушки, сигов, так и для искусственно выращиваемой форели (табл. 2). При этом активность этих ферментов в большей степени коррелировала с массой, чем с длиной, особенно в старших возрастных группах, что, возможно, связано с усилением процессов липогенеза с возрастом.

3. Половые различия во взаимосвязи между активностью ферментов энергетического и углеводного обмена, уровня экспрессии гена тяжелой цепи миозина, индексом РНК/ДНК и размерно-весовыми характеристиками рыб

При исследовании неполовозрелых особей сига (2+ и 3+) различий в характере взаимосвязи изучаемых показателей с длиной и массой особей между самцами и самками выявлено не было. У половозрелых особей сига (возраст 4+ и 5+) наблюдалось изменение характера и степени взаимосвязи исследуемых показателей с длиной и массой особей. Так, например, обнаруженная у неполовозрелых сигов взаимосвязь уровня экспрессии гена тяжелой цепи миозина и индекса РНК/ДНК с длиной и массой особей (рис. 1Б), у половозрелых рыб, как самцов, так и самок отсутствовала. Это вероятно связано с тем, что на поздних стадиях созревания гонад и преднерестовый период процессы роста замедляются, что непосредственно связано с большими энергетическими затратами на синтез половых продуктов (Решетников, 1980, Шатуновский, 2001). Кроме того, в характере взаимосвязи показателей с размерами особей возникают различия между самцами и самками. Для самцов установлена положительная взаимосвязь активности ЦО мышц только с длиной (г=0,59, р<0,05). У самок взаимосвязь ЦО с длиной особей не показана, а с массой была отрицательной (рис. 3 А). В печени сига корреляция активности ЦО с массой особей была положительной для самцов и отрицательной для самок (рис. 3 Б). Таким образом, можно заключить, что крупные половозрелые самки имеют более низкий уровень аэробного обмена в энергообеспечении печени и мышц, что, вероятно, связано с большими энергетическими затратами на генеративный обмен. Для ферментов печени 1-ГФДГ и Г-6ФДГ установлены различия между самцами и самками в степени взаимосвязи этих показателей с размерами особей. Так, положительная связь активности 1-ГФДГ с массой особей установлена только для самцов (г=0,79, р<0,05). Для самок, в отличие от самцов, показана положительная корреляция Г-б-ФДГ с массой (г=0,92, р<0,05). Таким образом, изменение в характере взаимосвязи исследуемых показателей с размерами рыб при наступлении половой зрелости, а также различия в этой взаи-

мосвязи между самцами и самками связаны со специфичным изменением интенсивности и направления путей энергетического и углеводного метаболизма в период созревания гонад и нерестовый период.

ЕА

(с?)У=°0,021х-1,11О R2 =0,50,р <0,05 Д ^

($)У«-0,007х+7,331 К?-0,47,р<0,05

250

3QQ

350

400

Рис. 3. Зависимость активности ЦО мышц (А) и печени (Б) от массы тела половозрелых самцов и самок сига возраста 5+

Условные обозначения:--зависимость достоверна при р<0,05;------зависимость

недостоверна; ЕА - единицы активности фермента

4. Сравнение исследуемых показателей и оценка их взаимосвязи с длиной и весом особей сига, обитающих в чистом озере и антропогенно-трансформированном водоеме

Сравнивали сигов, обитающих в чистом озере Каменное и озере Косто-мукшское (Республика Карелия), преобразованном в технологический водоём Костомукшского горно-обогатительного комбината (хвостохранилище). Водоём служит для захоронения отходов производства (хвостов обогащения, которые в виде пульпы поступают в водоём) и оборотного водоснабжения. Вода в озере характеризуется высоким содержанием ионов К*, Na+, Са+, S042", НСОЗ, высокой минерализацией (до 645 г/мл), высоким значением рН (около 8,4), большим количеством мелкодисперсной минеральной взвеси (1,34 мг/л) (Состояние природных вод...2007). В белых мышцах сига из хвостохранили-ща отмечалась более низкая активность ЦО и более высокая активность ЛДГ по сравнению с сигами из оз. Каменное (рис, 4), что указывало на низкий уровень аэробного энергетического обмена и высокий уровень анаэробного процесса синтеза АТФ в этой ткани. Кроме того, у сигов из сравниваемых озер наблюдались различия в корреляции между активностью ЦО и активностью ЛДГ: у ста из чистого озера она была положительной (г=0,82, р<0,05), а у сига из хвостохранилища- отрицательной (г=-0,71, р<0,05). Это свидетельствовало о том, что в норме аэробный и анаэробный пути синтеза АТф функционируют одкокапразленно, а в неблагоприятных условиях снижение интенсивности аэробного метаболизма частично компенсируется увеличением уровня анаэробного (Richards, 2009). Активность альдолазы в мышцах сигов из озера Костомукшское была ниже по сравнению с сигами из относительно чистого

озера (рис. 4). При этом в мышцах сига из чистого водоема была отмечена положительная корреляция активности альдолазы с активностью ЦО и ЛДГ (гЦО=Ю,88, гЛДГ=0,82, р<0,05), а для сига из техногенного озера установлена взаимосвязь активности альдолазы только с активностью ЛДГ (гЛДГ=0,76, р<0,05). Это может свидетельствовать о том, что в мышцах сига из озера Кос-томукшское происходило перераспределение использования углеводов между аэробным и анаэробным энергетическим метаболизмом в сторону усиления их использования в анаэробном синтезе АТФ. Значение показателя РНК/ДНК в белых мышцах сигов, обитающих в хвостохранилище, составило 0,61+0,07, что было ниже по сравнению с таковым в мышцах рыб из чистого водоема 1,09±0,05 (р<0,05). Это указывает на снижение уровня синтеза белков, ухудшение состояния рыб и снижение темпов их роста (Mohapatra, Noble, 1992; Audet, Coature, 2003; Varo et al., 2007; Mankiewicz-Boczek et al., 2010). Эти выводы подтверждаются и данными по линейно-весовым характеристикам рыб, свидетельствующими о меньших размерах сигов из неблагоприятного водоема. При исследовании взаимосвязи исследуемых показателей с размерами сигов были установлены как общие тенденции, так и различия. В частности, для сигов из обоих озер была характерна положительная взаимосвязь активности ЦО, уровня экспрессии гена миозина и индекса РНК/ДНК белых мышц с размерами особей (рис. 5 А, Б, В). Таким образом, несмотря на снижение темпов роста сига из хвостохранилища, закономерности формирования вариаций по размерам, установленные по перечисленным показателям мышц, аналогичны таковым для сига из чистого водоема.

ДЦГ альдолаза 4° ЗД1" альда^ Г-б-ФДГ

щ 03. Каменное доз. Костомукшское

Рис. 4. Активность ферментов (ЕА) мышц (А) и печени (Б) сига из озер Каменное и Костомукшское, (мкмоль субстрата/мин/г (для ЛДГ и альдолазы - ЕА*10"'),

к/г - для ЦО), ш±М * - различия достоверны при р<0,05

В отличие от сига из озера Каменное, для сига из хвостохранилища не установлена взаимосвязь ЛДГ мышц с размерами особей (рис. 5 Г), что, вероятно, связано с изменением интенсивности путей аэробного и анаэробного синтеза АТФ в общем энергообеспечении клеток мышц и усилением роли анаэробного обмена как компенсаторного механизма.

40 50 60 70 80

г(Д)у=0,037х-1,63

90 100 НО масса, г

К2 = 0,51, ¡><0,0.5

(а)у = 0,0152х-0,701 А В.2«0,84,р<0,01

40 50 60

70 80 90 100 110 масса, г

1,25

И 1

§0,75 Й

Е о ,5

0,25 О

г(о) у = 0,007х+ 0,519 Я2 = 0,38, р<0,05

В ЕА200

120 80

(Д)у =0,0152х- 0,46 Л2=0,70,р<0,01

'-"-1__I_

■А,

(Д) у = -1,190х+221,08

В?«0,28 (о) у = 0,741х+70,23 ^ = 0,61,р<0,05

40 50 60 70 80

90 100 110

масса, г

40 50 60 70 80

90 100 110

масса, г

| оз. Каменное доз. Костомукшское

Рис. 5. Зависимость активности ЦО (А), уровня экспрессии гена МуНС (Б), индекса РНК/ДНК (В), активности ЛДГ (Г) белых мышц от массы тела особей сига из озер Каменное и Костомукшское Условные обозначения: как на рисунке 3

В печени сига из озера Костомукшское установлены более низкие значения активности ЦО и высокие значения альдолазы, ЛДГ, Г-6-ФДГ по сравнению с таковыми у сига из озера Каменное. Это указывает на более низкий уровень аэробного обмена, более высокую степень окисления углеводов в гликолизе и пентозо-фосфатном пути в печени рыб из неблагоприятного водоема. Корреляция активности ЦО, Г-6-ФДГ, 1 -ГФДГ печени с размерами сигов из хвостохранилища была положительной, что соответствовало характеру взаимосвязи этих ферментов с длиной и массой сигов из чистого озера.

5. Соотношение активности ферментов ЦО и ЛДГ и уровня экспрессии генов СОХ1, СОХ4 и ¡Ж!-А в белых мышцах при формировании размерного разнообразия рыб исследуемых видов

Исследовали взаимосвязь уровня экспрессии генов цитохром с оксидазы субъединиц I и IV (|СОХ1 и СОХ4) и лактатдегидрогеназы субъединицы А (ЮН-А) с размерно-весовыми характеристиками особей и активностью самих

ферментов. У млекопитающих и рыб молекула цитохром с оксидазы состоит из 13 субъединиц: 3 основных каталитических, в том числе СОХ1, кодируемых митохондриальным геномом, и 10 минорных, в том числе СОХ4, которые кодируются ядерным геномом. Вместе с тем, мало изучен вопрос о том, с какими субъединицами связана регуляция активности фермента ЦО на уровне транскрипции (Davies, Moyes, 2007; LeMonie et al., 2008; Duggan et al., 2011). На примере лосося было показано, что взаимосвязь экспрессии гена ядерной субъединицы СОХ4 с размерами особей и активностью ЦО была положительной для всех возрастных групп (рис. 6 А и 7 А). Корреляция уровня экспрессии гена митохондриальной субъединицы СОХ1 с размерами особей установлена только для лосося возраста 0+ и 1+, а с активностью ЦО - только для возрастных групп 1+ и 2+ (рис. 6 Б и 7 Б). В целом, степень взаимосвязи гена

(0+)y=lJ19x+0312

R> - 0,52. р< 0,05 (1+)У-0,7ЭЭх-0,851 = 0.61,p<0j05

М ?

% 3

/а

у (2+) у = 0,252 х - 0,837

О 0+ Д 1+ и 2+

Рис. 6. Зависимость уровня экспрессии генов СОХ1 (А) и СОХ4 (Б) в белых мышцах от массы особей лосося разных возрастных групп

Условные обозначения:-зависимость достоверна при р<0,05;

------зависимость недостоверна

(1+)у=0,241х+0,729 Д R'-0Jl.p<0i>S

Lj^i

v^T (0+)у = 0,041х+0,б37

(2+) y^O,039x4-0,431 R2 = 0,41,p<0,p5

(l+)y =0,44 lx +0,606 R? = 0,47,p<0,05 Д

A /

& ^0+)y = 0.161x+0510

(2+) y = 0,ll2x+0362 R3-0,57,p <0j01

«PHKcotj/BPHK^,

O 0+ Д 1+ E 2+

HVHKcoX4lKfHK BF-I

Рис. 7. Зависимость активности цитохром с оксидазы от уровня экспрессии генов СОХ1 (А) и СОХ4 (Б) в белых мышцах лосося разных возрастных групп Условные обозначения: как на рисунке 3

Таблица 3

Уровень экспрессии генов СОХ1 и СОХ4 в мышцах лососей трех возрастных групп

Возраст мРНК СОХИ мРНК EF-I мРНК COX4I мРНК EF-1

0+ 2,48 ±0,21 1,62 ±0,1

1 + 2,79 ±0,19 1,98 ±0,14*

2+ 2,74 ±0,51 1,24 ±0,16*

* - различия между возрастными группами достоверно, р<0.05

субъединицы СОХ1 с размерами особей была ниже, чем таковая для экспрессии гена СОХ4. Был исследован уровень экспрессии генов СОХ1 и СОХ4 в разных возрастных группах. Уровень экспрессии гена митохондриальной субъединицы СОХ1 во всех возрастных ipynnax лосося оставался на одинаковом уровне. Возрастное изменение активности ЦО (табл. 1) в белых мышцах лосося соответствовало изменению уровня экспрессии гена ядерной субъединицы СОХ4 (табл. 3). Как известно, субъединицы, кодируемые митохондриальным геномом, непосредственно принимают участие в катализе и, вероятно, представлены в избыточном количестве (Kadenbach et al., 2000; Duggan, 2010). Возможно, этим и объясняется наблюдаемое нами постоянство уровня экспрессии гена субъединицы СОХ1 в исследованных возрастных группах и меньшая степень взаимосвязи с активностью ЦО и размерами особей. Ядерная субъединица СОХ4 является регуляторной, имеет аллостериче-ский центр (сайт связывания с АТФ) (Kadenbach et al., 2000; Little, 2010). Можно полагать, что количество СОХ4 влияет также на уровень синтеза ЦО, так как она первой из ядерных субъединиц включается в формирование структуры фермента (Duggan, 2010). Видимо, участие субъединицы СОХ4 в регуляции активности фермента, а также в формировании структуры фермента и определяет ее более сильную взаимосвязь с активностью ЦО. Поскольку аналогичная взаимосвязь экспрессии гена ЦО субъединицы IV с размерами особей и активностью фермента установлена и для других исследованных видов рыб - сига и форели, то, вероятно, изменение активности ЦО при формировании размерного разнообразия рыб в первые годы жизни регулируется, главным образом, на уровне транскрипции гена ядерной субъединицы СОХ4.

При изучении уровня экспрессии гена LDH-A в белых мышцах лосося разного возраста показана положительная корреляция этого показателя как с длиной и массой особей, так и с активностью фермента (рис. 8). Вероятно, различие в активности ЛДГ мышц у рыб разного размера определяются регуляцией на уровне транскрипции гена анаэробной субъединицы А лактатдегидрогеназы, характерной для этой ткани. Такая же взаимосвязь установлена нами и для сига из чистого озера. Полученные результаты согласуются с аналогичными исследованиями механизмов регу-

ляции активности пируваткиназы (ПК, фермента гликолиза), в результате которых была установлена взаимосвязь экспрессии гена ПК с активностью ПК и массой тела годовиков заводской форели (Burness et al., 1999) и четырёх видов морских окуней (Davies, Moys, 2007).

S ю » 1

масса, г мРІІК^р/ґ-^/мРНК SP-I

О 0+ А 1+ а 2+

Рис. 8. Зависимость уровня экспрессии гена LDH-A от массы особей (А),

зависимость активности ЛДГ от уровня экспрессии гена LDH-А (Б) лосося разных возрастных групп Условные обозначения: как на рисунке 3

Следует отметить, что для сигов из хвостохранилища взаимосвязь экспрессии гена LDH-A с длиной и массой особей и активностью ЛДГ не обнаружена, что, видимо, связано с изменением регуляции активности фермента и изменением интенсивности и направления реакции, катализируемой ЛДГ.

ВЫВОДЫ

1. Установлена положительная взаимосвязь между активностью цитохром с оксидазы, лактатдегидрогеназы, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина в мышцах, активностью ферментов цитохром с оксидазы, 1-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени и массой особей одновозрастных групп всех исследованных видов рыб. Такая взаимосвязь характерна как для рыб естественных популяций (ряпушка, лосось, сиг), так и для искусственно выращиваемой форели в летний нагульный период в первые годы жизни.

2. Взаимосвязь индекса РНК/ДНК в мышцах с размером и массой особей неоднозначна, она зависит от вида рыб и их возраста.

3. Для сига взаимосвязь между активностью цитохром с оксидазы, индексом РНК/ДНК, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина в мышцах, активностью цитохром с оксидазы, 1-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени и размерно-весовыми характеристиками рыб существенно различается у половозрелых и неполовозрелых особей. Для половозрелых особей сига взаимосвязь активности цитохром с оксидазы мышц и

печени с длиной и массой, а также активности 1-глицерофосфагдещдрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегндрогеназы печени с длиной и массой рыб зависит от пола.

4. Для сига из чистого и техногенного водоемов активность цитохром с оксидазы, индекс РНК/ДНК и уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина в мышцах и активность цитохром с оксидазы, 1-глицерофосфатдепщрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени повышаются с увеличением размера и массы особей. Различия наблюдаются только во взаимосвязи длины и массы особей с активностью лактатдегидрогеназы и альдолазы мышц. Это связано с возрастанием интенсивности анаэробного обмена и его роли в компенсаторных механизмах поддержания энергетического гомеостаза при более низком уровне аэробного обмена, наблюдавшегося у сигов в условиях антропогенного воздействия.

5. Для одновозрастных особей сига, лосося, радужной форели уровень экспрессии генов С ОХ 4 и LDH-А, также как и активность ферментов цитохром с оксидазы и лактатдегидрогеназы в белых мышцах, повышается с увеличением размера и массы. Это свидетельствует о регуляции активности ферментов при формировании размерного разнообразия рыб на уровне транскрипции соответствующих генов. У рыб, обитающих в условиях техногенного водоема, взаимосвязи уровня экспрессии LDH-A с активностью фермента лактатдегидрогеназы не выявлено.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЦО - цитохром с оксидаза

МДГ - малатдегидрогеназа

1-ГФДГ - а-глицерофосфатдегидрогеназа

Г-6-ФДГ — глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа

БСА - бычий сывороточный альбумин

MYHC - (myosin heavy chain) тяжелая цепь миозина

СОХ-(cytochrome с oxidase) цитохром с оксидаза

LDH-A - (lactate dehydrogenase - А) лактатдегидрогеназа

EF-1 - (elongation factor-1) фактор элонгации - 1

Список работ, опуликованных по теме диссертации:

1. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова H.H., Шатуновский М.И. Соотношение роста и некоторых биохимических показателей рыб на примере микижи Parasalmo mykiss Walb. // Известия РАН. Сер. Биол. - 2010. - № 3. - С. 289 - 299.

2. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова H.H. Взаимосвязь активности ферментов энергетического обмена с темпами роста и размерами рыб // Ученые записки ПетрГУ. - 2011. - № 4. - С. 31 - 37.

3. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Ильмаст Н.В., Немова H.H. Оценка состояния сигов Coregonus Lavaretus L., обитающих в хвостохранилище горнообогатительного комбината, по некоторым биохимическим и молекулярно-генетическим показателям // Труды КарНЦ РАН. Сер. Экспериментальная биология - 2011 -№3,-С. 137-145.

4. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Немова Н.Н. Биохимические методы оценки роста и развития рыб. Корреляции активности некоторых ферментов метаболизма с показателями веса и длины особей у разных возрастных групп ряпушки оз. Сямозеро (Республика Карелия) // Организмы, популяция, экосистемы: проблемы и пути сохранения биоразнообразия. Матер, всерос. конф. с междунар. участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» Вологда, 24-28 ноября 2008 г. - Вологда, 2008. - С. 71-75.

5. Мещерякова О.В, Чурова М.В., Шатуновский М.И., Немова Н.Н. Перспективы использования некоторых биохимических показателей в оценке скорости роста ценных видов лососевых рыб - объектов товарного производства // Высокие технологии, фундаментальные исследования, промышленность. Сборник трудов шестой междунар. научно-практической конф. «Иследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 16-17.10.2008. -Санкт-Петербург, 2008. - С. 160-161.

6. Мещерякова О.В., Чурова М.В, Немова Н.Н. Особенности энергетического обмена молоди лосося при заболевании некрозом плавников // Садковое рыбоводство. Технология выращивания. Кормления рыб и сохранения их здоровья. Матер, науч.конф. Петрозаводск, 13-17 октября 2008 г. - Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2008. - С. 73-76.

7. Мещерякова О.В., Унжаков А.Р., Хижкин Е.А., Чурова М.В., Немова Н.Н. Окисление лактата в митохондриях животных: механизм и значение // 4-й Междунар. симпозиум: Современные проблемы и методы экологической физиологии и патологии млекопитающих введенных в зоокультуру. Матер, симпозиума. Петрозаводск. 23-25 сенября 2009 г. - Петрозаводск, 2009. - с. 175 - 181.

8. Чурова М.В., Мещерякова О.В, Шатуновский М.И. Корреляция биохимических показателей с линейно-весовыми параметрами особей некоторых видов рыб // Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера: матер. XXVIII междунар. конф. Петрозаводск, 5-8 октября 2009 г. - Петрозаводск: изд-во КарНЦ РАН, 2009 - С. 612 - 617.

9. Чурова М.В, Мещерякова О.В, Немова Н.Н. Использование показателя РНК/ДНК и уровня экспрессии гена тяжелой цепи миозина в оценке интенсивности роста некоторых видов рыб // Биология - наука XXI века: 13-я Пущинская междунар. школа-конф. молодых ученых. Сборник тезисов. Пущино, 28 сентября — 2 октября 2009. - Пущино, 2009. - С. 252

10. Churova M.V, Mescheryakova O.V, Shatunovsky M.I, Nemova N.N. The search of biochemical indicators for estimation of growth and development of fish under anthropogenic influence on water ecosystems of the North-west part of Russia // Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change: abstracts of the intemat. scient. conf. «Arctic Frontiers». 18-23 January, 2009. - Tromso, 2009 - P. 122.

11. Churova M.V, Mescheryakova O.V, Nemova N.N. Energy and carbohydrate metabolism enzymes as bioindicators of fish health under anthropogenic transformation of lake ecosystem // 15th international symposium on Pollutant Responses in Marine Organisms. 17-20 May, 2009. - Bordeaux, France, 2009. - P.l 13.

12. Чурова М.В, Мещерякова О.В, Немова Н.Н.. Влияние сточных вод горно-обогатительного комбината на некоторые ферменты энергетического и углеводного обмена рыб // Природа морской Арктики: современные вызовы и роль науки: Тез. докл. Междунар.науч.конф. (г.Мурманск, 10-12 марта 2010 г.). - Апатиты: Изд-во Кольского научного центра РАН, 2010. - с. 221-223.

13. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова H.H. Изменение уровня экспрессии генов и активности некоторых ферментов углеводного и энергетического обмена у сигов (Coregonus lavaretus L.), обитающих в хвостохранилище горно-обогатительного комбината // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: Матер. III Междунар. конф. с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и студентов. Петрозаводск, 22 июня - 26 июня 2010 года. -Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. - С. 193 - 195.

14. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Немова H.H. Изменение активности некоторых митохондриальных ферментов органов рыб при антропогенной нагрузке // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: Матер. III Междунар. конф. с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и студентов. Петрозаводск, 22 июня - 26 июня 2010 года. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. - С. 116 - 117.

15. Чурова М. В., Мещерякова О. В., Немова H. Н. Взаимосвязь линейно-весовых характеристик с активностью некоторых ферментов и молекулярно-генети-ческими показателями в белых мышцах сигов разных возрастных групп из озера Каменное (Республика Карелия) / Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов организмов. Том I. Экологическая физиология и биохимия водных организмов: сборник научных статей. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. - С. 304 - 312.

16. Мещерякова О. В., Чурова М. В., Немова H. Н. Митоховдриальный лакгат-окисляюший комплекс и его значение для поддержания энергетического гомеостаза клеток / Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том I. Экологическая физиология и биохимия водных организмов: сборник научных статей. -Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010.163-172 с.

17. Churova M.V., Mescheryakova O.V., Veselov А.Е., Sterligova O.P., Nemova N.N. Myosin expression level in white muscle as a marker offish growth // Current problems of physiology and biochemistry of aquatic organisms. Vol.11. Arctic and subarctic biological resourses - potential for biotechnology: collected scientific papers of the first International seminar and PhD workshop (6-9 September, 2010, Petrozavodsk). - Petrozavodsk: Karelian Research Centre RAS, 2010. - p. 18 - 22.

18. Чурова M.B., Мещерякова O.B., Немова H.H. Корреляция биохимических и молекулярно-генетических показателей с размерами сигов Coregonus Lavaretus L. из оз. Каменное (Республика Карелия) // Современные проблемы и перспективы изучения мирового океана. I Научно-практическая конфер. молодых ученых ФГУП «ВНИРО»: тезисы. - М.: Изд-во «ВНИРО», 2010. - С. 24 - 27.

19. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н Активность цитохром с ок-сидазы и уровень экспрессии генов субъединиц СОХ1 и СОХ4 в белых мышцах атлантических лососей (Salmo Salar L.) разного возраста // V Российский симпозиум «Белки и пептиды» Петрозаводск, 8-12 августа, 2011. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2011. - С. 354.

20. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Веселое А. Е., Немова H.H. Использование некоторых биохимических и молекулярно-генетических показателей в исследовании процессов роста рыб на примере молоди лосося Salmo salar L разных возрастных групп из реки Индёра (Кольский полуостров) // Современное состояние биоресурсов внутренних водоемов. Материалы докладов I Всероссийской конференции с международным участием. 12-16 сентября 2011 г., Борок, Россия. -М.: АКВАРОС, 2011. - Том 2. - С. 809-816.

Формат 60x84 '/i6 Бумага офсетная. Гарнитура «Times». Уч.-изд. л. 1,2. Усл. печ. л. 1,3. Подписано в печать 10.02.12. Тираж 100 экз. Изд. № 274. Заказ № 27.

Карельский научный центр РАН Редакционно-издательский отдел 185003, Петрозаводск, пр. А. Невского, 50

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чурова, Мария Викторовна, Петрозаводск

61 12-3/691

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук

на правах рукописи

Чурова Мария Викторовна

АКТИВНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА И РАЗМЕРНО-ВЕСОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЫБ СЕМЕЙСТВ ЛОСОСЕВЫЕ (БАЬМОШВАЕ) И СИГОВЫЕ {СОЯЕСОМОАЕ)

Специальность 03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук Н.Н. Немова

Петрозаводск 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................ 7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................... 12

1.1 Роль энергетического и углеводного обмена в процессах роста и

развития рыб................................................................................ 12

1.2 Характеристика ферментов, использующихся в оценке интенсивности и направления путей энергетического и углеводного обмена: цитохром с оксидазы, альдолазы, дегидрогеназ лактата, малата, глюкозо-6-фосфата и

1-глицерофосфата........................................................................ ^

1.3 Особенности роста рыб и формирование размерного разнообразия...... 23

1.4 Особенности энергетического обмена в онтогенезе рыб..................... 28

1.5 Взаимосвязь между уровнем энергетического обмена, интенсивностью некоторых путей углеводного обмена и темпами роста и размерами рыб... 31

1.5.1 Взаимосвязь активности некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена с темпами роста рыб....................................... 31

1.5.2 Взаимосвязь активности ферментов энергетического и углеводного обмена с размерно-весовыми характеристиками рыб.................................. 34

1.5.3 Взаимосвязь между активностью ферментов энергетического обмена и уровнем экспрессии кодирующих их генов у рыб разного размера............................................................................................................. 38

1.6 Молекулярно-генетические показатели оценки темпов роста рыб........ 39

1.6.1 Индекс отношения нуклеиновых кислот РНК/ДНК как показатель уровня синтеза белка в оценке темпов роста рыб.............................. 40

1.6.2 Уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина в белых мышцах

как маркер темпов роста рыб....................................................... 42

Глава 2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ............................................... 45

2.1 Материал исследования............................................................. 45

2.2 Методы исследования...............................................................

2.2.1 Гомогенизация органов и тканей рыб................................ 52

2.2.2 Спектрофотометрическое определение активности ферментов..... 52

2.2.2.1 Определение общей активности лактатдегидрогеназы,

малатдегидрогеназы и 1-глицерофосфатдегидрогеназы.

2.2.2.2. Определение активности цитохром с оксидазы..........................................53

2.2.2.3. Определение активности альдолазы..................................................................54

2.2.2.4. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы..........55

2.2.3. Количественное определение белка в тканях......................................................56

2.2.4. Выделение тотальной РНК......................................................................56

2.2.5. Выделение ДНК..............................................................................................................................57

2.2.6. Спектрофотометрическое определение концентрации

¡ZQ

нуклеиновых кислот...................................................................

2.2.7. Синтез комплементарной ДНК..........................................................................................58

2.2.8. Проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального

времени.............................................................................................................

2.2.8.1 Подбор праймеров....................................................................................................................59

2.2.8.2 Амплификция..............................................................................................................................59

2.2.8.3 Анализ даных..............................................................................................................................61

£\ 1

2.2.9 Секвенирование................................................................................................................................°

2.2.9.1 Получение продуктов ПЦР............................................................................................61

2.2.9.2 Агарозный гель-электрофорез...................................................................................62

2.2.9.3 Реакция секвенирования........................................................................................................................63

2.2.9.4 Разделение синтезированных фрагментов и анализ данных..............63

2.2.10 Статистическая обработка данных..............................................................................64

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................................65

3.1. Взаимосвязь между исследуемыми биохимическими, молекулярно-генетическими показателями мышц и печени и размерно-весовыми характеристиками особей некоторых видов рыб семейств Salmonidae и Coregonidae естественных популяций................................................ 65

3.1.1 Молодь атлантического лосося {Salmo salar) разных возрастных групп (река Инд ера, Кольский п-ов).............................................. 65

3.1.2 Обыкновенный сиг (Coregonus lavaretus) разных возрастных групп (оз. Тумасозеро)...............................................................

3.1.3 Европейская ряпушка (Coregonus albulo) разных возрастных групп (оз. Сямозеро).................................................................. ^5

3.2 Взаимосвязь между исследуемыми биохимическими и молекулярно-генетическими показателями мышц и печени и размерно-весовыми характеристиками искусственно выращиваемой радужной форели {Parasalmo mykiss) разных возрастных групп (Суйсарьская губа, оз. Онего) 99

3.3. Сравнение исследуемых биохимических и молекулярно-генетических показателей органов особей сига (Coregonus lavaretus), обитающих в озере Каменное (заповедник «Костомукшский») и техногенном водоеме оз. Костомукшское - хвостохранилище ГОКа.......................................... 1

3.3.1 Сравнение исследуемых биохимических и молекулярно-генетических показателей в органах сига....................................... Ю6

3.3.2 Взаимосвязь исследуемых биохимических и молекулярно-генетических показателей мышц и печени с размерно-весовыми характеристиками особей сига.....................................................

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

130

4.1 Общие закономерности взаимосвязи исследуемых биохимических и молекулярно-генетических показателей с длиной и массой особей изучаемых видов рыб.................................................................... 130

4.2 Возрастные особенности взаимосвязи биохимических и молекулярно-генетических показателей с длиной и массой рыб................................ 138

4.3 Половые различия во взаимосвязи между активностью ферментов энергетического и углеводного обмена, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина, индексом РНК/ДНК и размерно-весовыми характеристиками рыб................................................................... 146

4.4 Сравнение исследуемых показателей и оценка их взаимосвязи с длиной и весом особей сига, обитающих в чистом озере и антропогенно-трансформированном водоеме.........................................................

4.5 Соотношение активности ферментов цитохром с оксидазы и лактатдегидрогеназы и уровня экспрессии генов СОХ1, СОХ4 и LDH-А в белых мышцах при формировании размерного разнообразия рыб

1 SR

исследуемых видов........................................................................ 1JO

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................... 163

ВЫВОДЫ.................................................................................. 170

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................. 172

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЦО - цитохром с оксидаза

МДГ - малатдегидрогеназа

1-ГФДГ - 1-глицерофосфатдегидрогеназа

Г-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ПК - пируваткиназа

ЦС - цитратсинтаза

ПФП - пентозофосфатный путь

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

НАДН - восстановленная форма кофермента НАД (НАДН+Н+) НАДфН - восстановленная форма кофермента НАДф (НАДфН+Н+) ДЕПК - диэтилпирокарбонат

МуНС - (myosin heavy chain) ген тяжелой цепи миозина СОХ- (cytochrome с oxidase) ген цитохром с оксидазы

LDH-A - (lactate dehydrogenase - А) ген субъединицы А лактатдегидрогеназы EF-1 - (elongation factor-1) ген фактора элонгации - 1

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Важнейшим метаболическим фактором, определяющим функциональную активность клеток различных органов и, соответственно, процессы роста и развития рыб, является уровень энергетического обмена. Достаточный уровень образования АТФ определяет активный рост и развитие организма рыб, особенно в период раннего онтогенеза, когда требуются большие энергетические затраты на синтез структурных, функциональных и запасных соединений. Поэтому в исследованиях взаимосвязи биохимических параметров с размерными характеристиками рыб и темпами их роста большое внимание уделяется изучению активности и экспрессии генов ферментов энергетического обмена, участвующих в процессах аэробного и анаэробного синтеза АТФ. Исследование биохимических и молекулярно-генетических параметров энергетического метаболизма проводится главным образом в белых мышцах рыб, т.к. они составляют значительную часть тела (около 60% веса) и, таким образом, во многом определяют особенности метаболизма всего организма и отражают темпы роста рыб (Goolish и Adelman 1987; Houlihan et al., 1993; Burness et al., 1999; Davies, Moyes, 2007; Savoie et al., 2008). Кроме того, активность ферментов гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи митохондрий, наряду с молекулярно-генетическими показателями - индексом РНК/ДНК и уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина могут использоваться как индикаторы темпов роста и состояния рыб в исследованиях по изучению влияния различных условий их на рост. Например, эти показатели применяются при изучении влияния на рыб загрязнения окружающей среды, температуры, качества и количества пищи, паразитарной инвазии (Buckley et al., 1999; Overturf and Hardy, 2001; Imsland et al., 2006; Dhillon R. et al., 2008; Caldarone, 2006; Vinagre et al., 2008). Ряд работ в этом направлении посвящен также изучению механизмов регуляции активности ферментов у рыб разного размера, а именно исследованию взаимосвязи уровня экспрессии генов ферментов с активностью этих ферментов и массой тела (Yang, Somero, 1996; Burness et al., 1999; Davies, Moyes, 2007).

Рост рыб представляет собой сложный многофакторный процесс, определяющийся взаимодействием организма с абиотическими и биотическими

факторами среды в процессе онтогенеза (Дгебуадзе, 1993, 2001; Павлов, 2010; Ншз, 2009). В отличие от млекопитающих, рыбы растут в течение всей жизни. При этом особи одной когорты могут значительно отличаться размерами в зависимости от соотношения генетической и негенетической составляющих процесса их роста и влияния различных факторов среды. В связи с этим, линейные и весовые показатели, характеризующие размер особи, являются одними из наиболее изменчивых характеристик организма рыб. Изучение биохимических и молекулярно-генетических закономерностей и механизмов формирования изменчивости и дифференциации рыб по размерам позволит значительно расширить представления об особенностях процесса роста у рыб и способов его регуляции в различные периоды онтогенеза, на разных стадиях жизненного цикла и при влиянии экологических условий. Несмотря на значительное число работ в этой области, ряд вопросов остается неизученным. Так, недостаточно данных по оценке взаимосвязи процессов энергетического и пластического обмена в мышцах и печени с размерами (длиной и массой) рыб. Не исследован характер взаимосвязи показателей друг с другом, возрастные и половые особенности этой зависимости, влияние антропогенного фактора. Таким образом, исследование особенностей и механизмов роста рыб и формирования размерной изменчивости на биохимическом уровне является одним из важных вопросов биохимии и физиологии рыб, популяционной биологии, экологии.

Задачи исследования:

1. Изучить взаимосвязь между активностью ферментов цитохром с оксидазы (ЦО), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), 1-глицрофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ), альдолазы в мышцах и печени, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина (.МуНС), показателем РНК/ДНК в мышцах и размерно-весовыми характеристиками особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой радужной форели.

4. Изучить взаимосвязь между уровнем экспрессии генов лактатдегидрогеназы субъединицы А (.LDH-A), цитохром с оксидазы субъединиц I и IV (СОХ1 и СОХ4) и активностью этих ферментов в мышцах у рыб разных размеров.

Положения, выносимые на защиту.

1. Активность исследуемых ферментов энергетического и углеводного обмена, уровень экспрессии генов ферментов и тяжелой цепи миозина в белых мышцах и печени рыб изучаемых видов положительно коррелируют с длиной и массой их тела.

2. Изменение уровня экспрессии генов цитохром с оксидазы и лактатдегидрогеназы является одним из возможных механизмов регуляции активности этих ферментов при формировании размерного разнообразия рыб.

Научная новизна. Получены новые данные о взаимосвязи активности некоторых ферментов углеводного и энергетического обмена мышц и печени, уровня экспрессии генов МуНС, СОХ1, СОХ4, LDH-А и показателя РНК/ДНК мышц и печени с длиной и массой особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой форели, с учетом возраста и пола. Впервые проведено комплексное исследование взаимосвязи изучаемых показателей с массой и длиной сигов и при влиянии антропогенного фактора. Впервые определена взаимосвязь между уровнем экспрессии генов двух субъединиц цитохром с оксидазы и активностью этого фермента у рыб разных по размеру.

разработки точных, удобных физиолого-биохимических индикаторов роста рыб и оценки состояния их здоровья, что может быть использовано в мониторинговых исследованиях, определении ресурсного потенциала водоемов и развитии новых технологий аквакультуры. Результаты исследования могут быть использованы для разработки лекционных курсов по физиологии и биохимии рыб, экологической биохимии и энзимологии для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и зарубежных конференциях: Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008); Международной научной конференции Arctic Frontiers 2009 "Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change" (Tromso, Norway, 2009); Международном симпозиуме 15th International Symposium on Pollutant Responses in Marine Organisms (Bordeaux, France, 2009); XXVIII Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера» (Петрозаводск, 2009); III Международной конференции с элементами школы для молодых ученых, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010); Международной школе-семинаре для молодых ученых «Биологические ресурсы Арктики и Субарктики - потенциал для биотехнологии: исследования и инновации» (Петрозаводск, 2010); I научно-практической конференции молодых ученых ФГУП «ВНИРО» «Современные проблемы и перспективы изучения мирового океана» (Москва, 2011); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), Научной конференции и школе молодых ученых, посвященных 65-летию КарНЦ РАН «Фундаментальная и прикладная наука в Республике Карелия: современное состояние и перспективы развития» (Петрозаводск, 2011); Молодежном инновационном конкурсе "МИК - 2011" (Петрозаводск, 2011).

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю член.-корр. РАН H.H. Немовой и научным консультантам к.б.н. О.В. Мещеряковой и заведующему лабораторией экологии низших позвоночных ИПЭЭ РАН им. А.Н. Северцова д.б.н., профессору М.И. Шатуновскому, а также сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН за всестороннюю помощь, поддержку, ценные советы и рекомендации. Особая благодарность д.б.н. О.П. Стерлиговой, к.б.н. Н.В. Ильмасту и сотрудникам лаборатории экологии рыб и водных беспозвоночных ИБ КарНЦ РАН за помощь при получении биологического материала и консультации. Искренняя признательность руководителю группы молекуля

Информация о работе

Чурова, Мария Викторовна
кандидата биологических наук
Петрозаводск, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Активность и экспрессия генов некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена и размерно-весовые характеристики рыб семейств лососевые (Salmonidae) и сиговые (Coregonidae) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы