Окислительная модификация белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина

Исмаилова, Жамила Грамидиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Окислительная модификация белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительная модификация белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина"

Исмаилова Жамила Грамидиновна

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ ГИПОТЕРМИИ И НАФОНЕ ВВЕДЕНИЯ ДАЛАРГИНА

03.00.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Махачкала-2004

Работа выполнена на кафедре биохимии и НИИ биологии Дагестанского государственного университета.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Эмирбеков Э.З.

кандидат биологических наук, доцент Кличханов Н.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Шугалей B.C. (Ростов-на-Дону),

кандидат биологических наук, доцент Даудова Т.Н. (Махачкала)

Ведущая организация: Дагестанский государственный педагогический университет

Защита состоится << -Р » 2004 г. в Ю часов на заседании дис-

сертационного совета К 212.053.12 в Дагестанском государственном университете, биологическом факультете, по адресу: 367000, Махачкала, Баты-рая,4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Даггосуниверситета 367000, г Махачкала, ул. Батырая. 1.

Автореферат разослан 1С4-РИ-'иЛЛ.004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук доцент

Нурмагомсдова ГТ.М.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время в различных областях медицины, таких как хирургия, психиатрия, терапия, и в экспериментальной биологии широкое применение нашел метод искусственного снижения температуры тела (Мешалкин, Верещагин, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985; Бабийчук и др., 1990). Защитным эффектом гипотермии является понижение функций и обменных процессов, приводящих к повышению устойчивости организма к воздействию многих неблагоприятных факторов и, прежде всего тканевой гипоксии, обычно сопутствующих различным видам патологии (Эмирбеков, Львова, 1985; Lei etal., 1994; Ooboshi, el al..2000)

Как известно, под действием низкой температуры тела и на начальных этапах гипотермии, активируется деятельность организма, повышаются энергозатраты, что стимулирует главный поставляющий энергию процесс-дыхание (Кулинский, Ольховский, 1992; Чуйкин, Вовенко, 1993; Алюхин, 1994). Активация дыхания увеличивает поток электронов по дыхательной цепи - от субстратов дыхания к кислороду, что неизбежно влечет за собой повышение продукции активных форм кислорода (Скулачев. 1998; Cadenas. Davies. 2000).

Усиленное образование активных форм кислорода имеет место в начальный период гипотермии гомойотермов, когда температура тела падает на несколько градусов. Об этом свидетельствуют данные по активации процессов перекисного окисления липидов различных тканей при умеренной гипотермии (Василькова, 1988; Львова и др , 1993). Эти исследователи отмстили важную роль активации процессов перекисного окисления липидов в развитии патологии при гипотермии. Вместе с тем установлено, что под действием активных форм кислорода окисляются в первую очередь не липиды, а аминокислотные остатки белков, приводящие к их окислительной модификации (Davies, 1987; Дубинина, Шугалей, 1993). Интенсивность окислительной модификации белков при гипотермии почти не изучена, а, следовательно, не установлена роль этих процессов в развитии гипотермической патологии. Существуют единичные данные, свидетельствующие об активации окислительной модификации белков при гипотермии (Халдун, 1998). Однако для оценки роли процессов окислительной модификации белков в развитии гипотермически.ч патологии необходимо выяснить, каковы механизмы этих процессов и как они зависят от температуры тела.

('ОС.. НАЦИОНАЛЕНU Г.1!КЛ»ОТЫчА

Установлено, что синтетический опиоидный пептид, аналог лей-эн-кефалина. даларгин способен снижать интенсивность процессов перекис-ного окисления липидов при различных стрессорных состояниях. Так. при эмоционально-болевом стрессе введение даларгина заметно понижало процессы перекисного окисления липидов в миокарде (Лишманов и др., 1991) и в клетках печени (Шлозников и др.. 1990; Короткина и др., 1991). И в условиях гипотермии введение даларгина способствует снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов в различных тканях (Львова и др., 1993). В связи с вышеизложенным представляется важным изучение, возможности регуляции окислительной модификации белков плазмы крови даларгином при гипотермии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение зависимости интенсивности свободно-радикального окисления белков плазмы крови и активности антиоксидантных ферментов эритроцитов от глубины и длительности гипотермии, а также возможности коррекции, обнаруженных изменений, путем парентерального введения опиоидного гексапептида - даларгина.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови крыс по анализу карбонильных и тиоловых групп;

2. Исследовать содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови;

3. Анализировать белковый спектр плазмы крови;

4. Исследовать состояние антиоксидантных ферментов по анализу активности супероксиддисмутазы и каталазы.

Основные положения, выносимые па защиту.

1. Установлено, что кратковременная, и особенно пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С существенно стимулирует процессы окислительной модификации белков плазмы крови крыс. Пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С увеличивает также окисляемость плазменных белков. Глубокая гипотермия снижает интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови. Повышение степени окислительной модификации белков стимулирует их деградацию и накопление среднемолекулярных пептидов.

2. Элсктро(|юрстичсский анализ белков и исследование среднемо-лекулярных пептидов свидетельствует о том. что гипотермия 30°С способствует как агрегации, так и фрагментации плазменных белков.

3. Интенсификация свободно-радикальных процессов в крови су-

ществснно активирует су пероксиддисмутазу а эритроцитах, но не влияет на активность каталазы.

4. Опиоидный гексапептиддаларгин при предварительном внутри-брюшинном введении оказывает защитный эффект при гипотермии ЗО°С. Это вьфажается в снижении окислительной модификации белков, нормализации спектра белков плазмы крови,- снижении содержания среднемо-лекулярных пептидов. Однако при пролонгировании 3 ч гипотермии ЗО°С и гипотермии 20°С даларгин не оказывает защитное влияние..

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведены систематические исследования интенсивности процессов окислительной модификации белков плазмы крови крыс при гипотермии.

Установлено, что интенсивность процессов свободно-радикального окисления белков зависит от уровня и длительности гипотермии. Кратковременная и пролонгированная 3 ч умеренная гипотермия существенно увеличивает окислительную деструкцию плазменных белков; Выявлена корреляция между интенсивностью окислительной модификации белков и содержанием в крови среднемолекулярных пептидов при гипотермии.

Обнаружено, что умеренная гипотермия и её пролонгирование способствует активации супероксиддисмугазы крови. При этом активность каталазы остается на уровне контроля.

Установлено зависимое от температуры изменение содержания суль-фгидрильных и дисульфидных групп в плазме крови в динамике гипотермии.

Установлено, что гипотермия 30°С существенно изменяет электро-форетическую подвижность белков плазмы крови, способствует их агрегации и фрагментации.

Выявлена возможность коррекции процессов окислительной модификации белков плазмы крови на начальных этапах гипотермии путем предварительного внутрибрюшинного введения даларгина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные представляют интерес для понимания молекулярных механизмов холодового повреждения и формирования компенсаторно-приспособительных реакций при снижении тем пературы тела гомойотермов. Практическая значимость данной работы определяется перспективностью использования ряда изученных показателей крови для оценки состояния организма при различных уровнях гипотермии и се пролонгировании.- Результаты работы указывают на возможность применения даларгина в качестве

препарата, участвующего в регуляции свободно-радикальных процессов в крови на начальных этапах гипотермии.

Материалы, полученные при выполнении данной диссертационной работы, используются в учебном процессе, осуществляемом кафедрой биохимии Дагестанского госуниверситета и Махачкалинского филиала Ростовского госуниверситета. Методические элементы работы включены в учебное пособие «Практикум по биохимии» (Ростов-на-Дону, 2001).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговой научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Дагестанского госуниверситета (Махачкала, 2001), 2-м международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1998); международной конференции, посвященной 50-летию ДНЦ РАН (Махачкала, 1999), международной конференции «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999). 38-й международной конференции, посвященной 100-летию основателя Сибирского отделения РАН М. А. Лаврентьева (Новосибирск, 2000), Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2001), международном научном семинаре вузов Северо-Кавказского региона «Циклы» (Ставрополь, 2002), 5-й и 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущине 2001.2(Х)2).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 237 источников, в том числе 85 на английском языке. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 16 рисунков.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на беспородных белых крысах массой 150-200 г. содержащихся в условиях вивария Опыты проводили в одно и то же время дня (с 9 до 12 часов) и года (май - июль или сентябрь - ноябрь).

Гипотермию крыс вьнывали в холодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода с температурой 4-5°С. Температуру тела у животных снижали равномерно и медленно, так что за 15-20 мин она достигала 30°С. а за 55-60 мин 20-19°С. в отдельных сериях опытов состояние умерсн-

ной (30°С) гипотермии поддерживали в течение 3-х часов. За 30 мин до дскппитации (контроль) или за 30 мин до начала снижения температуры тела животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл фармакопейного препарата даларгина в доче 100 мкг/кг массы. Контрольным животным вводили. такой же объем физиологического раствора. После декапитации животного собирали кровь. В опытах использовали сыворотку и плазму крови, а также эритроциты.,

Об интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови судили по накоплению в них карбонильных групп, реагирующих с 2,4-динитрофенилгидразином (Дубинина и др., 2000).

Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови определяли по реакции образования окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи (Осипович и др., 1987).

Активность супероксиддисмутазы и каталазы определяли в гемо-лизатах. Об активности супероксиддисмутазы судили по ее способности ингибировать процесс восстановления тетразолиевого нитросинего и фе-назинметасульфата в условиях генерации супероксидного анион-радикала (Fried, 1975; Дубинина и др., 1988). Об активности каталазы судили по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации. Концентрацию перекиси водорода определяли по реакции с молибдатом аммония, который дает стойкий окрашенный комплекс (Королюк и др., 1988). Содержание гемоглобина определяли аммиачным методом (Лопатина и др., 1976). Содержание тиоловых групп определяли методом амперометрического титрования с использованием азотнокислого серебра (Соколовский, 1962). Содержание дисульфидных групп определяли методом обратного титрования (Соколовский и др., 1977).

Электрофорез белков плазмы крови проводили по методу Ю. К. Леммли (Laemmly, 1970) в линейном градиенте концентрации полиакрила-мидного геля (в пределах 5-22%) с додецилсульфатом натрия. Электрофо-реграммы проанализированы на денситометре СД-1 (Институт Биофизики Клетки, г Пущино). Пики интегрированы на интеграторе Shimmadzu C-R3A а также - с помощью программы TotalLab 4.O.

Статистическую обработку результатов проводили методом малой выборки по t -критерию Стьюдента (Лакин, 1990).

Результаты ii их обсуждение. Механизмы окислительной модификации белков более сложны (Dean ct al.. 1997: Zvvart et al., 1999: Dalle-Donne ct al.. 2003). Это связано с наличием в молекуле белка разнообраз-

ных аминокислотных радикалов. Одним из важнейших маркеров окислительной модификации белков являются карбонильные группы (Levine et al, 1990). Поэтому оценка степени окислительной модификации плазменных белков производилась по содержанию в них карбонильных групп. При этом определяли базальный уровень карбонильных групп, а также их накопление в присутствии системы генерирующей активные формы кислорода (FeJ\ HjOj-ЭДТА). Анализ показал, что при умеренной гипотермии происходит более чем двукратное повышение содержания карбонильных групп в белках плазмы (табл. 1). Однако при этом не изменяется скорость окисления белков in vitro.

Таблица 1

Содержание карбонильных групп (нмоль/мг белка) в белках плазмы крови крыс при гипотермии и введении даларгина (М±т; п=6-8)

№ Состояние животного Исходный уровень карбонильных групп Прирост карбонильные групп за 15 мин

при спонтанном окислении при Кс-чависимоч окислении

1 Контроль 1,50*0.06 3,56*0,10 57,24*1,48

2 Котроль* даларгин 1.44*0,12 2,85*0,12* 52.63*1,28*

3 Гипотермия 30"С 3,91*0.10* 3,72*0,13 58,82*1,42

4 Гипотермия 30"С + даларгин 3 07Ю.19** 3,03*0,13** 53.56*1,67'

5 Гипотермия 30 С, пролонгированная Зч 4.47*0.0.14** 6.43*0.18** 94,19*3.91**

6 Гипотермия 30°Q прологированная Зч + даларгин > 4.4710.19* 6,42*0,12* 90.13*4 76*

7 Гипотермия 20UC 1,97*0.22*' 3,03*0.14** 49.3X+Z06** 49.64* 1,46*

8 Гипотермия 20"С + даларгин 1.64 НШ 3,28*0,08*

Здесь и на табл. 2, 3, 4р<0,05: *по сравнению с контролем, по сравнению с гипотермией 30°С

Существенное повышение содержания карбонильных групп в белках обнаружено при пролонгированной 3 ч гипотермии 30°С. При этом в белках плазмы крови содержание карбонильных групп увеличивается на 198%. а при спонтанном и Fe3' -зависимом окислении - на 81 % и 63 % соответственно относительно контроля (табл I). Повышение скорости окисления белков в условиях in vitro при пролонгировании 3 ч умеренной гипотермии свидетельствует, по-видимому, об изменении конформации белков, что приводит к увеличению доступа к ранее скрытым аминокислотным остаткам прооксидантов (Davies. 1987)

В то же время при глубокой гипотермии снижается содержание карбонильных групп в белках плазмы крови по сравнению с умеренной гипотермией. Снижение степени окислительной модификации плазменных белков при гипотермии 20°С является выражением защитной функции глубокой гипотермии.

Таким образом, кратковременная и особенно пролонгированная 3 ч гипотермия З0°С существенно ускоряют окислительную модификацию белков плазмы крови. Это свидетельствует о том, что на начальных этапах гипотермии интенсифицируются процессы образования активных форм кислорода в крови и тканях.

Другим важнейшим критерием окислительной модификации белков является окисление их тиоловых групп (Dean et al.,1997). Окисление тиоловых групп может протекать как напрямую, так и ферментативным путем, с участием фермента глутатионпероксидазы и гидроперекисей ли-пидов (Соколовский, 1988; Владимиров, 1989).

Полученные нами данные показали, что умеренная (ЗО°С) гипотермия приводит к небольшому (7,2%) уменьшению содержания белковых тиоловых групп и существенному возрастанию (33,3%) количества дисуль-фидных связей в белках, что свидетельствует о стимулировании умеренной гипотермией окислительной модификации белков, затрагивающей эти функциональные группы. Об этом же свидетельствует и повышение окислительного индекса белков (S-S/SH), который с 0,260 в контроле возрастает до 0,373 при гипотермии (табл. 2).

Таблица 2

Содержание сульфгидрильных и дисульфидных групп в белках плазмы крови при гипотермии и на фоне введения - даларгина(М±т: п=6-8)

Ч? Группы животных Белковые тиолы, мкмоль/ЮОмл Окислительным индекс

-SH S-S S-S/SH

1 Контроль 60,00±2.5К 15,60i2,50 0,260

2 Контроль + длларгии 69.00i2.2l* 16,60*2.40 0,241

3 1 ииогсрмия 30°С 55,70 (0,74 20.80*2,14» 0,373

4 Г ииогсрмия 30°С 1 длларгин 69.201 1,41)' 17.30i2.S0 0.250

5 1 имгпермия 30°(\ нролощ ироканная Зч 52.341 2.25 24.57±2,20* 0,469

(> 1 ии.пермии 30°С i далар1ии. мро'инп ирпиаипан Зч 53.75 1 1,К0» 24.341 1,84* 0,453

7 1 ииогермих 20"(' 54.17» 1.42* 1X.50J 1.35* 0.342

1 ищмьрмнн 2ilV < далар! ни 57 64>2 5К 10.15 с 2.30 О ?М)

При пролонгированной 3 ч умеренной (30°С) гипотермии, сохраняется тенденция к уменьшению (12.8%) содержания белковых тиоловых групп. При этом содержание дисульфидных групп возрастает на 57,5% относительно контроля. Это резко увеличивает окислительный индекс белков (0.469). Эти результаты согласуются с нашими данными о повышении количества карбонильных групп в белках и в целом свидетельствуют о существенном возрастании скорости окислительной модификации плазменных белков при пролонгированной умеренной гипотермии.

При гипотермии 20°С в плазме крови количество SH-групп белков понижается (9,7%). При этом содержание дисульфидных связей в белках остается повышенным (18,6%) относительно контроля. Таким образом, при глубокой гипотермии в крови еще сохраняются процессы окисления тиоловых групп.

Таким образом, полученные нами данные по анализу содержания карбонильных групп и дисульфидных связей свидетельствуют об активации процессов окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии.

Известно; что окислительно-модифицированные белки подвергаются, с одной стороны, агрегации, с другой стороны, фрагментации -спонтанной или под действием специфических протеиназ (Levine, 1983; Davies. 1987: Dean et al, 1997). Агрегация чаще всего является результатом образования битирозиновых сшивок и дисульфидных мостиков (Davies, 1987; Дубинин;), Шугалей, 1993; Dean el al., 1997).

Об агрегации белков при низких температурах тела свидетельствуют данные, полученные нами при гель-электрофорезе. Оказалось, при гипотермии 30°С, в отличие от контроля. на старте геля остается полоса неразделенных белков. Кроме этого, при гипотермии увеличивается количество полос на фореграмме по сравнению с контролем. Это происходит за счет увеличения количества высокомолекулярных и низкомолекулярных белков. Наличие полосы неразделенных белков и повышение доли высокомолекулярных белков в плазме крови при гипотермии свидетельствуют об агрегации белков, важную роль в которой играет, по-видимому, их окислительная модификация. Ранее (Эмирбсков и др., 1980: Михайлсико, 1985) наличие полосы неразделенных белков при гипотермии было обнаружено в водорастворимой фракции белков мозга крыс. Это. видимо, говорит о том. что при гипотермии индуцированная активными формами кислорода агрегация белков характерна для различных тканей.

Обращает на себя внимание тот факт, что при гипотермии ЗО°С. параллельно с возрастанием количества высокомолекулярных белков, выявляется возрастание количества низкомолекулярных белков. Увеличение пиков в низкомолекулярной области свидетельствует о частичной фрагментации окисленных белков, поскольку окислительно-модифицированные белки легче и быстрее гидролизуются специфическими протеиназа-ми (Davies, 1987: Oliver et al., 1987; Stadtman, 1992: Davies, 2001). Скорость распада модифицированных белков в 10 раз превышает среднюю скорость распада обычных белков (Дин, 1981). Повышение количества окислитель но-модифицированных молекул белков в условиях гипотермии приводит к их быстрому удалению путем активации системы распада (Эмирбеков, Львова, 1985). Снижение содержания карбонильных групп и дисульфид-ных связей в плазменных белках при глубокой гипотермии по сравнению с умеренной, видимо, также связано с ускорением распада модифицированных белков под действием специфических протеиназ.

Уровень среднемолекулярных пептидов, является показателем интенсивности протеолиза и спонтанной деградации окислительно-модифицированных белков (Гордеева и др., 1986; Волчегорский и др., 1994). Полученные нами данные показали, что при гипотермии происходит увеличение содержания среднемолекулряных пептидов в плазме крови крыс, которое зависит от ее глубины и длительности (табл. 3). При гипотермии 3()°С содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови крыс возрастает на 34%, а ее пролонгирование 3 ч, приводит к дальнейшему их росту (до 45%). При глубокой гипотермии содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови увеличивается еще в большей степени (до 70%). Повышение содержания среднемолекулярных пептидов плазмы крови при гипотермии в большей степени связано, видимо, с активацией процессов их протеолиза. в то же время нельзя исключить и попадание в плазму крови среднемолекулярных пептидов из тканей. Показано, что при гипотермии 2()°С в плазме крови обнаруживаются специфические ферменты печени (Утно и др . 1989). что свидетельствует о повышении проницаемости клеток тканей при гипотермии. Данные об активности протеиназ плазмы крови при гипотермии отсутствуют. В то же время при гипотермии увеличивается активность тканевых протеаз. а также происходит ускорение процессов автолиза и протеолиза белков мозга (Нурмагомедова и др.. 1983: Нурмагомедова 2001).

Таблица 3

Содержание среднсмолскулярных пептидов плазмы крови крыс при гипотермии и на фоне введения даларгина (М±т; п=8-12)

Содержание

№ Групиажиношых средпелниюкулмрмьк

пеп гидов, г/л

1 Контроль . 0Д2±0,16

2 Коиграль+дширгин 6.<Л±0Л0

3 Гипотермия 30°С из±020*

4 Гипотермия 30иС+даларгин

5 Гипотермия 30иС, пролонгированная Зч и1±0,18*-

б Гипотермия ЗОРС, пролонгированная Зч +даларгин 1,20±0.26*

7 Гипотермия 20°С 1.56±0,15*

8 Гипотермия 20иС4-далар1'ин 0.99±0,16**

Таким образом, одна из причин повышения уровня среднемолеку-лярных пептидов в плазме крови при гипотермии может быть связана с усилением протеолиза белков, модифицированных радикалами кислорода.

В организме важная роль в ингибировании свободно-радикальных реакций принадлежит таким низкомолекулярным сульфгидрильным соединениям, как глутатион и цистеин (Соколовский, 1988). Проявляя антирадикальное и антиперскисное действия, низкомолекулярные тиолы подвергаются обратимому окислению с образованием соответствующих дисульфидов (Кулинский, Колесниченко 1990; Соколовский и др., 1993).

Полученные нами данные показали, что при умеренной (30°С) гипотермии существенно (39,3%) увеличивается количество SH-групп низкомолекулярных тиоловых соединений в плазме крови (рис. 1). Параллельно значительно снижается количество дисульфидных связей в низкомолекулярных тиолах плазмы крови. Одной из причин ) величения содержания низкомолекулярных тиоловых соединений в плазме крови при умеренной гипотермии может являться их восстановление из окисленных форм. Другим источником тиоловых соединений плазмы крови при гипотермии могут быть эритроциты, которые усиленно подвергаются внутрисосу-дистому гемолизу (Эмирбеков и др.. 1991: Кличханов. 2001)

Рис. 1. Изменение содержания SH-групп и Б-Б связей шпкомолекулярных тиоловых соединений (в % от уровня интактного контроля) в плазме крови • крыс при гипотермии (I П и введении даларгина (■■). 1 - контроль; 2 - гипотермия ЗО°С, 3 - гипотермия, пролонгированная 3 ч; 4 - гипотермия 20°С.

При пролонгированной 3 ч умеренной (ЗО°С) гипотермии, в отличие от кратковременной, выявилось уменьшение содержания низкомолекулярных тиоловых групп, а содержание дисульфидных связей низкомолекулярных групп существенно повышается (54,2%).

При гипотермии 20°С в плазме крови количество низкомолекулярных восстановленных тиоловых соединений понижается на 38,2%, а содержание дисульфидных связей существенно возрастает (76,7°%)). Таким образом при пролонгированной 3 ч гипотермии ЗО°С и гипотермии 20°С наблюдается снижение содержания восстановленных тиолов в плазме крови. Снижение содержания низкомолекулярных тиолов плазмы крови отражает их окисление в реакциях со свободными радикалами, окисленными белками и липидами.

Основными низкомолекулярными соединениями плазмы крови, определяющими количество сульфгидрильных групп, являются цистеин и глутатион (Торчинский, 1977). В большинстве клеток концентрация небелковой серы на 90% определяется содержанием глутатиона. Уровень цисте-ина. напротив, в клетках и межклеточной жидкости низок (Степуро и др., 1995). Это. вероятно, связано с легкой окисляемостьюцистеина. БН-груп-пы этих соединений легко окисляются активными формами кислорода и

другими соединениями (Кулинский. Колссниченко. 1990). Принимая на себя «удар» окислителей, алкилирующих и ацилирующих агентов. глутатион и цистеин защищают, таким образом, от окисления 8И-группы ферментов, мембранных белков, либо восстанавливают их (Торчинский. 1977). Исходя из этих соображений, мы склонны думать, что снижение количества низкомолекулярных 8И-содержащих соединений в плазме крови крыс при пролонгировании 3 ч умеренной гипотермии и глубокой гипотермии отражает их участие в вышерассмотренных процессах.

Одними из важнейших антиоксидантных ферментов крови являются супероксиддисмутаза и каталаза. Супероксиддисмутаза является единственным антирадикальным ферментом, участвующим в дисмутации супероксида, а каталаза разрушает перекись, образующуюся в супероксид-дисмутазной реакции (Дубинина, 1992). Согласованное действие этих ферментов способствуют снижению уровню оксидантов в клетках.

Исследование супероксиддиелгутазы показало (табл. 4), что кратковременная гипотермия увеличивает активность супероксиддисмутазы на 22,6%, а при пролонгированной 3 ч гипотермии 30°С это повышение более существенно (80,3%). Рост активности супероксиддисмута ш при кратковременной и пролонгированной гипотермии 30°С следует рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на нормализацию уровня активных форм кислорода и процессов перекисного окисления липидов.

Таблица 4

Активность супероксиддисмутазы и ката лазы в эритроцитах крыс при гипотермии и введении даларгина (М ± т; п:=6-10)

№ Группа животных Супероксиддие мугаза, ед/мг НЬ Кааллаи. мкмоль 1Ь<)2'М1 НЫмин

1 Контроль 7,67±0,39 41,32 Л .03

2 Контроль + данаргин 7,471030 40.6211.13

Л Гипотермия .40 С 9,40±0,44* , 1X.72il.53

4 Гипотермия 30°С н далфшн 9.60*0.49* 3X.X1ll.44

5 Гипшермии 30ПС. пролонгированная 3 ч 13~83 ±0.43»*" 41.4X10.93

6 Гипотермия 30"С. пролонгированная 3 ч 1

даларгин l5.4fH0.5i',*' 4l.10i0.4f.

7 I ипокрмия 20ЛС ■ Vi.X5iO.30"" 40.9010 Х6

X Гииоюрмии 2(/'С .|лмр| им 7.30 '0.11 39.Х211.03

Высокий уровень активности супероксиддисмутазы служит показателем усиления генерации 02 и процессов перекисного окисления липидов (Львова и др., 1993). Повышение активности супероксиддисмута-зы при гипотермии возможно связано с изменением окислительно-восстановительного состояния важной тиоловой группы фермента. Показано, что добавление цистеина и глутатиона способствует повышению активности супероксиддисмутазы (Hoshino etal, 1985).

В отличие от умеренной гипотермии, глубокая (20°С) гипотермия приводит к небольшому (10,7%) снижению активности супероксиддисму-тазы по сравнению с контролем. Снижение активности супероксиддисму-тазы на этом этапе гипотермии может быть следствием снижения концентрации субстрата. Возможно, что снижение активности супероксиддис-мутазы при глубокой гипотермии является результатом её окислительной -модификации. Данные А.Г. Гасангаджиевой (1999) свидетельствуют о том, что восстановленный глутатион in vitro приводит к повышению активности супероксиддисмутазы при гипотермии 20°С. Эти результаты подтверждают возможность снижения активности супероксиддисмутазы при гипотермии 20°С вследствие окисление SH-групп активного центра.

В отличие от супероксиддисмутазы, активность каталазы существенно не изменяется при исследованных гипотермических состояниях (табл. 4). Высокий уровень каталазной активности на фоне снижения активности супероксиддисмутазы при глубокой гипотермии, видимо, с одной стороны связан с усилением генерации альтернативным путем, а с другой необходимостью поддержания концентрации перекиси водорода на низком уровне. Последнее необходимо в связи с тем, что перекись водорода во взаимодействии с ионами железа генерирует самый реакционноспособ-ный СНГ радикал (Menegliini, 1997; Griffiths, 2000).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что ферментативное звено антиоксидантной системы изменяется в соответствии с изменением интенсивности окислительной модификации плазменных белков.

Одной из основных причин активации свободно-радикального окисления при гипотермии является развитие низкотемпературного стресса (Куликов и др.. 1988; Бородин и др., 1992). Эффективным антастрессорным препаратом является синтетический аналог лей-энксфалина - гексапептидда-ларгин(Масловаидр., 1991:Дворцин, Шаталов. 1991:Лишмановидр., 1997) Установлено, что даларгин участвует в коррекции процессов перекисного окисления липидов при ра ишчных функциональных состояниях (Шло ши-ковилр.. 1990. Лишшновидр.. 1991. 1992: Короткина и др.. 1992) СП

Львова с сотр (1993) установили, что даларгин снижает интенсивность процессов перекисного окисления липидов в различных тканях при гипотермии.

Основываясь на этих данных, мы в своих исследованиях для коррекции процессов окислительной модификации белков плазмы крови также использовали даларгин.

У контрольных животных при введении даларгина наблюдается лишь слабая тенденция к снижению содержания карбонильных групп в плазме крови. Однако в инкубируемых пробах даларгин достоверно снижает накопление карбонильных групп.

При умеренной гипотермии даларгин достоверно снижает содержание карбонильных групп в белках как в неинкубируемых, гак и в инкубируемых пробах по сравнению с гипотермией без введения пептида. Однако при пролонгировании состояния гипотермии ЗО°С в течение 3 ч даларгин совершенно не оказывает эффекта на содержание карбонильных групп в белках плазмы крови, а также на их скорость окисления в условиях in vitro.

В условиях глубокой гипотермии введение даларгина способствует также снижению содержания карбонильных групп в плазме крови по сравнению с гипотермией без введения пептида, но при этом даларгин не влияет на окисляемость белков in vitro.

В следующей серии опытов мы исследовали влияние даларгина на тиоловые группы белков плазмы крови. В контроле введение даларгина достоверно (15%) повышает содержание общего количества SH-групп в белках, но существенно не влияет на содержание дисульфидных связей в них. При кратковременной умеренной гипотермии даларгин предотвращает снижение тиоловых групп в белках, а также их окисление. В случае пролонгирования в течение 3 ч умеренной гипотермии даларгин не препятствует снижению содержания тиоловых групп в белках, а также их окисление. При глубокой гипотермии введение даларгина способствует нормализации уровня как SH-групп, так и S-S связей в белках плазмы крови при гипотермии.

кисного окисления липидов в различных тканях (Львова и др., 1993; Кличха-нов, 2001). Опиоидные рецепторы весьма чувствительны к активным формам кислорода и продуктам перекисного окисления липидов и существенно теряют аффинность к своим лигандам (Белоконева, Зайцев, 1993). Возможно, и при пролонгированной умеренной гипотермии происходит потеря чувствительности рецепторов к даларгину и в связи с этим снижается выраженность его эффектов.

При кратковременной умеренной и глубокой гипотермии защитные эффекты даларгина, видимо, связаны с тем, что пептид влияет на генерацию активных форм кислорода. Ранее было показано, что введение даларгина приводит к снижению генерации активных форм кислорода в тканях (Корот-кина и др., 1990; Лишманов идр., 1992). Даларгин стабилизирует мембраны клеток, тем самым, предотвращая попадание в кровь окисленных белков из тканей. В частности показано, что введение даларгина предотвращало попадание в кровь гепатоспецифических белков при стрессе (Короткина и др., 1992).

Изменение количества окислительно-модифицированных белков в плазме крови при введении даларгина может быть связано с его влиянием на процессы протеолиза. Анализ содержания среднемолекулярных пептидов плазмы крови показал, что у контрольных животных введение опиоид-ного пептида не влияет на их уровень. При кратковременной умеренной и глубокой гипотермии почти полностью предотвращается рост содержания среднемолекулярных пептидов в плазме. А при пролонгированной 3 чуме-ренной гипотермии даларгин частично снижает уровень среднемолекулярных пептидов в плазме крови. Таким образом, динамика изменения содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови на фоне даларгина схожа с динамикой изменения степени окислительной модификации белков. Это означает, видимо, что снижение даларгином окислительной модификации белков способствует снижению скорости их протеолиза.

Параллельно со снижением содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови при умеренной гипотермии при введении даларгина уменьшается количество низкомолекулярных пиков на фореграммах белков плазмы крови. Это также свидетельствует о том. что даларгин уменьшает протсолиз белков плазмы крови при гипотермии. Показано, что даларгин способен регулировать активность протсиназ (Слепушкин и др., 1988). Снижение содержания срсднсмолскулярных пептидов и низкомолекулярных белков в плазме крови при гипотермии на фоне введения даларгина. возможно, связано также со снижением поступления их из тканей в результате стабилизации мембран клеток пептидом.

На фоне даларгина при умеренной гипотермии уменьшается количество высокомолекулярных белков, а также исчезает полоса неразделенного белка на старте. Это свидетельствует о том, что даларгин препятствует агрегации белков при гипотермии.

В связи с полученными данными было исследовано влияние далар-гина на компоненты антиоксидантной системы крови.

Анализ влияния даларгина на содержание низкомолекулярных тио-лов плазмы крови показал, что пептид при кратковременной гипотермии ЗО°С и 20°С предотвращает снижение содержания SH-групп в низко молекулярных соединениях плазмы крови и их окисление. Однако при пролонгировании 3 ч состояния гипотермии 30°С даларгин не препятствует снижению содержания низкомолекулярн ых тиолов и их окислению.

Таким образом, при кратковременных формах гипотермии даларгин предотвращает истощение фонда низкомолекулярных антиоксидантов плазмы крови. Возможно, это связано с тем, что в присутствии даларгина не наблюдается активации свободно-радикальных процессов и. тем самым сохраняются запасы антиоксидантов.

Исследование ферментативного звена антиоксидантной системы показал, что даларгин при гипотермии существенно не влияет на активность супероксиддисмутазы и каталазы. Это означает, что регуляция свободно-радикальных процессов даларгином при гипотермии не связана со стимуляцией пептидом антиоксидантных ферментов.

Снижение интенсивности активных форм кислорода в тканях гипо-термированных животных при введении даларгина может быть связано с несколькими причинами. Показано, что опиоидные пептиды, в том числе и даларгин, снижают потребность тканей в кислороде при экстремальных состояниях (Слепушкин и др., 1988).

Даларгин снижает уровень лактата в венозной крови. Это, по-видимому, обусловлено и способностью даларгина уменьшать проявления регионарной ишемии и гипоксии тканей. Противоишемическое действие опи-оидного пептида при различных видах циркуляторной недостаточности обусловлено снижением тонуса резистивных сосудов, общего периферического сопротивления сосудов и улучтением периферической гемодинамики (Зо-лоев и др., 1989) Установлено, что даларгин улучшает микроциркуляцию и лимфоток(Хугаева, 1988:3олоев, 1989).

Даларгин существенно влияет на уровень стрсссорных гормонов в крови. Показано, что введение даларгина не изменяет ба мльный уровень кптс\оламинов и глюкокортикоидов. но препятствует повышению их уровня при различных стрсссал (Лишманов. Маслов. 1994) Выше отмечалось, что !8

гипотсрмичсский стресс существенно увеличивает содержание катехола-минов глюкокортикоидов (Шкестерс и др., 1991) в плазме крови. Возможно, что даларгин в условиях гипотермии также препятствует росту стрессорных гормонов в плазме крови, следовательно, в этих условиях не будет нарастать уровень активных форм кислорода за счет окисления адреналина в адренох-ром.

Предотвращение повышения уровня катехоламинов на фоне далар-гина при гипотермии не будет способствовать стимуляции потребления кислорода и окислительных процессов в тканях. Снижение интенсивности дыхания на фоне даларгина снижает и выработку активных форм кислорода за счет этих процессов при гипотермии.

Уменьшение содержания активных форм кислорода при гипотермии на (|юне даларгина возможно за счет влияния пептида на ферменты, генерирующие их. Так, Р.Н. Короткина с сотр. (1992) показала, что введение даларгина снижает активность ксантиоксидазы в печени крыс с холестазом. Даларгин снижает активность этого фермента также и в мозге при миопле-гии (Короткина и др., 1990).

Оказалось, что даларгин при гипотермии снижает как уровень железа, так и гемоглобина в крови за счет снижения гемолиза эритроцитов (Клич-ханов, 2001). Следовательно, снижение уровня железа или железосодержащих компонентов плазмы крови при гипотермии на фоне даларгина приводит к снижению скорости генерации активных форм кислорода.

ции понижал содержание малоно,вого диальдегида в, печени крыс на 27%. Поданным RH. Короткиной с соавт. (199,2) внутрибрюшинное введение да-ларгина (10,50, ШО мкг/кг массы) в течение 5 ч поддерживает низкий уровень малонового диальдегида в печени. При этом через 1 ч после инъекции содержание малонового диальдегида по сравнению с контролем снижалось на 35,7%. через 3 ч - на 29%, а через 5 ч почти возвращалось к норме. В наших экспериментах с момента введения даларгина до момента декапита-ции животного при пролонгировании 3 ч гипотермии 30°С проходило 4 ч. Возможно за это время из крови полностью выводятся как даларгин. гак и продукты его деградации, в результате чего исчезают и их эффекты.

Выводы

1. Исследование содержания карбонильных и тиоловых групп в белках плазмы крови показало, что при кратковременной и особенно пролонгированной 3 ч гипотермии 30°С интенсифицируются процессы их окислительной модификации. При этом возрастает окисляемость белков. Напротив, при глубокой (20°С) гипотермии интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови снижается.

2. При гипотермии 30°С на фореграмме белков плазмы крови увеличивается количество высокомолекулярных белков, а также остается полоса неразделенных белков на старте.

3. Кратковременная гипотермия 30°С способствует повышению содержания восстановленных низкомолекулярных тиолов в плазме крови. Однако после пролонгированной 3 ч гипотермии 30°С и гипотермии 20°С содержание низкомолекулярных тиолов в плазме крови снижается, что отражает их участие в свободно-радикальных реакциях.

4. Гипотермия стимулирует образование среднемолекулярных пептидов Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови зависит от глубины и длительности гипотермии.

5. Кратковременная и пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С повышает активность супероксиддисмутазы эритроцитов. Углубление гипотермии до 2()°С приводит к снижению активности супероксиддисмутазы до контрольного >ровня Активность каталазы при всех уровнях гипотермии остается на уровне контроля.

6. Внутрибрюшинное введение даларгина контрольным животным незначительно, но достоверно снижает окислясмость белков пла мы крови, повышает содержание сул ьфгидрилькых групп в них, что снижает окислительный индекс. При этом даларгин не влияет на содержание в плазме

крови низкомолскулярных тиолов, среднемолекулярных пептидов, активность супероксиддисмутазы и каталазы.

7. При кратковременной гипотермии ЗО°С и 20°С даларгин предотвращает накопление в белках плазмы крови карбонильных групп и дисуль-фидных связей, повышение содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови, стабилизирует уровень низкомолекулярных тиолов в плазме и нормализует электрофоретический спектр белков. При пролонгированной 3 ч гипотермии ЗО°С даларгин не предотвращает изменение биохимического состава крови.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Кличханов Н.К., Халдун Авадх Убад, Исмаилова Ж.П Влияние даларгина на интенсивность окислительной модификации белков сыворотки крови при гипотермии / Физ-хим. основы функционирования белков и их комплексов. - Воронеж, 1998. - С. 103-107.

2. Исмаилова Ж.Г., Кличханов Н.К. Влияние гипотермии на содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови / Достижения и современные проблемы развития науки в Дагестане. Тез. докл. межд. конф. -Махачкала, 1999. - С. 223.

3. Кличханов Н.К., Львова СП., Халилов РА, Саидов М.Б., Исмаилова Ж. Г Влияние даларгина на перекисное окисление липидов тканей при гипотермии // Цитология. -1999. - Т. 41, №9. - С. 817-818.

4. Кличханов Н.К., Халилов Р. А., Саидов МБ., Исмаилова Ж.Г. Зависимость метаболических процессов от уровня гипотермии/ Тез. докл. межд. конф. -Тбилиси, 1999. - С. 22.

5. Азасв А.Б.. Исмаилова Ж.Г, Мирская P.O. Влияние предварительного внутрибрюшинного введения даларгина на потребление кислорода гомогенатами тканей крыс при гипотермии / Тез. докл. XXXVIII межд. научн. студенч. конференции. -Новосибирск. 2000. - С. 63-64.

6. Исмаилова Ж.Г. Дубровская Х.М., Кличханов Н.К. Интенсивность окислительной модификации белков и содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови сусликов в динамике зимней спячки /Материалы всероссийской научно практической конф. - Махачкала. 2001. - С. 111 -112.

7. Исмаилова Ж.Г. Кличхалов Н.К. Влияние гипотермии и даларги-на на содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови крыс // Вссгник ДГУ Ест. науки. - 2001. - Вып. I. - С. 71 -74.

8. Исмаилова Ж.Г, Кличханов Н.К. Окислительная модификация белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина /Тез.

докл. 5-й пущинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2001. — С.26-27.

9. Кличханов Н.К., Исмаилова Ж.Г., Эмирбеков Э.З. Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2001. - Т. 131, № 3. -С. 281-283.

К). Халилов РА, Магомедов К.Г., Исмаилова Ж.Г. Влияние далар-гина на тиоловые компоненты в гемолизатах крови крыс при гипотермии / Материалы всероссийской научно практической конф. — Махачкала, 2001. -С. 105-106.

11. Абдуллаев В.Р., Исмаилова Ж.Г, ДубровскаяМ. Д., Халилов Р. А., Кличханов Н.К. Интенсивность свободно-радикальных процессов в тканях сусликов при зимней спячке и периодических пробуждениях / Мат. научн. семинара. - Ставрополь, 2002. Вторая часть. - С. 64-65.

12. Исмаилова Ж.Г., Дубровская М.Д., Кличханов Н.К. Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови сусликов при зимней спячке / Тез. докл. 6-й пущинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2002.-С.85.

Форч.п 6П\Х-| 1/1 Г,. Гиршпурл «Г;шмо>. b'vM.iui »финиш. >«-.•■. псч. .1. 1,11. lnp.iA- ЮН h.'i. l'.iiMiiovicfin» im l\Ii.ntictinpi* lil»()KH «I,ih\ ii.iniiit.i».

р 12 7 7 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Исмаилова, Жамила Грамидиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Активные формы кислорода и механизмы окислительной модификации белков.

1.2. Интенсификация свободно-радикального окисления при низких температурах тела и его химическая коррекция.

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Обоснование выбора объекта исследования.

2.2. Постановка экспериментов.

2.2.1. Искусственное охлаждение животных.

2.3. Методика инъекций животным.

2.4. Препаративные методы исследования.

2.4.1. Получение плазмы и сыворотки крови.

2.4.2. Получение гемолизатов.

2.5. Биохимические методы исследования.

2.5.1. Определение окислительной модификации белков в плазме крови.

2.5.2. Определение содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови.

2.5.3. Определение активности супероксиддисмутазы в эриротроцитах.

2.5.4. Определение активности каталазы в эритроцитах.

2.5.5. Определение содержания гемоглобина.

2.5.6. Амперометрический метод определения низкомолекулярных и белковых сульфгидрильных групп.

2.5.7. Определение дисульфидных связей в белках и низкомолекулярных соединениях крови.

2.5.8. Электрофоретическое разделение белков плазмы крови.

Статистическая обработка материала.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина.

3.2.0кислительно-восстановительное состояние тиоловых групп белков и низкомолекулярных соединений плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина.

3.3. Электрофоретическое разделение белков плазмы крови при гипотермии и введении даларгина.

3.4. Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови при гипотермии и на фоне введения даларгина.

3.5. Активность СОД при гипотермии и введении даларгина.

3.6. Активность каталазы при гипотермии и введении даларгина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Окислительная модификация белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина"

Актуальность проблемы. В настоящее время в различных областях медицины, таких как хирургия, психиатрия, терапия, и в экспериментальной биологии широкое применение нашел метод искусственного снижения температуры тела (Мешалкин, Верещагин, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985; Ба-бийчук и др., 1990). Защитным эффектом гипотермии является понижение функций и обменных процессов, приводящих к повышению устойчивости организма к воздействию многих неблагоприятных факторов и, прежде всего тканевой гипоксии, обычно сопутствующих различным видам патологии (Эмирбеков, Львова, 1985; Lei et al., 1994; Ooboshi, et al., 2000).

Как известно, под действием низкой температуры тела и на начальных этапах гипотермии, активируется деятельность организма, повышаются энергозатраты, что стимулирует главный поставляющий энергию процесс - дыхание (Кулинский, Ольховский, 1992; Чуйкин, Вовенко, 1993; Алюхин, 1994). Активация дыхания увеличивает поток электронов по дыхательной цепи - от субстратов дыхания к кислороду, что неизбежно влечет за собой повышение продукции активных форм кислорода (Скулачев, 1998; Cadenas, Davies, 2000).

Усиленное образование активных форм кислорода (АФК) имеет место в начальный период гипотермии гомойотермов, когда температура тела падает на несколько градусов. Об этом свидетельствуют данные по активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) различных тканей при умеренной гипотермии (Василькова, 1988; Львова и др., 1993). Эти исследователи отметили важную роль активации процессов ПОЛ в развитии патологии при гипотермии. Вместе с тем установлено, что под действием АФК окисляются в первую очередь не липиды, а аминокислотные остатки белков, приводящие к их окислительной модификации (Davies, 1987; Дубинина, Шугалей, 1993). Интенсивность окислительной модификации белков при гипотермии почти не изучена, а, следовательно, не установлена роль этих процессов в развитии гипотермической патологии. Существуют единичные данные, свидетельствующие об активации окислительной модификации белков (ОМБ) при гипотермии (Халдун, 1998). Однако для оценки роли процессов ОМБ в развитии гипотермических патологии необходимо выяснить, каковы механизмы этих процессов и как они зависят от температуры тела.

Установлено, что синтетический опиоидный пептид, аналог лей-энкефалина, даларгин способен снижать интенсивность процессов ПОЛ при различных стрессорных состояниях. Так, при эмоционально-болевом стрессе введение даларгина заметно понижало процессы ПОЛ в миокарде (Лишма-нов и др., 1991) и в клетках печени (Шлозников и др., 1990; Короткина и др., 1992). И в условиях гипотермии введение даларгина способствует снижению интенсивности процессов ПОЛ в различных тканях (Львова и др., 1993). В связи с вышеизложенным представляется важным изучение возможности регуляции ОМБ плазмы крови даларгином при гипотермии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать содержание среднемолекулярных пептидов (СМП) в плазме крови;

3. Анализировать белковый спектр плазмы крови;

4. Исследовать состояние антиоксидантных ферментов по анализу активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что кратковременная, и особенно пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С существенно стимулирует процессы окислительной модификации белков плазмы крови крыс. Пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С увеличивает также окисляемость плазменных белков. Глубокая гипотермия снижает интенсивность ОМБ плазмы крови. Повышение степени ОМБ стимулирует их деградацию и накопление среднемолекулярных пептидов.

2. Электрофоретический анализ белков и исследование СМП свидетельствует о том, что гипотермия 30°С способствует как агрегации, так и фрагментации плазменных белков.

3. Интенсификация свободно-радикальных процессов в крови существенно активирует СОД в эритроцитах, но не влияет на активность каталазы.

4. Опиоидный гексапептид даларгин при предварительном внутри-брюшинном введении оказывает защитный эффект при гипотермии 30°С. Это выражается в снижении ОМБ, нормализации спектра белков плазмы крови, снижении содержания СМП. Однако при пролонгировании 3 ч гипотермии 30°С и гипотермии 20°С даларгин не оказывает защитное влияние.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведены систематические исследования интенсивности процессов окислительной модификации белков плазмы крови при гипотермии.

Установлено, что интенсивность процессов СРО белков зависит от уровня и длительности гипотермии. Умеренная кратковременная и пролонгированная 3 ч гипотермия существенно увеличивает окислительную деструкцию плазменных белков. Выявлена корреляция между интенсивностью ОМБ и содержанием в крови среднемолекулярных пептидов при гипотермии.

Обнаружено, что умеренная гипотермия и её пролонгирование способствует активации СОД крови. При этом активность каталазы остается на уровне контроля.

Установлено зависимое от температуры изменение содержания сульф-гидрильных и дисульфидных групп в плазме крови в динамике гипотермии.

Установлено, что гипотермия 30°С существенно изменяет электрофо-ретическую подвижность белков плазмы крови, способствует их агрегации и фрагментации.

Выявлена возможность коррекции процессов ОМБ плазмы крови на начальных этапах гипотермии путем предварительного внутрибрюшинного введения даларгина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные представляют интерес для понимания молекулярных механизмов холо-дового повреждения и формирования компенсаторно-приспособительных реакций при снижении температуры тела гомойотермов. Практическая значимость данной работы определяется перспективностью использования ряда изученных показателей крови для оценки состояния организма при различных уровнях гипотермии и её пролонгировании. Результаты работы указывают на возможность применения даларгина в качестве препарата, участвующего в регуляции свободно-радикальных процессов в крови на начальных этапах гипотермии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговой научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Дагестанского госуниверситета (Махачкала, 2001), 2-м международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1998), международной конференции, посвященной 50-летию ДНЦ РАН (Махачкала, 1999), международной конференции «Свободно-радикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), 38-й международной конференции, посвященной 100-летию основателя Сибирского отделения РАН М.А. Лаврентьева (Новосибирск, 2000), Всероссийской научно-практической конференции «Химия в технологии и медицине» (Махачкала, 2001), международном научном семинаре вузов Северо-Кавказского региона «Циклы» (Ставрополь, 2002), 5-й и 6-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Исмаилова, Жамила Грамидиновна

выводы

4. Гипотермия стимулирует образование среднемолекулярных пептидов. Содержание среднемолекулярных пептидов в плазме крови зависит от глубины и длительности гипотермии.

5. Кратковременная и пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С повышает активность СОД эритроцитов. Углубление гипотермии до 20°С приводит к снижению активности СОД до контрольного уровня. Активность каталазы при всех уровнях гипотермии остается на уровне контроля.

6. Внутрибрюшинное введение даларгина контрольным животным незначительно, но достоверно снижает окисляемость белков плазмы крови, повышает содержание сульфгидрильных групп в них, что снижает окислительный индекс. При этом даларгин не влияет на содержание в плазме крови низкомолекулярных тиолов, среднемолекулярных пептидов, активность СОД и каталазы.

7. При кратковременной гипотермии 30°С и 20°С даларгин предотвращает накопление в белках плазмы крови карбонильных групп и дисульфидных связей, повышение содержания среднемолекулярных пептидов в плазме крови, стабилизирует уровень низкомолекулярных тиолов в плазме и нормализует электрофоретический спектр белков. При пролонгированной 3 ч гипотермии 30°С даларгин не предотвращает изменение биохимического состава крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ход эволюции живых организмов совершается в тесном и неразрывном единстве с окружающей средой, возможность существования организмов в широком диапазоне внешней среды обеспечивается подвижной адаптационной перестройкой метаболизма тканей в соответствии с изменившимися условиями.

Одним из важнейших факторов, существенно сказывающихся на течении физиологических и биохимических процессов в организме, является температура. На суше это и наиболее изменчивый фактор внешней среды. При изменении температуры среды в организме гомойотермных незимоспя-щих животных развиваются как специфические терморегуляторные сдвиги, направленные на сохранение температурного гомеостаза, так и неспецифические стрессорные изменения, обусловленные действием температуры как чрезвычайного раздражителя (Гурин, 1989). Жесткое и продолжительное действие низкой температуры способствует развитию гипотермии.

Состояние гипотермии затрагивает практически все функциональные системы, причем сдвиги могут протекать по-разному в зависимости от ряда условий: вида животного, его возраста, состояния организма, особенностей охлаждения (способа, скорости и глубины понижения температуры тела).

На начальных стадиях гипотермии возрастает скорость потребления кислорода, дыхание, ускоряются некоторые функции почек (Акимов и др., 1977; Тимофеев, Прокопьева, 1997). При этом включаются вазомоторные и пиломоторные реакции, изменяются общие параметры кровообращения, наблюдается мобилизация липидов и углеводов, происходит соответствующая перестройка метаболических процессов (Сумбатов, 1985; Эмирбеков, Львова, 1985; Гурин, 1986; Кулинский, Ольховский, 1992). Во второй фазе происходит снижение, в третьей фазе - общее подавление основных жизненных функций. При переохлаждении эти процессы уже трудно регистрировать.

Биологическое время выживания у всех млекопитающих, включая человека, приблизительно одинаково. Время выживания уменьшается по мере углубления гипотермии: понижение температуры на несколько градусов -выживают дни и недели; 24°С - 24 часа; 15°С - 5-6 ч; около температуры замерзания - 1-2 часа. Механизм сокращения времени выживания еще не понятен, но полагают, что основная причина - неадекватная перфузия органов.

Состояние гипотермии, являясь типичным стрессорным раздражителем, приводит к активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (Турин, 1989; Кулинский, Ольховский, 1992). При чем на начальных этапах гипотермии резко увеличивается синтез и секреция катехоламинов, в результате чего в крови повышается содержание адреналина и норадренали-на (Майстрах, 1975; Шкестерс, 1991; Козырева, Верхогляд, 1997). Под действием катехоламинов происходит мобилизация депонированных липидов. Об этом свидетельствует существенное повышение в плазме крови НЭЖК на начальных этапах гипотермии (Алимова и др., 1973, 1984; Эмирбеков, Львова, 1985; Турин, 1986; Тимофеев, Прокопьева, 1997). НЭЖК являются более калоригенным субстратом, способствуют снижению Р/О и разобщению дыхания и фосфорилирования (Хаскин, 1975; Эмирбеков, Львова, 1985). Следствием разобщения является превращение энергии переноса электронов и протонов в тепло (Скулачев, 1989). В норме от 1 до 5% 02, потребляемого митохондриями, идет на образование АФК (Скулачев, 1998; Cadenas, Davies, 2000). Поскольку при разобщенном дыхании скорость потребления 02 митохондриями резко увеличивается, то количество образовавшихся АФК при этом также должно возрастать. Данные по анализу процессов ПОЛ в различных тканях свидетельствуют о том, что на начальных этапах гипотермии интенсифицируется образование АФК и активируются свободнорадикальные процессы в тканях (Шепелев и др., 1984; Василькова, Кухта, 1988; Львова и др., 1993; Кличханов, 2001). Процессы ПОЛ при гипотермии имеют свою специфику. Так, при умеренной гипотермии и, особенно при её пролонгировании, содержание первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (МДА) продуктов ПОЛ в различных тканях крыс увеличивается, а при глубокой гипотермии снижается, достигая значение контрольного уровня (Львова и др., 1993).

Вместе с тем установлено, что АФК, помимо ПОЛ, стимулируют окисление белков (Dean et al., 1997). Механизмы окислительной модификации белков более сложны, чем ПОЛ (Dean et al., 1997; Zwart et al., 1999; Dalle-Donne et al., 2003). Это связано с наличием в молекуле белка разнообразных аминокислотных радикалов. В отличие от ПОЛ, окислительная модификация белков при гипотермии совершенно не исследована. Поэтому не ясна роль процессов окислительной модификации белков в развитии патологии при гипотермии.

Активация свободно-радикальных процессов является неспецифической реакцией организма на различные по силе и длительности экстремальные воздействия (Меерсон, 1984; Барабой и др., 1992). При этом имеет место следующая цепь событий: стресс - выброс катехоламинов - активация свободно радикальных процессов. Отсюда следует, что антистрессорные препараты должны предотвращать активацию свободно радикальных процессов при экстремальных состояниях. Одним из препаратов, обладающих анти-стрессорным свойством, является синтетический аналог лей-энкефалина да-ларгин. Даларгин не влияет на базальный уровень катехоламинов, но предотвращает их рост при стрессе (Лишманов, Маслов, 1994). Даларгин предотвращает активацию процессов ПОЛ при стрессе (Шлозников, и др., 1990; Ко-роткина и др., 1992; Лишманов и др., 1992) и при гипотермии (Львова и др., 1993, 2002; Кличханов, 2001). Настоящая работа посвящена исследованию зависимости интенсивности процессов окислительной модификации белков плазмы крови от глубины и длительности гипотермии, а также выяснению возможности коррекции этих процессов путем введения даларгина.

При этом сосредоточили своё внимание на решении следующих задач:

1. исследование интенсивности окислительной модификации белков плазмы крови;

2. электрофоретического анализа плазменных белков;

3. выяснение роли антиокислительных ферментов в регуляции ОМБ;

4. установление коррегирующего влияния даларгина на ОМБ.

Карбонильные группы являются одним из важнейших маркеров окислительной модификации белков (Levine et al., 1990). Анализ показал, что при умеренной гипотермии происходит более чем двукратное повышение содержания карбонильных групп в белках плазмы. Однако при этом не изменяется скорость окисления белков in vitro.

Существенное повышение содержания карбонильных групп в белках обнаружено при пролонгированной 3 часа гипотермии 30°С. При этом в белках плазмы крови содержание карбонильных групп увеличивается на 198%, а л , при спонтанном и Fe -зависимом окислении - на 81% и 63% соответственно относительно контроля. Повышение скорости окисления белков в условиях in vitro при пролонгировании 3 ч умеренной гипотермии свидетельствует, по-видимому, об изменении конформации белков, что приводит к увеличению доступа к ранее скрытым аминокислотным остаткам прооксидантов (Davies, 1987).

Таким образом, кратковременная и особенно пролонгированная 3 ч гипотермия 30°С существенно ускоряют ОМБ плазмы крови. Это свидетельствует о том, что на начальных этапах гипотермии интенсифицируются процессы образования АФК в крови и тканях.

Другим важнейшим критерием окислительной модификации белков является окисление их тиоловых групп (Dean et al.,1997). Окисление тиоло-вых групп может протекать как напрямую, так и ферментативным путем, с участием фермента глутатионпероксидазы и гидроперекисей липидов (Соколовский, 1988; Владимиров, 1989).

Сульфгидрильные группы играют ключевую роль в поддержании на-тивной структуры и каталитической активности многих мембранных белков-ферментов (Торчинский, 1977; Леонова, 1987; Sies, 1999). Важную роль сульфгидрильные группы играют в процессах транспорта и пассивной проницаемости ионов через мембрану (Кулинский, Колесниченко, 1990). В крови нативное состояние сульфгидрильных групп особенно необходимо для нормального функционирования гемоглобина.

Известно, что в белках различают поверхностные (легкодоступные) и скрытые (труднодоступные) сульфгидрильные группы (Торчинский, 1977). Отношение поверхностных сульфгидрильных групп к скрытым является одним из показателей, свидетельствующих о конформационных изменениях в исследуемых белках. С другой стороны, измеряя количество дисульфидных связей и сопоставляя их с общим числом сульфгидрильных групп (тиол-дисульфидный коэффициент), можно судить об интенсивности процессов окисления и восстановления сульфгидрильных групп белков и низкомолекулярных соединений.

Полученные нами данные показали, что умеренная (30°С) гипотермия приводит к небольшому (7,2%) уменьшению содержания белковых тиоловых групп и существенному возрастанию (33,3%) количества дисульфидных связей в белках, что свидетельствует о стимулировании умеренной гипотермией окислительной модификации белков, затрагивающей эти функциональные группы. Об этом же свидетельствует и повышение окислительного индекса белков, который с 0,260 в контроле возрастает до 0,373 при гипотермии.

При пролонгированной 3 часа умеренной (30°С) гипотермии, сохраняется тенденция к уменьшению (12,8%) содержания белковых тиоловых групп. При этом содержание дисульфидных групп возрастает на 57,5% относительно контроля. Это резко увеличивает окислительный индекс белков (0,469). Эти результаты согласуются с нашими данными о повышении количества карбонильных групп в белках и в целом свидетельствуют о существенном возрастании скорости окислительной модификации плазменных белков при пролонгированной умеренной гипотермии.

При гипотермии 20°С в плазме крови количество SH-групп белков понижается (9,7%, р<0,05). При этом содержание дисульфидных связей в белках остается повышенным (18,6%) относительно контроля. Таким образом, при глубокой гипотермии в крови еще сохраняются процессы окисления тиоловых групп.

Каковы же возможные источники активных форм кислорода в крови при гипотермии? На начальных этапах гипотермии активируется как внешнее дыхание, так и дыхание на уровне митохондрий (Алюхин, 1992; Чуйкин, Вовенко, 1993). При гипотермии увеличивается также и скорость дыхания и фосфорилирования в митохондриях (Медведев, 1981; Волжина, 1992; Мирская, 2000). Это является одной из причин утечки электронов из электронно-транспортной цепи митохондрий, что приводит к усилению генерации АФК (Скулачев 1998; Dean et al., 1997; Griffiths, 2000).

Активация СРО при умеренной гипотермии приводит к повреждению клеток (Кличханов, 2001). Вследствие этого повреждения нарушается секвестрация ионов металлов переменной валентности, особенно железа (Биленко, 1989), которые, пока их не связал трансферрин, катализируют образование ОН"- радикалов из менее опасных 02 *, Н2О2. Десеквестрация железа может опосредоваться высвобождением Fe3+ из ферритина, индуцированным 02', из трансферрина за счет ацидоза, а также из цитохрома Р-450, гемоглобина, миоглобина (Дубинина, 1992). Именно металлы переменной валентности (Fe , Си ), генерируя ОН"- радикалы, способствуют образованию карбонильных групп в белках (Дубинина, Шугалей, 1993). Показано, что при умеренной гипотермии существенно ускоряются процессы внутрисосудистого гемолиза эритроцитов, в результате чего в плазме крови в 8 раз увеличивается содержание свободного гемоглобина (Кличханов и др., 1997). При этом на 30% возрастает в сыворотке крови содержание ионов железа. Установлено, что гемовое и негемовое железо играют важную роль в активации свободно-радикальных процессов в плазме крови (Лукаш и др., 1979).

Другим источником свободных радикалов кислорода может служить реакция превращения адреналина в адренохром (Меерсон, 1984, 1988). При умеренной гипотермии в плазме крови многократно возрастает содержание адреналина и норадреналина (Шкестсрс и др., 1991; Козырева и др., 1999).

Эндотелиальные клетки сосудов являются источником супероксида, пероксида и пероксинитрита, которые частично попадают в кровоток (Меныцикова, и др., 1997). Также источниками АФК в крови могут являться эндотелийсвязанные ферменты ксантиноксидаза, NO-синтаза и, по-видимому, экстрацеллюлярная СОД (Зенков, Меныцикова,1993).

Таким образом, на начальных этапах гипотермии могут активироваться множество путей образования АФК как в крови, так и в тканях. Наиболее долгоживущие из АФК (Н202, 02 *) в последующем могут также попасть в кровоток и стимулировать процессы окислительной модификации белков.

Известно, что окислительно-модифицированные белки подвергаются, с одной стороны, агрегации, с другой стороны, фрагментации - спонтанной или под действием специфических протеиназ (Levine, 1983; Davies, 1987; Dean et al, 1997). Агрегация чаще всего является результатом образования битирозиновых сшивок и дисульфидных мостиков (Дубинина, Шугалей,

1993; Davies, 1987; Dean et al., 1997).

Об агрегации белков при низких температурах тела свидетельствуют данные, полученные нами при гель-электрофорезе. Оказалось, при гипотермии 30°С, в отличие от контроля, на старте геля остается полоса неразделенных белков. Кроме этого, при гипотермии увеличивается количество полос на фореграмме по сравнению с контролем. Это происходит за счет увеличения количества высокомолекулярных и низкомолекулярных белков. Наличие полосы неразделенных белков и повышение доли высокомолекулярных белков в плазме крови при гипотермии свидетельствуют об агрегации белков, важную роль в которой играет, по-видимому, их окислительная модификация. Ранее (Эмирбеков и др., 1980; Михайленко, 1985) наличие полосы неразделенных белков при гипотермии было обнаружено в водорастворимой фракции белков мозга крыс. Это, видимо, говорит о том, что при гипотермии индуцированная АФК агрегация белков характерна для различных тканей.

Обращает на себя внимание тот факт, что при гипотермии 30°С пара-лельно с возрастанием количества высокомолекулярных белков выявляется возрастание количества низкомолекулярных белков. Увеличение пиков в низкомолекулярной области свидетельствует о частичной фрагментации окисленных белков, поскольку окислительно-модифицированные белки легче и быстрее гидролизуются специфическими протеиназами (Davies, 1987; Oliver et al., 1987; Stadtman, 1992; Davies, 2001). Повышение количества окислительно-модифицированных молекул белков в условиях гипотермии приводит к их быстрому удалению путем активации системы распада (Эмирбеков, Львова, 1985). Скорость распада модифицированных белков в 10 раз превышает среднюю скорость распада обычных белков (Дин, 1981). Снижение содержания карбонильных групп и дисульфидных связей в плазменных белках при глубокой гипотермии по сравнению с умеренной, видимо, также связано с ускорением распада модифицированных белков под действием специфических протеиназ.

Уровень ереднемолекулярных пептидов, является показателем интенсивности протеолиза и спонтанной деградации окислительно-модифицированных белков (Гордеева и др., 1986; Волчегорский и др., 1994). Полученные нами данные показали, что при гипотермии происходит увеличение содержания СМП в плазме крови крыс, которое зависит от её глубины и длительности. При гипотермии 30°С содержание СМП в плазме крови крыс возрастает на 34%, а её пролонгирование 3 ч, приводит к дальнейшему их росту (до 45%), При глубокой гипотермии содержание СМП в плазме крови увеличивается еще в большей степени (до 70%). Повышение содержания СМП плазмы крови при гипотермии в большей степени связано, видимо, с активацией процессов их протеолиза, а в то же время нельзя исключить и попадание в плазму крови СМП из тканей. Показано, что при гипотермии 20°С в плазме крови обнаруживаются специфические ферменты печени (Утно и др., 1989), что свидетельствует о повышении проницаемости клеток тканей при гипотермии. Данные об активности протсиназ плазмы крови при гипотермии отсутствуют. В то же время при гипотермии увеличивается активность тканевых протеаз, а также происходит ускорение процессов автолиза и протеолиза белков мозга (Нурмагомедова и др., 1983; Нурмагомедова, 2001).

Повышение активности протеолитических ферментов, видимо, имеет в какой то степени компенсаторный характер, поскольку накопление окислительно-модифицированных белков сопровождается развитием ряда патологических состояний, таких как ревматоидный артрит (Chapman et al., 1989), болезнь Альцгеймера (Smith et al., 1991), респираторный дистрессовый синдром (Gladstone, Levine, 1994), болезнь Паркинсона (Yoritaka et al, 1996) и атеросклероз (Uchida et al., 1994).

Таким образом, одна из причин повышения уровня СМП в плазме крови при гипотермии может быть связана с усилением протеолиза белков, модифицированных радикалами кислорода.

В организме важная роль в ингибировании свободно-радикальных реакций принадлежит таким низкомолекулярным сульфгидрильным соединениям, как глутатион и цистеин (Соколовский, 1988). Проявляя антирадикальное и антиперекисное действия, низкомолекулярные тиолы подвергаются обратимому окислению с образованием соответствующих дисульфидов (Ку-линский, Колесниченко, 1990; Соколовский и др., 1993).

Полученные нами данные показали, что при умеренной (30°С) гипотермии существенно (39,3%) увеличивается количество БН-групп низкомолекулярных тиоловых соединений в плазме крови. Параллельно значительно снижается количество дисульфидных связей в низкомолекулярных тиолах плазмы крови. Одной из причин увеличения содержания низкомолекулярных тиоловых соединений в плазме крови при умеренной гипотермии может являться их восстановление из окисленных форм. Другим источником тиоловых соединений плазмы крови при гипотермии могут быть эритроциты, которые усиленно подвергаются внутрисосудистому гемолизу (Эмирбеков и др., 1991; Кличханов, 2001).

При пролонгированной 3 ч умеренной (30°С) гипотермии, в отличие от кратковременной, выявилось уменьшение содержания низкомолекулярных тиоловых групп, а содержание дисульфидных связей низкомолекулярных групп существенно повышается (54,2%). Поскольку при пролонгированной гипотермии значительно ускоряются процессы образования АФК и окислительной модификации белков, то снижение содержания низкомолекулярных тиолов плазмы крови отражает их окисление в реакциях со свободными радикалами, окисленными белками и АФК.

Основными низкомолекулярными соединениями плазмы крови, определяющими количество сульфгидрильных групп, являются цистеин и глута-тиои (Торчинский, 1977). В большинстве клеток концентрация небелковой серы на 90% определяется содержанием глутатиона. Уровень цистеина, напротив, в клетках и межклеточной жидкости низок (Степуро и др., 1995). Это, вероятно, связано с легкой окисляемостью цистеина. БН-группы этих соединений легко окисляются АФК и другими соединениями (Кулинский, Колесниченко, 1990). Принимая на себя «удар» окислителей, алкилирующих и ацилирующих агентов, глутатион и цистеин защищают, таким образом, от окисления БН-группы ферментов, мембранных белков, либо восстанавливают их (Торчинский, 1977). Исходя из этих соображений, мы склонны думать, что снижение количества низкомолекулярных БН-содержащих соединений в плазме крови крыс при всех уровнях гипотермии отражает их участие в вы-шерассмотренных процессах.

Одними из важнейших антиоксидантных ферментов в крови являются СОД и каталаза. СОД является единственным антирадикальным ферментом, участвующим в дисмутации супероксида, а каталаза разрушает перекись, образующуюся в супероксиддисмутазной реакции (Дубинина, 1989, 1992). Согласованное действие этих ферментов способствуют снижению уровню ок-сидантов в клетках.

Исследование СОД показало, что кратковременная гипотермия увеличивает активность СОД на 22,6%, а при пролонгированной 3 ч гипотермии 30°С это повышение более существенно (80,3%). Рост активности СОД при кратковременной и пролонгированной гипотермии 30°С следует рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на нормализацию уровня АФК и процессов ПОЛ. Высокий уровень активности СОД служит показателем усиления генерации 02 * и процессов ПОЛ (Львова и др., 1993). Однако, повышение активности СОД, вероятно, является недостаточным для угнетения СРО, уровень которого в эритроцитах остается достаточно высоким (Ва-силькова и др., 1990; Эмирбеков и др., 1995). Повышение активности СОД при гипотермии возможно связано с изменением окислительно-восстановительного состояния важной тиоловой группы фермента. Показано, что добавление цистеина и глутатиона способствует повышению активности СОД (Hoshino et al., 1985).

В отличие от умеренной гипотермии, глубокая (20°С) гипотермия приводит к небольшому (10,7%) снижению активности СОД по сравнению с контролем. Так как при глубокой гипотермии снижается генерация АФК (в том числе и Ог *), снижение активности СОД может быть следствием снижения концентрации субстрата. Возможно, что снижение активности СОД при глубокой гипотермии является результатом её окислительной модификациии. Данные А.Г. Гасангаджиевой (1999) свидетельствуют о том, что восстановленный глутатион in vitro приводит к повышению активности СОД при гипотермии 20°С. Эти результаты подтверждают возможность снижения активности СОД при гипотермии 20°С вследствие окисления SH-групп активного центра.

В отличие от СОД, активность каталазы существенно не изменяется при исследованных гипотермических состояниях. Высокий уровень каталаз-ной активности на фоне снижения активности СОД при глубокой гипотермии, видимо, с одной стороны связан с усилением генерации Н202 альтернативным путем, а с другой необходимостью поддержания концентрации перекиси водорода на низком уровне. Последнее необходимо в связи с тем, что перекись водорода во взаимодействии с ионами железа генерирует самый ре-акционноспособный ОН' (Владимиров, 1989; Meneghini, 1997; Griffiths, 2000). Поддержание высокой активности каталазы при гипотермических состояниях играет важную биологическую роль, так как способствует разложению образовавшейся как ферментными дисмутазными, так и альтернативными путями, токсичной Н202.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что фермен-татавивное звено антиоксидантной системы изменяется в соответствии с изменением интенсивности окислительной модификации плазменных белков.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что умеренная и особенно пролонгированная 3 ч умеренная гипотермия стимулирует процессы образования АФК, приводящие к интенсификации окислительной модификации плазменных белков.

Одной из основных причин активации СРО при гипотермии является развитие низкотемпературного стресса (Куликов и др., 1988; Бородин и др., 1992). Антистрессорные препараты, по-видимому, будут способоствовать снижению интенсивности СРО в тканях при гипотермии. Эффективным ан-тистрессорным препаратом является синтетический аналог лей-энкефалина -гексапептид даларгин (Маслова и др., 1991; Дворцин, Шаталов, 1991; Лиш-манов и др., 1997). Установлено, что даларгин участвует в коррекции процессов ПОЛ при различных функциональных состояниях (Лишманов и др., 1991, 1992; Короткина и др., 1992; Шлозников и др., 1990). С.П. Львова с сотр. (1993) установили, что даларгин снижает интенсивность процессов ПОЛ в различных тканях при гипотермии. Основываясь на этих данных, мы в своих исследованиях для коррекции процессов окислительной модификации белков плазмы крови также использовали даларгин.

При умеренной гипотермии даларгин достоверно снижает содержание карбонильных ipynn в белках как в неинкубируемых, так и в инкубируемых пробах по сравнению с гипотермией без введения пептида. Однако при пролонгировании состояния гипотермии 30°С в течение 3 ч даларгин совершенно не оказывает эффекта на содержание карбонильных групп в белках плазмы крови, а также на их скорость окисления в условиях in vitro.

В следующей серии опытов мы исследовали влияние даларгина на тио-ловые группы белков плазмы крови. В контроле введение даларгина достоверно повышает содержание общего количества SH-групп в белках, но существенно не влияет на содержание дисульфидных связей в них. При кратковременной умереной гипотермии даларгин предотвращает снижение тиоло-вых групп в белках, а также их окислению. В случае пролонгирования в течение 3 ч умеренной гипотермии даларгин не препятствует снижению содержания тиоловых групп в белках, а также их окисление. При глубокой гипотермии введение даларгина способствует нормализации уровня как SH-групп, так и S-S связей в белках плазмы крови при гипотермии.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что даларгин защищает белки плазмы крови от окислительной модификации при гипотермии, хотя выраженность этого эффекта не столь значительна. Как видно, при пролонгированной гипотермии даларгин не препятствует ОМБ. Даларгин не обладает непосредственным антиоксидантным действием в использованной нами концентрации, а действует опосредованно через взаимодействие со специфическими рецепторами на клетках различных тканей (Лишманов, Мае лов, 1994). При пролонгированной гипотермии существенно ускоряются процессы ПОЛ в различных тканях (Львова и др., 1993; Кличха-нов, 2001). Опиоидные рецепторы весьма чувствительны к АФК и продуктам ПОЛ и существенно теряют аффинность к своим лигандам (Белоконева, Зайцев, 1993). Возможно, и при пролонгированной умеренной гипотермии происходит потеря чувствительности рецепторов к даларгину и в связи с этим снижается выраженность его эффектов.

При кратковременной умеренной и глубокой гипотермии защитные эффекты даларгина, видимо, связаны с тем, что пептид влияет на генерацию

АФК. Ранее было показано, что введение даларгина приводит к снижению генерации АФК в тканях (Короткина и др., 1990; Лишманов и др., 1992). Да-ларгин стабилизирует мембраны клеток, тем самым, предотвращая попадание в кровь окисленных белков из тканей. В частности показано, что введение даларгина предотвращало попадание в кровь гепатоспецифических белков при стрерсе (Короткина и др., 1992).

Изменение количества окислительно-модифицированных белков в плазме крови при введении даларгина может быть связано с его влиянием на процессы протеолиза. Анализ содержания СМП плазмы крови показал, что у контрольных животных введение опиоидного пептида не влияет на их уровень. При кратковременной умеренной и глубокой гипотермии почти полностью предотвращается рост содержания СМП в плазме. А при пролонгированной 3 ч умеренной гипотермии даларгин частично снижает уровень СМП в плазме крови. Таким образом, динамика изменения содержания СМП в плазме крови на фоне даларгина схожа с динамикой изменения степени окислительной модификации белков. Это означает, видимо, что снижение даларгином ОМБ способствует снижению скорости их протеолиза.

Параллельно со снижением содержания СМП в плазме крови при умеренной гипотермии при введении даларгина уменьшается количество низкомолекулярных пиков на фореграммах белков плазмы крови. Это также свидетельствует о том, что даларгин уменьшает протеолиз белков плазмы крови при гипотермии. Показано, что даларгин способен регулировать активность протеиназ (Слепушкин и др., 1988). Снижение содержания СМП и низкомолекулярных белков в плазме крови при гипотермии на фоне введения даларгина, возможно, связано также со снижением поступления их из тканей в результате стабилизации мембран клеток пептидом.

На фоне даларгина при умеренной гипотермии уменьшается количество высокомолекулярных белков, а также исчезает полоса неразделенного белка на старте. Это свидетельствует о том, что даларгин препятствует arpeгации белков при гипотермии.

В связи с полученными данными было исследовано влияние даларгина на компоненты антиоксидантной системы крови.

Анализ влияния даларгина на содержание низкомолекулярных тиолов плазмы крови показал, что пептид при кратковременной гипотермии 30°С и 20°С предотвращает снижение содержания 8Н-групп в низкомолекулярных соединениях плазмы крови и их окисление. Однако при пролонгировании 3 ч состояния гипотермии 30°С даларгин не препятствует снижению содержания низкомолекулярных тиолов и их окислению.

Таким образом, при кратковременных формах гипотермии даларгин предотвращает истощение фонда низкомолекулярных антиоксидантов плазмы крови. Возможно, это связано с тем, что в присутствии даларгина не наблюдается активации свободно-радикальных процессов и, тем самым сохраняются запасы антиоксидантов.

Исследование ферментативного звена антиоксидантной системы показал, что даларгин при гипотермии существенно не влияет на активность СОД и каталазы. Это означает, что регуляция свободно-радикальных процессов даларгином при гипотермии не связана со стимуляцией пептидом антиокси-дантных ферментов. Активация СРО при гипотермии способствует активации и ферментативного звена антиоксидантной защиты, а, скорее всего это связано с уменьшением индукции АФК.

Снижение интенсивности АФК в тканях гипотермированных животных при введении даларгина может быть связано с несколькими причинами. Показано, что опиоидные пептиды, в том числе и даларгин, снижают потребность тканей в кислороде при экстремальных состояниях (Слепушкин и др., 1988). Даларгин обладает способностью снижать кислородный запрос тканей (Яснецов, 1988; Слепушкин и др., 1988). Антигипоксические свойства даларгина обусловлены стимуляцией опиоидных рецепторов. В реализации проти-вогипоксических эффектов опиоидов принимают участие |ы- и 5-опиоидные рецепторы. По данным Г.К. Золоева с сотр. (1992) энкефалины, опосредуя свое влияние через (¿-рецепторы, повышают устойчивость организма к действию гипоксической гипоксии, в то время как б-рецеторы не принимают участия в реализации антигипоксического эффекта опиоидных пептидов.

Даларгин снижает уровень лактата в венозной крови. Это, по-видимому, обусловлено и способностью даларгина уменьшать проявления регионарной ишемии и гипоксии тканей. Противоишемическое действие опиоидного пептида при различных видах циркуляторной недостаточности обусловлено снижением тонуса резистивных сосудов, общего периферического сопротивления сосудов и улучшением периферической гемодинамики. (Золоев и др., 1989). Об этом свидетельствуют также данные В.И. Смирновой с сотр. (1994), о выраженном действии даларгина на транскапиллярный обмен жидкости в легких при экспериментальном отеке легких различной этиологии.

Установлено, что даларгин улучшает микроциркуляцию и лимфоток (Хугаева, 1988; Золоев, 1989). Авторы пришли к заключению о наличии трех механизмов действия даларгина на микроциркуляторном уровне. Первый заключается в увеличении сосудистой проницаемости. Это положение подтверждают такие проявления, как набухание стенок и ядер эндотелия микрососудов, увеличение диапедеза клеток крови из сосудов в ткань. Вторым важным механизмом действия даларгина является активация лимфотока, которая осуществляется тремя путями: 1) в результате прямого действия препарата на сократительный аппарат лимфатических микрососудов с увеличением частоты сокращения стенки и клапанов лимфатических микрососудов, 2) вследствие повышения сосудистой проницаемости увеличивается объем ин-терстициальной жидкости и, как следствие этого процесса, - лимфообразование и лимфоток; 3) усиление моторики кишечника способствует механическому выталкиванию спланхнической области, что также вносит определенный вклад в активацию лимфотока. Третьим важным механизмом действия даларгина является активация диапедеза лейкоцитов, которая будет способствовать активации фагоцитарной функции лейкоцитов во внесосудистом пространстве, что чрезвычайно важно для лечения воспалительных заболеваний различной этиологии и ускорения репаративных процессов в тканях (Зо-лоев и др., 1989).

Установлено, что даларгин существенно влияет на уровень стрессор-ных гормонов в крови. Показано, что введение даларгина не изменяет ба-зальный уровень катехоламинов и глюкокортикоидов, но препятствует повышению их уровня при различных стрессах (Лишманов, Маслов, 1994). Выше отмечалось, что гипотермический стресс существенно увеличивает содержание катехоламинов глюкокортикоидов (Шкестерс и др., 1991) в плазме крови. Возможно, что даларгин в условиях гипотермии также препятствует росту стрессорных гормонов в плазме крови, следовательно, в этих условиях не будет нарастать уровень АФК за счет окисления адреналина в адренохром.

Предотвращение повышения уровня катехоламинов на фоне даларгина при гипотермии не будет способствовать стимуляции потребления кислорода и окислительных процессов в тканях. Снижение интенсивности дыхания на фоне даларгина снижает и выработку АФК за счет этих процессов при гипотермии.

Уменьшение содержания АФК при гипотермии на фоне даларгина возможно за счет влияния пептида на ферменты, генерирующие их. Так, Р.Н. Короткина с сотр. (1992) показала, что введение даларгина снижает активность ксантиоксидазы в печени крыс с холестазом. Даларгин снижает активность этого фермента также и в мозге при миоплегии (Короткина и др., 1990).

В индукции АФК в крови важную роль играет геминовое и негемино-вое железо (Лукаш и др., 1979). Оказалось, что даларгин при гипотермии снижает как уровень железа, так и гемоглобина в крови за счет снижения гемолиза эритроцитов (Кличханов, 2001). Следовательно, снижение уровня железа или железосодержащих компонентов плазмы крови при гипотермии на фоне даларгина приводит к снижению скорости генерации АФК.

Отсутствие протекторного эффекта даларгина при пролонгированной гипотермии связано с его низкой стабильностью. При различных способах введения (интранозально, внутрибрюшинно, -венно, -мышечно) максимальная концентрация даларгина в крови наблюдается через 10 мин (Виноградов и др., 1988). В результате всасывания и деградации даларгина через 15 мин количество его составляет лишь 5% от дозы, а скорость элиминации даларгина не зависит от способа введения. Известно, что даларгин в крови довольно быстро (за 7-13 мин) деградируется протеолитическими ферментами до пентапетида (Тир-Дала-Гли-Фен-Лей) (Полонский, Коробов, 1986; Виноградов и др., 1988). Гидролиз энкефалинов и их аналогов в крови осуществляется тремя типами пептидаз (Клуша, 1984; Сепетов и др., 1986; Панченко и др., 1999). Пентапептид в свою очередь более медленно (40 мин) гидролизуется до тетрапетида (Тир-Дала- Гли- Фен), стабильного примерно около 60 мин. Как даларгин, так и образующиеся пента- и тетрапептиды рецептируются опиоидными рецепторами (Каленикова и др., 1988). Продукты более глубокой деградации молекулы даларгина (в частности трипептид) опиоидной активностью практически не обладают. Данные ряда авторов позволяют предположить, что пента- и тетрапептиды, образующиеся из даларгина, также обладают протекторным действием, защищая мембраны от избыточного ПОЛ. Так, в экспериментах Б.М. Шлозникова и сотр. (1990) даларгин через 3 ч после инъекции понижал содержание МДА в печени крыс на 27%. По данным Р.Н. Короткиной с соавт. (1992) внутрибрюшинное введение даларгина (10, 50, 100 мкг/кг массы) в течение 5 ч поддерживает низкий уровень МДА в печени. При этом через 1 ч после инъекции содержание МДА по сравнению с контролем снижалось на 35,7%, через 3 ч - на 29%, а через 5 ч почти возвращалось к норме. В наших экспериментах с момента введения даларгина до момента декапитации животного при пролонгировании 3 ч гипотермии 30°С проходило 4 ч. Возможно за это время из крови полностью выводятся как даларгин, так и продукты его деградации, в результате чего исчезают и их эффекты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исмаилова, Жамила Грамидиновна, Махачкала

1. Абдуллаев P.A. Свободные аминокислоты и аминокислотный состав белков мозга при гипотермии и постгипотермическом периоде. - Авто-реф. дис. . канд. биол. наук. - Ереван, 1982. - 21 с.

2. Акимов Г.А., Алишев Н.В., Бернпггейн В.А., Буков В.А. Общее охлаждение организма Л., Медицина, 1977. - 184 с.

3. Алимова Е.К., Максименко В.А., Шепелев А.П. Динамика показателей обмена липидов при острой гипотермии // Физиол. журн. СССР. 1973. -Т. 59, № 5. -С. 814-817.

4. Алюхин Ю.С. Дыхание и кровообращение в терминальных стадиях глубокой гипотермии // Физиол. журн. им. Сеченова. 1994. - Т. 80, № 5. -С. 46-53.

5. Арчаков А.И., Мохосоев И.М. Модификация белков активным кислородом и их распад // Биохимия. 1989. - Т.54, вып. 2. - С.179-186.

6. Бабийчук Г.А., Марченко B.C., Чижевская И.В. Синаптические механизмы пространтвенной синхронизации биотоков охлаждённого мозга // Криобиол. 1990. - № 2. - С. 11-17.

7. Барабой В.А., Брехман И.И., Голоткин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СпБ.: Наука, 1992. 142 с.

8. Бекбосынова Р.Б., Долгова З.Я. Изменения состояния окислительно-восстановительной системы глутатион-глутатионредуктаза НАДФН. в крови и тканях белых крыс при действии высокой и низкой температуры // Биол. науки. 1983. - № 6. - С. 50-54.

9. Белоконева О.С., Зайцев C.B. Роль мембранных липидов в регуляции функционирования рецепторов нейромедиаторов // Биохимия. 1993. -Т. 58, вып. 11.-С. 1685-1708.

10. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. -М.: Медицина, 1989. 368 с.

11. Болдырев A.A., Булыгина Е.Р., Волынская Е.А., Курелла Е.Г., Тюмина О.В. Влияние пероксида водорода и гипохлорита на активность Na, К-АТФазы мозга // Биохимия. -1995. Т.60, вып. 10. - С. 1688-1696.

12. Вальдман Б.М., Волчегорский И.А., Пужевский A.C., Лровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Среднемолекулярные пептиды крови как эндогенные регуляторы перекисного окисления липидов в норме и при термических ожогах // Вопр. мед. хим. 1991. - Т. 37, № 1. - С. 23-25.

13. Василькова Т.В., Кухта В.К. Применение а-токоферола ацетата для коррекции процесса перекисного окисления липидов эритроцитов при общей гипотермии организма // Здравохр. Белоруссии. 1988. - №8. -С.45-48.

14. Василькова Т.В., Кухта В.К., Королев А.Р. Сезонные различия в антиок-сидантной защите эритроцитов при общей перфузионной гипотермии организма // Здравохр. Белоруссии. 1990. - № 7. - С. 26-29.

15. Виноградов В.А., Полонский В.М. Даларгин наиболее активный синтетический аналог эндогенных опноидов для лечения язвенной болезни (итоги пятилетнего поиска) // Бюлл. Всесоюз. кардиол. науч. центра АМН СССР. 1986. - Т. 9, № 2. - С. 62-63.

16. Виноградов В.А., Каленикова Е.И., Соколов A.C. Биодоступность далар-гина и его метаболизм при интраназальном введении крысам // Биол. эксперим. биол. и мед. 1988. -№ 7. - С. 48-50.

17. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.

18. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Патол. физиол. и экспер. терап. -1989. -№4. -С.7-19.

19. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Сорос. образов, журн. 2000. - Т. 6, № 12. - С. 13-19.

20. Владыка A.C., Левицкий Э.Р., Поддубный Л.П., Габриэлян Н.И. Средние молекулы и проблема эндогенной интоксикации при критических состояниях различной этиологии // Анестезиол. и реаним. 1987. - № 2. -С. 37-42.

21. Волжина Н.Г. Углеводный и энергетический обмен головного мозга при адаптации к переохлаждениям / Автореф.дисс. докт. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1992. 35 с.

22. Волчегорский И.А., Вальдман Б.М., Скобелева H.A., Яровинский В.Г., Лифшиц Р.И., Зурочка A.B. О патогенетическом значении антиокси-дантных свойств среднемолекулярных пептидов при термических ожогах // Вопр. мед. хим. 1991. - № 2. - С. 28-32.

23. Волчегорский H.A., Вальдман Б.М., Скобелева H.A., Яровинский В.Г., Лифшиц Р.И., Зурочка A.B. О патогенетическом значении антиокси-дантных свойств среднемолекулярных пептидов при термических ожогах // Вопр. мед. хим. 1994. - № 2. - С. 28-32.

24. Волчегорский И.А., Власов A.B., Лившиц Г.Е., Ахкямов Э.М., Скабедева

25. H.A., Лифшиц Р.И., Эберт А.Я. «Средние молекулы» как неспецифические регуляторы активности фагоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. -1995.-№2. -С. 159-162.

26. Волчегорский И.А., Дятлов Д.А., Львовская Е.И., Ефименко Г.П., Са-шенков С.Л., Варыпаева Л.П. «Средние молекулы» как вероятные регуляторы системы эритрона у спортсменов-лыжников // Физиол. человека. 1996. - Т. 22, № 3. - С. 136-137.

27. Галактионов С.Г., Николайчик В.В., Цейтин В.М., Михнева Л.М. Моле-кулярно-биологические проблемы создания лекарственных средств и изучение механизма их действия // Хим-фарм. журнал. 1983. - Т. 17, № 11.-С. 1286-1293.

28. Гасангаждиева А.Г. Антиоксидантная активность тканей адаптированных к холоду крыс при гипотермии и самосогревании / Автореф дис. . канд. биол. наук. Махачкала, 1999. - 22 с.

29. Гордеева И.П., Иванова М.Н., Соловьева E.H., Габриэлян Н.И., Савостьянова O.A. Определение степени интоксикации у детей с хирургическими горными заболеваниями // Хирургия. 1986. - № 8. - С. 27-29.

30. Турин В.Н. Обмен липидов при гипотермии, гипертермии и лихорадке. Мн.: Беларусь. 1986. - 190 с.

31. Турин В.А. Симпатическая нервная система и регуляция температуры тела у эндотермных животных // Успехи физиол. наук. 1989. - Т. 20, № 2.-С. 3-25.

32. Дворцин Г.Ф., Шаталов В.Н. Антистрессорный эффект даларгина при иммобилизационном стрессе у крыс // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1991.- Т.61, №6. С.617-619

33. Дин Р. Процессы распада в клетке. М., 1981. 120 с.

34. Долгова З.Я. Изменение активности каталазы и угольной ангидразы в условиях легкой и глубокой гипотермии // Биол. науки. 1981. — №1. -С. 30-32.

35. Дубинина Е.Е. Активность и свойства СОД эритроцитов и плазмы крови человека в онтогенезе // Укр. биох. журн. 1988. - Т. 66, № 3. - С. 20-24.

36. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутаза в тканях организма // Успехи современ. биол. -1989. Т. 108, вып. 1 (4). - С. 3-18.

37. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови // Укр. биох. журн. 1992. - Т. 64, № 2. - С. 3-14.

38. Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков // Успехи совр. биол. 1993. - Т. 113, вып. 1. - С. 71-79.

39. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопр. мед. хим. 1995. - № 1. - С. 26-27.

40. Дубинина Е.Е. Активные формы кислорода и их роль в развитии оксида-тивного стресса / Фундамент, и прикладные аспекты современной биохимии: Труды научн. конф. С-Пб. - 1998. - С. 425-429.

41. Жигис JI.C., Рапопорт Е.М., Зуева B.C., Решетов П.Д. Исследование условий сульфитолиза рекомбинантного проинсулина человека // Хим.-фарм. журн., 1993. - Т. 27, № 11. - С. 53-58.

42. Зайцев В.Г, Закревский В.И. Методологические аспекты исследований свободно-радикального окисления и антиоксидантной системы организма // Вестник Волгоградской медицинской академии. Волгоград. 1998. Вып.4.-С. 49-53.

43. Зайцев В.Г., Закревский В.И. Защита клеток от экзогенных активных форм кислорода: методологические подходы к изучению / Фундамент, и прикладные аспекты современной биохимии: Труды научн. конф. — СПб. 1998. - С. 401-405.

44. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислотные метаболиты в биологических системах // Успехи современ. биол. 1993. - Т. 113, вып.З.-С. 286-296.

45. Зиц C.B. Определение тиол-дисульфидного равновесия крови методом кулонометрического титрования // Лаб. дело. 1991. - № 8. - С. 33-35.

46. Золоев Т.К., Слепушкин В.Д., Аргинтаев Е.С., Прум И.А., Соколович Т.Е. Использование синтетических аналогов энкефалинов в качестве ан-тиатерогенных средств // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1989. - Т. 58, № 10.-С. 468-470.

47. Золоев Г.К. Боброва И.В., Хабарова Н.И., Абисова Н.И. Некоторые механизмы участия опиоидных пептидов в регуляции углеводного обмена // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1992. - № 3. - С. 257-259.

48. Каленикова Е.М., Дмитриева О.Ф., Колобов Н.В., Жуковский С.Н., Ти-щенко В.А., Виноградов В.А. Фармакокинетика даларгина // Вопр. мед. хим. 1988. - № 1. - С. 75-83.

49. Кличханов Н.К. Метаболические и структурно-функциональные изменения в плазме крови и эритроцитах при гипотермии // Научная мысль Кавказа. Приложение. Спец. Выпуск. 2001. - С.38-50.

50. Клуша В.Е. Пептиды регуляторы функции мозга. Рига: Зинантние, 1984. - 142 с.

51. Ковалевский А.Н., Нифантьев О.Е. Замечания по скрининговому методу определения молекул средней массы // Лаб. дело. 1989. - № 10. - С. 3539.

52. Коган А.Х., Грачев C.B., Елисеева C.B., Баличев С.А. Углекислый газ -универсальный ингибитор генерации активных форм кислорода клетками (к расшифровке одной загадки эволюции) // Изв. АН. Серия биологическая. 1997. - №2. - С.204-217.

53. Козырева Т.В., Верхогляд Л.А. Адаптация к холоду и структура термо-регуляторного ответа при медленном и быстром охлаждении // Рос. Фи-зиол. журн. 1997. - Т. 83. - № 11-12. - С.135-142.

54. Козырева Т.В., Ткаченко Е.Я., Козарук В.П., Латышева Т.В., Гилинский М.Н. Особенности реакции симпатоадреналовой системы крыс при разных типах охлаждения // Рос. физиол. журн. 1999. - Т. 85, № 11. — С. 1434-1439.

55. Комов В.П., Шмелев В.К. О температурной зависимости кинетики ката-лазы в условиях субстратной инактивации // Биофизика. 1976. - Т. 21, вып5.-С. 799-809.

56. Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. - № 1. - С. 16-19.

57. Коростелев С.А., Исакова К.Л., Утешев Б.С., Щеголев А.И. Влияние эндогенных опиоидных пептидов и их синтетических аналогов на Т-клеточный иммунитет // Экспер. и клин. фарм. 1994. - Т. 57, № 1. — С.55.57.

58. Короткина Р.Н., Шлозников Б.М., Донич С.Г., Гребенчиков O.A., Ситников A.B., Карелин A.A. Изучение активности ксантиноксидазы в ткани головного мозга на фоне миоплегии // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. -Т. 59,№2.-С. 145-146.

59. Кричевская A.A., Шугалей B.C., Ананян A.A., Зигова И.Г. Оценка эффективности защитного действия аргинина в условиях холодового стресса // Вопр. мед. хим. 1985. - № 6. - С. 50 - 53.

60. Куликов В.Ю., Семенюк A.B., Колесникова JI.H. Перекисное окисление липидов и холодовой фактор. Новосибирск: Наука, 1988 - 191 с.

61. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Усп. совр. биол. 1990. - Т. 110, вып. 1. - № 4. - С. 20-23

62. Кулинский В.И., Ольховский И.А. Две адаптационные стратегии в неблагоприятных условиях резистентная и толерантная. Роль гормонов и рецепторов // Успехи соврем, биол. 1992. - Т. 112, вып. 5-6. - С. 697-714.

63. Лакин В. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 300 с.

64. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. - 957 с.

65. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. Новосибирск: Наука, 1987. - 240 с.

66. Линчевская A.A., Кондратьева Л.А. Влияние гипотермии на структурнофункциональные свойства мембран эритроцитов белых крыс // Вопр. мед. химии. 1989. - Т. 35, вып. 6. - С. 36-39.

67. Лишманов Ю.Б., Травков Ю.А., Федотов Г.В., Реброва Т.Ю. Влияние опиоидных нейропетидов на систему простагландинов и процессы ПОЛ в миокарде при его стрессорном повреждении // Бюлл. эксп. биол. и мед. -1991.-№6.-С. 612-621.

68. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1994. - 352 с.

69. Лопатина Н.И., Геронимус А.Л., Треместова Е.П. Определение фатального гемоглобина в крови с помощью ФЭКа // Лаб. дело. 1976. - № 6. -С. 328-331.

70. Лукаш А.И., Внуков В.В., Шерстнёва И.Я. Увеличение содержания гемоглобина и железа в сыворотке в условиях гипербарооксигенации и защитный эффект мочевины // Косм. биол. и авиакосм. мед. 1979. - № 2.-С. 45-51.

71. Львова С.П. Сравнительное изучение углеводно-фосфорного обмена в мозге сусликов и крыс в норме и при глубокой гипотермии в постна-тальном периоде // Укр. биохим. журн. 1971. - Т. 43. - № 2. - С. 198201.

72. Львова С.П., Горбунова Т.Ф., Абаева Е.М. Влияние гипотермии и далар-гина на перекисное окисление липидов в тканях крыс // Вопр. мед. хим. -1993. Т. 39, вып. 3. - С. 21-24.

73. Львова С.П., Абаева Е.М., Гасангаджиева А.Г., Михайленко И.К. Анти-оксидантная система тканей крыс при гипотермии и введении даларгина // Вопр. мед. хим. 2002. - Т.48. - С. 189-195.

74. Майстрах Е.В. Патологическая физиология охлаждения человека. Л.: Медицина, 1975. 216 с.

75. Маслова Л.В., Лишманов Ю.Б., Смагин Г.Н. Участие опиоидных пептидов в регуляции синтеза миокардного белка при стрессе и адаптации // Вопр. мед. хим. 1991. -№ 1. - С. 63-65.

76. Медведев А.Е. Исследование механизма активации НАД-зависимой изо-цитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ) при остром охлаждении // Регуля-торн. эффекты и обмен моноаминов и циклонуклеотидов. Красноярск, 1981.-С. 46-50.

77. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. Л.: Наука, 1981. -278 с.

78. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984. - 272 с.

79. Меерсон Ф.З. Избирательное подавление ПОЛ в головном мозге при стрессе // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1988. - № 11. - С. 542-544.

80. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении // Успехи совр. биол. 1997. - Т. 117, вып.2. - С. 155-171.

81. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Савинова А.Ф. Механизмы развития окислительного стресса при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Успехи современ. биол. 1997. - Т.117, вып.З. - С. 362372.

82. Мешалкин Е.Н., Верещагин И.Г. Окклюзия в условиях неглубокой гипо-термической защиты. Новосибирск: Наука, 1985. - 198 с.

83. Милютина Н.П., Ананян A.A., Шугалей B.C. Антирадикальный и анти-оксидантный эффект аргинина и его влияние на активность перекисного окисления липидов при гипоксии // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1990. - Т. 110,№9.-С. 261-265.

84. Мирская P.O. Исследование энергетических процессов в митохондриях тканей крыс при гипотермии. Дисс. канд. биол. наук. Махачкала, 2000. -32 с.

85. Михайленко И.К. Электрофоретическая подвижность белков различных фракций мозга крыс при гипотермии. В кн.: Биохимические механизмы зимней спячки и естественного сна / Тез. докл. симпоз. - Махачкала. -1985.-С. 89-90.

86. Никитченко Ю.В., Овсянников С.Е., Мазалов В.К., Липина О.В. Интенсивность перекисного окисления липидов в печени крыс при остром охлаждении / Патофизиологические аспекты действия холода на организм / Сб. научн. тр. Харьков, 1989. - С. 98-101.

87. Нурмагомедова П.М., Березин В.А., Эмирбеков Э.З., Рева А.Д. Влияние гипотермии на субклеточное распределение и некоторые физико-химическое свойства катепсина D в головном мозгу крыс // Укр. биохим. журн. 1983. - Т. 55, № 2. - С. 175-178.

88. Нурмагомедова П.М. Метаболизм белков мозга при гипотермии // Науч. мысль Кавказа. Приложение. Спецвыпуск. 2001. - С. 96-118.

89. Осипович В.К., Туликова З.А., Маркелов И.М. Сравнительная оценка экспресс-методов определения средних молекул // Лаб. дело. 1987. - № З.-С. 221-223.

90. Панченко Л.Ф., Митюшина Н.В., Фирстова Н.В., Генчин М.Т. Метаболизм энкефалинов при различных функциональных и патологических состояниях организма // Вопр. мед. химии. 1999. - Т. 4, вып. 4. - С. 271-289.

91. Ю1.Пашутин С.Б., Зиновьева Т.Д., Цыганков Л.Г., Смирнова В.И. Профилактика инфекционных осложнений даларгином у кардиохирургических больных // Хирургия. 1993. - № 11. - С. 55-59.

92. Пескин A.B., Столяров С.Д. Окислительный стресс как критерий оценки окружающей среды // Изв. АН. Серия биол. 1994. - № 4. - С. 588-595.

93. ЮЗ.Пескин A.B. Роль кислородных радикалов, образующихся при функционировании мембранных редокс-цепей в повреждении ядерной ДНК // Биохимия. 1996. - Т. 61, вып.1. - С. 65-72.

94. Поберезкина Н.Б., Осинская Л.Ф. Биологическая роль супероксиддисму-тазы // Укр. биохим. журн. 1989. - Т. 61, № 2. - С. 14-27.

95. Покровский В.М., Шейх-Заде Ю.Р., Воверейдт В.В. Сердце при гипотермии. Л.: Наука, 1984. - 141 с.

96. Полонский В.М., Коробов Н.В. Противоязвенное действие и периферическая опиоидная активность продуктов деградации даларгина // Бюлл. ВКНЦ АМН СССР. 1986. - Т. 9, № 2. - С. 83-86.

97. Ротанова Т.В. Энергозависимый селективный внутриклеточный протео-лиз. Строение, активные центры и специфичность АТР-зависимых про-теиназ // Вопр. мед. хим. 2001. - № 1.

98. Сантисук С. Перекисное окисление липидов в мозгу при гипотермии и возможная его химическая коррекция / Автореф. дис. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону. 1992. - 21 с.

99. ПО.Сепетов Н.Ф., Исакова О.Л., Пекелис Б.Л., Сураева Н.М. Изучение деградации даларгина и его аналогов в мембранах щеточной каймы энте-роцитов крыс методом Н-ЯМР спектроскопии // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР. 1986. - Т. 9. - № 2. - С. 76-78.

100. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии.

101. М.: Высшая школа. 1989. - 271 с.

102. Скулачев В.П. Снижение внутриклеточной концентрации 02 как особая функция дыхательных систем клетки // Биохимия. 1994. — Т. 59, вып. 12. - С. 1910-1912.

103. Скулачев В.П. О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 11. - С. 1570-1579.

104. Слепушкин В.Д., Лишманов Ю.Б., Золоев Г.К., Прум И.А. Современные представления о некоторых нетрадиционных механизмах стресса // Усп. физиол. наук.- 1985.-Т. 16,№4.-С. 106-118.

105. Слепушкин В.Д., Золоев Г.К., Аргинтаев Е.С. Влияние даларгина на течение стресса и шока в эксперименте // Бюлл. ВКНЦ АМН СССР. -1986.-№2.-С. 60-61.

106. Слепушкин Г.А., Золоев Г.К., Виноградов В.А., Титов М.И. Нейропеп-тиды. Их роль в физиологии и патологии. Томск. 1988. 144 с.

107. Смирнова В.И., Пулина H.H., Казеннов В.В., Оранский A.B., Смирнов Е.П. Возможности использования даларгина в интесивной терапии критических состояний // Вестник РАМН. 1994. - № 6. - С. 48-51.

108. Сныткина И. В., Смирнов В. Ю., Коноваленко О. В. и др. Влияние экзогенного L-аргинина на обмен углеводов и аминокислот // Мат. межд. науч. конф. "Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза". 2000. - Ч. И. - С. 207-211.

109. Соколовский В.В. Определение содердания сульфгидрильных групп в крови амперометрическим титрованием // Лаб. дело. 1962. - № 8. - С. 3-6.

110. Соколовский В.В., Белозерова Л.А, Огурцова P.E. Метод количественного определения дисульфидных групп крови обратным амперометрическим титрованием // Лаб. дело. 1977. -№ 1. - С. 26-28.

111. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальное воздействие (Обзор) // Вопр. мед. хим. 1988. - № 1. - С. 2-11.

112. Соколовский В.В., Гончарова Л.Л., Покровская Л.А., Тырнова Е.В. Тио-ловые соединения и ацетилхолинэстераза эритроцитов при экспериментальном иммобилизационном стрессе // Межд. мед. обзоры. 1993. - Т. 1.,№3.-С. 194-196.

113. Спевак С.Е., Соловьева А.И., Шехтер А.Б. Даларгин регулятор репара-тивной регенерации тканей // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР. 1986. - Т. 9, №2.-С. 78-80.

114. Степуро И.И., Соколовская С.Н., Солодунов A.A. Окисление глутатиона и цистеина под действием свободных радикалов, генерируемых ультразвуком // Биофизика. 1995. - Т.40, вып. 6. - С. 1158-1163.

115. Сумбатов Л.А. Искусственная гипотермия (патофизиология и защитное действие). М.: Медицина, 1985. - 88 с.

116. Тимофеев H.H. Искусственный гипобиоз. М.: Медицина, 1983. 192 с.

117. Тимофеев H.H., Прокопьева Л.П. Нейрохимия гипобиоза и пределы криорезистентности организма. М.: Медицина, 1997. - 208 с.

118. Туликова З.А. Среднемолекулярные уремические токсины (обзор литературы) // Вопр. мед. хим. 1983. -№ 1. - С. 2-10.

119. Туликова З.А. Влияние молекул средней массы, выделенных из сыворотки крови обожженных на процессы ПОЛ // Вопр. мед. хим. 1983. -№ 3. - С. 108-111.

120. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука, 1977. - 301 с.

121. Утно М.Я., Липсберга З.Э., Силова A.A., Гиргенсоне Н.Я., Бисениекс Э.А., Дубур Г.А. Кардиопротекторные свойства производного 1,4-дигидропиридина глутапирона в условиях глубокой гипотермии // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1989. - Т. 108, № 11. - С. 558-561.

122. Хайсман Е.Б., Арефолов В.А., Маликова Л.А. Роль периферических ка-техоламинэргических систем в антистрессовом действии нейропептидов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1988. - №3. - С. 302-305.

123. Халдун Убад Авадх Биохимические изменения в крови при гипотермиии последующем самосогревании на фоне введения даларгина / Автореф. дис. канд. биол. наук. Махачкала. 1998. - 10 с.

124. Халилов P.A., Саидов М.Б., Халдун Авадх Убад, Эседова Т.М., Кличха-нов Н.К. // Вест. Дагест. госуд. ун-та. Естест. науки. 1998. - Вып.1. - С. 140-145.

125. Хаскин В.В. Энергетика теплообразования и адаптация к холоду. Новосибирск: Наука, 1975. - 200 с

126. Хугаева В.К. Влияние даларгина на микрогемо- и микролимфоциркуля-цию // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1988. - № 3. - С. 3 00-302.

127. Чуйкин А.Е., Вовенко Е.П. Механизмы развития гипоксии у крыс в условиях иммерсионной гипотермии // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -1993.-Т. 79,№9.-С. 89-97.

128. Шепелев А.П., Юфит П.М. Состояние процессов перекисного окисления липидов и система антиокислителей в динамике острой экспериментальной гипотермии // Изв.Сев.-Кав. Центра Высш. Школы. Естествен, науки. 1974. - № 3. - С. 34-37.

129. Шепелев А.П., Юфит П.М. Состав жирных кислот липидов органов белых крыс при гипотермии и в динамике самосогревания // Теоретич. и практич. пробл. действия низких температур на организм. Тез. Всес. конф.-Л., 1975.-С. 227.

130. Шепелев А.П. Перекисное окисление липидов в бурой жировой ткани крыс при остром охлаждении // Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова. 1978. -№ 1. - С. 108-112.

131. Шепелев А.П., Костромина А.И. Активность ферментативной системы регуляции перекисного окисления липидов теплокровных животных в условиях гипотермии // Цитохимич. и биохимич. исслед. в эксперим. -Нальчик: Изд-во КБГУ. 1979. - Вып. 8. - С. 81.

132. Шепелев А.П., Тимофеев H.H., Линник Т.Л., Молдованова Л.Л. Устойчивость белых крыс к низкой температуре на фоне сочетанного действиядибунола и диетический факторов // Известия СКНЦ ВШ. Естеств. науки. 1984. -№ 3. - С. 89-92.

133. Шинкаренко Н.В., Алексовский В.Б. Химические свойства синглетного молекулярного кислорода и значение его в биологических системах // Успехи химии. 1982. - Т. LI, вып. 5. - С. 713-735.

134. Шкестерс А.П., Утно Л.Я., Гиргенсоне Н.М. Регуляция активности су-пероксиддисмутазы во время глубокой гипотермии одновременным применением водо- и жирорастворимых антиоксидантов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1991. - Т. 111, № 6. - С. 593-595.

135. Шлозников Е.Б., Короткина Е.Б., Бабкина И.В., Карелин H.A., Фомчен-ков Е.П. Влияние даларгина на некоторые показатели перекисного окисления липидов печени в эксперименте II Бюлл. экспер. биол. и мед. -1990. -№ 12.-С. 609-610.

136. Шугалей B.C., Могильницкая Л.В, Ананян А.А, Горошинская И.А., Цветненко Е.З. Аминокислотные регуляторы метаболизма мозга при адаптации к холоду / Адаптивные и компесаторные процессы в головном мозге. Сб. науч. трудов. М. 1986. - Вып. 15. - С. 162-163.

137. Эмирбеков Э.З., Абдуллаев P.A., Исмаилов И.А. Белки мозга теплокровного организма при пониженных температурах тела // Биохимия человека и животных. Киев: Наукова Думка, 1980. 84-90 с.

138. Эмирбеков Э.З., Львова С.П. Механизмы биохимических изменений при низких температурах тела. Ростов-на-Дону: Изд-во РГУ. - 1985. - 80 с.

139. Эмирбеков Э.З., Сфиев А.А, Кличханов Н.К. Исследование устойчивости эритроцитов крыс при гипотермии // Пробл. криобиол. 1991. - № 4. -С. 31-33.

140. Эмирбеков Э.З., Львова С.П., Кличханов Н.К. Биохимические изменения крови при искусственной и естественной гипотермии И Пробл. криоби-ол. 1995. -№ 1.-С. 14-21.

141. Яснецов В.В. Антигипоксические свойства эндорфинов, энкефалинов и их аналогов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1988. - № 8. - С. 174-177.

142. Berlett B.S., Stadtman E.R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 20331-20316.

143. Brigelius-flohe R, Traber M.G. Vitamin E: function and metabolism // FASEB J. 1999. - V. 13. - P. 1145-1155.

144. Bomzon A, Ljubuncic P. Oxidative stress and vascular smooth muscle cell function in liver disease // Pharm. and Therap. 2001. - V. 89. - P. 295 -308.

145. Cadenas E., Davies K.J.A. Mitochondrial free radicals generation, oxidative stress, and aging // Free Rad. Biol. Med. 2000. - V. 29, № 315. - P. 222230.

146. Chaudiere J., Ferrari-Iliour R. Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanisms // Food and Chem. Toxicol. 1999. - V. 37. - P. 949-962.

147. Chapman M.L., Rubin B.R., Gracy R.W. Increased carbonyl content of proteins in synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis. // J. Rheumatol. 1989.- V. 16.-P. 15-19.

148. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell life // EMBO J. 1998. - V. 17. - P. 7151-7160.

149. Ciechanover A. Orian A., Scwartz A.L. Ubiquitin-mediated proteolysis: biological regulation via destruction // Bioessays. 2000. - V. 22. - P. 442-451.

150. Ciolino H.R., Levine R.L. Modification of proteins in endothelial cell death during oxidative stress // Free Rad. Biol. Med. 1997. - V. 22, № 7. - P. 1277-1282.

151. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. Structure and functions of the 20S and26S proteasoms // Annu. Rev. Biochem. 1996. - V. 65. - P. 801-847.

152. Dahlmann B., Ruppert T., Kloetzel P., Kuehn L. Suptypes of 20S proteasomes from skeletal muscle // Biochimie. 2001. - V. 83. - P. 295-299.

153. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D., Milzani A., Colombo R. Protein car-bonyl groups as biomarkers of oxidative stress // Clin. Chim. Acta. 2003. -V. 329.-P. 23-38.

154. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, № 20. - P.9895-9901.

155. Davies K.J.A., Delsignore M.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, № 20. - P.9908-9913.

156. Davies K.J. A. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome // Biochimie. 2001. - V. 83. - № 3/4. - P. 301-310.

157. Dean R.T. Hunt J.V., Grant A.J., Yamamoto Y., Niki E. Free radical damage to proteins: the influence of the relative localization of radical generation, antioxidants, and target proteins // Free Rad. Biol. Med. 1991. - V. 11. - P. 161-168.

158. Dean R.T., Fu S., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation // Biochem. J. 1997. -V. 324. - P. 1-18.

159. Dubiel W., Ferrell K., Pratt G., Rechsteiner M. Purification of an 11 S regulator of the multicatalytic protease // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 22699-22702.

160. Dubinina E.E., Gavrovskaya S.V., Kuzmich E.V., Leonova N.V., Morozova M.G., Kovrugina S.V., Smirnova T.A. Oxidative modification of proteins: oxidation of tryptophan and production of dityrosine in purified proteins using

161. Fenton's system // Biochemistry (Moscow). 2002. - T. 67, № 3. - P. 413421.

162. Evans P, Lyras L, Halliwell B. Measurement of protein carbonyls in human brain tissue // Methods Enzym. 1999. - V. 300. - P. 145-156.

163. Fridovich I. Biological effects of the superoxide radical // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 15, №247(1).-P. 1-11.

164. Fridovich I. Oxygen toxicity: a radical explanation // J. Exp. Biol. 1998. -V.201.-P. 1203-1209.

165. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochimie. 1975. - V. 57, № 5. - P. 657-660.

166. Gebicki J.M. Protein hydroperoxides as new reactive oxygen species // Redox Report. 1997. - V. 3, № 2. - P. 99-110.

167. Gebicki S., Gebicki J.M. Formation of peroxides in amino acids and proteins exposed to oxygen free radicals // Biochem. J. 1993. - V. 289. - P. 743-749.

168. Gladstone I.M., Levine R.L. Oxidation of proteins in neonatal lungs // Pediatrics. 1994. - V. 93. - P. 764 -768.

169. Glickman M.H., Rubin D.M., Fried V.A., Finley D. The regulatory particle of the Saccharomyces cerevisiae proteasome // Mol. Cell. Biol. 1998. - V. 18. -P. 3149-3162.

170. Gordon C.J. Thermal biology of the laboratory rat // Physiol, and Behav. -1990. V. 47, N. 5. - P. 963-991.

171. Griffiths H.R. Antioxidants and protein oxidation // Free Rad. Biol. Med. -2000. V. 33. S. - P. 202-225.

172. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. Structure of 20S proteasome from yest at 2,4A resolution // Nature. 1997. -V. 386.-P. 463-471.

173. Grune T., Reinheckel T., Davies K.J.A. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells // FASEB J. 1997. - V. 11. - P. 526 - 534.

174. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Lipid peroxidation a radical chain reaction //

175. Free Rad. Biol. Med., Clarendon Press.Oxford. 1985. - P. 139.

176. Halliwell B. Oxidants and the central nervous system some fundamental questions. Is oxidant damage relevant to Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease, traumatic injuri or stroke? // Acta Neurol. Scand. 1989. - V 126. -P. 23-33.

177. Hayashi T., Goto S. Age-related changes in the 20S and 26S proteosome ac-tivieties in the liver of male F344 rats // Mechan. Ageing and Develop. -1998.-V. 102.-P. 55-66.

178. Hawkins C.L., Davies MJ. Generation and propagation of radical reaction on proteins // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V. 1504. - P. 196-219.

179. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system // Annu. Rev. Biochem.1998.-V. 67.-P. 425-479.

180. Heinemeyer W., Fisher M., Krimmer T., Stachon U., Wolf D.H. The active sites of the eucaryotic 20S proteasome and their involvement in subunit precursor processing // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 25200-25209.

181. Himmelfarb J, McMonagle E, McMenamin E. Plasma protein thiol oxidation and carbonyl formation in chronic renal failure // Kidney Int. 2000. - V. 58, №6.-P. 2571-2578.

182. Hoshino T., Ohta Y., Ishiguro I. The effect of sulfhydryl compounds on the catalytic activity of Cu, Zn-superoxide dismutase purified from rat liver// Ex-perientia. 1985. - V. 15, № 41(11).-P. 1416-1419.

183. Jones D.P., Carlson J.L., Mody C.V., Cal J., Lynn J.M. Redox state of glutathione in human plasma // Free Rad. Biol. Med. 2000. - V. 28, № 4. - P. 625-635.

184. Kisselev A.F., Akopian T.N., Castillo V., Goldberg A.L. Proteasome active-sites allosterically regulate each other, suggesting a cyclical bite-chew mechanism for protein breakdown // Mol. Cell. 1999. - V. 4. - P. 395-402.

185. Kruger E., Kloetzel P-M., Enenkel C. 20S proteasome biogenesis // Biochimie. 2001. - V. 83. - P. 289-293.

186. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the head bacteriophage T 4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

187. Lee C., Liu X., Zweier J.L., Regulation of xanthine oxidase by nitric oxide and peroxynitrite // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, № 13. - P. 9369-9376.

188. Lei Baiping, Tan Xinjuan, Cai Hongwei, Xu Qiming, Guo Quling. Effect of mogerate hypothermia on lipid peroxidation in canine brain tissue after cardiac arrest and resuscitation // Stroke. 1994. - V.25, № 1. - P.147-152.

189. Levine R.L., Oliver C.N., Fulks R.M., Stadtman E.R. Turnover of bacterial glutamine synthetase: oxidative inactivation precedes proteolysis // Proc Natl Acad Sci USA. 1981. - V. 78, № 4. - P. 2120-2124.

190. Levine R.L. Oxidative modification of glutamine synthetase // J. Biol. Chem. 1983. - V. 258. - P. 11828-11833.

191. Levine R.L. Mixed-function oxidation of histidine residues // Methods Enzym. 1984. - V. 107. - P. 370-377.

192. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent I., Lenz A.G., Ahn B., Shaltiel S., Stadtman E.R. Determination of carbonyl content in oxida-tively modified proteins // Methods Enzym. 1990. - V. 186. - P. 464-478.

193. Levine R.L, Williams J., Stadtman E.R., Shacter E. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins // Methods Enzym.- 1994. V. 233.-P. 346-357.

194. Li C., Jackson R.M. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury // Am J Physiol Cell Physiol. 2002. - V. 282. - P. 227241.

195. Lloyd R.V., Hanna P.M., Mason R.P. The origin of the hidroxyl radical in the

196. Fenton reaction // Free Rad. Biol. Med. 1997. - V. 22, № 5. - P. 885-888.

197. Lowe J., Stock D., Jap B., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon E. acidophilum at 3,4A resolution // Science. 1995. - V. 268. - P. 533-539.

198. Lowry D.H., Rosebrough K.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193, № 1. - P. 265-275.

199. Meneghini R. Iron homeostasis, oxidative stress, and DNA damage // Free Rad. Biol. Med. 1997. - V. 23, № 5. - P. 783-792.

200. Merker K., Stolzing A., Grune T. Proteolysis, caloric restriction and aging // Mechan Ageing and Develop. 2001. - V. 122. - P. 595-615.

201. Meucci E., Mordente A., Martorana G.E. Metal-catalyzed oxidation of human serum albumin: conformational and functional changes // J. Biol. Chem. -1991. V. 266, № 8. - P. 4692-4699.

202. Murphy M.P., Packer M.A., Scarlett J.L., Martin S.W. Peroxynitrite: A Biologically Significant Oxidant // Gen. Pharmac. 1998. - V. 31, № 2. - P. 179-186.

203. Murphy M.P. Nitric oxide and cell death // Biochim. Bioph. Acta 1999. - V. 1411.-P. 401-414.

204. Oden M. The role of reperfusion-induced injury in the pathogenesis of the crush syndrome // The new England J.of Medicine. 1991, - V. 324, № 20. -P. 1417.

205. Oliver C.N., Ahn B., Moerman E.J., Goldstein S., Stadtman E.R. Age-related changes in oxidized proteins // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 54885491.

206. Ooboshi H., Ibayashi S., Takano K., Sadoshima S., Kondo A., Uchimura H., Fujishima M. Hypothermia inhibits ischemia-induced efflux of amino acids and neuronal damage in the hippocampus of aged rats // Brain Research -2000.-V. 884.-P. 23-30.

207. Pacifici R., Davies K.J.A. Protein degradation as an index of oxidative stress // Methods Enzym. 1990. - V. 186. - P. 485-502.

208. Patel R.P., McAndrew J., Sellak H., White C.R., Jo H., Freeman B.A., Darley-Usmar V.M. Biological aspects of reactive nitrogen species // Biochim et Bioph Acta. 1999. - V. 1411. - P. 385-400.

209. Peterhans E. Oxidants and antioxidants in viral diseases: disease mechanisms and metabolic regulation // J. Nutr. 1997. - V. 127 (Suppl). - P. 963S-965S

210. Reinheckel T., Sitte N„ Ulrich O., Kuckelkorn U., Grune T., Davies K.J.A. Comparative resistance of the 20S and 26S proteasome to oxidative stress // Biochem. J. 1998. - V. 335. - P. 637-642.

211. Rock K.L., Gramm C., Rothstein L., Clark K., Stein R., Dick L., Hwang D., Rivett A.J. Proteasomes: multicatalityc proteinase complexes // Biochem. J. -1993.-V. 291.-P. 1-10.

212. Sadrzadeh S.M.H., Graf E., Panter S.S., Hallaway P.E., Eaton J.W. Hemoglobin // J. Biol. Chem. 1984. - V. 259, № 23. - P. 14354-14356.

213. Salo D.C., Pacifici R.E., Davies K.J.A. Superoxide dismutase undergoes proteolysis and fragmentation following oxidative modification and inactivation // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 11919-11927.

214. Seemuller E, Lupas A, Baumeister W. Autocatalytic processing of the 20S proteasome // Nature. 1996. - V. 382(6590). - P. 468-471.

215. Sies H. Glutithione and its role in cellular functions \\ Free Rad. Biol. Med.1999. V. 27, № 9/10. - P. 916-921.

216. Smith C.D., Carney J.M., Starke-Reed P.E., Oliver C.N., Stadtman E.R., Floyd R.A. Excess brain protein oxidation and enzyme dysfunction in normal aging and in Alzheimer disease. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88.-P. 347-353.

217. Stadtman E.R. Metall-ion-catalazed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Rad. Biol. Med. 1990. - V. 9, №5.-P. 315-325.

218. Stadtman E.R. Protein oxidation and aging // Science. 1992 - V. 257. - P. 1220-1224.

219. Taylor A., Davies K.J.A. Protein oxidation and diminished proteolytic capacity in cataract formation during aging // Free Rad. Biol. Med. 1987. - V. 3, №5.-P. 371-377.

220. Uchida K., Toyokuni S., Kishikawa S., Oda H., Hiaia H., Stadtman E.R. Michael addition-type 4-hydroxy-2-nonrenal adducts in modified low density lipoproteins: markers for atherosclerosis // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 12487-12494.

221. Uchida K. Role of reactive aldehyde in cardiovascular diseases // Free Rad. Biol. Med. 2000. - V. 28. - P. 1685-1696.

222. Wolff S.P., Dean R.T. Fragmentation of proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis // Biochem. J. 1986. - V. 234. - P. 399-403.

223. Ulrich O., Sitte N., Sommerburg O., Sandig V., Davies K.J.A., Grüne T. Influence of DNA binding on the degradation of oxidized histones by the 20S proteasome // Arch. Biochem. Biophys. 1999. - V. 362. - P. 211-216.

224. Yoritaka A., Hattori N., Uchida K., Tanaka M., Stadtman E.R., Mizuno Y. Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkinson disease // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. - V. 93. - P. 26962701.

225. Zwart L.L., Merman J.H.N., Commandeur J.N.M., Vermeulen N.P.E. Bio-markers of free radical damage applications in experimental animals and in humans // Free Rad. Biol. Med. 1999. - V. 26, № 5. - P. 202-225.1. J.

Информация о работе

Исмаилова, Жамила Грамидиновна
кандидата биологических наук
Махачкала, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Окислительная модификация белков плазмы крови при гипотермии и на фоне введения даларгина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы