Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности изменений содержания фосфоинозитидов в красных и белых мышечных волокнах при экспериментальной ишемии и реперфузии скелетных мышц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности изменений содержания фосфоинозитидов в красных и белых мышечных волокнах при экспериментальной ишемии и реперфузии скелетных мышц"

На правах рукописи

ШИНКАРЕНКО ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ СОДЕРЖАНИЯ ФОСФОИНОЗИТИДОВ В КРАСНЫХ И БЕЛЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКНАХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ СКЕЛЕТНЫХ

МЫШЦ

03.00.04,- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тверь, 1998

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии и в биохимической лаборатории научно-исследовательского центра Тверской государственной медицинской

академии

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

В.А. Соловьев

доктор медицинских наук, профессор H.H. Слюсарь

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.М. Девиченский

кандидат биологических наук, доцент Д.В. Ильященко

Ведущая организация: Институт биохимической физики

им. Н.М. Эмануэля

Защита диссертации состоится "3" февраля 1998г. В 14°°часов на заседании специализированного диссертационного совета К.063.97.09 Тверского государственного университета^ 70002, г.Тверь, пр.Чайковского, 70А, корп.5, аудитория 318)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета(г.Тверь, ул. Володарского, 44А)

Автореферат разослан " " ^е/^^л_199?-г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук,

доцент ^ А.Н. Панкрушина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Скелетная мышечная ткань млекопитающих состоит из волокон, имеющих различную морфофункциональную организацию, что позволяет выделить мышцы красные и белые(Данилов Р.К.Д996;Мавринская Л.Ф. и соавт.,1978; Соловьев В.А.,1985; Brooks S.V. et al.,1990;Ishihara А. et al.,1991). Формирование в онтогенезе функционально различных мышечных волокон(МВ) необходимо для достижения наилучшего приспособления мышц к изменениям, возникающим как между системами органов, так и внешней средой. Сегодня не вызывает сомнений, что любая функция органа и мышечного волокна, в частности, является производной от взаимодействия мембранных структур между собой и окружающей средой(Биленко М.В.,1989). Однако, до настоящего времени предметом детального исследования не были мембраны фенотипически различных MB и не изучался характер их реагирования в эксперименте. Среди соединений, составляющих 2- 12% фосфолипидов мембран (Лопина О.Д. и соавт.,1981), интерес представляли фосфоинозитиды(ФИН). Эти соединения участвуют в трансмембранной передаче сигналов(М1сЬе11 R. et al.,1986;Kappeller R. et al.,1994), что на фоне недостаточно изученной проблемы регуляции клеточного метаболизма привлекает к ним все большее внимание. Продукты ФИН цикла избирательно фосфорили-руют функционально значимые клеточные белки. Поскольку появление и поддержание морфофункциональной разнородности волокон связано, прежде всего, с закреплением определенных механизмов фосфорилирования в MB, то это обстоятельство обусловливает повышенный интерес к ФИН в скелетной мускулатуре.

Многочисленные современные исследования посвящены выяснению роли ФИН в различных патологических процессах(Зиньковский А.К. и соавт., 1992;Каргаполов A.B., Слюсарь H.H., 1990- 1997). Среди них есть единичные

работы по установлению содержания продуктов ФИН цикла и в ишемизиро-ваиных органах(Лопина Н.Г. и соавт.,1992; Меерсон Ф.З. и соавт.,1993). Однако, в литературе отсутствуют сведения по изменению содержания ФИН в красных и белых МВ при ишемии и реперфузии мышц. Строение и биохимические особенности МВ взаимосвязаны, вследствие чего их нужно исследовать и анализировать совместно. Сведения о морфологических проявлениях в ранние сроки ишемии и реперфузии в различных типах МВ в литературе не отражены.

Целью работы явилось изучение содержания фосфоинозитидов в сарко-леммальных мембранах, в митохондриальных фракциях и в мембранах сарко-плазматического ретикулума красных и белых интактных мышечных волокон крыс. Анализ изменений количества фосфоинозитидов и структурных перестроек в мышечных волокнах различных типов при ишемии и реперфузии скелетных мышц.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить содержание фосфоинозитидов в митохондриальных фракциях, в сарколеммальных и мембранах саркоплазматического ретикулума красных и белых мышечных волокон крыс.

2. Исследовать изменения содержания фосфоинозитидов после часовой и трехчасовой острой ишемии мышц в красных и белых мышечных волокнах крыс.

3. Изучить содержание фосфоинозитидов после реперфузии мышц различной продолжительности в ишемизированных мышечных волокнах разных типов.

4. Исследовать особенности структурных изменений красных и белых мышечных волокон после ишемии мышц и при восстановлении кровотока в различные сроки.

Научная новизна Установлены отличия в содержании фосфоинозитидов в субклеточной фракции, обогащенной митохондриями; в сарколеммаль-

ных и мембранах саркоплазматического ретикулума красных и белых мышечных волокон. Изучение быстрых изменений уровня содержания фосфоинози-тидоп в красных и белых мышечных волокнах показало различия амплитуды колебаний фосфоинозитидов и отличия в функционировании ферментативных систем красных и белых мышечных волокон, поддерживающих гомеостаз фосфоинозитидов. Впервые в условиях ишемии мышц с последующей репер-фузией обнаружены особенности изменения уровня фосфоинозитидов в красных и белых мышечных волокнах. Показана корреляция биохимических и морфологических изменений в мышечных волокнах различных типов со временем ишемии и реперфузии скелетной мускулатуры.

Научно- практическая значимость Результаты исследования представляют интерес для теоретической биологии и медицины, т.к. они дополняют знания по биохимии мембран в различных типах мышечных волокон в условиях нормы, ишемии и реперфузии скелетных мышц и позволяют приблизиться к пониманию механизмов внутриклеточных взаимодействий.

Особенности морфобиохимических характеристик красных и белых мышечных волокон при ишемии и реперфузии мышц могут быть учтены и использованы для выработки рекомендаций при оперативных вмешательствах по поводу острой и хронической ишемии конечностей, в спортивной медицине и травматологии.

Апробация работы. Основные положения работы и результаты исследования доложены на 3 Международном конгрессе морфологов, г.Тверь, 1996г.; научной конференции Тверской государственной медицинской академии "Структурно- функциональная: организация органов и тканей в норме, патологии и эксперименте", г.Тверь, 1996г.; Российском конгрессе "Здоровье человека", г.Тверь, 1996г; научном совещании 'Тистогенетический анализ изменчивости и регенерации тканей", г. С-Петербург, 1997г.; научной конференции "Актуальные вопросы медицины и организации здравоохранения",

г.Тверь, 1997г.; научно- практической конференции "Экология, здоровье и природопользование", г. Саратов, 1997; межкафедральном заседании сотрудников ТГМА, 1997г.

Внедрение. Результаты работы и основные ее положения используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии, биохимии, биоорганической химии Тверской государственной медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 84 отечественных и 101 зарубежный источник. Работа иллюстрирована таблицами, схемами, рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 324 крысах обоего пола массой 190-200 г в возрасте 2,5 мес. Животные были разделены на три группы: первую- составили интактные животные, вторую- крысы, мускулатура задних конечностей которых подвергалась часовой и трехчасовой ишемии; третья группа была образована животными с ишемизированной мускулатурой нижних конечностей, у которых исследования проводились после 3,6 и 24 часов реперфузии. Создание модели тотальной ишемии мышц осуществляли путем наложения лигатуры на нижнюю треть бедра; реперфузии мышц- путем снятия лигатуры. Забор материала проводили под эфирным наркозом, при котором через кожный разрез выделяли красную мышцу- камбаловидную(т. soleus) и белую- длинный разгибатель пальцев(т. extensor digitorum lohgus). Биохимические исследования проводили на разных уровнях организации мышечной ткани: в мышечных во-

локнах различных типов и в их ультраструктурах. Выделение субклеточных фракций ( митохондрий, сарколеммальных и мембран саркоплазматического ретикулума) скелетных мышечных волокон проводили по методикам, описанным в работах (Дядюша Г.П. и соавт.,1985; Финдлей Дж.Б. и соавт.,1990).

Из проб мышечной ткани, сарколеммальных и мембран саркоплазматического ретикулума, а также митохондриальных фракций экстрагировали ли-пиды. Выделение фосфоииозитидов осуществляли с помощью усовершенствованного метода проточной горизонтальной хроматографии(Каргаполов Л.В., Слюсарь H.H., 1991- 1996). Динамику быстрых изменений фосфоииозитидов в красных и белых MB определяли по методике Мацуль В.М.(1988). Результаты исследования выражали в нмолях фосфора соответствующих фосфоииозитидов на 1 мг белка. Количество белка определяли модифицированным методом Ло-ури (Macwell М.А. et al, 1978).

Для анализа структурной организации MB материал от всех групп животных фиксировали в 12% нейтральном формалине и 96° спирте, а для элек-тронномикроскопических исследований- в глутаровом альдегиде. Изготовление и окрашивание препаратов гематоксилин- эозином, гематоксилином по Вейгерту, по Ван- Гизону осуществляли по классической схеме(Меркулов Г.А., 1969).Сукцинатдегидрогеназу выявляли методом Нахласа в модификации по Лилли(1969),АТФазу- по Гомори(1969), гликоген и липиды- по Пирсу(1962). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме УМПТ-'6, их исследовали и фотографировали на электронном микроскопе УЭМВ- 100К при ускоряющем напряжении 75 кв.

Полученные количественные данные обрабатывали статистически на персональной ЭВМ "IBM-386-DX" с применением стандартного пакета прикладных программ "STATGRAF" версия 2.О., а также при помощи системы прикладных программ "Морфолог", взаимодействующей с видеокамерой, установленной на лабораторном микроскопе МНФ-11.

Достоверность отличий результатов исследований определяли при помощи критерия Стьюдента(Автандилов Г.Г., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.Особенности содержания фосфоинозитидов в красных и белых мышечных волокнах и в их биомембранах Анализ проведенных биохимических исследований позволил установить, что практически по всем фракциям ФИН мембранный комплекс белых МВ достоверно отличается от мембранного комплекса красных МВ(рис. 1).Отмечаемая разница в содержании различных форм фосфоинозитидов между красными МВ и белыми МВ находится в ряду тех отличий, которые обусловливают неодинаковый характер протекания тех физиологических процессов, которые ведут к различиям в функционировании целого волокна. Вместе с тем, результаты исследований свидетельствуют о том, что в белых МВ и красных МВ содержание ФИДФ в среднем в 2,4 раза выше ФИФ, а количество ФИФ в среднем в 32,8 раза снижено по сравнению с уровнем ФИ. Обнаруженные соотношения фосфоинозитидных компонентов в скелетной мускулатуре характерны и для других тканей животных(Крепс Е.,1981; Ревин В.,1990; Слю-сарь Н.Н.,1992). Так, в мозге крысы установлено превышение содержания ФИДФ над ФИФ, а значения ФИ всегда выше количества ФИФ. Таким образом, исходя из наших результатов и данных литературы, можно предположить, что высокое содержание ФИДФ по сравнению с ФИФ и низкое количество ФИФ по сравнению с уровнем ФИ является закономерностью, свойственной различным тканям млекопитающих. Кроме исследования содержания ФИН в фенотипически различных МВ были установлены уровни содержания ФИ в субклеточной фракции, обогащенной митохондриями и в биомембранах красных и белых МВ- сарколеммальных и мембранах СР (рис. 2). Результаты исследования показывают, что содержание ФИ в сарколеммальных мембранах белых МВ в 1,3 раза выше, чем в одноименных мембранах красных МВ. В ми-

Рис. 1. Содержание ФИФ1, ФИФ, ФИДФ, ФИДФ1, ФИТФ в красных я белых МВ, п=10. Примечание: *- различия содержания фосфоинозитидов между белыми и красными МВ достоверны, р<0,05.

□ БЕЛЫЕ МВ а КРАСНЫЕ ВДВ

1«:

£ И : й I ; •е 5 ;

° I;

е- % ;

! 20 \ 18 ! 16

! 312

: С

! I 8

|8!

4

! 2

!■ О

сарколеммгльные мембраны

мнтохондриальные фракции

| —

-- •

I

Л" ]

|

-- / 1 ■К"?'"'' ■Г/

* —1— -4—

фаны саркоп^азматическ ого ретикулума

Рис.2.Содержание ФИ в митохондриальныж фракциях, в сарколеммальпых и мембранах сарко плазматического ретикулума а красных н белых МВ, п=10. Примечание: *- различия содержания фосфатидилииознтов между белыми и красными МВ достоверны, р<0,05.

тохондриальной фракции белых МВ количество ФИ в 1,5 раза увеличено по сравнению с уровнем ФИ в митохондриалыюй фракции красных МВ. Вместе с тем, значения ФИ в СР белых МВ достоверно не отличается от их количества в мембранах СР красных МВ. При этом, Известно, что объемная плотность митохондрий выше в красных МВ и достигает 15%, а объемная вдотность саркоту-булярной сети выше в бельгх МВ и составляет примерно 21%( Данилов Р.К.,1996). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии корреляции между степенью развитости органелл и количеством в их мембранах ФИ.

В процессе работы по определению содержания ФИН в митохондриаль-ных фракциях МВ различных типов использовался метод, позволяющий исследовать динамику быстрых изменений ФИЩМацуль В.М.,1988; Слюсарь Н.Н.,1992). Было установлено, что при инкубации субклеточной фракции, обогащенной митохондриями с 50 мкМ хлорида калыщя(Са) наблюдались быстрые обратимые изменения количества ФИН в короткий промежуток времени(3 мин.) в ответ на воздействие. При этом время достижения максимального и минимального значений и амплитуды колебаний- разницы между максимальными и минимальными значениями фосфоинозитидов- в красных МВ отличались от их уровня в белых МВ. Самыми наглядными иллюстрациями различного колебательного режима содержания ФИН служили фракции ФИ и ФИДФ(рис.З и 4). Минимальные значения этих соединений на 30 секунде воздействия Са в митохондриальной фракции красных МВ сопровождались максимальными значениями в одноименной фракции белых МВ, тогда как на 90 секунде инкубации с Са содержание ФИ и ФИДФ в митохондриях красных МВ было максимальным, а в аналогичных органеллах белых МВ- минимальным. Вместе с тем, сравнение амплитуды колебаний 4- фосфорилиррванных, ФИН, таких как ФИФ и ФИДФ, и 3- фосфорилированных ФИН,-таких как. ФИФ 1, ФИДФ1 и ФИТФ, в различных МВ выявило следующую особенность(табл. 1 ).

Таблица 1.

АМПЛИТУДЫ КОЛЕБАНИЙ ФОСФОИНОЗИТИДОВ В ММТОХОНДРИАЛЬНЫХ

ФРАКЦИЯХ МВ

КРАСНЫЕ МВ БЕЛЫЕ МВ

11=10

ФИФ М±ш 0,8+0,02 0,8±0,02

ФИДФ М±ш 1,4+0,06 1,6+0,08

ФИФ1 М±ш 0,3±0,02 1,0±0,06*

ФИДФ1 М±т 0,6+0,02 0,9±0,07*

ФИТФ М±т 2 Д ±0,04 0,3+0,006*

Содержанке фосфоинозитидов выражено в нмоль Р соотв. ФИН/мг белка

Амплитуды колебаний ФИФ в красных и белых МВ одинаковые, а по фракции ФИДФ незначительно отличаются. Амплитуды колебаний ФИФ1,ФИДФ1 и ФИТФ демонстрируют существенные различия при сравнении их в красных и белых волокнах. Из вышесказанного можно сделать два предположения. Первое, что разнонаправленные быстрые изменения фракций ФИН в красных и белых МВ вызываются различным характером фосфорилировгния этих фосфо-липидов.

С. л

о о « 1 о 20 -

I2 X X 15 -

* 5 14

к- ж С

10 -

<3> X Ж

Щ 5 Л Ж ь -

8 5 о о о * 0 -

-

2

Рнс.З. Быстрые изменения ФИ в митохондриальных фракциях МВ, п=10. Примечание: *- максимальные значения ФИ;

* »-минимальные значения ФИ.

0 30 60 80 120 180 ^сск

а КРАСНЫЕ МВ □ БЕЛЫЕ МБ

Рис.4. Быстрые изменсиня ФИДФ в мигохондрнальиык фракциях МВ, п=10. Примечание: *- максимальные значения ФИДФ;

•«-минимальные значения ФИДФ.

Второе, ферментные системы канонического пути метаболизма ФИН в различных волокнах способны поддерживать сходным образом относительно постоянные уровни 4-ФИН конкретного МВ, тогда как, ферментные системы 3-фосфоинознтидного пути красных и белых МВ, вероятно, имеют отличия в механизмах поддержания относительно постоянных уровней ФИФ 1,ФИДФ 1 и ФИТ Ф.

2. Изменения количества фосфоинозитидов в красных н белых мышечных волокнах и в их биомембранах при ишемии скелетных мышц

В процессе работы по определению содержания ФИН в ишемизирован-ных МВ различных типов было установлено достоверное снижение количества ФИ с увеличением времени ишемии (рис. 5).

т £ □ ИНТАКТНЫЕ Р1 ЧИШЕМИИ [32 4ИШЕМИИ

| БЕЛЫЕ МВ КРАСНЫЕ РЛВ

2

Рнс.5. Содержание ФИ в красных и белых МВ после 1 ч и 3 ч ишемии скелетных мышц, п=10.

Примечание: *- различия фосфатндилшюзитов в МВ: нитакгны* и подвергнувшихся 1- часовой ишемии мышц достоверны, р<0,05;

»*- различия фосфатпднлннознтов в МВ, подвергнувшихся 1- часовой и 3- часовой ишемии мышц достоверны, р<0,05.

Одной из причин подобного уменьшения является активация перекис-ного окисления липидов (ПОЛ), что доказано методом спиновой резонансной спектроскопии на мышцах ишемизированных к он еч н остей (8 аШ! э в. е1 а1.,1994).

Нами было исследовано изменение содержания ФИН в биомембранах МВ после ишемии мышц, в частности в мембранах СР красных и белых МВ. Содержание фракции ФИ в мембранах СР различных МВ после 3 ч ишемии мышц было достоверно снижено к количеству ФИ в СР интактных красных и белых МВ в среднем в 1,4 раза. Сравнение особенностей изменения содержания ФИН в мембранах СР красных и белых МВ после ишемии различной продолжительности позволило установить, что в белых МВ изменения начинают проявляться сразу после прекращения кровотока. Вместе с тем, для ряда фракций ФИН красных волокон изменения отмечаются лишь после 3 часов ишемии, что ,по нашему мнению, свидетельствует о большей устойчивости мембран СР красных МВ к кратковременным изменениям кровотока в мышце.

Исследование субклеточных фракций, обогащенных митохондриями в красных и белых МВ выявило общую тенденцию изменения ФИН, фосфорили-рованных в 4 позиции инозитольного кольца, и различный характер изменения 3-фосфорилированных ФИН в митохондрнальных фракциях красных и белых МВ. Так, содержание ФИФ и ФИДФ в митохондриальной фракции белых МВ после 3 ч ишемии мышц снизилось, соответственно, в 1,5 и 2,5 раза по отношению к их количеству в митохондриях интактных белых МВ. Вместе с тем, уровень ФИФ и ФИДФ в указанных органеллах красных МВ после 3 ч ишемии мышц уменьшился, соответственно, в 3,5 и 1,8 раза по сравнению с содержанием ФИФ и ФИДФ в митохондриях интактных красных МВ. При этом, содержания ФИФ1, ФИДФ1 и ФИТФ в белых МВ достоверно увеличивается к 3 ч ишемии, тогда как в красных волокнах такая закономерность отмечается только для фракции ФИДФ1. Этот факт может свидетельствовать, что фосфатиди-линозиткиназы канонического пути метаболизма ФИН в митохондриях красных МВ и белых МВ сходным образом фосфорилируют ФИН при ишемии скелетных мышц. Вместе с тем, фосфатидилинозиткиназы 3- ФИН пути имеют отличия в характере фосфорилирования в митохондриях МВ различных типов при ишемии соматической мускулатуры.

Анализ изменения ФИН в сарколеммальных мембранах красных и белых МВ после 3 ч ишемии мышц выявил снижение содержания практически всех форм ФИН по сравнению с их количеством в одноименных мембранах красных и белых МВ (рис. 6, 7). Данный факт объясняется недостатком макроэргов, что приводит к активации биохимических путей, которые в интактных скелетных МВ слабо проявляются. Это прежде всего касается анаэробного пути фосфорилирования АДФ с помощью фосфатной группы мембранных поли-фосфоинозитидов(Киселев Г., 1987), которые преимущественно локализуются в capкoлeммe(Berridge М.,1987). Играя на ранних сроках ишемии мышц компенсаторную роль и .возможно, обеспечивая некоторое добавочное количество

т

р * ь.

3

III

•е- з

* 1 § а £ з 41 01 х Ч С -о о т О £

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

23.

ОИНТАКТНЫЕ НЗЧ ИШЕМИИ

ФИФ1

ФИФ ФИДФ ФИДФ1 ФИТФ

Рис. 6. Содержание фосфоннознтндов в сарколеммальных мембранах красных МБ после 3 ч пшемии скелетных мышц, п=10.

Примечание: *- различие содержания фосфоинозитндов в сархолеммальиых мембранах красных МВ: интактных и подвергнувшихся 3- часовой ишемии достоверны, р<0,05.

•в- г

2,5 т

5 2

о. 2 ^ =

1 »

Р

1,5 -

1 --

0,5-

° й-8

ФИФ1

ФИФ ФИДФ ФИДФ1 ФИТФ

Рис. 7. Содержание фосфоннознтндов в сарколеммальных мембранах белых МВ после 3 ч ишемии скелетных мышц, п=10.

Примечание: *- различие содержания фосфоннознтидов в сарколеммальных мембранах белых МВ: ннтактных и подвергнувшихся 3- часовой ишемии достоверны, р<0,05.

2

2

О

энергии АТФ для мембранных функций, главным образом транспорта катионов, такое дефосфорилирование сарколеммальных мембран в конечном счете, к 3 ч ишемии , может приводить к снижению количества ФИН в сарколемме МБ.

При морфологических исследованиях различных мышц на светооптиче-ском уровне выявляется выраженный отек перимизия и эндомизия. Это связано с накоплением ишемического токсина, который повышает проницаемость капилляров, вследствие чего происходит выпотевание жидкой части кро-ви(Нечаев Э.А. и соавт.,1993).Развивающаяся плазмопотеря и отсутствие органного кровотока проявляются также и во внутрисосудистой агрегации эритроцитов. Электронномикроскопические исследования показывают, что после часа ишемии сократительный и митохондриальный аппараты различных МВ остаются без изменений. При трехчасовом нарушении кровотока в отдельных белых МВ наблюдается разрыхление миофибрилл в саркомерах, а в красных появляются немногочисленные измененные митохондрии: набухшие, с просветленным матриксом. Повреждение миофибрилл гликолитических волокон согласуется с ранним снижением оптической плотности суммарного белка в белых МВ при гипоксии(Данилов Р.К., 1996). Причиной появления измененных митохондрий в красных волокнах является повреждение бислоя мембран, что ведет к увеличению пассивной проницаемости для воды, следствием чего и является набухание органелл(Биленко М.В.,1989).

З.Изменения содержания фосфоинозитндов в ишемизированных красных и белых мышечных волокнах и в их биомембранах после реперфузии мышц

Анализ особенностей содержания ФИН в ишемизированных красных и белых МВ с последующей 3 ч реперфузией показал достоверное снижение количества таких фосфоинозитидных фракций, как ФИФ1, ФИФ, ФИДФ1, ФИТФ

в среднем в 1,6 раза к их уровню содержания в контроле. Однако, через б и 24 часа ренерфузии, отмечается увеличение содержания ФИ, ФИФ, ФИДФ и ФИТФ в красных и белых МВ в среднем, соответственно, в 1,2; 1,5; 1,3; 1,1 раза к их содержанию в контроле.

Изучение содержания ФИН в сарколеммальных мембранах различных МВ выявило, что уровень содержание большинства фосфоинозитидных фракций после часовой ишемии и 3 - 6 ч ренерфузии ниже контрольных, тогда как после 3 часов ишемии и 3 - 6 ч реперфузии- выше, чем в контроле. Полученные результаты являются следствием физиологических эффектов тех продуктов, которые образовались в период ишемии. Данные литературы (Биленко М.,1989; Козлов Ю. и соавт.,1983) указывают, что содержание полиненасыщенных жирных кислот и окисленных полиненасыщенных жирных кислот с увеличением времени ишемии возрастает. Эти вещества оказывают выраженное вазоконстрикторное действие, что указывает на их участие в локальных и системных гемодинамических расстройствах. Кроме того, все окисленные фосфолипиды, содержание которых возрастает при длительном прекращении кровотока в органе, ухудшают скорость перфузии, т.е. увеличивают степень не восстановления кровотока. Из этих данных вытекает , что наиболее полное восстановление кровоснабжения в период от 3 до б часов реперфузии происходит в мышцах, подвергнувшихся часовой ишемии, а не 3-часовой. Этот вывод подтверждает и динамика изменений содержания ФИН к 24 часам реперфузии в сарколеммальных мембранах красных и белых волокон(рис. 8, 9 ). В МВ различных типов после часовой ишемии и 24- часовой реперфузии наблюдается увеличение количества фосфоинозитидных фракций по сравнению с их количеством после 6 ч реперфузии, а в МВ, подвергнувшихся 3-часовой ишемии и 24-часовой реперфузии- их снижение.

Обращает на себя внимание тот факт, что количество большинства фракций ФИН в митохондриальной фракции ишемизированных красных и бе-

□ 1ч ишемки/бч реперфузии В 1ч ишеиии/24ч реперфузии

ФИФ ФИФ1 ФИДФ ФИДФ1 ФИТФ

Рис. 8. Содержание фосфоипозитидов в сарколеммальцых мембранах белых МВ после 1 ч ишемии и 6,24 ч реперфузии мышц, п=10.

Примечание: *- различия содержания фосфоинозитидов в сарколеммальцых мембранах белых МВ после 1 ч ишемии н 6 ч реперфузии мышц н 1 ч ишемии и 24 ч реперфузии мышц достоверны, р<0,05.

□ Зч иищмии/б ч реперфузии ВЗч ишемии/24 ч реперфузии

ФИФ1

ФИФ ФИДФ ФИДФ1 ФИТФ

Рис. 9 . Содержание фосфоинозитидов в сарколеммальцых мембранах красных МВ после 3 ч ишемии и 6,24 ч реперфузии мышц, п=10.

Примечание: *- различия содержания фосфоинозитидов в сарколеммальцых мембранах красных МВ после 3 ч ишемии и б ч реперфузии мышц и 3 ч ишемии и 24 ч реперфузии мышц достоверны, р<0,05.

лых МВ после всех сроков реперфузии достоверно снижается. Причем уменьшение содержания ФИН выражено больше в митохондриях красных МВ, чем в митохондриях белых МВ, что согласуется с типом метаболизма этих воло-кон(Мавринская Л. и соавт.,1978; Данилов Р.К., 1996). Уменьшение количества ФИН- одной из легко окисляемых фракций фосфолипидов, содержащей большое количество высоконенасыщенных жирных кислот, приводит к снижению скорости свободнорадикалыюго окисления фосфолипидов(Бурлакова Е.,1980) и, следовательно, к защите митохондрий в период реперфузии мышц.

При исследовании содержания ФИН в мембранах СР ишемизироваи-ных белых МВ после 3,6 и 24 ч реперфузии было обнаружено, что количество основного ФИН- ФИ не изменяется к значениям ФИ в контроле. Сопоставление полученных данных с характером изменения ФИ в мембранах СР белых МВ после 1ч и 3 ч ишемии позволяет говорить о том, что уже после 1 ч ишемии скелетной мускулатуры произошли адаптивные изменения мембран СР белых волокон к продуктам гидролиза мембранных липидов, накопление которых имеет место в ишемизированных МВ(Козлов Ю. и соавт.,1983). Увеличение их концентрации при реоксигенация мышц(Биленко М., 1989) не приводит к заметным сдвигам количества ФИ в СР белых МВ. Вместе с тем, содержание ФИ в мембранах СР красных МВ после 1 ч ишемии и различных сроков реперфузии мышц снижено к значениям ФИ в контроле(рис. 10). Этот факт объясняется характером изменения ФИ после 1 ч и 3 ч ишемии мускулатуры. В мембранах СР красных МВ только после 3 ч ишемии обнаружены достоверные изменения ФИ, которые отражают адаптивные изменения МВ.

Морфологическое изучение ишемизированных красных и белых мышц после 3, 6 и 24 часов реперфузии показало, что во всех случаях микроскопическая картина отражает процессы, начавшиеся при ишемии: выраженный интер-стициальный отек, инфильтрация соединительно-тканной стромы лимфоцитами и гистиоцитами, гиперсокращения отдельных МВ.

X

3

I 18 Т

¡е

5 1ч ишемии 1ч 1ч 1ч

(контроль) ишемии/Зч ишемии/бч ишемии/24ч реперфузии реперфузии реперфузии

Рис.10. Содержание фосфатидилинозитов в мембранах саркоплазматического ретику-лума красных МВ после 1 ч ишемии и 3,6,24 ч реперфузии скелетных мышц, 11=10.

Примечание: *- различия содержания ФИ в мембранах СР красных МВ после 1 ч ишемии мышц и 1 ч ишемии/3 ч реперфузии мышц достоверны, р<0,05.

**- различия содержания ФИ в мембранах СР красных МВ послс 1 ч ишемии мышц н 1 ч ишемии/24 ч реперфузии мышц достоверны, р<0,05.

С увеличением времени реперфузии перечисленные признаки выражены сильнее. Электронномикроскопические исследования показывают изменения всех структур в красных и белых МВ. Однако, несмотря на жесткую генетическую детерминированность направления восстановительного процесса субмикро-скопически выявляется различная степень выраженности в повреждении отдельных органелл в красных и белых МВ. В красных МВ наблюдается появление многочисленных миелиноподобных образований, что, по- видимому, объясняется лучшим развитием мембранных структур в этих волокнах(Батыршина Г.Ф.,1994). Повреждение миофибриллярного аппарата белых МВ, начавшееся

при ишемии мускулатуры, становится еще более выраженным при ее реперфу-зии.

Установленные особенности подтверждают, что биохимические сдвиги первичны при любом изменении функционирования, за которыми следует структурная перестройка.

Таким образом, представленные в работе данные свидетельствуют о различиях в содержании не только ФИ, но и других фосфоинозитидных фрак-ций(ФИФ, ФИФ1, ФИДФ, ФИДФ1 и ФИТФ) в красных и белых МВ у интакт-ных и животных в различных экспериментальных условиях- при ишемии и ре-перфузии скелетных мышц. Показана корреляция биохимических и морфологических изменений в МВ различных типов со временем ишемии и реперфузии скелетной мускулатуры.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены отличительные особенности в уровне содержания фос-фоинозитидов в мембранах красных и белых мышечных волокон. Показано, что уровень содержания ФИ- в 1,2 раза; ФИДФ в 1,3 раза; ФИТФ- в 1,4 раза в белых мышечных волокнах выше, чем в красных.

2. Обнаружены быстрые обратимые изменения фосфошгозитидов после воздействия на митохондриальные фракции мышечных волокон ионов кальция. Выявлены различия во времени появления максимальных и минимальных значений содержания фосфоинозитидов и в амплитуде колебаний фосфоинози-тидов в красных и белых мышечных волокнах.

3.Ишемия скелетной мускулатуры различной продолжительности приводит к однотипному характеру изменений содержания фосфоинозитидов в красных и белых мышечных волокон. Обнаружено достоверное снижение содержания ФИ, ФИДФ в среднем в 1,4 раза и увеличение количества ФИТФ в

среднем в 2,0 раза в красных и белых мышечных волокнах после 3 ч ишемии мышц к их значениям в интактных мышечных волокнах.

4. Выявлена динамика морфологических изменений скелетной мускулатуры: после часа ишемии регистрируются гемодинамические расстройства при сохранении микро- и субмикроскопического строения мышечной ткани; после 3 часов ишемии обнаружены очаговые повреждения миофибриллярного аппарата в белых мышечных волокнах, в красных волокнах изменениям в большей степени подвергаются митохондрии.

5. При анализе особенностей изменения уровня содержания фосфоино-зитидов в ишемизированных красных и белых мышечных волоках с последующей 3 ч реперфузией установлено достоверное снижение ФИФ1, ФИФ, ФИДФ1, ФИТФ в сравнении с их значениями в контроле. С увеличением времени реперфузии до 6 ч и 24 ч отмечаются достоверные увеличения ФИ,ФИФ,ФИДФ и ФИТФ в красных и белых мышечных волокнах в среднем, соответственно, в 1,2; 1,5; 1,3; 1,1 раза к их содержанию в контроле.

6. Реперфузия ишемизированной мускулатуры в течение 3, 6, 24 часов на светооптическом уровне характеризуется процессами, начавшимися при ишемии: гиперсокращениями мышечных волокон, инфильтрацией соединительно-тканной стромы лимфоцитами и гистиоцитами. На ультрамикроскопическом уровне в белых мышечных волокнах отмечаются дальнейшие изменения преимущественно сократительного аппарата, в красных волокнах- мембранных структур.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Содержание фосфоинозитидов в мембранах мышечных волокон при ишемии скелетной мускулатуры/ Здоровье человека. - Материалы Российского

конгресса "Здоровье человека" 27- 29 февраля 199бг.-Тверь.-199б.-С.199-201(соавт. Соловьев В.А.,Слюсарь H.H., Матяш Б.Л.).

2. Морфо- биохимические параллели в поперечно-полосатой мускула-туре//Морфология.-1996.-Т.109.-Ы2.-С.91.(соавт. Соловьев В.А., Слюсарь H.H.).

3. Гистобиохимический профиль камбаловидной мышцы/ Структурно-функциональная организация органов и тканей в норме, патологии и экспери-менте.-Тверь.-1996. -С. 174.

4. Морфобиохимическая характеристика длинного разгибателя пальцев/ Там же-С.173.

4 5. Морфобиохимическая характеристика различных мышечных волокон при ишемии скелетной мускулатуры/Тезисы доклада научного совещания: "Гистогенетический анализ изменчивости и регенерации тканей".-С-Петербург.-1997.-С.81(соавт. Соловьев В.А., Слзосарь H.H.).

6. Изменения содержания арахидоновой кислоты в митохондриальных мембранах при реперфузии ишемизированной мускулатуры/ Тезисы доклада конференции: "Актуальные вопросы медицины и организации здравоохранения в Тверской области" (к 60- летию Областной клинической больницы).-Тверь,-1997.-С. 147(соавт. Слюсарь H.H.).

7. Морфологические изменения гетерогенной мускулатуры при её ишемии и реперфузии/ Там же. С. 148.

8. Биохимические сдвиги в скелетной мускулатуре при ишемии/Тезисы доклада конференции: "Экология, здоровье и природопользование"(Российская научно- практическая конференция, посвященная 200-летию Саратовской губернии).- Саратов,- 1997,- С.123- 124.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МВ -Мышечные волокна

СР -Саркоплазматический ретикулум

ФИН -Фосфоинозитиды

ФИ -Фосфатидшшнозиты

ФИФ 1-Фосфатидилинозит- 3- фосфаты

ФИФ -Фосфатидилинозит- 4- фосфаты

ФИДФ -Фосфатидилинозит- 4,5- дифосфаты

ФИДФ1 -Фосфатидилинозит- 3,4- дифосфаты

ФИТФ - Фосфатидилинозит- 3,4,5- трифосфаты

ТвГУ. Тираж 100 экз. Заказ 182.